Universidade de São Paulo

Instituto de Ciências Biomédicas Departamento de Microbiologia
BMM121 – Microbiologia Básica

Apostila de Aulas Práticas Profa. Elisabete José Vicente bevicent@usp.br 3091.7350 2004

MICROBIOLOGIA NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA É indispensável o uso de avental no laboratório. O avental deve ser comprido, de mangas compridas e estar abotoado; Não comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratório; O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material necessário ao trabalho prático, como: roteiro de aula, papel e lápis ou caneta para anotações; Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, aspiração de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o técnico responsável pela aula prática; Descarte de material: a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios, existentes nos laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias; b) Placas de petri deverão ser deixadas tampadas sobre a bancada; c) Lâminas fornecidas para visualização deverão ser deixadas sobre as bancadas; d) Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes. Prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes Terminados os trabalhos práticos: a) b) c) d) e) f) Esterilizar alças e fios de platina; Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas; Desligar lâmpadas e microscópios; Limpar microscópios e cobri-los com a capa; Tirar o avental e guardar; Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou anti-séptico.

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Módulo I Introdução à microbiologia

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Módulo I ......................................................................................................................... 4 Introdução à microbiologia ............................................................................................. 4 Prática 1 - NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA ................................................................. 7 Técnica de semeadura ............................................................................................... 7 Objetivo .................................................................................................................... 10 Material ..................................................................................................................... 10 Procedimento e Resultados...................................................................................... 10 Questionário ............................................................................................................. 11 PRÁTICA 2 - COLORAÇÃO DE GRAM........................................................................... 12 Fixação e coloração de microrganismos................................................................... 12 Preparação de esfregaços e coloração pelo método de gram.................................. 13 A técnica ................................................................................................................... 15 Objetivo .................................................................................................................... 16 Material ..................................................................................................................... 16 Procedimento:........................................................................................................... 16 Resultados:............................................................................................................... 18 Questionário ............................................................................................................. 18 PRÁTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA..... 19 Objetivo .................................................................................................................... 19 Materiais ................................................................................................................... 19 Procedimento e resultados ....................................................................................... 19 A. Visualização de bactérias:.................................................................................... 19 B. Visualização de fungos......................................................................................... 20 PRÁTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO .................................................................... 21 Crescimento Bacteriano ........................................................................................... 21 Curvas de crescimento ............................................................................................. 22 Objetivo .................................................................................................................... 25 Material ..................................................................................................................... 25 Procedimento............................................................................................................ 25 Resultados................................................................................................................ 25 Questionário ............................................................................................................. 25 PRÁTICA 5 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO................................................................................................................... 26 Estimativa do número de células viáveis .................................................................. 26 Problema: ................................................................................................................. 27 5

............................................................. 32 Questionário .........................................................Verificação de entendimento: ..................................................................PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS.......................................................................... 36 Introdução............... 29 Objetivos..................... 37 Procedimento... 35 Material .......................................................... 32 Objetivo ............................................................................................. 35 PRÁTICA 9 ................................................................................................................... ...................................................................................... 40 Abordagem clássica ................................. 32 PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA ............................. 33 Procedimento............................................................. 37 Material ...................................................................................................................................................CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS... 35 Introdução..................................................................................... 31 Material ................................. 32 Resultados........................................................ 40 6 ............................... 39 PRÁTICA 10 ....................................................................................................................................................... 32 Teoria .............POSTULADO DE KOCH.................................... 34 PRÁTICA 8 ......................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 35 Objetivo ..................................................................... 38 Resultados................. 28 PRÁTICA 6 ............................................... 36 Objetivo ..................................................................................................................................................................................................................................... 35 Procedimento.................................................................................................................................................................. 35 Resultados.................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 31 Procedimento................................. 33 Questionário ................................................................................................. 29 Anti-sépticos e desinfetantes ..................................................... 33 Materiais .....................................................................AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ....................... 35 Questionário .......................................................

e evitar acidentes laboratoriais. TÉCNICA DE SEMEADURA Toda a vez que se fizer uma semeadura é importante seguir as regras abaixo mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura por microrganismos presentes no ambiente. deve-se flambar a 7 . seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura. Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. Figura 1. esfriar previamente a alça. Esta deverá ser esfriada na parte interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de petri. Para retirar o material. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes.NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA Alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminação do manipulador como também dos meios de cultura empregados e das culturas microbianas. 1. Toda vez que fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio.Posição correta para a flambagem da alça 2. Flambagem da alça ou fio de platina: Tanto a alça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura.PRÁTICA 1 . A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45o em relação à mesa de trabalho (Figura 1).

Não pousar os tampões sobre a bancada!!! Flambar a alça após o uso. após flambar a alça até o rubro. 4. Após a retirada do material com a alça. semear na placa de Petri (fig. Figura 2 – Removendo o tampão de algodão 3. dentro de um cilindro metálico). 5. Esta deverá ser mantida segura pelo dedo mínimo. retirar primeiramente o papel da parte superior e depois a parte inferior (correspondente à ponta da pipeta). torcer o papel na região central da pipeta. Uma vez utilizada.3). flambar novamente a boca do tubo e colocar a tampa. da mão que está segurando a alça ( Figura 2). 8 . As pipetas utilizadas em microbiologia são previamente esterilizadas. Na semeadura usando placas de Petri. a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba contendo solução desinfetante. Esta seqüência evite que a pipeta seja contaminada pelas mãos do operador. são oferecidas embrulhadas em papel (às vezes. e introduzi-la na cultura de bactéria. Para uso. Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo. As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para evitar contaminação com germes do ar.boca dos mesmos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de algodão).

flambar novamente a alça. lembre-se: ela está muito QUENTE!!! Antes e depois da semeadura em placa mantenha a mesma. Figura 4 – Semedura em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias = eficiência no isolamento de colônias Não esqueça!!!!!! Sempre resfrie a alça (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo. girar a placa cerca de 30˚ e puxar nova estria. sempre invertida.Figura 3 – Semeadura em placa: primeiro conjunto de estrias 6. 9 . 7. antes de colocar a alça em contato com a cultura. As placas serão incubadas a 37˚C por 24h. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes (Figura 4) Essa técnica é conhecida também por esgotamento. Após a primeira estria. e depois guardadas a 4˚C até a próxima aula. ou num pedaço do ágar sem cultura).

