ISOLASI DAN IDENTIFIKASI PATOGEN

Oleh : Anna Yulita Sesar Fikri F. Goldha Biggest D. Nella Andini Y. Hafid Syaifuddin B1J008098 B1J008100 B1J008148 B1J009042 B1J009073

Rombongan II Kelompok 1 Asisten : Anna Laura

LAPORAN PRAKTIKUM FITOPATOLOGI

KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2011

I.

PENDAHULUAN A. Latar Belakang

Perkembangan suatu penyakit didukung oleh tiga faktor, yaitu inang yang rentan, patogen yang virulen dan lingkungan yang mendukung. Patogen terbukti memiliki daya virulensi yaitu keberhasilan untuk menyebabkan suatu penyakit sebagai ekspresi dari patogenisitas. Gejala layu dan rontok pada daun seiring dengan perkembangan bercak dapat diduga sebagai akibat dari substansi-substansi yang disekresikan oleh patogen dalam mekanisme penyerangannya untuk melumpuhkan inang. Kelompok-kelompok utama substansi yang disekresikan patogen ke dalam tubuh tumbuhan yang menyebabkan timbulnya penyakit, baik langsung atau tidak langsung adalah enzim, toksin, zat pengatur tumbuh, dan polisakarida (Semangun, 1996). Pengadaan bibit tanaman kehutanan berkualitas baik dalam jumlah yang cukup pada waktu yang tepat, merupakan salah satu faktor penentu keberlangsungan pengelolaan hutan lestari. Serangan patogen di pesemaian merupakan salah satu penyebab tidak terpenuhinya target penyediaan bibit tanaman kehutanan yang dibutuhkan. Oleh karena itu muncul dan berkembangnya penyakit-penyakit di pesemaian perlu dipelajari agar dapat dilakukan tindakan pencegahan atau pengendalian secara tepat (Achmad et al., 1999). Isolasi adalah proses pemisahan mikroorganisme yang diinginkan dari populasi campuran ke media biakan (buatan) untuk mendapatkan kultur murni. Inokulasi merupakan perpindahan inokulum dari sumbernya ke dalam tanaman inang. Dengan dilakukannya inokulasi, berarti patogen memiliki peluang yang besar untuk

menyerang inangnya dan menimbulkan penyakit. Hal ini dapat menjelaskan pengaruh inokulasi yang nyata terhadap intensitas dan luas serangan penyakit hawar daun. Sedangkan identifikasi adalah membandingkan gejala yang ada atau yang ditemukan dengan yang terdapat di dalam buku/pustaka (Perhutani, 1999).

B. Tujuan Mengetahui penyebab penyakit dengan cara mengisolasi dan mengidentifikasi patogen yang menyebabkan penyakit pada tumbuhan.

II.

TINJAUAN PUSTAKA

Isolat penyebab penyakit atau patogen yang diperoleh dari tumbuhan yang sakit menunjukkan bahwa patogen adalah berupa cendawan atau fungi. Pengamatan secara makroskopis terhadap biakan murni isolat pada media PDA menunjukkan bahwa pada hari pertama setelah tanam terlihat berupa koloni serabut benang tipis, berwarna putih keruh dan kecoklatan yang merupakan kumpulan miselia. Pada hari ke-3, mulai terlihat adanya gumpalan-gumpalan kecil yang tidak teratur dan berwarna putih menyebar tidak merata pada permukaan miselia. Pada hari ke-5, gumpalangumpalan tersebut berubah menjadi berwarna coklat yang disebut dengan sklerotia. Secara mikroskopis, fungi ini memiliki ciri-ciri antara lain percabangan hifa yang tampak tegak lurus, memiliki septa atau bersekat, tidak terdapat bentuk konidia atau bentuk spora serta tidak ditemukannya sambungan apit (clamp connection). Biakan fungi tumbuh dengan cepat, hanya dalam waktu tiga hari koloninya telah memenuhi cawan Petri dengan media PDA (Achmad dan M. Maisaroh, 2004). Menurut Agrios (1988), enzim pektinase turut terlibat dalam peristiwa penyumbatan saluran pembuluh dan peristiwa penyakit layu. Penyumbatan saluran pembuluh dapat menimbulkan akumulasi etilen yang terpusat dan munculnya substansi-substansi lain seperti auksin. Hal ini merubah permeabilitas sel, sehingga daun menguning, terjadi penggulungan, dan kerontokan dini (Goodman et al., 1967). Perkembangan penyakit juga bergantung pada faktor lingkungan, setelah faktor inang dan patogen. Fungi patogen dalam perkembangannya dipengaruhi oleh beberapa faktor abiotik yaitu suhu, kelembaban, oksigen, derajat kemasaman (pH) dan cahaya. Kisaran suhu terendah yang diduga turut mendukung fungi patogen untuk berkembang biak, seperti yang dinyatakan oleh Ullstup (1939) dalam Ogoshi

et al., (1985) bahwa Rhizoctonia sp. dapat memperbanyak diri pada kisaran suhu optimum antara 20 C 30 C.

