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RELATRIO DO ESTGIO PROFISSIONAL EM ANLISES CLNICAS

HEMATOLOGIA E COAGULAO

SUSANA ISABEL FERNANDES PEREIRA AGOSTINHO

REA DE INTERVENO: PERODO DE ESTGIO: LOCAL DA PRTICA:

Hematologia Janeiro 2006 a Dezembro 2006 LPD - Laboratrio Portugus de Anlises Clnicas

Susana Isabel Fernandes P Agostinho

Hematologia e Coagulao

NDICE

Introduo Descrio do local de estgio Listagem das anlises efectuadas durante o estgio Descrio por equipamento: o Analisador Sysmex SF-3000 - Hemograma o Analisador Starrsed - Velocidade de sedimentao o Analisador Sysmex CA-500 - Coagulao o Analisador Microtech 648 PC - Electroforese de hemoglobina Descrio das tcnicas manuais: o Imuno-hematologia o Citologia o Coagulao ndice de Figuras e Tabelas ndice de Abreviaturas Bibliografia

4 6 7

8 17 20 25

26 30 31 32 33 34

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INTRODUO
Este relatrio pretende descrever a minha actividade laboratorial na rea de Hematologia e Coagulao, no Laboratrio Portugus de Anlises Clnicas LPD, sob a superviso da Directora Tcnica, Dra. Maria Jlia Agrela, durante o ano de 2006. Esta fase coincidiu com o perodo em que frequentei o curso de especializao em anlises clnicas na Faculdade de Farmcia da Universidade de Lisboa (V Curso CEAC). Durante o perodo em que permaneci em Lisboa pude reforar os meus conhecimentos em vrias reas, quer pelo facto de estar a frequentar o curso de especializao quer, tambm, por estar mais perto de formaes, que de outra forma, no teria condies de assistir. De acordo com o que j referi nos meus relatrios anteriores, os meus dois primeiros anos de estgio profissional foram desenvolvidos no Funchal, no Laboratrio Castro Fernandes SA, nas reas de Endocrinologia; Imunologia; e Bioqumica. Como fazia parte da equipa de preveno que d apoio a duas clnicas com servio de urgncia, tive de me preparar para todas as valncias do laboratrio. Actualmente sinto que, nesses anos, a minha prestao na rea de hematologia foi insuficiente e consigo me lembrar de algumas situaes em que poderia ter dado uma informao mais completa ao clnico. Hoje em dia, sinto-me mais segura na validao de um resultado nesta rea e consigo perceber melhor quais as informaes relevantes que devem ser transmitidas. Outro aspecto importante deste meu estgio profissional foi o reforar da ideia de que fundamental perceber a origem do resultado analtico. H que entender a metodologia do equipamento, para conseguirmos detectar, de forma consciente, um possvel erro inerente ao mtodo aplicado. Essa funo da nossa exclusiva responsabilidade e pode ser crucial na avaliao do processo final. Todas as tecnologias so susceptveis de erros ou interferncias e cabe-nos a ns fazer a correcta avaliao do resultado final e, sempre que necessrio, recorrer a tcnicas complementares como a observao do esfregao de sangue perifrico. A hematologia e a microbiologia so reas onde a prtica , indiscutivelmente, um pilar da formao. Por mais tecnologia avanada que o laboratrio disponha, o tcnico deve estar apto a saber analisar qualquer parmetro ou situao. Durante este ano, tive oportunidade de aprender a lidar com a rotina de um departamento que considero muito aliciante. Pude tambm assistir a situaes menos frequentes, tendo sempre o apoio da Dra. Slvia Neves, responsvel pelo departamento de Hematologia do LPD. Participei na execuo e avaliao dos controlos internos e externos da qualidade, executei todas as tarefas e tcnicas manuais ao meu alcance e observei diariamente esfregaos de sangue perifrico ao microscpio. Durante 2 meses estive a estagiar, na parte da manh, na seco das colheitas onde aprendi a fazer colheitas com o sistema de vcuo. Sendo esta uma fase pr-analtica importante, era de esperar

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que resultasse numa grande aprendizagem e uma mais valia a nvel da compreenso do funcionamento global do laboratrio. Desde j, quero deixar aqui o meu maior agradecimento os colegas do LPD que me acolheram e permitiram que este estgio fosse proveitoso, quer a nvel tcnico quer na vertente humana.

DESCRIO DO LOCAL DE ESTGIO


DIRECO TCNICA DO LABORATRIO:

Dra. Maria Jlia Figueira Nunes Pereira de Agrela Especialista em Anlises Clnicas n 529 Carteira profissional n 4965

O Laboratrio - LPD - Laboratrio Portugus de Anlises Clnicas, est situado em Linda-aVelha, na Avenida Carolina Michaelis, n 24 B. Dispe as valncias de Bioqumica, Endocrinologia, Imunologia, Microbiologia, Hematologia e Coagulao. Todas as anlises que no sejam executveis neste laboratrio, so enviadas para a Clnica Dr. Mrio Moreira, no Porto. O LPD encontra-se em fase de implementao de um sistema de gesto da qualidade com vista concesso de um Certificado de Qualidade. Actualmente recebe em mdia 150 utentes por dia, sendo que o maior volume , muitas vezes, resultado de acordos com empresas de medicina do trabalho. Funciona das 7.30h s 18.00h, estando a recepo fechada hora do almoo. Tem dois postos de colheita: Toms Ribeiro e Pontinha. No tem servio permanente nem d apoio a nenhuma clnica com servio de urgncia. Fazem parte da equipa tcnica duas especialistas em anlises clnicas, trs tcnicas superiores, uma tcnica de anlises clnicas com licenciatura e uma auxiliar tcnica.

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LISTAGEM DAS ANLISES EFECTUADAS NO ESTGIO


Tabela 1. Listagem por parmetro das anlises efectuadas no departamento de hematologia e coagulao

Parmetro Contagem de reticulcitos Electroforese de hemoglobina Fibrinognio Frmula leucocitria Grupo sanguneo Hemograma - RBC - HGB - HCT - ndices: MCV MCH MCHC RDW-CV - WBC - diferenciao WBC Morfologia do sangue perifrico Plaquetas - Contagem - ndices: MPV P-LCR PDW Prova de falciformao Retraco do cogulo TH e TC T. Tromboplastina Parcial Activado(PTT) Tempo de Protrombina (TP) Testes de Coombs Velocidade de sedimentao

Tcnica Citologia: colorao Vital Electroforese em acetato de celulose Concentrao dada pelo tempo de coagulao com excesso de trombina Citologia: colorao com tcnica hemacolor Reaco com anti-soros em placa (hemaglutinao) DC (Direct Current Detection Method) / Impedncia SLS HGB Determinao colorimtrica Amplitude / Somatrio do sinal (impedncia) de RBC Clculo a partir de RBC e HCT Clculo a partir de RBC e HGB Clculo a partir de HCT e HGB Clculo Citometria de fluxo por laser semicondutor Citometria de fluxo por laser semicondutor Citologia: colorao com tcnica hemacolor DC (Direct Current Detection Method) / Impedncia Clculo Clculo Clculo Avaliao da capacidade de falciformao das clulas Tcnica manual Tcnica manual Estudo da coagulao com fosfolpidos e activador de superfcie Estudo da coagulao com tromboplastina e clcio Hemaglutinao Westergren adaptado

Aparelho/Empresa Eurotubo / Deltalab Microtech 648 PC Sysmex CA-500 / Dade Behring Reagentes Merck Biotec Laboratories

Pg. 30 25 23 14 28 15 8 11 9

Sysmex SF-3000 / Emlio Azevedo Campos SA

15

13 13 Reagentes Merck 14

Sysmex SF-3000 / Emlio Azevedo Campos SA

15

Na2O5S2 / Merck

30 32 31

Sysmex CA-500 / Dade Behring Biotec Laboratories StaRRsed

22 21 26 17

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DESCRIO DAS METODOLOGIAS E TCNICAS UTILIZADAS SYSMEX SF-3000 - Analisador usado na determinao do Hemograma e Plaquetas.

