Universidade de São Paulo

Instituto de Ciências Biomédicas Departamento de Microbiologia
BMM121 – Microbiologia Básica

Apostila de Aulas Práticas Profa. Elisabete José Vicente bevicent@usp.br 3091.7350 2004

MICROBIOLOGIA NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA É indispensável o uso de avental no laboratório. O avental deve ser comprido, de mangas compridas e estar abotoado; Não comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratório; O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material necessário ao trabalho prático, como: roteiro de aula, papel e lápis ou caneta para anotações; Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, aspiração de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o técnico responsável pela aula prática; Descarte de material: a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios, existentes nos laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias; b) Placas de petri deverão ser deixadas tampadas sobre a bancada; c) Lâminas fornecidas para visualização deverão ser deixadas sobre as bancadas; d) Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes. Prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes Terminados os trabalhos práticos: a) b) c) d) e) f) Esterilizar alças e fios de platina; Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas; Desligar lâmpadas e microscópios; Limpar microscópios e cobri-los com a capa; Tirar o avental e guardar; Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou anti-séptico.

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Módulo I Introdução à microbiologia

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Módulo I ......................................................................................................................... 4 Introdução à microbiologia ............................................................................................. 4 Prática 1 - NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA ................................................................. 7 Técnica de semeadura ............................................................................................... 7 Objetivo .................................................................................................................... 10 Material ..................................................................................................................... 10 Procedimento e Resultados...................................................................................... 10 Questionário ............................................................................................................. 11 PRÁTICA 2 - COLORAÇÃO DE GRAM........................................................................... 12 Fixação e coloração de microrganismos................................................................... 12 Preparação de esfregaços e coloração pelo método de gram.................................. 13 A técnica ................................................................................................................... 15 Objetivo .................................................................................................................... 16 Material ..................................................................................................................... 16 Procedimento:........................................................................................................... 16 Resultados:............................................................................................................... 18 Questionário ............................................................................................................. 18 PRÁTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA..... 19 Objetivo .................................................................................................................... 19 Materiais ................................................................................................................... 19 Procedimento e resultados ....................................................................................... 19 A. Visualização de bactérias:.................................................................................... 19 B. Visualização de fungos......................................................................................... 20 PRÁTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO .................................................................... 21 Crescimento Bacteriano ........................................................................................... 21 Curvas de crescimento ............................................................................................. 22 Objetivo .................................................................................................................... 25 Material ..................................................................................................................... 25 Procedimento............................................................................................................ 25 Resultados................................................................................................................ 25 Questionário ............................................................................................................. 25 PRÁTICA 5 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO................................................................................................................... 26 Estimativa do número de células viáveis .................................................................. 26 Problema: ................................................................................................................. 27 5

................... 31 Procedimento.............................. 40 Abordagem clássica ....................................................................... 32 Objetivo .................................................. 35 PRÁTICA 9 ........... 29 Anti-sépticos e desinfetantes .............................................. 35 Procedimento............................................................................. 37 Procedimento.................................................................................................................................CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS........................................................... 36 Objetivo ...... 32 PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA ............ 31 Material ........................................................................................AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ...................................................................... 38 Resultados...................................................................................................................................................... 35 Introdução................. 33 Questionário ....................................................................................... 33 Materiais ...................................... 34 PRÁTICA 8 .......................................................... 35 Objetivo ............................................................................................................................................................................. 28 PRÁTICA 6 ........................................................................................................................................... 35 Questionário ........................................................................................................................POSTULADO DE KOCH.. 35 Resultados.......................... 29 Objetivos....................................................... 39 PRÁTICA 10 .......................PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS..................................................................................................... 40 6 .............................................................................................................................................................................................................................................. 32 Questionário ....................................................................................................................................................................................... 33 Procedimento.. 32 Teoria .................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 37 Material .....................................................................................................................................Verificação de entendimento: .................................. ............................ 36 Introdução.............................. 35 Material .......................... 32 Resultados...................................................