III. METODE A. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah Laminar Air Flow (LAF), cawan petri, pipet tetes, kertas saring, jarum ose, lampu spirtus dan skapel. B. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum Isolasi dan Identifikasi Patogen adalah media PDA, alkohol 70%, akuades, chloramphenicol, dan preperat yang digunakan adalah daun Mangga (Mangifera indica), daun Jagung (Zea mays), daun Singkong (Manihot utillissima), buah Cabai (Capsicum annum), buah Stroberi (Fragaria sp.) serta buah Tomat (Lycopersicon esculentum). C. Cara Kerja 1. Disiapkan media PDA dalam cawan petri, kemudian bagian sampel dari daun tanaman yang sakit dipotong dengan skapel. 2. Bagian sampel tanaman sakit yang telah dipotong dicuci dengan alkohol 70%, kemudian dibilas dengan akuadas, lalu keringkan dengan kertas saring. 3. Sampel tanaman sakit yang telah disiapkan pada no.2 dimasukan kedalam media PDA aseptis. 4. Diinkubasi 5x24 jam dalam suhu kamar. Setelah diinkubasi, isolat diambil 1 plug dan ditanam kembali pada media PDA yang baru. 5. Diinkubasi kembali 3x24 jam. 6. Biakan hasil permurniaan diamati dan diindentifikasi. IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Tabel pengamatan isolasi dan identifikasi: No. Pengamatan Kelompok

1. 2. 3.

Warna koloni Tepi koloni -rata -bergerigi Tekstur permukaan -halus -kasar Warna sebaliknya koloni Polo penyebaran -tersebar -konsentris -radial

1 abu-abu

2 putih

3 hitam keabuabuan *

4 putih

5 putih

6 putih

* *

4. 5.

* hijau tua

* putih kekunin gan

* hitam keabuabuan

* merah

* Putih pucat

putih

* * * * * *

Keterangan: * = (tanda benar)

Gambar koloni hasil inkubasi dan identifikasi

B. Pembahasan Pengisolasian merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal.

Manfaat dilakukannya kultur murni adalah untuk menelaah atau mengidentifikasi mikroba, termasuk penelaahan ciri-ciri kultural, morfologis, fisiologis, maupun serologis, yang memerlukan suatu populasi yang terdiri dari satu macam mikroorganisme saja (Sadiqul, 2010). Menurut Soni (2010), Identifikasi biakan mikroorganisme seringkali memerlukan pemindahan ke biakan segar tanpa terjadi pencemaran. Pemindahan mikroorganisme ini dilakukan dengan tekhnik aseptis untuk mempertahankan kemurnian biaka selama pemindahan berulangkali. Ada beberapa metode atau teknik yang digunakan pada isolasi

mikroorganisme, yaitu metode tuang (pour plate), metode sebar (spread plate), metode goresan (streak plate), pengenceran (dilution method), serta

micromanipulator (teh micromanipulator method). Metode tuang adalah suatu teknik dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar yang masih cair dengan stok kultur bakteri. Dimana kelebihan metode ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada media agar, metode ini cocok untuk isolasi mikroba yang bersifat anaerob. Kekurangan metode ini adalah kurang cocok apabila digunakan untuk isolasi mikroba yang bersifat aerob (Sadiqul, 2010). Metode sebar adalah teknik dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menuangkan stok kultur murni atau menghapuskannya di atas media agar yang telah memadat. Bedanya dengan metode tuang adalah pencampuran stok kultur bakteri dilakukan setelah media agar memadat, sedangkan metode tuang kultur dicampurkan ketika media masih cair (belum memadat). Kelebihan metode sebar adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata

pada media agar, dan metode ini digunakan untuk isolasi mikroba yang bersifat aerob. Kekurangan metode ini adalah tidak cocok digunakan untuk isolasi mikroba yang bersifat anaerob (Sadiqul, 2010). Metode pengenceran dilakukan dengan cara mengencerkan suatu suspensi berupa cairan spesies kemudian diencerkan dalam tabung tersendiri. Dari pengenceran tersebut kemudian diambil 1 ml umtuk diencerkan lagi. Jika perlu, dari pengenceran yang kedua diambil 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut hingga pengenceran yang diinginkan. Dari akhir pengenceran diambil kembali 1 ml untuk disebarkan pada suatu medium padat sehingga kemungkinan besar akan didapatkan beberapa koloni yang tumbuh pada medium tersebut. Dilakukannya pengenceran bertujuan untuk memperoleh biakan atau koloni murni dari suatu medium. Selain metode yang disebutkan diatas, terdapat metode lainnya yaitu metode

