Apostila Microbiologia - Prática2010

Universidade Federal de Mato Grosso Faculdade de Nutrio Departamento de Alimentos e Nutrio
AULAS PRTICAS
ANLISE MICROBIOLGICA
DE
ALIMENTOS
Prof. Dr. ODVIA OLIVEIRA ROSA Prof. M.Sc. CLUDIA PUERARI FARIA
UFMT / FANUT / DAN
Cuiab- 2009
AULA 1 FUNDAMENTOS
DA
BIOSEGURANA - Normas de Higiene e de Ordem Pessoal

Reduza ao mnimo as conversas durante o manuseio de
amostras. Use o jaleco sempre que estiver dentro do laboratrio e retire-o ao sair. Mantenha os cabelos presos ou afastados do rosto durante as prticas de laboratrio.
Guarde materiais de uso pessoal (bolsas, livros, cadernos, etc.)

em locais apropriados. No coloc-los sobre a bancada de trabalho. Caso apresente algum ferimento nas mos, informe ao professor. Lave sempre as mos ao entrar e antes de sair do laboratrio No fume, coma ou beba lquidos dentro do laboratrio. No prepare refeies (especialmente no microondas) e no guarde alimentos ou bebidas nos refrigeradores e congeladores do laboratrio. Evite tocar os olhos, boca ou nariz com as mos durante as anlises. No coloque na boca lpis, caneta ou quaisquer outros objetos durante a realizao dos procedimentos laboratoriais No use o jaleco para limpar objetos ou instrumentos de trabalho. Trate os cortes ou rasges imediatamente, limpando com soluo antisptica e cobrindo com curativos. Comunique imediatamente qualquer suspeita de haver contrado uma enfermidade conseqncia de uma infeco no laboratrio. Utilize os lava-olhos, jatos de gua correntes e/ou chuveiros existentes na parte externa do laboratrio caso ocorra algum acidente, sobretudo se relacionado a provveis contaminaes microbianas. O professor deve ser notificado imediatamente a fim de tomar medidas compatveis com o problema.
Prof. Dr. Odvia Oliveira Rosa / Prof. M.Sc. Cludia Puerari Faria
54
UFMT / FANUT / DAN
Normas para o trabalho em microbiologia No incio de cada anlise traar um plano de trabalho considerando o tempo necessrio para uma anlise e sua leitura. Trabalhar sempre de maneira ordenada, tranqila, constante e metdica, evitando movimentos desnecessrios como trocar de lugar, assento, etc. Limpar e desinfetar a superfcie de mesas e balces antes e depois do trabalho de cada dia.
Evite a formao e disperso de aerosis durante a pipetagem, flambagem de alas bacteriolgicas, abertura de frascos, manipulao de seringas, agulhas, swabs, placas de Petri, etc. Descartar em frascos contendo hipoclorito de sdio a 2% ou outra soluo desinfetante os seguintes materiais usados: pipetas, bastes de vidro, lminas, lamnulas, swabs, etc. Jamais depositlos sobre bancadas ou dentro de pias. Efetuar registro de anlise, anotando o tipo de produto, procedncia, dia e hora da entrada no laboratrio e qualquer outra observao prvia anlise. Na anlise propriamente dita anotar: mtodo, meio de cultura empregado e resultados obtidos. Identificar as amostras antes de iniciar a anlise e, em geral, no descartar at obter os resultados. O material a analisar deve ser tocado exclusivamente com instrumentos estreis e nunca com as mos. No caso de derramamento fortuito de material infectado, desinfetar e esterilizar imediatamente. O material utilizado deve receber a seguinte seqncia de tratamento: esterilizao, lavagem, secagem, embalagem, esterilizao e armazenamento. Os cultivos, aps leitura, e demais materiais utilizados (diluies, etc.) devem ser colocados em refrigerador de descarte para serem descontaminados em autoclave.
54
UFMT / FANUT / DAN
No retirar qualquer cultivo do laboratrio Observar e registrar a temperatura das estufas e banho Maria utilizados para incubao durante as anlises.
MEIOS
DE
CULTURA UTILIZADOS
EM
MICROBIOLOGIA
DE
ALIMENTOS
Os meios de cultura so definidos como produtos que contm uma fonte de nitrognio e outra de carbono, podendo ser lquido ou slido, com solues tamponantes, enriquecidos com fatores de crescimento e ou com substncias inibidoras que permitem a visualizao da resposta bioqumica de acordo com o substrato do meio. Podemos caracterizar os meios de cultura pelo uso: a) diluente: favorece a hidratao dos microrganismos. Ex.: Soluo salina, Soluo salina peptonada, Soluo Ringer, gua destilada estril (ADE), gua peptonada tamponada 0,1% (APT). b) meios para uso comum: sem agentes inibidores ou indicadores, podem ser utilizados em condies de incubao e de temperatura que permitem uma seletividade. Ex.: Agar padro para contagem (PCA), Agar nutriente (AN). b) meios de enriquecimento: tambm sem agentes inibidores, permitem o desenvolvimento da maioria dos microrganismos usualmente pesquisados para a avaliao higinico-sanitria de alimentos. Ex.: Infuso de crebro e corao (BHI), gua peptonada 1% (APT 1%). c) meios de enriquecimento seletivo: apresenta os componentes bsicos dos meios (nutrientes), mais agentes seletivos ou inibidores. Estes agentes podem ser de origem biolgica ou qumica, como a bile e seus derivados, os antibiticos, o selenito de potssio e o verde brilhante. Ex.: Caldo bile verde brilhante (BVB) sais biliares, verde brilhante e selenito de potssio; Caldo Escherichia coli (EC) sais biliares;
54
UFMT / FANUT / DAN
Caldo Selenito cistina (CS), Caldo Tetrationato (TT) bile de boi e verde brilhante. d) meio seletivo diferencial: contm os componentes bsicos, agentes seletivos, um ou mais substratos e os indicadores da utilizao deste (s) substrato(s). Ex.: agar eosina-azul de metileno (EMB), Salmonela-Shigela (SSA), Baird-Parker (BPA) e sulfito polimixina sulfadiazina (SSP). e) meios de identificao presuntiva: contm os componentes bsicos, substratos especficos e indicadores dos metablicos finais da utilizao destes substratos. Ex.: Agar trplice acar (TSI), agar Lisina e Ferro (LIA). f) meios de identificao seletiva: semelhante aos anteriores, porm contm um nico substrato indicador, tais como a srie de acares e de aminocidos.
COMPONENTES BSICOS
DOS MEIOS DE
CULTURA
1. Fontes de nitrognio: Protenas, Peptonas, Extrato de carne, Soros, Sulfato de amnia, Aminocidos (mais usados). 2. Fontes de carbono: todos os carboidratos, sendo a fonte de uso universal a glicose ou dextrose. 3. Fontes de sais minerais: resduos de outras matrias primas. 4. Vitaminas ou fatores de crescimento: extrato de levedura (complexo B). 5. Sistemas de enriquecimento: vitaminas, sangue, gelatina e acares. 6. Sistemas de reduo: azul de metileno, resazurina, nitratos. 7. Sistemas inibidores: - Qumicos: pH, sulfato de lauril, sulfato, azul de metileno, verde brilhante, antibiticos sintticos; - Biolgicos: Bile e sais biliares, antibiticos; - Fsicos (sistemas de incubao): Temperatura, aerobiose, anaerobiose; 8. Sistemas indicadores (corantes): - Mudana de pH: vermelho metil, vermelho fenol, prpura de bromocresol, azul de bromotimol; - Condies de oxi-reduo: azul de metileno, resazurina;
54
UFMT / FANUT / DAN
- Formao de substncias ou compostos: citrato de ferro, sais amoniacais.
PRINCIPAIS
SUBSTNCIAS INDICADORAS EM MICROBIOLOGIA
Quadro 1 - Reaes de indicadores de pH e de corantes presentes em meios de cultura

Indicador Azul de bromotimol Azul de timol Prpura de bromocresol Vermelho de cresol Vermelho de fenol Vermelho neutro pK 7,1 8,9 6,2 8,3 7,8 7,5 6,1 7,7 8,0 9,0 5,4 7,0 7,4 9,0 6,9 8,5 6,8 8,0 = = = = = = = = = = = = pH de viragem amarelo azul amarelo azul amarelo prpura amarelo vermelho amarelo vermelho vermelho amarelo
REPARO DE MATERIAL DE LABORATRIO PARA ANLISES MICROBIOLGICAS
PREPARO
DE
MEIOS
DE
CULTURA: CONSIDERAES
GERAIS
O crescimento de uma bactria em laboratrio observado pela semeadura em meios de cultura. Quanto ao estado fsico, podem ser considerados 3 grupos de meios: lquidos, slidos e semi-slidos. Os lquidos (ou caldos) so obtidos pela dissoluo dos nutrientes em gua. Os meios slidos so obtidos pela adio de um agente solidificante, sendo o agar-agar geralmente preferido. O agar-agar, um polissacardeo obtido de certas algas, apresenta a vantagem de no ser txico para as bactrias, fundir a 80-100C e solidificar 4045C. Alm disso, a estrutura fibrosa do agar-agar permite a difuso dos nutrientes mesmo os macromoleculares. A concentrao do agaragar nos meios slidos geralmente de 1,5 a 2,0%, podendo variar dependendo da pureza do agar empregado. Os meios de cultura devem conter fontes de carbono, nitrognio, sais inorgnicos e em certos casos vitaminas e outros fatores de crescimento.
54
UFMT / FANUT / DAN
A composio do meio de cultura varivel segundo as exigncias nutritivas do microrganismo em estudo. Alguns microrganismos so capazes de se proliferar em meios extremamente simples, como por exemplo, a Escherichia coli que cresce abundantemente em meios contendo apenas glicose e sulfato de amnio. Por outro lado, existem bactrias como Lactobacillus leichmannii, com reduzida capacidade sinttica, sendo necessria a incluso de cerca de doze nutrientes. Alm da composio qumica preciso considerar: 1. fornecimento de oxignio (em alguns casos); 2. certo grau de umidade; 3. pH do meio; 4. esterilidade; 5. preveno da contaminao externa do meio j esterilizado.
TCNICAS
DE INOCULAO DE BACTRIAS
Os microrganismos necessitam de um meio de cultura adequado para seu crescimento in vitro. Mas, alm dos componentes presentes no meio, outros fatores interferem no seu desenvolvimento, ou seja, os fatores ambientais como temperatura (psicrfilas, mesfilas ou termfilas) e tenso de oxignio (aerbias, anaerbias, microaerfilas e anaerbias facultativas). Inoculando um microrganismo em um meio de cultura que possua todos esses requisitos nutritivos e fatores ambientais adequados, o microrganismo inicia seu desenvolvimento, passando pelas diversas fases da curva de crescimento, desde a fase de latncia, logartmica, estacionria, at a fase da morte. A fase logartmica (exponencial) caracterizada por divises sucessivas, originando a formao de um grupamento de bactrias da mesma espcie que denominado colnia. Esta visualizada sem o auxlio do microscpio, sendo ento considerada como caracterstica macroscpica das bactrias.
54
UFMT / FANUT / DAN
Como cada espcie possui um tipo morfolgico colonial diferente, que devem ser analisadas quanto elevao, forma, tamanho, presena de halos, bordas e pigmentao. Em um meio de cultura, um nico tipo de colnia observado denominado de cultura pura; vrios tipos de colnia, cultura mista. Em microbiologia, h vrias tcnicas de inoculao de microrganismos; algumas so utilizadas para exames qualitativos e outras para estudos quantitativos (contagem de bactrias), as quais sero descritas adiante. Tcnicas de inoculao As seguintes normas devem ser seguidas nas inoculaes dos meios de cultura: a agulha e a ala de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer inoculao, ou seja, devem ser aquecidos ao rubro no cone interno da chama do bico de bunsen. Para a coleta do material, devem ser resfriados na parte interna do recipiente com meio de cultura; os recipientes (tubo de ensaio, placas de petri, etc) com meio de cultura devem ser sempre abertos prximo ao bico de bunsen; a boca do tubo de ensaio deve ser aquecida antes e aps a retirada da alquota, antes da colocao da tampa. A tampa nunca deve ser colocada sobre o balco, sendo retirada e mantida segura pelo dedo mnimo da mo direita durante a inoculao.
Tcnica de semeadura em meios lquidos - inocula-se a cultura com o auxlio de ala de platina. Tcnica de semeadura em meio slido inclinado inocula-se a cultura da bactria em um meio de cultura inclinado em tubo fazendo estrias na superfcie do Agar com o uso da agulha de platina. Tcnica de semeadura em meio slido em tubo - inocula-se a cultura de bactrias em meio slido utilizando a agulha de platina em profundidade de 2/3 do meio, devendo ser realizada uma nica picada. Tcnica de semeadura em meio slido em placa (tcnica de esgotamento) - a tcnica de esgotamento em placa consiste em depor sobre um ponto da superfcie do meio uma alquota do material e depois espalh-la em dois ou trs setores, por meio de ala de
54
UFMT / FANUT / DAN
platina, sem recarreg-la, de maneira a obter quantidades progressivamente menores de material. Temos que obter rarefao suficiente do material, de modo a formar colnias perfeitamente isoladas. O sucesso da semeadura est em grande nmero de estrias, no perfurar o meio, no voltar a ala sobre a estria e pegar pequena quantidade de material para semear. Tcnica de semeadura em placa pour-plate - a tcnica pourplate ou por incorporao pode ser realizada com o objetivo de se obter colnias isoladas (estudo qualitativo) ou para realizar a contagem de colnias em placa (estudo quantitativo). Aps realizar as diluies deve ser feito o plaqueamento. Agitar e retirar 1 mL de cada diluio, transferindo para placas estreis. Em seguida, colocar 15 a 20 mL de Agar fundido em cada uma delas. As placas devem ser suavemente submetidas a movimentos rotatrios, visando perfeita mistura da cultura com o Agar. Esperar solidificar e inverter as placas para incubar. Tcnica de semeadura em superfcie - Aps realizar as diluies deve ser feito o plaqueamento sobre a superfcie do Agar solidificado. Agitar e retirar 0,1 ou 0,2 mL de cada diluio, transferindo para o Agar solidificado nas placas estreis. Espalhar com a ala de Drigausky at completa absoro. Inverter as placas para incubar. Quando utilizar este mtodo, deve-se corrigir o valor da alquota no clculo do resultado da contagem de colnias para volume igual a 1ml. Condies de incubao aps a inoculao as bactrias devero ser incubadas em ambiente com tenso de oxignio e temperatura ideal para o desenvolvimento pretendido (aerbias, anaerbias, psicrfilas, mesfilas, termfilas, etc.). O tempo tambm vai depender do microrganismo em estudo. Aps os perodos determinados as colnias se tornaro visveis macroscopicamente.
COLETA, TRANSPORTE, ESTOCAGEM E PREPARO ANLISE

