IdentiIicao Laboratorial de

Leveduras de Importncia Medica

nneke Marie van der Heijden
Laboratrio de Bacteriologia (LM-54)
nstituto de Medicina Tropical
Hospital das Clnicas - FMUSP
Caractersticas gerais Caractersticas gerais
Grupo heterogneo
Unicelulares
Diversidade
Cor das colnias
Textura
Reproduo
Reproduo das leveduras Reproduo das leveduras
Assexuada
stado anamorfo
Por brotamento ou
gemuIao
Formao
bIastocondios e
pseudo-hifas
Reproduo das leveduras Reproduo das leveduras
Reproduo sexuada: conjugao
Ascosporadas
Candida guilliermondii (anamorfo)
Pichia guilliermondii (teleomorfo)
Anascosporadas
Candida famata (anamorfo)
Debaryomyces hansenii (teleomorfo)
Balistosporadas
Rhodotorula rubra
Basidiosporadas
Cryptococcus neoformans (anamorfo)
Filobasidiella neoformans (teleomorfo)
Procedimentos laboratoriais Procedimentos laboratoriais Procedimentos laboratoriais Procedimentos laboratoriais
Diagnstico laboratorial
Exame direto: levedura ou fungo filamentoso ?
Cultura: isolamento e identificaao
Condioes adequadas de incubaao
Neio de cultivo
Temperatura
Tempo
Agar Sabouraud com cloranfenicol (leveduras e fungos
filamentosos)
Agar PDA (batata-dextrose) (fungos filamentosos)
Agar Mycobiotic=Mycosel= agar seletivo para fungos
patognicos (uso restrito=inibe vrios fungos sensveis
cicloheximida, inclusive leveduras)
Meios mais utilizados na Meios mais utilizados na
micologia micologia
xame direto da amostra xame direto da amostra xame direto da amostra xame direto da amostra
a fresco entre lmina e lamnula
aps clarificao com KOH (10 a 20%)
com tinta da China (nanquim)
aps colorao:
.esfregaos (Gram, Giemsa e outras)
.cortes histolgicos (Mucicarmin de Mayer,
Gomori-Grocott, H.E. e outras)
xame da cuItura: xame da cuItura:
achados microscpicos achados microscpicos
xame da cuItura: xame da cuItura:
achados microscpicos achados microscpicos
Leveduras com filamentao (hifas)
abundante: Candida spp.
escassa: Candida spp e outras dezenas de
gneros (p.ex. hifas curtas,curvas=Malassezia spp)
Leveduras sem filamentao
Sem cpsula: Candida spp e outros gneros
capsuladas: Cryptococcus neoformans
Exame direto Leveduras
dentificao Laboratorial dentificao Laboratorial
Colorao de GRAM Colorao de GRAM
Colorao de Mucicarmin
Fonte: Laboratrio de Micologia MT LM HC/FMUSP
Colorao de Gomori Colorao de Gomori- -Grocott Grocott
Fonte: Laboratrio de Micologia MT LM HC/FMUSP
dentificao Laboratorial dentificao Laboratorial
Pureza das colnias
Deteco por exame direto
Sub-cultivo
Tcnica de esgotamento
Meios seletivos
Cloranfenicol: inibir bactrias
Cicloheximida: inibir fungos anemfilos
dentificao Laboratorial dentificao Laboratorial
Caractersticas macroscpicas
dentificao Laboratorial dentificao Laboratorial
Caractersticas microscpicas
Tcnica de esgotamento Tcnica de esgotamento
FinaIidade: obter coInias isoIadas FinaIidade: obter coInias isoIadas
Pureza das colnias Pureza das colnias
#agar #agar Candida Candida
$ugere espcie conforme $ugere espcie conforme
cor da colnia: cor da colnia:
Verde = Verde = C. albicans C. albicans
Azul = Azul = C. tropicalis C. tropicalis
Rosa = Rosa = C. krusei C. krusei
Branco = outras espcies Branco = outras espcies
e outros gneros e outros gneros
Alternativa: meios cromognicos Alternativa: meios cromognicos
dentificao Laboratorial dentificao Laboratorial
Mtodos clssicos
Anlise morfolgica
Assimilao de fontes de carbono e nitrognio
Fermentao de carboidratos
Hidrlise da uria (teste da urease)
Mtodos comerciais
