DETEKSI WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) PADA UDANG DENGAN TEKNIK PCR METODE IQ-20001 Agus Sunarto2

PENDAHULUAN White spot syndrome virus (WSSV) adalah virus golongan DNA berbentuk silindris berukuran 275x83 nm yang termasuk dalam famili Nimaviridae. Virus ganas ini merupakan penyebab penyakit bercak putih (white spot disease) pada udang, termasuk udang windu (Penaeus monodon) dan udang putih (Penaeus vannamei) yang saat ini banyak dibudidayakan di Indonesia. Dampak ekonomi dari wabah penyakit bercak putih pada industri udang di Indonesia sangat besar. Diperkirakan kerugian ekonomi mencapai $300 juta/tahun (Rukyani, 2001). Gejala klinis udang yang terserang WSSV adalah udang lemah, berenang dipermukaan air, minggir dan mati di pematang dengan tubuh berwarna kemerahan. Gejala klinis yang khas adalah adanya bercak-bercak putih berdiameter 0,5-3.0 mm pada bagian dalam karapas. WSSV menyebabkan perubahan histopatologis berupa kerusakan hampir semua jaringan, inti sel membesar (hypertrophy) dan ditemukan badan inklusi berwarna eosinofilik atau basofilik yang dikenal dengan Cowdry Type-A inclusion body. Diagnosa konfirmatif terhadap WSSV dapat dilakukan dengan teknik ELISA, imunohistokimia, in-situ hybridization atau PCR (Lightner, 1996; OIE, 2003). Mengacu pada standar FAO/NACA/OIE (Bondad-Reantaso et al, 2001), pemeriksaan penyakit ikan dan udang berbasis molekuler (molecular-based diagnostic tools) terutama dengan teknik polymerase chain reaksi (PCR) merupakan pilihan tepat. PCR adalah reaksi berantai suatu primer dari urutan DNA (DNA sequence) dengan bantuan enzym polymerase sehingga terjadi amplifikasi DNA target secara exponensial. PCR sangat cocok untuk digunakan sebagai alat diagnosa penyakit ikan karantina karena mempunyai beberapa keunggulan komparatif dibandingkan metode diagnosa yang lain, yaitu: 1). Spesifik. Metode PCR mampu mendeteksi suatu patogen penyebab penyakit (parasit, jamur, bakteri maupun virus) pada tingkat DNA-nya. Hal ini akan menghindari kesalahan diagnosa karena urutan DNA setiap makhluk hidup sangat spesifik dan berbeda satu sama lain, 2). Sensitif. PCR mampu mendeteksi suatu patogen

1. Makalah disampaikan pada Apresiasi Teknik PCR untuk Diagnosa Hama dan Penyakit Ikan di Stasiun Karantina Ikan Kelas I Tanjung Perak Surabaya, Mei 2006 2. Peneliti di Laboratorium Riset Kesehatan Ikan, Badan Riset Kealutan dan Perikanan, DKP. Email : agus.sunarto@gmail.com

dalam jumlah sangat sedikit, sehingga belum memperlihatkan gejala klinis. Dengan kata lain PCR mampu mendeteksi penyakit dalam tahap subklinis atau carrier. Hal ini dimungkinkan karena cara kerja PCR adalah dengan meningkatkan jumlah DNA target sampai milyaran kali, sebelum hasilnya dilihat dengan elektroforesis. 3). Cepat. Keseluruhan proses pemeriksaan penyakit dengan metode PCR dapat diselesaikan dalam waktu 5 jam. Diagnosa cepat sangat diperlukan untuk pemeriksaan ikan karantina, sehingga proses lalu-lintas ikan tidak terganggu, 4). Efisien. Dalam sekali jalan, PCR dapat melakukan pemeriksaan terhadap 48-96 sampel sekaligus, sehingga sangat efisien untuk digunakan di Balai Karantina Ikan dengan lalu-lintas ikan yang padat, dan 5). Praktis. Metode ini sangat praktis karena dengan satu alat saja (PCR), secara teoritis dapat memeriksa seluruh penyakit ikan dalam daftar Hama Penyakit Ikan Karantina (HPIK), asalkan tersedia primer spesifik untuk setiap jenis penyakit ikan tersebut. Makalah ini menjelaskan prosedur deteksi WSSV pada udang dengan teknik PCR metode IQ-2000. Metode IQ-2000 dipilih karena metode ini menggunakan prinsip double step PCR atau nested-PCR yang lebih sensitif daripada single step PCR. Makalah ini sangat teknis, terperinci dan sistematis, sehingga dapat menjadi pedoman kerja di laboratorium. Prosedur kerja pendeteksian WSSV dan KHV dibuat dalam bentuk step by step sehingga mudah dilaksanakan. Tahapan dimulai dari penjelasan komponen kits, kebutuhan alat dan bahan, persiapan bahan uji dan sampel, ekstraksi dan amplifikasi DNA, elektroforesis dan analisa hasil. 1. Komponen kits WSSV (disimpan pada -20oC) : First PCR PreMix Nested PCR PreMix Standar kontrol : : : : : : : : : 1 botol @ 100 ml, atau 4 vials @ 450 l/vial, termasuk buffer, dNTP & primer spesisfik WSSV 4 vials@ 840 l/vial, termasuk pereaksi buffer, dNTPs & primer spesifik WSSV 1 vial 100 l/vial, 104/ l (plasmid DNA WSSV) 1 vial @ 500 l/vial dengan konsentrasi 40 ng/ l 1 vial 2U/ l @ 360 l/vial 1 vial @ 1500 l/vial 1 vial @ 100 l/vial berisi DNA standar dgn berat 848 bp, 630 bp & 333 bp Reagen Ekstraksi DNA o Lysis Buffer