1. Coleta de amostras
DE
AMOSTRAS
PARA
54
UFMT / FANUT / DAN
1.1. Coleta de amostras de alimentos em embalagens
individuais. A coleta de amostras constitui a primeira fase da anlise do produto. Dentro do conceito de que a anlise comea com a coleta da amostra, este servio deve estar bem integrado com o laboratrio, devendo haver sincronismo entre a remessa e a capacidade do laboratrio em executar a anlise. As amostras para exame microbiolgico devero ser enviadas separadas daquelas destinadas a exames fsicoqumicos. Sempre que possvel tais amostras devem ser enviadas em sua embalagem original, fechada e ntegra, evitando modificaes em suas caractersticas. No aceitar a amostra caso esta esteja violada. As amostras para exame microbiolgico devero ser acondicionadas em recipientes estreis e ntegros (sem perfuraes, rachaduras) na quantidade mnima de 200g. Quando o peso unitrio no atingir o mnimo aqui estabelecido, devero ser colhidas tantas unidades para se obter aquele quantitativo. Neste caso, cuidados especiais so necessrios para que todas as amostras pertenam a um mesmo lote, partida e data de fabricao. Em casos especiais, a amostra poder ser acompanhada de relatrio adicional, contendo informaes que possam auxiliar na conduta do trabalho. Todas as amostras que chegarem ao laboratrio em condies diferentes das aqui preconizadas devem ser recusadas, cabendo ao laboratrio notificar pessoa que realizou a coleta, as razes de no aceitao.
1.2. Coleta de amostras de alimentos em embalagens no individuais. Alimentos em grandes quantidades (tanques, grades, embalagens), devero ser transportados ao laboratrio em pores representativas da massa em sacos estreis, sob condies asspticas. a. Homogeneizar toda a massa de alimento, antes de iniciar a coleta de unidade de amostra.
54
UFMT / FANUT / DAN
b. Para alimentos impossveis de serem homogeneizados, deve-se compor a unidade de amostra com pores de diferentes partes do contedo. c. Deve-se evitar a coleta apenas das regies prximas a abertura do tanque. d. Deve-se limpar as torneiras com lcool 70%, caso a coleta seja efetuada por esta, e deixar escoar uma certa quantidade, antes de iniciar a coleta. e. Para coletar amostras de p, deve-se utilizar amostradores tipo caladores ou amostradores de tubos mltiplos, usando uma amostrador para cada amostra e estes devero estar estreis. f. Deve-se utilizar furadeira com broca estril para coletas de amostras congeladas. As raspas que saem no momento da perfurao so coletadas em frascos estreis.
1.3.
Coletas de alimentos toxinfeces alimentares.
envolvidos
em
surtos
de
a) Coletar e analisar o mais rpido possvel.
b) No coletar alimentos que j estejam em decomposio. c) Caso no haja sobras de refeies ou contra-prova das mesmas, seguir as alternativas: - Coletar os vasilhames onde as refeies se encontravam acondicionadas. - Coletar amostras do lote de ingredientes e matrias-primas utilizadas na preparao dos mesmos. - Coletar amostras de refeies similares, preparadas posteriormente sob as mesmas condies.
1.4. Coleta de amostras de gua.
As amostras de gua clorada devero ser neutralizadas imediatamente aps a coleta, com tiossulfato de sdio a 10%. 2. Transporte e estocagem das amostras. Depois de coletadas, as amostras devero ser acondicionadas adequadamente, para evitar qualquer alterao nas mesmas at sua chegada ao laboratrio. Deve-se transportar e estocar as amostras de alimentos da mesma forma como o produto normalmente estocado e comercializado.
54
UFMT / FANUT / DAN
a) As amostras de produtos facilmente alterveis e os alimentos
perecveis comercializados na forma refrigerada devero ser acondicionados em recipientes isotrmicos, e acompanhadas de gelo ou outra substncia refrigerante, cuidando-se sempre pra que no haja contatos deste com a amostra. Devem ser transportados e mantidos sob refrigerao, at o momento da anlise.
Observao: Essas amostras no devero ser congeladas e o tempo mximo de estocagem, decorrido entre a coleta e anlise no dever ultrapassar 36 horas.
Caixas bem fechadas e com gelo suficiente para envolver toda a embalagem ou frasco de amostra podem manter temperaturas de refrigerao adequadas por at 24-30 horas. Se o transporte for prolongado, pode-se utilizar gelo seco, porm, certos cuidados devem ser observados: - Amostras de alimentos perecveis comercializados na forma congelada devem ser transportadas e mantidas congeladas at o momento da anlise, no podendo sofrer descongelamento total ou parcial durante o transporte. A temperatura de estocagem dessas amostras no deve ser superior a 10 C. - Se a embalagem da amostra for permevel aos gases ou tornarse quebradia com o frio, deve-se usar embalagem secundria para prevenir um possvel contato do CO2 com a amostra. Geralmente um embrulho em papel grosso suficiente para prevenir esse problema; - No se deve colocar gelo seco em contato direto com amostras que devem ser apenas resfriadas, pois elas podem congelar. Providncias especiais devero ser tomadas para que o tempo decorrido entre a coleta da amostra e sua chegada ao laboratrio seja o mais breve possvel, recomendando-se que sejam evitados mecanismos que impliquem a estocagem intermediria entre o ponto de colheita e o laboratrio. b) Somente devero ser aceitas para anlise amostras que tenham sido acondicionadas em embalagem lacrada pela pessoa que efetuou a coleta, sugerindo-se para tal a utilizao de lacre ou outro tipo de fechamento hermtico, que no possa ser violado sem que se torne evidente. Tal providncia se faz necessria para evitar a substituio ou adulterao das amostras entre o ponto de coleta e o laboratrio, com reflexos no resultado da anlise. c) Os alimentos comercializados estreis em embalagens hermticas podem ser transportados e mantidos temperatura ambiente
54
UFMT / FANUT / DAN
devendo ser protegidos contra a exposio a temperaturas superiores a 45oC. d) Alimentos de baixa atividade de gua podem ser transportados e estocados temperatura ambiente, devendo ser protegidos contra a umidade. e) Amostras de gua, em geral, devem ser mantidas sob refrigerao e analisadas preferencialmente em 8 horas e no mximo em 24 horas apos a coleta, no devendo ser congeladas. 3. Recepo e preparo das amostras para anlise 3.1. Recepo de amostras
Na recepo de amostras para anlise no laboratrio, devem ser observadas as condies da embalagem e as condies em que foi feito o transporte, antes da aceitao do pedido de anlise. Deve ser recusada qualquer amostra com embalagem rasgada, furada, violada, com corpos estranhos ou qualquer outro tipo de defeito, bem como amostras transportadas sob condies inadequadas. Se o interessado estiver encaminhando amostras com embalagem j aberta ou com selo violado (comum no caso de amostras encaminhadas para responder a reclamaes de consumidores, por exemplo), pode-se proceder anlise, dependendo do tipo de embalagem, tipo de produto e microrganismos investigados, porm, as condies em que a amostra foi recebida devem constar da identificao da amostra e do laudo final de anlise.
ATENO: No h sentido em analisar amostras de alimentos resfriados ou congelados que foram transportados temperatura ambiente.
O preparo de amostras para a anlise envolve basicamente duas etapas: a retirada da unidade analtica, que deve ser feita de forma a garantir que a poro removida seja representativa de todo o contedo da unidade de amostra, e o preparo de diluies decimais seriadas de unidade analtica, para inoculao nos meios de cultura. No caso de alimentos slidos ou lquidos concentrados, a primeira diluio (10-1) deve ser acompanhada de uma adequada homogeneizao da unidade analtica, que deve ser conseguida por agitao ou por disperso em stomacher. 3.2. Retirada da unidade analtica
54
UFMT / FANUT / DAN
Na retirada da unidade analtica, alguns cuidados devem ser tomados, sendo descritos a seguir. A abertura das embalagens e a retirada da unidade analtica devem ser feitas, preferencialmente, no interior de cmaras de fluxo laminar, para prevenir qualquer contaminao ambiente da amostra. Na impossibilidade de uma cmara de fluxo laminar, deve-se trabalhar na regio prxima chama de um bico de Bunsen de tamanho mdio, chama azulada, com as portas e janelas do laboratrio fechadas para evitar correntes de ar. Todos os instrumentos e utenslios utilizados na abertura das embalagens e na retirada das unidades analticas (tesouras, pinas, facas, esptulas, etc.) devem ser previamente esterilizados em autoclave ou estufa de esterilizao ou mergulhados em etanol 70% e flamejados no momento do uso. a) Para retirada da unidade analtica de peas de alimentos slidos, como cortes de carne, salsichas, queijos duros, etc, deve-se usar uma faca ou tesoura estril para cortar pedaos menores, de diversos pontos da pea, at se obter a quantidade requerida para a anlise. No caso de peixes inteiros, recomenda-se remover uma parte da pele, carregando a menor quantidade possvel dos tecidos internos, ou utilizar o mtodo de esfregao de superfcie. b) Se a amostra for heterognea, como o caso de bolos recheados, tortas, sobremesas e outros pratos prontos para consumo, por exemplo, compostos por diferentes camadas de composies distintas, a unidade analtica deve ser composta com pores tomadas de cada uma das camadas. Eventualmente, dependendo do microrganismo investigado e da razo da anlise, pode-se macerar toda a amostra e retirar a unidade analtica no macerado. Em outras situaes, ao contrrio, pode ser recomendvel tomar unidades analticas separadas, de uma ou mais camadas distintas e analisar separadamente. Um exemplo de situao em que essa prtica pode vir a ser necessria a anlise de alimentos suspeitos em surtos de toxinfeces alimentares, em que as camadas foram preparadas separadamente e posteriormente reunidas no prato completo, podendo conter nmeros e tipos de microrganismos diferentes em cada camada. c) Alimentos congelados devem, de preferncia, ser preparados para a anlise sem descongelamento prvio, pois o processo de descongelamento pode provocar injrias a um nmero significativo de clulas dos microrganismos. Alm disso, o recongelamento de
54
UFMT / FANUT / DAN
amostras, depois da retirada da unidade analtica, para estocagem como contra-amostra, deve ser evitado sempre que possvel. Os resultados obtidos na eventual anlise dessa poro, depois de um segundo processo de congelamento/descongelamento, sempre sero menos confiveis, em funo das perdas das clulas por injria ou morte. Esse cuidado particularmente importante no caso de amostras destinadas deteco ou contagem de Vibrio sp. e C. perfringens e bactrias lcticas, particularmente sensveis s injrias pelo congelamento. Para estocagem de contra-amostras, nesses casos, a unidade analtica deve ser retirada sem descongelamento prvio, com a ajuda do mtodo da furadeira eltrica, se necessrio. d) Quando no for possvel retirar a unidade analtica sem descongelar a amostra, o descongelamento deve ser feito em geladeira e, sempre que possvel, na embalagem original. Geralmente, 18 horas so suficientes para descongelar a maioria das amostras de alimentos em geladeira. Se um descongelamento rpido for requerido, pode-se manter a amostra a 20-25C por trs horas seguidas, seguidas de, no mximo, 15 minutos a temperaturas mais altas (no superior a 40C), removendo-se a unidade analtica, se possvel, antes do completo descongelamento. Em nenhum caso essas amostras devem atingir temperaturas superiores 5C, antes do incio das anlises. Para a anlise simultnea de Salmonella, requerida uma unidade analtica adicional, geralmente de 25g, diluda diretamente em 225 ml de caldo de pr-enriquecimento. Preparo da amostra Antes de abrir as embalagens, desinfetar a rea externa com etanol 70%, para remover os contaminantes presentes. No caso de latas destinadas ao teste de esterilidade comercial, lavar as latas com gua e detergente e, em seguida, desinfetar com lcool iodado (etanol 70% suplementado com 4% de iodo). Observar e anotar qualquer anormalidade nas embalagens, bem como no contedo interno, como odor e/ou aparncia estranha, ou presente de corpos estranhos. Produtos esterilizados Cuidados especiais devero se observados na abertura dos recipientes hermeticamente fechados. Posicionar a lata com a borda no codificada para cima e costura lateral voltada para o lado oposto
54
UFMT / FANUT / DAN
ao analista. Colocar sobre a mesma, algodo embebido com hipoclorito de sdio a 5%. Usando um abridor, previamente esterilizado, abrir um pequeno orifcio no centro. Mantendo a presso do abridor, retira-lo lentamente. Alargar a abertura at o tamanho desejado e transferir pores do contedo para os meios de cultivo indicado. Alimentos lquidos concentrados, pastosos, modos ou em p Podem ser homogeneizados por simples agitao manual do frasco (invertendo-se 25 vezes em ao de 30 cm) ou em shaker rotativo. Amostras de condimentos em casca ou raiz, como canela em casca, por exemplo, devem ser previamente modas em liquidificador (100 gramas, 30 segundos em baixa rotao). Amostras de lquidos concentrados e de alimentos pastosos, modos ou em p devem ser revolvidas com uma esptula estril em movimentos circulares, antes da retirada de unidade analtica no deve exceder 15 minutos. Se no houver espao-livre para a agitao da amostra, utilize um segundo frasco, estril, e misture a massa do produto transferindo a amostra de um frasco para o outro, por 3 vezes. Amostras de bebidas e refrigerantes gaseificados devem ser transferidas para um frasco estril e, com a tampa ligeiramente aberta, agitadas em shaker at a completa expulso dos gases. O intervalo entre a mistura da amostra e a retirada da unidade analtica no deve ultrapassar 3 minutos. Alimentos pastosos, como extrato de tomate, goiabada, purs, queijos mole, sorvetes de massa etc., podem ser homegeneizados por disperso em Stomacher (30 a 60 segundos). Amostras de maionese e outras coberturas para saladas exigem pelo menos 2 minutos, para uma boa homogeneizao e, anlise de coliformes, E. coli, Salmonella, S. aureus, Listeria e Yersinia devem ser tratadas com uma soluo estril de NaOH 1N na quantidade necessria para neutralizar a acidez. Alimentos slidos em peas Cortes de carne, queijos duros, chocolate em barra, etc., podem ser homogeneizados por triturao em liquidificador, com rotao de 8000 a 15000 rpm por 1 a 2 minutos. Dependendo da resistncia do alimento, pode ser gerada em quantidade significativa de calor, principalmente se o tempo requerido para a completa triturao da amostra ultrapassar os 2 minutos. Nas situaes em que isso seja esperado, recomenda-se que o diluente seja pr-resfriado em banho de gelo, antes do incio da homogeneizao.
54
UFMT / FANUT / DAN
Espessantes Na homogeneizao de espessantes por agitao, o diluente no deve ser adicionado ao produto, pois isso dificultar a disperso. A prtica recomendvel pesar a unidade analtica em um pedao de papel ou de alumnio estril agitao. Nesse caso, recomendvel utilizar um agitador magntico, esterilizando-se previamente a barra magntica.Opcionalmente, essas amostras podem ser homogeneizadas em stomacher por 2 minutos. Ps de baixa solubilidade Amostras de alimentos em p com baixa solubilidade, como ovo em p e leite em p instantneo, tambm so melhor homogeneizadas se a agitao for feita com o auxlio do agitador magntico, adicionando-se o diluente aos poucos, sob constante agitao. Alimentos gordurosos Para homogeneizar alimentos slidos com alto teor de gordura (>20%), como toucinho defumado, por exemplo, recomenda-se utilizar o diluente previamente suplementado com 1% (peso/volume) de Tergitol 7 aninico, Tween 80 ou triton x-10, para facilitar a emulsificao. A homogeneizao conseguida com 1 a 2 minutos em liquidificador, baixa rotao (8000rpm). Essa forma de homogeneizao tambm pode ser utilizada por amostras de manteiga, margarina, gorduras e similares, que alternativamente podem ser homogeneizadas por fuso em banho Maria (40C/15 min.), adio de diluente pr-aquecido a 40C, agitao e preparao das diluies seriadas rapidamente, antes que a suspenso resfrie. O intervalo entre a homogeneizao analtica e a preparao das diluies posteriores no deve ultrapassar 3 minutos. Amostras de moluscos em conchas Devem ser preparadas obedecendo aos seguintes procedimentos: lavar as mos com gua e sabo e, em seguida, com etanol 70%. Com uma escova abrasiva estril, esfregar as conchas sob gua corrente (tratada) removendo todos os resduos aderidos casca. Colocar as conchas sobre uma toalha estril e aguardar que a gua escorra e seque naturalmente. Com as mos limpas e higienizadas com lcool, abrir as conchas com o auxlio de uma faca estril, recolhendo os organismos e o lquido que escorre do interior das conchas entre a abertura de uma concha e outra. Amostras de ovos em casca Devem ser preparadas obedecendo aos seguintes procedimentos para a anlise do contedo interno; retirar os ovos da geladeira e transferir para uma estufa a 20C, por um perodo de tempo. Em seguida passar estufa de 25C, tambm por um perodo de tempo e
54
UFMT / FANUT / DAN
em seguida transferir para a temperatura ambiente, para equilibrar definidamente a temperatura. Esses cuidados visam evitar o acmulo de condensado na casca fria, que favorece a penetrao de bactrias para o interior. Lavar os ovos com gua e detergente, garantindo que a gua de lavagem se encontre numa temperatura 11C acima da temperatura dos ovos, porm no inferior a 32C. Drenar o excesso de lquido, mergulhar os ovos em etanol 70% por 10 minutos e flambar. Lavando e desinfetando bem as mos, segurar os ovos, quebrar a casca e verter o contedo a um perodo inicial de 1 a 2 minutos de homogeneizao, antes da adio de diluente e homogeneizao definitiva da diluio 10-1.
3.3.
Realizao das diluies seriadas
3.3.1. Preparo da Diluio 10-1
Retirar assepticamente uma unidade analtica de 25g da amostra e transferir para o frasco de homogeneizao previamente esterilizado e tarado. Transferir assepticamente uma poro de 1 ml da amostra para 9 ml de diluente, utilizando os mesmos diluentes recomendados anteriormente. Alternativamente, pode-se transferir 10 ml de amostra para 90 ml de diluente ou 25 a 50 ml de amostra para 225 a 450 ml de diluente, dependendo do grau de contaminao esperado. Adicionar unidade analtica de 25g, 225ml de diluente e homogeneizar, obedecendo as seguintes recomendaes: Os diluentes recomendados para a anlise da maioria dos alimentos so a gua peptonada 0,1%, a soluo salina peptonada ou tampo fosfato pH 7,2. A diluio inicial recomendada para a maioria doa alimentos slidos 1:10. H casos especiais em que se recomenda a utilizao de outros diluentes ou outras diluies iniciais, a maioria deles discutidos em captulos especficos. As diferenas mais freqentes so: Na anlise de alguns derivados de leite, o diluente recomendado a soluo de citrato de sdio 2% (queijos, leite em p de baixa solubilidade, iogurte e outros leites fermentados) ou a gua destilada estril (leite em p de alta solubilidade, leite condensado, concentrado ou evaporado). Na anlise de Salmonella a diluio inicial diretamente no caldo de pr-aquecimento. No caso de amostras preparadas pelo mtodo de lavagem ou esfregao de superfcie, o material diludo no caldo de
