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Ensaios biológicos para avaliação de segurança

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Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada

Journal of Basic and Applied Pharmaceutical Sciences

Rev Ciênc Farm Básica Apl.,2009;30(1):19-30 ISSN 1808-4532

Ensaios biológicos para avaliação de segurança de produtos cosméticos
Chorilli, M.1; Tamascia, P.2; Rossim, C.2; Salgado, H.R.N.3*
Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Vida, Pontifícia Universidade Católica de Campinas, PUCCAMP, Campinas, SP, Brasil. 2 Curso de Farmácia, Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade Metodista de Piracicaba, UNIMEP, Piracicaba, SP, Brasil. 3 Departamento de Fármacos e Medicamentos, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista, UNESP, Araraquara, SP, Brasil.
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Recebido: 07/01/2009 / Aceito: 25/05/2009

RESUMO Apesar de não ser desejável, alguns produtos cosméticos podem apresentar reações adversas aos usuários. Tais efeitos, muitas vezes, podem ser decorrentes de fatores individuais ou até mesmo pelo uso inadequado do produto. Logo, os ensaios biológicos para avaliação de segurança devem preceder a colocação do cosmético no mercado. Historicamente, estes ensaios sempre foram realizados in vivo, em animais, uma vez que podem ser utilizados para avaliar grande parte dos riscos potenciais envolvidos, seja irritação, alergia ou efeitos sistêmicos; todavia, atualmente alguns centros de pesquisa estão adotando alternativas in vitro aos ensaios com animais. Esta revisão enfatiza a necessidade de realização de ensaios biológicos para avaliação de segurança de produtos cosméticos, bem como apresenta os principais testes in vivo e in vitro empregados, abordando a necessidade de aplicar-se métodos alternativos aos ensaios in vivo na avaliação de segurança dos mesmos, de forma a oferecer aos consumidores o máximo de segurança com o menor risco, garantindo as melhores condições de uso do produto. Palavras-chave: Ensaios biológicos. Avaliação de segurança. Produtos cosméticos. INTRODUÇÃO Os produtos cosméticos são usados pelo homem desde épocas remotas. Inicialmente, as fontes de seus ingredientes eram essencialmente plantas, animais e minerais. No entanto, o avanço da tecnologia resultou

Autor correspondente: Hérida Regina Nunes Salgado - Departamento de Fármacos e Medicamentos - Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara - Universidade Estadual Paulista - UNESP - Rodovia Araraquara-Jaú, km 1 - CEP: 14801-902 – Araraquara, SP, Brasil Telefone: (16) 3301-6967 - e-mail: salgadoh@fcfar.unesp.br

na inclusão de muitas substâncias químicas sintéticas na formulação destes produtos. Atualmente, o uso, principalmente como produtos de higiene, é amplo e atinge um grupo populacional cada vez maior (Leonardi, 2004). Na prática, os produtos cosméticos são raramente associados com sérios danos à saúde. Entretanto, isto não significa que produtos cosméticos sejam sempre seguros, especialmente considerando os efeitos a longo prazo. Partindo do pressuposto de que estes produtos podem ser usados extensivamente durante um amplo período de nossa vida, é extremamente necessário garantir a segurança e eficácia dos mesmos, através do controle da toxicidade do produto final e dos seus ingredientes conforme vários autores relatam na literatura (Romanowski & Schueller, 1996; Brasil, 2002), bem como outros dados de nosso grupo de pesquisa (Chorilli et al., 2007a). A legislação brasileira de acordo com a Resolução nº 79, de 2000, estabeleceu normas e procedimentos para registro de Produtos de Higiene Pessoal, Cosméticos e Perfumes. Portanto, os produtos cosméticos devem passar por processos de avaliação de risco para que se faça valer o direito do consumidor e, principalmente, garantir a saúde da população (Brasil, 2000; 2005). Todos os anos, milhares de novos cosméticos, produtos de limpeza e de higiene pessoal são lançados no mercado. Potencialmente, muitos deles são testados em animais em vários estágios do seu desenvolvimento com objetivo de oferecer segurança para que estas substâncias não causem danos aos seres humanos (Baker & Bruner, 1997; Drill & Lazar, 1997). Recentemente, dados sobre reações adversas a cosméticos foram publicados por nosso grupo (Chorilli et al., 2007b). Os ensaios biológicos utilizados para avaliação de segurança de produtos cosméticos, entre eles o teste de sensibilidade de pele, irritação ocular, fototoxicidade, teste adjuvante de Freund e citotoxicidade geram discussão entre os pesquisadores, e cabe, portanto, ao profissional envolvido em questões técnico-científicas, o bom senso na utilização de ensaios toxicológicos e a busca de abordagens alternativas, evitando sempre que possível a morte e o

