UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TÉCNICA CURSO TÉCNICO EM BIOTECNOLOGIA

Fundamentos de Laboratório

Júlio Xandro Heck Jane Elisabete Marques de Almeida Caon

Porto Alegre, 2006

OS AUTORES
Júlio Xandro Heck é formado em Química Industrial de Alimentos, Mestre em Microbiologia Agrícola e do Ambiente (ênfase em Tecnologia de Bioprocessos) pela UFRGS e Doutor em Biologia Celular e Molecular (ênfase em Biotecnologia) pela UFRGS. Foi bolsista de Pós-doutorado do CNPq e atualmente é professor na Escola Técnica da UFRGS. Jane Elisabete Marques de Almeida Caon é formada em Biologia, Especialista em Programas de Saúde e Mestre em Ecologia pela UFRGS. Professora na Escola Técnica UFRGS.

APRESENTAÇÃO
Este manual foi desenvolvido com o objetivo de servir como guia básico para o desenvolvimento do Componente Curricular de Fundamentos de Laboratório, oferecido para o Curso Técnico em Biotecnologia, da Escola Técnica da UFRGS. Não é nossa intenção fornecer ao aluno subsídios para a realização de todas as operações utilizadas em laboratórios de Biotecnologia e nem permitir a utilização eficiente de qualquer equipamento disponível, pois esta tarefa seria extremamente extensa e, provavelmente, não teríamos sucesso. No entanto, esperamos que a nossa obra sirva de orientação geral para o desenvolvimento das atividades cotidianas do Técnico em Biotecnologia e torne mais fácil o desempenho de suas atividades profissionais.

Os autores

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TÉCNICA DA UFRGS Curso de Biotecnologia Fundamentos de Laboratório Professor: Charley Christian Staats

Aula 1: NOÇÕES BÁSICAS DE BIOSSEGURANÇA ACIDENTES COM SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS E PRIMEIROS SOCORROS Orientações gerais sobre comportamento em um laboratório de Biotecnologia 1. Ao entramos em um laboratório (de química, bioquímica, microbiologia, etc) devemos sempre colocar o jaleco (avental, guarda pó, etc). Este procedimento é IMPRESCINDÍVEL. Não devemos tolerar que pessoas circulem pelo laboratório sem a vestimenta adequada. Obviamente, o jaleco deve ser limpo e adequado para a função. 2. Não coloque lanches, cigarros e outros materiais sobre as mesas do laboratório, pois elas podem estar contaminadas com produtos corrosivos ou tóxicos . 3. Mantenha seu lugar de trabalho em perfeito estado de limpeza e evite obstáculos inúteis na sua bancada de trabalho. 4. É expressamente proibido fumar no ambiente de laboratório. 5. Nunca use tubos de vidro com as bordas cortantes, mesmo em caso de urgência. Vidro trincados jamais devem ser usados. 6. Não faça força sobre o vidro. 7. Lubrifique os tubos de vidro para introduzi-los nas rolhas. No caso de rolhas de borracha, use glicerina como lubrificante.

7. Proteja suas mãos com luvas de couro ao colocar rolhas em um tubo. 8. Os frascos com amostras contaminadas com solução ácida, soda cáustica ou outros materiais corrosivos devem ser lavados com água após serem usados. 9. Vidros quebrados devem ser jogados em recipientes próprios e nunca despejados no lixo comum. 10. Ao sifonar ou pipetar líquidos, NUNCA FAÇA ISSO COM A BOCA, use pipetadores apropriados. 11. Materiais tóxicos ou voláteis devem ser manipulados em local apropriado (capela de exaustão). Na falta desta, fazer esse procedimento ao ar livre, fora do laboratório, tomando as devidas precauções. 12. Amostras e produtos químicos em recipientes sem rótulos na devem ser usados. 13. Amostras quentes devem ser identificadas como tal. 14. Roupas contaminadas devem ser trocadas imediatamente. 15. O bico de Bunsen deve ser usado somente em lugares isentos de inflamáveis ou explosivos. 16. Coloque os recipientes contendo produtos em seus lugares apropriados, isso evitará erros na análise e possíveis acidentes. 17. Jogue o lixo nos locais adequados. 18. No caso de diluições, DERRAME SEMPRE O ÁCIDO NA ÁGUA E NÃO a água no ácido. 19. Evite tocar em produtos que não conhece. 20. Não procure, com fins recreativos, misturar reativos e produtos sem saber o que vai acontecer. 21. Evite respirar vapores e fumaças. 22. Rotule os recipientes antes de enchê-los. 23. Não beba água, café, leite, refrigerantes, etc, em locais que sejam apropriados (béqueres, por exemplo). 24. Não jogue na pia líquidos corrosivos ou inflamáveis que não tenham sido previamente diluídos. 25. Se, por acaso, quebrar um frasco de vidro, não apanhe os estilhaços com as mãos. Use uma escova ou vassoura.

26. REDOBRE SUA ATENÇÃO QUANTO ESTIVER FAZENDO ALGUM EXPERIMENTO NO LABORATÓRIO, POIS SÓ ASSIM PODERÁ INTERPRETAR CORRETAMENTE OS RESULTADOS E GARANTIR A SUA SEGURANÇA E A DE TODOS QUE ESTIVEREM NO LABORATÓRIO.

Acidentes com substâncias químicas e primeiro socorros Vale a pena lembra que é dever de todos o conhecimento dos riscos dos produtos químicos que estão sendo manipulados no laboratório. Os procedimentos gerais, em caso de acidentes, estão listados a seguir: Derramamento de ácidos e bases: ÁCIDOS: antes de lavar com água é correto adicionar Ca(OH) 2 (hidróxido de cálcio). BASES: adicionar NAHSO4 (bissulfato de sódio). Respingos de produtos químicos sobre a pele e mucosas: 1. Lavar com água corrente em abundância, sem esfregar a superfície afetada, até que seja removido o componente químico em contato com a pele ou a mucosa. 2. Retirar as roupas da pessoa e tomar cuidado para não se contaminar neste processo. Lavar as roupas separadamente, antes de usar.

3. Procurar atendimento médico, se necessário.

Respingos sobre os olhos 1. Lavar os olhos com água corrente em abundância, forçando levemente as pálpebras, assegurando que a água banhe-os totalmente. 2. Todos os acidentes causados por agentes químicos que envolvam os olhos devem receber cuidados médicos.

Inalação de gases 1. Remover imediatamente a pessoa do local e afrouxar as roupas. 2. Se a vítima estiver inconsciente, deite-a e verifique a respiração. Se a respiração estiver parada, inicie respiração artificial. 3. Procure assistência médica. Ingestão 1. Se o ocorrer o contato de qualquer produto químico com a boca, enxágüe com bastante água, tomando cuidado para não engolir. Se o composto químico foi ingerido, beber água para diluí-lo no estômago. 2. Não induzir vômito. 3. Transportar a vítima para o centro médico mais próximo. O tratamento dos diferentes tipos de intoxicação baseia-se, fundamentalmente, em terminar a exposição do organismo à substância, promover a excreção, empregar antídotos ou antagonistas da substância química e, se esta for ingerida, aplicar medidas de sustentação. A seguir estão apresentados alguns antídotos e suas aplicações.
Antídoto Acetato de amônio (solução 61,5%) para lavagem gástrica Ácido acético 1% Hidróxido de cálcio (solução 0,14%) para administração oral Amido de milho (80 g/L) Indicado para acidentes com: Formaldeído

Hidróxidos Ácidos

Iodo

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TÉCNICA DA UFRGS Curso de Biotecnologia Fundamentos de Laboratório Professor: Charley Christian Staats

Aula 2: INSTRUMENTOS E MATERIAIS DE LABORATÓRIO - Agarradores: Utilizados para segurar buretas, balões, erlenmeyers, condensadores e funis nos suportes.

- Argola: Suporte para funil de separação, funil simples, tela de amianto e frascos que são coletados sobre a tela de amianto quando aquecidos.

- Balança analítica: Instrumento usado para determinação de massas de reagentes. As balanças analíticas possuem precisão de 0,0001 g.

- Balão de fundo chato: Empregado para aquecimento ou armazenamento de líquidos ou solução.

- Balão volumétrico: Balão de fundo chato e gargalo comprido, calibrado para conter determinados volumes líquidos. Possui um traço de referência, que marca o volume exato. Utilizado na preparação de soluções de concentrações conhecidas.

- Bastão de vidro: É um bastão de vidro maciço utilizado para agitações e para auxiliar na transferência de líquidos de um recipiente para outro (direcionador de fluxo).

- Béquer (becker): Recipiente de vidro utilizado para aquecer substâncias, recolher filtrados, fazer decantações, misturar reagentes, preparar soluções e realizar reações.

- Bico de Bunsen: Bico de gás especialmente construído para usos em laboratórios. Utilizado para aquecimento até temperaturas de 800ºC. Além deste, utilizam-se outros métodos de aquecimento em laboratório: banho-maria e banho de óleo.

Como utilizar o bico de bunsen: 1. abrir a chave geral de gás do laboratório. 2. abrir a válvula do registro de gás individual de cada bico (ele está localizado, geralmente, próximo do bico). 3. verificar se a entrada de ar do bico está aberta. Com ela fechada não é possível ligar o bico. 4. girar a válvula que liga efetivamente o bico e, com auxílio de um isqueiro ou de palitos de fósforo, acender o bico. A altura da chama pode ser controlada através do controle da entrada de ar. Para desligar: desligar a válvula do registro de gás (item 2), desligar o bico (item 4).

- Bureta: Serve para dar escoamento a volumes variáveis de líquidos. Não deve ser aquecida. É constituída de tubo de vidro uniformemente calibrado, graduado em décimos de mililitro. Na parte inferior possui uma torneira. É utilizada para titulações.

- Cadinho de porcelana: Pequeno recipiente de porcelana que resiste a altas temperaturas (>1000ºC). Utilizado em calcinações, eliminação de substâncias orgânicas, secagens, aquecimentos e fusões.