54
UFMT / FANUT / DAN
pr-aquecimento pode ser utilizado na realizao das demais anlises. Na anlise de moluscos em concha (ostras, mexilhes, mariscos), a primeira diluio deve ser 1:1 e, caso no seja possvel pipetar o material, diluir a 1:3. Na anlise de condimentos, pode-se trabalhar com uma unidade analtica de 11 gramas, diludas em 99ml diluente. Na anlise de espessantes, pode-se trabalhar com unidade analticas de 5 a 12,5 gramas, recomendando-se diluio inicial de 1:100, em funo da alta viscosidade do material. A homogeneizao da unidade analtica com o diluente pode ser feita de diferentes formas, dependendo das caractersticas da amostra analisada.
3.3.2.
Demais Diluies seriadas
Para o preparo da segunda diluio (10-2), transferir assepticamente 1 ml da diluio 10-1 para 9 ml de diluente ou 10 ml da 10-1 para 90 ml de diluente. As diluies subseqentes so obtidas de maneira similar, transferindo-se 1 ou 10 ml da diluio anterior para 9 ou 90 ml de diluente. Ao preparar as diluies seriadas, procurar obedecer s seguintes recomendaes: O diluente utilizado na preparao das diluies 10 -2 e superiores deve ser o mesmo utilizado na preparao da primeira diluio (10 -1). necessrio, entretanto, suplementar o diluente, nos tubos de diluio, com Tween 80, Tergitol 7 ou triton X-100, para a 2 a e demais diluies de amostras gordurosas. O nmero de diluies requeridas depende do nvel de contaminao esperado. Por exemplo, se a contagem estimada encontra-se por volta de 2.500 a 25.000/g de amostra, as diluies recomendadas para a contagem em placas so a 10-1, 10-2 e 10-3 para se obter placas com contagens entre 25 e 250 colnias. Caso no haja possibilidade de se estimar previamente o nvel de contaminao da amostra, ento deve-se preparar e inocular um maior nmero de diluies (10-1 a 10-7). Na transferncia de volumes entre as diluies, usar sempre uma pipeta diferente para cada situao. Antes de retirar o volume a ser transferido, agitar vigorosamente o tubo ou frasco, invertendo 25 vezes em arco de 30 cm ou com auxlio de um agitador tipo vortex. Na seleo das pipetas para a anlise escolher sempre
54
UFMT / FANUT / DAN
pipetas que tenham capacidade no mximo 10 vezes superior ao volume que vai ser coletado. Por exemplo, para pipetar volume de 1 ml, utilizar pipetas de no mximo 10 ml. A pipeta deve ser completamente preenchida e o volume descarregado a partir da marca superior, mesmo que se v liberar um volume menor do que a capacidade da pipeta. Deve-se evitar a liberao de volumes a partir da ltima e penltima marca inferiores das pipetas. A liberao do volume deve ser feita com a ponta da pipeta encostada na parede interna do tubo ou frasco, de forma que o lquido escorra pela parede. No se deve flambar pipetas. Caso a ponta venha a tocar qualquer superfcie no estril, como a parte externa do porta-pipetas, a boca das outras pipetas ou as paredes externas do tubo ou frasco de diluio, por exemplo, a pipeta deve ser descartada e substituda por outra.
RESUMO MATERIAL:
DO
PREPARO
DA
AMOSTRA
PARA
1 - Capela de fluxo laminar ou bico de bunsen 2 - Balana semi-analtica 3 Sacos plsticos resistentes estreis ou Erlenmeyer, capacidade de 400 a 500 mL 4 - Bisturis, facas com lmina e cabo de ao inoxidvel, esptulas, pinas, colheres, abridores de lata e tesoura esterilizados 5 - Bandejas de alumnio ou ao inoxidvel esterilizados 6 - Caneta para retroprojetor ou lpis dermogrfico 7 - Cuba com desinfetante para o descarte do material utilizado 8 Frasco de diluio autoclavvel contendo 225 mL de soluo salina peptonada estril ou 225 mL de gua peptonada tamponada estril 10 - Soluo desinfetante PROCEDIMENTO: 1 Verificar o peso lquido do produto; desinfetar a superfcie das embalagens que esto em contato direto com o produto;
54
UFMT / FANUT / DAN
2 - Abrir as embalagens tomando as seguintes precaues: - Fazer inspeo visual do produto; - Retirar as alquotas para anlises caso o produto no apresente sinais visveis de alterao; - Se o produto apresentar sinais visveis de alteraes, s fazer a anlise se for necessrio elucidar a ocorrncia de toxinfeco alimentar de origem microbiana; - Evitar que o produto entre em contato com a superfcie externa da embalagem ou com superfcies no estreis; 3 Pesar 25 g da amostra dentro dos sacos ou erlenmeyers. Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1% (diluio 10-1); 4 - Acoplar ao homogeneizador de laboratrio (Stomacher) e homogeneizar durante 2 minutos; 5 - Se necessrio, transferir o contedo do saco plstico para os frascos originais de soluo salina peptonada e programar a sua semeadura, no prazo mdio de 15 minutos; 6 - Para a pesquisa de salmonela, repetir as operaes descritas em 3 e 4 usando-se 225 mL de gua peptonada tamponada 1% e, aps a homogeneizao, transferir o contedo do saco plstico para os frascos originais de gua peptonada tamponada. Obs.: Caso seja necessrio conservar a amostra, respeitar as condies especficas de armazenagem do produto.
PROCEDIMENTOS
DE
AULA 2 PREPARO E ESTERILIZAO
DE
MATERIAIS
1Descontaminao e descarte de resduos contaminados Submeter todo o material esterilizao em autoclave a 121 oC por 30 minutos, observando-se os seguintes cuidados: 1. Afrouxar as tampas de todos os frascos com tampa de rosca 2. Adicionar gua ou soluo detergente aos estojos de descarte de pipetas, para amolecer os resduos e facilitar a posterior remoo. 2Lavagem 1Usar detergentes aninicos, com compostos alcalinos; em casos especiais utilizar agentes mais fortes, como a soluo sulfocrmica, constituda de cido sulfrico
54
UFMT / FANUT / DAN
e dicromato de potssio ou a soluo alcolica 1N de hidrxido de sdio. 2Remover todo o material descontaminado dos frascos e utenslios. 3Mergulhar o material em soluo detergente e deixar de molho por 2 horas. 4Colocar os tubos de Durhan de molho em frascos separados. 5Retirar o algodo das pipetas antes de coloc-las de molho. 6Efetuar de seis (06) a doze (12) enxges sucessivos em gua corrente, seguidos de um a vrios enxges em gua destilada. 3Acondicionamento 1As pipetas devero ser preenchidas no bocal com algodo hidrfobo e acondicionadas em estojos de ao inoxidvel, com as pontas para baixo, ou embrulhadas individualmente em papel Kraft, identificando o volume e o local de abertura da embalagem (pelo bocal). Colocar algodo no fundo do estojo para no quebrar as pontas das pipetas 2Os tubos de ensaio devero ser tampados com suas respectivas tampas de rosca ou tampo de algodo, acondicionados em cestas e cobertos com papel Kraft. 3Os frascos devero ser cobertos com papel Kraft e amarrados com barbante, individualmente. 4Esptulas, pinas, tesouras e demais utenslios devero ser acondicionados individualmente em papel Kraft, sendo devidamente identificados. 4Esterilizao A esterilizao de materiais pode ser feita em autoclaves, com temperatura de 121C por 15 minutos, ou em estufa de esterilizao, pelo uso de calor seco, a 170C por 2 horas. 1No trabalhar com autoclaves excessivamente cheias. 2As pipetas e vidros volumtricos devero ser esterilizados somente em autoclaves. 3As tampas dos tubos de ensaio devero ser afrouxadas durante a esterilizao e aps o trmino, devero ser completamente fechadas.
54
UFMT / FANUT / DAN
Na esterilizao de vidraria vazia em autoclaves recomendvel liberar o vapor imediatamente aps o trmino do tempo de esterilizao. 5No caso de meios de cultura, diluentes e reagentes, necessrio aguardar que a presso baixa at zero, antes de descarregar o vapor. 5Preparo da vidraria 1- Toda a vidraria nova deve ser colocada em gua destilada por 24 horas, enxagada e submetida a teste de pH. 2- Tampas de plstico ou borracha, de tubos de roscas ou outros frascos, devem passar por um tratamento para remoo de resduos txicos. Mergulhar em gua destilada, autoclavar por 121 C durante 15minutos e enxaguar em gua destilada. Repetir este procedimento por duas vezes.
4-
Testes para verificao da eficincia da lavagem e enxge na remoo de resduos Tomar alguns frascos de uma batelada de material lavado, principalmente aqueles submetidos a tratamento com soluo sulfocrmica ou soluo de NaOH e adicionar gotas de soluo 0,04% de azul de bromotimol, observando a cor. Verificao da presena de resduos txicos a) Preparar 3grupos de placas de Petri: b) Lavar 6 placas de forma usualmente utilizada no laboratrio (A). c) Lavar 6 placas de maneira usualmente utilizada no laboratrio e depois submeter a 12 enxges adicionais, com 12 pores diferentes de gua destilada (B). d) Lavar 6 placas de Petri e deixar secar sem enxaguar a soluo detergente( C). Usar cada grupo para contar uma suspenso de E. coli ou E. Aerogenes por plaqueamento em profundidade de Agar Padro para Contagem (PCA). Calcular a mdia do nmero de colnias desenvolvidas nas 6 placas de cada grupo e comparar as mdias obtidas. Se a diferena entre as mdias dos grupos A, B e C for menor do que 15% significa que o detergente utilizado no apresenta ao contra os microrganismos. Se a diferena entre as mdias dos grupos A e C for maior ou igual a 15% significa que o detergente apresenta efeito txico contra os microrganismos. Se a diferena entre os grupos A e B for maior ou igual a 14% significa que o mtodo de enxge utilizado pelo laboratrio no foi eficiente para remover completamente esses
54
UFMT / FANUT / DAN
resduos. Se, por outro lado, a diferena entre as mdias A e B for menor do que 15% significa que o mtodo de lavagem o enxge utilizado pelo laboratrio foi eficiente para remover os resduos. Para avaliar a presena de resduos em tubos ou frascos, preparar o caldo e a suspenso de E. coli ou E. aerogenes em 3 grupos de frascos, lavados da mesma forma recomendada para os grupos A, B e C de placas de petri. Verificar a contagem final obtida nessas suspenses. Aps a incubao por contagem padro em placas e comparar os resduos de formas anlogas utilizada para as placas.
AULA 2 - CONTAGEM PADRO
EM
PLACA
54
UFMT / FANUT / DAN
A contagem de microrganismos em placas o mtodo geral que pode ser utilizado tanto para contagem de grandes grupos microbianos, como os aerbios mesfilos, os aerbios, psicrfilos, os fungos e leveduras e os clostrdios sulfito redutores, dentre outros, como tambm para a contagem de gneros e espcies em particular, como Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Clostridium perfringens, por exemplo. Essa versatilidade decorrente do princpio do mtodo, que se baseia na premissa de que cada clula microbiana presente em uma amostra ir formar, quando fixada em um meio de cultura slido adequado, uma colnia visvel e isolada. Variando o tipo (meio de enriquecimento, meio seletivo, meio seletivo-diferencial) e as condies de incubao (temperatura a atmosfera), possvel selecionar o grupo, gnero e espcie que se deseja contar. Como as clulas microbianas muitas vezes ocorrem em agrupamentos (pares, ttrades, cachos, cadeias, etc.), no possvel estabelecer uma relao direta entre o nmero de colnias e o nmero de clulas. A relao correta feita entre o nmero de colnias e o nmero de unidades formadoras de colnias (UFC), que podem ser tanto clulas individuais como agrupamentos caractersticos de certos microrganismos.
CONTAGEM PADRO
EM
PLACA
DE
AERBIOS MESFILOS - CPP
a determinao de unidades formadoras de colnias (UFC) pelo mtodo de semeadura em profundidade, utilizando-se o agar padro para contagem (PCA) e temperatura de incubao a 36 1C por 48 2h. O resultado expresso na forma de UFC/g ou UFCg-1 ou ml do produto. Esta determinao tem sua interpretao associada avaliao das condies microbiolgicas durante o processamento do produto e empregada para indicar a qualidade sanitria dos mesmos. um parmetro microbiolgico para o qual se admite tolerncia, visto que envolve um nmero muito grande de microrganismos que nem sempre esto associados patogenicidade. Entretanto, contagens muito elevadas desses organismos indicam o uso de matria prima contaminada, condies higinicas de manipulao e ambientais insatisfatrias, e processamento inadequado, conduzindo ao descuido ou descaso com que os produtos foram elaborados. Embora no tenha valor quando da anlise de produtos que naturalmente apresentam uma flora bacteriana mesfila, como o
54
UFMT / FANUT / DAN
caso de vegetais, ervas e morango, ou mesmo para produtos fermentados, deve ser sempre observado para os produtos perecveis, considerando que todas as bactrias patognicas de origem alimentar so mesfilas e ndices superiores a 105 UFCg-1 significam que foram dadas condies para que esses patgenos se multiplicassem.
CONTAGEM
EM
PLACAS
DE
BACTRIAS AERBIAS PSICROTRFILAS
So geralmente utilizadas para deteco das condies de estocagem de produtos refrigerados, uma vez que o crescimento de microrganismos conduziria deteriorao dos produtos e perda das caractersticas organolpticas e resultaria na reduo da vida til dos mesmos. Pode ser utilizado em produtos vegetais para acompanhamento do crescimento da microbiota epfita e alertar para o perigo de crescimento de cepas frio-tolerantes como Listeria monocytogenes e Bacillus cereus, microrganismos comumente encontrados nos locais de produo desses artigos.
CONTAGEM
EM
PLACAS
DE
BACTRIAS AERBIAS TERMFILAS
Utilizada para determinao de processamentos trmicos eficientes indicando se a relao tempo/temperatura de processamento foi ou no suficiente para a eliminao de formas esporuladas viveis.
CONTAGEM
DE
BOLORES
LEVEDURAS
Formam um grupo complexo, composto por fungos leveduriformes e fungos filariformes, que de uma maneira bastante acentuada esto presentes no meio ambiente. Seu crescimento muito lento em alimentos de baixa acidez e alta atividade de gua, sendo dificilmente responsveis pela deteriorao nesses produtos. No entanto, em alimentos cidos e de baixa atividade de gua seu crescimento maior, produzindo geralmente a deteriorao de frutos, hortalias, sucos de frutas, doces em compotas, queijos, alimentos congelados, desidratados, picles e conservas, bolos, tortas e produtos de confeitaria, quando em condies inadequadas de armazenamento. A determinao em laboratrio feita atravs de semeadura em profundidade das diluies decimais efetuadas, utilizando o agar
54
UFMT / FANUT / DAN
batata dextrose (BDA) acidificado, aps ter sido fundido, com o cido tartrico a 10% at obter um pH em torno de 3,5 para inibio da microbiota bacteriana acompanhante. Pode ser usado tambm o agar Saboroud acrescido de antibiticos (clorafenicol). A incubao realizada a 22-25C por at 5 dias. A interpretao e significado deste grupo esto relacionados com as condies de higiene ambiental, presena de cepas deteriorantes na matria a prima, condies de processamento inadequadas e higienizao insatisfatria de equipamentos e superfcies de trabalho. A presena de bolores em ndices superiores a 102-103 UFCg-1 considerada de risco para produo de micotoxinas. Visto que as micotoxinas so resistentes aos tratamentos trmicos usuais e so determinadas por mtodos qumicos, as mesmas no so consideradas nas anlises microbiolgicas usuais sendo realizadas em laboratrios especficos. H tolerncia para esta classe de indicador nos alimentos e o Brasil um dos poucos pases que incluram este parmetro nos padres legais devido ao tipo de solo existente e grande eminncia de contaminao de alguns produtos como o milho, a batata e o amendoim. Seu controle, entretanto, no fcil em produtos que no so tratados termicamente como as farinhas de trigo, milho, mandioca, etc.
PRTICA
DE
CONTAGEM
PADRO EM PLACAS
(MESFILOS)
OBJETIVO Realizar a contagem de microrganismos mesfilos em alimentos atravs da tcnica de plaqueamento em profundidade. MATERIAL Estufa bacteriolgica regulada a 35 1 C; Contador de colnias com fundo escuro; Placas de Petri estreis; Pipetas bacteriolgicas de 1,0 ml com graduao decimal; Agar Padro para Contagem, estril (PCA); Tubos contendo 9 ml de soluo salina peptonada a 0,1% (SSP 0,1%). PREPARO DA AMOSTRA Pesar 25g de amostra no saco plstico estril e adicionar os 225ml de soluo salina peptonada (SSP 0,1%). Colocar o saco plstico no homogeneizador durante 30-60 seg., obtendo assim a diluio 10 1.
54
UFMT / FANUT / DAN
Preparar as diluies necessrias, 10, 10 e 10-4, a partir da diluio 10, transferindo 1 ml da diluio inicial para tubos com 9 ml de soluo salina peptonada, homogeneizando entre as transferncias; Para fazer as diluies subseqentes e as semeaduras, resuspender por 10 segundos em agitador. Distribuir 1 ml de cada diluio no centro de placas de Petri estreis em duplicata, adicionando-se cerca de 15 ml de gar Padro para Contagem (PCA) fundido e resfriado a 45C. Em superfcie plana, submeter a placa a duas sries alternadas de cinco movimentos de vai-vem e cinco movimentos rotatrios. Deixar solidificar e incubar as placas invertidas a 35 +/- 1 C por 48 horas.
LEITURA DOS RESULTADOS Sero consideradas significativas as contagens das diluies que apresentarem entre 30 e 300 colnias; para calcular o nmero de Unidade Formadora de Colnia (UFC) por grama do produto:
UC /g o m = F u L n o co n s l ia d i ilu o
Obs.: Para contagens em duplicata, na obteno dos resultados, utilizar a mdia das contagens nas placas que apresentarem entre 30 e 300 colnias. Demais casos seguir a regra do Anexo: Normas para Interpretao e Expresso de Resultados para Contagem em Placas.
PRTICA
DE
CONTAGEM
DE
TERMFILOS
PSICROTRFILOS
O procedimento para a pesquisa de termfilos e psicrotrfilos o mesmo descrito para mesfilos, variando o tempo e a temperatura de incubao: a) Psicrotrfilos ....................................................2 a 8C/10 dias. b) Termfilos.........................................................55 +/- 1 C/48 horas.
CONTAGEM
OBJETIVO
DE
BOLORES
LEVEDURAS
54
UFMT / FANUT / DAN
Realizar a contagem de bolores em leveduras em alimentos atravs da tcnica de plaqueamento em profundidade. MATERIAL Cmara climtica regulada a 25+/- 1C; Pipeta bacteriolgica de 1 ml com graduao decimal; Placas de Petri estreis; Agar Dextrose Batata (PDA) estril; Soluo de cido tartrico a 10%; Tubos de ensaio contendo 9 ml de soluo salina peptonada a 0,1% (SSP); PREPARO DA AMOSTRA Pesar 25g de amostra em um saco plstico estril e adicionar os 225ml de soluo salina peptonada. Colocar o saco plstico no homogeneizador durante 30-60 seg. obtendo assim uma diluio 10 1 . Preparar a diluio 10 e 10-3, transferindo 1 ml da diluio 10 para um tubo contendo 9 ml de soluo salina peptonada a 0,1 %; Fundir em banho-maria o meio PDA: resfriar em torno de 45c e adicionar soluo de cido tartrico a 10% de forma a reduzir o pH para 3,5; Transferir 1 ml das diluies 10-1, 10-2 e 10-3 da amostra para as placas de Petri estreis e verter em cada uma delas cerca de 15 ml do meio de PDA acidificado; Misturar adequadamente o inculo com o meio sob uma superfcie plana, fazendo movimentos em forma de oito, aguardar a solidificao, inverter as placas e incubar a 251C por 3 a 5 dias. Fazer a contagem das colnias formadas no terceiro e quinto dias de incubao. LEITURA DOS RESULTADOS Proceder contagem das placas que apresentarem colnias bem diferenciadas e expressar o resultado em UFC grama; Para contagens em duplicata, na obteno dos resultados, utilizar a mdia das contagens nas placas que apresentarem entre 10 e 150 colnias.
54
UFMT / FANUT / DAN
Nos demais casos seguir a regra do Anexo: Normas para Interpretao e Expresso de Resultados para Contagem em Placas. Obs.: As diluies a serem realizadas devem ser superiores ao padro da legislao, ou seja: padro 10, fazer diluies at 10-4. As tcnicas de anlise de aerbios mesfilos, psicrfilos, termfilos e bolores e leveduras podem ser realizadas em plaqueamento de superfcie, sendo que neste caso o inoculo deve ser de 0,1ml e no clculo do resultado este valor deve ser corrigido, ou seja, deve-se multiplicar o nmero de colnias por 10.
UC /g o m = F u L
n o co n s l ia d i ilu o
0 1
ESQUEMAS
CONTAGEM PADRO
DE
ANLISE
MESFILOS
EM
PLACAS -
54
UFMT / FANUT / DAN
CONTAGEM
DE BOLORES E LEVEDURAS
54
UFMT / FANUT / DAN
AULA 3 - DETERMINAO
DE
DE
COLIFORMES A 35C, ESCHERICHIA COLI.
45C
DETECO
BACTRIAS
DO GRUPO COLIFORMES TOTAIS
Entendem-se como coliformes as bactrias pertencentes famlia Enterobacteriaceae que fermentam a lactose com produo de cido e gs. Como coliformes totais entendem-se a somatria entre os coliformes de origem ambiental e os de origem fecal. Nos alimentos que foram submetidos a um tratamento de higienizao eficaz que assegure sua inocuidade para o consumidor, est indicada, em geral, a determinao de coliformes. Esta determinao no tem necessariamente relao com uma contaminao de origem fecal e com a possvel presena de microrganismos patgenos. Os coliformes encontram-se espalhados no meio ambiente, sendo um indicador das condies higinicas de obteno da matria prima, das condies de manuseio, transporte, acondicionamento e comercializao da maioria dos produtos frescos. Indicam ainda deficincias ou falhas no processamento dos alimentos, condies de higiene ambiental inadequadas e a presena de poeira no ambiente de preparo e manipulao, indicando que a qualidade higinica no est adequada. A determinao de nmeros superiores a 5 NMP/g ou ml (Nmero Mais Provvel) em alguns produtos suficiente para consider-los em condies higinicas insatisfatrias. A determinao deste grupo feita utilizando a tcnica de tubos mltiplos (NMP) em meios de baixa ou mdia seletividade, como o caso do lauril sulfato triptose (LST) e caldo lactosado (CL). A formao de gs nas campnulas de fermentao ou tubos de Durhan dispostas nos tubos contendo estes meios indica a fermentao da lactose com liberao de vrios gases, principalmente CO2, sendo considerado como presuntivo positivo para coliformes. A confirmao feita usando meios mais seletivos, geralmente o caldo lactosado bile-verde-brilhante (BVB) a 2% e incubado a 35 1C por 24 a 48h. COLIFORMES So continuar incubados coliformes
FECAIS
(A 45C)
OU TERMOTOLERANTES E
ESCHERICHIA
COLI.
considerados neste grupo os coliformes capazes de fermentando a lactose com produo de gs, quando temperatura de 44,5 a 45C. Pertencem ao grupo dos os gneros Escherichia coli, Enterobacter, Klebsiella, e
54
UFMT / FANUT / DAN
Citrobacter. Sendo assim, os grupos coliformes ambientais e coliformes fecais so separados pela capacidade que este ltimo tem de crescer a temperaturas prximas de 45C, onde 90% das culturas de E. coli so positivas, e nas quais os primeiros (de origem ambiental), via de regra, no so capazes de se desenvolver. Entretanto, ambos os grupos crescem bem nos meios seletivos temperatura de 35 1C e por isso os coliformes totais so indicadores aos quais se permite tolerncia na legislao de alimentos. A deteco de E. coli nos alimentos indica a contaminao direta por fezes humanas ou de animais de sangue quente, conduzindo ao perigo da presena de outros patgenos de origem fecal como Salmonella e enterococos. Em alimentos processados, a presena destes microrganismos indica processamento inadequado e/ou recontaminao psprocessamento, tendo como principais causas o manuseio inadequado durante a embalagem, equipamentos mal higienizados, matria prima altamente contaminada, onde o processamento trmico no foi suficiente para eliminar estes organismos. A interpretao dada nestes casos de que a proliferao microbiana pode permitir a multiplicao de microrganismos patognicos e toxignicos nestes alimentos. Escherichia coli um membro da famlia Enterobacteriaceae, que rene as bactrias Gram negativas anaerbias facultativas e oxidase negativas. As principais caractersticas bioqumicas que distinguem essa espcie dos demais membros da famlia so: a) O metabolismo fermentativo da glicose, que se d por fermentao cido mista e resulta em uma quantidade significativa de cidos como produtos finais (cido ltico, actico e frmico). Essa caracterstica evidenciada no teste positivo de vermelho de metila (VM), que verifica se o pH final do meio de cultura atinge valores abaixo de 4,5. Conseqentemente, o teste de Voges Proskauer (VP), que verifica a produo de butilenoglicol (butanodiol) como produto final de fermentao da glicose, negativo para E. coli. Outra caracterstica importante do metabolismo fermentativo a capacidade de hidrolizar parte do cido frmico produzido, resultando em dixido de carbono e hidrognio (produo de gs). So raras as cepas anaerognicas, que no produzem gs a partir da glicose. b) As cepas de E. coli podem utilizar acetato, glicose, lactose e vrios outros compostos como fonte de carbono, mas no utilizam o citrato, caracterstica bastante explorada na identificao da espcie. A capacidade de fermentao da lactose com produo de gs, tanto a
54
UFMT / FANUT / DAN
35C quanto a 45C, amplamente utilizada na sua quantificao, atravs da anlise de coliformes fecais pelo mtodo do Nmero Mais Provvel. c) Caracteristicamente, E. coli produz indol e a enzima glicuronidase, mas no produz sulfeto de hidrognio nem hidroliza a uria. A -glicuronidase produzida por 96% das cepas, incluindo as anaerognicas, mas no pelos outros membros da famlia Enterobacteriaceae, exceto Shigella (44%) e Salmonella (29%). Um dos substratos mais utilizados para verificar a presena da glicuronidase o 4-metilumbeliferil--Dglicurondeo (MUG), composto no fluorescente que, quando degradado pela glicuronidase, resulta na 4-metilumbeliferona, fluorescente sob luz UV. O MUG ou seus similares cromognicos (cujos produtos de reao so coloridos sob luz normal) tm sido amplamente utilizados numa nova gerao de meios de cultura, para quantificao diferencial de E. coli em gua e alimentos. Podem ser adicionados ao Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) ou ao Caldo E. coli (EC), para quantificao direta pelo mtodo do NMP, ou ao gar Vermelho Violeta Bile (VRB), para quantificao em placas. O VRB contendo um substrato cromognico da glicuronidase foi utilizado pela 3M Company no desenvolvimento do Petrifilm coliformes/E. coli, que permite a quantificao diferencial de E. coli e coliformes totais. d) E. coli, assim como todos os membros da famlia Enterobacteriaceae, no uma bactria esporognica, logo, no resistente aos tratamentos trmicos brandos como a pasteurizao. Em relao aos testes bioqumicos, E. coli apresenta a frmula clssica IMViC (++--). A investigao de E. coli est fundamentada na sua procedncia do intestino do homem e de animais de sangue quente, e, embora possa sobreviver e multiplicar-se em determinados substratos, sua sobrevivncia na ausncia de matria orgnica muito curta, indicando por isso uma contaminao fecal recente. Da origem fecal de E. coli conclui-se que se esta bactria foi encontrada no alimento, indica que houve contaminao de origem fecal direta e que, conseqentemente, h o risco da presena de outros microrganismos de origem entrica no produto, como Salmonella SP. e C. perfringens, entre outros. Portanto, E. coli o indicador sanitrio ideal para anlises microbiolgicas da gua e de alimentos crus ou que no tenham sido submetidos a tratamento para assegurar sua inocuidade. Em alimentos que sofreram tratamento trmico, por sua vez, a presena
54
UFMT / FANUT / DAN
deste indicador revela contaminao do produto aps processamento, por manipulao ou armazenamento inadequado.
DETERMINAO
DE
COLIFORMES A 35C, A 45C ESCHERICHIA COLI.
DETECO
DE
OBJETIVO Realizar a determinao do nmero mais provvel (NMP) de coliformes a 35C e coliformes 45C em alimentos atravs da tcnica de tubos mltiplos e detectar E. coli. PREPARO
DA AMOSTRA
MATERIAL 01 erlenmeyer com 225 ml de soluo salina peptonada 0,1% estril (SSP) 02 tubos com 9ml de soluo salina peptonada 0,1% (SSP). 01 saco estril; Pina e bisturi.
PROCEDIMENTO Pesar 25g de amostra no saco plstico estril e adicionar os 225ml de soluo salina peptonada. Colocar o saco plstico no homogeneizador durante 30-60 seg. obtendo assim uma diluio 10 1 . Inocular 1ml do homogeneizado no 1 tubo de SSP (diluio 10 2 ) e aps agitao no vortex, inocular 1ml da diluio 10 2 no 2 tubo (diluio 10 3). INOCULAO TESTE
DA AMOSTRA
PRESUNTIVO
MATERIAL Pipetas de 1ml ou 5ml estreis; 09 tubos de LST. PROCEDIMENTO Inocular 1ml de cada diluio em 3 tubos contendo LST. (3 tubos por diluio) Incubar a 37C
54
UFMT / FANUT / DAN
LEITURA DOS RESULTADOS Aps 24 a 48h de incubao, verificar o nmero de tubos positivos presena de gs nos tubos de durham e turvao do meio pela produo de cido. TESTE
CONFIRMATIVO
- COLIFORMES
35C
MATERIAL Pipetas de 1ml ou 5ml estreis; 09 tubos de Caldo Bile Verde Brilhante (BVB). PROCEDIMENTO Inocular 1 alada de cada tubo positivo de LST para 1 tubo contendo BVB e incubar a 35,5C 1C LEITURA DOS RESULTADOS Aps 24 48h de incubao a 35,5C, verificar o nmero de tubos positivos presena de gs nos tubos de durham e turvao do meio pela produo de cido. Com esse nmero, determinar o NMP (nmero mais provvel) de coliformes totais de acordo com a tabela de NMP (anexo C). TESTE
CONFIRMATIVO
- COLIFORMES
45C
MATERIAL Pipetas de 1ml ou 5ml estreis; 09 tubos de Caldo EC. Ala de platina PROCEDIMENTO Inocular 1 alada de cada diluio dos tubos positivos em LST para 3 tubos contendo caldo EC. Incubar a 44,5C, em banho-maria LEITURA DOS RESULTADOS Aps 24 s 48h de incubao, verificar o nmero de tubos positivos presena de gs nos tubos de durham e turvao do meio devido acidificao. Com esse nmero, determinar o NMP (nmero mais provvel) de coliformes a 45C de acordo com a tabela de NMP. NMP - Interpretao e expresso de resultados: Organismos coliformes: turvao do meio com produo de gs nas campnulas de fermentao = resultado positivo.
54
UFMT / FANUT / DAN
a) O NMP calculado atravs
do nmero de tubos positivos. Consultando a tabela, expressar o resultado do NMP de bactrias por grama ou mililitro quando tomadas as diluies 10 1, 10-2 e 103 . Exemplo: 10 1 = 2 tubos positivos; 10-2 = 1 tubo positivo; 10 3 = zero Na tabela de NMP, srie 2 1 0, encontramos para esta combinao NMP igual a 15 NMP/g = 15
b) Quando forem tomadas diluies seriadas acima de 10-1 dever ser
utilizada a frmula para correo. NMP = Nmero encontrado na tabela x diluio mdia com expoente positivo dividido por 100, ou seja: NMP = N tabela x diluio mdia 100 Exemplo: diluies tomadas 10-2, 10-3 e 10-4 combinao das sries 3 2 1 nmero encontrado na tabela: 15 NMP/g = 15 x 103 = 15 x 10 = 150 100 NMP/g = 150 Obs.: Verificar sempre as diluies tomadas para confeco da tabela em uso e caso necessrio realizar as devidas correes decimais.
DETERMINAO
DE
ESCHERICHIA
COLI
MATERIAL Pipetas de 1ml ou 5ml estreis; Placas de Agar BEM-Levine (BVB) PROCEDIMENTO A partir dos tubos positivos de Caldo EC, inocular por estriamento em superfcie placas de Agar BEM-Levine, incubando em condies de aerobiose a 35C/24 a 48h. LEITURA
DOS RESULTADOS
54
UFMT / FANUT / DAN
Aps 24 48h de incubao verificar a presena de colnias escuras, com brilho verde metlico. Retirar colnias isoladas em Agar nutriente para realizar a identificao bioqumica, incubando a 35C/24h.
COLIFORMES
35C
E A
45C
54
UFMT / FANUT / DAN
TESTE
CONFIRMATIVO DE
ESCHERICHIA
COLI.
54
UFMT / FANUT / DAN
54
UFMT / FANUT / DAN
AULA 4 PESQUISA
DE
SALMONELLA
SP.
A dificuldade para o isolamento de Salmonella est relacionada ao seu pequeno nmero quando comparado a outras bactrias da microbiota acompanhante, pois esta microbiota boa competidora e utiliza mais rapidamente os nutrientes do meio, por possuir um metabolismo mais rpido, ao contrrio das salmonelas que possuem um metabolismo mais lento, o que dificulta o seu crescimento e desenvolvimento. A anlise de rotina para deteco de Salmonella requer uma seqncia de etapas de pr-enriquecimento, enriquecimento seletivo, cultivo em placas de meios seletivos diferenciais, isolamento e identificao bioqumica presuntiva e identificao sorolgica. 1. Pr-enriquecimento ou enriquecimento no seletivo: era usado apenas quando analisvamos alimentos que foram submetidos a aquecimento, congelamento e dessecao, ou naqueles alimentos onde se esperava encontrar salmonelas em nmero escasso. Entretanto, atualmente, este procedimento usado para todos os tipos de alimentos considerando que esta etapa reduz qualquer efeito que o prprio alimento possa exercer sobre a seletividade dos caldos de enriquecimento. Os meios lquidos usados no prenriquecimento (por ex.; o caldo peptonado tamponado modificado para salmonela, os caldos nutritivos e caldo lactosado) no possuem inibidores e permitem o crescimento da microbiota normal e tambm das salmonelas. Os meios ou o procedimento pode ser modificado com vrias finalidades, sendo s vezes feitas adies para superar as substncias inibidoras que podem estar presentes em determinados alimentos (por ex.; leite em p no caso de anlise de coco). Os alimentos de baixo ou alto pH requerem que o caldo de pr-enriquecimento seja neutralizado aps ter sido preparada a suspenso do alimento. A reidratao lenta de alguns alimentos dessecados pode aumentar a sensibilidade para a deteco de Salmonella. 2. Enriquecimento seletivo: tem por finalidade inibir o crescimento de outros microrganismos presentes no alimento analisado, tais como coliformes, Proteus e Pseudomonas, e por sua vez permite o crescimento das diferentes espcies de salmonela. Isto se consegue atravs
54
UFMT / FANUT / DAN
do emprego de compostos qumicos inibidores (por ex.; corantes, tetrationato, selenito, etc.), da temperatura e da durao da incubao, que permitem que a proporo de salmonelas aumente em nmero, quando comparada a outros microrganismos, de forma que possam ser identificadas em placas de meios seletivos-diferenciais ou mediante outras tcnicas de identificao. Os perodos de incubao recomendados variam de 16-24 horas, e as temperaturas de incubao desde 35 a 43C; a incubao a 41-43C, com freqncia, d como resultado um aumento da deteco das salmonelas, sendo por isso recomendadas pela maior seletividade comprovada. As tcnicas apresentadas pela "Association of Official Analytical Chemists (AOAC), a "American Public Healt Association (APHA), e Food and Drug Administration (FDA) recomendam o uso de pelo menos dois caldos de enriquecimento seletivo, pois a resistncia das salmonelas aos agentes seletivos destes meios varia de cepa para cepa. Os meios mais usados so: caldo Tetrationato (TT), o caldo Selenito Cistina (SC) [AOAC, FDA, ICMSA e ABNT]; o caldo para bactrias Gram-negativas (GN) e o caldo cloreto de magnsio-verde de malaquita de Rappaport-Vassiliadis (RV) [recomendado pela ISO]. O caldo tetrationato recomendado pelo seu alto poder inibitrio proporcionado pelo tetrationato presente no meio base e formado a partir da adio do iodo iodeto (lugol) e verde brilhante adicionado. Para obter maior inibio pode ser adicionado ao meio novobiocina que tem por fim inibir particularmente Proteus e Citrobacter e assim facilitar a utilizao de nutrientes pela Salmonella. O caldo Rappaport-Vassiliadis um meio de maior seletividade decorrente da adio do cloreto de magnsio e do verde de malaquita que so considerados bons inibidores do crescimento de microrganismos normalmente presentes no intestino.
Obs.: Se for utilizado o caldo Rappaport-Vassiliadis modificado (RV), o volume de inculo deve ser dez vezes menor (0,1 ml de caldo de prenriquecimento em 10 ml de caldo RV), porque um inculo muito carregado reduz a capacidade seletiva do meio. 3. Cultivo em placas de meios seletivos diferenciais ou
isolamento seletivo diferencial: a presena de Salmonella observada semeando alquotas a partir dos caldos de enriquecimento seletivo em placas previamente preparadas
54
UFMT / FANUT / DAN
com agar seletivo diferencial, utilizando a tcnica de estria por esgotamento. Como agentes seletivos so empregados os sais biliares, o desoxicolato, o verde brilhante, o bismuto sulfito e os antibiticos. A diferenciao da salmonela de outros microrganismos observada mediante as mudanas de cor que apresentamos corantes e os indicadores de pH que respondem quando h fermentao da lactose ou da sacarose contidas nos meios. Tambm se baseia na produo de H2S a partir da degradao de aminocidos sulfurados ou na descarboxilao da lisina. Os meios mais utilizados incluem: agar Verde Brilhante (BGA) com ou sem sulfodiazina ou sulfopiridina, o agar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD), o agar Bismuto Sulfito (BS), o agar Entrico de Hecktoen (HE), o agar Salmonella Shigella (SS), e mais recentemente o agar Rambach (RBA). Devido diversidade fisiolgica do grupo Salmonella e da microbiota mista existente nos alimentos, nos mtodos de cultivos clssicos esta etapa deve tambm usar dois ou mais destes meios. O substrato nutritivo (peptona, propileno glicol, mistura cromognica, e desoxicolato de sdio) no Agar Rambach capacita as Enterobacteriaceaes para multiplicar imediatamente. O desoxicolato de sdio inibe a microbiota Gram positivas acompanhantes (Staphylococcus aureus, Bacillus cereus) e habilita as espcies de Salmonella para diferenciao de outras bactrias. As cepas caractersticas de salmonela no meio apresentaro colorao vermelha diferenciando-as das cepas de E. coli, de colorao azulesverdeada, Klebsiella azul-violeta e Shigella e Proteus amareladas. O agar Salmonella-Shigella, devido presena de cistina ou cistena proporciona o crescimento de cepas produtoras ou no de H2S, diferenciando-as pela colorao negra quando de reao positiva, ou apresentando uma colorao translcida parecendo gota d'gua por no fermentar a lactose e a sacarose, mantendo um pH alcalino no meio. J as cepas lactose e/ou sacarose positivas vo adquirir uma cor rosa devido ao indicador de pH ser o vermelho neutro, que quando em meio cido toma colorao rosa intensa. OBJETIVO Realizar a deteco de Salmonella sp.em alimentos.
54
UFMT / FANUT / DAN
MATERIAL Banho-maria a 42+/- 0,5C. Na ausncia do banho-maria, pode ser utilizada precariamente a estufa bacteriolgica; Pipetas bacteriolgicas de 1 ml com graduao decimal; Estufa bacteriolgica a 35+/- 1C; Ala de platina; Frasco contendo 225 ml de gua peptonada 1% tamponada estril; gar Rambach (RBA) estril; gar Verde Brilhante (BGA), estril; Caldo Rappaport Vassiliads Caldo Tetrationato em tubos; Soluo de Verde Brilhante a 0,1% (adicional 0,1ml ao caldo TT) Soluo de Lugol (adicional 0,2ml ao caldo TT) gar trplice Acar Ferro (TSI) em tubos; gar Lisina Ferro (LIA) em tubos; Kit para identificao de enterobactrias; Lpis dermogrfico. PREPARO PR
DA AMOSTRA
ENRIQUECIMENTO
Pesar 25g da amostra e diluir em 225ml de gua peptonada tamponada a 1% para proceder ao pr-enriquecimento da soluo, incubando-a a 35+/- 1 C por 24 horas. ENRIQUECIMENTO SELETIVO Transferir pores de 1 ml para dois tubos contendo caldo tetrationato (ao qual se adicionou 0,1 ml da soluo de Verde Brilhante, e 0,2 ml da soluo de Lugol) e 0,1 ml em outros dois contendo caldo Rappaport; Incubar os tubos de caldo Tetrationato e Rappaport em banhomaria a 36C e a 42C.
PLAQUEAMENTO SELETIVO DIFERENCIAL Aps a incubao nos caldos, semear em estrias, em RAMBACH e BGA ,a partir de cada um dos tubos de TT e RV; incubar as placas a 35+/- 1 C e a 42C por 24 horas; Examinar as placas e verificar o desenvolvimento de colnias tpicas:
54
UFMT / FANUT / DAN
Em BGA: Colnias rseas, translcidas, transparentes, podendo ou no apresentar halo rseo; Em RAMBACH: Colnias vermelhas, pequenas. A partir das colnias tpicas selecionadas, repicar em tubos de Agar TSI e LIA Incubar a 35+/- 1C/24 horas; Aps a incubao proceder leitura das culturas: - Em agar TSI a Salmonela tpica apresenta-se com formao de gs, produo de cido (base amarela), produo de H 2S (enegrecimento do local da picada) e superfcie sem alterao da cor do meio; - Em agar LIA a Salmonela tpica se apresenta com uma colorao do meio semelhante do original, tanto na base como na superfcie e produo de H2S (enegrecimento no local da picada); A partir dos tubos de identificao presuntiva, que apresentarem respostas tpicas para salmonelas, pode-se proceder aos testes sorolgicos de aglutinao em lmina, usando, os ati-soros O e H polivalentes. LEITURA DOS RESULTADOS Colnias tpicas em RBA e BGA com quadro caracterstico nos meio de triagem (TSI, LIA) sero consideradas positivas para Salmonella sp. EXPRESSO DOS RESULTADOS Pesquisa de Salmonella sp em 25 g: positiva/negativa. Caractersticas das colnias de Salmonella sp. em outros meios de cultura:
Agar HE. Colnias transparentes, verde-azuladas, com ou sem centro preto. Cepas fortemente produtoras de H2S podem produzir colnias inteiramente negras. Colnias de fermentadores de lactose ou sacarose so de cor salmo e no transparentes. Agar BS. Colnias marrons ou pretas, com ou sem brilho metlico. O meio ao redor das colnias muda gradativamente para a colonizao marrom a preta com o prolongamento de tempo de incubao. *OBSERVAES: As placas devem ser observadas com 24 horas de incubao e, na ausncia de colnias tpicas, novamente observadas com 48 horas ou mais. Diversos estudos tm demonstrado que o meio recm-preparado txico para vrias cepas de Salmonella, sendo recomendvel a estocagem das placas em geladeira por, pelo menos, 5 dias antes do uso. Agar XLD. Colnias transparentes, cor de rosa escuro, com ou sem centro preto. Cepas fortemente produtoras de H2S podem produzir colnias com centro preto grande e brilhante, ou mesmo inteiramente pretas. Colnias de fermentadores de lactose ou sacarose produzem colnias amarelas com ou sem centro preto.
54
UFMT / FANUT / DAN
Diversas cepas de salmonela podem apresentar colnias transparentes amarelas, atpicas com ou sem centro preto.
ESQUEMA DE ANLISE PARA SALMONELLA
54
UFMT / FANUT / DAN
AULA 4 CONTAGEM
DE
ESTAFILOCOCOS COAGULASE POSITIVA
STAPHYLOCOCCUS
AUREUS
Pertencente a famlia Micrococcaceae, estas bactrias tm seu hbitat normal na pele e orofaringe (nariz e garganta) do homem e de outros animais de sangue quente. Uma porcentagem considervel das cepas de estafilococos coagulase positivas capaz de produzir e liberar no alimento uma enterotoxina estafiloccica que, quando ingerida em quantidades suficientes, pode produzir doena no homem. Quando em nmero elevado representa perigo potencial de causar toxinfeco alimentar ao consumidor, sendo por isso um indicador de risco sade pblica, j que vrias pesquisas demonstram que a presena de um nmero relativamente alto de estafilococos enterotoxgenos no alimento uma boa evidncia circunstancial de que o alimento j contm toxina estafiloccica. A determinao do S. aureus feita utilizando meios seletivos diferenciais como o Baird Parker (BPA) e o Vogel Johnson (VJA), pela tcnica de semeadura em superfcie para diferenciao de cepas caractersticas, utilizando alquotas de 0,1 a 0,2 ml das diluies decimais selecionadas. Aps a incubao a 36 1C por 48h, as colnias caractersticas so isoladas em Agar nutriente (AN) para realizao da prova de coagulase, alm das provas de catalase e colorao de Gram. Provas complementares como DNAse, fosfatase, termonuclease e glicose O-F, podem tambm serem realizadas para comprovao. Entretanto a prova de coagulase tida como fundamental para elucidao de risco. O agar de Baird-Parker um meio seletivo e diferencial para estafilococos em alimentos e materiais farmacuticos, segundo BAIRDPARKER (1962). um meio de cultivo contendo cloreto de ltio e telurito para inibio da microbiota acompanhante, e piruvato e glicocola que atuam favorecendo o crescimento dos estafilococos. Aps o preparo e esterilizao do meio base acrescida uma soluo de gema de ovo, que vai favorecer o diagnstico pelas suas caractersticas de liplise e protelise (degradao das lipoprotenas da gema do ovo), atravs da produo de um halo esbranquiado prximo ao centro de colorao negra devido a reduo do telurito a telureto, alm de apresentar uma zona de transparncia mais distal, devido a degradao da lecitina presente na gema do ovo, denominada de zona de lecitinase. Estas reaes com a gema de ovo e a reduo do telurito apresentam um notvel paralelismo com a reao de coagulase positiva, caracterstica dos estafilococos patognicos, e por isso so usadas como ndice de possvel produo de enterotoxina estafiloccica. Entretanto, para uma demonstrao direta de estafilococos coagulase positivas recomendada a incorporao ao meio de cultivo de plasma
54
UFMT / FANUT / DAN
sanguneo em lugar da gema de ovo, alm da utilizao de provas complementares de Gram, Catalase e Coagulase. O significado e interpretao desta bactria pode ser duplo. Quando em quantidades inferiores a 103/g significa condies higinico-sanitrias e/ou de processamento inadequadas por se tratar de uma bactria procedente de manipulao perigosa e, mais raramente, da microbiota superficial de outros animais, alm de que, quando em nmero reduzido, no so capazes de produzir toxina, a no ser que sejam dadas condies de multiplicao. Em quantidades prximas a dose infectiva (103-104) significa risco epidemiolgico e >105, risco sade pblica, j que esta dose est associada produo de enterotoxina.
CONTAGEM
DE
ESTAFILOCOCOS COAGULASE POSITIVA
OBJETIVO Realizar a contagem de Estafilococos coagulase positiva pelo mtodo de plaqueamento em superfcie. MATERIAL Estufa bacteriolgica a 35+/- 1C; Ala de Platina ou Nquel-Cromo n. 25 em cabo de Kolle; Microscpio; Pipetas bacteriolgicas de 1 ml com graduao decimal; Soluo salina peptonada 0,1%; gar Nutriente inclinado em tubos; gar Baird-Parker em placas; Basto de vidro em L ou ala de Drigalski; gua oxigenada 10 volumes; Tubos estreis 12 x 120 mm; Reagentes para colorao de Gram (Lugol, Fucsina, Violeta de Genciana, lcool); Plasma de coelho citratado; Lmina de microscpio PREPARO
DA AMOSTRA
Pesar 25g de amostra no saco plstico estril e adicionar os 225ml de soluo salina peptonada. Colocar o saco plstico no homogeneizador durante 30-60 seg. obtendo assim uma diluio 10 1 .
54
UFMT / FANUT / DAN
Inocular 1ml do homogeneizado no 1 tubo de SSP (diluio 10 2 ) e aps agitao no vortex, inocular 1ml da diluio 10 2 no 2 tubo (diluio 10 3). Semear 0,1 ou 0,2 ml de cada diluio preparada na superfcie do gar Baird-Parker, espalhando em toda superfcie o material semeado, com auxlio do basto de vidro em L ou ala de Drigalski. Aguardar a secagem, inverter a placa e incubar a 36 + 1C por 24/48 horas. Verificar o desenvolvimento de colnias tpicas: so colnias de bordos regulares, pretas, brilhantes, com dimetro normalmente circundadas por 2 halos, um mais extenso, e transparente e outro menos extenso, opaco, e mais prximo da colnia; Selecionar para contagem placas que contenham entre 20 a 200 colnias. No caso da menor diluio semeada conter um nmero de colnias com aparncia de S. aureus menor que 20, utiliz-la para a contagem. Isolar para a confirmao 3 colnias tpicas e 3 colnias atpicas em tubos contendo Agar Nutriente inclinado. Caso haja apenas um tipo de colnia, isolar 5 colnias. Incubar os tubos de Agar Nutrientes a 36+ 1C/24 horas. A partir da cultura obtida em Agar Nutriente, proceder ao teste de catalase, de coagulase e examinar ao microscpio, pela colorao de Gram; ESTAFILOCOCOS
COAGULASE POSITIVA
54
UFMT / FANUT / DAN
TCNICAS
DE MICROSCOPIA
- COLORAO
DE
GRAM
PREPARO DA LMINA a) colocar uma gota de gua destilada em uma lmina bem limpa
54
UFMT / FANUT / DAN
b) com a ala de inoculao previamente esterilizada em chama, retirar uma amostra de uma colnia bem isolada c) misturar o material com a gua destilada d) fixar utilizando o calor, aquecendo suavemente a lmina no bico de Bunsen at secar totalmente.
Aps preparar a lmina, realizar a colorao: a) 1 minuto em cristal violeta b) lavar em gua destilada c) 1 minuto em lugol d) descolorir com lcool 95GL e) lavar com gua destilada f) 1 minuto em safranina g) lavar com gua corrente h) secar suavemente com papel de filtro PRINCPIO DO MTODO O mtodo baseia-se nas diferenas estruturais da parede celular das diferentes bactrias. PAREDE CELULAR DE BACTRIAS GRAM POSITIVAS: Muitas camadas de peptidioglicano, parede espessa e rgida, com cido teicico. PAREDE CELULAR DE BACTRIAS GRAM NEGATIVAS: Uma ou mais camadas de peptideoglicano, sem cido teicico, com uma membrana externa de lipoprotenas, lipopolissacardeos e fosfolipdeo.
54
UFMT / FANUT / DAN
Parede celular de bactrias Gram positivas bactrias Gram negativas
Parede
celular
de
Ao colorir com o cristal violeta, as paredes de Gram positivas e negativas adquirem colorao violeta. O lugol forma o complexo cristal violeta-iodo. Com a adio do lcool, a parede das bactrias Gram positivas desidrata, os poros contraem e o complexo CV-I no retirado, ou seja, a clula continua apresentando cor violeta, verificada pelo contraste com safranina Nas bactrias Gram negativas, a adio do lcool faz com que haja uma extrao das substncias lipdicas, aumentando a porosidade e descorando a clula pela eliminao do complexo CV-I. No contraste com safranina, ir apresentar colorao rosa. OBSERVAO AO MICROSCPIO Quando a lmina estiver seca, colocar uma gota de leo e observar com a objetiva de imerso. Aps utilizar a objetiva de imerso, limpar com xilol. Bactrias Gram positivas: cor violeta Bactrias Gram negativas: cor rosa (descoradas) OBSERVAES Anotar as observaes realizadas em relao cor das clulas, sua disposio (isoladas ou em grupos) e forma. ATENO: bactrias Gram positivas podem apresentar-se como Gram negativas dependendo de situaes como: idade do cultivo (cultivos velhos no retm o cristal violeta, mas tingem com safranina, parecendo Gram negativas), modificaes na execuo da tcnica. TESTE DE CATALASE: Transferir 1 gota de gua oxigenada 10 vol. para uma lmina de vidro; Transferir para a gota de perxido de hidrognio (H2O2) uma poro de cultura pura obtida do Agar Nutriente;
54
UFMT / FANUT / DAN
O teste positivo ser evidenciado pela formao de bolhas na superfcie de gota, ou seja, ocorre quebra da molcula de H 2O2 pela presena da enzima catalase, com liberao de oxignio e gua. O S. aureus catalase positiva. TESTE DE COAGULASE: A partir da cultura obtida no caldo de infuso de crebro e corao proceder prova de coagulase. Transferir 0,3 ml da cultura, para tubos estreis de 12 x 120 mm e acrescentar 0,5 ml de plasma, incubando a 35+/- 1C por 4 a 6 horas; Aps a incubao verificar a presena de cogulo distinto, firme e compacto, indicando a presena de coagulase; O S. aureus coagulase positiva. OBTENO DOS RESULTADOS: As colnias que se mostrem cocos gram positivos e sejam catalase e coagulase positivas sero contadas como S. aureus. O resultado final ser calculado em funo do nmero de colnias confirmadas em relao proporcional ao nmero de colnias submetidas confirmao. Calcular o nmero de colnia de S. aureus por grama de alimento levando em considerao a diluio e a alquota semeada. CLCULO
DA CONTAGEM DE
S.
AUREUS NA PLACA:
onde: S = contagem de S. aureus; n = total de colnias tpicas na placa; I = total de colnias isoladas para confirmao; N = nmero total de colnias confirmadas. CLCULO
DA CONTAGEM DE
S.
AUREUS POR GRAMA:
onde: D = fator de diluio; A = fator de correo da alquota para 0,1 ml, sendo: 0,1ml = 10
54
UFMT / FANUT / DAN
0,2ml = 5 0.5ml = 2
CONTAGEM
DE
CLOSTRIDIUM
PERFRINGENS
CARACTERSTICAS DO MICRORGANISMO. Clostridium perfringens um bacilo Gram (+), anaerbio, esporulado, apresenta cpsula e imvel. Produz uma srie de protenas biologicamente ativas, algumas com atividade txica e outras com atividade enzimtica. De acordo com a produo das quatro toxinas extracelulares mais importantes (toxinas alfa, beta, epsilon e iota), as cepas de C. perfringens so classificadas em cinco tipos : A, B. C, D e E. Todos os cinco tipos produzem a toxina alfa, que tem atividade fosfolipsica (lectinase) e hemoltica. A toxina beta produzida por C.perfringens dos tipos B e C, a toxina epsilom por C. perfringens tipos B e D e a toxina iota produzida somente pelo tipo E. Os tipos A, C, e D so tambm produtores de enterotoxina, mas quase todos os casos descritos de toxinfeco alimentar por este microrganismo foram causados por cepas do tipo A. C. perfringens tem intensa atividade metablica em alimentos. capaz de produzir uma grande variedade de enzimas hidrolticas extracelulares, incluindo colagenase, hialuronidase, desoxirribonuclease, lecitinase, proteases que hidrolisam casena e gelatina. tambm capaz de fermentar um grande nmero de carboidratos (glicose, lactose, frutose, galactose, maltose, inositol, manose, amido, sacarose). Durante a fermentao h intensa produo de gs (H2 e CO2) e de produtos finais cidos. Para sua multiplicao, imprescindvel a presena de vitaminas e de nucleotdeos. Uma das caractersticas mais importantes de C.perfringens sua capacidade de multiplicao em temperatura alta, estando a temperatura tima entre 40 e 45 C. O tempo de gerao de 7,1 minutos a 41oC um dos menores entre as bactrias de interesse em alimentos. A temperatura mnima e mxima para multiplicao, relatadas na literatura de 15C e 51,7C, respectivamente. No entanto, para esporulao, a temperatura tima fica entre 35oC e 40oC. Embora C.prefringens no seja considerado um microrganismo anaerbio estrito, o crescimento inicial dependente do potencial de
54
UFMT / FANUT / DAN
oxido-reduo. O valor timo para multiplicao est em torno de 200mV. Clostridium perfringens responsvel por dois tipos diferentes de toxinfeco alimentar. Cepas do tipo A causam a intoxicao alimentar na forma clssica e as do tipo C causam a enterite necrtica, bem mais grave. Os sintomas de intoxicao alimentar por C.perfringens do tipo A so dores abdominais agudas, diarria com nuseas e febre, sendo os vmitos raros. Os sintomas aparecem mais freqentemente entre 8 e 12 horas aps a ingesto de alimentos contendo nmero elevado de clulas (106 a 107 clulas por grama de alimento ou mais) e a durao dos sintomas freqentemente de 12 a 24 horas. Normalmente, esta intoxicao alimentar branda, raramente causando a morte dos indivduos afetados. Entretanto, a ocorrncia desta intoxicao muito comum, em todas as partes do mundo. A enterite necrtica, causada por C.prefringens tipo C, rara. Os sintomas so dores abdominais agudas muito intensas, diarria sanguinolenta, algumas vezes vmitos, e inflamao necrtica do intestino delgado, sendo freqentemente fatal. Os casos descritos na literatura tm sido associados ao consumo de carne de porco mal cozida. Em muitos pases, C. perfringens o agente etiolgico mais freqentemente isolado em surtos. Uma caracterstica curiosa dos surtos por C. perfringens que na maioria dos casos relatados o nmero de indivduos afetados alto. Isto certamente devido ao fato de os surtos por C. perfringens serem causados pelo consumo de alimentos preparados em grandes quantidades e consumidos vrias horas aps. Neste perodo, o microrganismo se multiplica nos alimentos quando mantidos em temperatura inadequada (em estufas ou temperatura ambiente), em vez de serem refrigerados. Mesmo quando refrigerados, o frio pode demorar a alcanar o interior dos produtos, devido ao seu grande volume e a multiplicao existe. Nestes casos, h intensa atividade metablica e aumento da velocidade de multiplicao, a populao de C. perfringens, nestas condies, eleva-se rapidamente para 105-106 clulas ou mais por grama de produto, necessrias para causar doenas no homem. Os alimentos base de carne bovina e de carne de frango tm sido os principais causadores de intoxicao alimentar por C. perfringens. A maioria dos surtos relatados associada alimentao em estabelecimentos institucionais (restaurante, hospitais, fbricas, escolas, etc.)
54
UFMT / FANUT / DAN
CONTAGEM
DE
CLOSTRDIOS
SULFITO REDUTORES
OBJETIVO Realizar a contagem de Clostridios sulfito redutores pelo mtodo de plaqueamento em profundidade e incubao em anaerobiose. MATERIAL Estufa bacteriolgica a 46 1C; Pipetas bacteriolgicas de 1 ml com graduao decimal; Soluo salina peptonada 0,1%; gar Nutriente inclinado em tubos; gar Sulfato de Polimixina Sulfodiazina Sdica (SPS) em placas; Jarra de anaerobiose; Gerador de anaerobiose e indicador de anaerobiose;
PREPARO
DA AMOSTRA
Pesar 25g de amostra no saco plstico estril e adicionar os 225ml de soluo salina peptonada. Colocar o saco plstico no homogeneizador durante 30-60 seg. obtendo assim uma diluio 10 1 . Inocular 1ml do homogeneizado no 1 tubo de SSP (diluio 10 2 ) e aps agitao no vortex, inocular 1ml da diluio 10 2 no 2 tubo (diluio 10 3). Inocular 1ml em placas estreis vazias, em duplicata, para cada diluio realizada. Adicionar o Agar SPS temperatura de 38C e homogeneizar com movimentos em forma de oito em superfcie plana. Aguardar solidificar e adicionar uma sobrecamada de Agar nas placas, para facilitar a gerao de anaerobiose. Colocar as placas invertidas dentro de uma jarra de anaerobiose, adicionar o gerador de anaerobiose preparado conforme instrues do fabricante e o indicador de anaerobiose, fechar a jarra e incubar a 46C durante 48h. LEITURA DOS RESULTADOS Selecionar placas com 30 a 300 colnias e contar apenas as colnias pretas, tpicas de clostrdios sulfito redutores
54
UFMT / FANUT / DAN
EXPRESSO
DOS RESULTADOS
Calcular o nmero de Unidade Formadora de Colnia (UFC) por grama do produto:

Obs.: Para contagens em duplicata, na obteno dos resultados, utilizar a mdia das contagens nas placas que apresentarem entre 30 e 300 colnias. Demais casos seguir a regra do Anexo: Normas para Interpretao e Expresso de Resultados para Contagem em Placas.
SISTEMA DE INCUBAO DE ANAEROBIOSE (JARRAS DE ANAEROBIOSE SEGUNDO GSPAK) A jarra de anaerobiose feita de vidro ou plstico transparente com capacidade de 1,5 litros, ou 8 placas de Petri descartveis, que devem ser colocadas junto com o gerador e indicador de anaerobiose, no interior da jarra. Sistemas geradores de anaerobiose disponveis: GsPak Anaerobiose Systcm (BBL 7004) Anaerocul A (MERCK 13829) Gs Generating Kit (OXOIO BR 38 Anaerobac (pROBAC) INSTRUO PARA USO comercialmente
54
UFMT / FANUT / DAN
1 - Colocar as placas de Petri inoculadas no suporte de metal no interior da jarra de anaerobiose, deixando um espao de, pelo menos, 5cm em entre a ltima placa e a tampa da jarra. 2 - Destacar o papel alumnio que cobre a fita indicadora de anaerobiose, a qual dever apresentar cor azul (indicador azul de metileno) ou rosa (resazurina), e coloc-la voltada para o lado de fora da jarra. No caso do ANAEROBAC a fita indicadora j vem acoplada placa contendo o gerador de anaerobiose como mostra a figura abaixo.
3- Destacar o papel alumnio que cobre o envelope gerador de anaerobiose e distribuir 10ml de gua destilada dentro do envelope. No caso de placas do ANAEROBAC distribuir 20ml na superfcie da placa.
4 - Colocar o gerador de anaerobiose na parte lateral do suporte de metal (ou sobre a ltima placa com a parte mida para cima, no caso
54
UFMT / FANUT / DAN
do AEROBACTER) da jarra em posio vertical.
5- Ao colocar a tampa de metal, esta deve estar centrada, de forma que o parafuso a ser atarrachado entre na depresso circular existente no centro da tampa. Atarrache totalmente o parafuso garantindo assim a perfeita vedao do sistema. 6 - Fechar a Jarra e coloc-la na estufa a 43- 46C por 24-48horas, e visualizar o crescimento de colnias negras caractersticas. 7 - Realizar a contagem e determinar o nmero de UFC/ g ou mI do produto. OBSERVAES: No final da incubao a fita indicadora dever estar branca e virar para azul (ou rosa de acordo com o indicador de anaerobiose) quando a jarra for aberta. Preste ateno no fechamento hermtico da jarra. Fracassos no funcionamento do sistema so devidos falta de vedao da jarra incubadora, por inadequada manipulao da mesma. Verifique se a jarra no necessita de catalisadores. Caso seja necessrio, providencie e verifique a data de sua validade e conservao. Os catalisadores devem ser conservados em lugares secos e frescos.
Bacillus cereus
O Bacillus cereus est includo na classificao dos bacilos do Grupo I definidos por terem um esporngio que no est deformado pelo esporo. Dentro do grupo feita a diviso em espcies com base no dimetro da clula. Nas espcies de clulas grandes, onde esto
54
UFMT / FANUT / DAN
includos, os B. cereus com dimetro 9 m. Os demais bacilos grandes deste grupo so B. megaterium, B. anthracis, B. mycoides e B. thuringiensis (Vasconcellos e Rabinovitch, 1995; ICMSF, 1996; Helgason et al., 2000; Kim et al., 2000). So bastonetes longos, Gram positivos, esporulados, aerbios facultativos, com motilidade variada, produtores de toxina. Crescem na faixa de temperatura entre 10 e 40C, tendo timo de 30C, uma atividade de gua mnima entre 0,92 0,95 e faixa de pH para crescimento entre 4,9 e 9,3. O Bacillus cereus encontra-se bastante difundido na natureza, sendo isolado com facilidade do solo, poeira, gua doce e sedimentos, hortalias, gros e cereais, e do plo dos animais. Conseqentemente, no surpreendente encontr-los no interior ou superfcie de praticamente todos os produtos agrcolas e em muitos alimentos naturais frescos, secos ou tratados industrialmente (Mossell e Garcia, 1983; Frazier, 1985; Harmon e Kautter, 1991; Fermanian et al., 1994; Jay, 1994; Vasconjcellos e Rabinovitch, 1995; ICMSF, 1996; Notermans e Batt, 1998; Helgason et al., 2000; Kim et al., 2000). Trabalhos citados revelam que a incidncia de B. cereus em alimentos muito alta, estando presentes em 52% de 1546 ingredientes alimentcios analisados, 44% de 1911 pratos de cremes e sobremesas, 52% de 431 produtos crneos e vegetais, alm de ser um contaminante freqente do leite e produtos lcteos, especialmente leite em p integral e desnatado, e inclusive leite submetido ao tratamento UHT (48%) (Gilbert et al., 1974; Delazari et al. 1978; Rodriquez e Barret, 1986; Beecker et al., 1994; Fermanian et al., 1994; ICMSF, 1996; Kim, et al., 2000). De acordo com Notermans e Batt (1998) todo tipo de alimento no qual o B. cereus for isolado e onde o manuseio ou o armazenamento permitiu sua multiplicao, deve ser considerado veculo potencial para toxinfeco alimentar. Uma avaliao da doseresposta deve ser efetuada se os dados epidemiolgicos estiverem disponveis para caracterizao do perigo e prov uma estimativa da natureza, da severidade e da durao dos efeitos adversos associados ao consumo do B. cereus e suas toxinas. Devido sua estabilidade, deve ser considerado como um agente perigoso quando encontrado no alimento. A caracterizao de perigo envolve uma avaliao qualitativa e/ou quantitativa da natureza dos efeitos adversos associados com o B. cereus e suas toxinas. Em circunstncias normais, o B. cereus encontra-se nos alimentos em concentraes <103 g-1 e quase sempre <102 g-1. Nesses ndices o organismo pode ser considerado incuo j que a
54
UFMT / FANUT / DAN
concentrao mnima necessria para causar enfermidade estimada em >105g-1 (Hobbs e Gilbert, 1974; ICMSF, 1996). De acordo com Rodriguez e Barrett (1986) quando o B. cereus est presente em pequeno nmero no produto, pode dificultar a sua deteco entre a microbiota normal. Entretanto, este nmero pode ser suficiente para eventual proliferao e produo de toxina no produto. Segundo Charni et al. (2000) impossvel para a indstria de alimentos excluir o B. cereus de seus produtos, pois como demonstram vrios estudos, os esporos de B. cereus podem sobreviver ao processamento trmico e assim crescerem em alimentos sob condies de refrigerao (Gilbert et al. 1974; Rodriguez e Barrett, 1986; Fermanian et al.,1994; Mahakarnchanakul e Beuchat, 1999). Certas cepas podem crescer em temperaturas to baixas quanto 4-6C (Charni et al., 2000). A variao na dose infecciosa calculada varia de 1x103 at 1x1010 g-1 de B .cereus de alimento, com um valor 7 -1 mediano de 1x10 g (Notermans e Batt, 1998). Esta grande variao tem uma relao valiosa com a dose-resposta e sua grande estabilidade. A taxa de exposio mostra que freqentemente os seres humanos esto expostos a altos nmeros de B. cereus. Ainda segundo os autores, doses presentes nos alimentos de 1x104 de B. cereus g-1 do produto devem ser consideradas como perigosas. A patogenicidade do B. cereus indicada pela presena de uma enterotoxina, embora trs fatores extracelulares produzidos pela bactria, como a fosfolipase, hemolisina e uma toxina letal a ratos, estejam associados produo de toxinfeco. Sua presena pode indicar contaminao de matrias-primas, bem como condies inadequadas de conservao, relacionadas temperatura (Notermans e Batt, 1998). Os meios contendo gema de ovo e polimixina so indicados para seu isolamento uma vez que poucos microrganismos produzem reaes parecidas s produzidas pelo B. cereus. Ele tido como resistente a certas concentraes de Polimixina B que so eficientes para inibio da flora acompanhante. Suas cepas produzem lecitinase degradando produtos insolveis da lecitina presentes na gema de ovo que se acumulam em volta das colnias formando um precipitado branco caracterstico. Em muitas colnias esta reao se apresenta precocemente de forma que com freqncia possvel fazer uma identificao rpida, inclusive antes que eventuais cepas polimixinaresistentes acompanhantes alcancem pleno desenvolvimento. Os meios mais usados so o Agar manitol vermelho de fenol - gema de ovo com polimixina B (MYP) segundo Mossel et al. (1967), ou o Agar
54
UFMT / FANUT / DAN
polimixina-piruvato gema de ovo-manitol azul de bromotimol (PEMPA) segundo Holbrook e Anderson (1980) e ICMSF (1996). Vasconcellos e Rabinovitch (1995) descreveram uma nova frmula para um meio de cultura seletivo/indicador, sem antibitico, para ser usados na quantificao de B. cereus, comparando ao meio tradicional de Mossel (MYP). Os autores consideraram que o meio oferece duas vantagens distintas: (1) no requer o uso de antibiticos tais como a polimixina B e (2) possui complexidade reduzida em termo de produo no laboratrio. Os mtodos convencionais para a identificao de B. cereus consistem de testes bioqumicos e anlises microscpicas da morfologia da clula necessria principalmente para a diferenciao do B. thuringiensis que tem caractersticas bioqumicas similares. Provas bioqumicas como testes VP, reduo de nitrato, prova de liquefao de gelatina, prova do leite tornassol, fermentao da lactose, entre outras, so utilizadas na sua identificao presuntiva, seguida de confirmao pela presena de toxinas (McFadim, 1974; ICMSF, 1983; Mossel e Garcia, 1983; ICMSF, 1996; Silva et al., 1997). Dois kits comerciais produzidos para identificao de B. cereus so citados por Kim et al. (2000). O kit TECRA VIA (International Bioproduct, Inc., Remond, Wash) e o kit BCET-RPLA (Oxoid Ltda., Basingstoke, United Kingdom). O primeiro especfico para uma protena 45-Kda dos trs componentes no hemolticos da enterotoxina, enquanto o Kit BCET-RPLA especfico para a protena L2 dos trs componentes hemolisina.
ESQUEMA DE ANLISE PARA Bacillus cereus 1. Preparo da amostra 25g de amostra + 225ml Soluo Salina Peptonada (SSP) 0,1%
54
UFMT / FANUT / DAN
1ml
1ml
10-1
10-2
10-3
Plaqueamento seletivo diferencial 0,1 ou 0,2ml Espalhar com ala de Drigausky
35C/2448h
Universidade Federal de Mato Grosso Faculdade de Nutrio

______________________________________________________________________
LAUDO DE ANLISE
LAUDO N: DATA DE RECEBIMENTO DA AMOSTRA: SOLICITANTE DA AMOSTRA: FABRICANTE: ENDEREO DO FABRICANTE: NATUREZA DA AMOSTRA: MARCA: DATA DE FABRICAO: HORA:
TC: UNIDADES AMOSTRADAS: DATA DE VALIDADE:
CARACTERSTICAS ORGANOLPTICAS ASPECTO: No caracterstico COR: No caracterstico ODOR: Caracterstico
54
UFMT / FANUT / DAN
CARACTERSTICAS MICROBIOLGICAS PARMETROS MICROBIOLGICOS RESULTADOS NMP/COLIFORMES AMBIENTAIS NMP/ COLIFORMES (45C) 2400 NMP/ml 2400 NMP/ml
CONDIES INTERPRETATIVAS: De acordo com Resoluo RDC N.12/jan./2001. Item 17 alnea h o produto analisado atende s exigncias, se encontrando em condies higinico-sanitrias adequadas.
BASE INTERPRETATIVA: ANVISA SECRETARIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA MS BRASIL, Resoluo RDC N.12/jan./2001.
CUIAB_____de____________________de________ ______________________________ RESPONSVEL TCNICO ______________________________ RESPONSVEL TCNICO
OOR/2010
54

Apostila Microbiologia - Prática2010

Enviado por

Dados do documento

Título original

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Apostila Microbiologia - Prática2010

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Universidade Federal de Mato Grosso Faculdade de Nutrio Departamento de Alimentos e Nutrio

UFMT / FANUT / DAN

BIOSEGURANA - Normas de Higiene e de Ordem Pessoal

Guarde materiais de uso pessoal (bolsas, livros, cadernos, etc.)

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

- Formao de substncias ou compostos: citrato de ferro, sais amoniacais.

SUBSTNCIAS INDICADORAS EM MICROBIOLOGIA

Quadro 1 - Reaes de indicadores de pH e de corantes presentes em meios de cultura

REPARO DE MATERIAL DE LABORATRIO PARA ANLISES MICROBIOLGICAS

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

COLETA, TRANSPORTE, ESTOCAGEM E PREPARO ANLISE

UFMT / FANUT / DAN

1.1. Coleta de amostras de alimentos em embalagens

UFMT / FANUT / DAN

Coletas de alimentos toxinfeces alimentares.

a) Coletar e analisar o mais rpido possvel.

1.4. Coleta de amostras de gua.

UFMT / FANUT / DAN

a) As amostras de produtos facilmente alterveis e os alimentos

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

Realizao das diluies seriadas

3.3.1. Preparo da Diluio 10-1

UFMT / FANUT / DAN

Demais Diluies seriadas

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

AULA 2 PREPARO E ESTERILIZAO

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

AULA 2 - CONTAGEM PADRO

UFMT / FANUT / DAN

AERBIOS MESFILOS - CPP

UFMT / FANUT / DAN

BACTRIAS AERBIAS PSICROTRFILAS

BACTRIAS AERBIAS TERMFILAS

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

COLIFORMES A 35C, ESCHERICHIA COLI.

DO GRUPO COLIFORMES TOTAIS

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

COLIFORMES A 35C, A 45C ESCHERICHIA COLI.

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

a) O NMP calculado atravs

UFMT / FANUT / DAN

UFMT / FANUT / DAN

CUIAB_dede RESPONSVEL TCNICO ________________ RESPONSVEL TCNICO