perfumes e correlatos (CFR. 2001. devido à dificuldade de manuseio e ao porte não estão entre as mais empregadas. Chorilli et al. 1994. Estes testes são mencionados no Code of Federal Regulations (Código dos Regulamentos Federais – codificações gerais e permanentes publicadas anualmente pelos departamentos executivos e pelas agências do governo federal americano) para fabricação de produtos de higiene. reduce. o porco e o macaco são as que apresentam maior semelhança do ponto de vista fisiológico à espécie humana. Após a realização de estudos de irritação em várias espécies animais como coelhos. os coelhos foram os animais que apresentaram melhores resultados para verificação de irritação (Draize et al. o teste é realizado na 20 Rev Ciênc Farm Básica Apl. Pruniéras. com a pele tricotomizada. biofísicas e bioquímicas são muitos similares da pele humana. Filipe & Gomes. Para minimizar estes problemas. o meio científico tem demonstrado uma forte tendência em aplicar a política dos 3 Rs (replace. substituição. O macaco Rhesus e os outros animais primatas poderiam ser modelos interessantes. Aubin. espessura. seu custo e sua relativa dificuldade de manipulação são sérios fatores limitantes (Pruniéras. Entretanto.. sem comprometer a qualidade do trabalho científico que está sendo executado. portanto a maioria dos métodos alternativos ainda não são 100% confiáveis (Balls & Fentem. Modelo animal A metodologia preconiza a utilização de coelhos albinos. 2004). Barlow et al. Um menor tempo de contato com a pele (quatro horas) foi proposto pela FDA (2003). refinamento. Worth & Balls. ou seja. 2004. Todavia. Modificações nos procedimentos de Draize et al. ESPÉCIES ANIMAIS Das espécies animais empregadas nos ensaios de segurança de cosméticos. cobaias e coelhos (Aubin. (1944) foram propostos para aumentar a uniformidade de resultados.. conforme descrito em nossos estudos (Marona & Lucchesi. 2005. Chorilli. dentre outros.. 2003. 1994)... Assim sendo. alguns deles desenvolvidos por nosso grupo científico (Polacow et al. natureza do sebo. para testar compostos de forma menos rigorosa e mais semelhante às condições de uso e ir de encontro a uma necessidade específica do pesquisador. sofrimento desnecessários dos animais de experimentação (Goldberg. com efeito. camundongos. camundongos. mas a sua utilização de forma adequada e humanitária. 1994). refine) introduzida por Russel & Burch (1959). Certamente a pele do porco não é idêntica à pele humana. 1994. Draelos. 2004). redução. Lachapelle.. há necessidade de realizar testes em seres humanos após o trabalho exploratório em animal para melhor validação e confiabilidade dos produtos (Jackson. Chorilli et al. Pires-de-Campos et al.2009. Todavia. Diante das críticas que vem sofrendo. destacando a necessidade de se aplicar métodos alternativos aos ensaios in vivo na avaliação de segurança dos mesmos.. 2008). 2007d. Chorilli et al. coelhos e cobaias apresentam uma pele diferente da pele humana em alguns aspectos. uma peculiaridade é que o porco é um dos raros animais que possui um sebo de natureza glicerídica como o homem (Aubin. (1944) e o protocolo do teste permanece inalterado em sua essência. uma pele cujas características fisiológicas. Pinto et al... hamsters. camundongos. 2004. Apesar destas limitações..30(1):19-30 . 2002).. 1986. não visando impedir a utilização dos modelos animais nos experimentos.. 1989. Logo. Pinto et al. 1994). estão entre os animais de escolha para realização dos ensaios biológicos (Viglioglia & Rubin. logo. 2008). cobaias. O porco tem sido empregado em alguns ensaios que visam observar a eficácia de princípios ativos lipolíticos na pele. tenta-se validar metodologias in vitro para determinação do potencial tóxico de ingredientes presentes nos produtos cosméticos. Chorilli et al. como quantidade de pêlo. 1999. os animais ainda permanecem como recurso insubstituível. 1994). 2003. utilizados para avaliação de segurança de produtos cosméticos. 2007c. mas apresenta várias semelhanças. 1999. Politi et al. 2003. estes modelos animais são os mais utilizados para avaliação de segurança de produtos cosméticos por serem de custo baixo e de fácil acesso. 1990. porém estas alterações não foram oficializadas. todavia. 2007). Presgrave et al. 1944. ENSAIOS BIOLÓGICOS Teste de irritação de pele O teste padrão para avaliar o potencial de irritabilidade de um composto em animais foi publicado por Draize et al. Os macacos apresentam. os relatos de literatura mostram que tais metodologias não foram suficientemente validadas para uso. 2003). Esta preocupação na comunidade científica também é discutida em publicações de nosso grupo de pesquisa (Marona. Os ratos. dentre eles o tiratricol. descritos em compêndios nacionais e internacionais. as espécies mais utilizadas acabam sendo os clássicos animais de laboratório.. cachorro e outros animais. 1991. 2003. cosméticos. O objetivo desta revisão foi descrever alguns ensaios biológicos in vitro e in vivo. 2006). a cafeína e a hialuronidase.Ensaios biológicos e produtos cosméticos. Alternatives to Animal Testing. como ratos. Outro modelo animal interessante é o porco doméstico.

