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FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA V2

FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA V2

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Sections

  • FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
  • Microbiologia Básica
  • Leveduras
  • Morfologia da célula
  • Forma da célula
  • Tamanho da célula
  • Estrutura da célula
  • Parede celular
  • Membrana citoplasmática ou Plasmalema
  • Núcleo
  • Vacúolos
  • Mitocôndria
  • Citoplasma
  • Cápsulas
  • Reprodução
  • Reprodução vegetativa
  • Reprodução por esporos
  • Fissão
  • Leveduras contaminantes ou nativas
  • Fisiologia, metabolismo oxidativo e fermentativo das leveduras
  • Nutrição e crescimento das leveduras
  • Bactérias
  • Morfologia das células bacterianas
  • Forma das bactérias
  • Dimensões da célula bacteriana
  • Estrutura bacteriana
  • Membrana citoplasmática ou protoplasmática
  • Material celular
  • Flagelos
  • Reprodução bacteriana
  • Ciclo normal de crescimento da cultura bacteriana
  • Caracterização e Classificação dos Microrganismos
  • Classificação em Nível de Gênero
  • Classificação em Nível de Espécie
  • Grupos Relevantes em Usinas de Açúcar e Álcool
  • Estudo do fenômeno da floculação
  • Medida da Floculação
  • Monitoramento e interpretação dos dados do laboratório
  • Tabela para interpretação das análises laboratoriais
  • Procedimentos
  • Fatores que afetam o desempenho fermentativo
  • Glicerol
  • Ácido succínico
  • Ácido acético
  • Biomassa
  • Estequiometria da fermentação
  • Carboidratos de reserva
  • Espécie de levedura
  • Identificação de leveduras pela técnica da cariotipagem
  • Permanência de leveduras tradicionais no processo fermentativo
  • Seleção de linhagens para fermentação industrial
  • Nutrição mineral da levedura
  • Principais nutrientes e suas funções
  • Potássio
  • Magnésio
  • Cálcio
  • Zinco
  • Manganês
  • Ferro
  • Cobre
  • Molibidenio, Cobalto e Boro
  • Nitrogênio
  • Fósforo
  • Enxofre
  • Inibidores da fermentação
  • Alumínio
  • Sulfito
  • Temperatura
  • pH
  • Contaminação bacteriana
  • MATÉRIAS-PRIMAS PARA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
  • Caldo: composição, pré-tratamento, controle de qualidade
  • Composição
  • Pré-tratamento do caldo
  • Processos de tratamento
  • Processo de tratamento do caldo para destilaria – 1
  • Processo de tratamento do caldo para destilaria – 2
  • Processo de tratamento do caldo para destilaria – 3
  • Processo de tratamento do caldo para destilaria – 4
  • Controle de qualidade do caldo
  • Mel final: composição, armazenamento e controle de qualidade
  • Armazenamento
  • Controle de qualidade
  • CONTROLE MICROBIOLÓGICO – MICROSCOPIA
  • Microscópio ótico
  • Parte mecânica
  • Parte Óptica
  • Recomendações para uso do microscópio ótico
  • Antes de iniciar o uso
  • Ajuste da Dioptria
  • Manutenção do equipamento
  • Método de determinação da viabilidade celular de leveduras
  • Especificações da câmara de NEUBAUER
  • Preparo das soluções
  • Solução estoque de Eritrosina
  • Tampão Fosfato
  • Solução de trabalho
  • Procedimento analítico
  • Cálculos
  • Viabilidade celular
  • Contagem de células em brotamento
  • População de Leveduras
  • Exercícios
  • Método para contagem de bactérias ao microscópio ótico
  • Solução A - sulfato azul de nilo - 2,0%
  • Solução B - azul de metileno - 0,20%
  • Amostras de caldos, PCTS, primário e misto
  • Amostras de vinho bruto e levedo tratado
  • Teste de Gram
  • Solução de cristal violeta
  • Solução de iodo-lugol
  • Para Microrganismos em Suspensão Líquida
  • Para Microrganismos de Cultivos Sólidos
  • Técnica de Coloração
  • Interpretação
  • Quantificação
  • Detecção de esporos
  • Solução de verde malaquita
  • Solução de safranina
  • Interpretação/Quantificação dos Esporos
  • Teste de Floculação
  • Teste de sensibilidade de bactérias aos antibióticos, através da
  • Solução estoque de actidiona (inibidor de leveduras)
  • Solução estoque de Antimicrobianos
  • Determinação da acidez
  • Determinação da acidez sulfúrica (inicial e final) das amostras
  • Cálculo
  • Interpretação dos resultados
  • Exemplo
  • Preparo das Soluções Estoque
  • Meios de Cultivo
  • Meio de Cultivo (Mayeux & Colmer, 1961)
  • Meio de Cultivo ( GLT)
  • Preparo do Inóculo
  • Realização do Teste
  • Leitura da Densidade Óptica ( D. O . )
  • Interpretação dos Resultados
  • Equipamentos
  • Vidraria
  • Reagentes
  • Outros
  • Pipetadores automáticos
  • Modelos de boletim para o controle microbiológico por
  • Matéria-prima
  • Moenda
  • Fermentação
  • CONTROLE MICROBIOLÓGICO – PLAQUEAMENTO
  • Introdução
  • Esterilização
  • Esterilização por Calor Úmido - Autoclave
  • Constituição da Autoclave
  • Operação da autoclave
  • Esterilização por Calor Seco
  • Esterilização por calor seco – Estufa
  • 2.1.2 Operação da estufa
  • Esterilização por Filtração
  • MEIOS de CULTIVO
  • Plate Count Agar (P C A - Agar Padrão) – Bactérias Aeróbios
  • Ágar- Man, Rogosa & Sharpe (MRSA) - Bactérias Lácticas
  • Extrato de Levedura- Peptona- Dextrose - Ágar (YEPD + A) –
  • Meio – Mayeux & Colmer – Teste de Sensibilidade
  • Meio de Cultivo G. L .T. – Teste de Sensibilidade
  • Diluição em série
  • Técnica de plaqueamento
  • Cálculo do número UFC/ml
  • Plaqueamento de Superfície (Método “Spread Plate”)
  • Cálculo do número de UFC/ml
  • Avaliação da População Microbiana por Filtração em
  • Cultivo por Estrias
  • Cultivo em PetriFilm®
  • OUTRAS ANÁLISES
  • Avaliação da Floculação da Levedura
  • Procedimento Analítico
  • FLOCULAÇÃO DAS CÉLULAS DE LEVEDURAS
  • Floculação da levedura pela bactéria Lactobacillus fermentum
  • Aspectos gerais
  • Aspectos genéticos
  • Ação de íons
  • Aspectos físico-químicos
  • Aspectos químicos
  • Mecanismos de floculação
  • Hidrofobicidade celular
  • Ligação tipo-lectina
  • Reconciliação dos dois mecanismos
  • Cofloculação levedura-bactéria
  • Ação de bactérias
  • Considerações importantes
  • ÁCIDO LÁTICO
  • Produção de ácidos por microrganismos
  • Histórico
  • Considerações Gerais
  • Bactérias láticas
  • Requerimentos nutricionais
  • Características da colônia
  • Tolerância à acidez:
  • Padrões de fermentação de carboidratos em bactérias láticas
  • Bactérias homofermentativas
  • Bactérias heterofermentativas
  • Principais bactérias láticas
  • TIPOS DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
  • Fermentação descontínua ou batelada
  • Condução da fermentação
  • Providencias preliminar para partida
  • Partida e sistemas de partida
  • Partida com tubo de cultura pura
  • Partida com leite de fermento selecionado
  • Partida com fermento prensado
  • Controle operacional da fermentação contínua
  • Introdução e estratégias
  • Interpretação dos parâmetros do laboratório
  • Critérios de dimensionamento da fermentação alcoólica
  • Dornas
  • Resfriamento de dornas
  • Centrífugas de fermento
  • Tratamento do fermento – pé-de-cuba
  • PERDAS DURANTE O PROCESSO
  • Qualidade da cana-de-açúcar
  • Lavoura
  • Carregamento, transporte e recepção
  • Armazenamento: pátio e barracão
  • Lavagem
  • Preparo e extração
  • Caldo e mosto
  • Aquecimento e decantação
  • Resfriamento do mosto
  • Centrifugação
  • Tempo de aproveitamento

FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA .................................................................................... 9 Microbiologia Básica.................................................................................................... 9 Leveduras ..............

................................................................................................... 9 Morfologia da célula............................................................................................. 9 Forma da célula ................................................................................................ 9 Tamanho da célula ............................................................................................ 9 Estrutura da célula .............................................................................................. 10 Parede celular ................................................................................................. 10 Membrana citoplasmática ou Plasmalema ..................................................... 10 Núcleo............................................................................................................. 11 Vacúolos ......................................................................................................... 11 Mitocôndria .................................................................................................... 12 Citoplasma ...................................................................................................... 13 Cápsulas .......................................................................................................... 13 Reprodução ......................................................................................................... 13 Reprodução vegetativa ................................................................................... 13 Reprodução por esporos ................................................................................. 14 Fissão .............................................................................................................. 14 Leveduras contaminantes ou nativas .................................................................. 14 Fisiologia, metabolismo oxidativo e fermentativo das leveduras....................... 17 Nutrição e crescimento das leveduras ................................................................ 19 Bactérias ................................................................................................................. 20 Morfologia das células bacterianas..................................................................... 20 Forma das bactérias ........................................................................................ 20 Dimensões da célula bacteriana...................................................................... 21 Estrutura bacteriana ............................................................................................ 21 Membrana citoplasmática ou protoplasmática ............................................... 23 Citoplasma ...................................................................................................... 23 Material celular ............................................................................................... 23 Flagelos........................................................................................................... 24 Cápsulas .......................................................................................................... 24 Reprodução bacteriana ....................................................................................... 24 Ciclo normal de crescimento da cultura bacteriana ............................................ 26

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Caracterização e Classificação dos Microrganismos.......................................... 27 Classificação em Nível de Gênero.................................................................. 28 Classificação em Nível de Espécie ................................................................. 29 Grupos Relevantes em Usinas de Açúcar e Álcool ............................................ 30 Estudo do fenômeno da floculação......................................................................... 37 Medida da Floculação......................................................................................... 39 Monitoramento e interpretação dos dados do laboratório industrial .......................... 40 Tabela para interpretação das análises laboratoriais............................................... 41 Procedimentos ........................................................................................................ 43 Fatores que afetam o desempenho fermentativo ........................................................ 47 Glicerol ................................................................................................................... 48 Ácido succínico ...................................................................................................... 49 Ácido acético .......................................................................................................... 49 Biomassa................................................................................................................. 50 Estequiometria da fermentação .............................................................................. 50 Carboidratos de reserva .......................................................................................... 50 Espécie de levedura ................................................................................................ 51 Identificação de leveduras pela técnica da cariotipagem.................................... 52 Permanência de leveduras tradicionais no processo fermentativo ..................... 53 Seleção de linhagens para fermentação industrial .............................................. 53 Nutrição mineral da levedura ................................................................................. 54 Principais nutrientes e suas funções ................................................................... 55 Potássio ........................................................................................................... 55 Magnésio ........................................................................................................ 55 Cálcio .............................................................................................................. 55 Zinco ............................................................................................................... 56 Manganês ........................................................................................................ 56 Ferro ............................................................................................................... 56 Cobre .............................................................................................................. 56 Molibidenio, Cobalto e Boro .......................................................................... 56 Nitrogênio ....................................................................................................... 56 Fósforo ............................................................................................................ 57 Enxofre ........................................................................................................... 58

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Inibidores da fermentação ...................................................................................... 58 Alumínio ............................................................................................................. 58 Sulfito ................................................................................................................. 59 Temperatura ........................................................................................................ 59 pH ....................................................................................................................... 60 Contaminação bacteriana.................................................................................... 61 MATÉRIAS-PRIMAS PARA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA ................................. 62 Caldo: composição, pré-tratamento, controle de qualidade ....................................... 62 Composição ............................................................................................................ 62 Pré-tratamento do caldo .......................................................................................... 63 Processos de tratamento ......................................................................................... 63 Processo de tratamento do caldo para destilaria – 1 ........................................... 63 Processo de tratamento do caldo para destilaria – 2 ........................................... 64 Processo de tratamento do caldo para destilaria – 3 ........................................... 64 Processo de tratamento do caldo para destilaria – 4 ........................................... 64 Controle de qualidade do caldo .............................................................................. 65 Mel final: composição, armazenamento e controle de qualidade. .............................. 65 Composição ............................................................................................................ 65 Armazenamento ...................................................................................................... 66 Controle de qualidade ............................................................................................. 66 CONTROLE MICROBIOLÓGICO – MICROSCOPIA ............................................... 67 Microscópio ótico ....................................................................................................... 67 Microscopia de Campo Claro ................................................................................. 67 Parte mecânica .................................................................................................... 68 Parte Óptica ........................................................................................................ 68 Recomendações para uso do microscópio ótico ................................................. 68 Antes de iniciar o uso. .................................................................................... 68 Ajuste da Dioptria........................................................................................... 69 Manutenção do equipamento .............................................................................. 69 Método de determinação da viabilidade celular de leveduras .................................... 70 Especificações da câmara de NEUBAUER............................................................ 71 Preparo das soluções............................................................................................... 72 Solução estoque de Eritrosina............................................................................. 72

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..... 75 Preparo das soluções................................................................................................... PCTS..... 81 Solução de iodo-lugol ................................................ 74 Viabilidade celular..................................................................... 79 Exercícios ........azul de metileno ................................. 77 Procedimento analítico ........... primário e misto .................................................................................................... 77 Solução de trabalho ........................................................................ 78 Amostras de vinho bruto e levedo tratado .............................................. 78 Amostras de caldos............sulfato azul de nilo ........................................................................................................................................................ 77 Solução B ............................................Tampão Fosfato ..................................................................................... 73 Procedimento analítico .....................................................................................................0...................................2........................... 81 Para Microrganismos de Cultivos Sólidos ......................................................................................................................................... 74 Contagem de células em brotamento ..............................................................................0...................... 73 Cálculos ............................................... 84 Detecção de esporos ..0% ............................................................................................................................................................ 83 Quantificação ............................................................................................................................................................................................................................................ 81 Procedimento analítico ......................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 82 Interpretação .... 80 Solução de cristal violeta ........................................................................................................................................................................................................................................ 80 Solução de safranina ..................... 79 Teste de Gram...........doc 4 6/7/2011 ...........20% ...................................................................................................... 75 Método para contagem de bactérias ao microscópio ótico ......................................... 84 Preparo das soluções......................................................... 82 Técnica de Coloração .......................................................................................... 74 População de Leveduras .......................................................................... 72 Solução de trabalho .............. 80 Preparo das soluções........... 85 Solução de safranina ............ 77 Solução A ............. 81 Para Microrganismos em Suspensão Líquida.................................................................................................................... 78 Cálculos ........................................................................................ 85 Fermentacaoalcoolica v2........ 74 Exercícios ..................................... 85 Solução de verde malaquita ......

........................................ 94 Leitura da Densidade Óptica ( D.................................................................................................... 97 Matéria-prima .................................................................................................................................................................................... 92 Teste de sensibilidade de bactérias aos antibióticos por spectrofotometria ............................................................................................ 91 Interpretação dos resultados .....................................................................................................................Procedimento analítico .................................................................................................................................................................................................. através da variação da acidez ........... 92 Preparo das Soluções Estoque .......................... 89 Solução estoque de Antimicrobianos ..................................................... 94 Realização do Teste ..................................................................................................................................................................................................................................................... 96 Outros ............................. 97 Moenda .......................................... 97 Pipetadores automáticos .............................................................................................................................................................. 93 Meio de Cultivo ( GLT) ........................................................... 97 Modelos de boletim para o controle microbiológico por microscopia .................................................... 88 Preparo das soluções............................................................................................................................................. 89 Determinação da acidez ...... 1961) ................. 96 Vidraria ............................................ 87 Teste de sensibilidade de bactérias aos antibióticos............................. 90 Determinação da acidez sulfúrica (inicial e final) das amostras.................................................................... 95 Interpretação dos Resultados .................................................................................... 86 Teste de Floculação ............................................ O ................................................................................................ ....... 96 Equipamentos ...................................................................... 98 Fermentacaoalcoolica v2................................................................................ ............................................ 95 Relação de materiais necessários para instalação do laboratório de controle microbiológico – microscopia .................................................................................. 85 Interpretação/Quantificação dos Esporos ........................................... 93 Preparo do Inóculo ................. 96 Reagentes ............................... 89 Solução estoque de actidiona (inibidor de leveduras).................................................................................................... ) .......................................... 92 Meios de Cultivo .........0.............................................. 90 Cálculo .............................. 87 Procedimento Analítico ............................................................. 91 Exemplo .........doc 5 6/7/2011 .. 93 Meio de Cultivo (Mayeux & Colmer. 89 Procedimento analítico .....

............................. 110 Avaliação da População Microbiana por Filtração em Membrana...... 105 Extrato de Levedura........................................ 112 Cultivo por Estrias ..................................................................... 99 Introdução .................... 107 Técnica de plaqueamento ..............................................Man... 104 Ágar......... 113 Procedimento analítico ........................ 108 Cálculo do número UFC/ml............. 99 Esterilização ..................................................................................................................................... 103 MEIOS de CULTIVO ........ 106 Bactérias ..................... 99 Esterilização por Calor Úmido ................................................. 101 Operação da autoclave ........................................................................ 113 Fermentacaoalcoolica v2............................................................ 106 INIBIDORES de CRESCIMENTO MICROBIOANO – Soluções Estoque ........................................................ 109 Cálculo do número de UFC/ml........................................................1........................................................ 110 Procedimento analítico .......................... L .............Fermentação ..................................................Ágar (YEPD + A) – Leveduras ... 99 Constituição da Autoclave .................................0..........Dextrose ...................... 102 Esterilização por calor seco – Estufa ................................................ 106 Leveduras .......................... 108 Plaqueamento de Superfície (Método “Spread Plate”)............................................................................................doc 6 6/7/2011 ....... 103 Esterilização por Filtração ........................................................... 104 Plate Count Agar (P C A ................................................................................................................................................................................................................................................................... 105 Meio – Mayeux & Colmer – Teste de Sensibilidade ..........................................Peptona............................................................................. 106 MÉTODOS PARA CONTAGEM DE CÉLULAS VIÁVEIS: LEVEDURAS E BACTÉRIAS .......................................................................................Agar Padrão) – Bactérias Aeróbios Mesófilas Totais . 101 Esterilização por Calor Seco ..................................................................................................... 105 Meio de Cultivo G.......................Autoclave ...................................Bactérias Lácticas Totais ............................... Rogosa & Sharpe (MRSA) ................... – Teste de Sensibilidade ................................. 112 Cálculo do número de UFC/ml........................................................... 98 CONTROLE MICROBIOLÓGICO – PLAQUEAMENTO ..............................................................................................T............ 103 2............................................................................................................................................ .......................................2 Operação da estufa ......................................... 107 Plaqueamento por Incorporação ou Profundidade (Método “Pour Plate”) ................. 107 Diluição em série ........... .....................

............... 124 Aspectos químicos ..........................................................................................................0................................................................. 124 Mecanismos de floculação ............................................................................................................................................................................................................................................................. 115 Procedimento Analítico .................... 119 Aspectos gerais ............................................................................................................................................................................. 122 Ação de íons ............................. 130 Padrões de fermentação de carboidratos em bactérias láticas ... 120 Aspectos genéticos .......................... 115 OUTRAS ANÁLISES ..................................................................... 129 Requerimentos nutricionais ............................................................................................................................................................................................................... 128 Histórico ......................................................................... 130 Tolerância à acidez: ................................................................................................................................... 115 Avaliação da Floculação da Levedura .............................................................................................. 130 Bactérias heterofermentativas .................................................... 130 Características da colônia ......................... 127 ÁCIDO LÁTICO ................................................................................................................. 124 Ligação tipo-lectina ........................................................................................................................................................ 129 Bactérias láticas ........................... 131 Fermentacaoalcoolica v2............................................................................................................ 131 Principais bactérias láticas .................................................................................................Cultivo em PetriFilm® .......... 128 Considerações Gerais ............................................... 126 Considerações importantes .................................................................... 128 Produção de ácidos por microrganismos ................. 130 Bactérias homofermentativas ............................................................ 117 Floculação da levedura pela bactéria Lactobacillus fermentum ........doc 7 6/7/2011 .... 125 Ação de bactérias ......................... 131 TIPOS DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA....................................................................... 124 Hidrofobicidade celular ........................................................................................................... 123 Aspectos físico-químicos..................................................................................................................................... 116 FLOCULAÇÃO DAS CÉLULAS DE LEVEDURAS .................... 125 Reconciliação dos dois mecanismos ................................................................................................................................................................................................................................ 114 Cálculo do número de UFC/ml....................................... 114 Procedimento analítico ..................... 125 Cofloculação levedura-bactéria ......

........................................................................................................................... 139 Critérios de dimensionamento da fermentação alcoólica ............................. transporte e recepção........................................................................................ 137 Controle operacional da fermentação contínua ............ 147 Lavagem ................................................................... 148 Caldo e mosto .......... 147 Armazenamento: pátio e barracão . 131 Providencias preliminar para partida .................................... 151 Tempo de aproveitamento ...................................................................................................................................................... 144 Tratamento do fermento – pé-de-cuba.......... 145 Qualidade da cana-de-açúcar ............................................................................................................................................. 149 Aquecimento e decantação .......................................................................... 146 Carregamento...................doc 8 6/7/2011 ............. 132 Partida com tubo de cultura pura ................................. 133 Partida com leite de fermento selecionado ...........................................................0.............................................................. 149 Resfriamento do mosto ..... 131 Partida e sistemas de partida..................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 152 Fermentacaoalcoolica v2............................................ 151 Fermentação ..... 145 PERDAS DURANTE O PROCESSO................................................ 148 Preparo e extração ................ 131 Condução da fermentação ................ 135 Partida com fermento prensado .............................................................................................................................. 140 Dornas.......................................................................................................................................................... 142 Centrífugas de fermento ........... 146 Lavoura ............................................................................................................................... 151 Centrifugação ................. 138 Introdução e estratégias ......................................................................................................... 138 Interpretação dos parâmetros do laboratório ...............................................................................................................Fermentação descontínua ou batelada .......................................................................................................................................................................................... 140 Resfriamento de dornas ...........................

não significa que em uma população de leveduras todas as células apresentarão aquela forma. Fermentacaoalcoolica v2. mas pelo menos em um determinado período do desenvolvimento celular as células terão uma forma característica. Mas foi somente após os estudos do gênio Pasteur. Entretanto. globosa. embora existam certas leveduras com formas altamente características. ovóide e alongada. Tamanho da célula O tamanho da célula de levedura é também variado. com limites desde 1 a 5 μm de largura e 5 a 30 μm de comprimento.FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA Microbiologia Básica Leveduras A palavra levedura traz imediatamente à mente a idéia "fermentação". as quais podem ser os resultados da maneira de reprodução vegetativa bem como das condições de cultivo e idade da cultura. mas numa cultura jovem o tamanho da célula pode ser bem uniforme em algumas espécies ou extremamente heterogêneo em outras.0. pois os dois termos têm sido muito associados através da história. Entretanto.doc 9 6/7/2011 . dizer que uma determinada forma de célula é característica de uma dada espécie ou gênero. De uma maneira geral as leveduras industriais variam consideravelmente no que se refere às suas dimensões. Estas disparidades podem ser usadas para diferenciação entre espécies e algumas vezes até mesmo entre linhagens da mesma espécie. é que se caracterizou a individualidade da levedura como um organismo vivo com características próprias. o desenvolvimento do conceito de levedura pode ser considerado como tendo tido início por volta de 1680 (Van Leeuwenhoek). As formas que mais comumente são encontradas são esférica. em 1876. Morfologia da célula Forma da célula A célula da levedura pode apresentar várias formas.

dependendo do gênero e espécie considerados. técnicas de coloração da célula para componentes específicos.5 a 13.Estrutura da célula A maioria das investigações feitas sobre as estruturas da célula de levedura é baseada em trabalhos feitos com Saccharomyces cerevisiae. espessando-se com a idade. parte das quais provavelmente enzimas. a membrana citoplasmática ou plasmalema. Membrana citoplasmática ou Plasmalema Fermentacaoalcoolica v2. sua rigidez é responsável pela forma particular que a célula apresenta. já que invertases e outras hidrolases foram identificadas na parede celular. Saccharomyces cerevisiae apresenta 6 a 8% de proteínas.doc 10 6/7/2011 . As concentrações em lipídeos variam de 8. A quantidade de quitina também varia com a espécie sendo que Saccharomyces cerevisiae apresenta entre 1 a 2% deste composto. Na parede celular são encontrados ainda outros compostos. a camada intermediária de β glucana solúvel em alcali e a camada exterior de glicoproteína na qual o carboidrato é a manana fosforilada. A parede celular das leveduras é fina nas células jovens. um ou mais vacúolos e a mitocôndria. já a glicosamina foi encontrada em pequenas quantidades nas paredes das leveduras. Basicamente a parede celular do gênero Saccharomyces consiste de três camadas: a camada interna de β glucana insolúvel em alcali. microscopia eletrônica de transmissão de cortes ultrafinos das células. quando a célula íntegra é observada pode-se verificar perfeitamente a presença das cicatrizes dos brotamentos na parede celular. como lipídeos e heteropolissacarídeos. As principais micro-estruturas da célula de levedura são: a parede celular.0. o núcleo. As proteínas são constituintes constantes das paredes celulares das leveduras. As informações sobre a citologia da levedura têm sido obtidas por observações diretas com o microscópio óptico. Os principais constituintes da parede celular de Saccharomyces cerevisiae são os polissarídeos glicano (30 a 34%) e manano (30%). Com o microscópio eletrônico de varredura. Parede celular A parede celular pode ser vista com um simples microscópio óptico (campo claro) como uma linha externa da célula.5%. Embora um pouco elástica. bem como através da microscopia de varredura.

Eles têm geralmente aparência (forma) esférica e são mais transparentes a um feixe de luz que o citoplasma que os circunda.3. esfingolipídeos complexos. O núcleo é composto de uma parte opticamente densa. Os exames de cortes ultrafinos mostram que o núcleo das leveduras é uma organela bem definida. Depois de Fermentacaoalcoolica v2. di e triglicerídeos).0 μm de diâmetro). ao microscópio de contraste de fase. Por outro lado.0. Os ácidos graxos nos vários componentes são de cadeia longa (C16 . circundada por uma membrana nuclear semipermeável.3 . neutro e ácido glicolipídeos. glicerofosfatideos. Vacúolos Quando as células de levedura são vistas ao microscópio de contraste. e uma porção menos densa que contém o material cromatínico. com funções metabólicas e reprodutivas. Núcleo O núcleo das células de levedura não é facilmente visto ao microscópio óptico (campo claro) quando as células são preparadas para observação em suspensão aquosa. Durante a formação do brotamento das leveduras a divisão do núcleo é acompanhada por alongamento e constrição deste. Além do DNA.Esta estrutura é localizada diretamente abaixo da parede celular e tem uma importante função na entrada seletiva de nutrientes do meio de crescimento. Quando as células são colocadas em meio nutritivo e começam a emitir brotamentos os grandes vacúolos se dividem por constrição em numerosos pequenos vacúolos. Ela protege também a célula de perder compostos de baixo peso molecular por vazamento do citoplasma e ela representa a "matriz" sobre a qual os compostos da parede celular são depositados durante o crescimento da célula.C26) com o ácido oléico (C18:1) sendo o ácido graxo mais importante. nucléolo e a porção contendo cromatina se dividem e são incorporados no núcleo das duas novas células. Durante o desenvolvimento do broto os vacúolos são distribuídos entre as células mãe e filha (brotamento). usualmente pode-se observar um ou mais vacúolos de diferentes tamanhos (0. o núcleo pode ser observado em leveduras desenvolvidas em meio nutritivo contendo 18-21% de gelatina. esterois livres e esterificados (principalmente ergosterol).doc 11 6/7/2011 . o nucléolo. Na composição química do plasmalema é encontrada uma mistura complexa de lipídeos neutros (mono. Ambos. o núcleo contém várias categorias de RNA e um tipo de polifosfato com uma cadeia de 20 a 40 resíduos de ortofosfato. a qual acontece naturalmente no pescoço do broto.

portanto conhecidos como "dancing bodies". A existência de hidrolases nos vacúolos também sugere que estes sejam os lisossomos celulares (compartimento onde se dão a cisão e síntese de macromoléculas). Mitocôndria As mitocôndrias ocorrem como organelas membranas-limitadas que. Ao microscópio eletrônico pode-se observar que o vacúolo é cercado por uma simples membrana. sua principal função é a de conversão aeróbia de energia. Os vacúolos servem também como vesículas de armazenamento para várias enzimas hidrolíticas. no vacúolo podem ser encontrados polimetafosfatos (volutina). Estas organelas são envolvidas por uma membrana externa e outra interna as quais formam as cristas que se estendem dentro do estroma mitocondrial. Durante o brotamento celular as mitocôndrias também se dividem e são distribuídas entre a célula mãe e a filha. ribonucleases e esterases. As mitocôndrias são ricas em lipídeos.completado o processo de brotamento os pequenos vacúolos podem se fundir para formar novamente grandes vacúolos. ao exame microscópico têm a aparência de filamentos pregueados com diâmetro de 0. Os vacúolos também funcionam como reservatório energético.0. Também uma grande porção dos aminoácidos livres da levedura é armazenada no vacúolo e tem sido sugerida inclusive a presença de lipídeos nos vacúolos. Sob condições anaeróbias de fermentação de glucose ou mesmo sob condições Fermentacaoalcoolica v2. Em Saccharomyces elas estão geralmente localizadas bem próximas à periferia da célula. Por exemplo. Uma vez que as mitocôndrias contêm as enzimas respiratórias. mas em leveduras aeróbias obrigadas elas estão mais distribuídas através do citoplasma. com os materiais acima temporariamente não metabolizados. O número de mitocôndria pode variar de um a vinte por célula. purinas.3 a 1 μm e comprimento de até 3 μm. fosfolipídeos e ergosterol.doc 12 6/7/2011 . incluindo RNA polimerase e um grande número de enzimas respiratórias participando no ciclo do TCA e transporte de elétrons. o vacúolo pode se romper e o processo de autólise da célula acontecer. RNA e proteínas. a qual dada a sua constituição está relacionada ao transporte de substâncias armazenadas no vacúolo. Elas contêm também DNA. incluindo proteases. Uma grande variedade de compostos de alto e baixo peso molecular pode entrar no vacúolo. os quais apresentam ativo movimento Brawniano e. Quando em condições adversas. derivados de purina de baixa solubilidade formando cristais.

Cápsulas Algumas leveduras são cobertas por um material extracelular limoso. glicogênio e trealose. forma-se uma parede transversal. Citoplasma O citoplasma é a matriz na quais todas as organelas discutidas até agora estão localizadas. O tubo passa para a protuberância. a respiração pode ser restabelecida facilmente pela diminuição da concentração de glucose e arejamento das células. de modo que os entrossomos de cada unidade sejam vistos no ponto de união. permanecendo cicatrizes das gêmulas como resultado deste processo de reprodução. incluindo heteropolissacarídeos e substâncias semelhantes ao amido. A parede do broto contém apenas material recentemente sintetizado. As gemulações sucessivas são sempre formadas em locais diferentes na superfície celular.doc 13 6/7/2011 . De 1. transformando-se na chamada promitocôndria. etc. produzida por um enfraquecimento local da parede celular existente.0. adjacente ao núcleo da célula-mãe. por gemulação. uma média de 24 células-filhas. polifosfato e os polissacarídeos de reserva. Quando a gêmula estiver com tamanho aproximado ao da célula-mãe. viscoso e aderente. Reprodução Reprodução vegetativa As leveduras podem se reproduzir por esporulação. A maior parte das cápsulas de leveduras tem composição polissacarídica. de modo semelhante ao que ocorre nas leveduras em divisão. Fermentacaoalcoolica v2. Completada a divisão nuclear. o aparelho nuclear de ambas as células se reorienta. o que faz com que diminua a capacidade respiratória. com cristas pouco desenvolvidas. Ali.0 a 5. por gemulação (brotamento) ou por fissão. enzimas glicolíticas.0% de DNA da levedura podem estar presentes no citoplasma. Ele contém grandes quantidades de ribosoma. que é a substância capsular. forma-se uma pequena protuberância na superfície mais externa da célula. Por outro lado. que aumenta de volume e se enche com material nuclear e citoplasmático da célula-mãe.aeróbias em altas concentrações de glucose (5-10%) as mitocôndrias parecem se degenerar. O método mais comum é o da gemulação onde forma-se um tubo a partir do vacúolo nuclear. orientando para um ponto da parede celular mais próxima do vacúolo. Durante sua vida uma célula madura produz.