micromanipulator, dimana kita memerlukan kesabaran dalam pengerjaannya, selain itu harganya sangat mahal, tetapi dengan menggunakan alat micromanipulator ini kita dapat mengambil satu bakteri dari sekian banyak bakteri dengan tidak ikut sertanya bakteri lain (Sadiqul, 2010). Dalam proses isolasi dan identifikasi mikroba ini didapatkan berbagai macam bentuk bakteri maupun fungi. Berdasarkan hasil isolasi patogen dari daun mangga (Mangifera indica) yang sakit, diperoleh identifikasi patogen yaitu: warna koloni kelompok 1 adalah berwarna abu-abu, sementara kelompok 3 berwarna hitam keabuabu, dan kelompok 2, 4, 5, 6 berwarna putih. Sedangkan warna koloni sebaliknya untuk kelompok 1 adalah hijau tua, kelompok 3 berwarna hitam keabu-abuan, kelompok 4 berwarna merah dan kelompok 2, 5, 6 adalah putih. Bentuk tepi koloni

kelompok 1,2, 3, 4, 5 dan 6 adalah bergerigi. Tekstur permukaan koloni pada kelompok 1,2, 3, 4, 5 adalah kasar, dan kelompok 6 adalah halus. Sedangkan pola penyebaran koloni dibagi menjadi 3 yaitu: tersebar, konsentris dan radial. Pada kelompok 1, 2, 3 pola penyebaranya adalah konsentris. Sementara pada kelompok 5, 6 pola penyebaran koloninya adalah radial dan kelompok 4 pola penyebaran koloni adalah tersebar. Menurut Sadiqul, (2010), dimana untuk bakteri terdapat bentuk tidak beraturan & menyebar, bundar, dan rizoid. Sedangkan untuk tepiannya lebih beragam meliputi licin, bercabang, berombak, berlekuk, dan siliat. Untuk elevasi didominasi datar, cembung dan timbul. Dan untuk warna, semuanya sama yaitu berwarna putih susu. Sedangkan untuk fungi hanya satu bentuk yaitu berbenang-benang dengan tepian yang siliat, elevasi yang datar serta berwarna putih susu. Peremajaan biakan adalah upaya yang dilakukan untuk mempertahankan sifat alami patogen yang diisolasi. Patogen yang diremajakan adalah jenis patogen biakan murni yaitu patogen yang terdiri dari satu jenis patogen yang dibutuhkan tanpa adanya kontaminasi. Perlakuan aseptik dibutuhkan untuk mendapatkan biakan murni (Black, 1999). Peremajaan mikroba bertujuan untuk memperoleh biakan yang baru sehingga diharapkan dapat berkembang biak dengan baik. Hasil dari peremajaan mikroba adalah mikroba yang masih muda sehingga dapat digunakan dengan baik sesuai dengan fungsinya. Peremajaan biakan adalah tindakan pemeliharaan kultur yang penting dalam mikrobiologi untuk mencegah terjadinya kerusakan sel patogen. Kerusakan yang dapat terjadi meliputi penurunan viabilitas dan stabilitas sel bahkan suatu mikroba akan kehilangan potensinya sebagai suatu mikroba (Black, 1999).

Peremajaan biakan yang dilakukan dalam praktikum ini diperoleh dari biakan murni patogen penyebab penyakit tanaman yang tersedia dalam penyimpanan jangka pendek (aerob) dan penyimpanan jangka panjang (parafin oil dan nitrogen cair). Penyimpanan isolat dalam peremajaan biakan dilakukan selama tiga hari. Peremajaan dilakukan pada media agar miring dengan bahan media PDA dengan penggoresan zig-zag (Meryandini, 2009). Pemurnian biakan murni bertujuan untuk mendapatkan satu spesies dalam satu tabung pemeliharaan kultur. Langkah-langkah pemurnian biakan murni adalah sebagai berikut, koloni dengan karakter morfologi tertentu (koloni tunggal) dapat dipisahkan satu dengan lainnya dengan cara mengambilnya dengan ose (diusahakan koloni yang berjauhan). Kemudian digoreskan pada medium agar pemurnian. Pengambilan dengan ose dapat memisahkan koloni tunggal dengan yang lainnya. Untuk memurnikan kapang, ambil koloni dengan karakter morfologi tertentu dengan cara mengambilnya dengan jarum enten kemudian menaruhnya pada satu titik media PDA pada cawan petri. Jarum ose dan jarum enten yang digunakan untuk memindahkan sedikit biakan bakteri dan kapang ke gelas obyek harus disterilisasi dengan cara dipanaskan diatas lampu bunsen agar terbebas dari mikroba (steril), begitu pula dengan bibir cawan petri tempat koloni fungi (Soni, 2010). Penyebab penyakit busuk daun ini adalah kapang patogen. Penyebaran spora/ patogen kapang melalui angin, air atau serangga. Jika spora sampai ke daun basah, ia akan berkecambah dengan mengeluarkan zoospora atau langsung membentuk tabung kecambah, kemudian masuk ke bagian tanaman, dan akhirnya terjadi infeksi. Kasus penyakit busuk daun biasanya sering terjadi di daerah dataran tinggi yang bersuhu

