Universidade Federal de Uberlndia Campus Patos de Minas Curso: Biotecnologia - 2 Perodo Disciplina: Gentica II Prof. Dra.

Vvian Alonso

ELETROFORESE

JOS BORGES PACHECO JNIOR LUIZ GUILHERME MENDES NAYARA FRANCIELE OCTVIO AUGUSTO COSTA ALMEIDA

Patos de Minas, 8 de dezembro de 2011.

NDICE 1 - INTRODUO...........................................................................................................3 2 - OBJETIVOS.................................................................................................................4 3 - MATERIAIS E MTODOS........................................................................................4 3.1 - EQUIPAMENTOS UTILIZADOS............................................................4 3.2 - REAGENTES UTILIZADOS....................................................................4 3.3 - PROCEDIMENTOS...................................................................................5 4 - RESULTADOS E DISCUSSES...............................................................................6 5 - CONCLUSO.............................................................................................................6 6 - REFERNCIAS...........................................................................................................7

1 - INTRODUO Muitas plantas e animais domesticados so produtos de uma seleo artificial de seres humanos, a fim de utilizar suas caractersticas desejveis encontradas em populaes selvagens. H mais de dez mil anos, ocorre a chamada Revoluo Agrcola, onde os primeiros fazendeiros escolheram e selecionaram sementes de plantas capazes de expressar certas caractersticas que acentuariam seu valor como fonte alimentar. Um exemplo o milho. A partir da engenharia gentica, que teve incio de seu desenvolvimento no sculo passado, tornou-se possvel a separao de caractersticas genticas de interesse de uma certa espcie e a introduo dessas caractersticas em outra espcie, que resumidamente entende-se por transgenia. Hoje com a disseminao dos alimentos transgnicos pelo mundo todo, e a cada dia com a mais variada quantidade de espcies transgnicas obtidas em laboratrio, tem sido colocado no mercado consumidor as mais variedade de alimentos para consumo humano contendo produtos obtidos atravs da transgenia. Em vista disso, existem leis que regulamentam a fabricao e colocao no mercado desses alimentos. Mas como saber se o limite estabelecido por lei est sendo cumprido? Existem tcnicas que permitem analisar e descobrir. Uma dessas tcnicas a eletroforese. Esta tcnica baseia-se na migrao de uma amostra por um gel, de agarose ou de poliacrilamida, atravs da aplicao de diferena de potencial, gerado um campo eltrico e promovendo a separao das espcies pela diferena de carga eltrica e peso molecular. De acordo com Martinez e Paiva a eletroforese foi inicialmente proposta por Arne Teselius (1937) como tcnica empregada para a visualizao de protenas de acordo com as diferenas de comprimento dos fragmentos de aminocidos e cargas eltricas. A simplicidade e rapidez da tcnica impulsionaram seu aprimoramento e uso, atualmente para separar, identificar e purificar fragmentos de DNA. Griffiths et al, no livro Introduo Gentica, explicam:
"Uma mistura de molculas lineares de DNA colocada em uma cuba de um gel de agarose, e a cuba ligada ao catdio de um campo eltrico. Como as molculas de DNA contem cargas, os fragmentos iro migrar para o andio em velocidade inversamente dependentes de seu tamanho. Portanto, os fragmentos em classe de tamanhos distintos formaro bandas no gel. As bandas podem ser visualizadas corando-se o DNA com brometo de etdio, que faz com que o DNA fluoresa na luz ultravioleta."

2 - OBJETIVOS O objetivo nesta prtica analisar a tcnica de eletroforese utilizando fub de milho. Tendo isso como base um trabalho cientfico que est sendo realizado por uma equipe de pesquisadores do INGEB (Instituto de Gentica e Bioqumica) da Universidade Federal de Uberlndia em parceria com a ANVISA. Tal trabalho tem por objetivo analisar alimentos feitos atravs de milho, como matria prima, do mercado consumidor e definir se contm presena de milho transgnico em sua composio e sua porcentagem presente, cumprindo com a leis que permitem e estipulam limites para a utilizao de transgnicos em alimentos de consumo humano.