Kits Ekstraksi DNA

200 reaksi/kit

Kondisi penyimpanan untuk setiap komponen reagen tertera pada label, umumnya disimpan dalam suhu -20oC atau dalam suhu ruang. 2. Peralatan dan bahan yang diperlukan tetapi tidak tersedia dalam kits : 1. Thermal cycler dengan blok sampel untuk tabung 0,2ml 2. Microcentrifuge (kecepatan 12.000 rpm, diameter rotor 5 - 8 cm) 3. Unit electrophoresis 4. UV transilluminator 5. Vortex mixer 6. Heating block 7. Micropipette (2-20 l, 20-200 l DAN 100-1000 l) 8. Polaroid camera atau digital photo system 9. Chloroform 10. Ethanol 95% 11. Ethidium bromide 12. Buffer elektroforesis (TAE atau TBE) 13. Agarosa 3. Sensisitivitas dan batas deteksi Kits ini menghasilkan tingkat sensistivitas dan batas pengujian yang berbeda, tergantung dari dari sumber sampel yang diuji (Tabel 1.). Tabel 1. Daftar sampel yang sering diuji dan sensitivitasnya Sampel Plasmid DNA WSSV Eye stalk induk < PL12 PL12 30 Jumlah 2 buah 1 buah 25 - 50 PLs Ekor (tanpa hepatopankreas) Batas Deteksi 2 DNA/reaksi 20 DNA/reaksi 20 DNA/reaksi 20 DNA/reaksi 2 DNA/reaksi 2 DNA/reaksi 20 DNA/reaksi 2 DNA/reaksi Sensitivitas 2 DNA/l plasmid 500 DNA/bola mata 500 DNA/PL 2,5 DNA/mg udang atau 500 DNA/setengah badan udang 100 DNA/kaki atau insang 1 DNA/mg 0,4 DNA/mg 2,5 DNA/ml

positif Yeast tRNA IQzyme

DNA

Polymerase Loading Dye 6x DNA Marker

Kaki renang, Kaki jalan, 2 buah atau 20 mg atau insang Daging 20 mg Lumpur dirt 200 mg Air tambak 2 ml

Dari table di atas diketahui bahwa jika hasil tes negatif berarti spesimen tidak terinfeksi oleh WSSV atau terinfeksi tetapi dengan derajat infeksi lebih rendah dari batas pengujian. Dari berbagai penelitian diketahui bahwa kasus/wabah WSSV baru terjadi jika jumlah virus sudah mencapai 10-100 kali lipat batas deteksi dengan nested-PCR.. Oleh karena itu hasil negatif dari tes ini, dapat diartikan bahwa sampel atau lingkungan budidaya pada saat tes dilakukan adalah bebas WSSV. Semua hasil test yang tertera di Tabel 1., diuji berdasarkan prosedur standar dan reagen yang ada di dalam manual. Hasil tidak dijamin sama bila ekstraksi DNA dengan menggunakan kits ekstraksi DNA produk lain. 4. Persiapan sampel dan ekstraksi DNA 4.1. Penyiapan sampel (untuk metode DTAB-CTAB) a. Tangkai mata induk udang: (1) Tangkai mata yang sudah dipotong, dicuci dengan air steril (2) Tangkai mata dimasukkan kedalam tabung mikro (microtube) ukuran 2 ml yang telah diisi 0,6 ml DTAB solution. (3) Sampel digerus di dalam tabung menggunakan pestel steril. b. Larva, Post Larva (PL) atau Juvenile (1) Dua puluh milligram (20 mg) sampel dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml yang berisi 0,6 ml DTAB solution (untuk larva dibutuhkan minimal 50 buah, untuk <PL12 diperlukan minimal 30 buah; untuk PL12 -30 hanya diperlukan setengah dari ekor, jangan menggunakan sampel hepatopankreas atau kepala) (2) Sampel digerus di dalam tabung menggunakan pestel steril. c. Pleopod, periopod, atau insang udang dewasa (1) Dua lembar sampel dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml yang berisi 0,6 ml DTAB solution. (2) Sampel digerus di dalam tabung menggunakan pestel steril. d. Ekor atau otot udang dewasa (1) 20 mg otot atau ekor dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml yang berisi 0,6 ml DTAB solution. (2) Sampel digerus di dalam tabung menggunakan pestel steril.