tubo de ensaio com meio completo líquido placa de Petri com meio completo sólido. e obter colônias isoladas MATERIAL alça de platina. tubo de ensaio com cultura de Eschirichia coli. PROCEDIMENTO E RESULTADOS Descreva o que foi realizado em cada uma das etapas abaixo. não esquecendo de ilustrar os resultados obtidos A) SEMEADURA EM MEIO LÍQUIDO B) SEMEADURA EM PLACAS CONTENDO MEIO SÓLIDO 10 .OBJETIVO Fazer semeaduras em meios líquido e sólido de cultura de Eschirichia coli.

contendo meio sólido? 11 . Por que deve-se manter sempre que possível a placa de Petri com meio sólido invertida? 3. na semeadura em placa. Por que deve-se flambar os tubos antes e depois de cada transferência? 2. Qual a finalidade de se fazer várias estrias.C) OBTENÇÃO DE CULTURAS PURAS QUESTIONÁRIO 1.

PRÁTICA 2 . A célula bacteriana é negativamente carregada. Quanto aos tipos de coloração temos: 1) Coloração simples . A introdução de colorações. enquanto que os ácidos tem a cor do seu íon negativo. Porém. é chamado de radical cromóforo. Então. em geral. portanto atrai corantes básicos. por quatro razões principais: Permitem uma visualização melhor das células.COLORAÇÃO DE GRAM FIXAÇÃO E COLORAÇÃO DE MICRORGANISMOS A morfologia individual e as reações tintoriais constituem. Os corantes básicos mais comuns são: cristal violeta. os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama. Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares. Um desse íons. já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos.nessa coloração o corante reage diferentemente com 12 . permite a visualização de determinadas estruturas. Os corantes são sais compostos de um íon positivo e um íon negativo. os corantes conhecidos como básicos tem a cor do seu íon positivo. além de facilitar sua observação. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que. veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia. eventualmente. no estudo dos microrganismos.cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis. Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e Podem. o microrganismo deve ser fixado à lâmina. azul de metileno e safranina . Existem inúmeros métodos para coloração. 2) Coloração diferencial . antes de ser corado. identificar alguns grupos. o que dá a cor.

etanolacetona e fucsina básica. Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram(-) (Fig. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas.diferentes tipos de bactérias. iodo. Essas substâncias são chamadas mordentes. Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo). 13 . é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias. A coloração de Gram não está relacionada com os constituintes químicos da parede celular. o que confere a característica de positividade ao Gram. PREPARAÇÃO DE ESFREGAÇOS E COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram.são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos. fixado pelo calor. flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas. mas sim com sua estrutura física.ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais. e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano. A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. 3) Coloração especial . 5). com os reagentes cristal violeta. e é o caso do iodo na coloração de Gram. Essa maneira de reagir diferentemente. A coloração de Gram e a álcool . enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo). em 1884. No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. frente ao Gram. Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração.

mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta. e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CVIodo. a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante. 14 .Parede celular constituída de uma camada grossa de peptídeoglicano Gram positiva Membrana plasmática Complexo de membrana externa. que é maior que a molécula de CV que penetrou. Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana. quando corretamente realizada e interpretada. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil. que não consegue reter o complexo. com inclusões de lipopoliproteínas e lipossacarídeos Parede celular constituída de uma camada fina de peptídeoglicano Membrana plasmática Gram negativa Figura 5 – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente. Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptideoglicano.

o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Grampositivas e provoca a contração dos poros do peptidioglicano. podendo produzir resultados falsos. O objetivo desta prática é demonstrar a importância desta coloração e fazer com que os alunos sejam capazes de distinguir entre Gram (+) e Gram (-). a fucsina básica.A TÉCNICA O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. Por outro lado. mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos. Por outro lado. dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. densidade. células velhas. seguido de tratamento com um fixador. Células de bactérias Gram-positivas. O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%. o etanol-acetona (1:1 v:v). porosidade e integridade. o corante primário é retido e as células permanecem coradas. o uso de material fresco é importante. adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo. as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. com os mesmos resultados. o cristal violeta. pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. com um corante primário. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido. portanto. pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. decorando as células. Em seguida. O corante cristal violeta pode ser substituído. em seus citoplasmas. Paralelamente. 15 . a amostra é tratada com um corante secundário. que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. A etapa da descoloração é crítica. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. o lugol. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina. insolúvel. A retenção ou não do corante primário é. Ao microscópio. resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido. Portanto. tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. tornando-as impermeáveis ao complexo. devem ser capazes de distinguir formas e arranjos.

5) Espalhar o material sobre a lâmina. 4) Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca. MATERIAL alça de platina. OBS. solução diferenciadora. tubo de ensaio com cultura de microrganismo em meio líquído. 7) Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen. PROCEDIMENTO: A. Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido 1) Colocar com a própria alça. já flambada. fucsina básica. placa de Petri com cultura de microrganismo em meio sólido. uma gota de água de torneira no centro da lâmina de vidro. 2) Flambar novamente a alça 16 . lâmina de vidro. lugol. pelo método de Gram. sólido e líquido. cristal violeta a 1%.OBJETIVO Coloração de microrganismos provenientes de meios. PREPARO DO ESFREGAÇO Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido 1) Flambar a alça corretamente 2) Esfriá-la nas paredes do tubo 3) Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça. passando a lâmina algumas vêzes pela chama. 8) Realizar a coloração. 6) Secar à tempetatura ambiente. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixá-lo. procurando obter um esfregaço fino.

