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REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

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Published by: Jean Bressan Albarello on Nov 18, 2011
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CURSO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA UNIDADE BENTO GONÇALVES LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR Prof.

Fábio Lius Maciel

CAMILA ECKERT GRAZIELA PILETTI JEAN BRESSAN ALBARELLO MARCEL RAMOS DA SILVA

RELATÓRIO EXPERIMENTO 02 - REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) -

Novo Hamburgo 2011

1. Introdução

Reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) é um método de amplificação de DNA sem o uso de um organismo vivo, por exemplo, Escherichia coli (bactéria) ou leveduras. O processo foi descrito por Kary Mullis, em 1983, sendo patenteado em 1989, pela Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation. O método PCR é usado habitualmente nos laboratórios de investigação médica e biológica para uma variedade de tarefas, como a detecção de doenças hereditárias, a construção de árvores filogenéticas, a clonagem de genes, testes de paternidade, etc. O principal propósito da PCR é fazer um número imenso de copias de um determinado fragmento gênico, ao qual o tamanho pode variar de poucos pb (pares de bases) até milhares de pb. A técnica explora função natural da enzima chamada de taq – polimerase, extraída da bactéria Thermus aquaticus, esta enzima é semelhante à enzima DNA – polimerase que é capaz de sintetizar DNA a partir de seus precursores no sentido 5’  3’. Para catalisarem essa síntese, os precursores de DNA devem estar presente sob a forma de desoxirribonucleotídeos trifosfatos (dATP, dTTP, dGTP e dCTP). Para utilizar esta técnica é necessário ter um conhecimento prévio da seqüência dos genes a serem amplificados, e a partir disso são sintetizados dois primers ou iniciadores, ou seja, é a partir deles que se inicia a síntese do DNA pela enzima taq – polimerase. A síntese se desenvolve sempre no sentido 5’  3’. A Reação em cadeia da Polimerase é um método muito sensível de análise e, por isso, é realizado com muito cuidado para evitar contaminações. O presente relatório descreve o experimento realizado no laboratório de Biologia Molecular da Universidade Estadual do Rio Grande do Sul, unidade de Novo Hamburgo, no dia 10 de novembro de 2011, que teve como objetivo, amplificar um fragmento de DNA no vetor PETCKIB.

2. Materiais e Métodos

2.1. Reação em Cadeia da Polimerase

Para a realização da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), foram utilizados os seguintes materiais:          Pipeta de 20,0 μl Iniciadores de cadeia direto (anela na extremidade 5’ do molde) Iniciadores de cadeia inverso (anela na extremidade 3' do molde) DNA-molde (pETCKIB) dNTPs (desoxirribonucleotídeos): dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Tampão da Taq DNA-polimerase Taq DNA-polimerase Água bidestilada MgCl2

O primeiro passo foi pipetar as soluções, na ordem e quantidades indicadas na tabela 1, em dois tubos de centrífuga de 0,2 ml, identificados como controle positivo e controle negativo.

Ordem 1º 2º 3º 4º 5º 6º 7º 8º

Quantidade (μl) Controle - Controle + Água Bidestilada 12,4 13,4 Tampão da Taq DNA-polimerase (10X) 2,0 2,0 Iniciador 5' (20 pmol/μl) 1,0 1,0 Iniciador 3' (20 pmol/μl) 1,0 1,0 dNTP's (10 mM) 1,0 1,0 DNA molde (50 ng/μl) 1,0 MgCl2 0,6 0,6 Taq DNA-polimerase (0,5 U/μl) 1,0 1,0
Tabela 1 – Soluções utilizadas para a PCR.