Mtodos clssicos de Mtodos clssicos de
identificao de leveduras identificao de leveduras
Anlise morfolgica
presena de cpsula
produo de tubo germinativo, em geral
leitura s 2h
cultivo em lmina (micromorfologia,
filamentao e presena de clamidosporos)
Tubo germinativo Tubo germinativo
dentificao presuntiva e rpida de
Candida albicans
Descrito em 1960
Capacidade de formar filamentos na
presena de soro (1-3 h)
Humano, fetal bovino ou cavalo
Tcnica simples
94-97% de positividade para C. albicans
Sidrim et al., 1999
Fonte: anuaI da ANVI$A, 2005-duIo 7
Anlise morfolgica Anlise morfolgica
Produo de tubo germinativo
- - ausncia de tubo germinativo ausncia de tubo germinativo
2 2 - - presena de tubo germinativo presena de tubo germinativo

2 2
Produo de tubo Produo de tubo
germinativo germinativo
Anlise morfolgica Anlise morfolgica
Cultivo em lmina
Fonte: anuaI da Anvisa, 2005- duIo 7
Cultivo em lmina Cultivo em lmina
spcies de
Candida spp
Candida albicans Candida albicans
Anlise morfolgica Anlise morfolgica
Presena de cpsula
Anlise morfolgica Anlise morfolgica
Presena de cpsula
Assimilao de fontes de C
Assimilao de nitrognio
Fermentao de carboidratos
I#AA
Hidrlise da uria (teste da urease)
Mtodos clssicos de Mtodos clssicos de
identificao de leveduras identificao de leveduras
AUXAN#AA AUXAN#AA
}

Presena de oxignio
Utilizao de fontes de:
Carbono (a partir de acares)
Nitrognio (a partir de nitrato)
CQ: cepas ATCC
AUXAN#AA AUXAN#AA
Meio basal sem fonte de carbono
$Iido ou lquido
east Nitrogen Base (YNB)- 40mL
nculo: escala 1 McFarland (2mL)
ncorporar suspenso de levedura ao meio
Aplicao de discos ou acar in natura
ncubao 30
o
C por 24-48h
AUXAN#AA AUXAN#AA
Meio basal sem fonte de nitrognio
Slido
east Carbon Base (YCB)- 20mL
nculo: escala 1 McFarland (1mL)
ncorporar suspenso de levedura ao meio
AUXAN#AA AUXAN#AA
Auxanograma Auxanograma
Aplicao de compostos nitrogenados
Peptona (controle positivo)
Nitrato de potssio
ncubao 30
o
C por 24-48 h at 7 dias
Resultados: presena de zona de
crescimento (leitura visual)
Baixa tenso de oxignio
Fermentao
Utilizao de fontes de Carbono
a partir de acares
produo de CO
2
Meio lquido ou semi-slido gelosado
a 0,6%
I#AA I#AA
Meio basal (3mL)
Azul de bromotimol (opcional), extrato de levedura,
peptona, etanol 95% e gua
Soluo de acar 6% (1,5mL)
Suspenso levedura: 2 McFarland (0,2mL/tubo)
Leitura aps 10-14 dias de incubao a 37
o
C
Resultados: presena ou ausncia de bolhas no tubo de
Durham
ZMOGRAMA ZMOGRAMA
Testes adicionais Testes adicionais
Teste da urease
Positiva: Cryptococcus neoformans
Negativa: Candida albicans
Resistncia cicloheximida
Resistentes: C. albicans, C. stellatoidea,
C.guilliermondii e C.pseudotropicalis
Cultura positiva
Exame direto
Bactria Levedura
Cultura Pura
Sim No
Obter Colnia Pura
por isolamento
Cpsula
+
Macromorfologia
oInia bege:
Criptococcus sp
oInia
saImo/Iaranja:
Rhodothorula sp
-
Tubo Germinativo
- +
C. albicans
Provas Bioqumicas e Cultivo em Lmina (continua)
FIuxograma para FIuxograma para
Identificao de Identificao de
Leveduras de Leveduras de
Importncia dica Importncia dica
uItivo em Imina uItivo em Imina
Provas bioqumicas Provas bioqumicas
Blastocondios - Urease positiva:
nositol - : Rhodotorula
nositol + : Cryptococcus
Presena de artrsporos(=artroconidios)
Urease - : eotrichum
Urease + : %richosporon (brotamento +)
Artrsporos Artrsporos
botanyutorontoca
mycoIogyadeIaideeduau
eotrichum eotrichum sp sp
Artrsporos Artrsporos
%richosporon %richosporon sp. sp.
http://www.doctorfungus.org
%richosporon beigelii %richosporon beigelii
Sidrim et al., 1999
Mtodos comerciais de Mtodos comerciais de
identificao de leveduras identificao de leveduras
Chromoagar Candida
AP 20C AUX (BioMrieux)
D 32C (BioMrieux)
Candifast (nternational Microbio)
Vitek (BioMrieux)
Meios cromognicos Meios cromognicos
Cromognicos: detectam enzimas
atravs de substratos especficos ou
substratos cromgenos
Permitem deteco de colnias mistas
Rpida identificao de C. albicans
Colnias Colnias::
Verdes Verdes == C C.. albicans albicans
Azul Azul == C C.. tropicalis tropicalis
Rosa Rosa == C C.. krusei krusei
Branco Branco == outras outras espcies espcies
Chromoagar Chromoagar Candida Candida
Painel de identificao Painel de identificao
AP20C AUX system (BioMrieux) AP20C AUX system (BioMrieux)
19 testes assimilativos - incubao 30
o
C - 24, 48
e 72 horas
Leitura por verificao de crescimento - turbidez
Necessidade de correlao com a anlise
morfolgica
nforma a necessidade de testes adicionais
Mtodo de referncia
Acurcia entre 96 e 98% para as espcies
patognicas mais comuns, sem testes adicionais
AP20C AUX system AP20C AUX system
(BioMrieux) (BioMrieux)
AP20C AUX system AP20C AUX system
(BioMrieux) (BioMrieux)
AP20C AUX system AP20C AUX system
(BioMrieux) (BioMrieux)
D 32 C STRPS D 32 C STRPS
(BioMrieux) (BioMrieux)
29 testes
leitura aps 24/48 horas de incubao a 30
o
C -
visual ou automatizada
taxas de identificao variam de 94 a 98 %
Ramani et al, 1998
taxa de identificao de 92% para as espcies comuns
de leveduras
85 % para isolados raros
apresenta uma base de dados bastante ampliada
Comparao entre os mtodos comerciais Comparao entre os mtodos comerciais
semi semi- -automatizados mais utilizados na automatizados mais utilizados na
identificao de leveduras identificao de leveduras
Fonte: Sidrim e Moreira, 1999.
Candifast Candifast (nternational Microbio) (nternational Microbio)
dentificao e teste de sensibilidade
Gneros: Candida, %richosporon, Cryptococcus, Rhodotorula e
Saccharomyces
nico inculo e leitura colorimtrica
Resultados em 24 a 72 horas (37
o
C)
dentificao
sensibilidade actidione
fermentao de 7 acares
hidrlise da uria
Teste de Sensibilidade
sete antifngicos: 1 concentrao
www.int-microbio.com
Vitek system (BioMrieux) Vitek system (BioMrieux)
Sistema automatizado: leitura
turbidimtrica
26 substratos baseado nos mtodos
convencionais
Bionmero - banco de dados do
sistema
Resultado: percentual de
probabilidade de ser a espcie
identificada
16 espcies de Candida
6 espcies de Cryptococcus
3 espcies de Rhodotorula
2 espcies de %richosporon
3 espcies de eotrichum
2 espcies de Prototheca, Pichia
anomala, Pichia ohmeri, Saccharomyces
cerevisiae e Yarrowia lipolytyca
Vitek system (BioMrieux) Vitek system (BioMrieux)
Vitek system (BioMrieux) Vitek system (BioMrieux)
Percentual de probabilidade baixo = testes adicionais
93 % das leveduras comuns foram identificadas
55 % das leveduras menos comum foram corretamente
identificadas
Falhas na identificao:
42% de C. krusei
80 % de C. lambica
88 % de %. beigelli
83 % de Cryptococcus (no C.neoformans)
Vitek system (BioMrieux) Vitek system (BioMrieux)
Sistema rpido e adequado para identificar os isolados clnicos
comuns
Falhas na identificao de leveduras no usuais (Dooley et al,
1994)
Vitek 2 Vitek 2
Vitek 2 ID Y$% ard
47 testes (29 clssicos e 18 enzimticos)
leitura fluorescente automatizada
15 horas de incubao
base de dados com 51 espcies
inclui Candida dubliniensis e a atualizao
sistemtica dos gneros Rhodotorula e
%richosporon
taxa de identificao de 96,8%
omparao entre mtodos omparao entre mtodos
comerciais para identificao de comerciais para identificao de
Ieveduras Ieveduras
Candifast X Vitek
98% de concordncia (www.int-microbio.com)
Candifast X AP 20C AUX (Gundes et al., 2001)
116 isolados clnicos (C.albicans, C.parapsilosis, C.glabrata e
outras leveduras)
87% de identificaes corretas para AP 20C
82,7% de identificaes corretas para Candifast
Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).
Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).
Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).
Consideraes finais Consideraes finais
Diversos mtodos
Diferentes nveis de sensibilidade, especificidade e
acurcia em cada sistema
Necessidade de estudo morfolgico e/ou a
complementao com testes tradicionais
Escolha do(s) mtodo(s)
Realidade de cada laboratrio
Freqncia de isolamento
Custo do teste
Eficcia do teste