1 TINCIONES Tinciones o Coloraciones Las tinciones son un conjunto de procesos que conducen a la coloracin de las estructuras que componen

a las clulas, bacterias, hongos y parsitos. Esto tiene por objeto el aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, y permite por tanto que las clulas sean visualizadas microscpicamente con mayor facilidad. Frotis Un frotis de sangre es un mecanismo cientfico que consiste en el extendido de una gota de sangre en la superficie de un portaobjetos o de un cubreobjetos, con el fin de analizarla posteriormente; es ms adecuado emplear sangre que aun no ha estado en contacto con el anticoagulante, pues este podra alterar los resultados (algunos anticoagulantes tienden a deformar las clulas de la sangre) Importancia del Frotis La valoracin de la estimulacin eritropoyetica. Las anomalas en la maduracin nuclear y citoplsmica de las clulas hemticas. Los trastornos en la arquitectura de las clulas al formarse en la mdula sea. Las alteraciones singulares en la forma de las clulas, que son una identificacin especifica de algunas enfermedades. Algn indicador de los efectos nocivos de la quimioterapia y de la radioterapia. La diferenciacin y recuento de los elementos celulares de la sangre. TIPOS DE TINCIONES TINCIONES VITALES Y NO VITALES Las tinciones vitales y supravitales: son aquellas que se practican sobre clulas que estn vivas. Las tinciones vitales: son aquellas que se efectan sobre clulas que estn vivas, mediante la introduccin de un colorante en la circulacin de un organismo vivo. Son colorantes vitales, por ejemplo, el verde Jano y el azul de metileno. Las tinciones supravitales: son aquellas que se realizan sobre clulas o tejidos vivos, pero que estn aislados del organismo del que proceden. Las tinciones no vitales: se realizan sobre clulas muertas. La coloracin de clulas muertas requiere un proceso previo de fijacin, que tiene por objeto el mantener inalterada su estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos. La fijacin puede realizarse mediante calor, aunque habitualmente se realiza con etanol o metanol. Coloracin panptica Hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones polcromas. Una coloracin es panptica cuando se utilizan sucesivamente sustancias colorantes neutras y es pancrmica cuando se aplican todas las sustancias colorantes neutras juntas. El primero que tuvo la idea de realizar una de estas combinaciones fue Romanowsky, y los colorantes hematolgicos utilizados en la actualidad suelen derivar del que l prepar. Los colorantes de tipo Romanowsky constan de un colorante cido (eosina) y de colorantes bsicos (tiacinas). Las tiacinas son el azul de metileno y sus derivados obtenidos por desmetilacin oxidatiya (colorantes tipo azur). Las tinciones realizadas con colorantes de tipo Romanowsky, que ms frecuentemente se emplean en el diagnstico hematolgico, son la de Wright y la de Giemsa (utilizada sola o en combinacin con la de May-Grnwald).

2 TINCIONES PANPTICAS RPIDAS Tinciones fluorescentes: emplean colorantes (fluorocromos) que se fijan a las clulas y que, cuando son estimulados por una luz ultravioleta, emiten una radiacin visible, de un color caracterstico. Los fluorocromos ms utilizados en esta clase de tinciones son el naranja de acridina y el rojo neutro. Tinciones citoquimicas: demuestran la presencia, ms o menos abundante, o la ausencia de deteminadas sustancias, localizadas en el interior de los grnulos citoplasmticos de los leucocitos. Sirven para reconocer clulas leucocitarias (normales o anmalas) y, por tanto, para diferenciar unas clases de leucemias de otras. Por ejemplo, un colorante preparado a base de diaminobenzidina y de agua oxigenada, descubre la presencia de peroxidasa endocelular, y por consiguiente permite atribuir el origen de unas clulas leucocitarias inmaduras a la lnea granuloctica o a la monoctica. DENOMINACIN DE LAS ESTRUCTURAS COLOREADAS. Estructuras acidfllas u oxifilas: son aquellas que fijan colorantes de naturaleza cida. Si el colorante cido que captan es la eosina, se dice que son eosinfilas. Con las tinciones tradicionales adquieren un color rosado. Estructuras basfllas: son aquellas que fijan colorantes de naturaleza alcalina. Con las tinciones tradicionales adquieren un color azulado. Si se tien de lila o prpura con colorantes de tipo azur, se llaman azurfllas. CAUSAS DE ERROR EN LAS TINCIONES REALIZADAS A FROTIS SANGUNEOS. Si la tincin de una extensin sangunea es demasiado rosa, probablemente esto se deba a: Un pH bajo del colorante. Un tiempo de coloracin insuficiente. Un lavado excesivamente prolongado. Si la tincin es demasiado azul, posiblemente, esto est causado por: un grosor excesivo de la extensin, o un pH alto del colorante. Una coloracin excesivamente prolongada. Un lavado insuficiente. Si tras la tincin aparecen artefactos o/y precipitados en la extensin, probablemente esto se deba a: Un empleo de portaobjetos sucios. Una falta de filtracin del colorante. Una coloracin excesivamente prolongada. Un secado del colorante durante la tincin. Un lavado insuficiente. Muchos de estos errores pueden obviarse utilizando teidores automticos de las extensiones sanguneas. Actualmente, no suelen emplearse en la prctica clnica.