rendah dengan kelembaban tinggi. Selain itu penyebaran spora patogen dipicu oleh keadaan lingkungan udara yang relatif lembab (di atas 80%). Gejala pada daun tanaman berupa hawar (blight) atau bercak berwarna abu-abu yang berukuran besar dengan bagian tengahnya agak gelap dan agak basah (Purwantisari, 2008). Menurut Purwantisari (2008), isolat patogen diisolasi dari daun tanaman yang positif terinfeksi patogen. Isolasi dilakukan dengan cara isolasi langsung (direct plating), yaitu : daun tanaman yang sakit diambil dan diletakkan pada cawan petri yang berisi TEA steril yang telah ditambahkan chloramfenikol 50 ppm, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 3 hari. Koloni kapang yang telah diinkubasi dipindahkan dalam medium PDA lainnya dalam cawan petri secara aseptik dan diinkubasi pada suhu ruang selama 3 hari lagi. Sementara identifikasi menurut Barnett dan Hunter (1972) (dalam jurnal Purwantisari (2008)), digunakan untuk memperoleh isolat murni.

V. KESIMPULAN Berdasarkan hasil pembahasan dari praktikum isolasi dan identifikasi patogen dari tanaman yang sakit diperoleh bahwa: 1. Teknik/cara isolasi patogen bagi menjadi 3 yaitu: metode tuang (pour plate), metode sebar (spread plate), metode goresan (streak plate), pengenceran (dilution method), serta micromanipulator (teh micromanipulator method).

2. Isolasi dilakukan dengan cara isolasi langsung (direct plating), yaitu : daun tanaman yang sakit diambil dan diletakkan pada cawan petri yang berisi TEA steril yang telah ditambahkan chloramfenikol 50 ppm, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 3 hari. Koloni kapang yang telah diinkubasi dipindahkan dalam medium PDA lainnya dalam cawan petri secara aseptik dan diinkubasi pada suhu ruang selama 3 hari lagi. Sementara 3. identifikasi digunakan untuk memperoleh isolat murni.

DAFTAR PUSTAKA Achmad dan M. Maisaroh. 2004. Identifikasi dan Uji Patogenisitas Penyebab Penyakit Hawar Daun pada Suren (Toona sureni MERR.). Jurnal Manajemen Hutan Tropika Vol. X No. 1 : 67-75. Achmad, S. Hadi, E,N. Herliyana, dan A. Setiawan. 1999. Patogenisitas Rhizoctonia solani pada semai Pinus merkusii dan Acacia mangium. J. Manajemen Hutan Tropika V(1-2):10-17. Agrios, G.N. 1988. Plant Pathology. Ed. ke-3. Academic Pr. New York.

Black J G. 1999. Microbiology : Principles and Explorations. New Jersey : Prentince Hall. Goodman, R.N., Z. Kiraly and M. Zaitlin. 1967. The Biochemistry and Physiology of Infectious Plant Diseases. D. Van Nostrand. New Jersey. Meryandini Anja et al. 2009. Isolasi bakteri selulolitik dan karakterisasi enzimnya. Makara Sains 2009; 13: 33-38. Ogoshi, A., B. Sneh and L. Burpee. 1985. Identification of Rhizoctonia sp. APS Press. Minnesota. Perhutani. 1999. Selayang Pandang Persemaian Permanen Pongpoklandak KPH Cianjur. Perum Perhutani Unit III Jawa Barat KPH Cianjur. Cianjur. Purwantisari, S., Rejeki Siti Ferniah, dan Budi Raharjo. 2008. Pengendalian Hayati Penyakit Lodoh (Busuk Umbi Kentang) Dengan Agens Hayati Jamur-jamur Antagonis Isolat Lokal. BIOMA, Desember 2008 ISSN: 1410-8801 Vol. 10, No. 2, Hal. 13-19. Sadiqul, M. 2010. Laporan Praktikum Laboratorium Lingkungan Isolasi Dan Pemurnian Mikrobia. Program Studi Teknik Lingkungan Fakultas Teknik Universitas Lambung Mangkurat, Banjarbaru. Semangun, H. 1996. Pengantar Ilmu Penyakit Tumbuhan. Gajah Mada Univ Press. Yogyakarta. Soni, Ahmad. 2010. Skripsi: Isolasi Dan Pemurnian Mikroba, Teknik Pemeliharaan Kultur Murni Dan Perhitungan Angka Lempeng Total (Total Plate Count= Tpc). Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Brawijaya, Malang.