Flambagem da alça ou fio de platina: Tanto a alça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura. Esta deverá ser esfriada na parte interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de petri. Toda vez que fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio. esfriar previamente a alça. A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45o em relação à mesa de trabalho (Figura 1).Posição correta para a flambagem da alça 2. deve-se flambar a 7 . TÉCNICA DE SEMEADURA Toda a vez que se fizer uma semeadura é importante seguir as regras abaixo mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura por microrganismos presentes no ambiente. Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. Para retirar o material.PRÁTICA 1 . e evitar acidentes laboratoriais. seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura. 1. Figura 1. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes.NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA Alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminação do manipulador como também dos meios de cultura empregados e das culturas microbianas.

flambar novamente a boca do tubo e colocar a tampa. da mão que está segurando a alça ( Figura 2). 5. após flambar a alça até o rubro. a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba contendo solução desinfetante. Esta seqüência evite que a pipeta seja contaminada pelas mãos do operador. Na semeadura usando placas de Petri. Esta deverá ser mantida segura pelo dedo mínimo. 4.3). retirar primeiramente o papel da parte superior e depois a parte inferior (correspondente à ponta da pipeta). Não pousar os tampões sobre a bancada!!! Flambar a alça após o uso. e introduzi-la na cultura de bactéria. Figura 2 – Removendo o tampão de algodão 3. Para uso. torcer o papel na região central da pipeta. As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para evitar contaminação com germes do ar. Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo. Uma vez utilizada. semear na placa de Petri (fig. 8 . dentro de um cilindro metálico). Após a retirada do material com a alça.boca dos mesmos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de algodão). são oferecidas embrulhadas em papel (às vezes. As pipetas utilizadas em microbiologia são previamente esterilizadas.

Após a primeira estria. 9 .Figura 3 – Semeadura em placa: primeiro conjunto de estrias 6. ou num pedaço do ágar sem cultura). As placas serão incubadas a 37˚C por 24h. flambar novamente a alça. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes (Figura 4) Essa técnica é conhecida também por esgotamento. Figura 4 – Semedura em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias = eficiência no isolamento de colônias Não esqueça!!!!!! Sempre resfrie a alça (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo. lembre-se: ela está muito QUENTE!!! Antes e depois da semeadura em placa mantenha a mesma. girar a placa cerca de 30˚ e puxar nova estria. e depois guardadas a 4˚C até a próxima aula. sempre invertida. 7. antes de colocar a alça em contato com a cultura.

PROCEDIMENTO E RESULTADOS Descreva o que foi realizado em cada uma das etapas abaixo.OBJETIVO Fazer semeaduras em meios líquido e sólido de cultura de Eschirichia coli. e obter colônias isoladas MATERIAL alça de platina. tubo de ensaio com cultura de Eschirichia coli. tubo de ensaio com meio completo líquido placa de Petri com meio completo sólido. não esquecendo de ilustrar os resultados obtidos A) SEMEADURA EM MEIO LÍQUIDO B) SEMEADURA EM PLACAS CONTENDO MEIO SÓLIDO 10 .

Por que deve-se manter sempre que possível a placa de Petri com meio sólido invertida? 3.C) OBTENÇÃO DE CULTURAS PURAS QUESTIONÁRIO 1. Por que deve-se flambar os tubos antes e depois de cada transferência? 2. Qual a finalidade de se fazer várias estrias. na semeadura em placa. contendo meio sólido? 11 .

o que dá a cor.nessa coloração o corante reage diferentemente com 12 . por quatro razões principais: Permitem uma visualização melhor das células. Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e Podem.PRÁTICA 2 . enquanto que os ácidos tem a cor do seu íon negativo. 2) Coloração diferencial . portanto atrai corantes básicos. o microrganismo deve ser fixado à lâmina. Então. Existem inúmeros métodos para coloração. eventualmente. Um desse íons. A introdução de colorações. é chamado de radical cromóforo. antes de ser corado. permite a visualização de determinadas estruturas. A célula bacteriana é negativamente carregada. em geral. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que. Os corantes são sais compostos de um íon positivo e um íon negativo. além de facilitar sua observação. veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia. já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos. identificar alguns grupos. através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama. azul de metileno e safranina . no estudo dos microrganismos. os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. Porém. Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares.cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis.COLORAÇÃO DE GRAM FIXAÇÃO E COLORAÇÃO DE MICRORGANISMOS A morfologia individual e as reações tintoriais constituem. Quanto aos tipos de coloração temos: 1) Coloração simples . os corantes conhecidos como básicos tem a cor do seu íon positivo. Os corantes básicos mais comuns são: cristal violeta.

etanolacetona e fucsina básica.são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos. Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram(-) (Fig. 3) Coloração especial . 5). No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. mas sim com sua estrutura física. enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo). flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas. Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo). em 1884. e é o caso do iodo na coloração de Gram.diferentes tipos de bactérias. e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano. com os reagentes cristal violeta. 13 . A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. fixado pelo calor. Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração. PREPARAÇÃO DE ESFREGAÇOS E COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram. Essa maneira de reagir diferentemente. iodo. frente ao Gram. o que confere a característica de positividade ao Gram. é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias. A coloração de Gram e a álcool .ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais. Essas substâncias são chamadas mordentes. A coloração de Gram não está relacionada com os constituintes químicos da parede celular. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas.

Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta. Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptideoglicano. com inclusões de lipopoliproteínas e lipossacarídeos Parede celular constituída de uma camada fina de peptídeoglicano Membrana plasmática Gram negativa Figura 5 – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente. e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CVIodo. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil. a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas. mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. quando corretamente realizada e interpretada. que é maior que a molécula de CV que penetrou. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante. 14 .Parede celular constituída de uma camada grossa de peptídeoglicano Gram positiva Membrana plasmática Complexo de membrana externa. Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana. que não consegue reter o complexo.

tornando-as impermeáveis ao complexo. com um corante primário. pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. com os mesmos resultados. 15 . decorando as células. o etanol-acetona (1:1 v:v). densidade. pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. devem ser capazes de distinguir formas e arranjos. em seus citoplasmas. dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. Em seguida. Células de bactérias Gram-positivas. as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. portanto. O objetivo desta prática é demonstrar a importância desta coloração e fazer com que os alunos sejam capazes de distinguir entre Gram (+) e Gram (-). resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido. o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Grampositivas e provoca a contração dos poros do peptidioglicano. que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias.A TÉCNICA O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. Ao microscópio. insolúvel. a fucsina básica. Paralelamente. A etapa da descoloração é crítica. o lugol. O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%. O corante cristal violeta pode ser substituído. adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo. o cristal violeta. Por outro lado. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador. o corante primário é retido e as células permanecem coradas. Portanto. Por outro lado. células velhas. A retenção ou não do corante primário é. mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos. seguido de tratamento com um fixador. podendo produzir resultados falsos. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina. o uso de material fresco é importante. porosidade e integridade. a amostra é tratada com um corante secundário.

lâmina de vidro. 7) Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen. 6) Secar à tempetatura ambiente. sólido e líquido. 4) Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixá-lo. MATERIAL alça de platina. Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido 1) Colocar com a própria alça. placa de Petri com cultura de microrganismo em meio sólido. já flambada. OBS. uma gota de água de torneira no centro da lâmina de vidro. PREPARO DO ESFREGAÇO Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido 1) Flambar a alça corretamente 2) Esfriá-la nas paredes do tubo 3) Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça. passando a lâmina algumas vêzes pela chama. cristal violeta a 1%.OBJETIVO Coloração de microrganismos provenientes de meios. 8) Realizar a coloração. tubo de ensaio com cultura de microrganismo em meio líquído. 2) Flambar novamente a alça 16 . pelo método de Gram. PROCEDIMENTO: A. 5) Espalhar o material sobre a lâmina. procurando obter um esfregaço fino. lugol. fucsina básica. solução diferenciadora.

A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. Evitar estas culturas! 17 . com a solução diferenciadora: álcool ou acetona. devendo ser filtrada para a remoção de precipitados.3) Esfriá-la na tampa da placa de Petri. 6) Secar a lâmina por exposição ao ar. Os esfregaços não devem ser muito espessos. 4) Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano. cuidando para obter uma suspensão pouco densa e sem grumos. B. com bactérias G (+) apresentando-se como G(-) e bactérias G(-) corando-se fracamente. 5) Lavar uma ou duas vezes. Porém. A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada. pois são mais difíceis de descorar e de permitir observações. 7) Fixar o esfregaço. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!! 2) Lavar rapidamente em água corrente. 6) Lavar rapidamente em água corrente. 5) Homogeneizar este material com a gota de água. tomando o cuidado de não remover o esfregaço. 10) Observar ao microscópio com objetiva de imersão. 7) Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos. 3) Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto. Ela deve ser efetuada rapidamente. não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada. ou no meio sólido numa região sem colônia. COLORAÇÃO 1) Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. 9) Secar a lâmina. 8) Lavar novamente em água corrente. Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração. Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram. rapidamente. 4) Lavar rapidamente em água corrente.

podendo inclusive levar a erros? 18 . Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas? 2. Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram.RESULTADOS: ___________________ ____________________ __________________ ___________________ QUESTIONÁRIO 1.