3 Tincin de Romanowsky La tincin de Romanowsky es una mezcla que contiene azul de metileno y eosina y que se utiliza para preparar frotis para anlisis sanguneos como base de diversos colorantes, como los de Wright, Giemsa o Leishman. La tincin de la muestra permite distinguir la forma, tamao y contorno de los hemates, leucocitos y plaquetas y el ncleo, citoplasma y granulaciones de las distintas clulas ya que adquieren diferentes colores: azul, prpura, rosa o salmn. Esta separacin por colores es el llamado efecto Romanowsky, que tie de prpura a los ncleos y grnulos neutroflicos y de color rosa a los eritrocitos. Los cidos nucleicos, las protenas y el citoplasma se tien de azul, delatando a los posibles parsitos. Tincin de Giemsa La tincin de Giemsa es un mtodo habitual para el examen de frotis sanguneos, cortes histolgicos y otro tipo de muestras biolgicas. Este mtodo tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las ricketsias localizadas dentro de la clula huspedes. La coloracin de giemsa se emplea tambin para teir frotis de sangre en el examen para protozoos. Se puede emplear, como variaciones, otras coloraciones como es la tcnica de citoconcentracin para parsitos sanguneos, la cual tiene un bajo coste y ofrece la posibilidad de aislar e identificar en el mismo sedimento el parsito principal, con excepcin de los trofozoitos jvenes y el plasmodium falciparum. Fundamento de la tincin de Giemsa Estos organismos adquieren una coloracin diferencial y se ven dentro del citoplasma de la clula husped. La tcnica de Giemsa est formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno como tinte bsico y la eosina como tinte cido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de metileno es un colorante metacromtico, de ah que muchas estructuras se tian de prpura y no de azul. El pH de la solucin de coloracin es crtico y se debe ajustar idealmente segn diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y 6.9 Procedimiento Realizar el extendido. Fijar con Metanol durante 3 minutos y dejar secar. Cubrir el extendido con colorante y dejar entre 3 y 5 min. Lavar con agua destilada y dejar escurrir hasta secar. Tincin de Wright La tincin de Wright es una tincin de tipo Romanowsky. Es extremadamente importante en el laboratorio de hematologa este tipo de tincin, ya que puede obtenerse una cantidad abundante de informacin a partir del examen de un frotis de sangre perifrica bien teido Una tincin de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidacin, as como eosina Y o eosina B La accin combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky y da una coloracin prpura a los ncleos de los leucocitos y a los grnulos neutroflicos y de color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y Las propiedades de tincin de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras

4 qumicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Los agrupamientos de cidos nucleicos, las protenas de los ncleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante bsico La eosina Y, colorante cido, se fija a los agrupamientos bsicos de las molculas de hemoglobina y a las protenas bsicas. Procedimiento Realizar la extensin sin dejar escurrir, secar al aire sin fijar. Cubrir la totalidad del extendido, en cantidad suficiente para evitar la evaporacin. Transcurridos 5 7 min agregar igual cantidad de solucin amortiguadora o en su defecto agua destilada, evitando que se derrame. Transcurridos 20 25 min lavar con abundante agua del chorro con cuidado para evitar arrastrar el frotis. La aparicin de una espuma verdosa es indicativo del final del tiempo de tincin. Tincin de Gram La tincin de Gram o coloracin Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa. Fundamento de la tincin de Gram El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas). El lugol est formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual est presente para solubilizar el yodo. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen. Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al trmino del protocolo, las Gram positivas se vern azl-violceas y las Gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina) Tincin de Ziehl-Neelsen La tincin de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una tcnica de tincin diferencial rpida y econmica, para la identificacin de microorganismos patgenos, por ejemplo M. tuberculosis. Este mtodo se basa en que las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (por ejemplo, el cido miclico) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistencia|bacilos cido-alcohol resistentes o BAAR. Las Mycobacterium|micobacterias como Mycobacterium tuberculosis|M. tuberculosis y Mycobacterium

5 marinum|M. marinum y los parsitos con la coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Procedimiento clsico 1. Hacer un frotis de la muestra de esputo. 2. La fijacin al calor asegurar de que el frotis quede adherido al portaobjetos. Un frotis muy delgado puede darle resultados falsamente negativos y un frotis muy grueso puede desprenderse del portaobjetos durante la tincin. 3. Utilizando pinzas, coloque los portaobjetos en una gradilla de tincin con los extendidos hacia arriba. Coloque todos los portaobjetos orientados uniformemente, con el frotis hacia arriba. Nunca tia ms de 12 portaobjetos a la vez. 4. Dejar el frotis sobre el puente de tincin. 5. Aplicar fucsina-fenicada. 6. Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5 minutos. Mantenga el calor durante este perodo. 7. Calentar con un mechero hasta la emisin de vapores (3-5 minutos). 8. Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada penetre y tia la pared celular de la bacteria. No deje que hierva o se seque el colorante. 9. Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua corriente fra hasta que toda la tincin libre quede lavada. Lave suavemente de manera que el extendido no se barra del portaobjetos. Retire el exceso de agua. 10. Decolorar con alcohol-cido. 11. Cubra cada portaobjetos con la solucin decolorante, tal como alcohol cido y mantngalo sobre el portaobjetos durante 3 minutos. Si no se decolora suficientemente, el contenido del esputo que no son bacilos TBC puede permanecer teido. Enjuague con agua una vez ms los portaobjetos y quite el exceso de agua. Si los portaobjetos an estn rosa, aplique una cantidad adicional de la solucin decolorante de 1 a 3 minutos. 12. Aplicar azul de metileno (1 minuto). 13. Aplique la solucin de contraste, azul de metileno, durante 1 minuto. 14. Enjuagar con agua 15. Vuelva a enjuagar con un leve chorro de agua e incline cada portaobjetos hasta drenar el exceso de agua. Finalmente, coloque cada portaobjetos en una gradilla a que sequen al aire. Procedimiento en fro 1. Hacer un frotis. 2. Dejarlo en el puente de tincin. 3. Aplicar fucsina-fenicada (solucin con fenol y mayor concentracin de fucsina). 4. Dejar en vasos coplin durante 20 minutos. 5. Decolorar con alcohol acido. 6. Lavar con agua del grifo. 7. Contrastar con azul de metileno Tincin Negativa Tincin negativa es una tcnica de microscopa que permite contrastar las muestras mediante una sustancia opaca a los fotones (microscopa ptica) o a los electrones (microscopa electrnica). En el primer caso, se emplea nigrosina o tinta china; para el caso de bacterias que esporulan, esta tcnica permite visualizar las esporas como entes refringentes sobre un campo de fondo oscuro.[1] En caso de microscopa electrnica de transmisin, se emplean sustancias de alto nmero atmico que, por tanto, resultan opacas a los electrones transmitidos. Tpicamente, estas sustancias son acetato de uranilo,

6 citrato de plomo o molibdato de amonio. Al eletrnico, esta tcnica permite visualizar virus, flagelos, bacterias y otros entes de escaso tamao. Lugol El lugol o solucin de Lugol es una solucin de yodo diatmico|I2 (1%) en equilibrio con yoduro de potasio|KI (2%) en agua destilada. Fue nombrada en honor al mdico francs Jean Guillaume Auguste Lugol|J. G. A. Lugol. Este producto se emplea frecuentemente como desinfectante y antisptico, para cubrir deficiencias de yodo, y para la desinfeccin de agua en emergencias. En microbiologa, es empleado en la tincin de Gram para retener el colorante cristal violeta. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta. JHA Este reactivo reacciona con algunos polisacridos como los almidones, glucgeno y ciertas dextrinas, formando un complejo de inclusin termolbil que se caracteriza por ser colorido, dando color diferente segn las ramificaciones que presente la molcula. El yoduro de potasio es agregado para aumentar la solubilidad del yodo diatmico por formacin del anin triatmico I3-. Adems se utiliza como antisptico y en determinacin de algunos polisacridos, como el almidn o el glucgeno. Frente a la presencia de estos, vira al color negro-morado. Tambin es usado para contrastar estructuras parasitarias como huevos y quistes Gracias