Verificase se houve a formação de eritema e/ou edema sobre as áreas sadias e abrasadas. portanto.. Dispõe-se.. As áreas de aplicação são recobertas com gaze fixada com fita adesiva durante 24 horas (Brasil. composto por epiderme e estrato córneo Rev Ciênc Farm Básica Apl. 2003. sendo a substância-teste aplicada em quantidade de 0. com posterior hidratação com solução de sulfato de magnésio (154 mM). a substância teste é corrosiva. 1994.2009. a substância não é corrosiva. Eun & Suh (2000) afirmam que embora a maioria dos modelos in vitro para verificação de irritação cutânea apresente grande número de estruturas celulares da pele humana. 2002.Ensaios biológicos e produtos cosméticos. a substância ou produto acabado é aplicado topicamente por mais de 4 horas num modelo de cultura de tecido. Draelos. o que dificulta o emprego destes métodos em substituição ao teste de Draize et al. 2004. Valor 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 (RBC). Se TER for ≥ 5 KW.0 kg. Leituras são realizadas após 24 e 72 horas. teste de irritação elétrica transcutânea (TER) e teste de pele humana reconstruída (EPSKINTM) (Ponec. como os fibroblastos da derme e os queratinócitos da epiderme. Modelo in vitro Os seguintes testes in vitro são utilizados para avaliação de irritação da pele: teste em membrana. A pele é colocada sobre a extremidade de um tubo de politetrafluoroetileno.. seguindo a escala de Draize et al. 2005a). Já no teste EPISKINTM. Se o valor de TER for ≤ 5 KW. seis coelhos.. Presgrave et al. com o cuidado de garantir que a superfície epidérmica esteja em contato com o tubo. A pele é fixada na extremidade do tubo com borracha e eliminase o tecido em excesso. sendo os eletrodos colocados de cada lado do disco de pele para medida da resistência elétrica em KW/disco de pele. 1995. A substância teste é então removida por lavagem com jato de água (até 30ºC). ensaio de difusão em ágar. com peso corpóreo acima de 2. (1944) (Tabela 1). como vasos sangüíneos endoteliais e células inflamatórias. No TER. Draelos. 2002. A TER é então medida usando uma corrente alternativa de baixa voltagem. 2004. (1944). Embora a concentração de álcool utilizada seja muito alta e com possibilidade de agredir a pele. ensaio de citotoxicidade em células SIRC (linhagem celular derivada de córnea de coelho). no mínimo. Tais discos são preparados a partir da pele dorsal de animais sacrificados. são utilizados três discos de pele da epiderme de ratos. ele é adicionado com o objetivo de reduzir a tensão superficial. de 24 resultados quando utilizados seis animais. 2004). Presgrave et al. Indans.5 mL. 1999. teste de hemólise e desnaturação protéica Red Blood Cell Tabela 1 . Para cada substância a ser testada. o qual pode ser verificado na Tabela 1 (Lachapelle. São utilizados. 2003.. adicionase etanol 70%.. 2003.0 cm2. eles não contêm outros tipos de células que estão envolvidas no mecanismo de inflamação da pele in vivo. 2002). que é utilizado na apreciação do poder irritante do produto testado. Pinto et al. Loprieno et al. pele intacta e na pele após abrasão. 1992. Parâmetros Formação de Eritema e Escaras Repostas da pele Ausência de eritema Eritema muito leve Eritema bem definido Eritema moderado a severo Eritema grave com formação de escaras Formação de edema Ausência de edema Edema muito leve (apenas visível) Edema leve (contornos nítidos) Edema moderado (espessura = + 1 mm) Edema grave (superior a 1 mm) Fonte: Lachapelle. 1999. tem-se o TER e o EPISKINTM.. Hoffmann et al. área utilizada de aproximadamente 6. Antes de medir a TER.. o total destes resultados é dividido por 24 para obter o índice de irritação cutânea. Presgrave et al.30(1):19-30 21 . ICCVAM. a substância ou produto a ser testado é aplicado durante 24 horas discos da epiderme de ratos. 1994.Parâmetros para verificação do grau de irritação cutânea após aplicação do produto. Pinto et al. Identifica-se se um material é corrosivo pela sua capacidade em danificar a integridade do estrato córneo e da barreira funcional da pele. Entre os métodos utilizados para verificação in vitro de irritação pele. Liebsch & Spielmann.