O Sysmex SF-3000 utiliza um sistema nico de distribuio das populaes celulares em histograma chamado de A.C.A.S., ou sistema adaptativo de anlise de classificao. Esta distribuio proporciona um resultado mais exacto, diminuindo a necessidade de repeties de amostra. Este contador automtico analisa 23 parmetros. Velocidade: processa 80 amostras/hora. Volume de amostra: 270l (modo fechado); 170l (modo aberto) Capacidade memria: 1000 testes incluindo histogramas Controle de qualidade: 12 arquivos (com 180 pontos cada)
Fig. 1 Analisador Sysmex SF-3000

Classificao Diluente

Nome

Tabela 1. Caractersticas dos reagentes e segurana Funo Componentes Reagente WBC/BASO Reagente anlise DIFF Diluente RBC/PLT Diluente HGB NaCl Tampo de cido brico Antissptico

pH neutro

Txico

CELLPACK

No

STROMATOLYSER FB Reagente hemoltico SULFOLYSER SLS

Reagente WBC/BASO

Surfactante no inico (SNI)

cido

No

Reagente HGB

Lauril sulfato de sdio; NaCl

neutro

No

STROMATOLYSER FD I Reagente para diferencial WBC STROMATOLYSER FD II

Reagente anlise DIFF

Surfactante no inico (SNI); NaCl; Antissptico; Cromognico Surfactante catinico; Surfactante no inico (SNI); NaCl; Antissptico

cido fraco

No

Reagente anlise DIFF

cido fraco

No

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Fig. 2 Esquema dos parmetros analisados pelo Sysmex SF-3000

A. Princpios de operao:
1. Glbulos vermelhos (RBC) e as Plaquetas (PLT) so determinados por impedncia elctrica. O princpio converter cada partcula num sinal electrnico que, uma vez processado, se relacione com o tamanho da partcula. Na zona de deteco, uma abertura de dimetro e comprimentos definidos, mantm uma corrente elctrica contnua entre um elctrodo interior e outro exterior. A corrente constante na ausncia de clulas ou partculas. Quando existem partculas ou clulas diludas no reagente a passar pela abertura, provocam um aumento momentneo da impedncia, que directamente proporcional ao volume das mesmas. O software ao processar estes dados d uma resposta na forma de histograma de volumes de glbulos vermelhos e plaquetas. Este sistema de deteco muito fivel e usado por vrios analisadores de diferentes casas comerciais.
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Esta tcnica tambm possibilita a determinao de 5 parmetros relacionados: RDW-SD; RDW-CV; PDW; MPV; P-LCR. Todas as amostras de sangue total so diludas a 1:25000 com CELLPACK antes de entrarem no detector. A diferenciao de RBC ou PLT ou rudo de fundo baseada em valores mnimos de impulso para cada uma das situaes.

Fig. 3 Valores mnimos de impulsos detectados permite distino RBC/PLT/Rudo

2. Os Glbulos Brancos (WBC) ou Leuccitos tm uma anlise mais complexa onde se inclui contagem total, diferenciao e classificao. Isto conseguido utilizando a tecnologia de citometria de fluxo com laser semi-condutor e disperso ptica. Depois de aspirada a amostra e diluda no reagente especfico, cada clula em suspenso conduzida at uma cmara de fluxo. Nesta cmara as clulas passam em fila atravs do canal central do bloco de quartzo da cmara. Por cada passagem de uma clula atravs da luz do laser, gera-se um sinal ptico que detectado como sinal elctrico e convertido em sinais digitais pelo software do sistema. As clulas sanguneas dispersam a luz em todas as direces medida que passam pela luz do laser. Esta luz dispersada, quando recolhida em ngulos especficos, oferece abundante informao sobre a morfologia celular, como o tamanho, estrutura interna, granularidade citoplasmtica e lobularidade nuclear. O tamanho celular obtido atravs de disperso de luz de baixo ngulo, enquanto que a informao acerca do contedo celular dado pela disperso de luz de alto ngulo. No primeiro caso uma partcula pequena tem uma disperso de luz reduzida e uma intensidade de disperso de luz baixa, sendo esta intensidade medida num ngulo especfico (1 a 6) - baixo ngulo. No segundo caso temos uma emisso de laser que vai gerar uma disperso de luz
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quando encontra a superfcie do ncleo ou dos grnulos. Analisando a intensidade de disperso de luz num ngulo especfico (8 a 20) possvel obter informao acerca do contedo celular. Os linfcitos e os moncitos, por exemplo, tero uma intensidade de disperso de luz baixa e um medida de disperso de luz de alto ngulo reduzida. A combinao destas duas informaes permite ao analisador diferenciar e avaliar os 5 tipos de leuccitos.

a) Disperso de luz de baixo angulo Informao do tamanho celular

b) Disperso de luz de alto angulo Informao do contedo celular

Fig. 4 Esquema dos dois tipos de informao obtida com disperso da luz

A anlise diferencial dos leuccitos tem duas abordagens:

- No canal DIFF, 33L de sangue total so diludos e hemolisados com FD (I) e FD (II). A combinao dos dois tipos de disperso de luz resulta num Diagrama de Disperso DIFF que apresenta 4 populaes de leuccitos: Linfcitos, Moncitos, Eosinfilos e Neutrfilos+Basfilos. O reagente FD (I) surfactante no inico cromognico carregado negativamente que estabiliza a morfologia leucocitria e conjuga-se com os grnulos dos eosinfilos possibilitando a diferenciao deste tipo de WBC. O FD (II) uma combinao de um surfactante catinico e um surfactante no-inico que possibilita a hemlise dos RBC. A maioria dos WBC mantm as suas caractersticas, com excepo dos moncitos.

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Fig. 5 Exemplo das reas relativas a uma disperso normal

- No canal WBC/BASO todos os leuccitos (e basfilos) so submetidos a anlise por citometria de fluxo usando laser semi-condutor originando um Diagrama de Disperso WBC/BASO. Neste caso o sangue total diludo e hemolisado com FB, que um reagente cido e contm agentes surfactantes no-inicos. Nestas condies cidas todos os WBC com excepo dos basfilos sofrem alteraes. Da ser o canal indicado para os basfilos para posterior diferenciao do valor total obtido pela contagem anterior (NEUT+BASO). NEUT# = WBC ( LYMPH# + MONO# + EO# + BASO#) NEUT%= 100 ( LYMPH% + MONO% + EO% + BASO%)

3. A Hemoglobina (HGB / Hb ) determinada por um mtodo colorimtrico, mtodo SLS ou lauril sulfato de sdio. O sangue total diludo a 1:500 e hemolisado. O reagente hemoltico e incorpora SLS. Aps reaco o sinal determinado colorimtricamente, sendo que a HGB-SLS produz uma absoro mxima a 535 nm. A leitura efectuada a 555 nm pois possui um sinal mais amplo comparativamente a outros mtodos e leituras. O conhecimento das caractersticas do Sysmex SF-3000, aliada formao que fui adquirindo ao longos destes anos, quer a nvel da licenciatura, quer na ps-graduao em anlises clnicas, tornou a minha prestao, como tcnica superior de anlises nesta seco, mais consistente.

B. Interpretao dos resultados analticos


Para alm do que j foi referido, este analisador dispe de um sistema automtico de alerta para situaes anormais e que o operador deve estar apto a identificar. So chamadas Mensagens interpretativas IP (Interpretive Messages), determinam o processo como positivo ou negativo e so descritas na tabela 2 . Existem dois tipos de mensagens IP; Anormais e Suspeitas. As primeiras podem ser adaptadas pelo operador aos critrios de validao do laboratrio, enquanto as segundas indicam possibilidades de alteraes com a amostra que devem ser averiguadas.
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Tabela 3. Descrio das mensagens do Sysmex SF-3000 Mensagens IP (1) Diagrama de disperso anormal WBC (2) Neutropnia (3) Neutrofilia (4) Linfopnia W B C Glbulos brancos (5) Linfocitose (6) Monocitose (7) Eosinofilia (8) Basofilia (9) Leucocitopnia (10) Leucocitose (1) Blastos ? (2) Granulcitos imaturos ? (3) Desvio esquerda ? (4) Linfcitos atpicos/anormais (5) NRBC/ PLT Agregados ? Parmetros afectados Anormais DIFF, WBC/BASO NEUT#, (NEUT%) NEUT#, (NEUT%) LYMPH#, (LYMPH%) LYMPH#, (LYMPH%) MONO#, (MONO%) EO#, (EO%) BASO#, (BASO%) WBC WBC Suspeitas DIFF, WBC/BASO WBC/BASO WBC/BASO DIFF, WBC/BASO DIFF Anormais (1) Distribuio anormal dos RBC RBC Glbulos vermelhos (2) Dupla populao (3) Anisocitose (4) Microcitose (5) Macrocitose (6) Hipocromia (7) Anemia (8) Eritrocitose (1) Aglutinao dos RBC ? (2) Interferncia na HGB ? (3) Deficincia de ferro ? (4) Defeitos na HGB ? (5) Fragmentos ? (1) Distrib. anormal das PLT (2) Trombocitopnia (3) Trombocitose (1) NRBC/ PLT Agregados ? RL, RU, WBC, MP flag, DW flag Valor numrico calculado pelo analisador e relacionado com variao do tamanho * RDW-SD > 65fL ou RDW-CV > 20% MCV < 70 fL MCV > 110 fL MCHC < 29,0 g / dL HGB < 10,0 g / dL RBC > 6,50 x 106 / L Regra de alerta Imagem da disperso DIFF e WBC/BASO NEUT # < 1 x 103 / L NEUT # > 11 x 103 / L LYMPH # < 0,80 x 103 / L LYMPH # > 4 x 103 / L MONO # > 1 x 103 / L EO # > 0,70 x 103 / L BASO # > 0,20 x 103 / L WBC < 2,50 x 103 / L WBC > 18,00 x 103 / L Imagem da disperso DIFF e WBC/BASO Imagem da disperso WBC/BASO Imagem da disperso WBC/BASO Imagem da disperso DIFF e WBC/BASO Determinado a partir do diagrama disperso

PLT

MP flag RDW-SD, RDW-CV MCV (VGM) MCV (VGM) MCHC (CHGM) HGB (Hb) RBC Suspeitas MCHC, MCH, RBC MCHC MCHC, MCV, RDW-CV RDW-CV, MCV RDW-SD, MCV Anormais PDW, PLT, P-LCR, MPV PLT PLT Suspeitas DIFF

* PLT < 60 x 103 / L PLT > 600 x 103 / L

Determinado a partir do diagrama disperso * Determinados a partir das quebras no grfico detectadas pelo analisador e pela forma do pico do histograma de distribuio de volume/tamanho. DW flag Quando no foi possvel determinar o valor de RDW-SD MP flag multiple peak in histogram RU - Position of RBC Upper discriminator RL Position of RBC Lower discriminator PU - Position of PLT Upper discriminator

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Estas so as condies que vieram por defeito com a instalao do aparelho. Cabe agora a cada laboratrio definir os seus intervalos de aceitao e adequar os intervalos de alerta do analisador.

Fig. 6 Exemplo de vrias alteraes hematolgicas identificadas nos diagramas de disperso.

importante saber tirar o mximo benefcio dos analisadores que estamos a trabalhar, mas tambm ter noo que existem erros possveis e que muitos deles j esto estudados. So exemplos disso: WBC A contagem de glbulos brancos pode estar incorrectamente aumentada na presena: - Eritrcitos resistentes lise - Aglutininas a frio (aquecer o tubo e pass-lo imediatamente no analisador) - Agregados plaquetrios - Eritroblastos (deve ser feita contagem e correco do valor final de WBC) - Criogamaglobulinas Os eritrcitos podem estar incorrectamente diminudos na presena de: - Aglutininas a frio (aquecer o tubo e pass-lo imediatamente no analisador) - Micrcitos - Eritrcitos fragmentados (esquiscitos) Os eritrcitos podem estar incorrectamente aumentados na presena de: - Leucocitose ( > 100 000/L) * O doseamento da hemoglobina pode estar incorrectamente aumentado na presena: - Leucocitose ( > 100 000/L) * - Lipmia * (correco tambm do MCHC) - Protenas anormais O hematcrito pode estar incorrectamente diminudo na presena de: - Aglutininas a frio (aquecer o tubo e pass-lo imediatamente no analisador) - Eritrcitos fragmentados (esquiscitos) - Esferocitose O hematcrito pode estar incorrectamente aumentado na presena de: - Leucocitose ( > 100 000/L) *

RBC

HGB

HCT

* O sangue dever ser centrifugado e o plasma deve ser reposto por igual volume de reagente de diluio e introduzido novamente no analisador. Assim so corrigidos o hematcrito e consequentemente o VGM, a hemoglobina, o RBC e os ndices associados. Susana Isabel Fernandes P Agostinho

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PLT

A contagem das plaquetas pode estar incorrectamente diminuda na presena de: - Pseudotrombocitopnia - Agregados plaquetrios - Megaloblastos e plaquetas gigantes (analisador conta como RBC) A contagem pode estar incorrectamente aumentada na presena de: - Micrcitos - Eritrcitos fragmentados (esquiscitos) podero aparecer em simultneo pois a sua

As mensagens Blastos e Linfcitos atpicos

distribuio idntica quer no diagrama DIFF (sendo a rea situada entre os linfcitos e os moncitos) quer no diagrama WBC/BASO. Este um exemplo de um caso que deve ser sempre avaliado o esfregao de sangue perifrico. A mensagem Granulcitos imaturos indicada apenas pelo diagrama WBC/BASO, devido ao procedimento que antecede a leitura, onde usado um reagente hemolisante cido. Este reagente preserva apenas a estrutura dos basfilos e destas clulas, sendo evidenciado no diagrama WBC/BASO, pela mancha superior. A desgranulao suprimida mas o tamanho no afectado. Sugere-se observao da lmina, a fim de caracterizar os possveis graus de maturao presente. No caso de Desvio esquerda onde tambm haja uma neutrofilia, indicador da existncia de neutrfilos em banda, devendo tambm ser confirmada com a observao do esfregao. A mensagem NRBC/PLT clumps surge no caso de estar presente uma mancha larga na zona abaixo dos linfcitos no diagrama DIFF (zona de rudo de fundo ou ghost ou background). Sugere a existncia de NRBC (nucleated red blood cells) ou mesmo agregados plaquetrios que podero estar a induzir uma falsa trombocitopnia. Esta segunda situao poder ser frequente, em situaes de colheitas difceis ou demoradas, devendo ser confirmada pela lmina, referida e justificada ao mdico ou ento pedida uma repetio de colheita para confirmao do resultado. Outras informaes pertinentes na validao dos resultados: - MCHC muito elevada (?) verificar a presena de hemlise, ou plasma lactescente. Confirmar, tambm, a existncia de esferocitose hereditria, hemoglobinopatia (Hb C), presena de aglutininas a frio ou, ainda, confirmar a possibilidade de teraputica com agentes quimioterpicos que podem desidratar os glbulos. - um nmero aumentado de partculas na zona de rudo de fundo ou background: verificar a deteriorao dos reagentes em uso, ou a presena de agregados plaquetrios.

Relativamente colorao das lminas para observao do esfregao do sangue perifrico utilizada a tcnica Hemacolor que uma colorao rpida, que resulta de uma adaptao do mtodo de MayGrnwald-Giemsa. Na observao ao microscpio so procurados aspectos que justifiquem ou complementem a informao fornecida pelas contagens do equipamento. So pesquisadas alteraes

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qualitativas e/ou quantitativas dos glbulos brancos, glbulos vermelhos e plaquetas. Sempre que seja necessrio proceder quantificao leucocitria com contagem manual, esta deve ser feita em duplicado (total de 200 leuccitos) devendo ser percorrida a maior parte do esfregao possvel na zona recomendada para esta avaliao. Os critrios de identificao devem ser partilhados e cumpridos por todas as pessoas responsveis por este departamento. O sistema de gesto da qualidade sugere que os casos patolgicos devem ser confirmados, se possvel, por 2 tcnicos com competncia para tal. Para uniformizar os critrios de validao, foram institudas quais as condies nas quais deve ser observado o esfregao de sangue perifrico:
- Aumento ou diminuio dos RBC; - Alteraes no MCV, MCHC, MCH e RDW, quando isoladas ou associadas a outras alteraes dos RBC; - Alteraes na HGB e HCT, incluindo situaes nas quais no se observam alteraes nos outros parmetros; - Sempre que pedida electroforese de hemoglobina ou outra anlise que sugira alteraes morfolgicas dos RBC; - Sempre que haja uma mensagem de alerta; - Sempre que haja uma inverso de frmula leucocitria, incluindo crianas e grvidas. - Aumento ou diminuio anormal das plaquetas.

Tabela 4. Valores de referncia utilizados na validao do hemograma VALORES DE REFERNCIA Homem RBC HGB HCT Mulher 3,8 5,8 11,5 16.5

Contagem total de glbulos vermelhos (milhes/mm ) Concentrao da Hemoglobina (g/dL) Hematcrito (% ocupada pelos RBC no volume total de sangue) - pode ser obtido: (RBC x VCM)/10 - depende do nmero de eritrcitos existentes no sangue mas tambm da sua forma e tamanho. Volume mdio dos eritrcitos (fL) - no caso do Sysmex SF-3000 depende do HCT Volume mdio de hemoglobina nos eritrcitos (pg) - razo entre a hemoglobina e os eritrcitos (HGB/RBC) x 10 Concentrao mdia de hemoglobina nos eritrcitos (g/dL) - razo entre a hemoglobina e o hematcrito (HGB/HCT) x 100 Contagem total das plaquetas - excluir: Pseudotrombocitopnia: agregados plaquetrios, satelitismo, plaquetas gigantes, aglutininas a frio. - excluir: Pseudotrombocitose: crioglobulinmia, inf. por parasitas da malria, fragmentos de RBC, microesfercitos.

4,5 6,5 13,0 18, 0

40,0 54, 0

37,0 47,0

VCM/VGM

76,0 96,0

76,0 96,0

HCM/HGM

27,0 32, 0

27,0 32,0

CHCM

30,0 36,0

30,0 36,0

PLT

150 000 a 380 000

150 000 a 380 000

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VALORES DE REFERNCIA Homem WBC NEUT Mulher 4,0 11,0 2,1 7,6 45 70 < 0,60 16 < 0,20 01

Contagem total de glbulos brancos (milhares/mm ) Contagem total de neutrfilos (milhares/mm3) Percentagem em relao ao WBC total (%) Contagem total de eosinfilos (milhares/mm3) Percentagem em relao ao WBC total (%) Contagem total de basfilos (milhares/mm3) Percentagem em relao ao WBC total (%) Contagem total dos linfcitos (milhares/mm3) Percentagem em relao ao WBC total (%) - deve ser considerada a relao com os neutrfilos em percentagem para averiguar inverso da frmula. Caso exista confirmar a morfologia dos linfcitos por observao da lmina do esfregao do sangue perifrico.

4,0 11,0 2,1 7,6 45 70 < 0,60 16 < 0,20 01

EO

BASO

LYMPH

1,0 4,20 20 45

1,0 4,20 20 45

MONO

Contagem total de moncitos (milhares/mm3) 0,10 1,20 Percentagem em relao ao WBC total (%) 2 10 - no caso do Sysmex SF-3000 a contagem diferencial do moncitos pode necessitar de ajuste por parte do operador. Os reagentes usados no garantem a morfologia destas clulas e os casos anormais devem ser confirmados por lmina.

0,10 1,20 2 10

Cada hemograma analisado tendo em conta o sexo, a idade, o histrico e a informao disponvel relativamente a outros pedidos laboratoriais (ex. Valor da ferritina , etc).

C. Controlo da Qualidade
O controlo da qualidade interno processado diariamente nos trs nveis (baixo, normal e alto), utilizando controlos fornecidos pela empresa representante do Sysmex SF-3000 (Emlio Azevedo Campos), que tambm fornece um outro controlo inter-laboratorial (IQAS) feito periodicamente com todos os laboratrios que utilizam este analisador. O resultado enviado em formato de disquete por correio, sendo avaliado e respondido posteriormente, ao LPD, tambm por correio. O operador tem acesso a fazer pequenos ajustes na calibrao da hemoglobina e do hematcrito, caso os resultados do controlo interno o justifiquem. Nesses casos os controlos dirios so repetidos, sendo a alterao registada no dossier do aparelho. O controlo externo da qualidade efectuado segundo um protocolo estabelecido com o Instituto Nacional de Sade Dr. Ricardo Jorge (PNAEQ-INSA) quer a nvel de hemograma, quer tambm a nvel de avaliao de esfregaos corados de sangue perifrico.

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STARRSED - Analisador usado na determinao da Velocidade de Sedimentao (VS ou ESR)

Instrumento automtico utilizado para a avaliao da velocidade de sedimentao dos eritrcitos com base no mtodo de Westergren - sistema rotatrio com leitor de cdigo de barras, uma unidade de enchimento, uma unidade de leitura e uma unidade de lavagem e secagem imediata. - constitudo por 120 pipetas de vidro do tipo Westergren. - Amostra: sangue total com EDTA - Tempo de execuo da anlise: 1 hora - Ligao online ao sistema informtico central. - Volume amostra: 1,7mL sangue total com EDTA
Fig. 7 Analisador Starrsed

A.

Princpios de operao:

O mtodo de referncia de Westergren utiliza um tubo de vidro graduado numa escala de mm, com 30 cm de comprimento e no mnimo de 2,55 mm de dimetro. Nestas condies e temperatura ambiente foi possvel correlacionar a velocidade de sedimentao dos eritrcitos com um estado clnico definido, sendo muito utilizado como marcador inespecfico de inflamao, e sobretudo na monitorizao de patologias j diagnosticadas. A definio actualmente aceite para esta anlise no a velocidade de sedimentao dos eritrcitos mas, simplesmente, a medida da distncia em milmetros, que ocorreu sedimentao dos eritrcitos na primeira hora de estudo da sedimentao. Existem vrios factores que influenciam a sedimentao. Podem estar relacionados com as propriedades dos eritrcitos ou com as propriedades do plasma ou ainda factores mecnicos e factores tcnicos. A velocidade de sedimentao de uma partcula directamente proporcional massa da partcula e diferena de densidade entre a partcula e o fluido e inversamente proporcional viscosidade do fluido. De acordo com o mtodo de referncia, foi desenvolvido um sistema automatizado onde so garantidas as condies deste processo fsico sem que haja qualquer interveno do operador.

B.

Interpretao dos resultados analticos

O processo de sedimentao eritrocitria de uma amostra de sangue humano com anticoagulante um fenmeno natural. O aumento da sua velocidade que deve ser avaliado. Num processo inflamatrio a quantidade de fibrinognio no sangue aumenta exponencialmente levando
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aglomerao dos eritrcitos, mais conhecido como Fenmeno de rouleaux que conduz ao aumento da velocidade de queda ou sedimentao dos mesmos. O fenmeno rouleaux est tambm associado a patologias linfoproliferativas, onde um ou mais tipos de imunoglobulinas so exageradamente secretados. Contudo, existem tambm estados no patolgicos onde a velocidade de sedimentao (VS) poder estar aumentada: - No sexo feminino a VS naturalmente mais elevada e na gravidez (a partir 3ms). - Idade: acima dos 50 anos j deve ser considerado outro valor limite para o normal. - Durante o perodo menstrual e com o uso de contraceptivos orais. No entanto, como j foi referido, um bom marcador de inflamao, sendo actualmente utilizado sobretudo, na monitorizao de doenas inflamatrias crnicas.

Tabela 5. Valores de Referncia para mtodo Westergren

Idade Criana Adulto Idoso


a

Sexo feminino < 10 < 20 < 25

Sexo masculino < 10 < 15 < 20

Westergren (1924) : A tcnica original especificava o citrato de sdio 3,7% como anticoagulante numa proporo

de 4:1, com valores de referncia mais baixos dos que esto apresentados nesta tabela para sangue total com EDTA. Posteriormente j foram efectuadas algumas outras modificaes do mtodo com ajustes dos valores de referncia. Ex. Wintrobe and Landsburg (1935); Landau (1933)

Tabela 6. Alteraes das protenas plasmticas que aumentam a VS:

PCR Fibrinognio Haptoglobina Ceruloplasmina

Aumento das imunoglobulinas Diminuio da albumina cido -1- glicoproteina -1 antitripsina

til no diagnstico e monitorizao do tratamento da arterite temporal, da polimialgia reumtica e da Doena de Hodgkin. Valores muito altos (>100 mm/h) tm valor predictivo de 90% em doenas graves, incluindo infeces, doenas do tecido conectivo e doenas malignas (sobretudo mieloma). A velocidade de sedimentao pode estar diminuda na poliglobulia, na insuficincia cardaca e em caso de distonia neurovegetativa. As medies repetidas permitem apreciar a evoluo de um estado patolgico. A tabela 7 enumera as principais situaes onde avaliada a progresso da VS.

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Tabela 7. Correlao Clnica da Velocidade de sedimentao

I. VS muito aumentada ( > 100 mm3/h)


A. Mieloma mltiplo e Macroglobulinmia de Waldenstrms B. Linfoma maligno C. Leucemias D. Anemia severa E. Carcinoma / Sarcoma F. Infeco bacteriana aguda severa G. Doenas de colagnio H. Cirrose biliar I. Colite ulcerativa

II. VS moderadamente aumentada


A. Doenas infecciosas agudas e crnicas B. Infeces agudas localizadas C. Febre reumtica e Artrite Reumatide D. Hiper e Hipotiroidismo E. Tumores malignos com necrose F. Enfarte agudo do miocrdio (leso tecidular aguda)* G. Intoxicaes por Chumbo ou Arsnico H. Hemorragias internas I. Hepatite aguda viral J. Tuberculose (inflamao crnica) K. Glomerulonefrite aguda L. Hiperlipidmia

III. VS usualmente normal


A. Apendicite aguda (durante as primeiras 24h) B. Cirrose heptica C. Artrite degenerativa D. Mononucleose infecciosa sem complicaes E. Alergias agudas e Toxoplasmose F. Febre tifide e outras doenas por Rickettsias

IV. VS muito baixa


A. Policitmia vera (devido grande concentrao de eritrcitos) B. Drepanocitose e Esferocitose (mesmo com anemia severa no detectada na VS) *No enfarte e isqumia o estudo da VS poder servir como factor de prognstico: uma VS aumentada aquando da admisso hospitalar est associada a uma deteriorao clnica durante as primeiras 24h aps enfarte, pois serve provavelmente como marcador de trombo.

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Sysmex CA-500 - Analisador usado no estudo da coagulao

Fig. 8 Analisador Sysmex CA-500

O Sysmex Automated Blood Coagulation Analyser da srie CA-500 um dispositivo compacto e totalmente automatizado com capacidade para anlise de 5 parmetros aleatrios para utilizao em Diagnstico in vitro. - Processamento prioritrio de amostras (STAT). - Funo de controlo de qualidade incorporada com possibilidade de arquivo de 6 ficheiros (lotes QC). - Mtodo utilizado: Mtodo de Coagulao. - Tipo de amostra: plasma de uma soluo de 1 parte citrato de sdio a 3,8%, a 9 partes de sangue venoso. - Leitura por cdigo de barras. - Volume de amostra: 0,5 mL . - Processa no mximo 54 testes / hora

A.

Princpios de Operao

O LPD utiliza este analisador para a determinao do Tempo de Protrombina (TP) com clculo de INR, Tempo de Tromboplastina parcial activado (PTT) e fibrinognio (FIB). Princpios de Anlise: Mtodo de deteco da reaco da coagulao (mtodo de deteco da luz dispersa): - Uma mistura de plasma e reagente exposta a luz vermelha (660nm). A alterao da turvao que ocorre quando o fibrinognio transformado em fibrina detectada como uma alterao na respectiva luz dispersa e, assim, medido o tempo de coagulao. Mtodo de deteco do ponto de coagulao (mtodo de deteco da percentagem): - Partindo do princpio que a intensidade da luz dispersa logo aps o incio da deteco 0% e que a intensidade quando termina a reaco de coagulao de 100%, ento o intervalo de tempo decorrido at que a luz dispersa definida no ponto de deteco de coagulao atingida o tempo de coagulao. O tempo mximo de deteco est estipulado para 120 segundos no caso do TP, de 100 segundos para o Fibrinognio e de 190 segundos para PTT. Acima desse valor, definido como incoagulvel, o tcnico dever reportar ao Responsvel do Departamento ou Direco Tcnica, de forma a decidir o procedimento posterior.

A curva de calibrao um conjunto de valores utilizado para determinar cada parmetro de clculo com base no tempo de coagulao nos resultados da anlise.

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TEMPO DE PROTROMBINA (TP); Tempo de Quick; INR; Taxa de Protrombina Reagente: Thromborel

S da Dade Behring - tromboplastina clcica humana liofilizada

proveniente de placenta humana. reconstitudo com gua destilada tendo uma estabilidade de 5 dias aps reconstituio, desde que conservado entre 2 a 8 C. Fundamento: Determinao do tempo de protrombina (TP), segundo Quick. Mede a actividade de diversos factores de coagulao. O processo de coagulao desencadeado mediante incubao do plasma com quantidades ptimas de tromboplastina e clcio. Mede-se o tempo transcurso at formao do cogulo de fibrina. considerado um teste de triagem rpido e sensvel para detectar transtornos da coagulao no mbito do sistema extrnseco (factores II, V, VII e X). Com o mesmo reagente poderia determinar-se a actividade de cada um destes factores, bastando para isso adquirir um plasma deficitrio correspondente. Devido ao seu alto grau de sensibilidade a estes factores, esta anlise usada para: regulao e controlo da terapia anticoagulante por via oral com cumarnicos, diagnstico de deficincias congnitas de factores do sistema extrnseco, diagnstico de deficincias adquiridas dos factores de coagulao, controlo da actividade de sntese heptica em doenas do fgado

O equipamento fornece os resultados em trs nveis: tempo (em segundos), taxa (em percentagem do valor normal) e em INR (razo normalizada internacional). O valor de INR calculado mediante um factor de correco (ISI), includo em cada lote de reagente. O valor da percentagem obtido dividindo o tempo de reaco da amostra pelo tempo de reaco de uma pool de plasmas normais (ex. Plasma humano standard ou Control Plasma N). A calibrao efectuada na abertura de um novo lote, utilizando um Plasma humano standard (Dade Behring), sendo programada no analisador de acordo com o procedimento Definir curva de calibrao. Para estabelecimento da curva de referncia ainda introduzido um valor especfico do calibrador tendo em conta o reagente utilizado. Cada embalagem de calibrao constituda por 6 frascos contendo uma pool de plasmas de dadores sos liofilizada, com uma estabilidade aps reconstituio de 4 semanas, desde que a 20C. Aps reconstitudo ou descongelado, o plasma no dever permanecer mais de 2 horas temperatura ambiente. O controlo de qualidade efectuado diariamente, utilizando o Control Plasma N (Dade Behring) e o analisador arquiva os valores em ficheiro prprio, podendo ser feita uma avaliao de conjunto, sem ser necessrio recorrer a clculos posteriores. Os valores de referncia, no caso da medio em segundos, so determinados tendo em conta o aparelho e a metodologia utilizada. A taxa dever estar entre 70 a 130%

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O INR num indivduo saudvel sem teraputica, dever estar prximo do valor 1,0. No caso de teraputicas com anticoagulantes cumarnicos, o INR pode ser interpretado mediante vrios escales teraputicos descritos na tabela 8.
Tabela 8. Valores de INR consoante o escalo teraputico

Indicao - Trombose venosa profunda - Embolia pulmonar - Doenas arteriais e enfarte do miocrdio - Vlvulas cardacas artificiais - Embolias sistmicas recidivantes

INR recomendado por escalo teraputico 2,0 3,0

% da actividade

36 23 %

2,5 3,5

28 19 %

TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADO (APTT) Reagente: Pathromtin SL da Dade Behring : partculas de dixido de silcio, fosfolpidos vegetais, cloreto de sdio, hepes. Aps abertura, mantm-se estvel por 2 semanas temperatura 2 a 25 C. Fundamento: Determinao do tempo de tromboplastina parcial activado em plasmas humanos citratados. A incubao do plasma com quantidades ptimas de fosfolpidos e um activador de superfcie leva a uma activao dos factores do sistema intrnseco da coagulao. Mediante a agregao de ies de clcio desencadeado o processo de coagulao. Mede-se o tempo transcurso at formao de um cogulo de fibrina. utilizado: - como teste de triagem de perturbaes da coagulao, especialmente antes de intervenes cirrgicas, a fim de poder submeter potenciais hemoflicos a um tratamento preventivo, - no diagnstico da hemofilia, - no controlo de teraputica heparnica, - na avaliao da via intrnseca da coagulao (factores VIII, IX, XI, XII devem estar todos presentes e em nveis adequados num caso de um PTT normal). Obs. Valores muito aumentados de PTT devero ser repetidos, usando mistura 1:1 de plasma em anlise e plasma normal. Se o valor for corrigido sinal de deficincia de algum factor. Caso contrrio a existncia de um inibidor a opo mais provvel. O controlo da qualidade efectuado diariamente com Control Plasma N (Dade Behring). Valores esperados: 26 36 segundos

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DETERMINAO DA CONCENTRAO DE FIBRINOGNIO Reagente: Multifibren U (Trombina bovina; pptido retardador da agregao da fibrina; cloreto de clcio; brometo de hexadimetrina; polietilenoglicol; NaCl; Tris; albumina bovina; azida de sdio). Estabilidade aps reconstituio de 2 meses a 20C ou de 5 dias a 2 8C. Fundamento: Modificao do mtodo de Clauss. O plasma citratado levado coagulao com um grande excesso de trombina. Neste caso, o tempo de coagulao depender largamente do teor de fibrinognio da amostra. A interpretao dos resultados feita atravs de uma curva de referncia efectuada previamente sempre que o reagente muda de lote utilizando o mesmo calibrador descrito para o TP. O doseamento de fibrinognio pode estar diminudo em caso de: Deficincia de fibrinognio adquirida: - em consequncia de uma protelise intravascular do fibrinognio pela trombina (coagulopatia de consumo). Ex. em obstetrcia, aps intervenes cirrgicas, venenos de serpente ou plasmina (hiperfibrinlise 1ria ou terapia com estreptoquinase, uroquinase ou tPA). - doenas hepticas ( produo), - perda no espao intravascular (ascites ou hemorragia aguda) - choque ou carcinomas ( degradao) Deficincias de fibrinognio congnitas: Relativamente ao seu aumento muito frequente associ-lo a situaes de inflamao, trauma, enfarte do miocrdio e infeces, j que considerada uma protena de fase aguda. Um aumento persistente pode estar associado a doenas inflamatrias crnicas e neoplasias. O controlo de qualidade efectuado sempre que haja um pedido deste doseamento, usando para isso o Control Plasma N (Dade Behring). A calibrao efectuada sempre que h mudana de lote, sendo utilizado Plasma humano standard (Dade Behring). Valores esperados: 1,8 3,5 g/L

B.

Interpretao dos resultados analticos

Na avaliao dos resultados obtidos para as provas de coagulao devem ser recolhidas todas as informaes relativas medicao do utente e, caso esteja a fazer medicao anticoagulante, se houve alguma alterao recente. Sempre que o resultado o justificar o utente ou o mdico devem ser contactados.
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Tabela 8. Frmacos que podem modificar a aco dos anticoagulantes orais (anti-vitamina K)

Aco Potenciao do efeito anticoagulante

Mecanismo
Diminuio da sntese dos factores de coagulao Aumento do catabolismo dos factores de coagulao Diminuio da disponibilidade de vitamina K Aumento da afinidade para o receptor Deslocao do anticoagulante da protena de transporte no plasma Inibio enzimtica

Frmacos
Salicilatos; Quinidina Esterides anabolizantes; Tiroxina ATB largo espectro; Esterides anabolizantes; Clofibrato; Tiroxina; Metotrexato Esterides anabolizantes; Tiroxina AINES; Sulfamidas; Clofibrato; c. Nalidixico Antidepressivos tricclicos; Dissulfiran; Isoniazida; Metilfenidato; Fenirapidol; Contraceptivos orais Griseofulvina; Mg(OH)2; Barbitricos; Colestiramina; Laxantes Barbitricos; Griseofulvina; Carbamazepina; Rifampicina; Tiroxina; Fenitona; Rifampicina; lcool etlico Vitamina K, Corticosterides; Estrogneos

Inibio do efeito anticoagulante

Inibio da absoro do anticoagulante

Induo de enzimas microssomticas hepticas

Estimulao dos factores de coagulao

Os resultados devem ser confirmados na mesma amostra sempre que no estejam compatveis com o histrico do utente, ou quando o valor de INR superior a 3,0. Resultados com valor muito discrepante e sem que haja justificao clnica, devem ser repetidos, com nova colheita. O anticoagulante usado deve ser sempre o citrato de sdio a 3,8%, 3,2% ou 3,13%. - Quando se utiliza qualquer outro anticoagulante, que no esta soluo, dar origem a uma precipitao de cor branca, conduzindo a resultado de anlise incorrectos. - Quando a proporo da mistura varia, o tempo de coagulao tambm varia, originando ocasionalmente resultados de anlise incorrectos. As amostras devem ser analisadas nas 4 horas seguintes colheita se conservadas com refrigerao, - Quando as amostras tm mais de 4 horas ou no so conservadas em condies de refrigerao, no daro resultados de anlise correctos.

C.

Controlo da Qualidade

Como j foi referido, o controlo da qualidade interno efectuado, sempre que esses parmetros existam na lista de trabalho diria, e so arquivados em ficheiro prprio no analisador. O controlo externo da qualidade efectuado segundo um protocolo estabelecido com o Instituto Nacional de sade Dr. Ricardo Jorge (PNAEQ-INSA) com envio peridico de amostras liofilizadas para estudos de coagulao.

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MICROTECH 648 PC - Analisador usado para a Electroforese da Hemoglobina

Representante: Baptista Marques. - tiras: acetato de celulose em suporte Mylar. - tampo: especfico para electrof. de Hb. - sistema de cabea electromagntica com um sensor ptico. - soluo corante: Vermelho de Ponceau; TCA. - soluo descorante: cido Ctrico. - soluo de lavagem (transparentizante). - tina de migrao permite uma correcta distribuio da corrente, contendo 2 elctrodos (carbonium). - leitura por 8 canais de densitmetro, garantindo rapidez, preciso e confiana nos resultados.

Fig. 9 Analisador para Electroforeses

ELECTROFORESE DA HEMOGLOBINA

A.

Princpios de Operao

As hemoglobinas normais e variantes apresentam uma diferente mobilidade electrofortica podendo, portanto, serem identificadas atravs de electroforeses executadas em acetato de celulose. O padro electrofortico de um adulto normal apresenta, apenas, tipos fisiolgicos de hemoglobina, estes incluem HbA, HbF e HbA2. A deteco de bandas anormais indica a presena de variantes de hemoglobina. A electroforese em acetato de celulose a um pH alcalino um mtodo simples e til na separao, na identificao qualitativa e na determinao semi-quantitativa de diferentes tipos de hemoglobina. Estudos realizados para este kit de hemoglobinas alcalinas, determinaram o limite de deteco para concentraes superiores a 0,4 mg/ml.

B.

Interpretao dos resultados analticos

- HbA o tipo de hemoglobina predominante no glbulo vermelho. O seu pico electrofortico tem forma regular com perfil uniforme do lado do ctodo e ligeiramente untuosa do lado do nodo. - Banda HbA2 normalmente pequena e concentrada, apesar de ligeiramente corada. - As bandas HbA2 e de anidrase carbnica so marcas importantes da qualidade do padro electrofortico das hemoglobinas. - O ponto de aplicao da amostra no deve ser visvel no padro. (se estiver visvel, provvel ocorrer um padro manchado, com fraca resoluo e uma focagem das bandas inferior ao normal).
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Tabela 9. Valores de referncia das vrias fraces da hemoglobina

Fraco HbA HbA2 HF

Percentagem 96 98 % 1,5 3,5 % < 2,0

Fig.10 Imagem electrofortica de uma migrao

Interferncias: A lavagem dos glbulos vermelhos, com uma soluo salina, antes da aplicao, fundamental para uma boa qualidade do padro electrofortico. Amostras congeladas podero produzir uma banda falsa perto da HbA.

C.

Controlo da Qualidade

Todas as amostras so processadas em duplicado e, caso haja discrepncia entre os dois resultados, todo o ensaio repetido. Em cada ensaio so usados sangues de controlo da Interlab (Hemo-Cal) ou sangues normais que tenham sido processados correctamente com os controlos.

Tcnicas manuais Imuno-Hematologia

TESTE DE COOMS DIRECTO- Teste directo da antiglobulina humana Reagente: BIOTEC Laboratories -Soro de Coombs Verde (BIOTEC Laboratories): Contm anticorpos antiglobulina humana (antiIgG) e anticorpo anti-complemento C3d humano (anti-C3d). Fundamento: Este teste utilizado na deteco de anticorpos ou protenas do complemento na superfcie dos glbulos vermelhos, cuja sensibilizao ocorreu in vivo. o principal teste para diagnstico da hemlise auto-imune, hemlise induzida por drogas e reaces transfusionais. O reagente (AGH) directamente adicionado aos glbulos vermelhos em anlise lavados. Amostra: Sangue total fresco ou conservado a 2 - 8 C (colhido em tubo de EDTA)

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Procedimento: Prova efectuada em tubo: 1. Lavar as clulas a serem testadas 4 vezes com grandes volumes de soro fisiolgico. Entre cada lavagem, decantar completamente aps centrifugao a 3000 rpm durante 5 minutos. Manter os tubos bem tapados com parafilme ou tampa adequada. 2. Ressuspender os glbulos em soro fisiolgico de modo a obter uma suspenso a 5%. (ex. 20 L de glbulos em 400 L de soro fisiolgico). 3. Deitar num tubo: 2 volumes de reagente de coombs e 2 volumes de suspenso celular. 4. Homogeneizar cuidadosamente e centrifugar durante 1 minuto a 1000 rpm. 5. Agitar levemente e examinar a presena de aglutinao. Os negativos so confirmados ao microscpio ptico e por adio de clulas sensibilizadas.

TESTE DE COOMS INDIRECTO Pesquisa de aloanticorpos Reagentes: - Albumina bovina a 30% - potenciador da aglutinao em grupagem de sangue; - Soro de Coombs Verde (BIOTEC Laboratories) - Clulas 0 Rh positivas frescas; - soro fisiolgico; - soro anti-D (para o controlo +) Fundamento: A presena de aloanticorpos irregulares da classe IgG na circulao materna, pode ter consequncias graves no filho (ex. eritroblastose fetal). A aloimunizao pode ter acontecido em partos de incompatibilidade sangunea, aborto, amniocentese, transfuses sanguneas, etc. Esta anlise utilizada tambm na deteco de anticorpos imunes na anemia hemoltica auto-imune e em provas de compatibilidade eritrocitria. A tcnica utiliza como reagente adicional a Albumina bovina a 30%. Os anticorpos dos grupos sanguneos (do tipo IgG) so incapazes de aglutinar eritrcitos directamente, presumivelmente por o seu tamanho no ser o adequado. A presena de protenas de alto peso molecular como a albumina bovina ajuda a ultrapassar este problema. Amostra: Soro do paciente Descrio do Procedimento: 1 FASE: Fase de potencial sensibilizao hemcias (clulas 0 Rh positivo) com anticorpos imunes, caso existam no soro do paciente. So utilizadas clulas 0 Rh positivo pois deste modo a presena de anticorpos Anti-A e/ou Anti-B no soro no dar origem a aglutinaes interferindo com a tcnica 2 FASE: Aglutinao das hemcias sensibilizadas por adio do soro de Coombs (AGH). Controlo positivo (clulas sensibilizadas): Clulas 0 Rh positivo previamente lavadas em suspenso a 3% com 2 gotas de soro Anti-D (30 min a 37C); Controlo negativo: Clulas 0 Rh positivo previamente lavadas em suspenso mas com 2 gotas de soro fisiolgico em vez de soro Anti-D).
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Tcnica: 1. Lavar as clulas 0 Rh positivo 4 vezes com um grande volume de soro fisiolgico. Entre cada lavagem decantar aps centrifugao a 3000 rpm durante 5 minutos. 2. Preparar uma suspenso a 3 % das clulas lavadas; (ex. 12 L clulas + 400 L soro fisiolgico) 3. Identificar um tubo de vidro com o n do utente. Adicionar 2 gotas de soro a ser testado (mas no controlo negativo usar 2 gotas de soro fisiolgico) + 2 gotas de suspenso de clulas (mas no controlo positivo usar 2 gotas das clulas j sensibilizadas) + 1 gota de albumina bovina. 4. Incubar a 37C durante 30 minutos; 5. Lavar 4 vezes as clulas que esto depositadas no tubo com grandes volumes de soro fisiolgico, decantando aps centrifugao a 3000 rpm durante 5 minutos. 6. Adicionar 2 gotas AGH; centrifugar 1 min a 1000 rpm. Observar aglutinao macroscpica. Falsos resultados pela tcnica de AGH (Antiglobulina humana) Falsos negativos: - A tcnica de lavagem das clulas a serem testadas de grande importncia, uma vez que a presena de protenas livres susceptvel de neutralizar o reagente AGH. Falsos positivos: - Existncia de aglutinao das clulas antes da adio do soro de coombs, devido a aglutininas a frio ou outros factores que induziram uma aglutinao no especfica; - Uma centrifugao correcta favorece a aproximao entre as clulas sensibilizadas e os anticorpos do soro-reagente (AGH ou Coombs), no entanto, uma centrifugao exagerada pode conduzir a uma pseudo-aglutinao (falso positivo).

DETERMINAO DO GRUPO SANGUNEO AB0 e Rh Reagente: Anti-soro A, Anti-soro B, Anti-soro D e Anti-soro C,D,E da BIOTEC Laboratories Ltd. Correspondem aos reagentes para a prova celular pesquisa de antignios (Ag) nas clulas (eritrcitos). A determinao da prova srica s utilizada em casos de confirmaes, e so usadas clulas comerciais para pesquisar anticorpos no soro do utente. Fundamento: So testes de aglutinao para reconhecimento dos antignios A e/ou B (tipagem AB0) e do antignio D (tipagem Rh), nos glbulos vermelhos humanos, permitindo a atribuio de um grupo sanguneo ao utente em anlise. Neste sistema poder haver 8 possibilidades diferentes: A(-); A(+); B(-); B(+); AB(-); AB(+); 0(-); 0(+) Os anticorpos (Ac) presentes nos reagentes, vo reagir com os antignios (Ag) presentes ou no na superfcie dos eritrcitos. A reaco Ac-Ag produz uma aglutinao macroscpica.
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A ausncia de antignio D sempre confirmada com a pesquisa de Du. O termo colectivo Du utilizado para descrever clulas que tenham diferenas quantitativas (fracas) ou qualitativas (parciais), em relao ao glbulos vermelhos Rh D positivos normais. O reagente utilizado o Anti-C+D+E (Biotec laboratories). O componente anti-D monoclonal IgM deste reagente aglutina directamente glbulos vermelhos D positivos e a maioria das Du . O componente Anti-D monoclonal IgG aglutina fentipos Du de baixo grau, pelo teste indirecto de anti-globulina (soro de coombs). Procedimento: Aglutinao dos glbulos vermelhos que transportam antignios C, D ou E na presena do anticorpo especfico correspondente. O reagente uma mistura de Anti-C IgM humano (clone MS-24), Anti-D IgM humano (clone MS-201), Anti-E IgM humano (clone MS-80) e Anti-D IgG humano (clone MS-26). Contm tambm albumina bovina e potenciadores qumicos macromoleculares. O seguinte esquema ilustra a forma como se confirma o Factor Rh:

Soro Anti-D (reagente BIOTEC) + Clulas em estudo

Presena de Aglutinao

Ausncia de Aglutinao

Rh positivo

Pesquisa de Du, C e E

Os resultados negativos da pesquisa pelo teste de Coombs (soro AGH) devem ser confirmados. Para isso basta juntar ao tubo final 2 gotas de clulas sensibilizadas e centrifugar 1 min a 1000 rpm. Deste modo testamos a actividade do soro AGH e eliminam-se possveis erros na execuo da tcnica. Na leitura do resultado ao m.o., observam-se eritrcitos aglutinados (que foram sensibilizados com IgG) e outros eritrcitos isolados (em estudo), fenmeno designado por Mix-Field Obs. Preparao das clulas sensibilizadas: 2 gotas de reagente anti-D + 3 ml de soluo R previamente diludo (1:10) Soluo R: suspenso a 3 % de clulas 0 Rh positivas previamente lavadas em soro fisiolgico.

Teste de Coombs Indirecto para pesquisa de antignios fracos do sistema Rhesus.

POSITIVO

NEGATIVO

Rh positivo

Rh negativo

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Tcnicas manuais - Citologia

CONTAGEM DE RETICULCITOS (Colorao vital) Reagente: Corante azul de cresil brilhante e azul de metileno (Eurotubo- Deltalab) Fundamento: Os reticulcitos so clulas vermelhas jovens que contm RNA residual suficiente para ser corado. As granulaes so azuis devido precipitao destes corantes com o cido ribonucleico (RNA). A contagem de reticulcitos um bom indicador da eritropoiese. O seu aumento pode estar associado a um aumento da necessidade de glbulos vermelhos, sendo assim, indicador de que a medula est a responder bem s demandas do organismo. Pode tambm ser associado a outros testes, no despiste de doping (se > 2,5%) Procedimento: Adicionar 3 gotas de sangue total aos tubos do fornecedor contendo corante. Misturar bem e deixar incubar 10-15 min temperatura ambiente. Agitar o tubo e fazer 2 esfregaos, deixando-os secar ao ar. Observar no microscpio com leo de imerso. Os reticulcitos apresentam-se com uma colorao esverdeada com os grnulos corados de azul. Interpretao dos resultados: A contagem deve ser feita em 1000 eritrcitos, percorrendo diferentes partes ou reas da lmina.

Valores de referncia: - recm-nascidos:

0,5 a 2,5 % 2,5 6,5 %

(o valor desce aps 2 semana de vida)

Fig.11 Reticulcitos numa colorao vital

PESQUISA DE CLULAS FALCIFORMES Reagente: Na2O5S2- Metabissulfito de Sdio da Merck (M= 190 g/mol) Fundamento: O sangue tratado com um agente redutor (metabissulfito de sdio), potenciando assim a formao de clulas falciformes, nos casos de Drepanocitose. Procedimento: Numa lmina limpa misturar 1 gota de sangue fresco e uma gota de reagente. Cobrir de imediato com a lamela e derreter uma vela nos bordos da lamela. Observar ao microscpio

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ptico e avaliara a presena de clulas em foice. Em caso negativo, levar estufa a 37C e fazer observaes peridicas (5, 10, 15 minutos). Falciformao imediata- Drepanocitose ntida (homozigotia) Falciformao entre 5-15 min.: formas atenuadas (heterozigotia)

Fig 12 Clulas falciformes

Tcnicas manuais - Coagulao

T. de hemorragia (TH), T. de coagulao (TC) e retraco do cogulo (RC) Tempo de hemorragia: Aps desinfeco da pele do lobo da orelha, faz-se uma inciso horizontal, com uma lanceta, de 4 mm de comprimento. A inciso deve ser feita na borda do lobo. O sangue que vai afluindo ao local deve ser removido de 30 em 30 segundos, sem tocar na inciso. Valor de referncia: 1 a 4 min Este valor, est relacionado com a hemostase primria e poder estar aumentado em: Anomalia a nvel da contraco dos vasos; Adeso anormal das plaquetas ao colagnio; Libertao anormal de ADP ou de tromboxano; Contagem baixa das plaquetas (trombocitopnia); Doena de Von Willebrand e indivduos com problemas renais; Administrao de aspirina ou outros anti-agregantes plaquetrios. Obs. TH est normal em: Hemofilia; Hipofibrinogenmia e Hipoprotrombinmia hereditria.

Tempo de coagulao: Colher 4 a 5 ml de sangue venoso. Disparar o cronmetro logo que aparea sangue na seringa. Colocar 1 mL em cada tubo de ensaio de vidro e deixar em banho-maria a 37C. Aps 5 min observar o primeiro tubo e registar o tempo at que se forme um cogulo. Valor de referncia: 6 a 12 min Este valor poder estar aumentado em: Hemofilia; Deficincia em vitamina K; Uso teraputico de heparina e dicumarol; Afibrinogenmia; Presena de anticoagulantes circulantes (ex. anticoagulante lpico, heparina) Obs. TC est normal em: Trombocitopnia; Deficincia do F.VII; Doena de Von Willebrand

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Retraco do cogulo: Colher 5 mL de sangue e colocar num tubo graduado, sem anticoagulante, e deixar coagular em banho-maria ou na estufa a 37C. Aps formao do cogulo, deixar o tubo a 37C durante 3 horas. Decorrido esse tempo, retirar com cuidado, o cogulo formado e centrifugar o soro e glbulos vermelhos restantes. Observar no tubo graduado a quantidade de soro restante e aplicar a frmula: % retraco = volume do soro / volume de sangue x 100 Valores de referncia: 40 % a 50 %

NDICE DE FIGURAS E TABELAS

Fig. 1 Fig. 2 Fig. 3 Fig. 4 Fig. 5 Fig. 6 Fig. 7 Fig. 8 Fig. 9 Fig. 10 Fig. 11 Fig. 12

Analisador Sysmex SF-3000 Esquema dos parmetros analisados pelo Sysmex SF-3000 Valores mnimos de impulsos detectados permite distino RBC/PLT/Rudo Esquema dos dois tipos de informao obtida com disperso da luz Exemplo das reas relativas a uma disperso normal Exemplo de vrias alteraes hematolgicas identificadas nos diagramas de disperso. Analisador Starrsed Analisador Sysmex CA-500 Analisador para Electroforeses Imagem electrofortica de uma migrao Reticulcitos numa colorao vital Clulas falciformes

Tabela 1 Tabela 2 Tabela 3 Tabela 4 Tabela 5 Tabela 6 Tabela 7 Tabela 8

Listagem por parmetro das anlises efectuadas em hematologia e coagulao Caractersticas dos reagentes do sysmex SF-300 e segurana Descrio das mensagens do Sysmex SF-3000 Valores de referncia utilizados na validao do hemograma Valores de Referncia para mtodo Westergren Alteraes das protenas plasmticas que aumentam a VS: Correlao Clnica da Velocidade de sedimentao Frmacos que podem modificar a aco dos anticoagulantes orais (anti-vitamina K)

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NDICE DE ABREVIATURAS

AINES APTT ATB BASO CHGM DIFF EO FIB Hb HBG HCM HGB INR ISI LYMPH MCH MCHC MCV m. o. MONO NEU PLT PTT RBC SLS SNI TP VCM VGM WBC

Anti-inflamatrios no esterides Tempo de tromboplastina parcial activado Antibitico Basfilos Concentrao de hemoglobina globular mdia Diferenciao da srie branca (leuccitos) Eosinfilos Fibrinognio Hemoglobina Hemoglobina Hemoglobina corpuscular (globular) mdia Hemoglobina Razo Normalizada Internacional Internacional Sensitivity Index Linfcitos Hemoglobina corpuscular (globular) mdia Concentrao de hemoglobina globular mdia Volume globular (corpuscular) mdio Microscpio ptico Moncitos Neutrfilos Plaquetas Tempo de tromboplastina parcial activado Red Blood Cells Glbulos vermelhos (rubros) ou hemcias Lauril Sulfato de Sdio Surfactante no inico Tempo de protrombina Volume globular (corpuscular) mdio Volume globular (corpuscular) mdio White Blood Cells Glbulos brancos

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BIBLIOGRAFIA

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1.

- Folhetos informativos dos reagentes.

- Manuais dos Equipamentos.

- Manual Tcnico de Hematologia do Laboratrio Portugus de Anlises Clnicas (LPD).

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