3 - MATERIAIS E MTODOS 3.1 - EQUIPAMENTOS UTILIZADOS Agitador tipo Vortex Balana Eletrnica Analtica Micro-centrfuga cap. 20 tubos Cuba de Eletroforese Horizontal para Gel Agarose Falcon Freezer Incubadora de banho-maria Micro-ondas Microtubos Pipeta Automtica Ponteiras Transiluminador Tubos de Ensaio Tubos de Falcon

3.2 - REAGENTES UTILIZADOS 1ml de etanol 70% 1ml de etanol absoluto 1l de brometo de etdio 200l de gua Milli-Q
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400l de isopropanol gelado (-20 C) 600l de clorofrmio: lcool iso-amlico (24:1) 700ml de tampo CTAB 2x Amostra de fub de milho Gel de agarose 1% a 80v Tampo TBE 5x

3.3 - PROCEDIMENTOS O mtodo para anlise desse milho foi a extrao de DNA do fub e anlise no gel, aps aplicar a tcnica de eletroforese. Primeiramente para a extrao do DNA, dever ser medida uma amostra de 500mg em uma balana eletrnica analtica. Essa amostra adicionada a um tubo de falcon contendo 700l de tampo CTAB 2x para a homogeneizao. Aps a homogeneizao, o tubo deve ser colocado em uma incubadora de banho-maria a 65 C, em um perodo de 30 a 60 minutos, sendo que deve ser feita a agitao do tubo constantemente. Depois do trmino do banho-maria adiciona-se 600l de clorofrmio: lcool isoamlico (24:1) para uma nova homogeneizao, agitando durante 5 minutos em um agitador do tipo vortex. A amostra ento transferida para microtubos. Os microtubos ento so colocados na micro-centrfuga, a uma velocidade de 5000xg pelo prazo de 10 minutos. Aps a centrifugao, elimina-se a fase slida, e fase aquosa adicionado 400l de isopropano gelado (-20 C), misturando suavemente por inverso de tubo vrias vezes. Os microtubos ento so colocados em um freezer, sendo submetidos a uma temperatura de -20 C por 30 minutos. Os microtubos so novamente colocados na micro-centrfuga, desta vez por 20 minutos e velocidade de 12000xg. O sobrenadante, que formado aps a centrifugao, ento descartado, e o precipitado final deve ser lavado duas vezes em 1ml de etanol 70% pelo prazo de 5 minutos, e uma vez com 1ml de etanol absoluto pelo prazo de 3 minutos. O DNA, ou seja, o pellet, deve ser secado para uma ressuspenso do DNA extrado em 200l de gua Milli-Q. Agora, inicia-se uma segunda parte do experimento que a tcnica da eletroforese em si. Primeiramente feito a preparao do gel de agarose em
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represadores, que ser submerso em uma soluo tamponada, que deve possuir ons para a conduo de corrente eltrica, e que no haja mudana significativa no pH. Com o auxlio do pente so feitos poos no gel onde a amostra deve ser colocada. Aplica-se ento a corrente eltrica. A amostra tambm deve ser tamponada com material denso e que possua colorao para que seja facilmente visualizada no transiluminador, emissor de raios UV.

4 - RESULTADOS E DISCUSSES Aps seguidos todos os procedimentos, ao analisar o gel no transiluminador percebemos as bandas marcadas ao longo do gel. Ou seja, a migrao do DNA ocorreu assim como era esperada. Tais bandas so as sequncias de DNA que migraram pelo gel aps a aplicao de corrente eltrica. A separao feita com base no tamanho da molcula, ou seja, tamanho da sequncia de bases. As sequncias menores se encontram mais prximas da extremidade final, pois possuem menor peso molecular. Molculas menores possuem menor peso, assim migram mais rapidamente, molculas maiores possuem maior peso molecular e assim migram numa velocidade menor, sendo as bandas mais prximas da extremidade inicial. A maioria dos procedimentos utilizados gastavam um certo tempo, cerca de 20 minutos em mdia, para serem realizados. Prestando ateno a isso, quem estiver realizando a tcnica deve ter acima de tudo, cautela, pacincia e seguir todas as regras de biossegurana. Isso no s para que seja assegurada a segurana de todos dentro do laboratrio, mas para tambm que todos os procedimentos saiam como previsto e os resultados esperados sejam obtidos.

5 - CONCLUSO Assim como esperado, ocorreu a migrao das sequncias de DNA pelo gel de agarose, distribuindo em bandas de tamanhos especficos e suas visualizaes, atravs do transiluminador, foram possveis. A anlise de comparao em relao ao milho transgnico, no foi realizada por ns alunos, pois algo que exige maior preparao, conhecimento cientfico, mais tcnicas, tempo e recursos necessrios.

E somada aos conhecimentos j obtidos em aulas tericas anteriormente, a realizao da prtica de eletroforese teve bastante importncia visando que uma das tcnicas mais utilizadas e constantes em laboratrios das mais abrangentes reas biotecnolgicas.

6 - REFERNCIAS MARTNEZ, E. R. M.; PAIVA L. R. S. Eletroforese de cidos Nuclicos: Uma Prtica Para o Ensino de Gentica. < http://www.geneticanaescola.com.br/ano3vol1/9.pdf > acessado em 7 de dezembro de 2011. GRIFFITHS, A. J. F. et al. Introduo Gentica. 9 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008. 712 p.