Na produção de álcool a partir do melaço e/ou do caldo de cana-de-açúcar a presença de leveduras contaminantes tem sido pouco ou raramente mencionada. tipo de colônias) daquelas da levedura alcoólica foi constatada. O número de esporos pode variar para uma espécie particular. Fissão Durante este processo reprodutivo a levedura aumenta de tamanho ou se alonga. embora ascos com dois ou três esporos sejam comuns nesta espécie.doc 14 6/7/2011 . e. o núcleo se divide e as duas células-filhas são formadas. A esporulação constitui uma fase do ciclo sexual da levedura. processos esses que levam as mudanças evolucionárias (melhoramento genético). Entretanto. Mas na maioria das leveduras ascosporogenas (Saccharomyces cerevisiae) o número máximo de esporos é quatro por asco. mutação. embora não se tenha feito testes específicos. em algumas destilarias a presença de células de levedura com características diferentes (forma. Durante os períodos de rápida multiplicação. hibridação e seleção. Esses contaminantes podem trazer problemas graves no que se refere ao processo fermentativo e. Em algumas leveduras o número máximo é oito. nas safras 84/85 até 88/89. isto é. Fermentacaoalcoolica v2. uma vez que pouco ou nenhum esporo são formados sob condições anaeróbias (fermentação). Leveduras contaminantes ou nativas A presença de leveduras contaminantes (selvagem) tem trazido sérios problemas para a fermentação. principalmente a deterioração do produto final. até mesmo na produção de fermento prensado para panificação. Este ciclo permite a levedura sofrer recombinações genéticas. É geralmente conhecido que condições de aerobiose são essenciais para esporulação. formando-se cadeias de células. Este processo de reprodução é característico para o gênero Schizosaccharomyces.Reprodução por esporos A formação de esporos sexuados em leveduras é de grande importância biológica. provocando o aparecimento de sabores e aromas que descaracterizam totalmente a bebida.0. tamanho. tanto na produção de vinhos como na fabricação de cerveja. alternância da condição haplóide (1n cromossomos) e diplóide (2n cromossomos). as células podem se dividir sem se separarem. embora a maioria das leveduras forme um número máximo definido de esporos em cada asco.

maior tempo de fermentação. o xarope. com ou sem tratamento térmico do caldo (aquecimento. A predominância de uma ou de outra forma vai depender do tipo de processo empregado pela indústria.A proporção destas leveduras em relação à levedura alcoólica tem variado bastante. a água de lavagem de cana e o próprio solo. Um levantamento feito por plaqueamento. O caso encontrado por nós (Fermentec) mais impressionante. uma vez que a levedura contaminante dominou completamente o processo. maior formação de espumas pelo aumento da viscosidade.doc 15 6/7/2011 . o melaço. desde algumas células até quase total dominância. ou seja. Sua forma era diferente da levedura industrial (TA. A quantidade de espuma era intensa e foi necessário modificar todo o processo para poder continuar produzindo álcool. na água de refrigeração das dornas. formando verdadeiros cachos. Na safra 88/89. Esta levedura foi identificada (Barre. foi na fermentação contínua da Usina Vale do Rosário (Morro Agudo). controle da temperatura de aquecimento do caldo e controle da temperatura da fermentação foram as maneiras que conjuntamente se conseguiu contornar o problema. monitoramento constante. mostrou que esta levedura se encontrava disseminada em todo o processo. ocorreram dois casos de contaminação com levedura selvagem entre os clientes da Fermentec. e por incrível que pareça. onde a levedura selvagem provocou sérios prejuízos. A passagem pelo aparelho de destilação não conseguia eliminá-la completamente. A maior ou menor intensidade desses fatores vai depender das características fisiológicas da espécie de levedura contaminante. na vinhaça. no caso) e as células filhas não se soltavam da célula mãe. Os efeitos da presença de leveduras contaminantes na fermentação alcoólica podem ser sentidos pelo abaixamento do rendimento da fermentação.). A origem destas leveduras contaminantes (selvagem) é variável. Esta levedura foi encontrada no caldo. Essas leveduras podem chegar as dornas de fermentação tanto na forma vegetativa como de esporos. concentração. etc. destacando-se como principais.0. com sérios problemas para o processo. Montpellier. que era oriunda da cana e que estava passando pelo tratamento térmico uma vez que a temperatura de aquecimento era igual ou inferior a 100ºC. Fermentacaoalcoolica v2. etc. Assepsia rigorosa. Em ambas as indústrias houve um grande aumento do tempo de fermentação e uma sensível diminuição do rendimento. decantação. França) como sendo uma Candida krusei. ou seja. se Saccharomyces ou não Saccharomyces.

Candida krusei. O problema foi resolvido pela troca de todo o fermento em processo e a elevação da temperatura de aquecimento do caldo para 105 . Saccharomyces capensis. Saccharomyces bayanus. Através de testes de assimilação e fermentação de carboidratos.0. Torulaspora pretoriensis e Kluyveromyces vanudenii entre outras. Durante as safras 91/92 a 97/98 várias outras leveduras contaminantes foram isoladas e caracterizadas de amostras de mosto de alimentação e vinho bruto de clientes da Fermentec.1 e 2: Células vegetativas e colônias de Saccharomyces cerevisiae FOTO .As características básicas diferenciais desta levedura contaminante eram células alongadas com brotamento exclusivamente unipolar (apical). Testes realizados com meios diferenciais pelo setor de Microbiologia da Fermentec e pelo Instituto National De La Recherche Agronomique da França (INRA) mostraram que esta levedura não pertencia ao gênero Saccharomyces. Pichia ohmeri. FOTO . e segundo Barre.doc 16 6/7/2011 . era uma Candida krusei de linhagem diferente da encontrada na Vale do Rosário.3 e 4: Células vegetativas e colônias de Saccharomyces chevalieri Fermentacaoalcoolica v2. segundo o procedimento da taxonomia numérica descrito por GRIFFITHS (1981) foram encontradas Saccharomyces chevalieri.110ºC. Trichosporum brassicae.

A levedura como entidade viva independente. A transformação do açúcar (glicose) até resultar em etanol e CO2 envolve 12 reações em seqüência ordenada. vitaminas.5 e 6: Células vegetativas e colônias de Kluyveromyces vanudenii FOTO . A célula de levedura possui compartimentações para adequação de sua atividade metabólica. Em biotecnologia é corrente o emprego do termo fermentação para definir reações microbianas. substâncias do próprio metabolismo. Se o homem pretende beneficiar-se dessa habilidade metabólica.7 e 8: Células vegetativas e colônias de Candida krusei Fisiologia.FOTO . se o substrato for completamente oxidado diz-se que há respiração e se o substrato for parcialmente degradado acarretando a formação de metabólitos diz-se que há fermentação. Fermentacaoalcoolica v2. outros que reprimem a ação enzimática. realiza a fermentação do açúcar com o objetivo de conseguir a energia química necessária à sua sobrevivência.doc 17 6/7/2011 . inibidores. metabolismo oxidativo e fermentativo das leveduras. alguns que estimulam.). afetando assim o desempenho do processo. pH. Tais enzimas sofrem ações de diversos fatores (nutrientes. No conceito bioquímico. A fermentação alcoólica (glicólise anaeróbia) ocorre no citoplasma. ele deve buscar os conhecimentos que lhe permitam propiciar às leveduras. minerais. com maior eficiência na produção de etanol. condições ideais para que as mesmas trabalhem a seu favor. enquanto que a oxidação total do açúcar (respiração) se dá na mitocôndria. sendo o etanol apenas e tão somente um subproduto desse processo. isto é. etc. temperatura.0. cada qual catalisada por uma enzima específica.

) e biossínteses. etc. A fermentação alcoólica é um processo não oxidativo. mas apenas em condições de aerobiose.doc 18 6/7/2011 . Durante a fermentação. rotas metabólicas alternativas aparecem para propiciar a formação de materiais necessários à produção da biomassa (polissacarídeos. sem utilidade metabólica para a célula em anaerobiose. etc. proteínas. os quais desviam esqueletos carbônicos provenientes do açúcar. e. Fermentacaoalcoolica v2. que conjuntamente com a biomassa são quantitativamente os principais subprodutos metabolicamente relacionados ao equilíbrio do redox celular em anaerobiose. o glicerol. motivo pelo qual. O etanol e o CO2 resultantes se constituem em produtos de excreção. É ele.) bem como para a formação de outros produtos de interesse metabólico. relacionados direta ou indiretamente com a adaptação e sobrevivência. é gerar uma forma de energia química (ATP) que será empregada na realização dos diversos trabalhos fisiológicos (absorção. reduzindo a produção de etanol. Em termos energéticos a respiração é muito mais eficiente (produção de ATP) do que a fermentação. Entretanto o etanol e outros produtos de excreção podem ser oxidados metabolicamente.O objetivo primordial da levedura ao metabolizar anaerobicamente o açúcar. necessários à manutenção da vida.0. acopladas à produção de etanol e de glicerol. perpetuando assim a espécie. intrínsecas à formação de etanol. crescimento e multiplicação. gerando mais ATP e biomassa. ácidos nucléicos. os ácidos orgânicos (principalmente o succínico e o acético). sem a participação do oxigênio molecular (O2). excreção. todo NADH formado (em reações de oxidação) deve ser consumido em reações de redução. portanto. na seqüência de reações de produção de ATP. a oxigenação permite uma maior multiplicação da levedura. para se manter o equilíbrio de redox celular.

doc 19 6/7/2011 . De todos os elementos encontrados na levedura apenas alguns são considerados essenciais sendo que muitos deles aparecem fortuitamente dependendo da composição do meio no qual a levedura cresceu. Fermentacaoalcoolica v2. quando a célula está sob aerobiose e aparecem as mitocôndrias ativas (no destaque).0. Nutrição e crescimento das leveduras As leveduras exigem diversos íons inorgânicos (minerais) em concentrações tanto micro como milimolar para manifestarem ótimos crescimento e rendimento fermentativo. um desequilíbrio entre os nutrientes minerais. Deficiências ou concentrações elevadas de tais minerais. provoca alterações metabólicas significativas. ou seja.Denise '95 RESPIRAÇÃO CICLO DE KREBS CADEIA RESPIRATÓRIA Figura 3: Esquema da fermentação (em anaerobiose) e da respiração.

bases nitrogenadas e outros compostos orgânicos e que são utilizados pela levedura. proteínas. sequestrantes e absorventes os quais reduzem a concentração efetiva de espécies iônicas. aminoácidos. Bactérias Morfologia das células bacterianas Das características principais das células bacterianas destacam-se suas dimensões. Forma das bactérias Fermentacaoalcoolica v2. Co. Já os íons minerais estão predominantemente implicados na atividade enzimática. Mn e Cu). como ativador ou estabilizador da função enzimática (K. pode-se considerar que a necessidade de um elemento qualquer pode ser diminuída. como mantenedor de um controle fisiológico (pela ação antagônica exercida entre íons). complexam diversos íons com diferentes afinidades. Mg). como é o caso do alumínio. existe uma vasta gama de interações entre os nutrientes minerais resultando que tal concentração ótima é altamente dependente da concentração de outros minerais no meio. os quais constituem a morfologia da célula. Isso ocorre quando o mosto apresenta aminoácidos. Por outro lado. ácidos húmicos. Os elementos minerais que afetam negativamente a levedura podem ser classificados como elementos tóxicos. atuando como neutralizador de forças eletrostáticas em diversas unidades celulares aniônicas (K. Embora se possam postular concentrações ótimas para cada elemento. estrutura e arranjo celular.As necessidades de N. ácidos orgânicos.doc 20 6/7/2011 . Igualmente. minerais de argila. P e S são as mais facilmente justificáveis por integrarem constituintes celulares tanto estruturais quanto metabolicamente ativos. apresentar o produto final de uma reação catalizada por uma metalo-enzima. Para tornar a situação mais complexa. Ca. polifosfatos e outros materiais coloidais. NH4. se o mosto empregado na indústria. Mg e Zn neutralizando cargas negativas do DNA. alguns íons atuam como antagônicos minimizando efeitos inibitórios de outras espécies iônicas e por outras inter-relações metabólicas que determinam a quantidade absorvida do íon e os efeitos conseqüentes. tornando desnecessária a síntese dos mesmos. Assim. os mostos empregados na indústria podem conter agentes quelantes. ácido fítico. RNA. e ainda do ponto de vista estrutural.0. geralmente complexo. forma. polifenóis. Assim o mineral pode funcionar como o centro catalítico de uma enzima (Zn. proteínas. membranas fosfolipídicas e fosfomananas da parede celular).

mas a parede celular e o citoplasma são naturalmente comuns a maioria das células bacterianas. Estas características podem ser usadas para a caracterização das espécies bacterianas. As formas esféricas (cocos) variam de tamanho de 0. bastonetes e espiralada/helicoidal. que equivale a 10-3 mm. Estrutura bacteriana O exame da célula bacteriana mostra estruturas. Algumas dessas estruturas aparecem apenas em certas espécies. Dimensões da célula bacteriana A unidade de medida da célula bacteriana é o micro. mas podem se apresentar isolados. aos pares (diplobacilos) e em cadeias (estrepto bacilos).5 μm a 1.0 μm de comprimento é de 0. As células bacterianas elipsoidal-esféricas denominadas de cocos podem apresentar os seguintes tipos de arranjos: As células bacterianas cilíndricas ou em bastonetes (bacilos) não se dispõem de acordo com os padrões encontrados entre os cocos. outras são mais características de uma espécie de que de outra. mas é devida a etapa de crescimento ou às condições de cultura.3 μm a 1. De um modo geral essas duas formas de bactérias são as mais comuns entre os contaminantes nas indústrias do açúcar e do álcool.doc 21 6/7/2011 . os organismos isolados podem apresentar uma das três formas gerais: elipsoidal/esférica.0. as quais são esquematizadas abaixo. Já as bactérias em forma de bastonetes (bacilos) variam de 1.0 μm a 5.0 μm de diâmetro.0 μm de largura. Em alguns casos esses arranjos não constituem padrões morfológicos característicos.Apesar de existirem milhares de espécies bacterianas. Fermentacaoalcoolica v2.

uma vez que a célula bacteriana desprovida de parede celular (protoplasto) é incapaz de promover a divisão ou crescimentos normais. açúcares aminados.Parede celular Esta se encontra externamente à delicada membrana citoplasmática e devido a sua rigidez própria mantém a forma característica da célula mesmo quando esta é submetida a condições físicas extremas (altas pressões osmóticas ou temperaturas abaixo de zero). Várias substâncias são encontradas na parede celular bacteriana como. Outros compostos principais da parede celular das bactérias são aminoácidos. A parede celular representa uma porção significativa do peso seco total da célula.0. podendo ser responsável por 10 a 40% do peso seco do microrganismo. O conteúdo lipídico das bactérias Gram negativas é consideravelmente maior do que a dos organismos Gram positivos. o ácido murâmico e o ácido teicóico. Todas estas substâncias são reunidas para formar substâncias poliméricas complexas que formam a estrutura da parede celular. Fermentacaoalcoolica v2. Ela parece ter uma função importante na divisão e crescimento celulares. carboidratos e lipídeos. por exemplo. responsável pela rigidez da parede celular. Estas substâncias são típicas das bactérias. Nas bactérias Gram negativas o peptoglicano constitui uma fração menor do total da parede celular do que nas bactérias Gram positivas. o ácido diaminopimélico (DPA).doc 22 6/7/2011 . mas de um modo geral a parede celular das células Gram negativas é quimicamente mais complexa. como é o caso do composto polimérico conhecido como peptidoglicano.

doc 23 6/7/2011 . Dentre estas se incluem grânulos de amido. onde é encontrado o ADN da célula bacteriana. Nenhum vacúolo tem sido observado no conteúdo citoplasmático. sem. polímero de fósforo inorgânico. Membrana citoplasmática ou protoplasmática A membrana citoplasmática ou protoplasmática ou simplesmente membrana plasmática está situada imediatamente abaixo da parede celular. O núcleo da célula bacteriana pode ser revelado pelo corante Fermentacaoalcoolica v2. etc. uma área rica em ácido desoxiribonucleico (ADN) (área nuclear ou cromatínica) e uma área fluida com nutrientes dissolvidos. controla a passagem de nutrientes e de resíduos para dentro e para fora da célula. Acredita-se que geralmente os grânulos podem servir como fonte de material nutritivo de reserva. Nesta são encontrados também várias enzimas responsáveis por diversas funções celulares. contudo. Entretanto deve-se usar o termo núcleo. Estas partículas ribonucleoproteicas são denominadas de ribossomos. Desta forma qualquer modificação (lesão) da membrana citoplasmática poderá resultar em morte da célula. de pigmentos.Acredita-se que a função da parede celular seja a de proporcionar uma moldura rígida que suporte e proteja as entidades protoplasmáticas mais sensíveis. mas várias outras inclusões podem ser encontradas através de técnicas microscópicas especiais. O ácido ribonucleico juntamente com proteínas forma corpúsculos ou macromoléculas densamente aglomeradas por todo o citoplasma.0. dentro do citoplasma são encontrados corpúsculos que são considerados como estrutura nuclear. separando esta do material citoplasmático. provocar alterações morfológicas que possam ser verificadas ao microscópio comum. uma vez que se trata de uma forma primitiva de núcleo. Citoplasma Este representa todo o material celular contido dentro da membrana citoplasmática. como transporte de elétrons e fosforilação oxidativa. Trata-se de uma membrana de real importância e sendo semipermeável e seletiva. Material celular Embora as bactérias não possuam o núcleo típico das células de animais e vegetais superiores. Nele pode-se distinguir uma área de aparência granular rica em ácido ribonucleico (área citoplasmática). respectivamente.

As bactérias capsuladas são responsáveis pelo aparecimento de certos prejuízos em processos industriais uma vez que este material é de natureza polissacarídica pertencentes a diversos tipos como o dextrano. conclui-se que existem espécies móveis e imóveis. Outra sugere um mecanismo rotatório. Nem todas as bactérias possuem flagelos. o qual é específico para ADN. semelhantes a cabelos. A mobilidade pode ser facilmente observada pela microscopia com preparação em gota pendente. ou pela microscopia eletrônica. mas pode-se generalizar que muitas espécies de bacilos o apresentam e raramente eles ocorrem em cocos e lactobacilos.doc 24 6/7/2011 . após o Fermentacaoalcoolica v2. típico das células superiores. Reprodução bacteriana Durante o crescimento bacteriano o processo mais comum de divisão celular (multiplicação) é a fissão binária. As cápsulas representam um envoltório protetor e podem servir também como reservatório de alimentos armazenados e como locais de despejo de substâncias de escória.de Feulgen. uma vez que é menos denso que o citoplasma. Uma das hipóteses diz que as cadeias protéicas se contraem e se relaxam produzindo um movimento ondulatório que puxa ou empurra o organismo. o levano e a celulose. a dextrina.0. Os flagelos são muito pequenos para serem vistos em seu estado natural. O método exato pelo quais os flagelos movimentam a célula bacteriana não é conhecido. onde uma única célula se divide em duas. de uma hélice relativamente rígida. Cápsulas Algumas bactérias estão envoltas por uma substância viscosa que forma uma camada de cobertura ou envelope ao redor da célula. Estas estruturas são designadas como cápsula ou camada limosa. Não há evidência de uma membrana separando o núcleo do citoplasma e durante a replicação do núcleo bacteriano não se tem observado o aparelho mitótico. a partir de uma extremidade fixa. pelo microscópio óptico. que se exteriorizam através da parede celular e se originam de uma estrutura granular imediatamente abaixo da membrana citoplasmática são denominados de flagelos. Uma vez que os flagelos são responsáveis pela mobilidade das bactérias e que nem todas as bactérias são flageladas. Flagelos Os apêndices muito finos.

as bactérias são capazes de crescer numa ampla faixa de condições físicas. Muitas espécies bacterianas pertencentes a vários gêneros (Bacillus.desenvolvimento de uma parede celular transversal.0. podendo utilizar alimentos muito diferentes. É importante mencionar que as bactérias capazes de formar esporos. o qual pode variar de 15 a 20 minutos até algumas horas. A germinação dos esporos geralmente requer a presença de um aminoácido específico e pode ocorrer somente após o esporo ter sofrido a ação de fatores físicos (choque térmico). O tempo de geração depende da espécie bacteriana e das condições ambientais. que dará origem ao esporo. Essa divisão da célula é um tipo de reprodução assexual. sob certas condições. temperaturas ao redor de 80ºC ou mais são apenas suficientes para provocar a germinação dos mesmos. podem crescer e multiplicar-se por muitas gerações como células vegetativas. mas seu crescimento ótimo requer condições específicas para uma dada espécie. mas num determinado momento do desenvolvimento pode ocorrer no interior do citoplasma vegetativo. Clostridium) são capazes de formar. a síntese de um novo protoplasma. A resistência dos esporos bacterianos as altas temperaturas é variável de espécie para espécie. e quando este germina resulta uma única célula bacteriana. ou seja. Nas espécies do gênero Bacillus somente um esporo é formado por célula. Eles contém somente parte dos constituintes celulares e a sua posição e forma na célula são importantes critérios na classificação dos bacilos. Fermentacaoalcoolica v2. ou como meio de disseminação da espécie. Esses esporos são formados no interior das células e portanto são denominados de endosporos. e de um modo geral.doc 25 6/7/2011 . O tempo necessário para que a célula se divida ou para que a população duplique é conhecido por tempo de geração. unidades celulares conhecidas como esporos. Entretanto a fissão binária não é o único processo de reprodução das bactérias.

0.ácido dipicolínico-peptoglicano que constitui a camada cortical do esporo. peptidoglicano.fase estacionária Fermentacaoalcoolica v2.doc 26 6/7/2011 . fase logarítmica ou exponencial. os esporos são extremamente resistentes aos agentes físicos e químicos adversos.A composição química do esporo é típica e todos os esporos bacterianos contêm grandes quantidades de ácido dipicolínico (5 a 10%). Log do número de bactérias B C D A Tempo (h) A . grandes quantidades de cálcio.fase exponencial C .lag fase B . em seguida há um rápido aumento da população e depois há uma diminuição do número de células. fase estacionária e fase de declínio ou de morte. verifica-se que inicialmente parece não haver crescimento. Comparados com as formas vegetativas. Esta capacidade de sobrevivência pode ser atribuída à sua parede ou capa impermeável a qual por sua vez está associada ao complexo ácido dipicolínico-cálcio. Esses períodos são conhecidos como fases do crescimento bacteriano. e são assim denominados: lag fase. Ciclo normal de crescimento da cultura bacteriana Quando se inocula um meio de cultura com certo número de bactérias e se observa o número de células a intervalos regulares por mais ou menos 24 horas. os quais formam um complexo Ca.

Ao final da fase lag cada organismo se divide.fase de declínio Fig. Fermentacaoalcoolica v2. num ritmo constante. 1) Na fase lag não significa que as células estejam em repouso ou dormentes.0. talvez como resultado da completa cessação das divisões ou do equilíbrio entre o ritmo de reprodução e o equivalente ritmo da morte. Chan . atividade metabólica e outras características fisiológicas. Na fase de declínio ou de morte. ao contrário durante esta fase as células aumentam de tamanho. vol. cria-se um grupo com características muito semelhantes.1981. (B) fase log (logarítmica). Por fim. (D) fase de morte ou de declínio. (C) fase estacionária. A tendência para o fim do crescimento pode ser atribuída a uma série de cirscuntâncias. são fisiologicamente ativas e estão sintetizando novo protoplasma. Várias condições contribuem para a morte bacteriana. as mais importantes são a depleção de nutrientes essenciais e o acúmulo de substâncias inibidoras como os ácidos. particularmente à exaustão de alguns nutrientes e. Por serem individualmente tão pequenos que não podem ser visualizados sem ajuda de um microscópio. (A) fase lag. 8. no entanto como nem todos os indivíduos completaram sua etapa lag simultaneamente ocorre um aumento gradual da população até o término desta fase. quando todas as células passam a ter capacidade de divisão em tempos regulares.D . a produção de produtos tóxicos. não é prático trabalhar com um único microrganismo. Caracterização e Classificação dos Microrganismos As comparações das características de grande número de microrganismos resultam num sistema de agrupamento das espécies semelhantes. A população é grandemente uniforme em termos de composição química. (Pelczar. Na fase logarítmica ou exponencial as células se dividem firmemente. Reid. Curva de crescimento típica das bactérias. isto é. Na fase estacionária a população permanece constante durante certo tempo. o microrganismo adquire um nome. as bactérias passam a morrer mais rapidamente do que a produção de novas células.doc 27 6/7/2011 . As bactérias no novo meio podem ser deficientes em enzimas ou coenzimas que devem ser sintetizadas em quantidades suficientes para o funcionamento ótimo da maquinaria química da célula. com menos freqüência. que é considerado como uma espécie e recebe um nome específico.

cultura que consiste de uma única espécie de microrganismos.doc 28 6/7/2011 .0. b) características morfológicas: as dimensões das células. Antes de se identificar e classificar um microrganismo. originada do crescimento de uma única célula microbiana. seus arranjos. mesmo hoje. a diferenciação e a identificação de suas estruturas. quanto mais informações forem coletadas sobre os microrganismos existentes. Se dois ou mais tipos crescem juntos tem-se uma cultura mista. assim como a determinação das relações entre o ADN isolado de diferentes microrganismos. ou seja. suas características devem ser determinadas com detalhes adequados. d) características de composição química: a identificação dos principais e típicos constituintes químicos da célula. Classificação em Nível de Gênero Fermentacaoalcoolica v2. f) características genéticas: a análise da composição do ácido desoxiribonucleico (ADN).Por esta razão é comum se trabalhar com culturas puras. Além disso. de fato. Uma vez que as características de um microrganismo tenham sido adequadamente determinadas e catalogadas. As principais a serem determinadas ou observadas. Entretanto é comum. incluem as seguintes: a) características culturas: os nutrientes exigidos para o crescimento e as condições físicas do ambiente que favorecem o desenvolvimento. é possível identificá-lo pela consulta a livros de referência que contêm descrições das espécies microbianas (exemplo: Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology). descobrir que o organismo que está sendo pesquisado é muito diferente de qualquer um dos que foram descritos anteriormente e pode. as idéias a respeito de seus agrupamentos podem sofrer modificações. e) características antigênicas: a detecção de componentes especiais da célula que fornecem evidência de semelhança entre as espécies. c) características metabólicas: a maneira pela qual o microrganismo desenvolve os processos químicos vitais. tratar-se de uma nova espécie.

Assim a identificação segura destas bactérias requer métodos sofisticados. Crescimento a determinadas temperaturas é usado pra distinguir cocos.5% de sal pode ser usada para distinção entre Enterococcus. Os Enterococcus são considerados bem tolerantes a pH extremos. A tolerância a acidez e alcalinidade pode ser usada para distinção entre os gêneros. (2) crescimento a determinadas temperaturas. Enterococcus crescem a 10°C e 45°C. Classificação em Nível de Espécie As análises das características fenotípicas são ainda importantes na classificação preliminar e no conhecimento de algumas propriedades importantes do ponto de vista industrial. Deve-se considerar que há superposição nos fenótipos entre os diferentes gêneros. Os Pediococcus e Aerococcus são morfologicamente idênticos. além de ácido láctico . mas não a 45°C e Estreptococcus não cresce a 10°C e a 45°C é variável conforme a espécie.doc 29 6/7/2011 .láctico e os Lactobacillus DL-láctico. (7) tolerância a sais de bile. (9) produção extracelular de polissacarídeos. as que formam. e exeções as características consideradas típicas são bastante freqüentes entre as bactérias.0. A formação de diferentes isômeros de ácido láctico na fermentação da glicose pode ser usada para distinguir Leuconostoc e Lactobacillus heterofermentativos. (10) demanda de fatores de crescimento. vitaminas e disponibilidade limitada de oxigênio). (5) hidrólise da arginina. (11) presença de certas Fermentacaoalcoolica v2. A divisão celular em um ou dois planos é importante na diferenciação dos cocos. (3) configuração do ácido láctico produzido. (6) formação de acetoína (teste Voges Proskauer). Lactococcus e Vagococcus a 10°C. (4) fermentação de diferentes carboidratos. Nessas condições as bactérias são divididas em dois grupos: (1) homofermentativo. ácido acético. Uma característica importante na diferenciação de bactérias em nível de gênero é o tipo de fermentação da glicose em condições padronizadas ( suprimento ilimitado de glicose e de fatores de crescimento como aminoácidos.A morfologia celular é ainda uma característica muito importante na descrição dos gêneros de bactérias. gás carbônico e etanol. mas os Pediococcus são mais tolerantes a ácidos e crescem em condições estritamente anaeróbias. envolvendo um número grande de provas bioquímicas. Lactococcus e Estreptococcus. Os Leuconostoc produzem apenas ácido D . envolvendo aquelas que convertem glicose quase exclusivamente a ácido láctico e (2) heterofermentativa. (8) tipo de hemólise. Assim as bactérias são divididas em bastonetes e cocos. A tolerância a 6. Algumas características importantes em nível de classificação de espécie são: (1) tolerância a pH e sal.

5 μm). Bacillus megaterium Aeróbios.2 μm). esporulados. ácido de glucose (v). (5) composição de ácidos graxos e (6) mobilidade eletroforética de desidrogenase do lactato. (4) relação de G + C no DNA. Gram (+) e com mobilidade. Outras características incluem a taxonomia molecular e quimiotaxonomia. esporos elíptico central.21.81. levana extracelularmente de sacarose. catalase (+).8. esporulados. catalase (+).0-3. catalase (+).5-4. isolados e raramente em cadeias. Aeróbios ou anaeróbios facultativos.0 μm x 0. ácido de glucose. esporo elíptico central ou terminal. tendência à formar pequenas cadeias trançadas. T ótima 30-37ºc (mínima 5-20ºC). Fermentação da glucose com produção de 2.doc 30 6/7/2011 .0 μm x 0. Bastonetes (2.5. Gram (+) e com mobilidade. Aeróbios. esporulados. Bacillus brevis Bastonetes (1. Espécie Bacteriana Bacillus subtilis Características Morfológicas e Citológicas Características Fisiológicas Produtos do metabolismo Bastonetes (2. T ótima 30ºC (mínima 3-20ºC e máxima 35-45ºC).0-5. Espécie Bacteriana Características Morfológicas e Citológicas Características Fisiológicas Produtos do metabolismo Fermentacaoalcoolica v2.0. isolados e raramente em cadeias. (2) presença e tipo de ácidos teicóicos. T ótima 30-35ºC (mínima 10-35°C e máxima 40-60ºC). ativo em pH 5.enzimas. Gram (+) e com mobilidade.0 μm x 1.70. esporo elíptico central. como (1) tipo de peptidoglicanas de ácido diamínicos.3 butanodiol + acetoína + CO2. (3) presença e tipo de menaquinonas.8 μm). (12) características de crescimento no leite e (13) tipificação sorológica. Grupos Relevantes em Usinas de Açúcar e Álcool Veremos a seguir a descrição de algumas espécies dos diferentes gêneros de bactérias que frequentemente são encontradas como contaminantes do processo de produção de açúcar e álcool.5 .

.9.0 μm) isolados e em cadeias.0. homofermentativos: ácido lático de glucose.5-0. heterofermentativos: ácidos de glucose. Espécie Características Morfológicas Características Fisiológicas - Fermentacaoalcoolica v2. Gram (+). catalase (-). Lactobacillus plantarum Bastonetes (3. Bacillus stearothermophilus Bastonetes (2. raramente com motilidade. frutose e sacarose. ác.5-5. frutose e sacarose. Anaeróbios facultativos.5esporulados.5-5. catalase (-). pH Ótimo: 5. catalase (-). Aeróbios ou anaeróbios facult.. catalase (+).3 butanodiol + acetoína + ác. não esporulados. Anaeróbios facultativos. pH mínimo p/ cresc.91.Bacillus coagulans Bastonetes (2.doc 31 6/7/2011 .2 μm). raramente com motilidade. Gram (+).0 μm). heterofermentativos: produção de ác. Gram (+) não esporulados. ácido de glucose.0-4. lático + 2. isolados e/ou em pequenas cadeias. lático + acetato + etanol + CO2 de glucose. T ótima 30-40ºC (15ºC (-) e 45ºC (+)) pH ótimo 5. 45-50ºC (mínima 35ºC e Lactobacillus fermentum Anaeróbios facultativos.8 μm). Gram (+) e com motilidade. fermentação de glucose com produção de ác. T ótima 40ºC (15ºC (-) e 45ºC (+)). 1.9 μm de largura e comprimento muito variável). Gram (+) e com motilidade. isolados e/ou aos pares. T ótima 35-40ºC (mínima 15-25ºC e máxima 5560ºC.5-5.8.0.5-5. não esporulados.61. frutose e sacarose. raramente com motilidade. catalase (+). 4.0-9. pH ótimo: 5.0-8. T ótima máxima 65ºC). T ótima 30-40ºC (15ºC (+) e 45ºC (-)).8. esporo elíptico central ou terminal. Lactobacillus delbruecki Bastonetes (2. esporo oval terminal.05. de glucose. Bastonetes (0.0 μm x 0. aos pares e/ou em pequenas cadeias. Aeróbios.0 μm x 0. esporulados.0 μm x 0. acético + etanol.50.0 μm x 0. isolados. principalmente isolados.

manitol. não esporulados e sem motilidade Anaeróbios facultativos catalase (-).0-3.0-4. heterofermentativos: ácidos de glucose. heterofermentativos: ácidos de glucose. maltose. maltose.5-5.8. pares e cadeias. frutose. xilose. celobiose.doc 32 6/7/2011 .0 μm x 0. T ótima 30-35ºC (10ºC (+) e 45ºC (-) ). T ótima 30-35ºC (10ºC (+) e 45ºC (-) ).Bacteriana Lactobacillus helveticus e Citológicas Produtos do metabolismo Bastonetes (2.0 μm x 0. Gram (+) e sem motilidade Espécie Características Morfológicas Características Fisiológicas - Fermentacaoalcoolica v2. Anaeróbios facultativos.0 μm) isolados.71. não esporulados. heterofermentativo facultativo: ácido de glucose. raramente com motilidade. 0.5-5. Lactobacillus brevis Bastonetes (2. raramente com motilidade Lactobacillus yamanashiensis Bastonetes (2. hemofermentativos: produção de ácido lático de glucose. Gram (+). aos pares e/ou em pequenas cadeias. sacarose. Anaeróbios facultativos.51. ramnose. catalase (-). ótima 30-40ºC (15ºC (-) e 45ºC (+)). catalase (-). pares.1 μm) isolados.0 μm x 0. catalase (-). não esporulado. T ótima 30-40ºC (15ºC (+) e 45ºC (-)). Gram (+). não esporulados. isolados.0-6.0. arabinose. heterofermentativos: ácido lático de glucose.0 μm). Anaeróbios facultativos.81. frutose e sacarose. pH ótimo: 5. pares e cadeias. frutose e sacarose. T ótima 30-35ºC (15ºC(-) e 45ºC (-)).61.0-3. Gram (+). frutose.7 μm). galactose. Lactobacillus vaccinostercus Bastonetes (1.8. catalase (-). isolados e em pequenas cadeias.5- Anaeróbios facultativos.0 μm x 0.0-6. não esporulados e com motilidade Lactobacillus coryniformis Bastonetes (1. Gram (+).0 μm). T. galactose. pH ótimo: 5.0 μm x 0. ribose.

