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Avaliao da viabilidade espermtica pela tcnica da citometria de fluxo aps gradiente Percoll Mariana R. Queiroz, Paulo V.

Cavalcanti, Jos A. Visintin, Mayra E. O. A. Assumpo Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, USP, SP
1. Objetivos A citometria de fluxo uma ferramenta que pode avaliar sub-populaes celulares presentes em uma mesma amostra de smen. Este trabalho visou validar a citometria de fluxo com a associao de sondas fluorescentes, para avaliar clulas espermticas de bovinos separadas pelo gradiente de densidade (Percoll, Sigma, 45/90%). 2. Material e mtodo Este estudo utilizou a associao da sonda fluorescente FITC-PSA (isotiocinato de fluorescena conjulgado aglutinina de Pisum sativum) e o PI (iodeto de propdeo). O FITC-PSA cora em verde as clulas com leso acrossomal, e o PI cora em vermelho clulas com leso de membrana plasmtica. O equipamento utilizado foi o Guava EasyCyte Mini Flow Cytometry da GE Life Science. Para cada ensaio (n=xxxx) uma palheta de smen foi descongelada e o contedo submetido separao por gradiente Percoll (45% e 90%). As clulas viveis passam pelo gradiente 45 e pelo gradiente 90%, ficando no sedimento do tubo. Como grupo controle foi realizado a induo de injrias nas membranas acrossomal e plasmtica, submetendo repetidamente as clulas ao nitrognio lquido, seguido de descongelao rpida. 3. Resultados Para a padronizao dos experimentos foram avaliados os quatro grupos: Grupo 1 Clulas submetidas ao Percoll, sem a presena das sondas (Figura 1 A); Grupo 2 Clulas submetidas ao Percoll coradas com a associao das sondas (Figura 1 B); Grupo 3 - Clulas espermticas com leso induzida pelo choque frio (Figura 2 A); Grupo 4 Espermatozides frescos corados com as sondas, mas sem serem submetidos ao Percoll (Figura 2 B). As partculas residuais de Percoll foram removidas pelo ajuste da linha de corte de anlise.
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Plot1: Not Gated

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Green Fluorescence (GRN-HLog) 10e1 10e2 10e3 10e0

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10e1 10e2 10e3 Red Fluorescence (RED-HLog)

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10e1 10e2 10e3 Red Fluorescence (RED-HLog)

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Figura 1: Em A, dotplot da auto-fluorescncia das partculas de Percoll. Em B, partculas de Percoll coradas com as sondas.
10e4 Green Fluorescence (GRN-HLog) 10e1 10e2 10e3

Green Fluorescence (GRN-HLog) 10e1 10e2 10e3

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Plot1: Not Gated

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10e1 10e2 10e3 Red Fluorescence (RED-HLog)

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Figura 2: Em A, dotplot do padro populacional das clulas com leso induzida. Em B, clulas ntegras em azul, leso de acrossomo em verde, leso de membrana plasmtica em vermelho e leso de ambas as membranas em laranja.

4. Concluso O procedimento de padronizao propiciou o ajuste dos parmetros para o uso das sondas FITC-PSA e PI, simultaneamente. Deste modo, a identificao de quatro sub-populaes celulares em ejaculados bovinos aps separao por gradiente de Percoll possvel o que propicia uma vantagem frente aos mtodos tradicionais de avaliao seminal, devido a maior sensibilidade e acurcia da tcnica, uma vez que se avalia um nmero maior de clulas por amostra 5. Referncias bibliogrficas
Guava EasyCyte Mini Flow Cytometry System Millipore Corporation, Billerica, U.S.A, 2008.