e. Lumpur tambak (1) 500 mg lumpur tambak ( 0,5 cm3) dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml yang berisi 0,6 ml DTAB solution. (2) Sampel divortex selama 20 detik. f. Plankton dalam air tambak (1) 2 ml air tambak dimasukkan ke dalam tabung mikro ukuran 2 ml, kemudian disentrifuse pada 12.000g selama 15 menit. (Microcentrifuge 12,000 rpm, r=7). (2) Supernatan dibuang, kemudian ditambahkan10 l (40 ng/ l) Yeast tRNA dan 290 l ddH2O, kemudian vortex. (3) Ditambahkan 0,6 ml DTAB solution, kemudian divortex selama 5 detik. 4.2. Prosedur ekstraksiDTAB-CTAB DNA

a. b.

Sampel yang telh disiapkan diinkubasi pada suhu 75oC selama 5 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruang. Divortex dan diputar (spin down) dengan cepat, kemudian ditambahkan 0,7 ml chloroform, divortex kembali selama 20 detik dan disentrifuse pada 12.000g (12000 rpm r=5~7cm) selama 5 menit.

c.

Supernatan bagian atas dipindahkan kedalam tabung mikro ukuran 2 ml yang baru, ditambahkan 100 l CTAB Solution dan 900 l ddH2O, divortex dengan cepat, kemudian diinkubasi pada suhu 75oCselama 5 menit.

d.

Didinginkan pada suhu ruang dan disentrifiuse pada12.000g selama10 menit. Supernatan dibuang dengan hati-hati, pellet dilarutkan dengan 150 l Dissolve Solution, kemudian diinkubasi pada suhu 75oC selama 5 dan didinginkan pada suhu ruang.

e. f. g.

Disentrifuse pada 12.000g selama 5 menit. Larutan yang jernih dipindahkan ke tabung ukuran 0,5ml yang baru yang telah diisi dengan 300 l ethanol 95%. Divortex dengan cepat, disentrifuse pada 12.000g selama 5 menit, kemudian pellet dicuci dengan 200 l ethanol 70%, di-spin down, pellet dikeringkan dan dilarutkan dengan TE buffer atau ddH2O. Volume pelarut (TE buffer atau ddH2O) yang digunakan, ada di Tabel 2.

4.3. Ekstraksi DNA dengan Lysis Buffer (pleopod, periopod, insang, naupli, PL12) a. Satu buah kaki, insang atau 30 buah naupli atau PL12 dimasukkan ke dalam tabung mikro ukuran 1,5ml. 5. Amplifikasi DNA 5.1. Kondisi reaksi dalam mesin PCR (Thermo cycler): a. Profil suhu reaksi PCR tahap 1: 94oC 30 detik; 62oC 30detik; 72oC 30 detik, diulang 5 siklus, kemudian 94oC 15 detik; 62oC 15 detik; 72oC 20 detik, diulanag 15 siklus, kemudian 72oC 30 detik; 20oC 30 detik pada akhir siklus. b. Profil suhu reaksi PCR tahap 2 (nested PCR): 94o C 20 detik; 62 o C 20 detik; 72 o C 30 detik, diulang 25 siklus, kemudian 72 o C 30 detik; 20 o C30 detik pada akhir siklus. 5.2. Persiapan Reagent (Pembutan Master Mix): a. Campuran reagen reaksi PCR tahap 1 (Master Mix 1): 8 l/reaksi 4.4. Pelarutan DNA

b. c. d.
e.