0. aos pares e em pequenas cadeias.0. raramente com motilidade. com extremidades arredondadas. oxidase (-).04.7-0.0 μm). Gram (+). Espécie Características Morfológicas Características Fisiológicas - Fermentacaoalcoolica v2. não esporulados. geralmente com crescimento em pH < 5. 4. crescimento a 45ºC (-).5-6.56. aos pares e em cadeias.0curtas. Lactobacillus fructosus Bastonetes (0. Gram (+).0 μm). Gram (+). pH favorável 5. não esporulados. fermentação da glucose (+).Bacteriana Lactobacillus viridescens e Citológicas Produtos do metabolismo Bastonetes (0. fermentação da glucose (+). isolados ou aos pares.0 μm x 2.5-0. Anaeróbios facultativos. crescimento a 15ºC (+).05. frutose (+) e sacarose (V). geralmente com crescimento em pH < 5. cresce em pH < 5. não cresce em pH > 6. não esporulados.0.7-1. crescimento a 15ºC (+). frutose (+) e sacarose (-). crescimento a 45ºC (-). Anaeróbios facultativos. pode utilizar etanol para crescimento. raramente com motilidade.0 μm). crescimento a 15ºC (+). crescimento a 45ºC (-).0 μm).0. fermentação de glucose (+). frutose e sacarose (+).5-0.9 μm x 2.8 μm x 154. crescimento a 45ºC (-). frutose (+) e sacarose (V). não esporulados. Anaeróbios facultativos. fermentação de glucose (+). raramente com motilidade.5-6. pH 5. isolados e em cadeias heterofermentativos.2. Microaerófilos. acidófilo (pH favorável 5. isolados. heterofermentativas. sem motilidade. extremidades arredondadas. pH 5. catalase (-). isolados.2. Lactobacillus fructivorans Bastonetes (0.0). Gram (+). heterofermentativos. Lactobacillus buchneri Bastonetes (0.doc 33 6/7/2011 .8 μm x 2.0.0. heterofermentativos.

crescimento a 15ºC (-).6-0. Anaeróbios facultativos.7 μm). homofermentativos com produção de DL-ácido lático. Microaerófilos. crescimento a 37ºC (+).7-1. catalase (-). ácido de frutose (+). glucose.0-5. pares ou em cadeias. sacarose (+). crescimento em 10% (-). rafinose. fermentação de carboidratos resultando em D (-) ácido lático e etanol ou ácido acético ao invés de etanol.56. Espécie Bacteriana Características Morfológicas e Citológicas Características Fisiológicas Produtos do metabolismo Fermentacaoalcoolica v2. crescimento a 45ºC (+). não esporulados.0 μm x 0. crescimento em pH 4. esporulados e com motilidade. raramente com motilidade. T. de glucose. heterofermentativos: ác. glucose (+). sacarose.7(+). sem motilidade. frutose e sacarose.2 μm x 0. frutose (+). aos sem motilidade.doc 34 6/7/2011 . Anaeróbios facultativos. Sporolactobacillus sp Bastonetes (3. crescimento em pH 4.5. pH ótimo 5. crescimento 10% etanol Leuconostoc dextranicum Células esféricas ou lenticulares (0. 0. fermentação de glucose (+).5-0.9 μm x 1.0. não esporuladas. isolados.7 μm). Gram (+). não produz gás. (mínima 10ºC e máxima 37ºC). ótima: 20-30ºC. não esporulados.7-1.Bacteriana Lactobacillus acidophilus e Citológicas Produtos do metabolismo Bastonetes (0. Gram homofermentativos: ácido lático Leuconostoc mesenteroides Células esféricas e frequentemente lenticulares (0. catalase (-) de frutose.50. oxidase (-). sacarose (+).8 (-).5-6.0 μm). Formação de dextrana. Gram (+).2 μm x 0. (-). aos pares e em pequenas cadeias. catalase (-). esporos elípticos terminais.8 (-). Gram (+). aos pares ou cadeias. maltose.8 μm) isolados e pares. Anaeróbios facultativos.

Leuconostoc lactis Células esféricas e frequentemente lenticulares (0. sem motilidade. Tº ótima: 35ºC (40ºC (+). aos pares ou em tétrades.8-1. catalase (+). (-). não esporuladas. não esporulado. pares ou em cadeias.0 (pH 4.7-1. sem cápsula. aos sem motilidade. Temperatura Ótima: 3035ºC (crescimento 37ºC (+)).2 μm x 0.0 μm de ∅). sem cápsula. Anaeróbios facultativos. de glucose. sem motilidade.5 (v)). T ótima: 25-30ºC. catalase (-). 40ºC (-)). sem cápsula.5-0.0.6 μm de ∅). não exibe metabolismo fermentativo.0 (+) e 8. Gram (+). Gram (+).0-6. heterofermentativos: ác. pH ótimo 5. (mínima 10ºC e máxima 40ºC). sem motilidade. Aeróbios (oxidativos). T ótima: 30ºC (crescimento 35ºC (+). frutose e sacarose. catalase (+). Anaeróbios Facultativos.5 (-)).5-6. sem motilidade. catalase (-). Ácido de glucose. predominante em tétrades. catalase (-). temperatura ótima: 3037ºC. Espécie Características Morfológicas Características Fisiológicas - Fermentacaoalcoolica v2. Gram (+). não esporulados. não esporulado. não esporuladas. Células esféricas (0. Pediococcus pentosaceus Cocos (0.0 μm de ∅). formação de dextrana.6-1. Pediococcus parvulus Anaeróbios facultativos. homofermentativos: ácido lático de glucose e sacarose (v).8-1. sem cápsula.6 μm de ∅) isoladas.doc 35 6/7/2011 . Gram (+). pH ótimo 5. aos pares ou em tétrades. pH ótimo 5.7 μm). homofermentativos: ácido lático de glucose. crescimento 10% etanol Micrococcus lylae Células esféricas (0.0 (+) e 8. 50ºC (-). crescimento em pH 4. aos pares e ocasionalmente em tétrades e cachos.0 (pH 4.0-6.8-1. Micrococcus halobius Aeróbios (Oxidativos).8 (-). Cocos (0.0. Gram (+).

doc 36 6/7/2011 .0.Bacteriana Pediococcus acidilactici e Citológicas Produtos do metabolismo Células esféricas (0. Gram (+). sem motilidade. sem motilidade. catalase (-). homofermentativos: ácido lático de glucose e sacarose (v). colônias negras brilhantes em BairdParker Agar. não esporuladas. aos pares e ocasionalmente em tétrades. 45ºC (v)). pH ótimo 7. aos pares. Aeróbios ou anaeróbios facultativos. crescimento em pH 7. tétradas e cachos. T.catalase (+). não esporuladas. T ótima: 35-40ºC (15ºC (+).5 μm de ∅). Gram (+). catalase (-). não esporuladas. fermentação de glucose com produção de DL ou L (+) lactato. crescimento entre 18 e 40ºC (+). Anaeróbios facultativos. Espécie Bacteriana Características Morfológicas e Citológicas Características Fisiológicas Produtos do metabolismo Fermentacaoalcoolica v2. crescimento a 50ºC (+). Staphylococcus sp Células esféricas (0. 45ºC (-). com 0. sem motilidade. Staphylococcus xylosus Células esféricas (0.5 μm de ∅). oxidase (-). isoladas. pH 9. catalase (+). 1. Lactococcus lactis Células ovais alongadas no sentido das cadeias.5cadeias. frutose e sacarose. metabolismo oxidativo e fermentativo: ácidos de glucose. Gram (+). ótima: 30ºC sensibilidade a penicilina. sem motilidade. gelatinase (+). não esporuladas.6 (-)).0 μm de ∅.2 μm de ∅).0-7. ácido de sacarose (-). tolerância a até 10% de NaCl.5.5-1. aos pares ou tétrades. Anaeróbios facultativos.0(+). isoladas.0 (pH 9. pH ótimo: 6. Anaeróbios facultativos. colônias amarelas/laranja em Staphylococcus medium 110. aos pares ou em (10ºC(+).07.5 (+).5-1.6-1. Gram (+). algumas espécies crescem a 45ºC. T ótima = 40ºC. isoladas são raras e nunca em cadeias.

doc 37 6/7/2011 . pH ótimo: 7. resistente a penicilina. com ou sem cápsula. Nestas condições acentua-se a sedimentação das células de leveduras nas dornas e interfere na operação das centrífugas contínuas. móteis por flagelos peritrigueos acético e fórmico.1-1. Gram (-).5 μm). A anaerobiose reprime a floculação e a aerobiose induz a formação de proteína responsável pela floculação. por agentes químicos ou microbiológicos.0 μm).0. Além do fator genético há outros que interferem ou inibem a sua ação.5-2. fermentação ácido-mista (produção de ácidos lático. Gram (-). Nas usinas alcooleiras. o termo floculação é normalmente usado para designar o fenômeno reversível de agrupamento celular que comumente se desenvolve no final da fase exponencial de crescimento ou na fase estacionária.5 μm Metabolismo oxidativo. Estudo do fenômeno da floculação No estudo de leveduras.5 μm x 2. as leveduras floculentas estão normalmente presentes como contaminantes das leveduras normais (não floculentas).0. não esporulados. T ótima: 30-32ºC. isolados. aos pares e em pequenas cadeias. A diferença da estrutura entre linhagens floculentas e não floculentas não pode ser detectada pela análise química. relativamente lisa. ácidos de glucose. a presença de leveduras floculentas em concentração superior a 12% causa dificuldade significativa na operação de centrifugação do vinho devido ao fenômeno de co-floculação. a partir de glucose). O fator responsável pela floculação de leveduras é governado geneticamente. Escherichia coli Bastonetes (1. fermentação de lactose com produção de gás. ou sem motilidade. catalase (+). sem motilidade. mas pode ser visualizada por microscopia eletrônica. x 1. Fermentacaoalcoolica v2. não esporulados. aos pares. Na fermentação alcoólica industrial. T ótima = 37ºC. oxidase (-).06.Acinetobacter calcoaceticus Bastonetes curtos (1. resistência a KCN (±). Isto pode ser causado pela ação de propriedades inerentes das células. O meio de cultivo também interfere na floculação. Anaeróbios facultativos. As células floculentas apresentam superfície fimbriada ou ciliada e as não floculentas.0-1.

Além disso. Na fermentação alcoólica industrial é freqüente a contaminação por bactérias do gênero Lactobacillus. A necessidade de íons Ca+2 para floculação depende do pH sendo que em concentrações elevadas (> 10-1 M) há desfloculação das células. e a sua interação com células de levedura é afetada com variação de pH. A floculação é dependente do Ca+2 em quantidades mínimas (10-6 a 10-8). associada o grupo carboxila da proteína da parede celular. a manose causa a desfloculação. A interação se estende por toda área causando distorção da parede no local do contato. Algumas dessas bactérias são capazes de provocar a floculação de leveduras como. plantarum.0. mas também pode ser que o íon Ca+2 atue como cofator na ativação da capacidade de ligação da proteína com a manana.O mecanismo exato de floculação da levedura não é conhecido. e atua somente ao redor de pH 4.0 e 4. Já glicose. O envolvimento da manana é indicado por diversos experimentos: (1) A floculação é inibida competitivamente por manana.0). maltose e sacarose não produzem nenhum efeito. mas depende do pH. O fenômeno ocorre a pH entre 2. Esta floculação apresenta algumas características similares às leveduras floculentas. Lactobacillus fermentum. A força de ligação entre as células floculentas pode ser dada pela ponte de hidrogênio ou polissacarídeos da parede celular e íon Ca+2. necessidade de íons metálicos e inibição por manose e excesso de íons.0 enquanto que Ca+2 atua a intervalo de pH maior (pH >3. Como no caso de leveduras floculentas. Esse componente protéico está associado à parede celular não podendo ser removido pelo calor ou tratamento químico. proteinase e pH’s extremos. Trabalhos realizados com linhagens floculentas mostraram que a manana da parede celular participava da floculação. como susceptibilidade às altas temperaturas. (2) A hidrólise de proteína de células não floculentas ou floculentas não altera a sua interação com células floculentas intactas.doc 38 6/7/2011 . No caso da floculação causada por Lactobacillus fermentum o fator responsável é de natureza protéica encontrado na célula bacteriana. Magnésio pode substituir Ca+2. por exemplo. presença de íons e manose. O sítio susceptível à temperatura e proteinase está localizado na célula bacteriana e não na levedura. indicando que existe um número fixo de sítios na levedura para formação do agregado. é termolábil e destruído por proteinase.0 e é inibido por sais neutros. O tratamento térmico aplicado sobre a célula bacteriana provoca a perda da sua capacidade floculadora. há uma relação numérica celular entre a bactéria e a levedura onde se consegue o máximo de floculação. O Fermentacaoalcoolica v2. Uma floculação específica também pode ser causada por L. É possível que a ligação seletiva de Ca+2 com proteína seja mediada por arranjo específico do grupo carboxila.

torna o controle do processo de floculação um desafio de grande importância e dificuldade. Já os testes de sedimentação. a) Condições de cultivo de células para o teste de floculação Fermentacaoalcoolica v2. Embora os flocos grandes que se formam sejam visíveis a olho nú. temperatura. bem como o grande volume de mosto manuseado durante a fermentação alcoólica industrial. pH. A redução da absorbância pela formação de agregado celular pode ser medida em espectrofotômetro. a técnica da absorbância tanto da parte não floculada (sobrenadante) como do sedimento formado após a ressuspensão. mesmo os mais simples que se baseiam na observação visual do sedimento formado. é essencial a padronização das etapas para a sua medida porque a floculação é afetada por íons e outros componentes do meio. usando como parâmetro a velocidade ou grau de sedimentação dos flocos formados. é uma técnica trabalhosa e demorada. mas a maioria das técnicas encontradas em literatura mede indiretamente. grau e forma de agitação.0. No geral. essa observação fornece resultados apenas qualitativos. Nas diversas técnicas disponíveis. Para medir a sedimentação usa-se no geral.estudo da mobilidade eletrostática das células de bactérias e levedura mostrou que a floculação era causada pela atração eletrostática entre as superfícies celulares de bactérias e leveduras com cargas opostas. fornecem resultados mais consistentes. Com a elucidação das causas envolvidas neste processo são prováveis que se obtenham meios eficientes e econômicos para o controle da floculação. a estimativa das células do sedimento formado ou remanescente na suspensão após a sedimentação é feita por turbidimetria. A seguir é apresentada uma das técnicas utilizadas para se avaliar a floculação. O exame direto do material ao microscópio. que é uma forma indireta de avaliar o grau de floculação. Medida da Floculação Algumas técnicas medem diretamente a floculação através do exame microscópico ou redução da turbidez da suspensão celular. Assim. além de estar sujeita a erros individuais do observador. as técnicas mais comumente utilizadas para quantificar a floculação consistem na medida da sedimentação. A diversidade dos microrganismos e dos agentes envolvidos na floculação do fermento nas dornas de fermentação.doc 39 6/7/2011 . embora forneça informações detalhadas como o número de células que integram cada floco e o número e diversidade de flocos em relação ao total de células de levedura.

Fermentacaoalcoolica v2. assim como o da equipe da destilaria. Hoje.YEPD. pH 7. as células serão centrifugadas a 2000 G por 10 minutos a 4°C e lavadas duas vezes com solução EDTA 0. Por outro lado. pH 4. utilizando como inóculo 1% de um cultivo de 24 horas em caldo . Esta ferramenta de trabalho foi uma nova luz na seleção de novas leveduras para a fermentação em escala industrial.7. As bactérias devem ser cultivadas em caldo MRS por 24-48 horas a 30°C. esse intervalo de tempo caiu para apenas três dias.0 .doc 40 6/7/2011 . sendo posteriormente ressuspendidas em tampão citrato 0. medindo-se sua absorbância em espectrofotômetro a 600nm. Após o crescimento. Com o avanço nas metodologias e pesquisas. também nos indica se estamos com leveduras não Saccharomyces que podem ser prejudiciais ao rendimento fermentativo e produzir muita espuma. Monitoramento e interpretação dos dados do laboratório industrial O acompanhamento analítico do processo é condição sine qua non para se obter alto rendimento. O entrosamento laboratório e gerência do processo ou produção é básico também. b) Teste de floculação Os testes de floculação devem ser realizados de acordo com o método de Stratford & Keenan (1988). Serão adicionados em tubos de ensaio (16 x 150 mm) 3 ml da suspensão de leveduras. se acompanha até a linhagem da levedura que está dominando a dorna com a ajuda da técnica de cariotipagem do DNA cromossômico.0. sendo que após 5 minutos. utilizando como inóculo 1% de um cultivo de 24 horas em caldo .5 ou tampão Tris-HCl 10-1 M. Há dezenove anos atrás não se fazia contagem de bactérias ao microscópio. e é claro o conhecimento era muito menor. A seguir os tubos serão agitados manualmente por 2 minutos. E a meta é ser cada vez mais rápida.5 ml). adaptado para a utilização de suspensões mistas de leveduras e bactérias. serão coletados 3 ml da amostra do sobrenadante.As leveduras devem ser cultivadas em caldo YEPD por 24-48 horas a 30°C. Em algumas ocasiões era necessário mais de um mês para debelar uma contaminação e neste tempo as perdas em rendimento eram enormes. além de retardar a fermentação.05M acrescido de EDTA 0. O investimento em treinamento de pessoal e criar equipe têm um retorno rápido e seguro.MRS.025M.5. em dois anos. com auxilio de um pipetador automático.005M. 3 ml da suspensão de bactérias e solução de CaCl2 5x10-2M em quantidade suficiente para se obter uma concentração final de 1x10-2M (1.

Os números apresentados na Tabela a seguir não são fixos e no futuro. Tabela para interpretação das análises laboratoriais Amostra Análise Observação cana PCTS caldo do 1º terno e caldo misto bactérias nº bast/ml < 104 = ótimo 1.0 . e o chefe da destilaria não "domine" o laboratório.10 = bom 103 .5.29ºC = normal acima 100 mg/l afeta fermentação deve ser menor que 2 quanto menor.0g H2SO4/litro = normal idem caldo decantado 27 .0 .35% = normal um pouco acima das contagens das Fermentacaoalcoolica v2.0 x 105 = bom 6. melhor 200 ppm 40-60 ppm 1000-1500 ppm 50-150 ppm até 25% = baixo 26% . O entrosamento entre o laboratório e a destilaria é fundamental.0.9. estes números poderão sofrer alterações. é necessário se ter uma idéia de como as análises do laboratório pode ajudar no julgamento do processo de fermentação e destilação.0 x 105 = regular > 106 = mau acima de 2 significa moenda suja < 102 2 3 relação contagem bactérias caldo misto/caldo 1º terno caldo decantado bactérias nº bast/ml = ótimo 10 . Devem-se estabelecer regras rígidas para que o chefe do laboratório não ultrapasse a linha de atuação do controle.doc 41 6/7/2011 .105 = regular para mau > 105 mosto acidez bactérias bast/ml temperatura SO2 Ca/Mg Ca Mg+ NH4 K P levedo tratado ou % levedo bactérias bast/ml = mau até 2. O bom senso deve sempre prevalecer.104 = regular 104 .Para um bom acompanhamento do desempenho de destilaria.

dornas é normal. levedo pronto Amostra Análise Observação vinho dornas % levedo 10 . 33-35ºC.0 x 107 = regular > 6. rendimento % fermentação 91 .90% = normal > 90% = cuidado com perdas de levedura bactéria: bast/ml < 106 = ótimo 1.92 ou maior = ótimo 90 .0.0 x 106 = bom 1.doc 42 6/7/2011 .90% = regular abaixo de 88% = mau geral da destilaria ídem fermentação (não se deve perder mais que 0.13% = ótimo acima de 14% = cuidado abaixo de 10% = baixo acidez brotamento viabilidade levedura 2.107 = mau fermentação temperatura manter a temperatura o mais constante possível durante toda a fermentação.5% na destilação) global da indústria 83% e acima = excelente 81 a 83% = bom 80 .9.0 .5.91% = bom 88 .0 .0 . e acima.81% = regular abaixo de 80 = mau Fermentacaoalcoolica v2. indica contaminação 5% a 15% ideal (depende da manutenção do fermento na dorna) < 80% = alta temperatura ou muito ácido 80 .5 vezes acidez do mosto = normal.

Usar ácido e antibiótico alternados.0.0 x 106 = diminuir pH da cuba de tratamento para pH = 2. para 2.0 x 105 = verificar sanidade da torre de recuperação do álcool. O uso de antibiótico é essencial quando a viabilidade está abaixo de 70%. O tempo mínimo é ao redor de uma hora e o máximo de três horas. o ácido também vai afetar significativamente a viabilidade e o desempenho da levedura. ou há problemas nas canalizações (ponto morto) ou água de embebição. Dosagem de antibiótico deve ser de 2 a 3 ppm considerando o volume da dorna. tem muita importância pois o tratamento se torna mais eficiente.0. Bactérias no vinho Fazer teste com os antibióticos toda semana (HJ. o tempo que o fermento ficar na cuba de tratamento. precisa ser lavada. Brotamento e viabilidade da levedura Fermentacaoalcoolica v2.0 x 106 = usar biocida. Depois de quatro horas. baixar mais o pH da cuba. Obs. significa que a moenda está suja.doc 43 6/7/2011 . VM e penicilina ou outro que aparecer).: Em caso de contaminação. Se não baixar os bastonetes.2.Procedimentos Contaminação: Bactérias no caldo primário e misto Relação entre as contagens do caldo misto/caldo primário maior que dois. Bastonetes: mais que 5. Bastonetes: mais que 1. Se estiver floculando muito aplicar o ácido duas horas antes de alimentar a dorna. Bactérias na água de diluição do fermento Bastonetes + cocos: mais que 5. Nas paradas só aplicar ácido na cuba pois na dorna não tem agitação. Nas paradas usar antibiótico na cuba e não aplicar ácido algum.

doc 44 6/7/2011 .0g H2SO4/litro pode ser normal.5 vezes a acidez do mosto. melhor. pois deve estar havendo caramelização. às vezes pode estar abaixo de 2. pois vai-se atingir o numero ideal de células em menor tempo. dependendo do tipo de contaminação: bastonetes pode-se usar penicilina. ou alta de mais (» 38ºC). faça o combate indicado. dependendo se há ou não contaminação). Acima de 15% de brotamento: verificar temperatura máxima da fermentação (dornas). é porque está havendo contaminação. Entretanto.5 a 1. Verificar temperatura da fermentação. Geralmente é temperatura alta. indica contaminação no caldo ou mosto. kamoran HJ. Viabilidades acima de 90% freqüentemente indicam perda de fermento na centrífuga ou no fundo de dorna. Brix do mel muito alto e pureza baixa favorecem acidez alta e caramelização.0g H2SO4/litro. isto é. quanto maior o brotamento. Vinho: Se for maior que 2.No início da safra. se estiver usando e for necessário). às vezes está muito baixa (abaixo de 30ºC). virginiamicina ou antibiótico. se estiver alto. acidez até no máximo 1.0 (elevar o pH para 2. para isto basta termos alto teor alcoólico junto com alta temperatura. cristalizador ou bombeamento. Mosto de caldo. Acidez: Mosto: mosto de melaço. a porcentagem de brotamento deve ser a menor possível. pode estar muito alta. Fazer teste em espectrofotômetro ou Δ acidez para verificar qual é o melhor Fermentacaoalcoolica v2. A viabilidade deve estar entre 80 a 90%. Pode-se ter perda com viabilidade baixa. Se for maior. Se for maior procure averiguar.2 ou mais. Abaixo de 5%: verificar contagem de bactérias. quando a quantidade de fermento está estabilizada. Baixar o pH da cuba. diminuir ou eliminar o sal sulfato de amônia ou uréia e outros (menos o zinco. desde que se mantenha a porcentagem de fermento estável na dorna.0. queima de açúcar no vácuo. Verificar acidez do mel (se for o caso). e até se atingir cerca de 6% de fermento na dorna. a acidez gira em torno de 0. Pode ser também muita perda de fermento na centrífuga ou no fundo de dorna. Verificar o pH da cuba de tratamento.5 a 2. o que indica uma boa recirculação de fermento e pouca perda.

5. Vinho: centrifugado (turbinado). Se estiver trabalhando com Brix acima de 20. Acima de 75% cuidado para não perder muito no vinho centrifugado (turbinado).0.0% pode parar a centrífuga para a lavagem.0. Fermentação: Temperatura: Procurar manter as temperaturas máximas indicadas na Tabela. até 13%. Caso use caldo não decantado. pois a cada grau centígrado acima de 33ºC o rendimento fermentativo decresce de 0. Acima de 1. pois as perdas são mais freqüentes.5. baixar. Floculação: Tanto na dorna como na cuba. tiver centrífuga suficiente.2. melhor.2%. O ideal é trabalhar com concentrações entre 10% e 13%.8% a 1. e se estiver a 2. tolera-se perdas até 2%.Levedura (fermento): Dorna: Quanto maior a se quantidade de fermento na dorna. Se não for contaminação comunicar os superiores e solicitar que entrem em contato a Fermentec. Use bicos nas centrífugas compatíveis com o teor de fermento na dorna. Baixar o Brix do mosto um ou dois pontos se o Brix for até 20. baixar para 2. principalmente de bastonetes. reduzir para 22 Brix se começar a flocular. pois deve estar suja.doc 45 6/7/2011 . alimentar a dorna mais devagar para que a temperatura não se eleve demais. Verificar contagens. baixar para 2. Se for contaminação aplicar os antimicrobianos indicados. Verificar temperatura máxima das dornas em fermentação. Entretanto cuidado dobrado quando estiver trabalhando com teores altos. Creme ou leite: Teores de 70 a 80% são ideais para a fermentação. Se a Fermentacaoalcoolica v2. quatro pontos: Exemplo: Estamos trabalhando com 26 de Brix no mosto. e a perda é alta.5% indicam apreensão. já vista e se não conseguir. Dextrana pode fazer flocular o fermento. Se estiver a 2. Teores acima de 0. do contrário os bicos vão entupir com facilidade e aí fica difícil operar. baixar o pH do fermento na cuba para 2.2. mesmo com baixa contaminação (nível de 106).

para baixar a temperatura destas e atrasar a fermentação (paradas até de 3 horas).Se a moenda parar e não houver mel ou xarope suficiente para trabalhar com mel ou xarope e água. com mel mais água. baixar um pouco ou deixar aí mesmo. alimentar mais rápido. mas apenas com uma diferença: não colocar ácido. . injetar ar na dorna.doc 46 6/7/2011 . se for menor que 50%. com mel mais caldo. Checar todos os outros parâmetros. Paradas: . arejar o tempo todo de tratamento (2 a 3 horas. Se o pH for menor que 2. e aplicar antibiótico (com o teste da Fermentec. É importante saber porque a viabilidade caiu. . fazer uma "injeção" de uma dorna que esteja fermentando bem e com uma temperatura acima de 32ºC.Se houver mel. . Exemplo: o Brix estava em 18. Se não houver possibilidade de enviar mosto quente. Fermento que não quer pegar: . não mais) e voltar este fermento para a dorna (não arejar na dorna) até que Fermentacaoalcoolica v2.0 fazer uma "injeção" de uma outra dorna que já esteja cheia e fermentando. . alimentar com mosto mais quente. centrifugar todo o vinho das dornas e destilar todo este vinho (se não houver bagaço. refrigerar mais as dornas.0. verificar qual o melhor antibiótico para esta ocasião). suba o Brix para 22 e espere o resultado do laboratório para ver se é preciso subir mais. Se estiver abaixo de 29ºC. O fermento centrifugado é colocado na cuba e recebe um tratamento igual ao normal.Verificar a porcentagem de células vivas (viabilidade). ou se não for possível.Verificar a temperatura da dorna. trabalhar com um Brix maior.0.temperatura for baixa.Se a parada for maior que seis horas. aplicar 20 kg de sulfato de amônia ou uréia mais Quinfóz (10 kg) para cada 100 m3 de dorna. até o pH desta dorna se elevar pelo menos a 3. Diluir o fermento com água o mais que puder.Verificar o pH do pé de cuba. alimentar com mosto a 40ºC até a temperatura subir para 33ºC. agora. gaste lenha).

minerais.0.) e biossínteses. alguns que estimulam outros que reprimem a ação enzimática. adicionar soda até pH 3. mas apenas em condições de aerobiose. motivo pelo qual. inibidores. o desempenho do processo. vitamina.haja mosto para reiniciar a fermentação novamente. realiza a fermentação do açúcar com o objetivo de conseguir energia química necessária à sua sobrevivência. substancias do próprio metabolismo. ele se acumula no fundo. O objetivo primordial da levedura ao metabolizar anaerobicamente o açúcar. É mais fácil de iniciar a fermentação se o fermento estiver na cuba.doc 47 6/7/2011 . temperatura. etc. Na dorna. Em termos energéticos a respiração é muito mais eficiente (produção de ATP) do que a fermentação. A fermentação alcoólica (glicólise anaeróbica) ocorre no citoplasma. enquanto que a oxidação total de açúcar (respiração) se dá na mitocôndria. condições ideais para que as mesmas trabalhem a seu favor. afetando assim. isto é.). O fermento assim tratado agüentará muitos dias. . perpetuando assim a espécie. cada qual catalisada por uma enzima específica. pH. sendo o etanol apenas e tão somente um subproduto desse processo. Se o ácido já tiver sido aplicado em alguma cuba.5. sem utilidade metabólica para a célula em anaerobiose. e na cuba temos agitação. gerando mais ATP e biomassa. crescimento e multiplicação. Fatores que afetam o desempenho fermentativo A levedura como entidade viva independente. excreção. ele deve buscar os conhecimentos que lhe permitam propiciar as leveduras. A transformação do açúcar (glicose) até resultar em etanol e gás carbônico envolve 12 reações em seqüência ordenada. Se o homem pretende beneficiar-se dessa habilidade metabólica. com maior eficiência na produção de etanol. O etanol e o gás carbônicos resultantes se constituem em produtos de excreção. para depois "arrear" o fermento na dorna. Fermentacaoalcoolica v2. Deixar o maior volume de fermento que puder. A célula de levedura possui compartimentações para adequação de sua atividade metabólica.Devem-se deixar umas dornas cheias de vinho centrifugado prontas para destilar nas paradas para acertar o balanço de vapor quando reiniciar a fermentação e destilação. nas cubas. Entretanto o etanol e outros produtos de excreção podem ser oxidados metabolicamente. etc. a oxigenação permite uma maior multiplicação da levedura. é gerar uma forma de energia química (ATP) que será empregada na realização dos diversos trabalhos fisiológicos (absorção. Tais enzimas sofrem ações de diversos fatores (nutrientes. necessários à manutenção da vida.

0. da formação de ácidos orgânicos (succínico e acético) e do crescimento da levedura. A espécie Debaryomyces hansenii. A fermentação alcoólica é um processo não oxidativo. Dados de laboratório demonstram que incrementos no teor de K+ de 1. O glicerol é considerado um metabólito osmorregulador. Tipo de levedura influencia na produção de glicerol.Durante a fermentação. da pressão osmótica do meio. De maneira que as leveduras Fleischmann e TA. como um desvio. intrínsecas à formação de etanol. para se manter o equilíbrio de redox celular. etc. rotas metabólicas alternativas aparecem para propiciar a formação de materiais necessários à produção de biomassa (polissacarídeos.000 mg/litro aumentam significativamente a produção de glicerol. os ácidos orgânicos (principalmente o succínico e o acético). acumula o glicerol que produz. ácidos nucléicos. enquanto que a Saccharomyces cerevisiae o excreta. A formação de glicerol é função do tipo de levedura. causando queda na eficiência fermentativa. motivo pela qual sua produção é inversamente a do etanol. A quantidade de açúcar desviado para a formação de glicerol varia até mesmo em nível de linhagens.000 mg/litro de potássio aumentando em 10 vezes o glicerol formado. os quais desviam esqueletos carbônicos provenientes do açúcar. Fermentacaoalcoolica v2.000 para 10. sem a participação do oxigênio molecular (O2). Forma-se na mesma via de síntese do etanol.) bem como para a formação de outros produtos de interesse metabólico relacionados direta ou indiretamente com a adaptação e sobrevivência. É ele. uma quantidade muito grande se comparada a algumas linhagens industriais (leveduras que aparecem e persistem no processo). e a literatura descreve valores de 56. reduzindo a produção de etanol. proteínas. que conjuntamente com a biomassa são quantitativamente os principais subprodutos metabolicamente relacionados ao equilíbrio do redox celular em anaerobiose. pois sua formação é aumentada em meios com baixa atividade de água (alta pressão osmótica) determinada pela presença de solutos tais como açúcar ou sais. na seqüência de reações de produção de ATP. e. que têm comportamentos muito parecidos.doc 48 6/7/2011 . desviam de 3 a 8% do açúcar para formar glicerol. todo NADH formado (em reações de oxidação) deve ser consumido (em reações de redução) estas acopladas à produção de etanol e glicerol. Glicerol O glicerol é o composto secundário formado em maior quantidade. portanto. por exemplo. o glicerol. na medida em que esta é uma característica genética. competindo com este pela utilização do poder redutor (NADH).

o ácido benzóico foi adicionado em meio fermentativo. quando a mitocôndria está reprimida em anaerobiose. Sua formação ocorre pela atividade residual de enzimas respiratórias. Fermentacaoalcoolica v2. a produção do mesmo é aumentada quando há excesso de NADH na célula. é necessário o consumo desse poder redutor.0. Observa-se que para a formação de um mol de succinato. que foi acompanhada por alta contaminação bacteriana.doc 49 6/7/2011 . causou drástica redução da formação de ácido succínico. quando 60% do total são produzidos. mas quando um inibidor de crescimento. que como visto. há conseqüente formação de cinco moles de NADH (poder redutor). A produção de ácido succínico ocorre em maior velocidade que a do etanol até a 1ª hora de fermentação. oxidativo. No entanto. cinco moles de glicerol serão produzidos quando ocorrer a formação de um mol de succinato. processo este. Ácido acético O ácido acético aparece na fermentação por ação principal do metabolismo bacteriano. Como a biossíntese do glicerol utiliza o poder redutor (NADH). Como a produção de um mol de glicerol consome um mol de NADH. A formação de ácido succínico é pouco variável de acordo com as condições do ambiente fermentativo. Para se estabelecer o equilíbrio de redox da célula. produz 5 NADH. Isto ocorre quando processos oxidativos se desenvolvem. tem-se que 4g de glicerol serão produzidos para cada grama de ácido succínico formado. Este poder redutor (analogamente ao descrito para o ácido succínico) é utilizado para a formação de dois moles de glicerol necessários à manutenção do equilíbrio de redox. sejam decorrentes da produção de biomassa (crescimento) ou formação de ácidos orgânicos (succínico e acético). Convertendo-se os valores molares em gramas.Em nível bioquímico. a levedura é capaz de sintetizá-lo. que é feito através da produção de glicerol. As razões fisiológicas que levam a levedura a produzir e excretar o ácido succínico (depois do glicerol é o produto secundário mais abundante na fermentação) ainda é discutível. correspondendo a um processo oxidativo. Observa-se que para formação de um mol de ácido acético ocorre a produção de dois moles de NADH. Ácido succínico Este é o principal ácido produzido pela levedura. parte do glicerol formado está acoplada à manutenção do equilíbrio de redox intracelular.

para formação de aminoácidos que irão compor as proteínas. O valor exato que correlaciona glicerol para manter o equilíbrio de redox. para a formação de tais produtos secundários da fermentação. butileno glicol= 0. encampando os carboidratos de reserva. calculando o açúcar desviado da síntese de etanol. O valor exato que correlaciona glicerol com biomassa ainda não está definido na literatura. totalizando 1.0. Biomassa Havendo incrementos de leveduras (crescimento).Convertendo-se em gramas. biomassa (massa seca)= 0. portanto com produção de NADH (0.7. que. ácido succínico= 0.2 – 0. gás carbônico= 43 – 47.5 – 1.para rendimento entre 90 – 95%: etanol= 45 – 49. sem considerar o açúcar integrando os constituintes celulares. trealose e glicogênio. Nos primeiros 30 minutos de fermentação ocorre intensa degradação da Fermentacaoalcoolica v2. Tais carboidratos sofrem oscilações em seus teores durante a fermentação.6 moles de NADH por 100 gramas de matéria seca de levedura). o poder redutor gerado será utilizado na formação de glicerol para manter o equilíbrio de redox. tem-se que para cada grama de ácido acético produzido. com dados médios obtidos no laboratório.7 – 1. Consequentemente. Os dados abaixo mostram a proporção dos diversos produtos da fermentação alcoólica (em gramas/100 gramas de glicose metabolizada). ocorre desvio de esqueletos carbônicos através do piruvato.4. óleo fúsel= 0. sendo em parte responsáveis pelas oscilações no rendimento fermentativo de um ciclo para outro.6. ácido acético= 0 – 1. trealose e glicogênio.6. podendo terminar o processo com teores diferentes (maiores ou menores) daqueles do início. Estequiometria da fermentação Com base nas relações molares descritas anteriormente. supõe-se seja de 1:1. Carboidratos de reserva Os carboidratos de reserva. podem representar parte significativa da composição da levedura (até 30% da matéria seca). O crescimento é um processo oxidativo.6 gramas de glicerol por cada grama de biomassa seca. 3 gramas de glicerol devem ser formados. mas o que parece chegar mais próximo da realidade seria de 0. . pode-se estabelecer uma estequiometria da fermentação. inclusive a biomassa.6 gramas de açúcar por cada grama de biomassa seca produzida.5. glicerol= 2 – 5.doc 50 6/7/2011 .2 – 0.