- Dessecador: Recipiente de vidro ou porcelana, inteiramente fechado e vedado, que contém em sua parte inferior uma substância capaz de absorver água. É usado para conservação de sólidos ou mesmo líquidos, no estado seco, para preservá-los da umidade. Também é usado para resfriamento de substâncias em atmosfera contendo baixo teor de umidade.

- Erlenmeyer: Recipiente de vidro utilizado para aquecer e cristalizar substâncias, especialmente quando estas precisarem ser agitadas. É utilizado também em titulações e para recolher filtrados. Além dessas aplicações é amplamente utilizado em microbiologia, para o crescimento de microrganismos e para o preparo de meios de cultura.

- Espátula: Utilizada para retirar reagentes sólidos de frascos. Pode ser de porcelana, plástico ou metal.

- Estantes para tubos de vidro: Suporte de madeira ou metal, de vários tamanhos, para tubos de ensaios.

- Frasco lavador (pisseta): Frasco de plástico com tampa. São utilizados para lavagem de precipitados, cristais, gases, etc. Pode conter água destilada, água acidificada, etanol, acetona, hidróxido de sódio.

- Funil de separação: Recipiente de vidro, em forma de pêra, que possui uma torneira e tampa esmerilhada. Utilizado para fazer extrações por meio de solventes e para a separação em líquidos imiscíveis.

- Funil de vidro simples: É um funil ao qual se adapta o papel filtro, lã de vidro, algodão simples, etc. Usado para filtrações.

- Gral de porcelana ou vidro: Empregado para pulverizações de substâncias sólidas.

- Kitassato - Usado em conjunto com o funil de Büchner na filtração a vácuo. - Lâminas: São vidros retangulares, em geral, no formato de 76 x 26, brancos, transparentes e com espessura não superior a 1,5 mm. Obs: Lâminas e lamínulas nuca se seguram na face do vidro, mas sempre apenas pelas bordas. - Lamínulas: São vidros quadradas (18 x 18) ou retangulares (24 x50), com espessura entre 0,1-0,2 mm. Servem juntamente com as lâminas para a inclusão temporária ou permanente do objeto.

- Mufa: Utilizada para prender, nos suportes universais, os agarradores que não as contenham em seus cabos.

- Papel filtro: Papel poroso, que retém partículas sólidas, deixando passar apenas a fase líquida. Quando o líquido é corrosivo se substitui o papel por lã de vidro ou amianto. Depois de colocado no funil o papel filtro deve ser umedecido, de forma que fique retido junto à parede.

- Pêra - Usada para pipetar soluções. - Pinça de madeira: Usada para prender tubos de ensaio durante o aquecimento direto no bico de Bunsen. - Pipeta graduada: Consiste de um tubo de vidro estreito geralmente graduado em 0,1 ml. É usada para medir pequenos volumes variáveis de líquidos. Encontra pouca aplicação sempre que se deseja medir volumes líquidos com maior precisão. Não deve ser aquecida.

- Pipeta volumétrica: É constituída por um tubo de vidro com um bulbo na parte central. O traço de referência é gravado na parte do tubo acima do bulbo. É usada para medir volumes únicos de líquidos com elevada precisão. Não deve ser aquecida. - Placa de Petri: Recipiente de vidro que pode se apresentar em vários tamanhos, sua utilidade é muito variada. Tem grande emprego nas culturas de bactérias, culturas de fungos, protozoários, etc. - Provetas: Recipiente de vidro, de capacidade variável geralmente indicada em mL. Utilizada para medir volumes de líquidos, para preparar soluções de concentração aproximada ou não conhecida.

- Suporte universal: Suporte de ferro utilizado como meio de prender argolas e agarradores.

- Tenaz: Empregada para segurar cadinhos, tubos e cápsulas quando aquecidos. É geralmente de ferro ou níquel.

- Termômetro: Usado para medir a temperatura durante o aquecimento em operações como: destilação simples, fracionada, etc. - Triângulo de porcelana: Triângulo construído de arame coberto por tubos de porcelana ou outro material refratário. Utilizado como suporte para cadinhos e cápsulas durante a calcinação.

- Tripé e tela de amianto: O tripé é o suporte para a tela de amianto. A tela tem a propriedade de distribuir o calor, evitando que os frascos quebrem quando aquecido no fogo.

- Tubo de ensaio: Tubos de vidro, cilíndricos, com tamanhos variados, usados em vários experimentos. Nele, efetuam-se reações simples. Podem sofre variações de temperatura. - Vidro de relógio: Peça de vidro de forma côncava. É usado para cobrir béqueres, em evaporações, pesagens de diversos fins. Não pode ser aquecido diretamente na chama do bico de Bunsen. Equipamentos de proteção individual (EPIs) recomendados - Proteção para os olhos: para se proteger contra respingos, aerossóis, combustíveis ou cacos de vidro, USE ÓCULOS DE PROTEÇÃO. - Máscara: algumas substâncias, especialmente voláteis, podem exigir o uso de máscaras respi ratórias. - Luvas: o manuseio de algumas substâncias tóxicas exige o uso de luvas. Na maioria dos casos, uma luva de látex já é suficiente.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TÉCNICA DA UFRGS Curso de Biotecnologia Fundamentos de Laboratório Professores: Jane Caon e Júlio Xandro Heck

Aula 3: MICROSCOPIA Conceito É a arte de empregar o microscópio. O que é um microscópio? A palavra tem origem grega – mikrós, pequeno, e skoppéoo, observar, ver através de – e significa um instrumento através do qual se observa coisas pequenas. Partes do microscópio a) Parte mecânica: pé (base); braço (estativa ou coluna); platina (mesa); canhão (tubo); parafusos: macrométrico e micrométrico; revólver (tambor); charriot. Compõem o sistema de suporte e ajuste. b) Parte óptica: lente ocular; lente objetiva; condensador com diafragma; espelho ou fonte de luz acoplada. Compõem o sistema de aumento e de iluminação. a) Parte Mecânica Pé: É o local de apoio, dá estabilidade ao aparelho e serve de suporte para as demais peças. Braço: Suporte pesado que sustenta os tubos, a mesa, o condensador, os parafusos macro e micrométrico. Platina: Redonda ou quadrangular, pode ser fixa, móvel ou giratória no plano horizontal. Sobre ela fica a lâmina com o material a ser observado. Apresenta uma abertura no seu centro permitindo a passagem dos raios luminosos, coletados pelo espelho ou oriundos de fonte luminosa própria e convergindo sobre o material da lâmina pelo condensador e diafragma. Os raios chegam através da lente objetiva do tubo e da ocular até o globo ocular (retina) do observador. A preparação sobre a lâmina é afixada à platina através de duas presilhas móveis. Canhão: Nos microscópios monoculares (que possuem uma só ocular), o canhão representa um cilindro metálico, que pode ser reto ou oblíquo. Os microscópios binoculares (que possuem duas oculares) podem ser inclinados, com ajuste para as distâncias entre os olhos de cada observador. Parafuso macrométrico: É o parafuso maior, de avanço rápido. Possui botões bilaterais, localizados acima ou abaixo da platina. Utiliza-se primeiro para atingir a aproximação da focalização grosseira do material. Possui um percurso vertical, com cerca de 7 cm. Parafuso micrométrico: É o parafuso menor, de avanço lento. Comandado, também por tambores laterais. Permiti o deslocamento do tubo a apenas dois milésimos de milímetro ou

menos, portanto seu emprego só é utilizado para acertar a focalização do material já visível. Emprega-lo antes não é indicado, pois perde-se muito tempo tentando obter deslocamentos maiores. É utilizado para obter um enfoque perfeito da preparação. Entretanto, quando a preparação já parecer estar perfeitamente focalizada, devemos ter sempre a mão sobre o parafuso e proceder a pequenas oscilações, que permitam precisar certos detalhes, ou perceber novos elementos, ainda não vistos. Revólver: Fica acima da platina. As objetivas se encaixam numa peça rotatória e giram sempre no sentido do menor para o maior aumento. Charriot: Peça reguladora localizada na platina e que serve para movimentar a lâmina no campo. Um parafuso desloca a lâmina para frente e para trás e outro parafuso a desloca para a esquerda ou para a direita. b) Parte Óptica Lente ocular: Encaixada na extremidade superior do tubo, pode ser retirada e substituída facilmente. Juntamente com a objetiva fornece a imagem do objeto. As oculares fornecem, geralmente, ampliações iguais às obtidas por lentes ou lupas manuais. Com a ocular de maior aumento a parte visível da preparação é mais restrita. Ex. Se examinarmos uma preparação de glóbulos de sangue com a ocular de menor ampliação, os elementos serão menores, porém mais numerosos em cada campo do microscópio. Por outro lado, com a ocular de maior ampliação, os elementos serão maiores, mas em cada campo ver-se-á um número muito mais reduzido de elementos. Se o microscópio for monocular é conveniente fazer a observação com ambos olhos abertos, olhando-se com qualquer um dos dois. Quanto menos iluminada estiver a mesa mais fácil será consegui-lo. Característica técnica da ocular: Aumento: O poder de aumento se encontra gravado na ocular. - a ocular X 4 aumenta 4 vezes a imagem produzida pela objetiva. - a ocular X 6 aumenta a imagem 6 vezes - a ocular X 10 aumenta a imagem 10 vezes. Se a imagem do objeto aumentou 40 vezes mediante a objetiva de X 40 e após 6 vezes mediante a ocular de X 6, o aumento total será de 6 x 40 = 240 X. Para calcular o aumento total da imagem do objeto que se observa, multiplicamos o poder de aumento da objetiva pelo da ocular. Lente objetiva: Fornece a imagem ampliada do objeto. Há objetivas a seco e de imersão. As objetivas de maior ampliação têm as lentes terminais menores. a) Objetivas a seco – São as mais correntemente empregadas. Entre a lente frontal e a lamínula só existe ar. As objetivas, sem indicação específica, são destinadas aos exames a seco, isto é, nenhum líquido pode ser interposto entre a preparação e a objetiva. É claro que isto não quer dizer que com elas não se possa examinar um líquido, mas sim que, neste caso é preciso que o líquido esteja coberto por uma lamínula e não em contato direto com a objetiva. b) Objetiva de imersão - A objetiva de imersão promove a maior ampliação do objeto em estudo, entretanto é menor a quantidade de raios luminosos que atravessam o tubo do microscópio, para corrigir essa situação e aproveitar a maior quantidade de luz possível, coloca-se entre a objetiva de imersão e a preparação uma gota de óleo de imersão, evitando assim a interposição do ar. O uso da objetiva de imersão requer grande luminosidade e o emprego do condensador. Nunca usar a seco uma objetiva de imersão.