Ditambahkan 500 l Lysis Buffer ke dalam tabung mikro dan digerus. Sampel diinkubasi pada suhu 95oC selama 10 menit, kemudian disentrifuse pada 12.000g (12.000 rpm, r=5~7cm) selama10 menit. 200 l supernatan yang jernih dipindahkan ke tabung mikro ukuran 1,5ml yang baru yang telah diisi dengan 400 l ethanol 95%. Divortex dengan cepat, disentrifuse pada 12.000g selama 5 menit, kemudian ethanol dibunag dan pelet dikeringkan dengan cara diletakkan pada suhu ruang selama beberapa menit.

f.

Pelet dilarutkan dengan ddH2O atau TE buffer.

a.

First PCR PreMix IQzyme DNA Polymerase 2U/ l

7.5 l 0.5 l

Karena sampel yang berbeda mengandung konsentrasi DNA yang berbeda, maka perlu mengatur konsentrasi DNA dengan melarutkan pelet DNA pellet dengan ddH2O atau TE buffer yang berbeda seperti tertera dalam Tabel 2. berikut. Tabel 2. Sumber sampel dan volume pelarut DNA SUMBER SAMPEL Tangkai mata induk udang PL Pleopod atau periopod Insang Lumpur tambak Air tambak VOLUME PELARUT 100 200 200 50 20 10 l l l l l l

b. Campuran reagen reaksi PCR tahap 2 (nested PCR) (Master Mix 2): 15 l /reaksi Nested PCR PreMix IQzyme DNA Polymerase 5.3. Prosedur reaksi 2U/ l 14 l 1 l

a.

Mempersiapkan campuran reagen reaksi tahap 1 dan 2 (nested PCR) sesuai dengan jumlah sampel. Untuk setiap persiapan campuran reaksi diperlukan juga 3 positif kontrol standar (103, 102 and 101) dan 1 kontrol negatif (ddH2O or Yeast tRNA).

b. Jika sampel perlu disimpan dalam jangka waktu yang cukup lama, disarankan menggunakan TE buffer. Sampel dapat disimpan pada suhu 20oC selama paling satu tahun.

b. c.

Masukkan (dengan pipet) 8 l Master Mix 1 ke dalam setiap tabung mikro ukuran 0,2 ml yang telah diberi label. Ditambahkan 2 l DNA sampel atau kontrol positif standard ke dalam setiap tabung mikro.

d.

Campuran reaksi ditutup dengan 20 l minyak (mineral oil), tahap ini tidak perlu dilakukan bila thermocycler sudah didesign bebas penggunaan minyak (oil-free design) karena sudah dilengkapi dengan tutup panas (heated lid).

e.

Ketikan gel agarose sudah padat sempurna, comb dilepaskan secara hati-hati dan blockers pada kedua sisi kotak gel diangkat. Agarose gel sudah siap digunakan untuk proses elektroforesis. Agarose gel yang telah jadi sebaiknya tidak dibiarkan pada suhu ruang lebih dari 4 jam

e.

Amplifikasi DNA dilakukan dengan Profil reaksi PCR tahap 1 yang sudah diprogram sebelumnya. Proses nested PCR dilakukan dengan menambahkan 15 l Master Mix 2 (nested PCR) ke dalam masing-masing tabung mikro setelah reaksi PCR tahap 1 selesai. Amplifikasi DNA dilakukan dengan Profil reaksi PCR tahap 2 yang sudah diprogram sebelumnya.

f.
g.

6.2. Elektrophoresis

a.
b.

Gel agarose diletakkan di dalam kotak gel. Molekul DNA akan bergerak ke arah kutup positif karena DNA bermuatan negatif.. Buffer elektroforesis 1x ditambahkan ke dalam kotak gel sampai buffer menutupi gelseluruh permukaan gel. Loading dye 1x sebanyak 5 l ditambahkan kedalam setiap tabung PCR yang sudah diamplifikasi dan dicampur merata. Selanjutnya 5-10 l campuran ini dimasukkan ke dalam setiap lubang gel (well). Campuran hasil PCR dan loading dye ini akan tenggelam ke dasar lubang karena loading dye lebih berat dari buffer. Prosedur ini harus dilakukan secara hatihati untuk menghindari konatminasi.

h.
i. 6. a.

Setelah reaksi nested PCR selesai, ditambahkan 5 l loading dye 6x ke dalam masingmasing tabung. Setelah dicampur homogen, siap dielektroforesis. Elektroforesis Buffer yang dapat dipakai untuk elektroforesis antara lain TAE 1x atau TBE 1x. Bila buffer yang tersedia dalam bentuk konsentrat (konsentrasi lebih dari 1x), maka buffer tersebut harus diencerkan dahulu dengan aquades steril sehingga konsentrasinya menjadi 1x. Selanjutnya buffer 1x ini dipakai untuk membuat agarose dan untuk proses elektrforesis. Perlu diingat buffer untuk proses elektroforesis dan pembuatan agarose gel harus sama.

c.