como as leveduras Fermentacaoalcoolica v2. que o desenvolvimento de resistência a agentes estressantes permitido pelo acúmulo de trealose como divulgado pela literatura. ou seja. pela facilidade de obtenção em grandes quantidades.doc 51 6/7/2011 . um período curto de exposição. como Saccharomyces cerevisiae. Enquanto a levedura é capaz de manter seus níveis de trealose. A trealose.0. É interessante ressaltar. Em condições de baixa atividade de água. um dissacarídeo constituído por duas moléculas de glicose é de uma importância tecnológica relevante. havendo uma correlação direta entre os teores do carboidrato e a resistência ao estresse térmico. mas na 1ª hora a ressíntese torna-se evidente. seja pela tradição de seu uso. é desencadeado por “flashes” do agente. Numa fermentação industrial. a viabilidade é mantida. onde é acumulada. a trealose na membrana (nos dois lados da camada fosfolipídica) substitui as moléculas de água. É uma prática muito freqüente nas destilarias se iniciar o processo fermentativo com uma determinada levedura. aumentando a resistência ao estresse hídrico. A função protetora da trealose é resultado da inter-relação entre sua localização e mobilização na célula. exerce uma influência na atividade de água do citossol contribuindo para desaceleração do metabolismo (latência). Sua presença no citoplasma. Muitas dessas situações constituem os fatores físico-químicos e microbiológicos que afetam o desempenho fermentativo como um todo. a levedura encontra-se exposta continuamente a um conjunto de situações estressantes. Terminada a fermentação. o choque térmico desencadeia a termotolerância. tornando-se menos vulnerável. tais reservas podem ser metabolizadas produzindo mais etanol e consequentemente enriquecendo a levedura com nitrogênio. quando a levedura é então induzida a acumular trealose. que de acordo com a intensidade pode acarretar a exaustão do seu conteúdo de trealose acompanhada pela queda da viabilidade. exerce uma função protetora contra estresses. mantendo a integridade da membrana. Tais alterações são de grande significado na remoção de parte da levedura do processo para produção de ração. Espécie de levedura O desempenho do processo fermentativo é enormemente afetado pelo tipo de levedura que o desenvolve. sendo que no final da fermentação. responsável pela manutenção das células vegetativas e esporos viáveis. o teor de trealose pode suplantar o teor inicial. Por exemplo.trealose. pois além da função básica de carboidrato de reserva.

etc. espécies. Em algumas ocasiões e especificamente quando ocorrem sérios problemas na condução da fermentação industrial. tem se mostrado como uma excelente ferramenta na diferenciação de gêneros. ou seja. Identificação de leveduras pela técnica da cariotipagem A permanência das leveduras tradicionais ao longo da safra nunca pôde ser sistematicamente avaliada devido à falta de um procedimento analítico confiável.de panificação. das próprias instalações industriais) se instalam na dorna e acabam competindo com as leveduras tradicionalmente empregadas. A técnica da cariotipagem. contidas no núcleo da levedura e primordialmente relacionadas com suas características genéticas). do mel. da cana.doc 52 6/7/2011 . Tal técnica. que já foi utilizada na tipificação de leveduras nas indústrias de vinho e cerveja. Neste particular a contaminação com Candida krusei tem sido detectada especialmente quando ocorrem condições de aerobiose suficiente para o crescimento desta espécie. Os testes de assimilação e fermentação de diferentes carboidratos se mostram de grande valia. floculação.). mas o tempo exigido inviabiliza tal procedimento para uma rápida identificação de leveduras. baseada na separação eletroforética do DNA cromossômico intacto (moléculas que se diferenciam tanto em número como em tamanho. foi adaptada para as necessidades da indústria alcooleira e nos permitiu acompanhar a permanência das leveduras tradicionais ao longo de várias safras. tais leveduras contaminantes foram identificadas (inclusive pelas técnicas clássicas mencionadas anteriormente) e responsabilizadas por tais transtornos (baixo rendimento. Tem sido documentado que no processo industrial leveduras contaminantes de diferentes origens (do campo. Fermentacaoalcoolica v2. bem como de diferentes linhagens de uma mesma espécie. pois que as características macromorfológicas de colônias bem como os aspectos das células ao microscópio nem sempre fornecem dados seguros para se discriminar diferentes linhagens de leveduras. pelo fato da mesma ser obtida através de melhoramento genético para se melhor adequar às necessidades do processo industrial. que acarreta grande proporção de espuma com queda do rendimento e aumento do tempo da fermentação. acrescidos o fato de que uma mesma linhagem pode apresentar alterações morfológicas das colônias e das células em função das condições do meio.0. excesso de espuma.

doc 53 6/7/2011 . tais como. contaminação bacteriana e conteúdo de trealose) e tolerância a alguns agentes estressantes (etanol. em escala laboratorial confrontando-as com as tradicionais quanto as suas habilidades fermentativas (rendimento de fermentação. monitorada a sua permanência ao longo da safra. e que a queda da viabilidade na indústria durante o início de safra. Demonstrou-se ainda que as leveduras tradicionais sejam substituídas por linhagens contaminantes. osmolaridade. viabilidade durante reciclos. Os resultados obtidos ao longo de 4 safras demonstram que tais leveduras não permanecem no processo por mais do que 30 – 40 dias. podem tanto congregar um grande número de diferentes Saccharomyces que se alternam durante a safra. sendo que em algumas ocasiões tais leveduras desaparecem por completo em até 15 dias. Seleção de linhagens para fermentação industrial Leveduras dominantes e persistentes no processo industrial foram identificadas e isoladas com o auxílio da técnica de cariotipagem. Fermentacaoalcoolica v2. sulfito. ou serem representadas por um pequeno número de leveduras com dominância e persistência no processo industrial. não só de leveduras tradicionalmente empregadas pela indústria. salinidade. IZ-1904. Tais resultados sugerem que as leveduras contaminantes com características de dominância (representando porção significativa da biomassa da dorna) e persistência (capacidade da levedura de sobreviver as condições estressantes da fermentação industrial) reúnem importantes atributos para uma leveduras alcoólica industrial. Itaiquara. ao mesmo tempo em que se avaliaram os diversos parâmetros da fermentação. como também de uma linhagem de Saccharomyces não floculante oriunda do Canadá. formação de glicerol. conhecida até então por “fase de adaptação” da levedura. As leveduras substituintes. Foram selecionas aquelas com características fermentativas desejáveis e que igualmente se apresentaram com maior tolerância aos fatores estressantes testados. Algumas dessas leveduras foram reintroduzidas no processo industrial. pode ser considerada uma fase de substituição. Fleischmann. conquanto se mostre altamente competitivas no ambiente da dorna.Permanência de leveduras tradicionais no processo fermentativo A técnica da cariotipagem possibilitou acompanhar a permanência. crescimento em biomassa. dependendo da destilaria e das condições do processo. Tais leveduras foram avaliadas. altas temperaturas e contaminação bacteriana).0.

polifenóis. ácido fítico. e ainda do ponto de vista estrutural. complexam diversos Fermentacaoalcoolica v2. Co e Cu). como ativador ou estabilizador da função enzimática (K. polifosfatos e outros materiais coloidais. tornando desnecessária a síntese dos mesmos. NH4. geralmente complexo. proteínas. provoca alterações metabólicas significativas. atuando como neutralizador de forças eletrostáticas em diversas unidades celulares aniônicas (K. os mostos empregados na indústria podem conter agentes quelantes. Mn. Assim o mineral pode funcionar como o centro catalítico de uma enzima (conforme o Zn. ou seja.doc 54 6/7/2011 . Por outro lado. Deficiências ou concentrações de tais minerais. Mg). como mantenedor de um controle fisiológico (pela ação antagônica exercida entre íons). Mg e Zn neutralizando cargas negativas do DNA. De todos os elementos encontrados na levedura apenas alguns são considerados essenciais sendo que muitos deles aparecem fortuitamente dependendo da composição do meio no qual a levedura cresceu. Já os íons minerais estão predominantemente implicados na atividade enzimática. Igualmente. Ca. aminoácidos. um desequilíbrio entre os nutrientes minerais. proteínas. existe uma vasta gama de interações entre os nutrientes minerais resultando que tal concentração ótima é altamente dependente da concentração de outros minerais no meio. sequestrantes e absorventes os quais reduzem a concentração efetiva de espécies iônicas. Assim. Isso ocorre quando o mosto apresenta aminoácidos. apresentar o produto final de uma reação catalizada por uma metalo-enzima. RNA. ácidos orgânicos. As necessidades de N. Para tornar a situação mais complexa. minerais de argila.0. se o mosto empregado na indústria. P e S são as mais facilmente justificáveis por integrarem constituintes celulares tanto estruturais quanto metabolicamente ativos. pode-se considerar que a necessidade de um elemento qualquer pode ser diminuída.Nutrição mineral da levedura As leveduras exigem diversos íons inorgânicos (minerais) em concentrações tanto micro como milimolar para manifestarem ótimos crescimento e rendimento fermentativo. Embora se possam postular concentrações ótimas para cada elemento. bases nitrogenadas e outros compostos orgânicos e que são utilizados pela levedura. alguns íons atuam como antagônicos minimizando efeitos inibitórios de outras espécies iônicas e por outras inter-relações metabólicas que determinam à quantidade absorvida do íon e os efeitos conseqüentes. ácidos húmicos. membranas fosfolipídicas e fosfomananas da parede celular).

Ativa ATPase em concentração 1mM. Os elementos minerais que afetam negativamente a levedura podem ser classificados como elementos tóxicos. Mantém integridade da membrana plasmática em condições adversas. com mostos à base de melaço. Resulta dessas observações que as concentrações ótimas de Magnésio. Aumenta a tolerância para íons tóxicos. mas na prática. mas se mostra inibidor a 10mM.íons com diferentes afinidades. Necessário para a absorção do H2PO4-. Estabilizador de membranas. Fermentacaoalcoolica v2. Inibe absorção de aminoácidos em concentração de 1mM e inibe o crescimento em concentrações de 25 mM. Estimula a absorção de H2PO4.doc 55 6/7/2011 .incrementando a fermentação. Por outro lado a absorção de nitrogênio é proporcional à concentração de fosfato. Sofre ação antagônica do cálcio. Participa da absorção. de cátions bivalentes (Zn e Co). Nestas condições. A necessidade desse nutriente para a célula gira ao redor de 700 ppm. controlando o pH intracelular. O potássio é necessário ao crescimento e à fermentação e sua absorção é facilitada pela absorção da glicose.são interrelacionadas.0. Magnésio Ativador enzimático no processo glicolítico de transferases e carboxilases. Na deficiência de potássio o H2PO4-não é absorvido e a absorção de magnésio é dependente do fosfato. Principais nutrientes e suas funções Potássio Ativador enzimático inclusive de reações da glicólise. pode-se assumir a necessidade de uma levedura industrial que seja tolerante às altas concentrações salinas. Cálcio Parece não ser importante para fermentações e multiplicação. Mantém a integridade e permeabilidade das membranas e regula o transporte de cátions bivalentes.000 ppm. a levedura encontra-se exposta às concentrações de K+ que podem atingir 6. inclusive H-. potássio e H2PO4. como é o caso do alumínio. por troca.

já em concentrações de 10 μ M inibe o crescimento. vitaminas. etc. Não é substituído por nenhum outro íon em suas funções. Ferro Participa do sítio ativo de diversas enzimas (hemoenzimas). Requerido para multiplicação na concentração de 1 a 3 μ M. cefalinas. sendo essencial ao crescimento e a fermentação.doc 56 6/7/2011 . purinas. O nitrogênio se mostra essencial não apenas para o crescimento como para uma fermentação adequada. pigmentos respiratórios (citocromos). Em concentrações de 1 a 1. lecitina. A absorção é reduzida. Inibição com concentrações acima de 5 μ M. constituindo as moléculas de aminoácidos. piridimidimas. Cobalto e Boro Estimulam crescimento e fermentação em baixas concentrações (1 μ M). Nitrogênio O teor de nitrogênio na levedura está ao redor de 8% (com base na matéria seca). É integrante de desidrogenases. enzimas. Fermentacaoalcoolica v2.5 μ M estimula fermentação e crescimento.0. proteínas. em pH abaixo de 5 e é efetuada mediante troca com 2 íons Potássio. Molibidenio. Cobre Integrante de algumas enzimas. Aumenta o teor de desidrogenase alcoólica. Concentrações de 10 a 15 μ M inibem crescimento e fermentação. Na concentração de 7 μ M estimula os efeitos do zinco.Zinco Participa da glicólise e da síntese de vitaminas. porém nas leveduras da fermentação alcoólica este teor é mais baixo (5 – 6%). Manganês Estimula a síntese de proteínas e tiamina. aldolases e desulfidrases. ácidos nucléicos.

da levedura. O fosfato absorvido. apresentam problemas com excesso de levedura na dorna. pode participar de imediato nas fosforilações ou ser Fermentacaoalcoolica v2. pois o nitrato (NO3-) absorvido do solo pela planta. é reduzido a N amoniacal e este transformado em aminoácidos. na taxa de multiplicação. uma vez que certos aminoácidos são precursores dos álcoois superiores. portanto necessário a multiplicação do fermento bem como à fermentação. Fato que distingue a uréia e o amônio como fonte nitrogenada e decorrente do modo de absorção.0.). sem ser acionado o sistema dependente de energia. o que pode ser desejável. pois em detrimento da produção de etanol. com temperatura controlada e sem perdas na centrífuga. etc. As outras formas iônicas não são absorvidas. biossíntese. contra um gradiente de concentração se necessário. Fósforo O fósforo além de integrar as moléculas informacionais – DNA e RNA. entra naturalmente na célula entra naturalmente na célula quando os teores no meio são altos. uréia e amônio. A uréia pode ser absorvida por difusão facilitada. Esta forma de nitrogênio na cana é intermediária. forma predominante no pH=4. com gasto de energia e acidificação do meio externo. O fósforo é. o teor ideal encontra-se entre 40 e 70 ppm de (NH4+) por litro de mosto. respiração. é o pH do meio exterior. e a % de levedo no vinho estão diretamente relacionados com a concentração de (NH4+). O nitrogênio na forma amoniacal (NH4+) é encontrado no mosto proveniente do caldo da cana e o brotamento. Existe correlação positiva entre o teor de fósforo da levedura e o rendimento da fermentação. mas nitidamente é menor na presença de sulfato de amônio. ácidos nucléicos e demais compostos nitrogenados. proteínas. a levedura acumula trealose. Destilarias com (NH4+) maior de 70 ppm no mosto. bases nitrogenadas. que inibem tal transporte. A levedura absorve o fósforo na forma do íon H2PO4-. A permease geral de aminoácidos garante a absorção dos mesmos na ausência de íons amônio. estruturais – membranas fosfolipídicas. que pouco é afetado quando se utiliza uréia. A absorção de amônio (NH4+) ocorre à custa da saída de íons H+. fermentação. Teores abaixo de 40 ppm ocasionam fermentação lente.doc 57 6/7/2011 . utilizando-se de vários sistemas de transporte para as diferentes fontes. baixo brotamento e baixo rendimento fermentativo.A levedura é capaz de utilizar uma ampla gama de compostos nitrogenados tais como aminoácidos.5. ou seja. participa ativamente nos processos de transformação e transferência de energia química (glicólise.

Sulfito e o tiossulfato podem substituir o sulfato. Os íons fosfatos são mais intensamente absorvidos em presença do íon K+ do que de Na+. sendo que glucose e nitrogênio assimilável devem estar presentes no meio.0. O alumínio bloqueia o crescimento do fermento e a formação de trealose. liberando fosfato que é absorvido. Mas frequentemente o que ocorre quando se usa melaço sulfitado na fermentação é o efeito tóxico do sulfito. já a partir de 10 ppm acarreta efeito estressante sobre a levedura em mosto de caldo e xarope. quer inibindo enzimas quer alterando a permeabilidade de membranas. reduzindo a velocidade de fermentação. assim como o zinco. Alumínio Tóxico ao nível das membranas. Entretanto tais aspectos “benéficos” Fermentacaoalcoolica v2. Ésteres fosfóricos orgânicos também podem se constituir em fonte de P. o cobre e o manganês. principalmente de melaço. visto que a quantidade de enxofre necessária é relativamente baixa. Porém a precipitação é significativa. Concentrações de 2 μ M diminuem o crescimento.armazenado como metafosfatos em elevadas concentrações. Tais efeitos tóxicos podem ser minimizados pela presença de agentes precipitantes e complexantes nos mostos industriais. Em conseqüência se observa aumento na eficiência fermentativa e diminuição na formação de glicerol. Inibidores da fermentação Muitos minerais às vezes encontrados no meio se mostram deletérios à multiplicação e à fermentação. durante o tratamento do caldo. após a ação da fosfatase localizada na parede celular. O enxofre utilizado na sulfitação bem como o oriundo do ácido sulfúrico empregado no tratamento ácido do fermento. O excesso de cal.doc 58 6/7/2011 . Em algumas ocasiões o sulfato origina SO2 e H2S. Enxofre O sulfato é uma fonte de enxofre para a levedura e a absorção do mesmo requer gasto de energia.0. faz precipitar o fósforo. parece fornecer quantidade suficiente do elemento para fermentação. Análises de mostos industriais demonstram a existência de quantidades tóxicas de alumínio o qual. se o pH for acima de 6. mas os aminoácidos cisteína e cistina não se constituem em fonte de S para a levedura.

o que é resolvido alimentando-se a dorna com mosto mais quente. onde é menos tolerante ao alumínio. devido à sua ação no metabolismo da levedura. Uma outra solução é cortar uma dorna em fermentação para dorna problema até que a referida dorna reaja. Concluindo. em uma destilaria. com incrementos nos teores alcoólicos. O sulfito faz a levedura produzir mais aldeído acético. foi detectado abaixamento no rendimento.) Sulfito A sulfitação do caldo de cana como clarificante resulta em melaços com teores de sulfito (SO2) que podem atingir 1. etc. Existem cepas de leveduras com menor capacidade de armazenar trealose. favorecendo assim a fermentação.observados nos primeiros ciclos fermentativos desaparecem com a queda na viabilidade do fermento nos ciclos subseqüentes. comprometendo a eficiência fermentativa. Temperatura Na indústria. Entretanto. O mosto sulfitado pode comprometer seriamente o desenvolvimento da fermentação alcoólica. a fermentação não desenvolve devido ao choque térmico. como reduções do crescimento e da formação de glicerol. sem. fornecendo mostos com até 300 ppm de SO2/litro. pode-se até apontar um efeito benéfico do sulfito. que na coluna A.doc 59 6/7/2011 . e irá aumentar a acidez do álcool. quando a contaminação é alta. quando se emprega mostos à base de melaço. causou discretas reduções nos teores de trealose e na viabilidade. O teor de Al chegou a 150 ppm nestes dias críticos. os efeitos tóxicos do Al são atenuados ou quase desaparecem muito possivelmente pela presença de maiores teores de substancias complexantes (ácidos orgânicos. a acidificação equivalente à presença do alumínio. a temperatura do mosto é um fator crítico no processo fermentativo. contudo comprometer o processo fermentativo. aumento do tempo de fermentação e diminuição da viabilidade quando se moeu uma cana que não havia sido calcareada e adubada. demonstram de maneira inequívoca os efeitos deletério de tal elemento.000 ppm. depois abaixou para 30 ppm e o problema desapareceu.0. resultando apenas em benefícios à fermentação. aliás. Se a temperatura for baixa (menor que 26 – 27ºC). pode acarretar um Fermentacaoalcoolica v2. aminoácidos. propicia maior formação de glicerol. não permitindo beneficiar-se dos efeitos aparentemente benéficos. reduzindo a infecção. quanto menor o pH do meio. com o aquecimento se oxida a ácido acético. Além disso. Em condições industriais. Por outro lado. acima de 30ºC. as quedas acentuadas na viabilidade e nos teores de trealose do fermento quando em presença do alumínio. Já o mosto quente. Porém. e é tanto mais tóxico.

As leveduras de destilaria crescem bem em temperatura de 30 – 33ºC e as fermentações podem ocorrer com altas velocidades em temperatura até mais elevadas. pH O pH é um fator significativo para as fermentações industriais devido à sua importância tanto no controle de algumas bactérias contaminantes quanto ao seu efeito sobre o crescimento da levedura. por isso. em temperatura mais elevadas os ácidos graxos saturados conferem à fluidez necessária à célula. Mas o mosto quente não é o único responsável pela elevação da temperatura. o número de bactérias aumentará proporcionalmente com o aumento da temperatura. ocorrendo queda na viabilidade.superaquecimento nas dornas em fermentação.doc 60 6/7/2011 . as leveduras podem aumentar as proporções de ácidos graxos saturados. Entretanto tais “aspectos benéficos” são à custa da biomassa (incluindo trealose) que está sendo consumida. Os valores de pH dos mostos industriais geralmente encontram-se na faixa de 4. quando há aumento no rendimento. Entretanto com o aumento da temperatura a levedura se torna mais vulnerável a toxidez exercida pelo etanol produzido. O efeito prejudicial da elevada temperatura. porém não tem sido apontada pela literatura como o único fator determinante na aquisição de termotolerância.5 a 5. diminuição do crescimento e da formação de glicerol. enquanto que os insaturados fluidez às membranas. pode ser mascarada. especialmente quando se desconsidera outros parâmetros na fermentação. principalmente entre 30 – 40ºC. Os ácidos graxos saturados conferem rigidez. Um fator extremamente importante. bem como o comprimento de suas cadeias. taxa de fermentação e formação de subprodutos. mas as leveduras mantém sua homeostase Fermentacaoalcoolica v2.5 com uma boa capacidade tamponante. e com progredir dos ciclos fermentativos ocorrerá o desaparecimento da levedura no processo. Portanto. leva a produção de 160 Kcal.0. O papel da trealose como mantenedora da viabilidade também é notado em temperaturas elevadas. correlacionando positivamente com a temperatura do mosto é a contaminação bacteriana. Alguns efeitos podem ser atribuídos às alterações na composição da membrana a fim de preservar a integridade das mesmas. A própria fermentação de 1 kg de açúcar (ART) pela levedura para produzir álcool. propiciando um aumento da temperatura do vinho e consequentemente uma diminuição do rendimento. se a temperatura do mosto for acima de 30ºC. até 40ºC. Assim.

Os mecanismos através dos quais as bactérias exercem efeito direto sobre as leveduras. propiciam maior contaminação bacteriana. A coexistência das leveduras com as bactérias láticas requer uma habilidade por parte das leveduras em resistirem ao ambiente proporcionado pelas bactérias. ele pode ser considerado um indicador mais preciso da contaminação. mesmo com o aumento da contaminação bacteriana. P e K da levedura que acaba por elevar o pH. mesmo que a toxidez bacteriana seja exercida por componentes outros. Onde há presença aumentada de bactérias. Fatores como as altas temperaturas são duplamente prejudiciais. há aumentos significativos na formação dos ácidos lático e às vezes de acético. o pH no final da fermentação se eleva acima de 4. pois reflete a atividade metabólica dessas bactérias. compreendendo ácidos orgânicos. via de regra. posto que em o mais freqüente agente estressante presente.de forma quase independente dos valores de pH do meio.0 e aumenta a floculação do fermento além de propiciar um aumento significativo na infecção. Trabalhos efetuados em laboratório e os dados da indústria são coincidentes quanto ao prejuízo que a contaminação pode exercer no rendimento fermentativo.doc 61 6/7/2011 . As relações antagônicas são travadas pela produção de uma ampla gama de substancias tóxicas. mais complexos que o referido ácido. como sendo também um produto da levedura. correspondendo ao pH da cuba de tratamento. Na indústria quando se utiliza muito melaço esgotado. ou mesmo por serem capazes de controlar a contaminação num estado basal. Fermentacaoalcoolica v2. de sorte que a fermentação industrial se inicia com pH muito baixo. por isso toleram o tratamento ácido. A acidez muito elevada do vinho é devida à atividade bacteriana. pode até ter sua formação diminuída. pois além do efeito deletério sobre a levedura.0. Como o ácido lático é um produto bacteriano. álcoois e até complexos compostos do metabolismo secundário. O tratamento ácido também provoca lixiviação de nutrientes tais como N. Contaminação bacteriana A contaminação bacteriana é um dos fatores preponderantes dentre aqueles que afetam a fermentação alcoólica. pela presença de ácido lático. são pouco conhecidos. O ácido acético.

dependendo do estado de maturação. das propriedades físicas. glicose e frutose. quando expressos em glicose ou açúcar invertido. ferro e alumínio. sendo estes agrupados em açúcares orgânicos. Fermentacaoalcoolica v2. enxofre. ceras. oxigênio e carbono. não açúcares e inorganicos.5% de matéria mineral. da variedade. As substancias inorgânicas. a matéria-prima para a indústria do álcool. sacaretina e antocianina).0. succínico. 0.) e de matérias corantes (clorofila. O caldo.2 a 0. No entanto. Os açúcares são representados pela sacarose. tem como componentes principais: sílica. gorduras. apresentam um teor de cerca de 15 – 16%. Para a fabricação de álcool.4%.MATÉRIAS-PRIMAS PARA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA Caldo: composição. potássio. etc. Os açúcares redutores – glicose e frutose – quando em teores elevados mostram um estágio pouco adiantado de maturação da cana. As duas frações principais da cana-de-açúcar para processamento são a fibra e o caldo. os açúcares redutores contribuem embora com uma pequena percentagem. do estágio de maturação. em canas maduras. aminoácidos.18%). etc.). magnésio. pré-tratamento. A distribuição destes elementos no colmo. ácidos (málico. glicose e frutose. é constituído de água (+/. em média é de 74. sódio.doc 62 6/7/2011 . em nosso caso. do estado sanitário. químicas e microbiológicas do solo. cálcio. aconítico. da idade. respectivamente para a frutose e glicose. Estes carboidratos que constituem o açúcar total. representadas pelas cinzas. sendo este a rigor. para o aumento do teor de açúcar total. Da sua composição.5% em água. do tipo de cultivo. controle de qualidade Composição A composição química da cana-de-açúcar é muito variável em função das condições climáticas. como o componente mais importante. fósforo. além da presença de outras substancias indesejáveis ao processamento. tem um valor médio de 14%. como também a nutrição da levedura. alguns componentes das cinzas são considerados importantes para o processo fermentativo. Os compostos orgânicos não açúcares são constituídos de substancias nitrogenadas (proteínas. entre outros fatores. 99% são devido aos elementos hidrogênio. enquanto os demais. A sacarose. definido como uma solução impura e diluída de sacarose.82%) e sólidos solúveis ou Brix (+/. pectinas. 25% de matéria orgânica e 0.

Pré-tratamento do caldo
Para uma boa evolução do processo de fermentação-destilação deve ser requerida da matéria-prima a ser processada, em nosso caso o caldo de cana, uma qualidade que não comprometa o desenvolvimento normal de uma fermentação e nem cause problemas na centrifugação do vinho ou na destilação. Para que isto aconteça, devem ser exigidos os seguintes requisitos no tratamento: - Eliminação de impurezas grosseiras (bagacilho, areia, etc.); - Máxima eliminação de partículas coloidais; - Preservação de nutrientes: vitaminas, açúcares, fosfatos, traços de metais, aminoácidos essenciais e, - Minimização de contaminantes microbianos.

Processos de tratamento
Todos os processos de tratamento que vamos referir estão esquematizados em anexo, sendo que as vantagens, desvantagens e comentários adicionais serão também citados. Não consideraremos em nenhum processo citado a hipótese da não retirada das impurezas grosseiras, (bagacilho, areia, etc.) como ocorre em algumas usinas, já que entendemos esta como uma condição primordial no tratamento do caldo para destilaria. Deve-se salientar que em todos os processos a serem ilustrados, na separação dessas impurezas, considerou-se a utilização de peneiras DSM.

Processo de tratamento do caldo para destilaria – 1
Conforme a Figura 1, este processo consiste basicamente em eliminar as partículas leves (bagacilhos) nas peneiras DSM e as partículas pesadas (areia, terra, etc.) nos hidrociclones. Neste caso, devido ao fato de não existir um choque térmico e, consequentemente, não havendo a degradação das proteínas, com certeza a formação de espuma será acentuada. Este problema deverá ser contornado com razoável adição de antiespumantes. Parece que a não eliminação de colóides poderá causar a adsorção dos mesmos na parede celular, provocando, ao longo do tempo, uma inibição na fermentação, além de favorecer também a formação de espuma.

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Nota-se que este tratamento atende apenas 2 dos 4 requisitos básicos do tratamento do caldo para destilaria; no entanto é o melhor processo no que se refere ao investimento inicial, ou seja, de baixo custo.

Processo de tratamento do caldo para destilaria – 2
Neste processo, Figura 2, além da retirada das partículas leves e pesadas, é realizado também uma pasteurização do caldo, ou seja, um aquecimento com posterior resfriamento. Através de alguns testes realizados notou-se que a contaminação bacteriana era a mesma antes do aquecimento e após o resfriamento. Isto implica que o tratamento térmico em si não resolve os problemas de contaminação. No entanto já ficou provado que com este tratamento a formação de espuma é minimizada. Para minimizar os problemas de infecção a tubulação deverá ter o mínimo número de flanges e outros pontos possíveis de acúmulo de resíduos, como também o resfriamento deverá ser instalado o mais próximo possível da fermentação. Este processo atende apenas os requisitos 1 e 3, com a vantagem em relação ao processo de tratamento 1, de diminuir a formação de espuma.

Processo de tratamento do caldo para destilaria – 3
Este processo, Fig 3, se diferencia do anterior, somente pela introdução do trocador de calor regenerativo. As vantagens deste processo em relação ao tratamento 2 é o menor consumo de vapor para aquecimento e menor consumo de água para resfriamento, além da necessidade de menor superfície global de transferência de calor (aquecimento e resfriamento). No entanto possui a desvantagem de ser enviado o caldo a 50ºC para destilaria, contra 100ºC do tratamento 2, já que a temperatura mínima para não se desenvolverem bactérias termófilas é da ordem de 80ºC, contribuindo para o acréscimo da infecção em relação ao tratamento 2.

Processo de tratamento do caldo para destilaria – 4
Este processo, conforme a Fig 4, é o que mais se aproxima do tratamento ideal de acordo com os cinco requisitos citados anteriormente, porém com a desvantagem de eliminar parte dos nutrientes (N e P) e micro nutrientes (Mg, Mn, Zn, na forma de sulfatos) presentes no caldo que são floculados pela ação da cal – polieletrólitos – calor. Cuidados especiais devem ser tomados no que se refere a dosagem de cal no caldo. O pH do caldo dosado deverá ser mantido na faixa de 6.3, pois o excesso de cal pode

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prejudicar o bom andamento da fermentação (o excesso de cal afeta o crescimento da cultura), além de causar incrustações na coluna de destilação e trocadores. A complementação de fósforo (na forma de P2O5) e adição de polieletrólitos também deve ser realizada neste caso.

Controle de qualidade do caldo
O controle de qualidade do caldo em qualquer dos processos apresentados é de fundamental importância para o bom andamento dos processos de fermentação/destilação. Os controles mínimos a serem adotados são: - análise de pH do caldo do primeiro terno; - controle de infecção na moenda e cush-cush, com lavagem com vapor ou água quente a cada 4 -5 horas; - adição de bactericida por choque e continuamente conforme a dosagem a ser determinada de acordo com o produto utilizado; - clarificação (quando existir) - controle de pH em torno de 6.3 pela adição do leite de cal 5ºBé - dosagem de polímeros na faixa de 1 a 3 ppm - controle de temperatura na entrada do balão de flash de 110ºC – 113ºC - análise de Brix, pol e ART do caldo

Mel final: composição, armazenamento e controle de qualidade.
Composição
Vários são os fatores que influem na composição do melaço ou mel final, destacandose entre eles a natureza da matéria-prima, a qualidade da cana processada, os métodos de fabricação, o sistema e o tempo de armazenamento e as regiões açucareiras. Segundo alguns autores, com tantas variáveis agindo individualmente ou conjuntamente, não há possibilidades de aplicação de números médios de aplicação geral que sejam comparáveis entre si. Mesmo considerando-se uma só variedade de cana e um só método de fabricação numa dada região, a composição do mel final varia com a época do ano e com o ano agrícola. Como ilustração da composição do mel final citaremos na tabela abaixo a média dos valores de Brix, Pol, sacarose, açúcares redutores e cinzas gravimétricas, obtidos em 4 épocas em 5 usinas diferentes, na região de Jaú, estado de São Paulo.

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Brix 1 2 3 4 média 90,85 91,42 91,53 89,66 90,87

Pol 39,30 36,01 38,79 37,54 37,91

Sacarose 39,87 38,59 39,27 38,72 39,11

AR 9,67 9,16 9,49 9,52 9,46

ART 51,5 49,7 50,7 51,1 50,8

Cinzas 8,04 8,31 7,96 7,83 8,04

Sabe-se que a composição do mel final das usinas é muito diferente da tabela acima no que se refere ao Brix, Pol e sacarose, devido ao esgotamento do mesmo. No entanto quanto aos AR e cinzas acredita-se que a diferença percentual não seja muito significativa.

Armazenamento
Devido a problemas de decomposição da sacarose e dos açúcares redutores do mel final durante o armazenamento por ação de fungos, leveduras e bactérias (dependendo da concentração e temperatura de armazenamento) e consequentemente desprendimento de gases inflamáveis, principalmente metano e hidrogênio, alguns critérios devem ser seguidos durante a armazenagem: - posicionamento do tanque no interior de uma bacia de contenção com volume igual ao volume armazenado, com altura do talude no máximo 1,8 mt - devido a possibilidade de formação de espuma e aumento da velocidade de degradação térmica dos açúcares em temperaturas acima de 45ºC, deverá ser instalada uma tubulação retornando do sistema de recalque ao topo do tanque, de forma a possibilitar a recirculação e conseqüente movimentação e resfriamento do mel.