Características técnicas das objetivas: 1. Aumentos: O poder de aumento de cada objetiva se indica por um número gravado no suporte da lente: a objetiva X 10 aumenta 10 vezes a objetiva X 40 aumenta 40 vezes a objetiva X 100 aumenta 100 vezes (A objetiva X 100 geralmente se encontra marcada com um anel para indicar que se deve usá-la com óleo de imersão). 2. Abertura numérica (NA): A AN também se acha gravada no suporte da lente, junto a indicação do poder de aumento. Ex. X 100 / 1.30 - 0,30 na objetiva X 10 - 0,65 na objetiva X 40 - 1,30 na objetiva X 100 A medida que aumenta a AN é maior o poder de resolução (capacidade de perceber detalhes adjacentes muito próximos, separando-os som nitidez). Ainda, a medida que aumenta a AN diminui a dimensão da lente frontal. A lente frontal da objetiva X 100 tem o tamanho de uma cabeça de alfinete, por isso deve-se manejar com cuidado. 3. No suporte da objetiva pode ter outros números: Ex. X 40 / 0.65 160 / 0,17 A altura recomendada em mm para o tubo do microscópio (entre a objetiva e a ocular), é geralmente de 160 mm. A espessura recomendada em mm para a lamínula utilizada sobre a lâmina, 0,17mm. 4. Distância de operação da objetiva: É a distância entre a lente frontal da objetiva e a lâmina quando a imagem se encontra focada. A medida que o poder de aumento do objeto é maior diminui a distância de operação. - objetiva X 10: a distância de operação é de 5 – 6 mm - objetiva X 40: a distância de operação é de 0,5 – 1,5 mm - objetiva X 100: a distância de operação é de 0,15 – 0,20 mm 5. Poder de resolução: É a capacidade de distinguir dois pontos muito próximos. A capacidade de resolução do olho humano é 0,25 mm. Quanto maior for o poder de resolução da objetiva, mais clara será a imagem e maior a capacidade de por em evidência detalhes adjacentes muito próximos, separando-os com nitidez. Condensador com diafragma: Localizado abaixo da platina, sua função principal é fornecer bastante luz, tornando mais clara a preparação, indispensável nas grandes ampliações (objetivas de grande aumento) do material a ser observado. Ao se elevar o condensador, através do parafuso de ajuste, a iluminação é máxima. Ao baixá-lo obtemos uma iluminação mínima. Alguns microscópios têm filtros coloridos, principalmente azuis de baixo do condensador. Se pode deixar ou tirar segundo o tipo de preparação que se vá observar. Pode haver três parafusos colocados ao redor do condensador: um na frente, um a esquerda e outro a direita. Usam-se para centrar o condensador exatamente em relação ao objeto em observação. O diafragma está dentro do condensador. Utiliza-se para reduzir ou ampliar um ângulo, portanto, também a quantidade de luz que entra no condensador. Fecha-se o diafragma quando se usam objetivas de pouco aumento, para eliminar os raios laterais. Abre-se o diafragma na medida em que se aumentam as ampliações, em conseqüência aumenta a NA e se pode observar detalhes menores do objeto.

Espelho: É encaixado por baixo do condensador. É redondo e possui duas faces: uma plana e outra côncava. A face plana é usada nos pequenos aumentos, quando quisermos obter um campo uniformemente iluminado e também para quando usamos a objetiva de imersão. A face côncava é usada em grandes aumentos. Entretanto estas regras não são absolutas. É sugerido proceder por tentativas, quando a preparação está sob o microscópio, e experimentar sucessivamente uma e outra face assim como as diferentes posições do espelho, até conseguir a visibilidade desejada.

Preparação do microscópio para uso Procedimentos para centrar corretamente o condensador: 1. Coloque na platina uma preparação em lâmina, sem lamínula. Desça o condensador. Abra o diafragma. Examine com a objetiva de menor aumento. Observe a preparação através da ocular e focalize. 2. Feche o diafragma. No campo microscópico aparecerá um círculo borrado de luz rodeado por um anel escuro. 3. Elevar o condensador lentamente até que as bordas do círculo luminoso estejam claramente focalizadas. 4. Ajuste, se necessário, a posição do espelho de maneira que o círculo luminoso fique centrado exatamente ou sobreposto à área clara que está rodeada pela zona escura. 5. Através dos parafusos para centrar o condensador faça os ajustes necessários até que o círculo luminoso se encontre exatamente no centro do campo microscópico. Repita a operação quando usar as outras objetivas. Ajuste do diafragma Abra o diafragma completamente, Retire a ocular e observe diretamente através do tubo do microscópio; a lente superior da objetiva aparecerá cheia por um círculo luminoso. Feche o diafragma lentamente até que este círculo luminoso ocupe somente 2/3 da superfície. Repita esta operação até usar cada objetiva. Ajuste da ocular 1. Escolha da ocular: As oculares X 5 ou X 6 proporcionam resultados satisfatórios no laboratório clínico. Se utilizarmos oculares de maior poder se intensificará o aumento, mas é provável que não se observe melhor os detalhes. 2. Ajuste da distância interpupilar (distância entre as pupilas dos olhos): Segurar as bases das oculares com as duas mãos e regular a distância interpupilar até obter uma perfeita visão binocular. 3. Focalização dos olhos direito e esquerdo: Um dos suportes das oculares, quase sempre o esquerdo, está provido de um anel para focagem. Se este anel se encontra no suporte da ocular esquerda, feche o olho esquerdo e, empregando a objetiva X 40, focalize a imagem para o olho direito pela ocular direita. A seguir feche o olho direito e observe com o olho esquerdo através da ocular esquerda. Se a imagem se encontra focalizada não é necessário ajuste. Se a imagem não é clara, faça girar o anel de focagem até obter nitidez de imagem. Neste momento o microscópio estará ajustado de acordo com a visão binocular própria do operador.

Focalização da objetiva 1. Emprego da objetiva de menor aumento ( X 5 ou X 10 ) Na observação de uma preparação, inicie sempre pela objetiva de menor aumento. - Coloque a lâmina sobre a platina, fixe-a com a(s) presilha(s), mova a lâmina com o charriot até que o objeto fique exatamente no centro do campo. - Desça o condensador completamente - “Desça” a objetiva até encontrar-se imediatamente acima da preparação - Utilizando o parafuso macrométrico de rápido avanço “eleve” a objetiva até observar uma imagem clara através da ocular - Faça ajustes com o parafuso micrométrico - Se a iluminação é insuficiente suba o condensador ligeiramente 2. Emprego da objetiva de maior aumento ( X 40 ) - Sem olhar pela ocular, baixe o condensador até a metade da distância. - Ainda olhando por fora, “desça” a objetiva até colocá-la imediatamente por cima da preparação (a distância de operação é muito pequena, cerca de 0,5mm). - Através do parafuso macrométrico de rápido avanço, “eleve” a objetiva muito lentamente até que apareça uma imagem borrada no campo microscópico. - Busque o foco por meio do parafuso micrométrico de avanço lento. - “Eleve” o condensador para obter suficiente iluminação. - Se o microscópio não tiver condensador utilize o lado côncavo do espelho. 3. Emprego da objetiva de imersão em óleo - Utilizar preparações completamente secas - Colocar uma pequena gota de óleo de imersão sobre a porção que se vai examinar (de preferência usar óleos sintéticos) - “Eleve” o condensador até onde possa chegar - Abra completamente o diafragma - “Desça” a objetiva X 100 até que entre em contato com o óleo - Aproxime a objetiva da preparação até onde seja possível, mas evite a pressão na lâmina (as objetivas modernas tem amortizador). - Observe através da ocular e gire para cima, muito cuidadosamente, o parafuso micrométrico, de avanço lento até que a imagem se encontre focalizada. Observação: Nos microscópios modernos a objetiva não “sobe nem desce”, e sim a platina que se move através do comando do parafuso macrométrico de avanço rápido e do parafuso micrométrico de avanço lento. Neste caso os parafusos devem girar em direção oposta para a focalização da imagem. Mudança das objetivas Os microscópios modernos são construídos de tal maneira que quando se muda a objetiva de menor aumento para a de maior aumento o objeto permanece mais ou menos focalizado sendo necessário pequeno ajuste com o parafuso micrométrico. Se isso não acontecer, suba o revólver antes de fazer a mudança para a objetiva de maior aumento e após focalize novamente. Antes de mudar a objetiva certifique-se que o objeto examinado encontra-se no meio do campo microscópico (círculo luminoso que se observa através da ocular), a fim de não perde-lo depois na troca de objetivas.