Soluções

Com as soluções pipetadas, obteve-se um volume final de 20,0μl em cada tubo. Os tubos foram colocados em um termociclador, com uma programação pré-definida, passando pelas seguintes etapas: 1º - Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada a 95°C durante 2 minutos. Nesta etapa ocorre a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação). O primeiro ciclo é iniciado mantendo-se a temperatura a 95ºC durante 30 segundos. 2º - Na segunda etapa, a temperatura é reduzida para 45°C, durante 30 segundos, para que os aconteça o pareamento dos primers com a fita molde de DNA (Anelamento). 3º - Na última etapa do ciclo a temperatura é elevada a 72 °C, durante 90 segundos, para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molécula (Extensão). 4º - Os ciclos são repetidos 30 vezes. 5º - Realiza-se o ciclo final, a uma temperatura de 72ºC, durante 5 minutos para eventual complementação de fitas não estendidas. O resultado da PCR foi analisado através de uma eletroforese em gel de agarose 0,8%.

2.2. Análise de DNA por eletroforese em gel de agarose

Para o preparo do gel, foi feita uma solução de agarose em frasco de Erlenmeyer e aquecida (até a fervura) em forno de microondas até a sua completa solubilização. O frasco foi coberto durante o aquecimento, e agitado freqüentemente para homogeneização e para evitar transboradamento. Após a solubilização, a solução de agarose foi resfriada por alguns minutos. Em seguida, foi adicionado 20 μl de uma solução de brometo de etídio 1 mg/ml (concentração final de 0,2 μg/ml). A solução foi agitada e derramada sobre uma placa-molde de gel com o pente já montado, conforme na figura 1.

Figura 1 - Preparo do gel de agarose.

Para a gelificação, a solução foi mantida em temperatura ambiente por 30 minutos a 1 hora. Em seguida, o gel foi transferido para a cuba de eletroforese, mergulhada em tampão TBE 1X. Após, as reações foram preparadas para serem aplicadas no gel. As amostras foram preparadas com DNA + tampão de amostra, e seguiram a ordem: 1. Marcador de peso molecular; 2. Amostras de DNA da Extração de Morango; 3. Amostras de DNA do fragmento amplificado do vetor – Controle negativo; 4. Amostras de DNA do fragmento amplificado do vetor – Controle positivo.

Figura 2 – Preparo da eletroforese.

Por fim, o gel foi visualizado em transilumidor ultravioleta.

3. Resultados e Discussões

Cada reagente utilizado para a reação em cadeia da polimerase tem uma finalidade específica, e são eles: DNA molde: DNA a ser amplificado, neste caso, fragmento do vetor PETCKIB; Tampão 10X: basicamente, estas soluções contêm íons diversos (Na+, Cl-, K+, entre outros) que otimizam as condições de reação e mantém pH ideal para funcionamento; dNTPs: desoxinucleotídeos são a matéria-prima propriamente dita para a síntese das fitas-filhas. São compostos por nucleotídeos (ATP, TTP, CTP, GTP) desoxilados no carbono 5´ da desoxirribose. São adicionados pela polimerase complementarmente à fita-mãe. Adiciona-se uma mistura de todos os dNTP´s em concentrações iguais à reação; Iniciadores (primers): são pequenas seqüências de DNA (12 a 35 bases) complementares às bordas que servem para indicar onde a enzima deve ligarse, para dar início à amplificação; MgCl: doador muito estável de íons Mg2+, que são cofatores

indispensáveis para atividade da enzima; Taq DNA Polimerase: Taq ainda é mais utilizada, numa concentração que varia de 1 a 4U por microlitro de solução, é a peça chave para a cópia do fragmento, por ser a enzima responsável por ligar os dNTPs ao sítio de amplificação, a partir dos primers (a enzima deve ser adicionado por último, pois ela deve ser sempre mantida em gelo para não perder sua identidade); Água: utilizada para completar a reação ao seu volume correto. As condições ideais de ciclagem foram determinadas em um programa no Termociclador. A quantidade de ciclos corresponde à quantidade de vezes em que haverá a amplificação (cópia) do fragmento de interesse. O resultado da reação de PCR foi corrida em eletroforese com gel de agarose 0,8%. Os ensaios de eletroforese se valem do princípio que determina que a carga global de uma fita de DNA é negativa. Portanto, uma solução que possua íons livres (eletrolítica) e que tenha moléculas de DNA em suspensão