Controle de qualidade
Para o perfeito conhecimento da matéria-prima empregada na fabricação do álcool, alguns controles de qualidade do mel são desejáveis. As principais análises rotineiras que podem ser empregadas são: Brix, ART, cinzas, SO2. A maior parte dos controles é na realidade feita após a mistura do mel com o caldo, no tanque de mosto. Estes controles são: nitrogênio amoniacal, P2O5, pH, acidez, Brix, temperatura, cinzas, contaminação bacteriana.

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amplia a imagem real do objeto que. 40X e 100X). Um destes. ou centenas.0. Basicamente existem dois tipos de microscópio. que são os mais comuns e mais utilizados e os microscópios de campo escuro. 10X. as objetivas (4X. 1 – oculares 2 – tubo binocular 3 – parafuso de fixação 4 – revólver 5 – cabeçote 6 – estativo 7 – platina ou mesa 8 – condensador 9 – diafragma do condensador 10 – manipulador da lente do condensador 11 – parafuso de centralização do condensador 12 – porta filtro 13 – suporte para lente auxiliar 14 – controle de focalização macro e micro 15 – suporte para lâmpada 16 – diafragma de iluminação 17 – base Fermentacaoalcoolica v2. as oculares (10 a 15X).CONTROLE MICROBIOLÓGICO – MICROSCOPIA Microscópio ótico Para se observar imagens ampliadas dezenas. o qual é formado basicamente por dois conjuntos de lentes. os de campo claro. é ampliada novamente pelo segundo conjunto. por sua vez. Microscopia de Campo Claro (usado em biologia: bactérias. de vezes recorre-se ao microscópio.doc 67 6/7/2011 . leveduras) Consideram-se no microscópio as seguintes partes essenciais e que podem ser vistas na Fig. 1.

Tubo ou canhão. luz que emerge do orifício da platina (OLHANDO POR FORA). Lentes objetivas. a imagem fique nítida no campo visual. Condensador e diafragma. até Olhar pela ocular. certificando-se de que está com a lamínula para cima. (charriot). Estativo ou coluna. Fermentacaoalcoolica v2.Parte mecânica • • • • • • Base ou pé. utilizando o parafuso de ajuste grosseiro (macro). Lentes oculares.. que a preparação fique bem próxima da lente objetiva (OLHANDO POR FORA).doc 68 6/7/2011 . Campo escuro: usado para contraste Recomendações para uso do microscópio ótico Antes de iniciar o uso. Mesa ou platina. Parte Óptica • • • • Sistema de iluminação. Revólver ou mecanismo para câmbio da lente objetiva. Parafusos de focalização macro e micro. • • • • • • • Posicionar a objetiva de menor aumento no eixo óptico do aparelho cuidando Colocar a preparação microscópica sobre a platina.0. Levantar lentamente a platina com o parafuso de focalização grosseira até que para não bater com as objetivas na platina ou no carrinho. entre as garras do carrinho Ligar a iluminação do aparelho. Mover o carrinho para aproximar o material montado na lâmina para o foco de Levantar a preparação.

focalização diferente.• • Posicionar uma borda da lamínula ou algo que deva estar no mesmo nível de Com objetos muito transparentes. após conseguir-se boa nitidez da imagem com estar em posição alta. • • • Ajustar a imagem utilizando o parafuso de focalização precisa (micro). Ajustar a iluminação regulando o diafragma íris do condensador. Este ajuste é Como freqüentemente os dois olhos de uma pessoa têm capacidade de necessário para uma melhor observação do campo visual. movendo o parafuso de focalização precisa. • • Assim. a objetiva de menor aumento e estando o objeto bem no centro do campo.0. após focalizar a borda da lamínula. percorrendo a área coberta pela lamínula. Observações: • • • Ao mudar de objetiva e trabalhando a seco. até conseguir uma boa nitidez de imagem. nunca passe a objetiva de imersão Mudança de objetiva e/ou de preparação exigem novo controle do diafragma. é conveniente proceder-se ao ajuste da dioptria quando se trabalha em um aparelho binocular. • • Focalizar.doc 69 6/7/2011 . trazer a objetiva seguinte para o eixo óptico do aparelho. Ajuste da Dioptria • • Dioptria é a unidade de medida do poder refrativo de uma lente. de início focaliza-se nitidamente uma estrutura olhando apenas com o A seguir. Manutenção do equipamento Fermentacaoalcoolica v2. abrindo-o convenientemente. inicie com a objetiva de menor aumento. quando o material é muito transparente. Proceder à nova regulagem do diafragma íris. se então metodicamente esses objetos. procura- focalização do objeto. sobre a preparação microscópica. que deve Desejando-se ampliação maior. vira-se o anel de ajuste da olho direito. dioptria (que existe apenas no encaixe da ocular esquerda) até obter foco também nesse olho. faixa por faixa. Para focalizar uma preparação. olhando apenas com o olho esquerdo.

No controle da viabilidade celular nos processos de produção de levedura (fermento prensado) e fermentação alcoólica.• • • • • • • • • Conservar o microscópio sempre limpo. até o momento não existe um método que forneça resultados totalmente seguros na determinação da viabilidade celular. Para maior precisão da análise. utilizando-se a objetiva de imersão (100x). somente com papel apropriado.0. Entretanto. a coloração das células da levedura com azul de metileno ou eritrosina e o cultivo por plaqueamento são os mais empregados. não menos que 100 retículos da câmara (os retículos centrais de cada quadrículo) sejam contados. Colocar com cuidado o microscópio sobre a mesa em posição tal que possa Daí por diante não mais altere a posição do instrumento. Para estimar a proporção de células viáveis em uma cultura ou processo fermentativo. métodos baseados no plaqueamento ou na observação microscópica têm sido usados. Nesta são contadas as células incolores e as coloridas de rosa (Fig. Após o uso. e. Não esfregue os dedos nas lentes. objetivas ou qualquer outra parte do aparelho. Transportar segurando-o pelo estativo ou pelo corpo do microscópio. limpar a objetiva de imersão com álcool. Limpar as lentes do microscópio. JAMAIS O ARRASTE! trabalhar comodamente. Método de determinação da viabilidade celular de leveduras Não existe um método absoluto para determinação da viabilidade celular de uma população de células de levedura. Na determinação da viabilidade através do uso de eritrosina a porcentagem ou o número de células viáveis/ml é determinado transferindo-se uma amostra já colorida para a câmara de Neubauer.doc 70 6/7/2011 . Cobrir para que não se empoeire ou guardar em lugar fechado e seco. 2). a diluição da amostra deve ser tal que não se tenha mais que 1250 células por câmara. Não desmontar as oculares. nas indústrias de produção de álcool o emprego de eritrosina é o mais indicado. Fermentacaoalcoolica v2. Devido às facilidades e a rapidez da análise. o que é regulado pela diluição adequada da amostra. Devem ser contadas entre 300 a 500 células por câmara.

0. Especificações da câmara de NEUBAUER • • • • • • • Profundidade: 0.doc 71 6/7/2011 .1 mm3 Fermentacaoalcoolica v2.Fig.0025 mm2 Volume de líquido em cada retículo: 0.00025 mm3 Volume total da câmara: 0. 2: Solução Eritrosina Uso da Câmara de Neubauer. 3: Preparo da câmara de Neubauer e imagem ao microscópio ótico de células não coradas e de células coradas com eritrosina.1 mm Número de quadrículos: 25 Número de retículos em cada quadrículo: 16 Número de retículos em cada câmara: 400 Área do retículo: 0. Fig.

0 ml de água destilada esterilizada. 4: Esquema de uma Câmara de Neubauer. Misturar as soluções A e B. Dissolver em 250. Validade: 8 meses desde que armazenada protegida da luz e sob refrigeração. Preparo das soluções Solução estoque de Eritrosina • • • Pesar 0.0 ml de água destilada esterilizada (solução A).doc 72 6/7/2011 . Observação: Fermentacaoalcoolica v2.90 g de Na2HPO4 . Conservar a solução estoque em frasco âmbar fora do alcance da luz e em refrigerador.Fig..0. Dissolver em 10. Dissolver em 250. Pesar 6. Validade: 8 meses desde que armazenada sob refrigeração. Transferir a solução para um frasco plástico e conservar sob refrigeração.1 g de eritrosina. Tampão Fosfato • • • • • • Pesar 17.89 g de NaH2PO4 .0 ml de água destilada esterilizada (solução B).

Homogeneizar em agitador para tubos.Para o uso da solução tampão deve-se retirar o frasco do refrigerador e aguardar até que o mesmo atinja a temperatura ambiente. Adicionar papaína na amostra. semana e conservá-la fora do alcance da luz. Transferir 1 ml da solução de trabalho de eritrosina para o tubo de ensaio que Homogeneizar em agitador para tubos. Fermentacaoalcoolica v2.1 ml da solução estoque de eritrosina para cada 5. não se utilizar todo o volume preparado. deverá ser descartado para evitar contaminações. Deixar em repouso durante 5 min. lâmínula 24x24 mm área da câmara de Neubauer. cobrindo a superfície espelhada com uma Transferir um volume suficiente da solução (amostra + corante) para cobrir a de células seja adequado para a faixa de maior precisão da metodologia). trabalho. Solução de trabalho • • • • Misturar 0. Procedimento analítico Após a coleta da amostra de vinho bruto e/ou creme de levedura. o restante fosfato. Diluir a amostra com água destilada (a diluição é realizada para que o número Transferir 1 ml da amostra diluída para outro tubo de ensaio. Homogeneizar em agitador para tubos. suficiente para um dia de Caso ao final da jornada. seja transferida para um tubo de ensaio.0 ml do tampão Preparar um volume da solução de trabalho o suficiente para uso durante uma Recomenda-se que uma porção dessa solução. Observação: Soluções que apresentem contaminações devem ser imediatamente descartadas.doc 73 6/7/2011 . contém 1 ml da amostra diluída. Preparar a câmara de Neubauer.5 ml) para um tubo de ensaio.0. proceder da seguinte maneira: • • • • • • • • • • • • Homogeneizar a amostra. Transferir uma alíquota da amostra (3 .

Contar, utilizando a objetiva de imersão (100X), as células presentes nos

quatro retículos centrais dos 25 quadrículos; Observação: • A contagem utilizando a objetiva de imersão (100X) permite uma observação mais precisa das células da levedura quanto a sua estrutura celular.

Cálculos

Viabilidade celular
A viabilidade celular indica a porcentagem de células em atividade na população de leveduras da amostra considerada. Total de células viáveis % Cel. viáveis = -------------------------------x 100 Total cel. viáveis + não viáveis

Contagem de células em brotamento
Indica a porcentagem de leveduras em atividade que estão se multiplicando Total de cel. viáveis em brotamento % Brotamento = ------------------------------------------- x 100 Total de células viáveis

População de Leveduras
Total de cel. viáveis x 4000 População leved./ml = Onde: D = diluição final --------------------------------- ----- x 1000 x D Total de retículos contados

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Exercícios
Calcular a viabilidade celular, a porcentagem de brotamento e a população de leveduras: a) Total de células viáveis: 199 Total de células não viáveis: 27 Total de células em brotamento: 21 Diluição: 1:40

b) Total de células viáveis: 270 Total de células não viáveis: 60 Total de células em brotamento: 16 Diluição: 1:30

Método para contagem de bactérias ao microscópio ótico
Esta técnica é mais adequada para a contagem de bacilos (bastonetes), embora outros tipos de bactéria (cocos) possam ser contados, e para população bacteriana acima de 104/ml. Maior precisão e repetibilidade são conseguidas quando o número de bastonetes/ml da amostra está entre 106 e 107. A contagem direta ao microscópio tem, portanto sua maior aplicabilidade para quantificação de bastonetes em amostras de caldos primário e misto e vinho (em fermentação ou final de fermentação). Para caldo clarificado e mosto onde a população normalmente é inferior a 104 - 105 bast./ml, esta técnica apresenta menor precisão. Não recomendamos realizar contagem em levedo tratado.

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Nesta preparação as células viáveis aparecerão incolores enquanto as não viáveis estarão coloridas de azul (Fig. 6). Deve-se diluir conveniente a amostra para que não mais que 3 a 5 bastonetes sejam encontrados por campo do microscópio.

Fig. 5: Corante sulfato azul de Nilo + azul de metileno, para contagem de bactérias e preparação de uma lâmina.

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2.2 g de azul de metileno.0. Dissolver em 100.20% • • Pesar 0. Observação: Fermentacaoalcoolica v2. Validade: 12 meses desde que armazenada em frasco fechado.0 ml de água destilada esterilizada.0 ml de água destilada esterilizada.doc 77 6/7/2011 . Solução de trabalho • • • Misturar partes iguais das soluções A e B. 6: Lâmina preparada para a contagem e uma amostra de vinho com a presença de bastonetes corados e não corados. Preparo das soluções Solução A .sulfato azul de nilo .0% • • Pesar 2.azul de metileno . Filtrar em papel de filtro.Fig. Deixar em repouso durante 24 h.0. Dissolver em 100. Solução B .0 g de sulfato azul de Nilo.

• Realizar a contagem de bastonetes não corados presentes em 70 campos. utilizando a objetiva de imersão (100x). Transferir 1 ml da solução corante para o tubo de ensaio que contém 1 ml da Homogeneizar em agitador para tubos. primário e misto • • • • • • • bolhas. Transferir 1 ml da solução corante para o tubo de ensaio que contém a amostra de células bacterianas seja adequado para a faixa de maior precisão da metodologia). PCTS.Checar semanalmente a solução de trabalho para verificar a presença de microrganismos contaminantes.0.0 L (lamínula de 20 x 20mm) ou 3. Transferir uma alíquota da amostra (3 – 5 ml) para um tubo de ensaio. Filtrar a amostra em algodão para eliminar as impurezas sólidas em Transferir 1 ml de amostra filtrada para um tubo de ensaio. • Homogeneizar em agitador para tubos. Homogeneizar a amostra. Deixar em repouso durante 5 min. Fermentacaoalcoolica v2. uniformemente distribuídos em toda a área da lamínula. Diluir a amostra com água destilada (a diluição é realizada para que o número Transferir 1 ml da amostra diluída para outro tubo de ensaio. amostra filtrada. tomando o cuidado para não formar Amostras de vinho bruto e levedo tratado • • • • • • • • • diluída. Adicionar papaína na amostra. da amostra corada para uma lâmina de vidro (26x76 mm). Procedimento analítico Amostras de caldos. Colocar uma lamínula sobre a preparação.doc 78 6/7/2011 . Homogeneizar em agitador para tubos. caso seja detectada contaminação a solução deve ser imediatamente descartada. Transferir 2. Homogeneizar em agitador para tubos.0 L (lamínula de 22 x 22mm) suspensão. Homogeneizar a amostra.

x M x D Vol.002 20 x 20 0. amostra onde: FM = fator do microscópio M = média total de bastonetes não corados / número campos contados D = diluição final Exercícios a) Calcular a população de bastonetes/ml das amostras. utilizando a objetiva para imersão (100x). • Transferir 2.004 24 x 24 Cálculos 1 População bastonetes/ml = FM x --------------------.003 ml no de bastonetes contados = 3 Fermentacaoalcoolica v2.003 22 x 22 0. Caldo: no de campos contados = 70 diluição final = 1:2 FM = 15406. Observação: O volume de amostra transferida para a lâmina depende do tamanho da lamínula utilizada. Volume (ml) Lamínula (mm) 0. uniformemente distribuídos em toda a área da lamínula.0 L (lamínula de 20 x 20mm) ou 3.• • bolhas. Colocar uma lamínula sobre a preparação.2 Vol. tomando o cuidado para não formar Proceder a contagem de bastonetes não corados presentes em 50 campos. amostra = 0.0 L (lamínula de 22 x 22mm) da amostra corada para uma lâmina de vidro (26x76 mm).doc 79 6/7/2011 .0.

0 ml de água destilada esterilizada.0.Vinho: no de campos contados = 50 diluição da amostra = 1:4 FM = 15406. Validade: 12 meses. Fermentacaoalcoolica v2.0%. amostra = 0. Solução B • Dissolver 0.doc 80 6/7/2011 . Preparo das soluções Solução de cristal violeta Solução A • Dissolver 2. Solução de trabalho • • Misturar as soluções A e B Filtrar.0 g de cristal violeta em 20.0 ml de álcool 95. mas quando forem detectados problemas de contaminação. A coloração não deve ser executada rotineiramente.003 ml no de bastonetes contados = 158 Teste de Gram A coloração de Gram é realizada para diferenciar microrganismos (Gram + e Gram -) tanto de suspensões líquidas como de colônias de cultivos sólidos.8 g de oxalato de amônia em 80.2 Vol.

Validade: 12 meses. Aguardar a lâmina esfriar. Aguardar secar o filme formado. Validade: 12 meses. Solução de iodo-lugol • Diluir 10 ml da solução de iodo-lugol (lugol forte) para 100. com água destilada esterilizada. Procedimento analítico Para Microrganismos em Suspensão Líquida • • • • • • • Transferir uma alíquota da suspensão para uma lâmina (26x76mm) bem limpa. Fermentacaoalcoolica v2. utilizando uma alça de platina esterilizada.0 ml com água destilada esterilizada. Fixar.doc 81 6/7/2011 . até formar um filme.0.5 g de safranina em 100.0 %. lâmina sobre chama baixa. com a alça da platina.Solução de safranina Solução estoque • Dissolver 2.0 ml de álcool 95.0 ml da solução estoque para 100. Solução de trabalho: • Diluir 10. Proceder a coloração da preparação fixada. através de aquecimento na chama de um bico de Bunsen. passando a Evitar que a lâmina aqueça demasiadamente.0 ml. Espalhar a amostra sobre a lâmina.

esta escorra da lâmina sem nenhuma coloração. aqueça demasiadamente. Fixar por aquecimento. Remover o corante.doc 82 6/7/2011 . Cobrir o filme com solução de safranina.Para Microrganismos de Cultivos Sólidos • • • • • • • • • Transferir uma gota de água destilada esterilizada para uma lâmina Remover uma pequena porção da colônia do microrganismo usando uma alça Transferir a amostra para a gotícula de água na lâmina. Lavar cuidadosamente o excesso de corante com água fria. evitando que a lâmina Aguardar a lâmina esfriar. de platina esterilizada. Espalhar a suspensão com a alça de platina até se formar um filme. com a alça de platina. Remover cuidadosamente o excesso de corante com água fria.5 minuto. Técnica de Coloração • • • • • • • • • • • Cobrir o filme fixado com algumas gotas da solução de cristal violeta. Cobrir o filme com solução de iodo-iodeto de potássio (lugol). lavando a lâmina com água fria. Proceder a coloração da preparação fixada. Fermentacaoalcoolica v2. Aguardar a preparação secar a temperatura ambiente. (26x76mm).0. à chama do bico de Bunsen. Descolorir com solução de álcool a 95% durante 30 a 60 segundos até que Lavar cuidadosamente com água fria. Homogeneizar. até obter uma suspensão uniforme. Aguardar 1. limpa e seca. Aguardar 2 minutos. Aguardar 1 minuto.

• Aguardar a preparação secar à temperatura ambiente. Fig. Interpretação As células de bactérias Gram positivas (+) se colorem de azul-violeta forte e aquelas Gram negativas (-) se colorem de vermelho (Fig 8).0.doc 83 6/7/2011 . Fermentacaoalcoolica v2. 7: Corantes utilizados e alguns procedimentos durante a realização da coloração de Gram. • Examinar ao microscópio utilizando a objetiva para imersão (100X). ou secar cuidadosamente (sem esfregar)a lâmina entre duas folhas de papel absorvente (papel de filtro).

Fig. Quantificação Após realizar a contagem das bactérias Gram + e Gram .0. ação Em alguns casos as bactérias podem apresentar reação de Gram variável. mesmo em condições adversas e/ou resistência ao aquecimento a temperaturas superiores a 100ºC. Isto é mais comum com as bactérias formadoras de esporos.doc 84 6/7/2011 . que nada mais são que estruturas altamente resistente. De modo geral todas as espécies dos gêneros Bacillus e Clostridium são capazes de produzir endosporos sendo algumas termófilas e a maioria mesófila. química)podem apresentar resultados falsos. 8: Exemplo de bactérias Gram positivas (+) e Gram negativas (-) Observações: • É indicado utilizar-se de cultivos de 18 a 24 horas para se obter melhores resultados. A natureza resistente de seus esporos lhes confere uma característica especial de sobrevivência por longos períodos de tempo.. Estas formações são denominadas "endosporos" ou mais comumente "esporos". Fermentacaoalcoolica v2. fazer em seguida a porcentagem de cada uma delas em relação ao total de bactérias contadas através da seguinte fórmula: Total de bactérias Gram (+) % Gram + = -----------------------------------------------x 100 Total de bactérias Gram(+) e Gram(-) Detecção de esporos Muitos gêneros de bactérias apresentam a capacidade de produzir certas formações ou corpos de parede espessa. pois as células jovens têm maior afinidade para os corantes do que as células velhas. • • Microrganismos que sofreram danos físicos na membrana (ação do calor. dependendo do seu estágio de desenvolvimento.

0. Solução de safranina • • • Pesar 0. outros). dissolver com água destilada esterilizada. Transferir para balão volumétrico de 100. produzindo por outro lado ácidos orgânicos (ácido láctico e. A determinação do número de esporos pode ser feita ou por cultivo em placas. Completar o volume com água destilada esterilizada Validade: 12 meses. Cobrir a preparação com algumas gotas de solução de verde malaquita 5. Deixar a lâmina esfriar à temperatura ambiente.0 g de verde malaquita. Procedimento analítico • • • • • • • Preparar um esfregaço da cultura sobre uma lâmina de vidro (26x76mm). Fermentacaoalcoolica v2. com emissão de vapores por quatro vezes. uma vez que com a germinação destes a carga bacteriana pode elevar-se rapidamente prejudicando todo o processo.A presença de esporos nos caldos e outros materiais se revestem de grande importância para o processo fermentativo. sacarose e outros açúcares. Validade: 12 meses. A coloração é normalmente empregada quando se pretende diferenciar os esporos das células vegetativas. por um minuto. os quais são capazes de utilizar glucose. Pesquisas mais recente (Fermentec) têm detectado a presença de bactérias em forma de bacilos esporulados em caldo clarificado (± 100ºC). Completar o volume com água destilada esterilizada. após ativação dos mesmos. Fixar a preparação. Os esporos aparecerão coloridos de verde e as células vegetativas coradas de vermelho (Fig. ou por contagem direta ao microscópio com ou sem coloração. Lavar o excesso de corante com água cuidadosamente. Aquecer a lâmina. Transferir o corante para balão volumétrico de 100.0 ml.5 g de safranina e dissolver com água destilada esterilizada.0 ml. dependendo do meio onde estão suspensos. por aquecimento à chama do bico de Bunsen.doc 85 6/7/2011 . 9). É importante não deixar o corante na lâmina entrar em ebulição. Preparo das soluções Solução de verde malaquita • • • Pesar 5.0%.

considerando a quantidade de esporos encontrados. Examinar ao microscópio usando a objetiva para imersão (100x). em relação ao total de bastonetes contados. Fig. Lavar o excesso de corante com água fria. Exemplo ilustrativo de esporos (coloração verde) e células vegetativas (coloração vermelha). Interpretação/Quantificação dos Esporos Normalmente é verificada apenas a presença ou não de esporos.0.5% Aguardar 15 a 20 segundos. Os esporos se apresentarão corados de verde enquanto as células vegetativas apareceram coradas de vermelho. Total bactérias com esporos % bactérias com esporos = ----------------------------------. 9: Corantes utilizados e alguns procedimentos durante a realização da coloração de esporos. Aguardar a lâmina secar.x 100 Total bactérias contadas Fermentacaoalcoolica v2.• • • • • • Contra corar a preparação com safranina a 0. contudo é possível que se faça a quantificação.doc 86 6/7/2011 .

doc 87 6/7/2011 . Fermentacaoalcoolica v2. Fazer a leitura quantificando de cima para baixo o espaço existente entre o volume total (100 ml) e início da separação do levedo. O teste é realizado com amostra de vinho bruto em final de fermentação Procedimento Analítico • • • • • Homogeneizar a amostra. Cronometrar 15 minutos.Teste de Floculação A floculação da levedura é um dos mais graves problemas e um importante parâmetro para o controle do processo de fermentação alcoólica. especialmente pela redução de produtividade e de dificuldades ocasionadas na centrifugação da levedura. principalmente o aumento da contaminação bacteriana. Transferir para uma proveta de 100 ml. Ajustar o menisco para 100 ml. A floculação pode ser causada pela própria linhagem da levedura e pelas condições da fermentação. excesso de cálcio e elevados níveis de temperatura.0.

indicando o melhor produto a ser empregado. 12: Ilustração do teste de floculação Teste de sensibilidade de bactérias aos antibióticos. através da variação da acidez do meio onde se desenvolvem os microrganismos contaminantes. avaliar o efeito de antimicrobianos sobre a microbiota contaminante presente. Fermentacaoalcoolica v2.doc 88 6/7/2011 . em relação à antimicrobianos. Esta metodologia é relativamente simples de ser realizada e permite. dentro de um período relativamente curto (6 a 8 horas). o que torna a utilização de antimicrobianos mais racional.0. econômica e eficaz. através da variação da acidez Este tem como objetivo avaliar a sensibilidade de bactérias contaminantes da fermentação alcoólica. de certa forma.% FLOCULAÇÃO = 79 % Fig.

Solução estoque de Antimicrobianos • • • • • Pesar 0. se necessário (é imprescindível Completar a dissolução com água destilada esterilizada. Transferir para balão volumétrico de 100 ml. Completar o volume para 100 ml com água destilada esterilizada. Observação: Recomenda-se que as soluções de antibióticos sejam preparadas no mesmo dia do seu uso.doc 89 6/7/2011 . Procedimento analítico Preparar 4 erlenmeyers (para testar 3 antimicrobianos + 1 testemunha). Completar o volume para 100 ml. estoque de actidiona + 3 ml da sol. estoque do antibiótico A (= 3 ppm). Transferir para balão volumétrico de 100 ml. com capacidade para 250 ml cada. Este é o tratamento A Fermentacaoalcoolica v2. Dissolver com água destilada esterilizada. Solubilizar em algumas gotas de álcool. como descrito a seguir: . Este é o tratamento testemunha. • • • • Pesar 0..Preparo das soluções Solução estoque de actidiona (inibidor de leveduras). Erlenmeyer 2: colocar 70 ml de mosto de alimentação + 30 ml de vinho bruto + 1 ml da sol. Erlenmeyer 1: colocar 70 ml de mosto de alimentação + 30 ml de vinho bruto + 1 ml da sol. estoque de actidiona.1 g de actidiona.01 g do antimicrobiano.0. seguir as recomendações do fabricante para a solubilização do produto).

estoque de actidiona + 3 ml da sol. estoque do antibiótico B (= 3 ppm). Homogeneizar. Assim. estoque de actidiona + 5 ml da sol. estoque do antibiótico C (= 5 ppm). Este é o tratamento C. Procedimentos: • • • • Transferir 20. frascos separados. Transferir 20. Aquecer até atingir ebulição e manter em refluxo durante 5 minutos. 1.0 ml de cada tratamento. Homogeneizar. tem-se: Erlenmeyer 1: Testemunha Erlenmeyer 2: Tratamento antibiótico A (3 ppm) Erlenmeyer 3: Tratamento antibiótico B (3 ppm) Erlenmeyer 4: Tratamento antibiótico C (5 ppm) • • • • • • • • Homogeneizar. Este é o tratamento B. usando pipeta volumétrica.0 ml de cada tratamento. para Determinar a acidez inicial de cada tratamento. para Determinar a acidez final de cada tratamento.0. frasco Erlenmeyer de 250 ml separados. Fermentacaoalcoolica v2. Erlenmeyer 4: colocar 70 ml de mosto de alimentação + 30 ml de vinho bruto + 1 ml da sol.0 ml de cada tratamento.Erlenmeyer 3: colocar 70 ml de mosto de alimentação + 30 ml de vinho bruto + 1 ml da sol.0ºC durante 6 h. Determinação da acidez Determinação da acidez sulfúrica (inicial e final) das amostras.0ºC Retirar os Erlenmeyers da estufa. Transferir 20. frascos separados. usando pipeta volumétrica. Incubar os Erlenmeyers em estufa a 35. usando pipeta volumétrica. para Adicionar 50 ml de água destilada.doc 90 6/7/2011 .

O tratamento que apresentar a menor variação da acidez.• • • • Resfriar Titular com NaOH 0.1 N. Fig. Anotar o volume gasto para cada amostra.0.doc 91 6/7/2011 .5. Acidez (g H2SO4) = Volume de NaOH gasto x 0. Calcular acidez.acidez inicial) para todos os tratamentos. corresponde ao antimicrobiano mais recomendado para ser dosado na fermentação. Interpretação dos resultados Calcular a variação da acidez (acidez final . Cálculo Delta Acidez (g H2SO4/L) = Acidez final – Acidez inicial Observação: Na ausência de refluxo deve-se manter a amostra em ebulição durante 2 minutos. até pH = 8. Fermentacaoalcoolica v2. 13: Ilustração da incubação e refluxo da amostra para avaliação de delta acidez.245 x fator do NaOH.

04 0. e por último. o efeito de antimicrobianos sobre bactérias contaminantes da fermentação alcoólica. para o emprego desta metodologia. como antibióticos e outros compostos. o laboratório deverá estar aparelhado com um bom espectrofotômetro. É uma metodologia relativamente simples de ser realizada e permite.82 1.doc 92 6/7/2011 . Apesar de simples.84 0. Completar o volume para 100 ml com água destilada esterilizada Validade e conservação – Até um mês armazenado sob refrigeração.31 0. de certa forma.84 0. Preparo das Soluções Estoque • Soluções estoque de inibidores de leveduras: Solução de Actidiona .15 Neste exemplo.49 0. seguido do antibiótico B. Transferir para balão volumétrico de 100 ml.07 0. Dissolver com água destilada esterilizada.inibidor do desenvolvimento de leveduras • • • • Pesar 0.0. bem como. dentro de um período relativamente curto (6 a 8 horas).83 0. o que torna a utilização dos antimicrobianos mais econômica e racional. O teste consiste em avaliar a ação dos antimicrobianos. • Soluções estoque dos antimicrobianos a serem testados : Fermentacaoalcoolica v2.91 0.1 g de actidiona. o antibiótico A foi o produto que apresentou melhor eficiência.88 0. indicar o produto mais eficaz e/ou dosagem a ser empregada. para o cultivo de microrganismos. todo o material necessário.98 0. Teste de sensibilidade de bactérias aos antibióticos por espectrofotometria Este teste tem como objetivo avaliar em laboratório. através da leitura espectrofotométrica da densidade ótica (absorbância) de uma suspensão microbiana. incubada com ou sem o produto em teste.Exemplo Testemunha Antibiótico A (3 ppm) Antibiótico B (3 ppm) Antibiótico C (5 ppm) acidez inicial acidez final Δ acidez 0. o antibiótico C.

para se conseguir a concentração de 3 ppm.. Retirar os tubos da Autoclave e deixar esfriar...... Meios de Cultivo Meio de Cultivo (Mayeux & Colmer...doc 93 6/7/2011 .0....... dosagem de 3.............. Validade e conservação – Preparar a solução no dia que realizar o teste ou no máximo um dia antes e armazenar sob refrigeração.......0g Fosfato monobásico de potássio ( K H2 PO4)....... é necessário transferir 0......... Neste exemplo.......5g Fermentacaoalcoolica v2.0g Água destilada ..10......0 ml Dissolver os componentes do meio por aquecimento em bico de Bunsen........01 g do antimicrobiano. a 121ºC .............. Solubilizar em algumas gotas de álcool..1000.. Após o uso.... Repetir o procedimento a cada teste realizado.. Completar o volume para 100 ml..0 ml de meio de cultivo......45 ml da solução estoque do antimicrobiano para cada tubo contendo 15............. 2......Exemplo: “antimicrobiano – A”.....0 ppm... Observação A concentração de antimicrobiano para a realização do teste é a mesma recomendada para a aplicação na dorna...... seguir as recomendações do fabricante para a solubilização do produto)...................0g Proteose – peptona . descartar a solução. Transferir para balão volumétrico de 100 ml......... • • • • • Pesar 0........0g Dextrose . autoclavável..........................20... se necessário (é imprescindível Completar a dissolução com água destilada esterilizada..5...... Meio de Cultivo ( GLT) • Extrato de Levedura ......... 2.. Transferir com pipeta 15 ml para tubos de ensaio com tampa de rosca Colocar os tubos na Autoclave e esterilizar por 15 min....... 1961) • • • • • • • • • Extrato de levedura..

..0 ml da amostra para tubo de cultivo.......... Homogeneizar a amostra.. para atingir a concentração desejada. Homogeneizar em agitador de tubos....0 ml Dissolver os componentes do meio por aquecimento em bico de Bunsen... Retirar os tubos da Autoclave e deixar esfriar.......15 ml da solução estoque de actidiona para cada Transferir com pipeta o volume necessário de antimicrobiano a ser testado Transferir com pipeta 0.• • • • • • • Triptona ... Transferir 5...0. meio de cultivo esterilizado. 1....0g Água destilada .doc 94 6/7/2011 ...0g Glucose (Dextrose) ................. Realização do Teste • • • • • Transferir com pipeta 0.....0 ml da amostra de vinho bruto para tubo de ensaio contendo 15 ml de • • • Incubar a 35 C por 12 horas.. pré inóculo já contendo papaína) tratamentos no aparelho de espectrofotômetro a 520 nm logo após a homogeneização... a 121ºC ..... Fazer a leitura (inicial) da absorbância da amostra testemunha e dos tubo com 15 ml do meio de cultivo esterilizado.. Transferir 1. Adicionar papaína e homogeneizar em agitador de tubos... Adicionar papaína ( Aguardar 5 min...... Este será o inóculo para a realização do teste.. autoclavável....15 ml do inóculo preparado (amostra de vinho ou Homogeneizar em agitador de tubos..1000.. Preparo do Inóculo • • • • • • • Coletar uma amostra de vinho bruto (dornas em final de fermentação)... 5 mg)..... 5....... Transferir com pipeta 15 ml para tubos de ensaio com tampa de rosca Colocar os tubos na Autoclave e esterilizar por 15 min.. Fermentacaoalcoolica v2..

Em seguida inocular mais dois tubos e assim sucessivamente até inocular todos os tubos. quanto maior for o efeito antimicrobiano do produto. é dada pela diferença entre a absorbância final menos a absorbância inicial. Lavar a cubeta do espectrofotômetro com a amostra a ser lida. O . Calibrar o espectrofotômetro para zero absorbância com água destilada. por esta metodologia. maior a turbidez do meio e. A eficiência do produto testado. Interpretação dos Resultados Quanto maior o desenvolvimento bacteriano. Quanto menor for a variação da absorbância. Assim tem-se: Delta ABS = ( ABS final – ABS inicial ) x 100.1º C. novamente homogeneizar o inóculo. no controle da microbiota presente na amostra testada. ) • • • • Ajustar o comprimento de onda do espectrofotômetro para 520 nm. mais eficiente será o produto.• • • • Transferir os tubos com as amostras testemunha e tratamentos para estufa Incubar por 6 horas. Fermentacaoalcoolica v2.doc 95 6/7/2011 . Leitura da Densidade Óptica ( D. Fazer a leitura (final) da absorbância nos tubos testemunha e tratamentos a 35º C +/. Retirar os tubos da estufa e homogeneizar em agitador de tubos. Importante Inocular apenas dois tubos por vez e.0. Realizar a leitura da absorbância. consequentemente maior será a leitura da absorbância. menor será a turbidez e menor a leitura da absorbância. Assim sendo. logo após a homogeneização.

Vidraria • • • • • • • • • • Tubos de ensaio 16x150mm. Funil 0.1ml (1/10).0ml (1/10). Eritrosina. Lâminas 26x76mm.A tabela abaixo é uma sugestão de como tabular os dados das leituras espectrofotométricas: Tempo Inicial (0h) Final (6h) Δ ABS x 100 Testemunha Produto A Produto B Relação de materiais necessários para instalação do laboratório de controle microbiológico – microscopia Equipamentos • • • • Microscópio óptico (campo claro). Lamínulas 22x22mm Pipetas graduadas de 0. Erlenmeyers de 500ml. Contador para células. Agitador automático para tubos de ensaio (marca Phoenix. Pipetas graduadas de 0.doc 96 6/7/2011 . Fermentacaoalcoolica v2. Sulfato azul de nilo. modelo AT-56). Câmara de Neubauer.0. Pipetas graduadas de 10ml (1/10). Pipetas graduadas de 1.1 ml (1/1000) Seringas de capacidade 5 L Reagentes • • • Azul de metileno.

Outros • • Algodão hidrófilo.0./ml % álcool Acidez pH Fermentacaoalcoolica v2. Verde malaquita. Observação: Os reagentes para as análises por microscopia devem ser da marca Merck. 200 uL. Lugol forte.doc 97 6/7/2011 . Modelos de boletim para o controle microbiológico por microscopia Matéria-prima Data Bast. Safranina. • • 1000 uL. Óleo para imersão (Marca Merck). Pipetadores automáticos Para maior segurança no trabalho sugere-se o uso de pipetadores automáticos com volume variável de. Cristal violeta.• • • • • • Citrato de sódio. Oxalato de amônia.

% Brotam. acidez e pH devem ser fornecidos pelo controle químico./ml Flocul.Média * Os valores de % álcool./ml % Álcool Brix Bast. máxima Fermento % Álcool % Média Fermentacaoalcoolica v2. % Temp.0. Moenda Caldo primário Data Bast. % Bast. Média Fermentação Data Viabil.doc 98 6/7/2011 ./ml % Álcool Brix Caldo secundário TAXA MULTI.

sendo. no ar. Para tal. como glutaraldeído 2%. os microrganismos (bactérias e leveduras) na forma vegetativa são menos resistentes ao calor do que na forma de esporos. emprega-se normalmente o calor úmido. os microrganismos são inativados por desnaturação das proteínas. Também pode ser utilizada quando se pretende isolar e caracterizar os diferentes grupos de microrganismos de seu habitat natural. De um modo geral. radiações ionizantes e não ionizantes. considerados inativos (mortos). etc. solo. Esterilização Esterilização. como gases (dióxido de etileno). deve-se esterilizar todo o material a ser utilizado. Esterilização por Calor Úmido . agentes químicos. o calor seco é o mais empregado. portanto.doc 99 6/7/2011 .CONTROLE MICROBIOLÓGICO – PLAQUEAMENTO Introdução O plaqueamento ou cultivo é uma das técnicas mais antigas para se avaliar a população microbiana. isolamento de microrganismos. os microrganismos submetidos à esterilização não serão capazes de se multiplicarem formando colônias. as vidrarias e peças ou equipamentos metálicos. enquanto. ou compostos químicos. tornando o microrganismo mais resistente e. Para se controlar a contaminação microbiana nos processos industriais e. etc. dependendo do Fermentacaoalcoolica v2. com calor seco as proteínas são desidratadas. Desta forma.. etc.Autoclave Na esterilização de meios de cultivo. por tempo variável de 15 a 30 minutos. a inativação completa (esterilização) vai depender do binômio tempo/temperatura empregado. portanto necessita-se de temperaturas mais elevadas e maior tempo de esterilização. por calor úmido emprega-se vapor saturado sob pressão (1 atmosfera /121 C). filtração. significa completa destruição de qualquer forma de vida.0. enquanto. em termos absolutos. pode-se usar: • • meios físicos: calor. De uma forma ou de outra. água. que possam inibir qualquer atividade microbiana. usados para avaliação das populações microbianas e/ou. Na esterilização empregando-se o calor úmido. alimentos. Para se conseguir a esterilização. para a esterilização dos meios de cultivo.

0. Fermentacaoalcoolica v2.doc 100 6/7/2011 .material a ser esterilizado. em equipamentos denominados Autoclaves. São encontrados dois tipos de Autoclaves: vertical e horizontal.

posição máxima do termostato). Fermentacaoalcoolica v2. pressão de trabalho e. termômetro e manômetro. Ajustar a válvula de segurança para a pressão de trabalho. através de resistência elétrica. uma válvula de segurança.0oC.doc 101 6/7/2011 . a válvula de segurança emitirá pequena quantidade de vapor. ou seja. uma tampa metálica resistente.0. Manter esta temperatura durante todo o tempo de esterilização (20 / 30 Verificar se há água suficiente na câmara de aquecimento. Carregar a Autoclave com o material a ser esterilizado. O aquecimento pode ser feito eletricamente. colocando todas as serpentinas para funcionar ( Deixar a válvula de descarga aberta até que todo o ar tenha sido removido. por serpentina de vapor ou diretamente com bico de gás.Fig. A pressão aumentará na câmara até atingir a Nestas condições a temperatura terá atingido 121. que fecha hermeticamente a câmara. Operação da autoclave • • • + ar ). Iniciar o aquecimento. Fechar a válvula de descarga. • • • • • • • min). Fechar a tampa e apertar os parafusos para vedar a saída de gases (vapor cobrindo as serpentinas. por uma borracha de vedação. Abrir a válvula de descarga de gases. Nesta tampa são encontrados uma válvula de descarga (saída de vapor e ar). 1: Aparelho de Autoclave de laboratório Constituição da Autoclave A Autoclave comum de laboratório é um equipamento constituído de uma câmara metálica vertical.

Deve-se esterilizar em estufas: placas de Petri. pipetas. contudo deixar que os mesmos se tornem vermelho rubro. etc. Fermentacaoalcoolica v2.0. • Em Estufas: a esterilização é feita em estufas esterilizadoras.0) o material poderá ser retirado da esterilização. sem. etc. Cuidados • Desligar o aquecimento (termostato). tubos de cultivo.. Esperar até que todo o vapor tenha saído (3 a 5 min) e abrir a tampa da Depois de alguns minutos (+/. seringas de vidro. Esterilização por Calor Seco No caso do calor seco. lâminas. passando-se com cuidado estes matérias pela chama do bico de Bunsen várias vezes. frascos de vidro.doc 102 6/7/2011 . depois de completado o tempo de Abrir a válvula de descarga bem lentamente. Não abrir a válvula de descarga de vapor e de ar. antes que a pressão tenha chegado a zero. a esterilização pode ser feita por: • • Aquecimento ao rubro: mantendo-se a peça na chama de um bico de Flambagem: para a descontaminação de bocas de frascos. O material a ser esterilizado deverá ser acondicionado em papel especial (papel manilha ou alumínio) ou recipiente metálico.• • • Autoclave. até que se torne vermelho rubro (alças de platina. usam-se a técnica de flambagem. etc). instrumentos metálicos. Mudanças bruscas de temperatura poderão provocar a quebra da vidraria. e esperar baixar à pressão a zero.3. com calor seco. agulhas. Bunsen. • Autoclave. agulhas. em temperatura a 180oC por duas horas. pois provocará ebulição violenta do líquido contido nos recipientes (frascos) e estes poderão até mesmo explodir • Não remover o material da Autoclave imediatamente após abri-la.

2 Operação da estufa • • • • • • Acondicionar o material a ser esterilizado em recipiente metálico ou papel Kraft Colocar todo o material na estufa Ligar a estufa e esperar a temperatura atingir 180ºC Monitorar a temperatura por duas horas (Tempo de esterilização) Desligar e esperar a estufa esfriar Retirar o material da estufa e mantê-lo em local apropriado Observações • • Não abrir a estufa antes de decorrido o tempo total de esterilização. É utilizada para esterilização de meios de cultivo que não podem ser esterilizados por aquecimento às altas temperaturas.doc 103 6/7/2011 .Esterilização por calor seco – Estufa Fig. ANÁLISES de CONTROLE MICROBIOLÓGICO por PLAQUEAMENTO Fermentacaoalcoolica v2. 2: Aparelho de Estufa 2. com poros de diâmetros adequados para retenção de microrganismos (bactérias ou leveduras). Somente abrir os recipientes no momento de uso do material e próximo à chama do bico de Bunsen. etc. soluções de antibióticos.1. Esterilização por Filtração Feita em membranas de acetato de celulose.0.

..... MEIOS de CULTIVO São usados diferentes meios de cultivo.A técnica de plaqueamento praticamente pode ser aplicada em todas as etapas dos processos de produção de açúcar e de álcool ............... Plate Count Agar (P C A . ....doc 104 6/7/2011 ..... 2.... sua aplicação se faz necessária principalmente nas etapas em que os níveis de contaminação são relativamente baixos e........Agar Padrão) – Bactérias Aeróbios Mesófilas Totais • • • • • Extrato de Levedura ..0g Agar ...... • • Mel final (fábrica.....................0g Dextrose .....0g Água destilada . o plaqueamento fornecerá resultados mais precisos e confiáveis. saída turbinas e tanque depósito): bactérias e leveduras Águas para diluição do fermento e do mosto Observação Para um rastreamento e detecção de pontos mortos na fábrica de açúcar...5g Triptona ........ a técnica de contagem por Microscopia não é a mais indicada.0.........15.... Entretanto.... embora o tempo para se obter os resultados seja maior......... 1.0 ml Fermentacaoalcoolica v2.......1000................ o plaqueamento é a técnica mais adequada.. em amostras em que os níveis de contaminação sejam inferiores a 1............ O controle microbiológico por plaqueamento deve ser feito para as seguintes amostras: • • • Matéria-prima : caldo da prensa – leveduras Caldo misto (amostra antes do aquecimento)... de acordo com a finalidade do plaqueamento..0 x 105 ........... Assim..bactérias e leveduras Após tratamento térmico (caldo decantado ou pré-evaporado): leveduras e bactérias • Mosto (antes e após trocadores de calor e alimentação das dornas) : bactérias principalmente. 5.........

........10..20.....0g Água destilada ......0g Dextrose ............................................2..................0g Proteose – peptona ................0g Acetato de sódio ...1000.....0............5......................0 ml Fosfato bibásico de potássio ...................................0g Tween 80 ....................................20.......................................Ágar............0g Ágar ...............................20...05g Ágar .................0g Meio – Mayeux & Colmer – Teste de Sensibilidade • • • Extrato de levedura...0g Sulfato de magnésio ..................0g Extrato de carne ........0g Dextrose .......15...Bactérias Lácticas Totais • • • • • • • • • • • • Peptona ........doc 105 6/7/2011 ..........1.........................5................................................................0g Água destilada ...........0g Dextrose .. 10...5.0......0g Fermentacaoalcoolica v2................0g Extrato de levedura ........5..................15..................................Peptona.................Man......1g Sulfato de manganês ...........1000..0..0g Citrato bibásico de amônio .............0 ml Extrato de Levedura............2......Ágar (YEPD + A) – Leveduras • • • • • Extrato de Levedura ....... Rogosa & Sharpe (MRSA) ..........0g Peptona ...........Dextrose ..........10........20.....

doc 106 6/7/2011 .0..... • Validade e conservação – Até um mês armazenado sob refrigeração...0 ml Observação Todos os meios de cultivo devem ser usados somente dentro do prazo de validade.....1000.............0 ml Meio de Cultivo G..0g Glucose (Dextrose) ..... – Teste de Sensibilidade • • • • Extrato de Levedura ..... INIBIDORES de CRESCIMENTO MICROBIOANO – Soluções Estoque Dependendo do plaqueamento/isolamento a ser feita.....0g Água destilada ......5g Triptona . Tetraciclina : • • Dissolver 250 mg de tetraciclina em 25 ml de água destilada esterilizada Dosagem recomendada – 100 ppm....• • Fosfato monobásico de potássio ( K H2 PO4......... 1................... Bactérias Cloranfenicol: • • • Dissolver 250 mg de cloranfenicol em 25 ml de água destilada esterilizada Dosagem recomendada ..100 ppm......... L ...T.... Validade e conservação – Até um mês armazenado sob refrigeração........... 2...... é necessário que se use inibidores de crescimento de leveduras ou bactérias.................... Leveduras Actidiona (ciclohexemide) : Fermentacaoalcoolica v2....... 2.................1000........ 5....0g Água destilada ...

• Validade e conservação – Até um mês armazenado sob refrigeração.• • Dissolver 100 mg de actidiona em 100 ml de água destilada esterilizada. Fermentacaoalcoolica v2. Diluição. MÉTODOS PARA CONTAGEM DE CÉLULAS VIÁVEIS: LEVEDURAS E BACTÉRIAS A semeadura em placas ou plaqueamento revela o número de leveduras e/ou bactérias capazes de se multiplicarem e formarem colônias em meios de cultivo apropriados e sob condições de incubação adequadas. 1:100 (102). Como para uma maior precisão da análise somente devem ser contadas as placas com número de colônias > que 30 e < 300. para homogeneização. para homogeneização. Cada colônia desenvolvida é supostamente originada a partir de uma unidade viável. Plaqueamento por Incorporação ou Profundidade (Método “Pour Plate”) Como a população microbiana presente no material pode ser variável.0. • Agitar em agitador de tubos. Pipetar 1.doc 107 6/7/2011 .0 ml de água esterilizada. deve-se fazer uma diluição da amostra para evitar que as colônias se desenvolvam aglomeradas e dificulte a contagem. Este procedimento é conhecido como diluição em série ou diluições sucessivas.0 ml da diluição (101) para tubo de ensaio contendo 9. uma diluição da amostra deve ser feita antes de se proceder a sua mistura com meio de cultivo.0 ml de água esterilizada. Dosagem recomendada – 10 ppm. 1:10 (101). • • Agitar em agitador para tubos. Diluição . Diluição em série • Transferir 1 ml da amostra para um tubo de ensaio contendo 9. antes de se realizar o plaqueamento.

Após este tempo. como mostrado no esquema a seguir. até conseguir-se a diluição desejada.0 1 C. Transferir 1 ml desta para a placa de Petri. Cálculo do número UFC/ml.000 = 1. Agitar a placa com movimentos rotativos para direita e para a esquerda para misturar a amostra e o meio de cultivo. • • • Aguardar esfriar (solidificar) o meio e inverter as placas antes de incubar. 1mL DA AMOSTRA 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 9 mL de H2O DESTILADA ESTERILIZADA 101 102 103 104 105 106 Técnica de plaqueamento • • • • Conseguida a diluição mais conveniente. Em seguida incubar as placas em estufa 35. Para se calcular o número de UFC / ml. da amostra deve-se multiplicar o número de colônias contadas pela diluição. previamente esterilizada.0. fazer a contagem das colônias formadas em contador de colônias (Aumento 30/50 x). Adicionar o meio de cultivo líquido. distribuindo os microrganismos presentes uniformemente no meio.2x105 UFC/ml Fermentacaoalcoolica v2.0 ml de cada diluição para tubos de ensaio com 9.• Para diluições maiores basta transferir 1. Ex: Número de colônias contadas = 120 Diluição 1:1000 (103) 120x1000 = 120.doc 108 6/7/2011 . a uma temperatura de 45 C/46 C.0 ml água esterilizada. por 24 a 48 horas.

Distribuir o meio de cultivo fundido (líquido) na placa de Petri. Transferir com pipeta. também esterilizada. • Levar a placa de Petri. Com auxílio de uma alça de Drigalsky. em autoclave ou forno microondas. Observação Fazer a contagem das colônias formadas em contador de colônias (Aumento 30/50X). diluída ou não para a placa. 3: Plaqueamento por Incorporação ou Profundidade.0.doc 109 6/7/2011 . esta será pesada para se fazer as diluições e o resultado deverá ser expresso em UFC / g. Plaqueamento de Superfície (Método “Spread Plate”) • • • • • Fundir o meio de cultivo.1ml da amostra. Fig. Deixar solidificar. espalhar a amostra sobre a superfície do meio solidificado. 0. inoculada para a estufa com temperatura regulada. Multiplicar o resultado final pela diluição realizada. • Incubar até o completo desenvolvimento das colônias (48 / 72 h ). de acordo com o microrganismo (bactéria ou levedura).Observação Para amostras que não se pode pipetar. Fermentacaoalcoolica v2. como o mel por exemplo.

deve-se multiplicar o número de colônias contadas pela diluição e por 10. tornando difícil a contagem.Cálculo do número de UFC/ml Para se calcular o número de UFC/ml da amostra. Fermentacaoalcoolica v2. • Volumes maiores que 0.1 ml devem ser evitados. pois excesso de líquido poderá causar o agrupamento das colônias. antes de transferir a amostra para a placa. Fig.0. Observações • É importante que a superfície do meio de cultivo na placa de Petri esteja bem seca.doc 110 6/7/2011 . Ex: Número de colônias contadas = 31 Diluição: 1: 100 (102) Tem-se: 31 x 100 x 10 = 31000 = 3. 4: Plaqueamento de Superfície Avaliação da População Microbiana por Filtração em Membrana.1 x104 UFC/ml.

porque se podem filtrar volumes maiores. Neste caso podem-se filtrar volumes menores. se baseia na filtração sob vácuo. através de membranas específicas com porosidade de diâmetro uniforme capaz de reter os microrganismos. Assim. porém.22 micra) e para retenção de leveduras (poro 0.É uma opção para se avaliar a população microbiana. As membranas para uso em contagens Microbiológicas já vêm esterilizadas e embaladas individualmente.doc 111 6/7/2011 . pode também ser usada para amostras com altas contaminações. fazendo-se diluições sucessivas da amostra. da amostra a ser analisada.45 micra) e com diâmetros de filtro variáveis. têm-se membranas para retenção de bactérias (poro 0. além do plaqueamento e. Esta técnica é bastante útil quando se têm amostras com pequeno número de células viáveis. Fermentacaoalcoolica v2.0.

contendo meio de cultivo apropriado. multiplica-se pela diluição e dividi-se pelo peso da amostra.0 UFC/ml Observações • Qualquer que seja o volume de amostra filtrado. Cálculo do número de UFC/ml Para o cálculo do número de UFC/ml.5 / 8. • • Incubar por 24 / 48 horas. para se expressar em UFC/ml. • Em caso de amostras sólidas. deve-se expressar em UFC/g. Levar para a estufa. Deixar em repouso para solidificar.0. Retirar a membrana com pinça metálica esterilizada. Caso contrário deve-se expressar como UFC/volume de amostra filtrada.Fig. Fermentacaoalcoolica v2. • • • • • Ligar a bomba ou trompa de vácuo. deve-se multiplicar o número de colônias contadas pela diluição Ex: Número de colônias contadas = 75 Diluição 1:10 (101) Volume de amostra filtrada = 100 ml 75 x 10 / 100 = 750 / 100 = 7.doc 112 6/7/2011 . da mesma forma que se faz no plaqueamento convencional. Colocá-la na placa previamente preparada. Em condições assépticas filtrar a amostra. Procedimento analítico • • • • Verter 15 a 20 ml de meio de cultivo em placa de Petri. 5: Membrana. conjunto de filtração. Fazer a contagem das colônias que se desenvolveram na superfície da membrana. Esterilizar o conjunto de filtração Montar em condições assépticas (câmara de fluxo) o conjunto de filtração com a membrana apropriada. deve-se dividir por este volume. à temperatura adequada para o microrganismo que se pretende avaliar (bactéria ou levedura).

• Distribuir 15/20 ml do meio previamente fundido em placas de Petri esterilizadas. em Autoclave ou microondas.0. Flambar a alça de platina ao rubro (bico de Bunsen) . de acordo com o microrganismo a ser cultivado (bactéria ou levedura) .Cultivo por Estrias Este não é um método de contagem propriamente dito. Incubar em estufa por 48/72 h à temperatura adequada. • • • • • • Esperar solidificar. Fazer estrias na superfície do meio de cultivo. diluída ou não. em vários sentidos.doc 113 6/7/2011 . Mergulhar a alça de platina na amostra. e sim uma técnica muito usada no isolamento de microrganismos. Esfriá-la em água esterilizada. • Considerar para análises posteriores somente as colônias bem isoladas. para posterior caracterização e classificação. Procedimento analítico • Fundir o meio de cultivo apropriado (bactérias ou leveduras). Fermentacaoalcoolica v2. Observação Este procedimento vai propiciar o desenvolvimento de colônias separado as quais serão depois transferidas para meio de cultivo líquido. para posterior aplicação dos testes bioquímicos específicos ou técnicas moleculares.

• • Levar as placas Petrifilm para a estufa. Fermentacaoalcoolica v2. É uma modificação da técnica convencional de contagem de células viáveis por plaqueamento. Procedimento analítico • • Fazer diluições em série da amostra a ser avaliada. que após a incubação. impregnados pelo meio de cultivo e por substâncias geleificantes solúveis em água fria e.0. • • Retornar o filme superior à posição original. bolores e leveduras. • • Fazer a contagem das colônias formadas (pontos coloridos).doc 114 6/7/2011 . Sob condições assépticas (câmara de fluxo laminar). revelarão o desenvolvimento microbiano. em praticamente todas as etapas do processamento de açúcar e álcool. com UFC/ml .Fig 6: Placa de Petri com cultivo por Estrias Cultivo em PetriFilm® Esta técnica pode ser aplicada para contagem de mesófilos aeróbios totais. erguer o filme superior de celofane da placa Petrifilm com pinça metálica esterilizada. por leve pressão manual. • Inocular o filme inferior (meio de cultivo). A placa Petrifilm é composta por dois filmes estéreis. Expressar o resultado. Fazer a distribuição da amostra com o espalhador específico. também com corantes próprios (compostos cromogênicos). Incubar à temperatura e tempo variáveis com o tipo de microrganismo em avaliação. reidratáveis. com 1ml das diluições a serem plaqueadas. de acordo com o microrganismo sendo avaliado.

com grande economia de tempo de trabalho • Em caso de amostras sólidas. tomando-se por base o peso da amostra usado para se fazer as diluições. especialmente pela redução de produtividade e aumento nas dificuldades de centrifugação da levedura.doc 115 6/7/2011 . para sua reutilização no processo (reciclagem).0. Exemplo: Número de colônias contadas = 99 Diluição = 1: 1000 (103) 99 x 1000 = 99.9 x 104 UFC/ml Observações • Este método é considerado equivalente ao convencional.Cálculo do número de UFC/ml Para calcular o número de UFC/ml. deve-se expressar em UFC/g . Fermentacaoalcoolica v2.000 = 9. deve-se multiplicar o número de colônias contadas pela diluição. Fig 7 e 8: Plaqueamento em Petrifilm OUTRAS ANÁLISES Avaliação da Floculação da Levedura A floculação da levedura é um dos mais graves problemas no processo de fermentação alcoólica.

doc 116 6/7/2011 . ou se induzida pela deficiência de minerais como nitrogênio e magnésio. dos gêneros Lactobacillus e Bacillus e também de agentes químicos (Ca++).0. % FLOCULAÇÃO = 79 % Fermentacaoalcoolica v2.O fenômeno de floculação pode ser de duas categorias: reversível e irreversível. 9: Flocos de leveduras. Transferir para uma proveta de Ajustar o menisco para 100 mL. Já a floculação irreversível pode ser o resultado de características próprias da levedura (levedura floculante) ou como resultado de falhas no desprendimento do broto (célula filha). Procedimento Analítico • • • • • Homogeneizar a amostra. Fazer a leitura quantificando de 100 mL. como resultado principalmente de contaminações bacterianas. Cronometrar 15 minutos. cima para baixo o espaço existente entre o volume total (100 mL) e início da separação do levedo. A floculação reversível se caracteriza pelo agrupamento de células no final da fase exponencial de crescimento ou na fase estacionária. Fig.

e mais. O agrupamento das leveduras diminui a área específica das leveduras expostas ao meio externo. Há. proteínas e polissacarídeos extracelulares). havendo separação de fases assim que a agitação causada pela liberação de CO2 diminuir. o que causa diminuição na velocidade de fermentação e de reprodução e aumento na taxa de morte. O tratamento ácido também auxilia no controle da floculação. outros problemas que complicam o tratamento. qualquer manobra errada significando grandes perdas de fermento e/ou redução de produção. relacionado tanto as condições de centrifugação como a presença dos flocos.doc 117 6/7/2011 . porém. carregando sólidos em suspensão e colóides (argila. em conjunto com o grande diâmetro dos flocos. ele se torna muito mais pesado. Além disso. 10: Ilustração do teste de floculação FLOCULAÇÃO DAS CÉLULAS DE LEVEDURAS A floculação segue sendo um dos principais problemas de fermentação. torna a operação da centrífuga extremamente crítica e pouco produtiva. como o floco tem um diâmetro muito maior que o de uma célula isolada. Fermentacaoalcoolica v2. pois é de difícil previsão e de difícil controle.Fig.0. em vista de sua grande área e voluma. o que diminui a velocidade de retirada de açúcar e nutrientes e torna mais difícil a liberação do álcool e do CO2. Quando um floco (formado por milhares de leveduras) é acelerado dento da centrífuga. carrega consigo não apenas as bactérias aderidas as leveduras como aquelas que originalmente não estavam aderidas. A alta concentração de fermento que se acumula no fundo das dornas no início da centrifugação. quebrando os flocos e permitindo que as bactérias em seu interior percam a proteção do floco e sejam agredidas pelos antibióticos.

Fermentacaoalcoolica v2.2 e quando existirem principalmente bactérias. por produção de ácidos e glicerol.Todo este material orgânico irá “reagir” com o ácido sulfúrico competindo pela ação desfloculante dos íons [H+] e reduzindo a eficiência do tratamento. este pH fica na faixa de 2. O maior consumo de ácido e em conseqüência maior acidez torna o tratamento mais agressivo. A maior parte dos problemas de floculação nas destilarias envolve a presença de um contaminante especial. diminuição do teor de fermento. que são naturalmente floculantes (como as utilizadas em cervejarias. Para complicar esta situação. ou seja.controle da assepsia do mosto (monitorada pelo delta-pH ou delta-acidez): deve ser minimizada a entrada de bactérias no mosto através de limpezas freqüentes de todas as linhas e os equipamentos em contato com o açúcar. diminuição da viabilidade. Os principais controles para evitar uma grave floculação bacteriana no processo são: . diminuindo a viabilidade do fermento. as linhas devem ser esgotadas e limpas com água e depois com água e biocida.doc 118 6/7/2011 . com grande consumo de ácido. quatro vezes por dia. A área por unidade do volume sendo tanto menor quanto maior o diâmetro do floco reduz ainda mais a eficiência de tratamento ácido.0. redução na produção. Nas paradas. aumento no tempo de fermentação. algumas leveduras contaminantes. para alterar a estrutura da proteína que estabiliza o floco. um tipo de bactéria do gênero Lactobacillus que tem a capacidade de sintetizar um tipo de proteína (associada a sua parte externa) que se adere firmemente a uma fração de carboidrato da parede celular da levedura. A única diferença entre estes dois tipos de floculação é a faixa de pH necessário para desflocular. desgaste acelerado nas centrífugas e perdas de rendimento por sobra de açúcares.5. por exemplo). Quando existem principalmente leveduras contaminantes. também têm a capacidade de co-flocular com a levedura normal. o pH de desfloculação estará abaixo de 2. resultando tudo isso em uma lenta recuperação do processo. A bactéria pelo seu pequeno tamanho e grande área. já que haverá grande aumento no número de bactérias no leite. a manana. tem a capacidade de aderir a diversas leveduras simultaneamente formando os flocos. preferencialmente passando caldo na temperatura de ebulição por pelo menos 15 minutos. bastando 20 a 30% do número total de leveduras nesta forma para promover a total aglomeração da população.

por agentes químicos ou microbiológicos. Isto pode ser causado pela ação de propriedades inerentes das células. O meio de cultivo também interfere na floculação. relativamente lisa. É possível que a ligação seletiva de Ca+2 com proteina seja mediada por arranjo Fermentacaoalcoolica v2. por exemplo. A diferença da estrutura entre linhagens floculentas e não floculentas não pode ser detectada pela análise química mas pode ser visualizada por microscopia eletrônica. A interação se estende por toda área causando distorção da parede no local do contato.O valor do delta-pH deve estar abaixo de 0. O fator responsável pela floculação de leveduras é governado geneticamente. (2) A hidrólise de proteina de células não floculentas ou floculentas não altera a sua interação com células floculentas intactas. Floculação da levedura pela bactéria Lactobacillus fermentum No estudo de leveduras. O mecanismo exato de floculação da levedura não é conhecido. pela inversão do lado de fluxo (caldo/água). Na fermentação alcoólica industrial. Esse componente proteico está associado à parede celular não podendo ser removido pelo calor ou tratamento químico. que deve ser mantido limpo. A anaerobiose reprime a floculação e a aerobiose induz a formação de proteína responsável pela floculação. cuidando-se principalmente do estado do trocador de calor. A força de ligação entre as células floculentas pode ser dada pela ponte de hidrogênio ou polissacarídeos da parede celular e íon Ca+2.6.0. associada a grupo carboxila da proteina da parede celular. Trabalhos realizados com linhagens floculentas mostraram que a manana da parede celular participava da floculação. Além do fator genético há outros que interferem ou inibem a sua ação. Nas usinas alcooleiras.doc 119 6/7/2011 . Nestas condições acentua-se a sedimentação das células de leveduras nas dornas e interfere na operação das centrífugas contínuas. o termo floculação é normalmente usado para designar o fenômeno reversível de agrupamento celular que comumente se desenvolve no final da fase exponencial de crescimento ou na fase estacionária. As células floculentas apresentam superficie fimbriada ou ciliada e as não floculentas. antes que o delta-pH suba. as leveduras floculentas estão normalmente presentes como contaminantes das leveduras normais (não floculentas). O envolvimento da manana é indicado por diversos experimentos: (1) A floculação é inibida competitivamente por manana. a presença de leveduras floculentas em concentração superior a 12% causa dificuldade significativa na operação de centrifugação do vinho devido ao fenômeno de co-floculação.

O sítio susceptível à temperatura e proteinase está localizado na célula bacteriana e não na levedura. Magnésio pode substituir Ca+2. Além disso há uma relação numérica celular entre a bactéria e a levedura onde se consegue o máximo de floculação. O estudo da mobilidade eletrostática das células de bactérias e levedura mostrou que a floculação era causada pela atração eletrostática entre as superfícies celulares de bactérias e leveduras com cargas opostas. como susceptibilidade às altas temperaturas. tornam o controle do processo de floculação um desafio de grande importância e dificuldade. Na fermentação alcoólica industrial é frequente a contaminação por bactérias do gênero Lactobacillus. A diversidade dos microrganismos e dos agentes envolvidos na floculação do fermento nas dornas de fermentação. Esta floculação apresenta algumas características similares às leveduras floculentas. necessidade de íons metálicos e inibição por manose e excesso de íons. O fenômeno ocorre a pH entre 2. maltose e sacarose não produzem nenhum efeito. onde células mães e filhas não se soltam umas das outras. Já glicose. A necessidade de íons Ca+2 para floculação depende do pH sendo que em concentrações elevadas (> 10-1 M) há desfloculação das células. No caso da floculação causada por Lactobacillus fermentum o fator responsável é de natureza proteica encontrado na célula bacteriana. Como no caso de leveduras floculentas. e a Fermentacaoalcoolica v2. presença de íons e manose.específico do grupo carboxila. bem como o grande volume de mosto manuseado durante a fermentação alcoólica industrial. Aspectos gerais Quando se estuda floculação. Algumas dessas bactérias são capazes de provocar a floculação de leveduras como por exemplo Lactobacillus fermentum. Uma floculação específica também pode ser causada por L.0 e é inibido por sais neutros. e a sua interação com células de levedura é afetada com variação de pH.0 e 4.0. O tratamento térmico aplicado sobre a célula bacteriana provoca a perda da sua capacidade floculadora. é importante fazer a distinção entre a (não reversível) formação da cadeia. mas depende do pH. indicando que existe um número fixo de sítios na levedura para formação do agregado.0 enquanto que Ca+2 atua a intervalo de pH maior (pH >3. A floculação é dependente do Ca+2 em quantidades mínimas (10-6 a 10-8). e atua somente ao redor de pH 4. a manose causa a desfloculação. plantarum.0). mas também pode ser que o íon Ca+2 atue como cofator na ativação da capacidade de ligação da proteina com a manana. proteinase e pH’s extremos. é termolábil e destruido por proteinase.doc 120 6/7/2011 .

devido à inclusão de CO2. além disso. Na verdade. a agregação mostrou ser dependente do pH. a produção de proteínas por choque térmico e formação de pseudomicélio. floculação induzida e reversível. a floculação foi demonstrada ocorrer entre a bactéria Grampositiva Lactobacillus fermentum e a levedura que não é inteiramente dependente do cálcio. ignorando que a agregação de células não é apenas pré-requisito para sedimentação. A floculação é um fenômeno muito comum observado em suspensão de microrganismos. Por isso.0. A formação de cadeias está relacionada com o crescimento e começa no início da fermentação.doc 121 6/7/2011 . Entretanto de um ponto de vista prático os dois últimos procedimentos podem criar sérios problemas. uma compreensão dos mecanismos de floculação e os fatores que a afetam são de grande importância para a fermentação e indústria relacionadas. centrifugação e/ou filtração. mas também para flotação. A floculação real pode ser considerada como uma reação de estresse. Após o término de seu papel metabólico numa fermentação. Especialmente em procedimentos contínuos a separação das células do meio pode ser obtida sem centrifugação. tal como o acúmulo de trealose. Tem sido relatado que a agregação de leveduras por Lactobacillus é devido a força eletrostática entre as superfícies das paredes celulares de bactérias e leveduras. a regulação da floculação mostra uma evolução paralela com outras respostas de estresse. a levedura deve ser removida do meio por floculação. Fermentacaoalcoolica v2. A floculação começa com a exaustão do meio. desta forma é compreensível que os vários ensaios de floculação (ou precisamente de sedimentação) são baseados nas medidas visuais ou fotométricas da velocidade de sedimentação do depósito de células. Consiste na agregação de células fazendo com que elas sedimentem. Durante a seleção de uma cepa de levedura para propósitos fermentativos. A floculação é classicamente descrita como um fenômeno reversível em que células de leveduras aderem-se em flocos e sedimentam-se rapidamente do meio em que estão em suspensão. podem flutuar para a superfície. Entretanto o termo floculação é mais usado para descrever apenas o fenômeno de sedimentação. As células localizadas na periferia do floco protegeriam as células que estão no centro contra as condições desfavoráveis do meio.real. Estes flocos podem sedimentar ou. Comparativamente poucos estudos foram enfocados na floculação de leveduras induzida por bactérias. a floculação pode ser considerada como uma estratégia de sobrevivência. sua habilidade de floculação é considerada ser maior de importância. Mais recentemente. Provavelmente. como uma resposta de um baixo nível de nutrientes ou um mecanismo de defesa contra altas concentrações de etanol.