Os valores obtidos para cada amostra podem ser usados para calcular uma porcentagem de viabilidade em relação ao controle negativo (Liebsch & Spielmann. Sparacio. 1986. 1994). 2002). 2008. Teste de irritação ocular O teste de irritação ocular é importante para produtos cosméticos. abrangendo edema. O ensaio baseia-se na medida da opacidade e da permeabilidade da córnea de bezerro após o contato com o produto teste. no geral até sete dias.. caracterizando-se por eritema e edema (Lachapelle. 1962. após cinco minutos de aplicação do produto.Ensaios biológicos e produtos cosméticos. 2002. adicionando fluoresceína e medindo a densidade óptica em 490 nm. na córnea e na íris de olhos de coelhos albinos. Barlow et al. hemorragia e coagulação). 1997. O teste descrito por Draize et al.. Brasil. 2007. ICCVAM. No caso de persistirem reações positivas. Este teste é um dos mais criticados. sendo 0. o teste utiliza no mínimo 6 animais. ele ainda é aceito por algumas agências regulatórias mundiais (Yan et al.5 diphenyl tetrazolium bromide) que forma um precipitado azul (formazan) sobre as células viáveis. Os olhos não são lavados. A medida da permeabilidade córnea é realizada conforme o tempo de contato. Apesar disto. 2002. Hoffmann et al.. As dermatites fototóxicas são limitadas à área de exposição à luz. Nigan. 1997). Modelo Animal Apesar de tentativa na redução do número de animais. 48 e 72 horas após a instilação (Kay & Calandra.. mantendo as pálpebras fechadas por um segundo e abrindo-as em seguida. O ensaio de BCOP tem como objetivo avaliar quantitativamente o potencial irritante de um produto ou de uma substância química após aplicação sobre a córnea isolada de bezerro. 24 horas (momento em que se lava os olhos tratados com solução salina a 0. a fototoxicidade é uma reação aguda. 1996). lacrimejamento. Vinardell & Mitians. INCQS. obtendo-se uma escala que considera os fenômenos observados (Gordon & Kelly. 1989. uma vez que pode ocorrer a introdução acidental de cosméticos no olho. Os detalhes do procedimento e interpretação são apresentados na Tabela 3 (Draize et al. Todavia. Por outro lado. 2003). permitindo que o próprio lacrimejamento promova a remoção. O ensaio baseia-se na observação dos efeitos irritantes (hiperemia. Meyer. géis e óleos) sobre a membrana cório-alantóide de ovo embrionado de galinha no décimo dia de incubação. Kay & Calandra (1962) incluíram parâmetros como eritema e espessura das pálpebras. emulsões.30(1):19-30 . que pode ser induzida por um simples tratamento com uma substância química e concomitante exposição à radiação ultravioleta ou visível. Fototoxicidade Segundo Liebsch & Spielmann (2002). 1994. Montalvo. Identificam-se os materiais corrosivos pela capacidade de diminuição na viabilidade das células abaixo de níveis definidos em períodos de tempo específicos. Os olhos não tratados servem como controle.1 mL da substância teste instilado no saco conjuntival inferior de um olho de cada animal. Presgrave et al. 1962. fixando um valor numérico da opacidade. As moléculas que produzem fototoxicidade geralmente vêem prontamente da radiação UVA (Lachapelle. (2005b) afirmam que o modelo de pele reconstruída fornece vantagens fundamentais em relação à cultura de células levando à resultados promissores conforme evidenciado por diferentes estudos de validação. A viabilidade das células é avaliada pela medida da atividade mitocondrial. 1989. Pinto et al. (1944) visa avaliar os efeitos da irritação de substâncias na conjuntiva.. O ensaio de HET-CAM tem como objetivo avaliar semi-quantitativamente o potencial irritante de um produto (produtos solúveis. Brasil. (1944). Modelo in vitro Vários grupos de pesquisadores propõem a utilização de métodos alternativos para a determinação da irritabilidade oftálmica. opacidade.. 22 Rev Ciênc Farm Básica Apl. tais como o teste de membrana cório-alantóide do ovo de galinha (HET-CAM) e ensaio de permeabilidade e opacidade corneal bovina (BCOP) (Gordon & Kelly. CFR. funcional. através de corante MTT (3-(4. Reações fototóxicas são decorrentes de mecanismos imunológicos e geralmente são acompanhadas de hiperpigmentação e descamação. 2005). 2003). particularmente no que diz respeito à avaliação do potencial de irritação ocular de produtos cosméticos. O controle negativo do valor de densidade óptica representa 100% de viabilidade celular. sobre a membrana cório-alantóide. puro ou diluído. 2001. 2009). aparelho que determina a diferença de transmissão do fluxo luminoso entre a córnea a ser avaliada.9%). 1944. a dermatite fotoalérgica é menos comum e geralmente necessita de exposições repetidas. danos e neovascularização da córnea neste protocolo. o qual é quantificado por espectrofotometria em comprimento de onda entre 545 e 595 nm.2009. sendo ambos examinados nos tempos 1 hora. 2004). Obtém-se uma escala que considera os fenômenos observados. A medida da opacificação córnea é realizada com o auxílio de um opacitômetro. 2003. Kay & Calandra. as avaliações poderão prosseguir.5 dimethyl thiazole-2yl)-2. Várias modificações têm sido propostas à metodologia de Draize et al. As reações observadas em cada animal são quantificadas e podem ser observadas na Tabela 2 (Drill & Lazar.