Cuidados no uso apropriado do microscópio 1. É essencial que você conheça as partes ópticas e mecânicas do microscópio, tendo o cuidado de ler e absorver as instruções contidas nos manuais que os acompanham, e/ou seguir as orientações do professor em classe. 2. Mantenha o microscópio livre de poeira, vapores ácidos e do contato com reagentes. Para mantê-lo seco, cubra com capa de flanela pois evita o pó e a multiplicação de fungos(Obs.: as capas devem ser lavadas periodicamente). 3. Não manusear o equipamento com as mãos sujas ou molhadas. 4. Jamais comer ou beber próximo ao equipamento. 5. Na remoção do equipamento, segure-o firmemente com uma das mãos no braço e outra na base. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de trabalho de superfície plana, evitando qualquer movimentação brusca. Nunca desloque o microscópio com a lâmpada acesa ou logo após ter sido apagada. 6. Muita atenção é necessária quando se observa a preparação em meio líquido, pois há sempre o risco de molhar a lente frontal da objetiva, portanto o conselho é retirar o excesso de líquido com papel filtro, antes de colocar a lâmina sobre a platina, em caso de acidente, enxugar imediatamente com lenço de papel absorvente macio. 7. Ao trabalhar com o colega no mesmo microscópio, após a focalização do objeto, desatarraxar o parafuso para soltar as oculares, e deslocá-la para o colega que deverá atarraxar suavemente, regulando o ajuste interpupilar. 8. Ao encerrar os trabalhos com o microscópio, desligue a luz, enrole o fio e posicione a objetiva de menor aumento sobre o orifício da platina. Limpeza:
- Parte óptica

A nitidez das imagens depende diretamente do estado de limpeza das lentes. Isto pode ser evitado pelo hábito de limpeza periódica. 1. Oculares Com a objetiva de menor aumento focalizado em uma preparação, gire as oculares e verifique se existem partículas que acompanham o movimento: caso existam elas, podem estar nas duas superfícies e neste caso ambas devem ser limpas com um bulbo de borracha e cotonete. Para retirar eventuais manchas de óleo, dedos; umedecer um cotonete com solvente apropriado (álcool a 70% ou éter), tomando cuidado para não inundar as lentes, e secar imediatamente com um lenço de papel. Freqüentemente basta projetar o hálito na superfície das lentes e limpa-las. Limpe freqüentemente as oculares com lenço de papel fino; pois o contato com os cílios e mesmo poeira podem sujá-las. Nunca toque as lentes com os dedos, pois a gordura atrai poeira. Precaução especial é requerida no uso de solventes hidrocarbonetos, como o xilol, pois podem penetrar na área de fixação das lentes no suporte dissolvendo a cola, bem como produzir película sobre as lentes.

2. Objetivas Cada objetiva deve ser desatarraxada cuidadosamente do revólver e após a limpeza recolocada na posição original, para tanto, usar a mesma técnica descrita para as oculares. No entanto, como as superfícies das lentes são menores que as das oculares, recomenda-se inspeciona-las com uma pequena lupa manual. Para retirar poeira da face posterior da objetiva, usa-se um pincel de pêlo muito macio. Após o uso da objetiva de imersão, retirar o excesso de óleo com um papel de filtro e terminar a limpeza com um cotonete levemente embebido de éter. Jamais usar álcool na limpeza do óleo de imersão, pois este não é dissolvido pelo álcool, mas forma com ele um precipitado branco. - Parte mecânica Evitar o acúmulo de poeira e areia. Antes de proceder a lubrificação, a sujeira deve ser retirada.Para lubrificar a cremalheira (peça dentada) do parafuso macro e micrométrico e condensador, coloque uma pequena quantidade de vaselina neutra e após move-se para cima e para baixo a fim de espalha-la. Nunca force o parafuso macro e micrométrico que esteja emperrado ou duro. Para as partes expostas, é suficiente lavá-las usando tecido umedecido com água e sabão neutro.

TÉCNICAS BÁSICAS DE LIMPEZA Material de vidro: 1. 2. 3. 4. 5. Lavar com água e sabão Enxaguar com água corrente Enxaguar com água ou álcool acidulado Deixar escorrer e lavar com água destilada Secar com pano limpo.

Álcool acidulado: Álcool 96%............................................3 partes Ácido clorídrico ....................................1 parte Água acidulada: Água destilada ......................................3 partes Ácido clorídrico ou acético..................... 1 parte Para o passo n. 4 também pode utilizar-se: Dicromato de K .........................................................5 g Ácido sufúrico a 5% em água destilada ................250 ml

Para lâminas e lamínulas 1. Deixar repousar durante 24 horas na seguinte solução Dicromato de K ............................................20 g Ácido sulfúrico concentrado .........................20 ml Água destilada ........................................... 250 ml 2. Lavar em Água com sabão e deixar em água corrente durante 24 horas 3. Colocar a água destilada durante 24 h 4 Manter por tempo indefinido e, um recipiente fechado com álcool 70%

Para lâminas com corantes e bálsamo 1. Dissolver a quente 100 g de bicarbonato de K em 1 litro de água 2. Deixar esfriar a solução e adicionar gota a gota com um bastão de vidro 100 ml de ácido sulfúrico concentrado. 3. Deixar as lâminas e lamínulas submersas nesta mistura por 3 dias. 4. Após lavar com água corrente e passar a uma segunda diluição que se prepara como segue: Água corrente .....................................50 ml Soda (NaoH) ......................................10 gotas (em diluição saturada) 5. Permanecer nesta mistura durante 24 horaas para após lavar em água corrente e colocar em álcool a 70 %. Outra técnica: 1. Colocar o material na seguinte mistura: Água da torneira ..........................................1 parte Álcool 96 % ..................................................1 parte Xilol .............................................................1 parte 2. Permanecer na mistura por 24 horas Água atua nos corantes e resíduos Álcool atua na gordura do manejo e nos corantes alcoólicos Xilol separa a lâmina da lamínula

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Aula 4: PESAGEM BANHO-MARIA

Pesagem A construção das balanças analíticas assinalou um notável progresso nas últimas décadas. O aperfeiçoamento na construção das balanças analíticas foi marcado pelo esforço em aumentar a sensibilidade dos aparelhos e, ao mesmo tempo, simplificar e abreviar a operação de pesagem. Em nosso laboratório dispomos de balanças eletrônicas de um prato em grau analítico (4 casas decimais) e em grau semi-analítico (2 e 3 casas decimais). Recomendações gerais para o bom uso das balanças: - As balanças eletrônicas devem estar localizadas em bancadas apropriadas, planas e construídas em concreto, para evitar oscilações. - É sempre aconselhável que as balanças sejam ligadas 15 minutos antes do uso para ambientação e auto-calibração. - As balanças analíticas são extremamente sensíveis e deve-se ter o máximo cuidado no seu manuseio e manutenção. Eventuais sujidades devem ser imediatamente limpas. - Certifique-se da massa máxima que pode ser pesada na balança em questão. Essa operação é muito importante, pois uma massa excessiva pode danificar enormemente a balança. - Antes de iniciar o processo de pesagem, verifique se o prato da balança está limpo e se ela está zerada (“tarada”). Tare a balança com o recipiente no qual vai ser colocado o material a ser pesado. Adicione o material e faça a leitura diretamente no mostrador. Em hipótese alguma coloque o reagente diretamente no prato da balança. - Conserve-a limpa, tendo o cuidado para não deixar cair reagente sobre a balança. - Depois do uso, desligue a balança e faça o registro do uso no espaço apropriado. Exercício: - Determine a massa de um objeto qualquer (anel, brinco, lápis, caneta, etc) nas duas balanças do laboratório e anote as massas. - Pese, em um vidro de relógio, 0,250 g de açúcar.

Banho-maria Os aparelhos de banho-maria são utilizados em procedimentos laboratoriais sempre que se deseja um controle fino de temperatura. Desta forma, inúmeras reações importantes devem ser conduzidas neste tipo de aparelho. A maioria dos banhos-maria opera eficientemente em faixas de temperatura que variam entre a temperatura ambiente e 80ºC. Dicas importantes: - na maioria dos banhos, temperaturas menores que a ambiente não podem ser atingidas, uma vez que não possuem sistema de refrigeração. - a água usada no banho-maria deve, preferencialmente, ser do tipo destilada e deve ser trocada sempre que se tornar opaca ou começar a cheirar. Alternativamente pode-se adicionar algum agente antibacteriano a esta água. - para evitar evaporação, use sempre uma tampa.

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Aula 5: PIPETAS CAPELA DE EXAUSTÃO Existem vários tipos de pipetas, todas com a mesma finalidade: transferência de líquidos de um local para outro. A transferência pode ser volumétrica, como na maioria das pipetas, ou não, como no caso das pipetas de Pasteur. Os principais tipos de pipetas usadas em biotecnologia são: - pipetas sorológicas (graduadas): estas são as pipetas-padrão de uso diário. Normalmente são de vidro, mas também podem ser de plástico. Podem ser de vários volumes e são usadas rotineiramente na medida de líquidos. A autoclavagem deve ser evitada, pois prejudica a calibração. A secagem também deve ser cuidadosa, em temperaturas que não excedam 45ºC. Modo de usar: Depois de perfeitamente limpa e seca, a pipeta pode ser introduzida na solução a ser transferida, tendo o cuidado para evitar a formação de bolhas. A sucção deve ser feita com o auxílio de um pipetador* ou de uma pêra de sucção. Se a pipeta estiver úmida, deve-se “ambientar” a pipeta com o líquido a ser transferido e em seguida proceder a transferência. A pipeta escolhida deve ser o mais próximo possível do volume a ser medido. A parte externa da pipeta pode ser seca com o auxílio de um papel filtro. Em seguida, o líquido pode ser escoado da pipeta para o recipiente receptor e a última gotinha pode ser removida encostando-se a mesma contra a parede do recipiente. Nunca deve-se soprar a porção do líquido que fica retido na extremidade da pipeta. * Existem dezenas de pipetadores, portanto, você poderá encontrar aquele que sirva exatamente a sua necessidade. - pipetas volumétricas: o modo de utilização destas pipetas é o mesmo das pipetas sorológicas. Ao contrário das anteriores, medem apenas um volume fixo. - pipetas de Pasteur: são de vidro ou de plástico. Não são usadas para medir volumes, apenas para transferências mais grosseiras. São boas para preencher tubos para balanceamento de centrífugas e para remover e transferir sobrenadantes - micropipetas: são instrumentos que carregam volumes em microlitros (µL, sendo 1000 µL= 1 mL) por ação da capilaridade ou por bulbos de sucção. São usadas para medir volumes pequenos e altamente precisos. As mais comuns são as P1 (1 µL) P5 (até 5 µL,

P10 (entre 5 e 10 µL), P20 (entre 10 e 20 µL), P200 (entre 40 e 200 µL), P1000 (entre 200 e 1000 µL) e P5000 (entre 1000 e 5000 µL). Modo de usar: - coloque a ponteira (tip) adequada. - aperte o êmbolo da pipeta até o atingir o primeiro estágio. - coloque a ponteira dentro da solução a ser pipetada (segurando o êmbolo apertado). Solte o êmbolo vagarosamente, certificando-se para que a ponteira esteja sempre dentro da solução. Este movimento deve ser lento, para que a solução não “suba” muito rapidamente. Jamais se deve permitir que o líquido atinja o interior da micropipeta. Ele deve sempre ficar confinado na ponteira (ou tip). - Descarte a solução, empurrando o êmbolo. Na maioria das micropipetas o êmbolo deve ser empurrado duas vezes para liberar o conteúdo da ponteira. Empurre até que você sinta uma resistência e então empurre de novo, gentilmente. Esse empurrão final expele a última gotinha do volume e deve ser dado o mais suavemente possível para evitar a formação de aerossóis. Estas pipetas devem sempre ser manipuladas com extremo cuidado, pois são relativamente caras e frágeis. Devem ser calibradas a cada poucos meses durante o ano, dependo da freqüência de uso. Algumas podem ser calibradas no próprio laboratório, seguindo o procedimento sugerido pelo fabricante; outras devem ser calibradas por profissionais. Este tipo de pipeta JAMAIS PODE SER AUTOCLAVADA. No entanto, as ponteiras podem, portanto, podem ser utilizadas em operações que exijam esterilidade. Exercício: - praticar o emprego de pipetas sorológicas e micropipetas, pipetando 6 mL de água destilada com o auxílio da pipeta sorológica de 10 mL e 500 µL de água (ou 150 µL) com uma micropipeta (P1000 ou P200).

CAPELA DE EXAUSTÃO Os produtos químicos voláteis e aqueles que liberam vapores tóxicos devem ser manipulados, exclusivamente, em capelas de exaustão. As características recomendáveis para a construção de capelas, dentro dos padrões aceitáveis, são descritas a seguir: - as capelas devem ser construídas, preferencialmente, em aço inoxidável, porém é aceitável que sejam construídas em alvenaria com cúpula de aço inoxidável, para facilitar a limpeza. - a área máxima do balcão deve ser de 3 m x 0,80 m e altura de 85 cm. - as janelas devem possuir movimentação vertical e armação com contrapeso. - o sistema de escoamento de esgoto deve ser resistente a agentes corrosivos. - deve possuir uma entrada de ar auxiliar ou secundária, para manter a mesma vazão de ar com a janela fechada. - deve possuir um sistema de filtros funcionando. - deve possuir peitoril, para conter pequenos vazamentos. - o fluxo de ar de uma capela deve ser laminar e potente. Como usar uma capela de vapores químicos:

1.

2.

3. 4. 5.

Ligue a capela e verifique se a exaustão está funcionando (é possível ouvir ou sentir). Nem o ar condicionado nem o ventilador devem estar funcionando perto da capela, pois isso poderá interferir nas correntes de ar dentro da mesma. A janela deve estar abaixo da altura do queixo do manipulador! Abaixe a janela até a altura indicada na parte frontal da capela. Quanto mais baixa a altura, ou seja, quanto mais fechada a janela, mais proteção haverá. Trabalhe, no mínimo, 20 cm dentro da capela. Prenda os papéis e outros materiais leves. Eles podem ser sugados pelo sistema de exaustão. Não bloqueie as fendas de exaustão traseiras ou o espaço entre a borda dianteira de metal e a superfície de trabalho.

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Aula 6: PREPARO DE SOLUÇÕES E DILUIÇÃO Soluções O preparo de soluções é um procedimento extremamente importante para o Biotecnologista, pois do preparo correto das soluções dependerá o sucesso de todos os experimentos realizados. Solução é uma dispersão homogênea de duas ou mais espécies de substâncias. As soluções podem ser formadas por qualquer combinação dos 3 estados físicos da matéria: gases, líquidos e sólidos, porém são sempre constituídas de uma única fase. Nosso estudo se restringirá a soluções binárias líquidas, isto é, soluto sólido ou líquido, dissolvido em solvente líquido. Existem várias classificações para as soluções, a citar: - Classificação 1: solução saturada, não-saturada e super-saturada, - Classificação 2: soluções diluídas e não diluídas, - Classificação 3: soluções moleculares e iônicas, - etc. No entanto, estudar os diferentes tipos de soluções não é o objetivo deste componente e por isso ficaremos restritos à parte prática. Informações teóricas úteis no preparo de soluções: - Concentração simples: é o quociente entre a massa do soluto (em gramas) e o volume de solução (em litros). C = m/V (em gramas/litro) - Molaridade: é o quociente entre o número de moles do soluto e o volume de solução (em litros). M = n/V (em moles/litro), sendo n = m/MM m = massa MM = massa molar

- Normalidade: quociente entre o número de equivalentes-grama (e1) do soluto e o volume de solução, em litros. N = m/E1.V, sendo E=MM/valência (número de H ou OH ionizáveis) E = Equivalente grama m = massa V = volume (litro) - Relação entre molaridade (M) e normalidade (N) N = M.x, sendo x o número de H ou OH ionizáveis.

- Soluções em porcentagem As soluções em porcentagem são baseadas em 100 mL (ou, ocasionalmente, em 100 g). Quase todas as soluções que você calcular serão soluções (p/v), nas quais o peso em grama do pó é misturado com o volume em mL. No entanto, existem 3 modos de de expressar a concentração em porcentagem: 1. porcentagem de peso por volume (p/v). Gramas do soluto por 100 mL do solvente. Exemplo: NaCl 20% (p/v) - dissolver 20 g de NaCl em um dado volume de água (aprox. 60 mL) e completar o volume em balão volumétrico de 100 mL. 2. porcentagem por volume (v/v). mL do solvente por 100 mL de solução. Usado para diluir uma solução estoque concentrada. Diluir uma solução de SDS 10% até 1% (v/v) - 10 mL da solução concentrada + 90 mL de água. 3. porcentagem por peso (p/p). Gramas do soluto por 100 g do solvente. Exemplo: Solução de sacarose a 10% (p/p) – pesar 10 g de sacarose e adicionar 90 mL de água.

Modo de preparar soluções: 1. Faça os cálculos apropriados e descubra a massa do soluto a ser pesada. 2. Pesar em balança analítica, em béquer de tamanho pequeno (40 – 80 mL), a massa calculada. 3. Dissolver o sólido com água destilada. Pode-se utilizar um bastão de vidro para auxiliar nessa operação. IMPORTANTE: Não esquecer do volume final da solução no momento de adicionar água ao béquer. Esse volume adicionado deve estar distante do volume final da solução. 4. Transferir o conteúdo do béquer para o balão volumétrico apropriado. O bastão de vidro pode ser utilizado com “direcionador de fluxo”. 5. Realizar a “lavagem” do béquer com água destilada, sem exceder o volume final da solução, para assegurar que todo o sólido pesado seja transferido ao balão.

6. Ajustar o volume final com o menisco do balão volumétrico. Fechar o balão volumétrico com a tampa apropriada e homogeneizar. 7. Estocar em recipiente adequado e devidamente identificado. Toda solução, uma vez preparada, deve ser CORRETAMENTE identificada. Esta identificação deve ser feita com fica adesiva apropriada e em tamanho que permita uma fácil visualização. Nesta identificação deve constar: - nome da solução (por exemplo, Hidróxido de sódio), - concentração da solução (0,1 M; 20%, etc), - data em que foi preparada, - responsável pelo preparo (Fulano de Tal), - cuidados especiais (por exemplo, “manter sob refrigeração”) OBS 1. Em alguns casos, dependendo do grau de precisão exigido pela solução, pode-se utilizar uma proveta ao invés de balão volumétrico. OBS 2. Em outros casos, como em meios de cultura para microbiologia, a solução pode ser preparada simplesmente adicionando-se o volume de água (medido em proveta) ao béquer contendo o material pesado.

Diluição Diluir uma solução significa adicionar a ela um solvente puro e inúmeras vezes essa operação será fundamental em procedimentos químicos, bioquímicos, microbiológicos, etc. Lei geral da diluição: C1V1 = C2V2 Sendo, C1= concentração da solução inicial C2= concentração da solução final (nova solução) V1= volume da solução inicial a ser medido (esta é a incógnita da equação!!!) V2= volume final (volume que se deseja preparar) Exercícios: 1. Preparar 100 mL de uma solução 0,1M do sal fictício XY, cuja massa molar é 30 g, utilizando balão volumétrico. 2. Preparar 40 mL de uma solução 5% (p/v) do sal fictício XY, utilizando proveta para aferição do volume. 3. Preparar 10 mL de uma solução 0,2 M do sal fictício XY a partir de uma solução concentrada a 1M.

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Aula 7: UTILIZAÇÃO DE PROTOCOLOS, CATÁLOGOS E INTERPRETAÇÃO DE RÓTULOS DE REAGENTES. ARMAZENAMENTO DE PRODUTOS QUÍMICOS

Protocolos Os protocolos são as “receitas” que devemos usar para a realização de um experimento. Um protocolo pode ser obtido de: - outro pesquisador/aluno/colega de laboratório: o melhor lugar para conseguir um protocolo é de outro investigador d laboratório, pois o protocolo será apropriado para os recursos e a especialidade do laboratório, podendo conter detalhes importantes sobre os detalhes do experimento. - um livro de protocolos: existem muitos manuais de laboratórios disponíveis comercialmente, com protocolos simples e claros para muitos campos da biotecnologia. Os manuais do laboratório ou do curso também são uma boa fonte para protocolos simples. A desvantagem de protocolos comerciais é que você terá que adequá-lo ao seu laboratório. - seção de “materiais e métodos” dos artigos científicos: esse é o lugar menos confiável para achar um protocolo. Essas seções são notórias pela ausência de detalhes que são deixados de lado devido a problemas de espaço ou por “outros motivos”. Quando você for fazer um experimento a partir de um protocolo novo algumas considerações são importantes: - leia o protocolo atentamente para ver se ele faz sentido para você. Faça o experimento mentalmente, passo a passo. Certifique-se que você está, de fato, entendo cada passo. - mude o protocolo conforme suas necessidades e reescreva-o. Isso serve para tornar os passos mais compreensíveis ou alterar algum equipamento conforme a necessidade. “Decodifique” a linguagem do protocolo para a sua linguagem. - prepare todos os reagentes listados no protocolo e certifique-se de ter tudo o que precisa. Certifique-se que todos os reagentes estão preparados e na concentração exigida. Assegure-se que os equipamentos que você precisará não estarão sendo usados quando você precisar deles! - siga o protocolo exatamente na primeira vez que fizer o experimento. Se não der certo, repita, e só então, em não dando certo novamente, faça alterações. Tente não ser uma variável do experimento.