A característica da floculação é estimada primeiramente como uma manifestação da parede celular externa da levedura.0. Tais medidas também resultam em um grau de confusão entre floculação. diz respeito a combinação de células de leveduras sexuadas. agitação e estresse. tais medidas são freqüentemente levadas a cabo externamente na fermentação do mosto com a presença de substâncias conhecidas para induzirem a floculação. produtos da fermentação. por exemplo etanol. Elas não fornecem informação direta no estado de agregação de células de leveduras como elas passam pela fermentação. proteínas e peptídios.doc 122 6/7/2011 . temperatura e concentração de íons bivalentes. fatores a e α que causam um número de mudanças fisiológicas. Cepas haplóides de dois tipos de leveduras sexuadas no caso de Saccharomyces cerevisiae trocam poucos feromônios peptídeos. Depois destas modificações. Uma outra razão para a diversidade de explicações de floculação de leveduras encontra-se na diversidade de metodologias usadas em investigações experimentais. pH. e sedimentação. tanto quanto a concentração de células. a população inicial de células de leveduras. composição da solução e agitação. todas com mecanismos distintos de adesão.componente de proteínas. função mitocondrial. tanto quanto a concentração das células. as células agregam-se antes da fusão celular para formarem Fermentacaoalcoolica v2.Primeiramente para se produzir uma cerveja de alta qualidade é essencial que as células de leveduras sejam removidas do mosto fermentado quando elas terminam seu trabalho. Muitos fatores exercem uma influência na floculação de leveduras. geometria do recipiente. especificamente. Existem três razões possíveis para as células de leveduras agregarem-se. que é chamada de autofloculação. Igualmente. Genes FLO). Dentre estes são componentes genéticos (por exemplo. O mecanismo desta agregação é um assunto de considerável controvérsia que é mencionada em várias literaturas. e cátions. a deposição subseqüente das células agregadas restantes. Aspectos genéticos A velocidade de floculação em levedura depende de parâmetros genéticos e ambientais. especialmente Cálcio. O primeiro e melhor entendido. Estas velocidades são muito dependentes das condições usadas. a manose . A floculação de leveduras é quase que exclusivamente estudada por medida direta ou indireta da velocidade de deposição de flocos de leveduras. Não é dada uma medida direta do tamanho do resultado da agregação. Um importante estágio desta remoção é a agregação espontânea de células de leveduras em flocos.

Ca++ causando agregação das células. é reversível. A floculação. A floculação tem sido usada pela indústria cervejeira. inibida por agentes quelantes ou por açúcares específicos. A floculação geralmente ocorre entre células de apenas uma cepa de levedura. talvez uma tentativa de um crescimento micelial e adoção de um tipo de vida multicelular. por exemplo. em contraste. Independente do tipo de combinação ou ploidia. A formação desta ramificação envolve o crescimento de leveduras em agregados multicelulares. Seja como for.diplóides. Estudos apontam que isto não é estritamente uma forma de agregação já que as células nunca estiveram isoladas. Há duas tradições básicas no uso de leveduras floculentas. A floculação. e agregação envolve um ajuntamento de células isoladas para formação de um floco. A terceira razão para encontrarem-se agregados de leveduras é o fracasso dos brotos em separar-se das células mães durante a multiplicação da levedura. ao contrário da cepa ale. A quantidade de EDTA para se evitar a agregação é Fermentacaoalcoolica v2. não parece envolver combinação sexuada. cepas que fermentam no fundo da dorna para um tipo de cerveja leve e clara (lager) e as cepas que fermentam na parte superior da dorna para a produção de uma cerveja mais incorpada (ale). mas parece superficialmente similar. continuam a formar novos brotos. e é conhecido como uma formação de uma ramificação. Pela ligação de Ca++ com EDTA esta agregação pode ser inibida. A floculação foi relatada por Pasteur em 1876 e desde aquela época. muito da pesquisa em floculação tem sido orientada para o papel da floculação nas cervejarias. A ligação parece ser proteína/carboidrato e requer a presença de íons de cálcio.0. As células. O fracasso dos brotos em separar-se pode dar-se pelo baixo nível de nutrientes. menos floculentas cujos flocos são carregados para cima para formar uma grossa espuma de leveduras no topo da dorna de fermentação. mãe e filha. Isto é comum em cepas Saccharomyces cerevisiae de cervejaria. provavelmente por muitos séculos. Cepas de baixa fermentação são tradicionalmente mais floculentas e decantam para o fundo da dorna de fermentação. Ação de íons A floculação de leveduras depende da presença de íons bivalentes como. não como uma agregação por combinação.doc 123 6/7/2011 . eventualmente crescendo em agregados de mais de 100 células. a formação de ramificação é um fenômeno inteiramente separado da floculação ou agregação por combinação. a cepa da levedura ou mutação em um gene. para separar a levedura da cerveja no final da fermentação. A adesão entre células é por ligação proteína/proteína entre aglutininas a e α fixadas nas paredes celulares complementares.

O restante da parede é constituído de proteína. Os modelos mais interessantes são aqueles que estão baseados em um aumento da hidrofobicidade celular durante a fermentação ou em uma ligação tipo-lectina de interação. O aumento da Fermentacaoalcoolica v2. Hidrofobicidade celular Vários autores enfatizaram a importância da hidrofobicidade celular na agregação celular. Aspectos físico-químicos Recentemente. É chamado de taxa de floculação e é expressa em *mol de EDTA. Aspectos químicos Existe uma grande concordância que a estabilidade da suspensão de leveduras é devida em grande parte negativamente encarregado pela parede celular. observando que íons cálcio intensificavam a agregação e que a agitação da mistura de células era essencial para o início da floculação.0. Esta mudança leva a um forte aumento na hidrofobicidade da levedura. Mecanismos de floculação Vários mecanismos são propostos para explicar a floculação. como no caso das leveduras floculantes. A quitina não é utilizada e o lipídio não é encontrado na superfície externa da célula. etanol e sensibilidade a açúcares podem ser concomitantemente avaliadas. quitina e lipídios. A proteína da parede é uma fonte de grupos negativos de carboxilas. que produz uma carga líquida negativa para seus grupos de fosfatos. A taxa de floculação pode ser usada para caracterizar tanto leveduras sedimentares quanto leveduras floculantes. Análises químicas da parede celular mostram que aproximadamente 80% do peso seco são compostos por *-glucana e *-manana. Estudos mostram que a floculação de leveduras é realizada por algumas linhagens de Lactobacillus. Nenhum destes mecanismos foi provado ser uma forma equivocada. Estes trabalhos mostram que a limitação de nutrientes está induzindo a mudança nas características fisico-química da parede celular da levedura. mas sabe-se que a camada externa é composta geralmente de fosfomanana. Estudos mostraram que a determinação de características de leveduras floculantes com respeito ao cálcio. foram feitos muitos estudos no mecanismo e aspectos físico-químicos do fenômeno da floculação.específica para diferentes cepas de leveduras. A estrutura da parede é complexa. e grupos positivos de amino.doc 124 6/7/2011 . pH.

hidrofobicidade e ligação tipo-lectina deveriam ser consideradas como dois aspectos do mesmo mecanismo. As proteínas da parede celular do grupo FLO1 são fortemente hidrofóbicas.. algumas proteínas da parede celular das leveduras podem ligar-se os resíduos de açúcares das glicoproteínas desta mesma parede celular e em outras células de leveduras. a dependência do pH na floculação está muito distante no grupo FLO1. Muitas cepas de laboratório pertencem ao grupo FLO1. maltose e glucose. este é também o caso para outras proteínas glicosiladas da parede celular que podem agir como açúcar ligante na ligação tipo-lectina. Além disso. Cofloculação levedura-bactéria Um caso especial da ligação tipo-lectina de floculação é a cofloculação levedurabactéria.0. Reconciliação dos dois mecanismos Frequentemente a teoria da hidrofobicidade e a teoria da ligação tipo-lectina são tratadas como dois mecanismos independentes. Bactérias láticas. Portanto. Por um mecanismo similar. a ligação de lectina é primariamente inibida por manose e a ligação é sem dúvida independente do pH do meio. Isto não é necessariamente o caso.hidrofobicidade coincide com a floculação. Cepas de cervejarias. Estudos sustentam que há pelo menos duas famílias de lectinas de leveduras: grupo FLO1 (inclusive as cepas que carregam o gene FLO1. A proteína tipo-lectina seria sintetizada durante a fermentação e o cálcio seria necessário para a ativação da proteína. mas também por sacarose.doc 125 6/7/2011 . entretanto. mais do que como dois mecanismos. Além de que o aumento na hidrofobicidade é causado pela síntese de uma glicoproteína muito hidrofóbica que pode ser a maior causa da floculação de leveduras. Neste grupo. Esta ligação induziria a floculação. Esta ligação resultaria na formação de flocos e por seqüência a floculação de proteínas. frequentemente pertencem ao grupo NewFlo em que a floculação não é apenas inibida pela manose. As sínteses destas proteínas resultarão em um grande aumento na hidrofobicidade da célula de levedura. mas também outros tipos de bactérias (Escherichia coli. mas também aquelas com os genes FLO5 e FLO8 e presumariamente aquelas com o gene floculante) e o grupo NewFlo. O cálcio que ativou a proteína é hábil em unir as cadeias de manose das glicoproteínas das leveduras. Ligação tipo-lectina Lectinas são proteínas que são hábeis em ligar resíduos de açúcar. Fermentacaoalcoolica v2.

Também neste caso. como é o caso na produção de cervejas ácidas ou cervejas claras naturalmente acidificadas. identificando uma espécie de Sporolactobacillus como responsável pela floculação do fermento. Fermentacaoalcoolica v2. No entanto apesar da floculação do fermento ser citada como um dos possíveis efeitos da contaminação. de qualquer maneira. porém sabe-se que um nível elevado de contaminação pode causar: (1) redução da produtividade e no rendimento fermentativo pela competição pelo substrato. como conseqüência da diminuição da superfície útil das células de levedura e redução de aproximadamente 15% no rendimento. A sensibilidade à contaminação da levedura pode não ser deduzida do comportamento da floculação da própria levedura: floculação de leveduras e cofloculação levedura-bactéria são determinadas por outra proteína da parede celular. Na maioria dos casos.0. Ação de bactérias Vários estudos sobre os efeitos da contaminação microbiana na fermentação alcoólica têm sido relatados na literatura. uma caracterização cuidadosa da cepa da levedura pode ajudar a prevenir problemas. O principal efeito dessa infecção. a ligação leva a contaminações indesejáveis. de acordo com estes autores. Estudos mostraram a relação entre a contaminação bacteriana presente nas dornas com o problema da floculação. o transtorno é grande. A floculação da levedura nas dornas de fermentação alcoólica causada por bactérias é conhecida pela maioria dos técnicos de usina. ligação tipo-lectina e inibição de açúcar são comparáveis com o mecanismo da floculação lectina-levedura. Esta interação pode ser positiva.Hafinia protea) podem aderir-se a levedura por indução de cálcio. este aspecto não foi investigado com maior profundidade. (2) redução da vitalidade das células de leveduras pela “intoxicação” por metabólitos do agente contaminante. O efeito do contaminante sobre a levedura é ainda pouco conhecido. Em alguns casos. a ligação levedura-bactéria depende fortemente da cepa. Comparável com a floculação de leveduras. Foi mostrado que algumas cepas de leveduras têm uma afinidade melhor com o ácido lático produzido por bactérias do que outras. A floculação da suspensão de leveduras pode ter pelo menos duas causas: (1) presença de linhagem floculante de levedura. (2) presença de bactéria que causa a floculação de leveduras. e (3) floculação das leveduras pela ação das células bacterianas.doc 126 6/7/2011 . dificultando principalmente a separação das leveduras nas centrífugas e afetando a produtividade na fermentação. consistiria no aumento progressivo de tempo de fermentação.

061 e na contagem microscópica uma razão de 5:1 célula de bactéria/célula de levedura. e carboidratos da parede celular da levedura. a floculação máxima foi observada com 1380mg de leveduras. para que houvesse floculação. Este processo deve envolver componentes protéicos da superfície celular das bactérias.0. Ao contrário. embora o sistema de floculação de Saccharomyces cerevisiae causado por bactérias do gênero Lactobacillus. Essa prática provocaria o acúmulo dos agentes da floculação limitando o número de reciclos e diminuindo a eficiência da fermentação. por sua vez. Desta forma.doc 127 6/7/2011 . Assim para 84 mg/50ml de suspensão bacteriana. ou seja. Este efeito mostrouse reversível. desfazendo os flocos. Outros estudos indicaram uma linhagem de Lactobacillus fermentum como responsável pela floculação. Estudos observaram que a adição de ácido provocou a separação das células. Considerações importantes Sugere-se que a floculação de Saccharomyces cerevisiae causada por bactérias do gênero Lactobacillus envolva um mecanismo intercelular em nível da parede celular destes microrganismos. também atuam diretamente neste sistema.0 e 12. uma vez que não são capazes de sobreviver por longos períodos nas condições de fermentação do álcool. mais especificamente. Os íons de Ca++.0 se comparada com a floculação provocada por leveduras floculentas. fermentum apresentouse como a bactéria predominante entre os Lactobacillus. tenha sido classificado de acordo com o modelo simbiótico. Verificou-se que o problema da floculação de leveduras por contaminantes bacterianos tem sido intensificado pelo reciclo de células que consiste na reutilização do chamado “leite de leveduras”. o número de células de bactérias deveria atingir um valor crítico com relação ao número de células de leveduras. uma vez que a floculação era restabelecida quando o pH era ajustado a valores superiores a 2. as bactérias pertencentes ao gênero Lactobacillus sobreviveriam sob tais condições e constituiriam aproximadamente 60% das espécies de bactérias encontradas na dorna de fermentação. fermentum ocorre numa faixa mais ampla de pH entre 2. A desfloculação com a acidificação da suspensão de levedura (“leite”) tem sido comumente observada nas destilarias de álcool. A floculação causada por L. bactérias sabidamente produtoras de goma não estariam implicadas na floculação.5. este pode Fermentacaoalcoolica v2. os grupos funcionais feno e indol. No entanto. uma relação em massa seca de 0. sendo que a espécie L.Estudos de contaminação microbiana na indústria do álcool no estado de São Paulo indicaram que provavelmente as espécies de Leuconostoc.

leites fermentados e outros.0. Os fungos também são usados na produção de ácidos por via fermentativa. o ácido lático foi um dos primeiros problemas microbiológicos. ÁCIDO LÁTICO Produção de ácidos por microrganismos Os fungos e as bactérias podem ser usados pelo homem para obtenção de produtos com grande valor econômico. glucônico. As bactérias envolvidas nos processos para obtenção de ácidos são principalmente as do gênero Acetobacter e Lactobacillus. vinagres.O ácido lático é o nome comum do ácido 2-OH propiônico (CH3-CHOH-COOH). fumárico. para a produção de ácido acético. gálico. . como cultura pura. foi Lister. conhecido como um componente dos leites ácidos. de maior interesse econômico algumas das bactérias produtoras de ácido lático.ser enquadrado no modelo das lectinas. As bactérias utilizadas industrialmente são as anaeróbias e microaerófilas. no entanto. isolou-o e identificou-o como sendo o principal constituinte do leite ácido. em 1847. As bactérias podem formar inúmeros ácidos diferentes. propiônico e outros. glucônico. identificou-o como um produto de fermentação. . ácido acético e de ácido propiônico.A produção industrial do ácido lático passou a ter maior importância após 1881. devido ao envolvimento de um componente protéico da parede celular do microrganismo floculante. . kógico. em 1780. o qual possui características de uma lectina e apresenta afinidade por sítios receptores constituídos por carboidratos. lático. giberélico. lático. descobriu sua estrutura.doc 128 6/7/2011 . Histórico . São.Nesta época. ou para a produção de alimentos como queijos. Fermentacaoalcoolica v2. em 1877. . ácidos graxos e outros.Para Pasteur.O farmacêutico Schelle. sendo que. e a cepa isolada foi de Streptococcus lactis. a presença de íons se mostrou importante para a manutenção deste processo. chucrutes. picles. Delbruek verificou que temperaturas relativamente altas eram favoráveis à produção do ácido.O primeiro a isolar os microrganismos. Os ácidos são provenientes da degradação anaeróbica de glicídeos por oxidação incompleta. . . itacônico. Os principais ácidos são: cítrico.O pesquisador Blandeau.

é produzido. principalmente.Atualmente. mas parece não ser importante para as células em crescimento ativo. Tem sido demonstrado que essa enzima prolonga a viabilidade das células em fase estacionária incubadas sob condições aeróbias. em meio contendo hemácias). portanto não pode mediar a decomposição de H2O2 de acordo com a seguinte reação: 2 H2O2---2 H2O + O2 A ausência de atividade de catalase. . Uma conseqüência da incapacidade de sintetizar hemeproteínas é que as bactérias láticas são catalase-negativas e. Tais espécies sintetizam uma proteína denominada pseudocatalase. um reflexo de sua incapacidade de sintetizar citocromos e enzimas contendo o grupo heme (a porfirina que é o grupo prostético de algumas enzimas e proteínas). obtido por fermentação. Fermentacaoalcoolica v2. Considerações Gerais Bactérias láticas As bactérias láticas são organismos sem mobilidade. demonstrada pela ausência de formação de O2 quando as células são misturadas com uma gota de H2O2 diluído. a partir de glicose de milho. As bactérias láticas são todas anaeróbias aerotolerante que crescem prontamente na superfície de um meio sólido exposto ao ar. é um dos mais úteis testes para o reconhecimento destes organismos. normalmente é sob forma racêmica. já que eles são virtualmente as únicas bactérias despojadas de catalase que podem crescer na presença de ar.doc 129 6/7/2011 . em forma de bastonetes ou cocos.O ácido lático. Certas bactérias láticas adquirem atividade de catalase quando desenvolvidas na presença de uma fonte de heme (ex. Pseudocatalase é uma enzima contendo manganês que apresenta fraca atividade de catalase mesmo na ausência de heme. no entanto Lactobacillus que produzem formas opticamente ativa. A denominação bactérias láticas vem do fato que a energia na forma de ATP é obtida através da fermentação de carboidratos. Entretanto. melaços e soro de queijos. não esporulados. existindo. elas são incapazes de sintetizar ATP por meio respiratório. que pode combinar-se com heme suprida exogeneamente para produzir uma enzima com as propriedades da catalase.. produzindo ácido lático como principal produto final.0. G+..

Como resultado desses requerimentos. Características da colônia Mesmo crescendo em meios muito ricos. Embora as bactérias láticas na forma de cocos possam iniciar o crescimento em meios com pH neutros ou alcalinos. uma conseqüência do seu metabolismo exclusivamente fermentativo.doc 130 6/7/2011 . Raramente são pigmentadas. um considerável número de aminoácidos e bases purínicas e pirimidínicas. as bactérias láticas são normalmente cultivadas em meios contendo peptona. extrato de levedura ou outros materiais vegetais ou animais digeridos. O crescimento de todas as bactérias láticas continua através da fermentação. Padrões de fermentação de carboidratos em bactérias láticas As bactérias láticas podem ser divididas em dois subgrupos bioquímicos de acordo com os produtos formados a partir de glicose. até que o pH tenha reduzido-se a um valor menor ou igual a 5. já que as capacita a eliminar a competição da maioria das outras bactérias em ambientes ricos em nutrientes. Fermentacaoalcoolica v2. as colônias de bactérias láticas sempre permanecem relativamente pequenas. A capacidade das bactérias de produzir e tolerar uma concentração relativamente alta de ácido lático é de grande valor seletivo. Estes devem ser suplementados com um carboidrato fermentável para prover uma fonte de energia.Requerimentos nutricionais Estes organismos possuem requerimentos complexos de fatores de crescimento: requer vitaminas do complexo B.0. Tolerância à acidez: Uma característica fisiológica diferenciadora das bactérias láticas é sua alta tolerância à acidez. Bactérias homofermentativas São muito importantes e tem grande interesse na fabricação do ácido lático. a maioria das formas bastonetes não podem crescer em meios com um pH inicial maior que 6. como resultado da ausência de citocromos. O tamanho reduzido das colônias é atribuído principalmente ao baixo rendimento de crescimento.

Fermentacaoalcoolica v2. devendo-se trabalhar com muito critério na fase de partida. sob a ação da enzima lactato desidrogenase dá origem ao ácido lático. o ácido pirúvico. Bactérias heterofermentativas As fermentações da glicose por essas bactérias resultam em vários produtos. . L. O intermediário importante para a formação do ácido lático é o ácido pirúvico.50°C.doc 131 6/7/2011 . Os compostos intermediários importantes na via heterofermentativa são o ácido piruvico e o aldeído acético. No final da via glicolíticas. TIPOS DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA Fermentação descontínua ou batelada Condução da fermentação Providencias preliminar para partida O sucesso da fermentação depende basicamente do número e do estado fisiológico da população inicial de leveduras. casei e Streptococcus lactis: temperatura ao redor de 30°c.0. L. Principais bactérias láticas Para a produção do ácido lático.L. ou mais especificamente a via de Embden-Meyerhof ou via glicolíticas.L. A espécie escolhida depende do carboidrato disponível e da temperatura a ser empregada: . . Enquanto as bactérias homofermentativas degradam a glicose através da via glicolíticas. leishmanii: temperatura acima de 30°C.Lactobacillus delbrueckii.Os primeiros estágios da via metabólica da fermentação lática são os mesmos da fermentação alcoólica. são as bactérias homoláticas do gênero Lactobacillus e Streptococcus. pentosis. O rendimento líquido em ATP: 2 moles / mol de glicose pela via homofermentativa e apenas 1 mol / mol de glicose pela via heterofermentativa. as heterofermentativas degradam a glicose através da via oxidativa das pentoses fosfato. bulgaricus: temperatura na faixa de 45 .

A data do início da propagação do fermento deve ser consensualmente decidida em função da data do início da moagem. devendo-se verificar os seguintes pontos: . bem como da expectativa de paradas em período próximo do início da propagação. tubulação de vapor de baixa pressão. Em paralelo deve-se atualizar o estoque de produtos químicos – nutrientes. . verificados o funcionamento e a aferição dos seus equipamentos. sistema de geração e aspersão de ar comprimido.O trabalho deve iniciar pela limpeza e teste geral da instalação de fermentação. É particularmente importante contabilizar a moagem com o consumo inicial de açúcar na fermentação.fermento selecionado.doc 132 6/7/2011 . Partida e sistemas de partida Existem atualmente três opções para a partida da fermentação: .. compressores e tubulação de ar.0. .centrífugas e sistemas de proteção – filtros e hidrociclones – testados e em condições de uso. serpentinas.válvulas e conexões da tubulação sem vazamentos e pontos estagnantes. particularmente agitador da cuba.verificar estoque de boquilhas de diversos tamanhos – 0. É particularmente importante verificar a limpeza do microscópio. além de estar atualizada toda a vidraria e reagentes. que devem ser minimizadas. sistema de recalque de água de resfriamento e diluição. padronizado o método de análise e atualizado os boletins e outros impressos necessários. . . de mosto.6 mm. . O pessoal da operação e de controle deve estar suficientemente treinado e motivado.linhas de fornecimento verificadas: tubulações. antibióticos e ácido sulfúrico etc. preparados os corantes. trocadores de calor. o número e o estado de laminas e lamínulas.fermento prensado. etc.tubulação e caixas de caldo. geração de vapor e energia elétrica. partindo de tubo de cultura pura.dornas e pés-de-cuba limpa e com acessórios verificados. .85 até 1. .fermento selecionado. bombas e peneiras de caldo. O laboratório de controle químico deve estar em condições de uso. pé-de-cuba e vinho limpos com água quente.instrumentação e controladores em condições de uso. preparadas as soluções padrões e reagentes necessários para toda a safra. Fermentacaoalcoolica v2. tanques e tubulações de ácido sulfúrico. do estoque de méis e do avanço da manutenção da instalação como um todo – moendas. tanques e bombas de méis. . partindo de leite de leveduras e.

. que afetam a performance da levedura. . como por exemplo. entre elas: .baixos requisitos nutricionais e alta afinidade com o meio em termos da habilidade de fermentar os açúcares presentes no mosto. Infelizmente não existe um único fermento que atenda satisfatoriamente a todos os requisitos acima.pH e acidez ótimos compatíveis com o processo normal de controle – pH da fermentação variável de 2. Kamoran WP. produtividades e graus de maturação da cana. É bastante provável que haja variações. Fermentacaoalcoolica v2.baixa tendência à floculação e/ou decantação.Cada uma das opções tem suas vantagens e desvantagens. em termos de número de dornas. .compatibilidade do fermento com a instalação.alta estabilidade no comportamento fermentativo. A principal desvantagem deste método é que o microrganismo tem um período de viabilidade pequeno devido à perda de água. diferentes variedades. Este método baseia-se no semeamento periódico da superfície de meios de cultura. seguindo-se incubação à temperatura ambiente (ou a 30 – 32º C).alta flexibilidade para suportar as variações normais na composição e vazão das matérias-primas e insumos. o tubo de cultura contém o microrganismo com as habilidades requeridas. ao acúmulo de produtos metabólicos e outros fatores. . Corstan. de fato.5. HJ Gold e KG.0.doc 133 6/7/2011 . solidificados com Agar. Partida com tubo de cultura pura A primeira desvantagem é a dúvida se.0 a 4. considerando-se ainda que cada instalação tem particularidades. Isso pode levar facilmente à contaminação externa. com quantidades muito pequenas de leveduras. . . os quais levam à necessidade de repliques (transferência) freqüentes.temperatura ótima para reprodução e fermentação compatíveis com o sistema de resfriamento e de recuperação do álcool evaporado. ao risco de seleção e principalmente à variação de crescimento. É importante ressaltar que já existe uma tecnologia perfeitamente dominada – na indústria de produção de fermento para panificação e outras indústrias que se utilizam do microrganismo – para garantir a estabilidade genética e fenotípicas de microrganismos selecionados. . da capacidade de resfriamento e capacidade de centrífugas.controle eficaz da contaminação bacteriana com o uso de antibióticos de alto espectro de atuação – Kamoran. no ambiente normal de trabalho. devido ao método de manutenção utilizado: repliques (subculturas).

O método ideal de manutenção seria aquele que paralisasse de forma não seletiva toda atividade metabólica de uma população crescida em condições que preservem as habilidades específicas. A baixa concentração inicial leva também a um tempo excessivamente longo de propagação. ou menos de 3x107 leveduras/ml) que será alimentado com um mosto não estéril. pois o volume de mosto adicionado será muitas vezes maior que o volume de vinho inicial. Em condições aeróbias. inicialmente presentes no mosto (ou vidraria) não estéril.doc 134 6/7/2011 .5% ART). Chegando-se finalmente a fase industrial. de acordo com o exposto. A segunda desvantagem é a necessidade de assepsia completa nas fases iniciais de propagação. que deve ser suficientemente baixa (< 0. que costumeiramente tem leveduras já adaptadas (da ordem de 105 lev. aumentando a probabilidade de infecção com bactérias e outras leveduras. É fato conhecido que mesmo em meio aeróbio. tratando-se. porém.5% ART) para garantir a conversão da maior parte dos açúcares em leveduras com alta atividade enzimática. tornando desfavorável qualquer competição com outras leveduras. se a concentração de açúcares for acima de um valor máximo. pois a concentração inicial de leveduras é muito baixa. Assim. aumentando o número de transferências de volumes e em conseqüência. levando assim a uma competição desfavorável. valor este dependente da cepa e da velocidade específica de reprodução (em geral menor que 0. pois a concentração celular inicial é baixa. seria altamente recomendável que se fizesse em meio fracamente aeróbio e com controle de concentração de açúcares no meio em fermentação. a velocidade específica de consumo de açúcares é mais baixa que em condições anaeróbias. haverá produção de álcool em detrimento da produção de leveduras. entretanto. Ainda com relação a propagação na fase industrial. a propagação realizada a partir de tubo de cultura pura só tem sentido em laboratórios de microbiologia e fermentação bem aparelhados./vol. principalmente nas cubas. O controle da contaminação bacteriana deverá ser mantido desde o início da propagação em laboratório sempre em dosagem de no mínimo 5. Há a necessidade também de complementação do mosto com quantidades compatíveis de nutrientes e da capacidade adequada de resfriamento./ml). provavelmente teremos um volume de vinho em fermentação ainda com uma pequena concentração de leveduras (em geral em torno de 1 – 2% vol. de uma técnica cara e que exige precauções especiais de manipulação e de segurança.0 ppm em relação ao volume de mosto a ser adicionado.0. Isso poderia ser conseguido por congelamento profundo em nitrogênio líquido. Fermentacaoalcoolica v2. o que levará a um tempo longo de propagação.

se a levedura contém 7% de nitrogênio em relação à matéria seca e. Com respeito a esse controle. Fermentacaoalcoolica v2. as leveduras passarão por várias gerações no meio de cultura (mosto-vinho) e assim resultarão bem adaptadas a este meio.). recomendando-se mais de 108 leveduras/ml. A aplicação de antibióticos com alto espectro é fundamental para o controle efetivo da população de bactérias. O mosto deve ser complementado com todos os elementos que fazem parte da composição da levedura. que exista muito pouco açúcar em solução para evitar o efeito inibidor da reprodução. Desde o início da propagação. o uso de mostos diluídos (digamos caldo ou méis diluídos a 8º Brix). se for garantida a presença de material genético adequado e ainda se o produto final da propagação resultar em alta concentração celular (>108 lev/ml).doc 135 6/7/2011 . podendo chegar mais próximo de 3. ou mais de 6% (vol.0 ppm. há a necessidade de aeração intensa para que exista oxigênio dissolvido no meio e. se foram produzidas. seca x 65 kg ART/m3 = 1.35 kg de levedura seca por quilograma de ART convertido e. A única vantagem da partida com o tubo de cultura é que haverá um grande aumento na massa celular e. recomendando-se entre 25 a 28ºC.5. Assim. ainda se for controlada a adição de açúcar a partir de um mosto a 8º Brix (65 g ART/lt).5 a 4. facilita o trabalho por não tamponar excessivamente o meio em fermentação. O pH deve ser controlado na faixa de 3. pois temperaturas maiores tenderiam a desviar o metabolismo para produção de álcool. além disso.0. portanto. O controle da temperatura nesta fase é essencial. para que se mantenha sempre um teor baixo de ART. minimizando assim. Para tanto. isto pode ser conseguido facilitando as atividades construtivas (anabolismo) da levedura.mesmo assim. a competição pelos açúcares.5%N. A dosagem deve ser em torno de 5. a concentração de leveduras deve ser suficientemente alta para evitar competição com as leveduras e bactérias do meio.07 kg N/kg mt. o mosto deverá conter: 0.35kg mat. em aerobiose 0.59 kg N/m3 mosto = 1. sempre em relação ao volume de mosto a ser utilizado durante a propagação do fermento. Seca/kg ART x 0. O objetivo da propagação é a produção da maior quantidade possível de fermento com a maior atividade enzimática.2. Partida com leite de fermento selecionado Se for admitida a hipótese de que o leite de leveduras recebido pela destilaria contém uma grande proporção de leveduras com habilidades específicas./vol. citado acima. é possível então propaga-lo de forma otimizada.

0. devendo-se complementar./m3 mosto Se o mosto a 8ºBrix contiver 100 ppm P2O5. cortes. se for determinado que o mosto a 8ºBrix contém 0.12% de nitrogênio assimilável. exigem um alto nível de controle microbiológico medindo-se a viabilidade celular.32 kg H2PO4. pH=2.35g de H2SO4 por litro de mosto supre as necessidades de enxofre. devendo-se tomar medidas urgentes caso sejam detectados problemas. uma vez que após a propagação serão feitos cortes com menor adição de nutrientes e os mostos mais concentrados conterão maior proporção de nitrogênio e fósforo.. observando-se a resposta do fermento em tempos do tempo de fermentação. perfeitamente possível utilizar somente DAP na proporção de 1. etc. verificar se os requisitos de enxofre estão atendidos.3 kg SO4=/m3 mosto A adição de 0. viabilidade e produção de leveduras. através da aplicação de antibiótico com alto espectro.35kg mat. Deve ser ressaltado que a complementação é necessária principalmente na fase inicial da propagação. Toda a fase de propagação..seca/kg ART x 65 kg ART/m3 – 0. recomendando-se inicialmente pH=3 para um teor de fermento até 5%. neste caso.1 kg S/m3 mosto = 0. portanto. já se deve usar o tratamento ácido do fermento.5 a 2. ou: 0. pois os nutrientes adicionados e não convertidos serão conservados em solução.8 de 5 – 7%.35 kg mat. É.5 g de sulfato de amônia ou DAP. isto representa 0. a acidez produzida. o teor de fermento.Por exemplo.seca x 0.6mM/g célula seca. portanto. sempre em dosagem em 5.5.5 g de MAP (ou DAP) por litro de mosto. Com relação ao fósforo.6 x 97g H2PO4.seca x 65 kg ART/m3 mosto = 1. etc. Após o tratamento ácido deverá ser alimentado mosto na proporção de 2 – 5 % do volume Fermentacaoalcoolica v2. o teor alcoólico.doc 136 6/7/2011 .seca/Kg ART x 0. ou cerca de 1.0004kg S/kg mat.2 para teores superiores a 7%. não havendo contra-indicação de se colocar mais que o suficiente para controle do pH na faixa de 3./kg mat. recomenda-se usa-lo na complementação do mosto na forma de H2PO4. deverá ser adicionado ao mosto 0. Após a fase de cortes.0 ppm do mosto a ser fermentado. O teor de açúcar do mosto deve ser aumentado gradativamente (10 – 20% por ciclo). Em relação à infecção. a melhor estratégia é a prevenção./m3. pois seriam necessários: 0. a contaminação bacteriana. devendo-se.5 a 4. pH=2.14 kg H2PO4.5g/lt para atender os requisitos de nitrogênio e fósforo.ou HPO4= para que se atenda ao requisito de 0. ou seja. alimentação. com aproximadamente 1.3g de nitrogênio por litro.

instalação de fermentação: 14 dornas de 300 m3 cada. porém. Fermentacaoalcoolica v2. Um outro ponto importante é que o fermento prensado destina-se basicamente para à panificação. No período inicial (mínimo de 2 semanas). Caso haja redução de viabilidade.5 a 2.0h com agitação e aeração. ou seja.de cuba (teor de açúcares na cuba inferior a 0. tem características totalmente diversas da produção industrial de álcool.massa a ser adquirida (partida em 4 semanas): 420/1. . o aumento de produção deve seguir o aumento da massa de leveduras ativas. Assim. quando o aumento adicional do teor alcoólico (através do aumento do teor de açúcares do mosto). .doc 137 6/7/2011 .2 tons .massa a ser adquirida (partida em 2 semanas): 420/100=4.0. a produção de álcool (e o teor alcoólico do vinho) deverá ser proporcional ao teor de fermento vivo nas dornas. alguns esclarecimentos são importantes: o primeiro é o fato de que este fermento é produzido em condições particulares. a partida com este fermento é talvez a melhor opção para médias e grandes instalações. devendo-se deixar por mais 1. embora seja um processo fermentativo. deve ficar claro que. baixar o teor de açúcares do mosto em 20 – 30%.000=420 kg Recomenda-se. seu processo de fabricação é rigorosamente controlado para a produção de leveduras com habilidade de fazer crescer rapidamente a massa de pão que. pouco adaptada ao meio ambiente da fermentação. resultando em uma população muito ativa.1 = 420 tons . A quantidade inicial de fermento a ser adquirida depende de uma série de fatores. haverá uma mudança brusca do ponto de vista do fermento. até que seja atingida a concentração desejada (6 a 12% vol/vol). tenderá a limitar a reprodução.000 em relação à massa de fermento após partida. ou seja. principalmente da velocidade desejada com que se pretende atingir a produção máxima. Uma sugestão para aquisição de fermento prensado é exemplificada abaixo: . com abundante aeração e com muita complementação nitrogenada. Apesar destas restrições. Partida com fermento prensado Com relação ao uso do fermento prensado na partida da fermentação. portanto. um inoculo de 1:100 até 1:1.5%) e junto com o mosto todos os nutrientes.teor de fermento desejado: 10%. pois minimiza o tempo de partida.massa de fermento “prensado” em processo (após partida): 14 x 300 x 0. ao contrário das outras opções onde a adaptação é gradual.

Os principais instrumentos do controle operacional são os boletins e gráficos de controle. Para exemplificar o que significa o controle da população de leveduras. Assim. Controle operacional da fermentação contínua Introdução e estratégias O objetivo básico do controle é fornecer os parâmetros necessários para a tomada de decisões que levem concomitantemente à maximização do rendimento e da produtividade do processo com custos mínimos (insumos. anteriormente foi citado que a temperatura de fermentação afeta tanto a velocidade de fermentação e de crescimento das leveduras como também afeta a velocidade de crescimento das bactérias contaminantes.reduzir o teor de açúcares no mosto: porque reduz a carga térmica horária. Uma fase posterior do controle envolve o tratamento estatístico dos dados.0. em uma determinada instalação de fermentação que esteja funcionando no máximo de sua capacidade de resfriamento.doc 138 6/7/2011 . Dentre as diversas estratégias que podem ser seguidas para cumprir o objetivo do controle. Ultrapassado este valor crítico. uma delas parece ser a mais eficiente: trata-se de dirigir a atenção ao agente da fermentação que é a população de leveduras. de onde são obtidos os parâmetros. o controle deve identificar qual o limite de temperatura em que o sistema pode operar de forma estável para que o rendimento não cais. Os boletins devem não apenas colecionar informações sobre as condições reais de operação. as decisões possíveis são: . mas também permitir a identificação da sua tendência de evolução (degeneração ou recuperação). o que se pode conseguir com a realização de gráficos de controle. . mão-de-obra. facilitando a tomada de decisões. energia e perdas). nutrientes.Todas as recomendações em relação ao pH.reduzir a velocidade de alimentação das dornas: pelo mesmo motivo. que deve ser maximizada. para identificar a existência de correlações entre os parâmetros. não só quantitativamente como também qualitativamente. aerações constantes e dosagem de antibiótico são igualmente válidas para os itens anteriores e importantes para o fermento prensado. Fermentacaoalcoolica v2. foi também dito que um aumento da temperatura eleva a taxa de morte de leveduras e aumenta as perdas por evaporação e arraste de álcool nas dornas.

o parâmetro mais importante é o índice de viabilidade.quando aumentar o índice de acidez produzida. Da experiência prática temos verificado que: . Seguindo esta estratégia.doc 139 6/7/2011 . pois altos teores elevam à inibição e morte de leveduras. Fermentacaoalcoolica v2. Interpretação dos parâmetros do laboratório Uma vez atingida a capacidade adequada de produção de álcool.aumentar a diluição do pé-de-cuba: rebaixar o nível inicial de temperatura pelo uso de mais água fria e diminuir a concentração inicial de leveduras. se associados a temperatura elevada. A queda neste índice (teor de levedura viva) está associada à nutrição (carência de nitrogênio). há necessidade de maximizar o rendimento fermentativo.0.aumentar a dosagem de antibiótico: tornar mais seletivas as condições de tratamento. O índice de produção de leveduras também se correlaciona com o tempo de fermentação e o rendimento. que não é possível estabelecer qualquer controle operacional se não houver condições para obter estimativas razoáveis dos parâmetros do processo. . à temperatura elevada (esta reduz a velocidade de reprodução e aumenta a taxa de morte) e principalmente ao teor alcoólico. ou seja. Normalmente este aumento está associado à infecção. Há evidencia de que quando o teor de levedura viva diminui. reduzindo a carga térmica horária. ou seja. portanto. aumentando a taxa de morte de bactérias e selecionando a população de leveduras.. estabelecido o nível desejado de produtividade. porém. Torna-se claro. deve-se investir prioritariamente em recursos laboratoriais (equipamento e principalmente mãode-obra) para a implantação do controle. o rendimento cai. dentro de restrições impostas pela instalação de fermentação de principalmente pela necessidade de integração com a fabricação de açúcar. . principalmente. aumenta o tempo de fermentação. o mais útil é o teor de leveduras vivas (que se encontra multiplicando a viabilidade pelo teor de levedura). Assim. .aumentar a aeração nas cubas e dornas: regenerar os danos causados pelo tratamento ácido intenso. se os métodos de medida não são confiáveis. as decisões que se seguem às diversas perturbações que ocorrem no processo em geral devem se dirigir a manutenção da maior e melhor população de leveduras que for possível.das análises microscópicas.

turbinagem de dornas vivas. . Fermentacaoalcoolica v2. substituição da fonte nitrogenada por nitrogênio orgânico.perdas de fermento superiores a 10% em geral causam redução de produtividade e rendimento embora sejam menos importantes que a queda de viabilidade.. Muita atenção deve ser prestada ao ponto de aplicação do produto antiespumante. deve-se procurar sérias falhas de operação. Assim. em 20 – 30%. do tempo de limpeza. viabilidade muito baixa.em fermentações contínuas é bastante raro índices de conversão de açúcares inferiores a 95%. do tempo de pós-fermentação (tempo de espera para início da turbinagem).2 ou até 1. . considerando o tempo do ciclo.aumentos no consumo de antiespumantes em geral. devidos à própria cana ou ao pré-tratamento do caldo. redução das perdas de fermento através de homogeneização das dornas com aeração antes da turbinagem e controle eficiente da centrifugação. . A presença de sólidos insolúveis como argila e bagacilho tendem a estabilizar a espuma. Em geral a redução na carga térmica está associada à formação de incrustação (orgânica) do lado da água. caso seja constatado sobra de açúcar inferior a 5%. redução do Brix do mosto.as análises microscópicas.0. etc. pH de tratamento ácido muito variável. que é a soma do tempo de fermentação (aí incluído o tempo de alimentação). .8.doc 140 6/7/2011 . regeneração aeróbia do fermento. do tempo de turbinagem (descarga). aumentando o consumo de antiespumantes. A flotação de leveduras na espuma em geral está associada à floculação.sendo que quedas substanciais podem estar associadas também a produtos inibidores no mosto ou nos nutrientes. por exemplo. do tempo de tratamento ácido (que pode ser reduzido a um mínimo. realizadas. deve ser estimada a carga térmica que está sendo efetivamente retirada. refletem variações no teor de polissacarídeos e/ou proteínas no mosto.sempre que possível. implica obrigatoriamente em aumento da temperatura de fermentação e em redução do rendimento. podem detectar alguma tendência à floculação e neste caso deve-se agir rapidamente para o seu controle com algumas medidas: redução do pH do tratamento ácido para 2 – 2. o que se pode fazer conhecendo-se a vazão de água e as temperaturas de entrada e saída. . Critérios de dimensionamento da fermentação alcoólica Dornas O volume total de dornas deve ser suficiente para atender à máxima produção de álcool projetada. A redução na carga térmica para uma mesma produção.

95 m álcool / dia Para uma fermentação não otimizada.vinho.4m 3 3 24 m álcool / dia x0. Se considerarmos um teor alcoólico mínimo de 8ºGL (onde a produção é máxima) terá para a produção de 1m3 de álcool (a 100%.ciclo 100 x x x 24 ocupação.de. deve estar previsto também espaço para o gás preso (“hold up”).0 horas.31 = 7.286 dia 10.turbinado = o 1 1 = = 12.dorna GLV FL − FV tempo ciclo= tempo fermentação + tempo pós-fermentação + tempo turbinagem + tempo espera e. que necessitaria de um volume de dornas de: volume.225VT FL − FVT 50 − 10.dornas = dornas 15.dornas = Onde: o 100 FL − FVT tempo.05m 3 3 2.dornas = dornas 15.286 x0.5 Portanto. o volume necessário de dornas será: volume.de.225 x12.5 horas.5m 3 GLVT 0.08 Supondo que na produção máxima teremos um teor de fermento no vinho de 10%.5 = 15. o volume de vinho (antes das turbinas) necessário será: vinho = FL − FVT 50 − 1 49 X .vinho.95 14 No caso geral: volume.doc 141 6/7/2011 . um teor de fermento de 1% no vinho turbinado e 50% de fermento no leite. cada dorna funcionará: vezes 24 = 2. 20ºC). 20ºC): volume. No volume das dornas.31 = 9.com o uso de fermentos adicionais ou do tratamento ácido contínuo) e do tempo d descarga do pé-de-cuba. espaço para controle da espuma e considerado o espaço ocupado por eventuais acessórios como serpentinas de resfriamento.0 40 Portanto.0.de.de. será necessário um volume de vinho de: vinho = 1.31m 3 Se o tempo de um ciclo for de 10. para produzir 1m3 de álcool (100%. o tempo do ciclo pode chegar a 14. Pode-se considerar 95% de aproveitamento do volume da dorna como um bom valor. Fermentacaoalcoolica v2.turbinado = VT = VT = 1.

no caso acima temos: Fermentacaoalcoolica v2. maior será a temperatura máxima a ser atingida na fermentação para um dado trocador e uma dada vazão de água fria ou maior terá de ser a vazão de água para manter a temperatura máxima constante. etc. Deste total aproximadamente 8% é perdido como evaporação de água e álcool. controle de pressão. se esta instalação pretendesse produzir 350 m3 álcool anidro/dia (máximo) teríamos: volume. o restante elevará a temperatura do mosto e pé-de-cuba até o valor de controle e então o trocador de calor manterá a temperatura neste valor. deveriam ser instaladas 7 dornas de volume em torno de 400 m3.tempo espera= tempo tratamento + tempo de descarga pé-cuba e. descarga.05 = 2. que pode ser aproximadamente a 150 Kcal/kg ART. controle de adição de antiespumantes. limpeza. Resfriamento de dornas Os equipamentos de troca de calor têm que ser acoplados às dornas tendo em vista que o processo é altamente exotérmico.total. No caso acima.de. O balanço entálpico em torno de uma dorna mostra que a entalpia a ser retirada é a diferença entre a gerada e a “absorvida” pelo mosto e pelo pé-de-cuba. sujeitas a erro como: alimentação. não inclui a dorna volante e deve ser dividido em um número mínimo de dornas. pé-de-cuba e evidentemente da água de resfriamento. o dimensionamento do sistema de resfriamento passa obrigatoriamente pelo conhecimento das temperaturas do mosto. que é um valor razoável. O calor total desprendido é igual à massa de ART fornecida multiplicada pela entalpia líquida da reação. que levam a um tempo de turbinagem muito longo e dificuldades de homogeneização. evitando-se dornas muito grandes.individual = 2. subtraída a entalpia retirada pela evaporação de água e álcool.468 = 411m 3 6 Considerando mais uma dorna como volante. nem dornas muito pequenas que aumentam muito o número de operações manuais ou automáticas. Este volume. como calculado acima.dornas = 350 x7. O tempo de turbinagem será aproximadamente 1 hora e 50 minutos. ocupação dorna= 92 – 98%.0. Por exemplo. Assim.doc 142 6/7/2011 . Quanto maior forem as temperaturas do mosto e do pé-de-cuba.468m 3 volume.

- 400 m3 de vinho, dos quais: 140 m3 são pé-de-cuba e 260 m3 de mosto; - temperatura do pé-de-cuba: 27ºC; - temperatura do mosto: 30ºC. Neste caso, cada dorna receberá 45,9 tons ART, que corresponderá à uma carga térmica liberada de:

C .T . = 45,9 x150.000 x 0,92 = 6.334.200 kcal
O mosto absorverá:

mosto = 260.000 x1,09 x (35 − 30) = 1.417.000 kcal
O pé-de-cuba absorverá:

pé − de − cuba = 140.000 x1,3 x(35 − 27 ) = 1.153.600 kcal
Resultando em uma carga térmica total a retirar de:

C.R. = 1.417.000 + 1.153.600 = 3.763.600kcal
Se 2/3 desta carga é liberada no período de enchimento, que neste caso é próximo de 2 horas, o trocador deverá retirar:

2 x1.763.600 = 1.254.533kcal 3x 2
Um trocador, instalado nesta dorna e que pode ser compartilhado com outro, teria uma equação de funcionamento como a seguir:

Q = UxAxΔT , ou.1.254.533 = UxAxΔT
Para U=3.500 kcal/m2 x h x ºC e ΔT =3,5ºC (trocador a placas),

A=

1.254.533 = 102,4m 2 3.500 x3,5

Como são seis dornas poderia ser comprados 3 trocadores de calor com uma área total de 307,2 m2. Neste caso a relação área de trocador/produção álcool fica em 307,2/350=0,88 m2/m3 de álcool por dia. Neste mesmo caso, seria impossível manter a mesma temperatura máxima com serpentinas, pois teria de ser instalada uma área de:

1.254.533 896,1 = 896,1m 2 , ou, = 2,24m 2 serpentinas/m3 dorna. A máxima área 400 x3,5 400
instalada de serpentinas ( em dornas de até 300 m3 ) é de 1,0 m2/m3, que já causa problema na limpeza. Ainda neste caso (por absurdo) seria necessário adquirir 6x896,1m2=5.376,6m2 de serpentinas (15,4 m2/m3 álcool por dia), que custaria muito mais que o conjunto de 3 trocadores de calor a placas.

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Centrífugas de fermento
Para produzir 1 m3 de álcool (100ºGL, 20ºC) é necessário processar um volume de vinho de:

vinho =

FL − FVT FL − FVT

Este volume, acrescido da reserva de vazão necessária para permitir limpezas freqüentes, é a capacidade operacional das centrífugas que devem ser instaladas, sempre considerando a máxima produção, no mínimo teor alcoólico. Para definir o número de unidades a serem adquiridas, considerar o máximo teor de fermento no vinho, pois quanto maior este teor, menor a capacidade individual de cada máquina, mantida a eficiência. Vazão centrífugas (m3/h)=produção horária x vinho =

FL − FVT 100 100 xo x FL − FVT GL %utilização

A porcentagem de utilização situa-se entre 90 a 95%, dependendo do tipo de centrífuga, do teor de sólidos insolúveis, não leveduras no vinho, ou seja do tempo e da freqüência de limpeza. Para o exemplo acima, correspondendo a uma produção máxima de 350 m3/dia (14,58m3 álcool/h) e um teor alcoólico correspondente de 8ºGL, com uma ocupação de 92,5%, a vazão a ser instalada é de:

14,58 x

50 − 1 100 100 x x = 241,3m 3 / h 50 − 10 8 92,5

Se o teor de fermento no vinho for maior, digamos 20%, mantido 50% no leite, teríamos uma capacidade de:

14,58 x

50 − 1 100 100 x x = 321,8m 3 / h 50 − 20 8 92,5

Por outro lado se for possível manter um teor de fermento no leite substancialmente maior, por exemplo, 70%, ficaríamos com:

14,58 x

70 − 1 100 100 x x = 271,9m 3 / h 70 − 20 8 92,5

Finalmente, dependendo da flexibilidade desejada e das condições do vinho (sólidos não leveduras) devem ser instaladas entre 240 e 320 m3/h ou entre 3 a 4 máquinas com capacidade efetiva de 80 m3/h cada uma.

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Tratamento do fermento – pé-de-cuba
O volume necessário de pé-de-cuba, depende do volume de leite gerado, da diluição desejada, do número de dornas processadas por dia e finalmente, do tempo de tratamento desejado. Para o tratamento convencional (batelada) são necessárias 1,75m3 cubas/m3 álcool por dia, divididos em 4 cubas. No exemplo, para a produção de 350m3 álcool por dia, o volume total de cubas seria de 612,5m3 ou 153,0m3 em cada cuba. Se o volume ocupado for de 150m3, seria possível uma diluição de 1:1. Diluições maiores exigiriam matérias-primas concentradas e evidentemente maiores cubas. O uso do tratamento ácido contínuo permite operar com 1,3m3 cubas/m3 álcool por dia (economia de 25% no volume) podendo-se dividir o volume total em 3 cubas.

PERDAS DURANTE O PROCESSO
Desde o preparo do solo para o plantio da cana até o carregamento do caminhão de álcool pode-se perder açúcar e/ou álcool. A otimização de cada etapa do processo de produção de álcool é condição prioritária para se obter altos rendimentos em litros de álcool por hectare. A origem das perdas pode ser de natureza não microbiológica, mas é via de regra, microbiológica. De todas as etapas da produção de álcool, existem duas onde as variações no rendimento são bem maiores que as outras: ART (açúcar total) por hectare e fermentação alcoólica. Encontramos locais onde a produção de cana por hectare é de 40 tons e em outros, 120 tons/há. Por outro lado a variação média anual do AART na cana de destilaria para destilaria pode variar de 13.5 ART% cana à 18,0 ART% cana (30% de variação). Na fermentação, caso semelhante pode ocorrer, pois fermentações infeccionadas ou com muita perda de fermento podem chegar a rendimentos de 70% ou menos, enquanto que se houverem bons equipamentos, e a operação for bem conduzida, este rendimento pode ir além dos 90% (22% de variação). Nas outras fases do processo de produção de álcool, como corte, transporte, pátio, barracão, extração, filtro rotativo, destilação e indeterminadas, é muito difícil chegar nesta variação que encontramos com certa facilidade em açúcar/há e rendimento fermentativo. Sem dúvida, é muito importante para se avaliar as perdas, métodos acurados no laboratório industrial, e claro, a partir de amostragens bem feitas na indústria.

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0. Lavoura A indústria pode se preparar da melhor maneira possível com todo o equipamento.7X107 1. o mais moderno.9X10 7 7 1.4X107 5.11 1. esta cana se infecciona com mais facilidade e a destruição de açúcar é grande.6X105 1.2 16.2X108 5. é impossível com as atuais tecnologias disponíveis. traz mais bactérias para a indústria.4X108 5. Eliminar a infecção.78 0.86 0.Qualidade da cana-de-açúcar A produção de açúcar por hectare é de responsabilidade do setor agrícola. mas tudo isso vaia penas diminuir percentualmente a contaminação que a cana está trazendo.0X108 1. traz para a indústria mais bactérias.11 0.2 16.3X106 3. qualidade da cana para a fermentação significa “nível microbiológico” ou “sanidade” da cana.04 0.04 0. portanto o prejuízo é dobrado.5 16. pois este aspecto pode afetar significativamente o rendimento fermentativo e a produção e qualidade do açúcar. Cana brocada.4X106 NQ=não queimada Fermentacaoalcoolica v2..6 17. nota-se então a importância da qualidade da matéria prima.01 0.0 17.7X10 5 5 16. cana com terra e cana plantada em solo que recebeu vinhaça.42 0. e com todo o biocida que quiser. além de desgastes de equipamentos por corrosão.7X105 1.1X10 5.doc 146 6/7/2011 .4 16. Uma parte do açúcar é transformada em álcool e ácido lático que saem no caldo e parte do álcool é evaporado. pois devido à grande superfície em contato com o ambiente. Por outro lado. etc.67 0. portanto. terra.08 0.3 16. A broca além de trazer infecção diminui o teor de açúcar na cana.6X105 8.80 0. A cana picada deve ser moída diretamente assim que chega à indústria.7X10 8. terra na cana. A tabela abaixo mostra a evolução de bactérias.78 0 0 0. Tempo (horas) Levedura contaminante Bactérias (bastonetes) Pol (%) Acidez Álcool (%) NQ NQ 12 24 36 48 60 72 2.6 0.85 0.45 0.4X105 7. esterilizar o caldo. leveduras e seus produtos em uma cana cortada e deixada na lavoura.

o desenvolvimento dos agentes contaminantes pode ser controlado através de um bom programa fitossanitário da cultura. Pode-se notar também que a cana queimada já inicia com uma contagem microbiológica bem maior que a não queimada. além de perder açúcar. as conclusões foram que as máquinas no pátio destroem 1. pois com a trepidação. Dados da Usina da Pedra. Na realidade o açúcar total decresceu embora a concentração tenha se elevado devido à perda de água por evaporação. fora a perda de açúcar por esmagamento. Nos Hilos. mas em termos de perda de açúcar e aumento de infecção.É bom notar que neste ensaio não choveu. e esta terra tem um efeito grande na indústria. exaustores das chaminés. bombas. o desenvolvimento dos agentes contaminantes pode ser controlado através de meios que impeçam a sua multiplicação ou que provoquem a destruição dos mesmos. a terra se localiza principalmente na parte de baixo. no descarregamento dos caminhões. a determinação do teor alcoólico no caldo é um parâmetro importante na determinação da deteriorização da cana. pois perdeu. pois traz infecção e aumenta a corrosão nas moendas. e as condições operacionais da indústria. Por outro lado. Isto pode ser conseguido por ação de meios físicos. Armazenamento: pátio e barracão Os dois tipos de armazenamento da cana têm suas vantagens e desvantagens. No pátio se amassa mais cana. pois seu amassamento provoca uma multiplicação bacteriana significativa. esta cana amassada. detalharam bem as perdas de ART. Carregamento. etc. transporte e recepção O carregamento da cana pode trazer muita terra. Como se pode observar. ela desce.3% lavada direta na mesa.78% da cana desviada para o pátio e 35. as canas que caem devem ser imediatamente retiradas. Um bom manejo dos barracões e pátios de cana também são fatores importantes no controle do aumento da população bacteriana.doc 147 6/7/2011 . Com base em 20.21% do açúcar correspondente da cana que passa pelo Fermentacaoalcoolica v2. e também perdeu água. químicos ou de ambos. No caminhão. corte e transporte. bem como através de uma adequação das operações de queima. Portanto. O aumento da POL não significa que a cana não perdeu açúcar.0. No campo. na indústria. o pátio é mais susceptível. ela se infecciona e leva esta infecção para a moenda e para toda a fábrica. pois a infecção seria maior se a umidade também fosse maior. quanto mais rápido moer a cana depois do ateamento do fogo no canavial. menos se perde em açúcar.

Por outro lado.29% na mesa. A cana amassada pode perder até 15% do ART original da cana. No pátio e na mesa representam 0. bombas. totalizando 1.0%. se um bom trabalho for feito na parte agrícola. as máquinas contribuem com 0. se a cana não for lavada. a lavoura 0. totalizando 0. o desgaste da moenda. se não tomarmos cuidado. Se o investimento que tem que ser feito nas indústrias se paga. A quantidade de açúcar que se perde na cana quando esta é lavada. dependendo do tamanho do tolete. A cana inteira perde cerca de 0.doc 148 6/7/2011 .70% do total que entrou na Usina. e assim caem novamente na esteira Fermentacaoalcoolica v2.pátio. ou 0. A quantidade de água que lava a cana não parece afetar significativamente a perda (acima de 3m3/ton) pois a quase totalidade do açúcar que é lavado é o que está na superfície da cana ou do corte. tubulações. A cana picada perde de 1. Preparo e extração No preparo da cana (facas e desfibrador). há um amassamento grande da cana e o caldo desta cana cai na esteira que é lavada posteriormente. a lavagem 0. é retirada por ventiladores ou escovas.0. pátio ou barracão.25%. há uma perda de açúcar a mais na lavagem dessa cana. a água de lavagem arrasta 1. Esta água geralmente vai se juntar á água de lavagem da cana. não é sabido.0 a 3.21%.26%. e também da maneira que a cana é estocada. menor a perda. o objetivo é extrair mais açúcar na moenda. perde cerca de 1. Entretanto. pode-se perder mais açúcar neste preparo e na extração do que imaginamos. qualidade do produto são fortemente afetados.25% do total que entrou na Usina. acreditamos que se possa moer a cana sem lavar.70%. 0. Resumindo.26%. Cada caso é um caso. Algumas usinas têm trabalhado assim.8 a 1. a cana desfibrada que fica aderente à esteira. Em média. A cana inteira de pátio perde cerca de 25% mais açúcar na lavagem do que a cana de barracão pois aquela é mais esmagada. como a cana chega com amassamento transversais e longitudinais da lavoura.26% da perda do açúcar total que entrou na Usina da balança até a esteira alimentadora. varia de acordo com o tipo de corte da cana. Entretanto. pois o tipo de solo vai influenciar muito.47% e do açúcar total entrado. No preparo. Quanto maior.21% do açúcar que passa no pátio e 1. se as facas não estiverem bem amoladas e no desfibrador os martelos não estiverem também acertados.7% do açúcar que ela contém. quebra de decantador. Lavagem Na maior parte das usinas e destilarias.

bagacilho e diminui a infecção bacteriana e de leveduras contaminantes. onde o ventilador da esteira parou por defeito no motor.0% do açúcar da cana foi perdido somente na esteira. parando pelo restante da hora. Entretanto. devido ao fato de que ter decantador e filtro não significam “a priori” alto rendimento na fermentação. A quantidade de cana desfibrada que fica na estira. Medições efetuadas em cinco usinas e destilarias evidenciaram que esta perda variou de 0. O medo de se perder elementos importantes para a fermentação no processo de decantação.5% do ART da cana. algumas dúvidas ainda persistem em algumas destilarias. durante todo o dia. Os biocidas aconselhados para moenda. uma destilaria sem decantador pode até ter rendimento maior do que uma com decantador. fizeram que muitas destilarias fossem montadas sem este sistema. A moenda é um dos grandes focos de infecção da indústria quando esta não é tratada convenientemente.0.1 a 0. O gasto com Fermentacaoalcoolica v2. são os baseados em amônia quaternária.doc 149 6/7/2011 . Portanto. portanto cerca de 1. o arraste de cana desfibrada elevou a perda na água de lavagem da cana de 1. pois além do equipamento ainda vai depender da operação. pois se o sistema de refrigeração das dornas e do mosto não forem adequados. o tratamento do caldo por decantação tem conseguido mais adeptos a cada ano que passa. a decantação bem feita elimina terra. Houve um caso. ou por falta de área de troca térmica ou por deficiência de água. reiniciando na hora seguinte. e não se conseguir diminuir a infecção somente com água. A diferença em rendimento é significativa. o custo do decantador e filtro. Entretanto.5%. a perda de ART no filtro. Atualmente não há dúvida que o decantador e filtro se pagam rapidamente.rápida e são levados à moenda. Caldo e mosto Aquecimento e decantação Polêmico por muitos anos.3 para 2. ou ainda se a decantação for mal feita. portanto dosa-se 15 minutos (tempo de residência do caldo nas moendas). o rendimento da fermentação não poderá ser bom. e o caldo de cana amassada pelas facas e desfibrador pode ser significativo. e é necessário lavagem de 3 em 3 horas com jato de água quente. dependendo das condições dos mesmos. Pode-se controlar a infecção na moenda com uma boa assepsia com água e biocida. durante um dia. apenas quando a cana já vem infeccionada (acima de 5x106 bastonetes/ml) ou quando a contagem do caldo misto é acima do dobro da contagem do caldo primário. que devem ser usados em dosagem por um período de 15 minutos com concentração em torno de 100 ppm.

há maior gasto de ácido.42% do ART da cana. e a sujeira vai toda para a destilaria. Um pH de no máximo 5. precipita o fósforo e o zinco principalmente. com o aquecimento se oxida a ácido acético. pois a terra que acompanha a cana realmente afeta toda a fermentação. abaixando o rendimento fermentativo. e irá aumentar a acidez do álcool. assim como o gasto com ácido sulfúrico quando o caldo é decantado. É preciso ter cuidado para interpretar esta perda quanto ao real prejuízo para a indústria. e se quiser manter a produção. tem que se forçar as outras máquinas. quanto menor o pH. que na coluna A. Quanto a perda de ART na torta de filtro das destilarias autônomas. A maior diferença em rendimento entre uma destilaria com e sem decantador.antiespumantes é bem menor. na decantação realmente há. a aumentam a produção de glicerol. assim como o zinco. O excesso de cal faz diminuir a absorção de magnésio e na clarificação. existe o entupimento. é na época que chove. Impureza no mosto afeta negativamente o rendimento da fermentação. O enxofre que vai produzir o sulfito com a combinação com o oxigênio. Em várias destilarias não se usa cal 90% do tempo. Quanto a precipitação de nutrientes. pois as vezes uma perda baixa na torta é devido a má decantação.8 é suficiente para decantar bem na maior parte do tempo. A terra e o bagacilho dão um desgaste grande nos bicos das centrífugas. Se for necessário. que não conseguem concentrar o fermento.0. O sulfito faz a levedura produzir mais aldeído acético. entretanto. mas só que para fermentação não é necessário fazer calagem muito forte como para o açúcar. e o cobre e o manganês também. a viabilidade do fermento diminui e o tempo de fermentação aumenta.20%. há um maior retorno de vinho para a cuba. Uma conseqüência do não aquecimento do caldo. com as conseqüências desagradáveis que todos sabem: o creme não concentra. enquanto algumas boas operaram com 0.doc 150 6/7/2011 . etc. que faz perder fermento pois há que parar as centrífugas com muita freqüência para limpeza. Sem aquecimento do caldo.0. a média foi de 0. Com isto. fica mais barato colocar um pouco de fósforo e zinco do que não ter decantação. Ao contrário dos desgastes dos bicos. e que já foi constatado foi a infecção com levedura contaminante (não Saccharomyces). se gasta mais ácido para manter o pH desejado. O fósforo vai se precipitar significativamente somente a pH acima de 6. Fermentacaoalcoolica v2. O uso excessivo da cal e enxofre na clarificação do caldo para açúcar pode afetar negativamente a fermentação. é impossível evitar. é tanto mais tóxico para a levedura.

e se a centrifugação for eficiente. onde o tempo de fermentação era de 18 a 20 horas. O fechamento das dornas e a recuperação do álcool se pagam em menos de uma safra. e menos sujeita à infecção. Fermentacaoalcoolica v2. além de outros produtos. o que às vezes pode não ocorrer. pois pode ser afetada pelos fatores físico-químicos do meio. temos que considerar tempo de fermentação de 4 a 6 horas para que possamos calcular a demanda de água e superfície de troca. Fermentação A fermentação é a fase da produção de álcool mais importante e há que ser monitorada com muita precisão e bom senso. Resfriamento do mosto Um soa fatores críticos para o rendimento fermentativo é a temperatura da fermentação. A degradação do açúcar produz ácidos orgânicos.doc 151 6/7/2011 . O rendimento é afetado por dois motivos. resfriar o mosto para se controlar a temperatura da dorna ao redor de 33 – 35ºC. propiciando a proliferação bacteriana. estas podem variar de 0. A temperatura do mosto afeta diretamente a temperatura máxima da fermentação. que conferem cor escura. Centrifugação A introdução das centrífugas na fermentação foi um marco histórico em termos de rendimento. As causas do descontrole da temperatura na fermentação são devidas principalmente a erros de projeto no sistema de refrigeração das dornas. a concentração de fermento na dorna se eleva e a fermentação fica mais rápida. há um efeito direto em aumentar a toxidez exercida pelo álcool à levedura. melanoidinas. é. Quanto as perdas de álcool por evaporação na fermentação.0% do álcool produzido dependendo do teor alcoólico da dorna e da temperatura. no tocante às leveduras e bactérias. no preparo do mosto. são tóxicos para a levedura. A economia com o volume de dornas de fermentação também é grande. que por sua vez afeta negativamente o rendimento da fermentação. Hoje. pois elas permitem usar o mesmo fermento para várias fermentações. Fundamental. o que promove o aumento da acidez. que além de refletir em perdas de açúcar. se o projeto for bem feito e executado. quando se eleva além do ótimo.0.4 a 2. Se a temperatura for acima de 35ºC. e o outro motivo é indireto.A perda de ART no aquecimento do melaço ocorre principalmente nos dias frios. portanto. Usam-se taxas de fermentação de vinte anos atrás. bem como pelos microbiológicos.

Se a temperatura máxima da fermentação não ultrapassar os limites já citados. Acontece. porém. Tempo de aproveitamento Nas paradas longas.05 – 0. As paradas de um ou dois dias por chuva ou falta de cana afetam significativamente o rendimento da fermentação. com antibióticos de alto espectro.1% de concentração de levedo) ou cerca de 5% do fermento da dorna. A variação na queda do rendimento nas pararas vai depender do preparo e conhecimento da equipe. Fermentacaoalcoolica v2. Daí será necessário sangrar. o açúcar é desviado principalmente para refazer as reservas da levedura. Quando se inicia a fermentação. e não houver problemas de infecção. como o Kamoran.doc 152 6/7/2011 . menor o rendimento. e as reservas são queimadas. produz mais glicerol e depois vai fazer álcool. se deixa o fermento até 4 – 5 dias (sempre sem ácido) em condições adequadas à conservação. em poucos dias.0. há lixiviação de sais da levedura para o meio. haverá excesso de fermento na dorna. Quanto maior o tempo.O desempenho das centrífugas é fator primordial para se obter altos rendimentos. dependendo da composição mineral do mosto. Um bom desempenho significa concentrar o leite ou creme o mais que puder (70 – 80%) e perder no vinho centrifugado o mínimo que puder (0. que se há infecção. O tempo médio de espera na cuba de tratamento pode afetar o rendimento da fermentação. muitas horas ou dias. Hoje. é necessário pelo menos duas horas de tratamento para que o ácido faça o efeito desejado. As paradas afetam até a extração.

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