Evitar estas culturas! 17 . 8) Lavar novamente em água corrente. 4) Lavar rapidamente em água corrente. A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. 10) Observar ao microscópio com objetiva de imersão. 6) Secar a lâmina por exposição ao ar. ou no meio sólido numa região sem colônia. pois são mais difíceis de descorar e de permitir observações. cuidando para obter uma suspensão pouco densa e sem grumos. não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada. 6) Lavar rapidamente em água corrente. 7) Fixar o esfregaço. A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!! 2) Lavar rapidamente em água corrente. com bactérias G (+) apresentando-se como G(-) e bactérias G(-) corando-se fracamente. devendo ser filtrada para a remoção de precipitados. COLORAÇÃO 1) Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram. Ela deve ser efetuada rapidamente. Porém. 4) Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano. 3) Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto. rapidamente.3) Esfriá-la na tampa da placa de Petri. com a solução diferenciadora: álcool ou acetona. 7) Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos. 9) Secar a lâmina. Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração. 5) Homogeneizar este material com a gota de água. tomando o cuidado de não remover o esfregaço. Os esfregaços não devem ser muito espessos. B. 5) Lavar uma ou duas vezes.

Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas? 2. Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram.RESULTADOS: ___________________ ____________________ __________________ ___________________ QUESTIONÁRIO 1. podendo inclusive levar a erros? 18 .

Repita o procedimento para os fungos apresentados. MATERIAIS Lâminas de placas com microrganismos diferentes (Staphylococcus aureus. Bacillus subtilis. Visualização de bactérias: b) Cocos Gram + : Staphylococcus aureus c) Bacilos Gram + : Bacillus subtilis d) Bacilos Gram . Streptococcus pyogenes e dois tipos de fungos). Microscópio ótico.PRÁTICA 3 .MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA OBJETIVO Visualização das colônias crescidas em placas contendo meio sólido e análise por microscopia óptica e Morfologia de bactérias e de fungos . Pseudomonas aeruginosa. A. PROCEDIMENTO E RESULTADOS Faça um esboço das características morfológicas e suas propriedades tintoriais de cada uma das bactérias apresentadas.: Pseudomonas aeruginosa 19 .

Visualização de fungos Filamentosos Leveduras 20 .e) Cocos Gram + : Streptococcus pyogenes B.

A evolução ocorre através de mutações genéticas que produzem variações na descendência de um organismo e o ambiente determina que mutações são vantajosas no sentido de aumentar suas chances de sobrevivência e de sucesso reprodutivo (adaptação). Quando uma bactéria se divide. O aumento em tamanho de uma célula bacteriana conduz à divisão celular e conseqüente aumento do número de indivíduos na população. cada célula bacteriana é uma unidade catalítica. aumento da massa de uma célula individual. Sob condições ótimas de crescimento. Assim. biomassa é sintetizada em uma taxa progressiva na população em crescimento.. como conseqüência. ou seja. a cada 20 minutos) a população dobra de tamanho. cada novo indivíduo pode catalisar a biossíntese de material celular adicional. aumento da massa total de uma população.CURVA DE CRESCIMENTO CRESCIMENTO BACTERIANO O crescimento de qualquer organismo pode ser definido como o aumento do número de suas células ou o aumento de sua massa. Do ponto de vista bioquímico.PRÁTICA 4 . pode-se presumir que a maioria delas esteja se dividindo ao mesmo tempo e a cada nova geração (e. A maior vantagem de um tempo de reprodução tão rápido é que as bactérias podem evoluir muito rapidamente e esta e a razão do seu sucesso no mundo vivo. muitas espécies bacterianas apresentam um tempo de geração médio de 20 minutos. Este tipo de crescimento populacional é denominado de crescimento exponencial ou logarítmico. Uma característica importante do crescimento bacteriano é o fato de que a maioria das espécies de bactérias é capaz de crescer em taxas bastante rápidas. o número de unidades catalíticas (células) aumenta com o tempo e. no qual o número de indivíduos dobra a cada geração. Devido aos tempos de geração muito curtos.g. as bactérias podem testar 21 . Em uma população composta por milhares de bactérias em crescimento ativo. O tempo de geração refere-se ao tempo requerido para uma célula bacteriana duplicar seu DNA e dividir-se. a cada 20 minutos uma nova geração de indivíduos é produzida. aumento do número de células de uma população. seja em ambientes naturais (in vivo) ou em culturas de laboratório (in vitro). Nos organismos unicelulares. o crescimento pode ser entendido como: aumento de tamanho de uma célula individual.

pH. como cultura pura. Não há método perfeito. Em condições experimentais. o crescimento dessa população passa por quatro fases características.bilhões de mutações em pequenos intervalos de tempo. CURVAS DE CRESCIMENTO Uma das abordagens mais comuns no estudo do crescimento bacteriano é a obtenção de curvas de crescimento. osmolaridade. dependendo do ponto no qual o processo do crescimento seja interrompido pelo experimentador. em meios de cultura e condições ambientais que variam em condições químicas e físicas. quando se inocula uma população bacteriana em um frasco contendo uma quantidade inalterável de meio de cultura (sistema fechado). osmolaridade. o crescimento bem sucedido de uma população bacteriana reflete seu grau de adaptação a um determinado ambiente e depende primariamente de sua composição: condições nutricionais. As distintas espécies bacterianas diferem no âmbito de fatores dentro dos quais podem crescer. Para se estudar o crescimento de uma bactéria é preciso cultivá-la. Essas quatro fases estão representadas na Figura 6. presença ou ausência de oxigênio e temperatura de incubação. O crescimento de uma cultura bacteriana pode ser monitorado através do aumento da biomassa total em determinados intervalos de tempo (através de curvas de crescimento) ou da estimativa do número de células viáveis presentes na população (método de determinação do número de unidades formadoras de colônia). Portanto. tais como fontes de nutrientes. Figura 6 – Curva de crescimento bacteriano padrão em sistema fechado 22 . ambos os métodos apresentam vantagens e desvantagens. Cada grupo bacteriano tem uma faixa de condições nas quais seu crescimento atinge uma taxa ótima. Estas são representações gráficas do aumento do número de indivíduos em um determinado período de tempo. oxigênio e luz. pH. temperatura. A escolha do método depende da situação particular que se apresente.

Cada medida obtida corresponde à densidade óptica (DO) da cultura em um dado momento do crescimento. Para a construção de uma curva de crescimento bacteriano. Desta forma pode-se construir um gráfico representativo do progresso do crescimento. A duração dessa fase depende das condições ambientais nas quais as células se encontravam anteriormente. Fase estacionária: fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente devido às condições limitantes do meio. ausente de inóculo. Após um determinado período de crescimento exponencial. podendo até mesmo decrescer. o que mantém constante o número de células viáveis na população. O número de indivíduos não aumenta nesta fase. Para tal utiliza-se um espectrofotômetro onde o branco é o meio de cultura utilizado. A curva de crescimento atinge um platô. acúmulo de metabólitos tóxicos e limitação de espaço.Fase lag: fase de adaptação metabólica ao novo ambiente. As células continuam metabolizando e se dividindo. Fase de declínio: fase de declínio exponencial do número de células viáveis: a taxa de morte celular torna-se maior que a taxa de divisão. o metabolismo celular está direcionado para sintetizar as enzimas requeridas para o crescimento nas novas condições ambientais encontradas pelas células. Alíquotas da cultura em crescimento são retiradas em determinados intervalos de tempo e mede-se a absorbância da cultura contra um comprimento de onda de 600 nm. mas parte das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito próxima da taxa de morte celular. A taxa de crescimento da população diminui e segue-se a fase estacionária. 23 . A duração da fase estacionária depende do balanço entre a taxa de divisão celular e o número de células que vão se tornando inviáveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido às condições ambientais tornarem-se progressivamente desfavoráveis. mede-se o aumento da biomassa total de uma cultura bacteriana em crescimento em meio líquido através de medidas da densidade óptica da cultura. Fase exponencial ou logarítmica: fase na qual o número de células da população dobra a cada geração. Esta taxa de crescimento não pode ser mantida indefinidamente em um sistema fechado. A absorbância aumenta proporcionalmente ao aumento do número de células (biomassa) na população. relacionando-se a DO pelo tempo. A fase lag será tão mais longa quanto maiores as diferenças de composição do ambiente anterior ou se a população for constituído de bactérias esporuladas. O número de células viáveis entra em declínio progressivo até a completa extinção da população. as condições ambientais tornam-se desfavoráveis pela escassez de nutrientes essenciais.

células bacterianas agrupadas após a divisão celular não prejudicam os resultados. acima disto as leituras perdem a confiabilidade. a introdução de erros experimentais pelo operador é menor. Acima disto as leituras perdem a confiabilidade.0 deve-se fazer uma diluição 10-1 dessa amostra e registrar sua DO. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas. medidas prontamente obtidas: o resultado do experimento é conhecido ao seu final. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais. Desvantagens e limitações não é possível a estimativa do número de células/ml da população. reduzida quantidade de material utilizado. 24 .0.0. Vantagens e desvantagens do método de medidas da densidade óptica Vantagens simplicidade da metodologia. Se a leitura de uma amostra for maior que 2. células inviáveis. só se obtêm leituras acuradas da DO até o valor de 2. reduzindo a introdução de erros experimentais por parte do operador. Quadro 1. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura interferem na obtenção de resultados . possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em gráfico). o experimento não é cansativo. Para a plotagem dos dados no gráfico deve-se multiplicar a DO obtida por 10.Só são confiáveis medidas de DO até 2.

OBJETIVO Obter uma curva de crescimento bacteriano de uma cultura pura de através de medidas de densidade óptica. Espectofotômetro. os demais pontos serão medidos pelos monitores e repassados para os grupos.(Não se esqueça de identificar os eixos. e suas unidades!!!) B) Identificar cada uma das fases de crescimento no gráfico. E. coli MATERIAL Cultura bacteriana pura. Solução salina. RESULTADOS A) Construir um gráfico a partir dos pontos obtidos. QUESTIONÁRIO 1. Pipetas. 25 . Tubos de ensaio. PROCEDIMENTO Durante a aulas serão obtidos apenas alguns pontos experimentais. Quais os problemas observados na construção dos gráficos (em que etapa do crescimento)? Você diria que todos os pontos são confiáveis? Justifique sua resposta.

prejudicando o cálculo se as células da bactéria estudada mantém-se agrupadas após a divisão celular (cada colônia em meio sólido seria formada por mais de uma célula) se as diluições não forem homogeneizadas adequadamente se um número muito pequeno ou muito grande de colônias for usado na contagem se o operador não fizer o espalhamento rapidamente e de forma possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em um gráfico) pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais 26 .PRÁTICA 5 . em solução salina. aquelas capazes de formarem colônias. muitos indivíduos viáveis podem não se replicar. o resultado da contagem das colônias multiplicado pela quantidade de diluições decimais é a estimativa do número de bactérias presentes em um ml da cultura original. no espalhamento. As colônias crescendo no meio de cultura podem ser visualizadas e contadas pelo experimentador. seguido da semeadura de uma alíquota de cada diluição em placas de Petri contendo meio bacteriológico sólido. Vantagens e desvantagens do método da contagem de células viáveis Vantagens permite uma estimativa do número de células viáveis/ml da população Desvantagens e limitações detecta somente as células viáveis e que se repliquem. Como cada colônia supostamente originou-se da multiplicação um único indivíduo. Esta técnica baseia-se na hipótese de que. ou seja. A célula individual que originou uma colônia é denominada de "Unidade Formadora de Colônia" ou UFC.DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO ESTIMATIVA DO NÚMERO DE CÉLULAS VIÁVEIS A estimativa do número de células viáveis comumente é feita através de diluições seriadas de uma cultura bacteriana. Esse procedimento é repetido em diferentes intervalos de tempo e com os resultados pode-se construir um gráfico representando o progresso do crescimento Quadro 2. células bacterianas individuais ocuparão posições separadas na superfície do meio de maneira que cada uma dê origem a uma colônia bacteriana isolada.

Neste caso você poderá: 0. QUE FAZER? 2. coli número de (UFC/ml da cultura original)? (X)_________ 27 .1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey ______ lac+ e 0.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura não interferem na obtenção de resultados adequada. Você tem um estoque de uma super bactéria Escherichia coli (lac+). Você fez um cultivo em meio liquido e tem suspeita que a cultura esta contaminada. Qual é a concentração de E. PROBLEMA: 1. Mas digamos que você precisa ou deseja conhecer o nível de que a bactéria contaminante seja lac-.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey ______ lac+ e contaminação e _________lac_________lac_________lac_________lac- 3. o que prejudica a estimativa a grande quantidade de material utilizado a acuracidade dos resultados está diretamente relacionada à quantidade de material (principalmente placas de Petri) a limitação de material impõe um aumento do erro experimental o resultado do experimento é só conhecido após o crescimento das colônias isoladas nas placas de Petri A) BACTERIANA A determinanção da concentração de bactérias é feita geralmente pela técnica de determinação do Número de UFC (unidades formadoras de colônias).células inviáveis. VOCE PRECISA RECUPERAR SUA BACTÉRIA SUPER MELHORADA GENETICAMENTE.1ml (diluição 10-3) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. a cada diluição um erro experimental é introduzido pela instrumentação e pelo experimentador este método detecta apenas um número muito reduzido de células.

Você saberia discutir por que as aqui empregadas foram escolhidas em cada um dos casos? 28 .contaminante (UFC/ml da cultura original)? ( Y) _________ Qual é porcentagem da contaminação? _( Y) / (X)_____________________ B) DE LEVEDURAS Pela técnica de contagem em câmara de ¨Neubauer¨ VERIFICAÇÃO DE ENTENDIMENTO: Várias técnicas podem ser empregadas para atingir o objetivo desta Prática. Qual é a concentração da bactéria lac.4.

Os desinfetantes possuem atividade bactericida ou germicida e costumam ser aplicados em superfícies inanimadas. CONCEITOS GERAIS Um desinfetante é uma substância usada para destruir bactérias ou outros microrganismos infectantes. tais como óleos voláteis. sendo utilizado em 1847-49 em um hospital vienense quanto à demonstração prática da ação benéfica da anti-sepsia. 29 . Coube a Lister. instrumental cirúrgico e anti-sepsia das feridas. além do fato de os vinhos e vinagres continuarem a serem utilizados durante a Idade Média ao recobrimento de feridas e. mura. Anos mais tarde Pasteur explicou sobre a fermentação bacteriana e a existência de agentes infectantes como responsáveis por processos patológicos. inicialmente desenvolvidos com o intuito da preservação do corpo à ressurreição. em 1865. seu número e sua suscetibilidade. USOS TERAPÊUTICOS DE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES Vários fatores podem influenciar na eficácia e/ou eficiência dos procedimentos ou agentes microbianos. interferindo assim com o crescimento normal do tecido de granulação na cicatrização de feridas. O tempo de contato entre o microorganismo e o antimicrobiano. As substâncias anti-sépticas são aplicadas ao tecidos para suprimir ou impedir a infecção bacteriana. número de microrganismos. concentração da droga e temperatura. A descoberta do cloro na Idade Média foi amplamente utilizada como substância desodorante e anti-séptica. até matar o tecido normal do hospedeiro. vinhos. A presença ou não de uma limpeza mecânica prévia. Uma substância anti–séptica não mata o microrganismo.AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES HISTÓRIA O uso de anti-sépticos e desinfetantes evolui desde o Antigo Egito. consequentemente. A diferença entre um anti-séptico e um desinfetante pode ser uma questão de tempo de reação. Bem como as células bacterianas. O agente microbiano e sua respectiva concentração. mas inibe sua velocidade de crescimento. a divulgação dos métodos de esterilização de bandagens. evitando a infecção. A presença ou não de resistência bacteriana ao agente antimicrobiano. Os anti-sépticos são valiosos no tratamento de infecções locais causadas por microrganismos refratários a quimioterapia sistêmica. O aumento da concentração de um agente anti-séptico pode irritar e talvez.PRÁTICA 6 . em relação aos processos de embalsamento. resinas oleosas. bálsamo. Os egípcios e outros povos utilizaram várias misturas. mel. Tais como: O microorganismo. A prévia remoção ou não de detritos e impurezas da superfície ou tecidos através do uso de sabões ou detergentes. compressas cirúrgicas. A concentração de anti-séptico em geral é baixa para evitar a lesão e irritação tecidual indesejáveis. vinagres.

ÁLCALIS Os álcalis foram utilizados como desinfetantes desde a antigüidade. HALOGÊNIOS Possuem efeitos antibacterianos potentes devido à alta afinidade pelo protoplasma. de terem ação rápida. podem ser usados em soluções com água e álcool. muitos vírus e não em esporos. Bromo. baixa toxicidade. A presença de água é fundamental para a atividade dos álcoois (50-70%) e são mais eficazes na ausência de sujeiras e matéria orgânica. baixa penetrabilidade. As atividades em soluções livres de matéria orgânica são. anti-sépticos e desinfetantes. As desvantagens são: baixa atividade fungicida e virucida. na presença de matéria orgânica o mais ativo é o Iodo. São potentes bactericidas contra micobactérias. 2º. Vantagens apresentadas referem-se ao fato de serem ótimos solventes em relação a outros agentes germicidas. são inodoros. mucosas e trato respiratório. Gram positivas. os detergentes catiônicos não possuem ação virucida. diminuindo assim. Gram negativas. fungicida ou esporocida. Apesar de possuírem efeitos limitados sobre os vírus. 3º. Já. Com base na posição hidrofóbica da molécula. Não-iônicos. não possuírem ação residual e não devem ser utilizados para limpezas de ferimentos abertos. Os surfactantes são adsorvidos em um grau significativo pelo algodão. em ordem decrescente: 1º. há três tipos: Aniônicos : Os sabões são os mais importantes. Um pH maior do que 9 inibirá a maioria das bactérias. não agem na presença de matéria orgânica e podem causar irritação quando em contato prolongado com a pele. desidratantes. pela borracha e materiais porosos. Catiônicos : Os compostos de amônio quaternário são os principais. METAIS PESADOS 30 . ÁLCOOIS Os álcoois alifáticos comuns são bons solventes. São utilizados isoladamente ou combinados com outros agentes. a concentração eficiente e a eficácia antibacteriana. Iodo. eles são eficientes contra bactérias Gram positivas e Gram negativas. SURFACTANTES É um composto químico que diminui a tensão superficial de uma solução aquosa. São antibacterianos contra microrganismos Gram negativos e ácido-resistentes. Cloro. fungos patogênicos. mas em geral. O mecanismo de ação está relacionado à concentração do íon hidroxila. Desvantagens: São neutralizados por surfactantes aniônicos (sabões). de apresentarem baixo custo e praticamente serem atóxicos. Vantagens: Não são em geral irritantes para a pele e tecidos.

A sua ação antibacteriana está relacionada à inibição reversível da atividade enzimática essencial da bactéria e à capacidade de se combinar com íons de compostos metálicos orgânicos e inorgânicos. 4 zaragatoas (“Swab”) estéreis. Os preparados de Prata coloidal não são corrosivos nem irritantes e são usados sobre tecidos sensíveis. O Permanganato de Potássio libera Oxigênio em contato com a matéria orgânica. antibacterianos pela ação do íon de prata livre e produz desnaturação de proteínas. anti-sépticos comerciais (anti-sépticos em geral disponíveis 1 para cada grupo. A prata metálica precipita as proteínas e produz efeito irritante. bico de Bunsen. Compostos de Prata Produzem efeitos cáusticos. 31 . É valioso para limpar e desodorizar o tecido infectado. As soluções possuem uma grande ação antibacteriana. Quando é distribuído sobre ferida com exsudato. sabão. adstringentes. lâminas. OBJETIVOS Verificar a ação de anti-sépticos no crescimento bacteriano. Liberam Oxigênio que se combina com a matéria orgânica se tornando inativos. bateria de Gram. 3 cotonetes embrulhados em papel alumínio autoclavados. mas não destroem esporos bacterianos. ou + 3 zaragatoas estéreis. Alça de Platina . podendo haver repetições). O uso para anti-sepsia de superfícies e objetos inanimados parece imprudente já que há agentes com um modo de ação mais eficiente. Inibem por pouco tempo o crescimento de microrganismos anaeróbicos. a sua efervescência vai remover o pus e restos celulares e confere atividade germicida limitada. AGENTES OXIDANTES São compostos germicidas de ação breve sobre algumas bactérias aeróbicas Gram+ e Gram-. mertiolate. MATERIAL 4 Placas com Ágar-sangue : Meio base para ágar sangue ou TSB enriquecido com 5% sangue desfibrinado de carneiro. A solução de Peróxido de Hidrogênio libera Oxigênio livre rapidamente ao entrar em contato com mucosas e superfícies sem pêlos que fornecem a enzima catalase. Possuem pouca atividade esporicida e são inativados por restos orgânicos. Microscópio óptico.Derivados do mercúrio Parecem ser primariamente bacteriostáticos e apenas levemente bactericidas. álcool iodado.

PROCEDIMENTO 1. numa área de mesmo diâmetro da primeira. Descreva duas situações: uma em que você usaria um anti-séptico e uma em que usaria um desinfetante. Umedecer um segundo cotonete com tintura de iodo ou mertiolato e esfregar nas costas da outra mão. 2. 2. PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA TEORIA Antibiogramas são bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de bactérias aos antimicrobianos.Nesta lista deve conter o principal composto ativo. Tomar cuidado para não atingir a região não desinfectada. 5. Procurar cobrir aproximadamente 4 cm de diâmetro. 4. 2. Espalhar o conteúdo do terceiro cotonete sobre a metade D da placa contendo ágar-sangue. Marcar na placa o anti-séptico utilizado e o número do grupo que realizou o experimento. em estufa a 37°C. 6. 7. Incubar a placa por 24h. e o uso . Espalhar sobre a metade A da placa contendo meio Ágar sangue. Esperar 4 minutos para que haja ação do anti-séptico e passar na área desinfectada um terceiro cotonete umedecido com solução fisiológica. Analisar a Morfologia MACROSCÓPICA das colônias e MICROSPICA das bactérias após coloração de Gram. Umedecer um cotonete estéril em solução fisiológica e esfregar vigorosamente sobre as costas de uma das mãos. o nome comercial. Faça uma lista com pelo menos seis anti-sépticos e seis desinfetantes. RESULTADOS Na quinta-feira: 1. (Não se esqueça de ilustrar o que você observou!) QUESTIONÁRIO 1. Observar os resultados e anotar. 3. Estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a 32 .

MATERIAIS “Swab” estéril. devendo-se realizar a coloração de Gram.5 na escala padrão de turbidez (Escala de MacFarland). Introduzir nas culturas um “swab” estéril. alguns fatores são essenciais: − Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton. 33 .Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um teste qualitativo. discos de papel com antibióticos. com meio Mueller-Hinton sólido. placas de Petri. no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar uniformemente semeado com o microrganismo. OBJETIVO Analisar pelo método de difusão a ressitência de E.atividade de novos agentes. 2. intermediário ou resistente. formando um halo de inibição que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. − Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias. A densidade do inóculo deve corresponder a turbidez 0. que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas.Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de diluição: consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration). cultura líquida fresca de Eschirichia coli. 1. PROCEDIMENTO 1. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível. Após incubação determina-se MIC e/ou MBC. A droga se difunde no ágar e produz inibição do agente sensível. Para a garantia desta técnica. pinças. régua. coli a alguns antibióticos. retirar o excesso de líquido comprimindo a ponta do “swab” nas paredes do tubo. e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias resistentes.

registrar os dados obtidos e relacionar com a tabela abaixo: Bactéria Oxacilina OX (1µg/mL) Carbemicilina CB (100µg/mL) Discos com antibióticos Kanamicina K (30µg/mL) Rifampicina RIF (30µg/mL) Sulfonamida SUL (300µg/mL) Estreptomicina EST (10µg/mL) Escherichia coli Leituras (mm) Resultados Padrões R< 10 S> 13 R< 13 S> 17 R< 12 S> 15 R< 16 S> 20 R< 12 S> 17 R< 11 S> 15 Relate os resultados obtidos e interprete comentando. por 16 a 24 horas. QUESTIONÁRIO 1. 2. O que é antibiograma e para que serve? Quais são os antibióticos beta-lactâmicos? Qual o seu modo de ação? Qual a diferença entre agente bactericida e bacteriostático? Dos antibióticos testados na experiência acima qual seria o mais indicado para o tratamento da infecção causada pela linhagem E. 4. de modo a obter um “tapete” de bactérias em toda a superfície do meio sólido. 4. Medir os halos formados (em mm).2. Colocar os discos de papel contendo os antibióticos sobre a cultura seca (usar pinças). Esperar a cultura sobre o agar secar bem ( 2 minutos). Incubar em estufa a 37ºC . Faça um esquema da parede de uma bactéria Gram-positiva e de uma bactéria Gram-negativa? 34 . coli testada? Por que? 5. Espalhar o conteúdo do “swab” sobre o meio de cultura sólido distribuído numa placa de Petri (meio Mueller-Hinton). 3. 6. 5. Espalhar bem. 3.

Pode ser algum já relatado na literatura ou algum de conhecimento popular. RESULTADOS Descreva as observações feitas ao final da incubação. Discos de papel de filtro. Espalhar sobre a superfície do meio com o próprio cotonete embebido na cultura. Um importante exemplo deste processo é o alho. Macerar o alho e a cebola. 2. INTRODUÇÃO Muitos vegetais contêm compostos que são inibidores de crescimento de microrganismos e exercem papel importante na resistência destes vegetais a patógenos.PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS. Embeber os discos de papel de filtro no macerado e colocá-los sobre a superfície do meio semeado. Culturas: Staphylococcus sp e E. OBJETIVO Estudar a presença de compostos antimicrobianos em vegetais. MATERIAL Placas de ágar Sabouraud. Alho e cebola. 4. separadamente. 35 . PROCEDIMENTO 1. Graal e pistilo. coli. Mergulhar o cotonete na suspensão do microrganismo. em graal. Incubar a 25°C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibição. QUESTIONÁRIO Pesquise e relato algum outro antimicrobiano natural . Cotonetes.PRÁTICA 8 . 5. A presença de substâncias antimicrobianas pode ser verificada através de extratos ou partes homogeneizadas de vegetais colocados frente a culturas de microrganismos. 3.

especifica proteínas envolvidas não só na interação superficial (contacto) entre as células doadora e aceptora. em um sítio específico. refere-se aos genes mob. O processo de conjugação foi descoberto em E. O outro grupo.CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS INTRODUÇÃO A conjugação bacteriana. os plasmídios mobilizáveis codificam. os produtos dos genes mob preparam o DNA para serem transferidos. Como a interação mob-oriT é específica. os quais especificam proteínas envolvidas na mobilização do DNA. chamado de oriT e catalisa o desenrolamento da dupla hélice. descoberta por Lederberg e Tatum (1946) é o processo “sexual"de transferência de genes de uma bactéria doadora para outra receptora. Para que uma linhagem bacteriana seja doadora. A transferência do DNA é iniciada pela ação de um gene mob que tem a atividade em romper (nicking) em uma única fita da molécula do DNA. Há dois tipos de plasmídios conjugativos: os plasmídios auto-transmissíveis e os mobilizáveis. Contudo. Os genes tra podem ser divididos em dois grandes grupos: um grupo. ainda que os produtos dos genes tra promovem o contacto das células doadora-aceptora e promovem um contexto físico (formação dos poros) para esta transferência. ela deve conter um plasmídio conjugativo (elemento extra-cromossômico). Os autotransmissíveis carregam um conjunto de genes. na formação dos poros na membrana. Experimentos genéticos demonstraram que todas as três classes de funcões de 36 . cujos produtos promovem a transferência deste plasmídio para uma célula aceptora. somente um dos conjuntos das funções encontradas nos plasmídios auto-transmissíveis para concluir a transferência. Como resultado. Concluindo.PRÁTICA 9 . somente uma fita. pode ser transferida para a célula aceptora e a outra fita permanece na célula doadora. Um exemplo de plasmídio mobilizável é o plasmído natural ColE1 ou colicinogênico que codifica as atividades dos genes mob e seu oriT. Esta célula doadora é diferenciada durante a conjugação pela presença de um apêndice na sua superfície chamado de pili F. os genes tra. o plasmídio mobilizável deve conter um ori T. para que o plasmídio possa ser transferido. o sítio de oriT deve ser compatível com as funcões mob presentes nas células doadoras. Ambas servem como molde para sintetizar a fita complementar. bem como. Por outro lado. coli K12 e o elemento extra-cromossômico responsável foi chamado de fator F (de fertilidade) ou plasmídio F.

37 . a linhagem bacteriana é chamada de F+ e no segundo Hfr ( a integração do fator F parece ser mediada por pequenas sequências chamadas de elementos IS). normalmente no cromossomo bacteriano. Raramente. Alguns plasmídios não promovem conjugação. coli. Linhagens a) Doadora: Linhagem de Salmonella typhimurium MG031 ( lac. a linhagem Hfr cujo fator F está integrado ao cromossomo bacteriano. o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. OBJETIVO Tranferir de Salmonella typhimurium o plasmídio que carrega o gene que confere resistência a tetraciclina. Hospeda um plasmídio que carrega o marcador que confere resistência a tetraciclina (Tcr ). Estes plasmídios ColE1 codificam proteínas chamadas de colicinas que matam algumas linhagens sensíveis de E. para a Escherichia coli K12 . O fenótipo de resistência ao ácido Nalidíxico deve-se a uma mutação cromossomal. Placas com meio sólido. Por outro lado. tornando-a F+. MATERIAL Tubos de ensaio . b) Receptora: Linhagem de Escherichia coli K12 (lac+ . Raramente.conjugação. As células F+ após contato com as células F-. transferem em alta frequência para esta última uma réplica ou cópia do plasmídio F. mas podem ser mobilizados por outros plasmídios conjugativos. Estes plasmídios possuem marcadores para a resistência às drogas antibacterianas e não integram-se. Após a descoberta do fator F. Nalr).. Neste estado. Os plasmídios conjugativos após serem transferidos e replicados podem permanecerem livres (autônomos) ou integrarem-se ao cromossomo bacteriano (chamados de estado integrado). No primeiro caso. sequencialmente marcadores ou fragmentos deste cromossomo. outros plasmídios conjugativos foram sendo descobertos como é o caso dos fatores ou plasmídios R ou RTF (fator de transferência de resistência). transfere. tra. o fator F media a transferência do cromossoma da célula Hfr para a célula F-. O fator F também é raramente transferido. o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. mob e oriT devem estar presentes para que ocorra conjugação entre bactérias e bactérias e leveduras. Tetr ).

2 Célula receptora: E.3 Mistura de conjugação (Transconjugantes): 0. Agitar bem e incubar por 1 hora sem agitação à temperatura de 37°C.0ml de TSB ou LB as seguintes culturas: 1. Fazer os pré-inóculos das linhagens doadoras e receptoras em 4. 3.1 Célula doadora: S.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey -Tc 0.1ml (diluição 10-4 ) em meio MacConkey -Nal 0. 38 .1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Tc 3. coli K12 0.1ml (diluição 10-2) em meio MacConkey -Nal-Tc 4.1ml (sem diluição) em meio MacConkey-Nal 0.0ml de meio TSB. 2°Dia 1. Adicionar em um tubo de ensaio contendo 1. coli K12 (receptora) 2.0 ml da linhagem S.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Tc 0.Antibióticos a) Ácido Nalidíxico (Nal) usar a concentração de 10µg/ml b) Tetraciclina (Tc) usar a concentração de 50 µg/ml PROCEDIMENTO 1° Dia 1. typhimurium MG031 (doadora) e 1.0 ml da linhagem E.1ml (sem diluição) em meio MacConkey -Nal-Tc 0.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Nal 3. Incubar em estufa à temperatura de 37°C por 16-24 horas (durante uma noite).1ml (sem diluição) em meio YT-Nal-Tc 0. typhimurium MG031 0. Fazer as seguintes semeaduras em placa contendo meio sólido: 3.1ml (diluição 10-1) em meio MacConkey -Nal-Tc 0.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Nal 0. Incubar à temperatura de 37°C por uma noite.

39 .RESULTADOS 3°Dia Analisar os resultados e determinar a freqüência de conjugação. A freqüência é determinada dividindo o número de células transconjugantes pelo número total de células receptoras.

A bactéria deve ser isolada de lesões de uma pessoa infectada e mantida em culturas puras. a susceptibilidade do hospedeiro é tão ou mais importante que as características de virulência da bactéria: Indivíduos cujo sistema imunológico esteja seriamente comprometido por quimioterapia anti-câncer. contudo. a bactéria ou seus produtos devem ser encontrados nas partes do corpo afetados pela doença. A mesma bactéria pode ou não satisfazer os postulados de Koch dependendo da sub-população usada como ponto de referência. Epidemiologia e da Genética Molecular. dos mecanismos que regem a infectividade bacteriana. Na realidade.PRÁTICA 10 . Os postulados de Koch foram originalmente desenvolvidos para identificar bactérias causadoras de epidemias como a cólera e a tuberculose. O segundo postulado enfatiza a obtenção de culturas puras do patógeno. ABORDAGEM CLÁSSICA Robert Koch (1877) formulou um conjunto de quatro postulados os quais afirmava deveriam ser adotados para que se aceitasse uma relação casual entre um microrganismo em particular e uma doença. A mesma bactéria deve ser re-isolada em cultura pura dos indivíduos intencionalmente infectados. uma série de limitações devido ao precário conhecimento. Os postulados de Koch implicam que a virulência é uma característica exclusiva das bactérias e independente do hospedeiro. tratamento com corticosteróides. 2. 1. Estes postulados apresentam. 4. Há algumas 40 . ao tempo de Koch. 1.POSTULADO DE KOCH Como provar que um microrganismo é responsável por uma doença? A resposta clássica é um conjunto de quatro postulados formulados por Robert Koch e posteriormente revisados com o desenvolvimento da Microbiologia. infecção por HIV ou diabetes e que podem ser infectados por bactérias incapazes de causar infecção em pessoas sadias. 3. Estes se constituíram nas primeiras abordagens que forneceram bases científicas para o estudo das doenças infecciosas. 2. A cultura pura quando inoculada em voluntário humano susceptível ou animal experimental deve produzir os sintomas da doença. A bactéria deve ser encontrada em todas as pessoas com a doença.

uma resposta imunológica dos indivíduos infectados contra os antígenos de superfície das bactérias observadas nas lesões provocadas pela doença.doenças cujo agente causativo não pode ser cultivado em meios de laboratório ou cujo meio adequando não é. 41 . 4. Há também. os mesmos sintomas podem ser causados por diferentes espécies de bactérias e há doenças cujas lesões são causados por uma mistura de diferentes linhagens (infecções polimicrobianas). O terceiro postulado requer que a bactéria seja reinoculada em um voluntário humano ou em um animal experimental e que a reinoculação cause os sintomas da doença. 3. os casos nos quais uma única espécie de bactéria é a única responsável por uma doença parece mais uma exceção do que uma regra. respectivamente. Alguns patógenos humanos não causam doenças em animais ou provocam sintomas diferentes daqueles observados em humanos. diferentes linhagens de uma espécie bacteriana não somente variam consideravelmente em virulência como podem causar doenças distintas. o cultivo de uma bactéria em meio de laboratório pode causar a "perda" do fator de virulência: não expressão dos genes nas condições ambientais do meio. Em muitos casos não é possível a utilização de voluntários humanos e a única alternativa é a utilização de um modelo animal. ainda. disponível: Há consideráveis evidências para implicar as bactérias Treponema pallidum e Mycobacterium leprae como causadoras da sífilis e hanseníase. A combinação das tecnologia da reação em cadeia da polimerase (PCR) com as de seqüenciamento de ácidos nucléicos possibilita a detecção e identificação de bactérias não-cultiváveis e revela o agente causativo de muitas doenças. Antibióticos que causam o desaparecimento de sintomas também causam a eliminação da bactéria do tecido infectado. Os segundo e quarto postulados consideram que todos os membros de uma espécie bacteriana são igualmente virulentos e que somente uma única espécie causa uma determinada doença. se houver um disponível.

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