- modifique o protocolo baseado em sua própria experiência. Isso só acontece depois de algum tempo de prática. É importante anotar as modificações realizadas e reescrever o protocolo. Exemplos de protocolos: Exemplo 1. Método de determinação de atividade proteásica

1. Adicionar 150 L de extrato enzimático a tubos de microcentrífuga (eppendorfs) 2. 3. 4. 5.

contendo 250 L de uma solução-substrato com 2% de azocaseína em tampão fosfato de sódio 0,05 M e pH 7,0 (1). Incubar a mistura a 37ºC por 30 minutos e no final deste período adicionou-se ácido tricloroacético (TCA) a 10% em cada tubo. Após 15 minutos, necessários para assegurar completa precipitação de fragmentos maiores de azocaseína, centrifugar os tubos a 14000 g por 5 minutos. Transferir 1 mL do sobrenadante para um tubo de ensaio contendo 1 mL de hidróxido de sódio 1,0 M. A absorbância desta solução é determinada a 440 nm em espectrofotômetro Para cada amostra enzimática prepara-se um branco, misturando, nesta ordem, enzima, TCA e substrato azocaseína.

Exemplo 2: o mesmo procedimento, mas apresentado de outra forma. Em 250 L de uma solução-substrato com 2% de azocaseína em tampão fosfato de sódio 50 mM e pH 7,0 adicionaram-se 150 L de extrato enzimático. A mistura foi incubada a 40ºC por 40 minutos e no final deste período adicionou-se ácido tricloroacético (TCA) a 10% em cada tubo. Para cada amostra enzimática preparou-se um branco, misturando, nesta ordem, enzima, TCA e substrato azocaseína. Preparou-se, também, um reagente branco substituindo a enzima por solução tampão. Após assegurada a completa precipitação de fragmentos maiores de azocaseína, centrifugou-se os tubos a 14000 g por 5 minutos. Transferiu-se 1 mL do sobrenadante para um tubo de ensaio contendo 1 mL de hidróxido de sódio 1,0 M. A absorbância desta solução foi determinada a 440 nm em espectrofotômetro.

Catálogos de reagentes Os catálogos de reagentes são auxiliares extremamente úteis em um laboratório de biotecnologia. Eles são fornecidos pelos fabricantes ou pelos vendedores dos reagentes. Cada empresa fabricante de reagentes possui o seu catálogo, atualizado anualmente. Os catálogos fornecem informações técnicas importantes sobre os reagentes, soluções, enzimas, equipamentos e todos os produtos fabricados/vendidos pela empresa. Nos catálogos são encontradas informações como: fórmula química, peso molecular, densidade, ponto de fusão e ebulição, coeficiente de extinção molar, toxicidade, incompatibilidades, etc.

Interpretação de rótulos de reagentes Os rótulos de reagentes fornecem algumas informações que orientam o biotecnologista no preparo do reagente. Fornecem uma quantidade menor de informações que o catálogo, mas na falta dele oferece informações básicas importantes (fórmula, peso molecular e densidade). Além disso, observando-se o rótulo pode-se ter uma idéia da toxicidade e dos cuidados que se deve ter ao manusear o reagente. À seguir, alguns pictogramas normalmente encontrados em rótulos de reagente

Armazenamento de produtos químicos Para armazenamento de produtos químicos, deve-se considerar as características de todas as substâncias, prevenindo, desta forma, a ocorrência de eventuais acidentes no laboratório. Estes produtos devem ser agrupados por espécies químicas e não por ordem alfabética. Assim, é possível separa-los em categorias: - inflamáveis, - tóxicos, - explosivos, - corrosivos, - oxidantes, - gases.

Dicas gerais: - os solventes perigosos (clorofórmio ou éteres não estabilizados) ou inflamáveis (éteres, cetonas, ésteres) não devem ser estocados em grandes quantidades. - anotar a data de chegada de todos os reagentes e deixar apenas a quantidade mínima destas substâncias no laboratório, verificando a data de validade de cada substância.

- armazenar sempre nos recipientes ou frascos originais. - armazenar os agentes corrosivos em uma prateleira baixa ou em armários especialmente separados para tais substâncias. - Os produtos químicos devem ser armazenados em área fria, seca e ventilada. - Não transformar as bancadas em armários!!

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TÉCNICA DA UFRGS Curso de Biotecnologia Fundamentos de Laboratório Professor: Charley Christian Staats Aula 8: SEPARAÇÃO SÓLIDO/LÍQUIDO (decantação e filtração) LAVAGEM DE MATERIAIS DE LABORATÓRIO Separação sólido líquido A – Decantação Um dos métodos mais simples de separação de misturas heterogêneas em laboratórios é a decantação. A decantação serve para a separação de misturas heterogêneas, sejam misturas heterogêneas sólido-líquido ou misturas heterogêneas líquido-líquido. No caso da decantação sólido-líquido, deixa-se o sólido sedimentar no fundo do béquer e então, cuidadosamente, verte-se a maior parte do líquido para outro béquer, com auxílio de um bastão de vidro, conforme a figura 1.

B- Filtração Um dos problemas comuns em laboratórios é separar um líquido de um sólido. Frequentemente utiliza-se a filtração para este fim. A filtração consiste na separação de um

sistema bifásico fazendo-se passar a fase líquido (filtrado) através de um meio que retenha a fase sólida (precipitado). O filtro mais econômico é o de papel. Uma das maneiras de preparar o papel filtro é a seguinte: - o papel filtro cortado de forma circular é dobrado pela metade e depois esta metade é novamente dobrada, adquirindo aproximadamente um quarto do tamanho original. A segunda dobra deve ser feita de maneira que fique um intervalo de 5 mm entre as duas pontas, como na figura 2.1.

- Em seguida, abre-se o papel de tal maneira que adquira a forma de um cone e coloca-se no funil de modo que o corte no papel fique aderido ao vidro. Par uma rápida filtração, o papel deve ser ajustado no funil de modo que o ar não penetre entre o papel e o funil. Para isso, coloca-se um pouco de água destilada sobre o papel para ajustá-lo às paredes do funil, conforme a figura 3. Quando o funil estiver bem selado, o líquido ficará retido na coluna do funil e o seu peso ajudará a puxar o líquido através do papel.

- A fim de não perder material, deve-se usar a técnica da figura 4. Cuide para que a superfície do líquido dentro do funil não alcance o topo do papel.

- O processo de filtração pode ser acelerado através de uma filtração por sucção, a chamada filtração a pressão reduzida. Como neste processo a sucção é forte, é necessário um funil especial, chamado funil de Büchner. Neste caso, o papel não é dobrado. O papel, de forma circular, é cortado de maneira que fique a meia distância entre a última linha de furos e a parede do funil, nunca podendo “subir pelas paredes” do mesmo, o que causaria vazamentos. Para a obtenção do vácuo necessário para este tipo de filtração pode se usar uma trompa d’água ou um bomba de vácuo. (figura 5).

Lavagem de materiais de laboratório A lavagem de materiais (vidrarias e outros instrumentos) é um procedimento extremamente importante em qualquer laboratório. Desta operação, certamente, dependerá o sucesso de todos os experimentos futuramente realizados com a vidraria em questão. Todo material utilizado em algum experimento, depois de devidamente descartado o resíduo do experimento, deverá ser cuidadosamente lavado com água corrente em abundância (água comum), detergente e escova/esponja. Depois disso, deverá ser extensivamente enxaguado com água destilada. Só depois dessas operações é que o material poderá ser colocado no local de secagem.

- existem no mercado várias escovas próprias para lavagem de materiais de laboratório e você deverá escolher aquela que melhor se adaptar ao material a ser lavado. - na lavagem dos materiais é comum a utilização de detergentes de cozinha (detergente comum), principalmente por estes serem de preços mais acessíveis. No entanto, existem detergente próprios para a lavagem de materiais de laboratório. No mercado são encontradas várias marcas diferentes com os mais variados preços. O mais utilizado é o Extran, que pode ser encontrado na forma alcalina, ácida e neutra, a qual será escolhida conforme o tipo de material a ser lavado. - é prática comum durante as operações de lavagem o laboratorista recorrer ao artifício de deixar o material “de molho”, ou seja, imerso em uma solução de água com detergente por algum tempo, para facilitar a operação de lavagem. - em alguns casos, quando o material a ser lavado está com resíduos firmemente aderidos a sua superfície, o laboratorista pode recorrer ao emprego de soluções extremamente corrosivas, como a conhecida Solução Sulfocrômica. Essa solução é composta por ácido sulfúrico concentrado e dicromato de potássio e é efetiva na limpeza de materiais que estejam sujos com matéria-orgânica (proteínas, açúcares, etc). No entanto, o uso deste tipo de solução tem sido desaconselhado, principalmente pelos potencias efeitos carcinogênicos do cromo em humanos, o que torna a sua manipulação altamente arriscada. Além disso, essa solução é muito corrosiva e exige atenção redobrada durante a manipulação. - uma vez limpo o material, este deverá ser abundantemente enxaguado com água destilada. Essa operação é crítica, pois nenhum resíduo do material utilizado no experimento ou durante a lavagem poderá permanecer presente no material, sob risco de interferir nos futuros experimentos. Portanto, não economize na água destilada. Quando trabalha-se com proteínas, é aconselhável, antes desta operação de enxágüe com água destilada, realizar um enxágüe preliminar com hidróxido de sódio 0,1 M. - em experimentos de Biologia Molecular é aconselhável, em sendo possível, não reutilizar os materiais que são descartáveis, pois quantidades-traço de DNA poderão não ser devidamente eliminadas pela lavagem e acabaram interferindo nas análises seguintes.