Presgrave et al. 2003.30(1):19-30 23 . Jackson. íris totalmente visível. ambrette. Rev Ciênc Farm Básica Apl.. Áreas necroticas. 2002).Teste de irritação ocular em coelhos: valores de graduação para lesões oculares.2009. tamanho da pupila pouco discernível Completa opacidade da córnea. 2002. Vermelho-carne difuso Quemose Não inchaço Algum inchaço acima do normal Obvio inchaço com parcial aversão das pálpebras Inchaço com pálpebras pouco fechadas Inchaço com pálpebras mais que metade fechadas Fonte: Drill & Lazar. 1993. Cada experimento deve ser planejado individualmente. musk. é necessário que seja realizado também o teste em peles humanas para melhor validação dos produtos (Pinto et al. Soni et al.. detalhes da íris não visíveis. Após o trabalho exploratório em animal. sendo a cobaia o animal de escolha. Áreas transluzentes facilmente discerníveis.. Conjuntiva Hiperemia Vasos normais Alguns vasos definidamente injetados Vermelho carmim difuso. Pode-se recorrer a duas espécies animais diferentes e a vários períodos de exposição (cálculos da dose recebida expressos em joules/cm2) modificando a irradiação (Brasil. a utilização de fonte de raios ultravioleta (UV) que não produz reação eritematosa parece adequada.Ensaios biológicos e produtos cosméticos. Tabela 2 . GRAU 0 1 2 3 4 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 4 Modelo animal Pode-se empregar neste estudo camundongos hairless. em particular quando se tratar de substâncias novas. substâncias antibacterianas e ésteres ácidos p-aminobenzóico (Groot et al. 1996). Íris (irite) Normal Dobras marcadamente profundas. Como os produtos químicos fototóxicos exercem atividade em comprimento de onda igual ou superior a 310 nm (comprimentos de onda pouco ou não eritrógenos). 2003).. Utiliza-se em geral. vasos individuais não facilmente discerníveis. porcos e cobaias. íris ainda reativa a luz. um aparelho de tipo UPVA (PUVA 180 Waldmann) e dispõe-se de dosímetro para exprimir a dose recebida na pele em joules/cm2 (Romanowski & Schueller. DESCRIÇÃO DAS LESÕES Córnea (opacidade) Não ulceração ou opacidade Área dispersa de opacidade. 2005). detalhes da íris pouco obscuros. Pinto et al. destruição grosseira.. Substâncias presentes em cosméticos e que podem causar fototoxicidade são: algumas fragrâncias. coelhos. íris não discernível. 2004. Não reação à luz. 2001. inchaço. hemorragia.. 1997. congestão. como metilcoumarina. 1988.

Esta propriedade de acneigênese também depende do tipo de pele do usuário.2009. Acneigênese (Comedogênese) Óleos minerais têm propriedades comedogênicas intensas. Numerosos produtos cosméticos têm propriedades comedogênicas fracas. hiperemia. hiperemia. quemose Irritante ou não Irritante N° de animais com reação positiva CFR (1986) Coelho albino 6 Depois da leitura de 24h NaCl 0. Eles provocam em certos usuários o aparecimento de acne cosmética (Katoulis et al. 2001. 48. obtinham uma hiperqueratose folicular cuja intensidade era reflexo exato de efeito comedogênico no homem. No 14º dia. enquanto o outro conduto serve de controle. Com pinças finas. Modelo Animal Os primeiros a descreverem este teste foram Adams et al. enquanto a outra é mantida no escuro. 48. 72 h 4 e 7 dias Opacidade. Segundo este método. Drill & Lazar. 2003... células chamadas 3T3 são mantidas em cultura durante 24 horas para a formação de monocamadas. Brasil. 72 h.9% por 5 Minutos 24. quemose 5 classes de irritação Nº de animais com reação positiva igual a Kay Lesões observadas Classificação do produto testado Critério de Classificação Fonte: Pinto et al. para ser usada como controle. uma das placas é exposta a uma dose de luz UV não citotóxica. quemose Irritante ou não irritante Nº de animais com reação Kay et al. irite. 72 h 4 e 7 dias Opacidade.9% por 5 minutos 24. irite. irite. vale dizer que. (1941) adaptando-o ao estudo de agentes comedogênicos fracos e em particular de produtos cosméticos. fixadas com formol e cortadas horizontalmente para confecção de lâminas e posterior análise microscópica. 1997). Tabela 3 . Guideline for Testing of Chemicals. a epiderme deve ser destacada e sua face interior examinada por 24 Rev Ciênc Farm Básica Apl. 48. Mills & Klingmam (1975) modificaram o teste inicial de Adams et al. a viabilidade celular é determinada pela aquisição do vermelho neutro durante três horas.Parâmetros dos métodos propostos para o teste de irritação ocular em coelhos PARÂMETROS MÉTODOS Draize et al. Neste teste.30(1):19-30 . Um resultado positivo neste teste indica que a substância teste tem potencial fototóxico (Barlow et al. nitidamente inferior às dos óleos minerais. 2002. (1941).9% por 5 Minutos 24. 1996). Em vez da preparação de seções histológicas. 1994). eles favorecem o desenvolvimento de acnes (Lachapelle. Klingman & Kwong (1979) efetuaram montagens para exames ao estereomicroscópio. 1994. cada produto a ser testado deve ser aplicado sobre um dos condutos auditivos externos de dois coelhos por cinco dias consecutivos por duas semanas. Duas placas por substância teste são préincubadas com oito concentrações diferentes da substância durante uma hora. 2002).Ensaios biológicos e produtos cosméticos. Modelo in vitro É empregado principalmente o teste de captação do vermelho neutro. 48. por isso os testes não revelam resultados totalmente confiáveis (Lachapelle. o meio de tratamento é depois substituído por meio de cultura e após 24 horas de incubação. hiperemia.. posto em contato com a pele durante um período suficientemente longo. Em 1979 este modelo foi modificado. (1944) Espécie de animal Numero de animal Irrigação Lavagem Leituras de testes Coelho albino 9 2 s após Aplicação 20 mL com água destilada 24. As áreas tratadas como no método inicial devem ser coletadas e depois imersas em água quente a 60ºC durante 2 minutos. secreção 7 classes de irritação Colocação das médias em tabela classificatória INCQS (1997) Coelho albino 5 Depois da leitura de 24h NaCl 0. Em ambas as placas. Em seguida. quemose.. irite. a região controle e as áreas tratadas são retiradas com auxílio de bisturi. Os autores constaram que pincelando o conduto auditivo externo do coelho com diferente óleo. 72 h 4 e 7 dias Opacidade. hiperemia. Opacidade. (1962) Coelho albino 5 Depois da leitura de 24h NaCl 0.