pode ser purificada aplicando–se uma dada voltagem. Ao final do processo as cadeias de DNA estarão próximas ao catodo (positivo), atraente de moléculas de carga negativa. No entanto, o foco da técnica é separar os fragmentos por tamanho, uma vez que a reação gera fragmentos de mesma extensão. A solução é “peneirar” o resultado da PCR por peneiras moleculares o (gel, neste caso de agarose). As cadeias são “empurradas” através da peneira pela corrente elétrica, e de acordo com o tamanho dos furos dela, elas serão retidas ou liberadas. Na verdade, nos valemos do fato de que cadeias maiores demoram mais tempo para passar pelos poros da “peneira”, e cadeias menores viajam mais rapidamente através dela. A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação é comparada com a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. Esta distância percorrida é analisada comparando -a a um marcador de peso molecular, que mostra várias bandas com pesos moleculares diferentes (quanto mais alto no gel, maior o peso), servindo de mapa para a análise de bandas no gel. O marcador utilizado foi de DNA de fago e Hind III. O preparo do gel foi feito com agarose e dissolvido numa soluçãotampão eletrolítica, no caso TBE, e por fim foi adicionado Brometo de Etídeo. O Brometo de Etídeo é uma substância altamente mutagênica e é utilizada pois ele tem a capacidade de inserir-se nas fendas da cadeia de DNA, apresentando fluorescência quando excitado com radiação ultravioleta, clivado com Eco RI

possibilitando a visualização das bandas de DNA. A solução-tampão de preparo do gel deve ser obrigatoriamente a mesma que o recobrirá na cuba de eletroforese e possibilitará a passagem de corrente elétrica (Tampão de Corrida). As amostras aplicadas no gel receberam tampão de amostra, que tem como função aumentar a viscosidade da amostra e assim impedir que esta comece a flutuar no tampão de corrida antes que a voltagem seja aplicada no sistema, além disto, ela possui um corante que possibilita a visualização do andamento da corrida. A corrida foi feita a 100V.

A revelação foi feita através do transiluminador, o qual demostrou que a reação do nosso grupo não amplificou o fragmento esperado, ou seja, não deu certo. Isto pode ocorrer por diversos fatores, mas principalmente pela falta de prática do grupo em manusear pipetas e técnicas de biologia molecular. A demora para pipetar, assim como a dificuldade para manusear quantidades tão pequenas de reagentes, que eram praticamente invisíveis aos olhos, foi fator relevante na falha da nossa reação. Ademais, a oportunidade de observar e "tentar" praticar técnicas e experimentos de biologia molecular é muito válido, pois a experiência é o que fica, mesmo que nossa reação não ocorreu como esperado.

4. Conclusões

A Reação em Cadeia da Polimerase é uma técnica muito utilizada por ser específica e sensível. Para observar o resultado da reação as amostras foram analisadas em eletroforese com gel de agarose. A revelação foi feita no transiluminador com Brometo de Etídeo. A reação do nosso grupo não amplificou, e foi atribuído a isto a falta de prática com equipamentos de laboratório e técnicas de biologia molecular dos colegas. Reações de outros grupos se mostraram boas, amplificando o gene de interesse, e confirmando a especificidade da técnica de PCR.

5. Referências Bibliográficas

Reação em Cadeia da Polimerase. Acesso em 14/11/2011. Disponível em: http://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polimerase

PCR. Acesso em 14/11/2011. Disponível em: http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio33/pcr.pdf

Principio do PCR Acesso em 14/11/2011. Disponível em: http://www.fisiologia.kit.net/biomol/4.htm

Reação em cadeia da Polimerase. Acesso em 15/11/2011. Disponível em: http://www.scribd.com/doc/15362706/Reacao-em-cadeia-da-polimerase-PCR

PCR. Acesso em 15/11/2011. Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechPCR.shtml

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