Microscópio ótico. Bacillus subtilis. Pseudomonas aeruginosa. Streptococcus pyogenes e dois tipos de fungos). PROCEDIMENTO E RESULTADOS Faça um esboço das características morfológicas e suas propriedades tintoriais de cada uma das bactérias apresentadas.: Pseudomonas aeruginosa 19 .PRÁTICA 3 . Visualização de bactérias: b) Cocos Gram + : Staphylococcus aureus c) Bacilos Gram + : Bacillus subtilis d) Bacilos Gram . Repita o procedimento para os fungos apresentados. A. MATERIAIS Lâminas de placas com microrganismos diferentes (Staphylococcus aureus.MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA OBJETIVO Visualização das colônias crescidas em placas contendo meio sólido e análise por microscopia óptica e Morfologia de bactérias e de fungos .

Visualização de fungos Filamentosos Leveduras 20 .e) Cocos Gram + : Streptococcus pyogenes B.

as bactérias podem testar 21 . ou seja. Uma característica importante do crescimento bacteriano é o fato de que a maioria das espécies de bactérias é capaz de crescer em taxas bastante rápidas. no qual o número de indivíduos dobra a cada geração. A evolução ocorre através de mutações genéticas que produzem variações na descendência de um organismo e o ambiente determina que mutações são vantajosas no sentido de aumentar suas chances de sobrevivência e de sucesso reprodutivo (adaptação).PRÁTICA 4 . Assim. pode-se presumir que a maioria delas esteja se dividindo ao mesmo tempo e a cada nova geração (e. Do ponto de vista bioquímico. o crescimento pode ser entendido como: aumento de tamanho de uma célula individual. a cada 20 minutos) a população dobra de tamanho. Este tipo de crescimento populacional é denominado de crescimento exponencial ou logarítmico. aumento da massa de uma célula individual. Em uma população composta por milhares de bactérias em crescimento ativo. aumento do número de células de uma população. O aumento em tamanho de uma célula bacteriana conduz à divisão celular e conseqüente aumento do número de indivíduos na população. O tempo de geração refere-se ao tempo requerido para uma célula bacteriana duplicar seu DNA e dividir-se.CURVA DE CRESCIMENTO CRESCIMENTO BACTERIANO O crescimento de qualquer organismo pode ser definido como o aumento do número de suas células ou o aumento de sua massa. o número de unidades catalíticas (células) aumenta com o tempo e. aumento da massa total de uma população. cada novo indivíduo pode catalisar a biossíntese de material celular adicional.g.. A maior vantagem de um tempo de reprodução tão rápido é que as bactérias podem evoluir muito rapidamente e esta e a razão do seu sucesso no mundo vivo. Devido aos tempos de geração muito curtos. seja em ambientes naturais (in vivo) ou em culturas de laboratório (in vitro). Quando uma bactéria se divide. Sob condições ótimas de crescimento. cada célula bacteriana é uma unidade catalítica. como conseqüência. biomassa é sintetizada em uma taxa progressiva na população em crescimento. Nos organismos unicelulares. muitas espécies bacterianas apresentam um tempo de geração médio de 20 minutos. a cada 20 minutos uma nova geração de indivíduos é produzida.

como cultura pura. A escolha do método depende da situação particular que se apresente. Portanto. O crescimento de uma cultura bacteriana pode ser monitorado através do aumento da biomassa total em determinados intervalos de tempo (através de curvas de crescimento) ou da estimativa do número de células viáveis presentes na população (método de determinação do número de unidades formadoras de colônia).bilhões de mutações em pequenos intervalos de tempo. dependendo do ponto no qual o processo do crescimento seja interrompido pelo experimentador. o crescimento bem sucedido de uma população bacteriana reflete seu grau de adaptação a um determinado ambiente e depende primariamente de sua composição: condições nutricionais. As distintas espécies bacterianas diferem no âmbito de fatores dentro dos quais podem crescer. tais como fontes de nutrientes. pH. Em condições experimentais. osmolaridade. pH. quando se inocula uma população bacteriana em um frasco contendo uma quantidade inalterável de meio de cultura (sistema fechado). Não há método perfeito. Estas são representações gráficas do aumento do número de indivíduos em um determinado período de tempo. em meios de cultura e condições ambientais que variam em condições químicas e físicas. oxigênio e luz. Para se estudar o crescimento de uma bactéria é preciso cultivá-la. Figura 6 – Curva de crescimento bacteriano padrão em sistema fechado 22 . presença ou ausência de oxigênio e temperatura de incubação. osmolaridade. Essas quatro fases estão representadas na Figura 6. temperatura. ambos os métodos apresentam vantagens e desvantagens. CURVAS DE CRESCIMENTO Uma das abordagens mais comuns no estudo do crescimento bacteriano é a obtenção de curvas de crescimento. Cada grupo bacteriano tem uma faixa de condições nas quais seu crescimento atinge uma taxa ótima. o crescimento dessa população passa por quatro fases características.

Fase lag: fase de adaptação metabólica ao novo ambiente. As células continuam metabolizando e se dividindo. acúmulo de metabólitos tóxicos e limitação de espaço. o que mantém constante o número de células viáveis na população. A curva de crescimento atinge um platô. Esta taxa de crescimento não pode ser mantida indefinidamente em um sistema fechado. Cada medida obtida corresponde à densidade óptica (DO) da cultura em um dado momento do crescimento. as condições ambientais tornam-se desfavoráveis pela escassez de nutrientes essenciais. Fase de declínio: fase de declínio exponencial do número de células viáveis: a taxa de morte celular torna-se maior que a taxa de divisão. Alíquotas da cultura em crescimento são retiradas em determinados intervalos de tempo e mede-se a absorbância da cultura contra um comprimento de onda de 600 nm. O número de indivíduos não aumenta nesta fase. podendo até mesmo decrescer. A duração da fase estacionária depende do balanço entre a taxa de divisão celular e o número de células que vão se tornando inviáveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido às condições ambientais tornarem-se progressivamente desfavoráveis. mede-se o aumento da biomassa total de uma cultura bacteriana em crescimento em meio líquido através de medidas da densidade óptica da cultura. Desta forma pode-se construir um gráfico representativo do progresso do crescimento. A duração dessa fase depende das condições ambientais nas quais as células se encontravam anteriormente. Após um determinado período de crescimento exponencial. O número de células viáveis entra em declínio progressivo até a completa extinção da população. mas parte das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito próxima da taxa de morte celular. 23 . Para tal utiliza-se um espectrofotômetro onde o branco é o meio de cultura utilizado. Fase estacionária: fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente devido às condições limitantes do meio. relacionando-se a DO pelo tempo. A fase lag será tão mais longa quanto maiores as diferenças de composição do ambiente anterior ou se a população for constituído de bactérias esporuladas. ausente de inóculo. A taxa de crescimento da população diminui e segue-se a fase estacionária. Para a construção de uma curva de crescimento bacteriano. o metabolismo celular está direcionado para sintetizar as enzimas requeridas para o crescimento nas novas condições ambientais encontradas pelas células. A absorbância aumenta proporcionalmente ao aumento do número de células (biomassa) na população. Fase exponencial ou logarítmica: fase na qual o número de células da população dobra a cada geração.

24 . reduzida quantidade de material utilizado.0 deve-se fazer uma diluição 10-1 dessa amostra e registrar sua DO. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura interferem na obtenção de resultados . Quadro 1. células inviáveis. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais. a introdução de erros experimentais pelo operador é menor. reduzindo a introdução de erros experimentais por parte do operador. Desvantagens e limitações não é possível a estimativa do número de células/ml da população. células bacterianas agrupadas após a divisão celular não prejudicam os resultados.0. só se obtêm leituras acuradas da DO até o valor de 2. Se a leitura de uma amostra for maior que 2. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas. acima disto as leituras perdem a confiabilidade. medidas prontamente obtidas: o resultado do experimento é conhecido ao seu final. Vantagens e desvantagens do método de medidas da densidade óptica Vantagens simplicidade da metodologia. o experimento não é cansativo. possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em gráfico).0. Para a plotagem dos dados no gráfico deve-se multiplicar a DO obtida por 10. Acima disto as leituras perdem a confiabilidade.Só são confiáveis medidas de DO até 2.

os demais pontos serão medidos pelos monitores e repassados para os grupos.OBJETIVO Obter uma curva de crescimento bacteriano de uma cultura pura de através de medidas de densidade óptica. RESULTADOS A) Construir um gráfico a partir dos pontos obtidos. e suas unidades!!!) B) Identificar cada uma das fases de crescimento no gráfico. 25 . Espectofotômetro.(Não se esqueça de identificar os eixos. Solução salina. Tubos de ensaio. Quais os problemas observados na construção dos gráficos (em que etapa do crescimento)? Você diria que todos os pontos são confiáveis? Justifique sua resposta. E. QUESTIONÁRIO 1. Pipetas. PROCEDIMENTO Durante a aulas serão obtidos apenas alguns pontos experimentais. coli MATERIAL Cultura bacteriana pura.

Vantagens e desvantagens do método da contagem de células viáveis Vantagens permite uma estimativa do número de células viáveis/ml da população Desvantagens e limitações detecta somente as células viáveis e que se repliquem. no espalhamento. aquelas capazes de formarem colônias. muitos indivíduos viáveis podem não se replicar. Como cada colônia supostamente originou-se da multiplicação um único indivíduo. células bacterianas individuais ocuparão posições separadas na superfície do meio de maneira que cada uma dê origem a uma colônia bacteriana isolada. As colônias crescendo no meio de cultura podem ser visualizadas e contadas pelo experimentador. prejudicando o cálculo se as células da bactéria estudada mantém-se agrupadas após a divisão celular (cada colônia em meio sólido seria formada por mais de uma célula) se as diluições não forem homogeneizadas adequadamente se um número muito pequeno ou muito grande de colônias for usado na contagem se o operador não fizer o espalhamento rapidamente e de forma possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em um gráfico) pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais 26 . seguido da semeadura de uma alíquota de cada diluição em placas de Petri contendo meio bacteriológico sólido. Esta técnica baseia-se na hipótese de que.DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO ESTIMATIVA DO NÚMERO DE CÉLULAS VIÁVEIS A estimativa do número de células viáveis comumente é feita através de diluições seriadas de uma cultura bacteriana. ou seja. A célula individual que originou uma colônia é denominada de "Unidade Formadora de Colônia" ou UFC. Esse procedimento é repetido em diferentes intervalos de tempo e com os resultados pode-se construir um gráfico representando o progresso do crescimento Quadro 2.PRÁTICA 5 . o resultado da contagem das colônias multiplicado pela quantidade de diluições decimais é a estimativa do número de bactérias presentes em um ml da cultura original. em solução salina.

células inviáveis. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura não interferem na obtenção de resultados adequada. QUE FAZER? 2. coli número de (UFC/ml da cultura original)? (X)_________ 27 .1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. PROBLEMA: 1.1ml (diluição 10-3) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. Qual é a concentração de E. Você fez um cultivo em meio liquido e tem suspeita que a cultura esta contaminada. Você tem um estoque de uma super bactéria Escherichia coli (lac+).1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey ______ lac+ e contaminação e _________lac_________lac_________lac_________lac- 3. o que prejudica a estimativa a grande quantidade de material utilizado a acuracidade dos resultados está diretamente relacionada à quantidade de material (principalmente placas de Petri) a limitação de material impõe um aumento do erro experimental o resultado do experimento é só conhecido após o crescimento das colônias isoladas nas placas de Petri A) BACTERIANA A determinanção da concentração de bactérias é feita geralmente pela técnica de determinação do Número de UFC (unidades formadoras de colônias). Neste caso você poderá: 0. Mas digamos que você precisa ou deseja conhecer o nível de que a bactéria contaminante seja lac-.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. a cada diluição um erro experimental é introduzido pela instrumentação e pelo experimentador este método detecta apenas um número muito reduzido de células. VOCE PRECISA RECUPERAR SUA BACTÉRIA SUPER MELHORADA GENETICAMENTE.

4. Qual é a concentração da bactéria lac.contaminante (UFC/ml da cultura original)? ( Y) _________ Qual é porcentagem da contaminação? _( Y) / (X)_____________________ B) DE LEVEDURAS Pela técnica de contagem em câmara de ¨Neubauer¨ VERIFICAÇÃO DE ENTENDIMENTO: Várias técnicas podem ser empregadas para atingir o objetivo desta Prática. Você saberia discutir por que as aqui empregadas foram escolhidas em cada um dos casos? 28 .

O aumento da concentração de um agente anti-séptico pode irritar e talvez. vinhos. mel. até matar o tecido normal do hospedeiro. em relação aos processos de embalsamento. A presença ou não de resistência bacteriana ao agente antimicrobiano. além do fato de os vinhos e vinagres continuarem a serem utilizados durante a Idade Média ao recobrimento de feridas e. compressas cirúrgicas. número de microrganismos. resinas oleosas. 29 . instrumental cirúrgico e anti-sepsia das feridas. inicialmente desenvolvidos com o intuito da preservação do corpo à ressurreição. O agente microbiano e sua respectiva concentração. mura. O tempo de contato entre o microorganismo e o antimicrobiano. Coube a Lister. Os egípcios e outros povos utilizaram várias misturas. em 1865.AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES HISTÓRIA O uso de anti-sépticos e desinfetantes evolui desde o Antigo Egito. a divulgação dos métodos de esterilização de bandagens. consequentemente. interferindo assim com o crescimento normal do tecido de granulação na cicatrização de feridas. Os desinfetantes possuem atividade bactericida ou germicida e costumam ser aplicados em superfícies inanimadas. mas inibe sua velocidade de crescimento. concentração da droga e temperatura.PRÁTICA 6 . vinagres. bálsamo. USOS TERAPÊUTICOS DE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES Vários fatores podem influenciar na eficácia e/ou eficiência dos procedimentos ou agentes microbianos. sendo utilizado em 1847-49 em um hospital vienense quanto à demonstração prática da ação benéfica da anti-sepsia. seu número e sua suscetibilidade. A descoberta do cloro na Idade Média foi amplamente utilizada como substância desodorante e anti-séptica. A prévia remoção ou não de detritos e impurezas da superfície ou tecidos através do uso de sabões ou detergentes. evitando a infecção. Bem como as células bacterianas. Anos mais tarde Pasteur explicou sobre a fermentação bacteriana e a existência de agentes infectantes como responsáveis por processos patológicos. A presença ou não de uma limpeza mecânica prévia. Tais como: O microorganismo. Uma substância anti–séptica não mata o microrganismo. A diferença entre um anti-séptico e um desinfetante pode ser uma questão de tempo de reação. A concentração de anti-séptico em geral é baixa para evitar a lesão e irritação tecidual indesejáveis. Os anti-sépticos são valiosos no tratamento de infecções locais causadas por microrganismos refratários a quimioterapia sistêmica. CONCEITOS GERAIS Um desinfetante é uma substância usada para destruir bactérias ou outros microrganismos infectantes. tais como óleos voláteis. As substâncias anti-sépticas são aplicadas ao tecidos para suprimir ou impedir a infecção bacteriana.

fungicida ou esporocida. HALOGÊNIOS Possuem efeitos antibacterianos potentes devido à alta afinidade pelo protoplasma. 2º. A presença de água é fundamental para a atividade dos álcoois (50-70%) e são mais eficazes na ausência de sujeiras e matéria orgânica. baixa toxicidade. não possuírem ação residual e não devem ser utilizados para limpezas de ferimentos abertos. mas em geral. eles são eficientes contra bactérias Gram positivas e Gram negativas. anti-sépticos e desinfetantes. são inodoros. As atividades em soluções livres de matéria orgânica são. diminuindo assim. São potentes bactericidas contra micobactérias. METAIS PESADOS 30 . de apresentarem baixo custo e praticamente serem atóxicos. mucosas e trato respiratório. Desvantagens: São neutralizados por surfactantes aniônicos (sabões). em ordem decrescente: 1º. Vantagens apresentadas referem-se ao fato de serem ótimos solventes em relação a outros agentes germicidas. não agem na presença de matéria orgânica e podem causar irritação quando em contato prolongado com a pele. Catiônicos : Os compostos de amônio quaternário são os principais. Os surfactantes são adsorvidos em um grau significativo pelo algodão. Já. pela borracha e materiais porosos. podem ser usados em soluções com água e álcool. São utilizados isoladamente ou combinados com outros agentes. Apesar de possuírem efeitos limitados sobre os vírus. 3º. Iodo. de terem ação rápida. a concentração eficiente e a eficácia antibacteriana. São antibacterianos contra microrganismos Gram negativos e ácido-resistentes. fungos patogênicos. baixa penetrabilidade. Cloro. Gram positivas. na presença de matéria orgânica o mais ativo é o Iodo. Um pH maior do que 9 inibirá a maioria das bactérias. Gram negativas. Com base na posição hidrofóbica da molécula. Não-iônicos. As desvantagens são: baixa atividade fungicida e virucida.ÁLCALIS Os álcalis foram utilizados como desinfetantes desde a antigüidade. Vantagens: Não são em geral irritantes para a pele e tecidos. muitos vírus e não em esporos. os detergentes catiônicos não possuem ação virucida. ÁLCOOIS Os álcoois alifáticos comuns são bons solventes. SURFACTANTES É um composto químico que diminui a tensão superficial de uma solução aquosa. O mecanismo de ação está relacionado à concentração do íon hidroxila. Bromo. desidratantes. há três tipos: Aniônicos : Os sabões são os mais importantes.