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Aula 9: ESTERILIZAÇÃO E ASSEPSIA (autoclaves, capela de fluxo laminar, luz UV, estufas e gases) Em muitas operações utilizadas em Biotecnologia é estritamente necessário que se trabalhe em condições estéreis, ou seja, sem a presença de nenhum organismo contaminante, ou, no máximo, com a presença de apenas um organismo (o seu organismo de trabalho). Autoclaves As autoclaves funcionam submetendo o material a altas temperaturas (maiores que 100ºC), que são atingidas graças ao aumento da pressão interna do equipamento. Se você não estiver familiarizado com a operação da autoclave em questão, peça auxilio a um colega que já tenha trabalhado com a autoclave. IMPORTANTE: apesar de o princípio de utilização de todas as autoclaves ser o mesmo, cada autoclave possui características próprias e por isso, na primeira vez que você for usa-la, é importante que alguém o acompanhe. Dicas de utilização: - Verifique se o frasco ou recipiente que você vai autoclavar é resistente à temperatura que será usada. Em geral, utiliza-se temperatura de 121ºC por 15 – 30 minutos. - Deixe livre pelo menos, um quarto do volume do frasco ou do recipiente. Assim haverá espaço para que os líquidos fervam e, mais do que isso, é o ar presente neste espaço o responsável pela esterilização (o princípio pelo qual a autoclave elimina microrganismos é o calor úmido). - Certifique-se que as tampas estejam frouxas para prevenir que o aumento da pressão interna quebre o frasco e para permitir a entrada do ar úmido. - Cole um pedaço de fita para autoclave (se o seu laboratório tiver a fita) em cada item a ser autoclavado. Esta fita é sensível ao calor e mostrará alteração de cor somente após o processo. Modo de uso da autoclave: - ligue a autoclave na rede elétrica, certificando-se da voltagem correta. - coloque água no interior da autoclave. A quantidade de água varia de equipamento para equipamento, mas, em geral, existe uma indicação do nível mínimo de água que a autoclave deve conter. É fundamental que a resistência esteja toda coberta pela água. Essa

operação é fundamental, se ela não for corretamente realizada a resistência da autoclave será destruída durante o processo. - ligue a chave seletora da autoclave no “no máximo” para que a água comece a aquecer. Essa operação pode ser feita alguns minutos antes de o seu material estar pronto, para que no momento de colocar o material a água já esteja quente. Isso fará você ganhar alguns minutos. - coloque o material a ser autoclavado no cesto da autoclave, não esquecendo dos cuidados que foram explicados acima. - feche e aperte bem a tampa da autoclave, mas não ao ponto de ter dificuldade na hora de abri-la novamente. Certifique-se que a válvula lateral, responsável pelo controle da pressão ESTEJA ABERTA NESTE MOMEMENTO. - quando a saída de vapor d’água for perceptível, indicando que a saturação do ar interno com água foi atingida, feche a válvula lateral. Agora a autoclave está completamente vedada e a pressão e a temperatura internas começarão a subir (isto pode ser acompanhado pelo manômetro. - quando a temperatura desejada for atingida, coloque a chave seletora no médio e comece a contar o tempo. - passado o tempo devido, desligue a chave seletora e espere a autoclave retornar a temperatura ambiente naturalmente. NÃO ABRA VÁLVULA NENHUMA! - quando a pressão baixar completamente a autoclave pode ser aberta. Mas tenha cuidado, pois o material estará extremamente quente. Use luvas termorresistentes. Estufas A esterilização de alguns materiais também pode ser feita em estufas. Neste caso, em virtude de o calor seco ser menos eficiente que o calor úmido, empregam-se temperaturas mais elevadas e tempos mais longos. O material a ser esterilizado, em geral utensílios, deve ser recoberto com papel. Esterilização com gases Uma forma de esterilizar materiais, principalmente em experimentos de cultura vegetal, é utilizar gases com atividade antimicrobiana. Utilizam-se pastilhas de formalina (formaldeído) que são colocadas em uma câmara fechada juntamente com o material a ser esterilizado. Com a sublimação da pastilha libera-se o gás responsável pela esterilização. Capelas de fluxo laminar Em virtude de o ar atmosférico estar cheio de poeira e de microrganismos é necessário trabalhar em um ambiente que esteja livre destes agentes contaminantes. Uma alternativa interessante contornar este problema é trabalhar em uma capela de fluxo laminar, que promove a filtração e a recirculação do ar no ambiente de trabalho. O fluxo de forma uma “cortina” que impede a passagem de ar externo para dentro da capela e de dentro para fora. Isso protege o manipulador do conteúdo da capela e protege o experimento do ambiente externo. Modo de trabalho: - antes de iniciar o trabalho na capela de fluxo laminar ligue a lâmpada ultravioleta que existe na capela. Este tipo de luz possui atividade microbicida, ou seja, elimina os microrganismos que possam estar presentes na capela (Nota: apesar de existirem

controvérsias quanto a eficiência deste procedimento, ele ainda é amplamente utilizado). A lâmpada deve ficar acesa por aproximadamente 15 minutos, durante os quais você não deverá colocar as mãos dentro da capela, pois a luz UV provoca sérias queimaduras. - Desligue a lâmpada UV e ligue a circulação de ar da capela. - Baixe o vidro da abertura da capela. - Limpe a superfície da capela com etanol 70%. - Coloque o material para dentro da capela. - Inicie o trabalho. Dicas importantes: - nunca obstrua o fluxo de ar da capela com papéis, instrumentos ou equipamentos. - se precisar colocar uma tampa estéril esterilizada na superfície da capela, coloquea virada para vaixo. - evite movimentos com as mãos para dentro e para fora da capela. - evite usar fogo dentro da capela, apesar de isso, às vezes, ser necessário.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TÉCNICA DA UFRGS Curso de Biotecnologia Fundamentos de Laboratório Professor: Charley Christian Staats Aula 10: PURIFICAÇÃO DE ÁGUAS (água destilada, deionizada e ultra-pura) A água é um importante componente das soluções e não simplesmente um líquido onde se dissolvem as coisas. A qualidade da água, a composição e o pH podem afetar drasticamente os experimentos. Não faltam exemplos de experimentos que não apresentarem os resultados esperados em virtude da má qualidade da água utilizada. Existem várias classificações gerais da qualidade da água de acordo com seu grau de pureza: 1. Água de torneira: a qualidade dessa água varia muito e sua composição depende da localização geográfica da fonte, da época do ano, da quantidade de chuva, da composição dos canos, etc. Alguns minerais podem inibir reações enzimáticas ou impedir o crescimento celular. Por isso, ela não deve ser usada, a não ser para lavagem de vidrarias e utensílios de laboratório. 2. Água com grau de laboratório: esta é a água adequada para preparar soluções e fazer os experimentos. Ela foi previamente tratada por algum dos métodos conhecidos, a citar: Água destilada: A destilação é um processo há muito estabelecido para a purificação da água, no qual a água é aquecida até evaporar e o vapor é condensado e recolhido. O equipamento é relativamente econômico, mas tem um grande consumo de energia – usa tipicamente 1kW de eletricidade por litro de água produzida. Dependendo do design do destilador, a água destilada pode ter uma resistividade de aproximadamente 1 MΩ-cm e será estéril quando acabar de ser produzida se for utilizado equipamento especificamente concebido para o efeito, mas não continuará estéril sem um armazenamento muito cuidadoso. Além disto, impurezas voláteis como dióxido de carbono, sílica, amoníaco e uma variedade de compostos orgânicos passarão para a água destilada. Quais são as desvantagens da destilação? A destilação produz água purificada lentamente. Não é um processo de resposta a pedido. Por este motivo, é necessário destilar uma determinada quantidade de água e armazená-la para utilizar mais tarde. Este armazenamento da água destilada pode constituir um problema se o reservatório em que a água é armazenada não for fabricado num material

inerte. Os íons ou plastificantes serão lixiviados do reservatório e irão recontaminar a água. Além disto, as bactérias desenvolvem-se muito bem em água que esteja arada durante algum tempo. Em áreas de água dura, os destiladores têm de ser limpos frequentemente com ácido, devido à acumulação de incrustações, a não ser que a água de alimentação seja pré-tratada. Água deionizada Neste sistema utilizam-se colunas de troca iônica, contendo tanto resinas trocadoras de cátions quanto resinas trocadoras de ânions, as quais removem os íons inorgânicos da água (Ca+2, Mg+2, Cl-1). Em seguida efetua-se uma destilação normal, para remover os íons restantes e materiais orgânicos. As colunas de troca iônica devem ser trocadas frequentemente. Água ultra-pura (“água Milli-Q”) Alguns laboratórios têm necessidades especiais em relação à água e exigem águas de alto grau de pureza. Esta água é obtida pela combinação de processos de osmose reversa (a água passa por uma membrana semipermeável por onde as impurezas não podem passar) com deionização. A ultrafiltração, a adsorção em carvão ativo para eliminar matéria orgânica e a luz ultravioleta podem ser usados em alguns equipamentos para complementar a purificação deste tipo de água. Experimentos de Biologia molecular, Bioquímica e análises de traços de elementos são exemplos de aplicação deste tipo de água. Princípios de osmose reversa A osmose reversa (OR) é um processo que resolve muitos dos problemas da destilação e da troca iônica. Para explicar a osmose reversa, vejamos primeiro a osmose. Este é um processo natural que ocorre sempre que uma solução diluída é separada de uma solução concentrada por uma membrana semi-permeável. A água, levada por uma força causada pela diferença na concentração – a pressão osmótica – passa através da membrana para a solução concentrada. O fluxo de água continua até a solução concentrada ficar diluída e a contra-pressão impedir a continuação do fluxo através da membrana (equilíbrio osmótico). Quando é aplicada uma pressão superior à pressão osmótica no lado da membrana onde se encontra a maior concentração, o sentido normal do fluxo osmótico é invertido, a água pura passa da solução concentrada através da membrana (impermeável às impurezas) e é assim separada dos seus contaminantes. Este é o princípio básico da osmose reversa.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TÉCNICA DA UFRGS Curso de Biotecnologia Fundamentos de Laboratório Professor: Charley Christian Staats Aula 11: CENTRIFUGAÇÃO A finalidade de uma centrífuga é separar substâncias imiscíveis em uma mistura heterogênea. E muitos experimentos realizados em Biotecnologia utilizam-se de centrífugas. São usadas para concentrar proteínas, extrair DNA e separar péletes de células. Importante: a presença de centrífugas em todos os cantos do laboratório não deve ser motivo de descuido. Ela é um instrumento importante e complicado que pode ser facilmente danificado e causar ferimento ferimentos no manipulador, quando for mal utilizada. Existem vários tipos de centrífugas e nos laboratórios elas são normalmente chamadas pelo nome do fabricante. As centrífugas de alta velocidade são construídas com unidade de refrigeração, necessárias devido ao calor gerado pela alta velocidade. Outras centrífugas estão disponíveis tanto em modelos refrigerados como não refrigerados. O frio também serve para preservar a amostra que está sendo centrifugada. Os principais tipos de centrífugas são: - Centrífuga de bancada, - Microcentrífuga, - Centrífuga de alta velocidade, - Ultracentrífuga Regras gerais de trabalho na centrífuga: - não coloque para centrifugar materiais radioativos, com risco biológico ou infecciosos antes de ter certeza de que está usando o material adequado. - Equilibre todos os tubos com seus suportes, tampas, proteção e pinos. Não equilibre somente os tubos e sim todo o sistema. Se for preciso usar um tubo para equilibrar encha- o com água. - Se houver folha de registros, seja meticuloso ao anotar as informações. Isso é importante para manter um controle sobre o uso do equipamento. - Limpe a centrífuga toda vez que usa-la. Use um pano úmido. - Conheça as limitações de velocidade da centrífuga e do rotor e não ultrapasse esses limites. - Use os tubos e os suportes apropriados. Isso é especialmente importante em centrifugações de alta velocidade. Os tubos não devem ficar frouxos nem apertados demais nos suportes ou no rotor. - Preencha os tubos até aproximadamente 2 cm da borda. Se você encher demais poderá ter vazamentos.

- Não use tubos com qualquer tipo de rachadura. Descarte estes tubos imediatamente. - Não se esqueça de tampar o rotor. - Feche a tampa das centrífugas refrigeradas no intervalo de uso para evitar condensação. - Remova as amostrar da centrífuga imediatamente. Nunca deixe as amostras paradas por muito tempo. O pélete pode se tornar disperso. Como centrifugar 1. escolha os tubos apropriados ao volume e à natureza do que você vai centrifugar. Use o menor número de tubos possível e procure usar aqueles de volume mais próximo ao do que você precisa. 2. escolha uma centrífuga e um rotor apropriados a sua amostra. Saiba a que velocidade a amostra deve centrifugada e se deve ser refrigerada ou não. 3. Equilibre os tubos. Cada tubo deve ser centrifugado com um tubo do mesmo peso colocado do lado oposto. O mesmo deve ser feito para todo rotor e toda centrífuga. Importante: somente os tubos colocados frente a frente devem ser de mesmo peso. Como equilibrar os tubos: - tubos de microcentrífuga podem ser ajustados pelo volume n não pelo peso. - tubos de ultracentrífuga e centrífugas de alta velocidade devem ser pesados individualmente em uma balança. 4. coloque os tubos na centrífuga, sempre na mesma orientação. Se ele tem uma assimetria, tal como uma aba na borda, coloque sempre cada tubo no suporte da mesma maneira. Dessa forma você saberá onde procurar o pélete. 5. Coloque a cobertura no rotor. 6. Feche a tampa da centrífuga. 7. Programe a centrífuga, ajustando a velocidade de aceleração, o tempo, a temperatura e velocidade de desaceleração. 8. Inicie o processo. Espere até que a centrífuga atinja a velocidade programada, só depois se ausente da sala, pois se houver algum problema de desbalanço esse geralmente aparece neste intervalo de tempo. 9. Quando a centrifugação terminar, remova os tubos cuidadosamente para não misturar o pélete novamente. 10. Remova o sobrenadante. Isso pode ser feito vertendo-se o líquido cuidadosamente ou por aspiração com micropipeta ou pipeta de Pasteur.

Como determinar a velocidade da centrífuga A velocidade da centrífuga será dada como força gravitacional (g) ou rotações por minuto (rpm). A força g é também chamada RCF (relative centrifuge force- força centrífuga relativa). Os protocolos normalmente determinam a velocidade em g, pois esta pode ser reproduzida facilmente, ao contrário das rotações por minuto.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TÉCNICA DA UFRGS Curso de Biotecnologia Fundamentos de Laboratório Professor: Charley Christian Staats Aula 12: Potenciometria (medida de pH) Em inúmeros casos, dentro da área de Biotecnologia, é fundamental conhecer o potencial Hidrogeiônico (pH) do material em questão. E isso normalmente deve ser realizado de forma rápida e precisa. Para tanto, utiliza-se um aparelho chamado potenciômetro (pHmetro), que permite a medida direta do pH das soluções (materiais) em questão. A grande maioria dos pHmetros utilizados em Biotecnologia utiliza eletrodos indicadores de vidro, de forma combinada , ou seja, o eletrodo indicador e o eletrodo de referência estão combinados em um única peça. Procedimentos para medida de pH utilizando pHmetros equipados com eletrodos indicadores de vidro Antes da medição: 1. remover a capa plástica de vedação do orifício usado para enchimento do eletrodo de modo a estabelecer equilíbrio com a pressão atmosférica; 2. retirar a capa plástica que protege o bulbo de vidro durante a estocagem, ela contém KCl 3M que garante a hidratação da membrana. Enxaguar o eletrodo com água destilada para retirar resíduos e eventuais cristalizações do sal no eletrodo; 3. Verificar a necessidade de completar o nível da solução interna com a solução de enchimento, normalmente KCl 3M saturado com AgCl. 4. Calibrar o eletrodo com as soluções-tampão escolhidas conforme a faixa de trabalho desejada. Entre uma solução e outra, lavar o eletrodo com água destilada. A medida é direta e o valor de pH é aquele em que houver estabilização do valor apontado no display. IMPORTANTE: O eletrodo é uma peça extremamente frágil e cara. Por isso manipule-o cuidadosamente. Use apenas os dedos na sua limpeza. Na medição: 1. mergulhar o eletrodo de modo que sua junção fique abaixo do nível da solução a ser medida.
IMPORTANTE: O pH varia em função da temperatura. E existe uma grande variação entre os aparelhos no que diz respeito ao ajuste de temperatura, por isso procure se informar da forma com que o ajuste deve ser feito no aparelho que você irá utilizar.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TÉCNICA DA UFRGS Curso de Biotecnologia Fundamentos de Laboratório Professor: Charley Christian Staats Aula 13: ESPECTROSCOPIA VISÍVEL/ULTRAVIOLETA A espectroscopia visível/ultravioleta é uma ferramenta amplamente utilizada em experimentos químicos, bioquímicos, microbiológicos, etc, uma vez que inúmeras metodologias analíticas se baseiam na absorção da luz polarizada pelas espécies analisadas. FUNDAMENTO A Espectroscopia pode ser conceituada como um procedimento analítico através do qual se determina a concentração de espécies químicas mediante a absorção de energia radiante (luz). A luz pode ser entendida como uma forma de energia, de natureza ondulatória, caracterizada pelos diversos comprimentos de onda (, expressos em nm, normalmente) e que apresenta a propriedade de interagir com a matéria, sendo que parte de sua energia é absorvida por elétrons da eletrosfera dos átomos constituintes das moléculas. Uma solução quando iluminada por luz branca, apresenta uma cor que é resultante da absorção relativa dos vários comprimentos de onda que a compõem. Esta absorção, em cada comprimento de onda, depende da natureza da substância, de sua concentração e da espessura da mesma que é atravessada pela luz.

Esquema simplificado de um sistema espectrofotométrico - a luz emitida por uma fonte (normalmente uma lâmpada de tungstênio para comprimentos de onda no visível e de Deutério no ultravioleta) passa por um monocromador que seleciona apenas o comprimento de onde desejado (luz monocromática). A luz atinge a amostra, de comprimento de onde b. Alguma quantidade de luz é absorvida de forma que I0 > I. A luz que não é absorvida é detectada por uma célula fotoelétrica e medida em um galvanômetro. Quando a luz (I0) é absorvida pela amostra a sua intensidade diminui (I).

b

Io

I

Relação entre cor observada e cor absorvida Comprimento de onda Cor absorvida (nm) 380 – 440 Violeta 440 – 500 Azul 500 – 550 Verde 550 – 580 Amarelo 580 – 620 Laranja 620 – 680 Vermelho 680 - 780 Roxo

Cor observada Amarelo Laranja/vermelho Roxo/violeta Violeta/azul Azul Azul/verde Azul

A lei de Beer A Lei de Lambert-Beer é a lei que rege a espectroscopia e diz o seguinte: a absorbância é proporcional à concentração da espécie química absorvente, sendo constantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e demais fatores. Verifica-se uma relação linear entre absorbância ou densidade ótica e concentração, e de uma relação logarítmica entre transmitância e concentração. A lei de Beer: A = a.b.c sendo A= Absorbância (adimensional – sem unidade) a = coeficiente de extinção molar (constante) b= espessura atravessada pelo feixe luminoso c= concentração

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