6.1. Mempersiapkan Agarose gel

d. e. f.

Pada setiap eletroforesis diperlukan marker DNA sebanyak 5 l. Marker DNA ini bertindak sebagai referensi untuk ukuran/berat produk PCR . Setelah semua sampel masuk ke dalam masing-masing lubang gel, kotak gel dihubungkan dengan power supply dan dinyalakan pada 100~150 volt (JANGAN LEBIH DARI 150 volt). Loading dye mengandung 2 zat pewarna yaitu Bromphenol Blue yang menghasilkan warna biru gelap dan Xylene Cyanol yang berwarna biru muda. Elektroforesis dihentikan ketika warna biru gelap sudah mencapai 1/2 atau 2/3 dari gel. Kemudian, gel diangkat dari kotak gel dan diwarnai dengan Ethidium Bromida (EtBr).

b.

Untuk elektroforesis direkomendasikan memakai gel agarose gel 2%. Untuk mempersiapkan gel agarose 2%: 2 g agarose dilarutkan dengan 100 ml buffer elektroforesis di dalam flask atau botol.

c.

Larutan tersebut dipanaskan sampai mendidih dan berubah warna menjadi bening sempurna tanpa ada partikel gel. Pemanasan dapat dilakukan menggunakan lampu alkohol, gas, hotplate atau microwave. Untuk menghindari campuran tersebut tumpah ketika mendidih, disarankan menggunakan gelas ukuran besar (2x labih besar dari volume larutan).

g.

Untuk menghindari kontaminasi, JANGAN MENGGUNAKAN buffer yang beberapa kali, kecuali kalau dilakukan pada hari yang sama. Setelah selesai, kotak elektroforesis dicuci dengan air dan dibilas dengan aquades steril.

d.

Larutan gel agrose yang sudah bening didinginkan pada suhu ruang sampai 50 oC, kemudian gel tersebut secara perlahan-lahan dituangkan ke dalam dalam kotak gel. Volume yang diperlukan tergantung dari ukuran kotak gel tersebut. Secara umum, ketinggian gel harus lebih tinggi dari dasar sisir (comb) kira-kira 0,3-0,5 cm dan ketebalan gel disarankan lebih kecil dari 0,8 cm. 6.3. Pewarnaan gel dan analisa data

a.

Ethidium Bromide (EtBr) biasanya tersedia dalam larutan stock 10mg/ml. Larutan ini harus disimpan dalam botol gelap karena EtBr dapat rusak karena cahaya. EtBr adalah zat

KARSINOGEN, oleh karena itu operator harus menggunakan jas lab, sarung tangan dan kaca mata pelindung.

a.

Pita DNA di 296 bp dan/atau 550 bp Pita DNA hanya di 848 bp Tidak ada pita DNA

: P(+) : N(-) : kualitas DNA jelek

b.
c.

b.

Larutan stock 10mg/ml diencerkan sebanyak 20.000 kali dengan cara mencampukan 5ul larutan stock dengan 100ml aquades steril. Larutan EtBr yang sudah diencerkan ini yang dipakai sehari-hari.

7.4. Setiap tes memerlukan kontrol positif dan negatif, jika standar kontrol positif 102 tidak menghasilkan pita DNA pada 296 bp berarti reaksi PCR gagal. Sebaliknya bila pada kontrol negatif terbentuk pita DNA pada 296 bp, berarti terjadi kontaminasi

c.

Selanjutnya gel agarose direndam dalam larutan EtBr dalam wadah atau kantung. Perendaman dilakukan selama 10 menit dan sesekali digoyang-goyang. Kemudian dicuci dengan aquades steril selama 10 menit untuk menghilangkan background.. Untuk membaca hasil; gel diletakkan di UV transilluminator. Analisa hasil

d.
e. 7.

7.1. Di dalam gel agarose, sampel positif dan kontrol positif standar mengikuti pola sbb: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M

Lane 1 : sampel positif WSSV berat Lane 2 : sampel positif WSSV sedang Lane 3 : sampel positif WSSV ringan Lane 4 : sampel positif WSSV sangat ringan Lane 5 : sampel negatif WSSV Lane 6 : ddH2O Lane 7 : standard 1, 2.000 buah/reaksi Lane 8 : standard 2, 20 buah/reaksi Lane 9 : standard 3, 20 buah/reaksi Lane M: marker DNA: 848 bp, 630 bp, 333 bp

7.2. Pada sampel negatif hanya terlihat satu pita DNA pada 848 bp, yaitu DNA udang (house keeping gene). 7.3. Prosedur analisa: