3.

1 Prosedur Analisa Komponen Gula dengan HPLC (Suhardi, 1993) Cara Kerja: Kolom : AMINEX HPX-87H, 300 mm x 7,8 mm resin ion eksklusi Flow rate Detektor Mobile Phase : 0,5 ml/menit : RID (Reflective Index Detector) 156 : Aquadest Dmin Bebas Ion; atau Aquabides. Konsentrasi Asam Sulfat (H2SO4) 0,01 N Merk : Beckman Suhu : Max 50C dengan tekanan pompa saat operasi 344 psi Sistem Elusi Waktu : 15 menit Preparasi Sampel: 1. Sampel ditimbang sebanyak 5 gram dan dipindahkan ke dalam tabung sentrifus polietilen sebanyak 50 ml
2.

: Isokratik

Sampel bebas lemak ditambahkan 20 ml campuran etanol absolut:air (80:20), dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifus, kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 80C selama 30 menit. Selain itu disentrifus dengan kecepatan minimum 2000 rpm selama 10 menit

3.

Supernatan yang didapat ditambahkan larutan Pb-asetat 10% sebanyak 2 ml. Kemudian disentrifus lagi dan dipisahkan supernatannya

4. Endapan yang didapat ditambah 20 ml campuran etanol absolut:air (80:20) dikocok dan disentrifus, supernatannya digabung dengan supernatan yang didapat sebelumnya
5.

Gabungan supernatan diuapkan dengan rotari evaporator sampai volume 10 ml. Kelebihan Pb-asetat dihilangkan dengan menambahkan Na-oksalat 5% sampai tidak terjadi endapan

6. Larutan dimasukkan kedalam labu takar 25 ml lalu ditambahkan etanol absolut:air (80:20) sampai tanda 7. Setelah dikocok sampai homogen, kemudian disaring dengan millex 8. Selanjutnya contoh siap diinjeksikan ke dalam HPLC
9.

Dibuat kurva standar gula: sukrosa, glukosa, fruktosa masing-masing 1000; 750 dan 500 ppm, volume injeksi 10 l

10. Perhitungan kadar gula didasarkan pada interpolasi dari kurva standar dengan menggunakan regresi linier Cara Kerja Alat: 1. Pasang kolom sesuai dengan komponen yang akan dianalisa
2.

Siapkan eluen (mobile phase) H2SO4 0,01 N, yang akan digunakan dalam botol (eluen telah disaring dengan kertas saring 0,45 m)

3. Masukkan selang inlet dari unit HPLC ke dalam botol eluen 4. Hidupkan stop kontak ke sumber arus bertegangan 220 V 5. Hidupkan unit alat (pompa, detektor, dan rekorder) dengan menekan tombol ON 6. Atur program (flow rate) sesuai yang diinginkan dan hilangkan gelembung udara yang terikut dalam selang 7. Hidupkan lampu detektor dan atur panjang gelombang yang diinginkan
8. 9.

Berikan waktu untuk kondisioning sampai diperoleh garis dasar (bare line) yang rata Suntikkan sampel (sudah disaring dengan filter 0,45 m) kedalam injektor port. Pada saat yang bersamaan tekan tombol start pada rekorder

10. Diamkan beberapa saat sampai semua komponen yang diinginkan keluar ke dalam kromatogram di dalam rekorder 11. Bandingkan dengan standar yang diinjeksikan dengan volume yang sama dengan volume sampel Cara Mematikan Alat:
1.

Cuci kolom dengan cara mengalirkan eluen dengan flow rate 0,2 ml/menit selama 10 menit. Kemudian kolom dicuci dengan etanol selama 10 menit dengan flow rate yang sama. Kolom dilepas kemudian disimpan

2.

Matikan lampu detektor

3. Matikan pompa 4. Matikan unit HPLC dengan menekan tombol OFF 5. Cabut semua stop kontak dengan sumber arus

METODE ANALISA PATI/AMILUM PADA SAMPEL CAIR: SEPERTI: NIRA TEBU, NIRA KELAPA, NIRA SIWALAN, JUICE BUAH dsb nya. Lakukan metode analisa sebagai berikut: Preparasi sampel: 1. Sampel ditimbang sebanyak 5 gram dan dipindahkan ke dalam tabung sentrifus polietilen sebanyak 50 ml
2.

Sampel bebas lemak ditambahkan 20 ml campuran etanol absolut:air (80:20), dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifus, kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 80C selama 30 menit. Selain itu disentrifus dengan kecepatan minimum 2000 rpm selama 10 menit

3.

Supernatan yang didapat ditambahkan larutan Pb-asetat 10% sebanyak 2 ml. Kemudian disentrifus lagi dan dipisahkan supernatannya

4. Endapan yang didapat ditambah 20 ml campuran etanol absolut:air (80:20) dikocok dan disentrifus, supernatannya digabung dengan supernatan yang didapat sebelumnya 5. Supernatan dipakai untuk penetapan atau analisa profil gula (monosakarida dll), endapan dipakai untuk analisa pati/amilum. 6. Residu/endapan dicuci beberapa kali dengan aseton, endapan/residu diuapkan dgn vacuum oven suhu 70 oC. Resdiu dihaluskan timbang 300 400 mg dan dilarutkan dengan aquabides 10 ml. 7. Campuran dididihkan dengan waterbath 4 jam. Setelah dingin tambahkan larutan buffer asetat 0,3 ml dan tambahkan 0,4 ml ensim amiloglukosidase (6100 unit/ml. Sigma Chemical, St. Louis) dan beberapa tetes toluene. Campuran di inkubasi pada 37 oC selama 24 jam. 8. Campuran di pi dahkan ke 50 ml labu ukur secara kuantitatif dan ditambahkan etanol 85% sampai garis batas. 9. Campuran disaring dengan whatman 541. Filtrat sebanyak 25 ml diuapkan dengan vacuum evaporator suhu 40 oC sampai diperoleh filtrate 3 5 ml. 10. Sebaiknya filtrate disaring dengan seperangkat alat ultrafiltrasi. Jangan gunakan kertas whatman, agar umur kolom HPLC bisa lama dan kromatogram yang diperoleh lebih bagus.

11. Sampel di injeksikan pada mesin HPLC untuk analisa gula dan kadar pati dalam sampel di hitung
12.

Kadar pati di hitung (g/100 g bahan) Luas area peak SPL X vol STD X kons. STD (g/100 g) X Total residu (mg) X 1.000 Luas area peak STD X vol STL X SPL. residu (mg) X SPL awal (g) X 55

Catatan: SPL = sampel; STD = standart; peak = area luas permukaan puncak.