4 e 8 dias após a tricotomização (Brasil. 1994).Ensaios biológicos e produtos cosméticos. que se torna severa e persistente na segunda exposição. A incidência de resposta eritematosa é calculada. Leituras quantitativas do teste intradérmico envolvem dificuldades significantes. Dois grupos de 20 cobaias são utilizados para cada substância-teste. a cada 2 dias até completar 10 injeções. recebendo graduações (Brasil. Animais-controle são simultaneamente tratados somente com diluente.025 mL no total de amostra líquida ou de 0.9%... os autores utilizaram mastócitos primários estimulados com imunoglobulina E (IgE). com 10 a 20 cobaias. Teste de sensibilização da pele Existem situações em que a primeira exposição a uma substância química promove pequena reação. Brasil. Contatos subseqüentes. os valores médios para a indução (10 injeções) e a fase de teste (injeção do 35º dia) no grupo experimental são comparados. Pinto et al. fator celular humano recombinante e anticorpos anti-IgE de modo a liberar significativamente a quantidade de histamina. pois o estado atípico da pele provavelmente conduz a um número significativo de falso-positivos (Lachapelle. Neste protocolo. O mecanismo ainda não foi totalmente determinado.1 mL de solução ou emulsão a 1:1 da formulação teste para 5% de ACF (emulsão água em óleo com antígeno) que são aplicados nos tempos 0. Pinto et al. Este ensaio permite quantificar e avaliar os efeitos adversos dos tensoativos empregados em xampus. Modelo Animal A indução é feita com um grupo teste e um grupo controle. São realizados em duas etapas chamadas de indução e de desafio. com 10 a 20 cobaias utilizando 6 x 2 cm da região supraescapular tricotomizada e injeção intradérmica de 0. 2002). sendo que qualquer valor positivo indica sensibilização. Modelo in vitro Para ensaios de sensibilização da pele. 1994. 2001) utilizaram culturas de fibroblastos primários derivados da orelha de coelho para verificar a comedogenicidade do esqualeno.30(1):19-30 . A tricotomização do dorso é realizada para a aplicação de seis concentrações diferentes com 0. avaliado através de sua forma oxidada. Modelo in vitro Chiba et al. A injeção intradérmica de 0.1% em solução aquosa de cloreto de sódio a 0. sabonetes líquidos e produtos de higiene sobre a membrana plasmática de hemácias e a conseqüente liberação da hemoglobina (hemólise) e ainda. 48 e 72 horas.2009. ao longo de três semanas (Lachapelle. podese empregar o teste chamado RBC (Red Blood Cell System). As regiões do desafio são examinadas após 24. o índice de desnaturação da hemoglobina. sendo um deles como controle. sendo este injetado intradermicamente (0. A via de administração é freqüentemente irreal comparada à condição de uso e a concentração de indução (0. 2003). com a finalidade de detectar substâncias com características alergênicas (Lachapelle.1%) é fixada sem considerar a concentração de uso. (2001) descreveram um modelo in vitro para verificação de sensibilização a substâncias potencialmente alergênicas baseado no isolamento de mastócitos primários de pacientes não alérgicos. Os autores verificaram que o grau de comedogenicidade induzida pelo monoidroperóxido de esqualeno foi maior do que o de substâncias reconhecidamente comedogênicas. 1994. Brasil. Modelo in vitro Gospos et al. 2002. ACF é utilizada igualmente no teste de indução.05 mL da amostra é aplicada na região dorsal tricotomizada. 2002). O desafio também é feito com um grupo teste e um grupo controle. 2002). ambos quantificados por espectrofotometria.05 mL). 2003). indicando dessa forma a capacidade dos mastócitos primários de causar uma reação de hipersensibilidade do tipo imediata. irradiou-se o esqualeno com radiação UVA de forma a obter monohidroperóxido de esqualeno. repetindo-se a mesma dose. Para estabelecer a especificidade do método. estereomicroscopia. como miristato de isopropila Teste adjuvante completo de Freund O teste adjuvante completo de Freund (TACF) é um teste modificado do ensaio de sensibilização em cobaias..01 mL da amostra semi-sólida. Se houver diferença significativa entre as reações dos animais dentro do mesmo grupo. A relação entre a hemólise e oxidação da hemoglobina fornece parâmetros 25 Rev Ciênc Farm Básica Apl. o qual pode ser extraído da cultura de fibroblastos com solução de metanol e isolado por cromatografia líquida de alta eficiência usando metanol como fase móvel. mesmo que após semanas ou anos produzem reações alérgicas de duração longa (Brasil. no 21° e 35° dia. Modelo Animal A sustância-teste é injetada intradermicamente como emulsão a 0. 2002). na mesma região da primeira aplicação. As amostras podem ser conservadas indefinidamente e os resultados devem ser comparáveis aos do método convencional (Lachapelle. para comparação dos resultados dos animais tratados com a substância-teste. (2000. No 35º dia o desafio final é feito no sítio de pele correspondente ao da primeira injeção. 1994.

efeitos indesejáveis. (2002) analisaram in vitro o potencial citotóxico de alquilfenóis de Ginkgo biloba L. pesquisadores examinam os danos causados aos órgãos internos dos coelhos (ICCVAM. Assim. que tem sido preconizada no Mercosul através das resoluções MERCOSUR/GMC/RES. como risco de aparecimento de câncer na boca. Brasil) e ao PADC-FCF-UNESP (Araraquara. independentemente de haver ou não métodos alternativos validados (Asociación Españhola de Toxicología. Os testes in vitro surgem como uma promissora e importante tentativa de substituição dos modelos animais nos ensaios biológicos para cosméticos. tendências futuras à curto prazo são a completa substituição dos testes envolvendo animais pelos testes in vitro. Os testes destinados a medir a citotoxicidade são úteis para avaliar esses perigos de forma a ter controles de toxicidade. a implementação de uma política de Cosmetovigilância na área de produtos cosméticos.2009. a Associação Européia de Cosméticos (Colipa) lançou uma diretriz orientadora abolindo os testes com animais. Regerol et al. 2003). Brasil). Tais medidas são imprescindíveis como forma de evitar tanto reações adversas relativamente simples como irritação da pele. lacrimação. 1996.. os ensaios para avaliação de segurança de produtos cosméticos em animais estão. Brasil). apesar do desenvolvimento de grande variedade de métodos alternativos experimentais. Devido às questões políticas e sociais. visão embaçada. quanto reações mais complexas. pelo apoio financeiro aos nossos projetos. da Comunidade Européia. Qin et al. CONSIDERAÇÕES FINAIS A avaliação da segurança de produtos cosméticos envolve o conhecimento de muitas áreas. que define o ano de 2009 como prazo máximo para não mais utilização de animais em testes de segurança de cosméticos. 1998. Todavia. 2006).. hipersensibilidade e queda de cabelo. 2002. Logo. no sangue e na cabeça. além de proibir a entrada em países da Comunidade Européia de cosméticos testados em animais a partir de 2004. Gazda et al. que podem ser decorrentes da inalação e exposição prolongada a produtos sensibilizantes. onde permanece por 24 horas. sempre levando em consideração princípios éticos. queimaduras. O teste de DL50 é o método básico utilizado para determinar qual dosagem oral do produto a ser testado é letal para 50% da população testada.. à FAPESP (São Paulo. AGRADECIMENTOS Ao CNPq (Brasília.. Já no teste de toxicidade percutânea a substância é aplicada na pele de coelhos. de caracterização dos efeitos destas substâncias in vitro (Romanowski & Schueller. Para os países do Mercosul. 1998). defeitos de qualidade. Citotoxicidade O ensaio de citotoxicidade define o potencial de degeneração ou morte celular provocado pelo material constituinte nos cosméticos. n° 26/04 e MERCOSUR/GMC/ RES nº 19/05. Stitzel et al.. bem como facilitar a este o acesso a relatos sobre problemas de uso. no pulmão. 2006. os ensaios biológicos para avaliação de segurança de produtos cosméticos ainda podem ser realizados em animais. Tal diretriz proíbe os testes de produtos cosméticos acabados ou de matérias-primas em animais.. Mesmo diante destes fatos. resultados positivos no ensaio de citotoxicidade descaracterizam a condição de inocuidade do cosmético. dentre eles o Brasil. aos poucos. pelo ensaio de incorporação do vermelho neutro e observaram que a ação citotóxica destas substâncias nestas células é mediada pela transformação da mitocôndria induzida pela fosforilação oxidativa. permitindo um prazo de seis anos para adequação das empresas. Hecker et al. sendo inclusive uma recomendação da 7a Ementa Diretiva 76/768/ECC constante no Boletín GTEMA 33/34 de 2006.Ensaios biológicos e produtos cosméticos. além de ser uma maneira de proibir e/ou coibir o uso indiscriminado de substâncias que podem se apresentar tóxicas. deixando de existir. 26 Rev Ciênc Farm Básica Apl. Neste teste. os métodos empregados nos testes de segurança e as concentrações máximas permitidas das matérias-primas nos produtos. é de extrema importância como forma de garantir ao usuário a segurança e eficácia dos produtos. vermelhidão. a redução do número de animais nos experimentos e a não existência de métodos alternativos válidos (Brasil. Modelo in vitro O estudo comparativo do ensaio de citotoxicidade pode ser realizado através de duas metodologias: ensaio de difusão em ágar e ensaio de incorporação do vermelho neutro (Demarco et al. nas narinas. Modelo Animal Determinadas quantidades de matérias-primas no organismo podem provocar vômitos. ratos recebem dose única da substância teste por meio de entubação gástrica (gavage). 2001. sendo possível causar processos de irritabilidade nos usuários (Demarco et al. Hostynek. 2006). danos aos órgãos internos e até a morte.. 1998). Após os testes. 2002). Neste sentido. Tanto no teste de citotoxicidade oral quanto percutânea registram-se os dados relativos de toxicidade e mortalidade por 14 dias. estes ainda não substituem a experimentação animal em sua totalidade.30(1):19-30 . incluindo o uso (e o mau uso) do produto pelo consumidor.

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