A solução de Peróxido de Hidrogênio libera Oxigênio livre rapidamente ao entrar em contato com mucosas e superfícies sem pêlos que fornecem a enzima catalase. 31 . mertiolate. É valioso para limpar e desodorizar o tecido infectado. podendo haver repetições).Derivados do mercúrio Parecem ser primariamente bacteriostáticos e apenas levemente bactericidas. Quando é distribuído sobre ferida com exsudato. adstringentes. Microscópio óptico. Os preparados de Prata coloidal não são corrosivos nem irritantes e são usados sobre tecidos sensíveis. AGENTES OXIDANTES São compostos germicidas de ação breve sobre algumas bactérias aeróbicas Gram+ e Gram-. Possuem pouca atividade esporicida e são inativados por restos orgânicos. ou + 3 zaragatoas estéreis. OBJETIVOS Verificar a ação de anti-sépticos no crescimento bacteriano. bateria de Gram. mas não destroem esporos bacterianos. A prata metálica precipita as proteínas e produz efeito irritante. Compostos de Prata Produzem efeitos cáusticos. bico de Bunsen. Liberam Oxigênio que se combina com a matéria orgânica se tornando inativos. MATERIAL 4 Placas com Ágar-sangue : Meio base para ágar sangue ou TSB enriquecido com 5% sangue desfibrinado de carneiro. O uso para anti-sepsia de superfícies e objetos inanimados parece imprudente já que há agentes com um modo de ação mais eficiente. 4 zaragatoas (“Swab”) estéreis. A sua ação antibacteriana está relacionada à inibição reversível da atividade enzimática essencial da bactéria e à capacidade de se combinar com íons de compostos metálicos orgânicos e inorgânicos. a sua efervescência vai remover o pus e restos celulares e confere atividade germicida limitada. As soluções possuem uma grande ação antibacteriana. anti-sépticos comerciais (anti-sépticos em geral disponíveis 1 para cada grupo. sabão. álcool iodado. Inibem por pouco tempo o crescimento de microrganismos anaeróbicos. Alça de Platina . 3 cotonetes embrulhados em papel alumínio autoclavados. antibacterianos pela ação do íon de prata livre e produz desnaturação de proteínas. lâminas. O Permanganato de Potássio libera Oxigênio em contato com a matéria orgânica.

PROCEDIMENTO 1. 5. numa área de mesmo diâmetro da primeira. Faça uma lista com pelo menos seis anti-sépticos e seis desinfetantes. Incubar a placa por 24h. e o uso . Descreva duas situações: uma em que você usaria um anti-séptico e uma em que usaria um desinfetante. 7. 3. Estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a 32 . 6. Procurar cobrir aproximadamente 4 cm de diâmetro. 2. Umedecer um cotonete estéril em solução fisiológica e esfregar vigorosamente sobre as costas de uma das mãos. o nome comercial. Analisar a Morfologia MACROSCÓPICA das colônias e MICROSPICA das bactérias após coloração de Gram. Marcar na placa o anti-séptico utilizado e o número do grupo que realizou o experimento. RESULTADOS Na quinta-feira: 1. em estufa a 37°C. 2.Nesta lista deve conter o principal composto ativo. 4. Umedecer um segundo cotonete com tintura de iodo ou mertiolato e esfregar nas costas da outra mão. Tomar cuidado para não atingir a região não desinfectada. Observar os resultados e anotar. Espalhar o conteúdo do terceiro cotonete sobre a metade D da placa contendo ágar-sangue. Espalhar sobre a metade A da placa contendo meio Ágar sangue. PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA TEORIA Antibiogramas são bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de bactérias aos antimicrobianos. 2. (Não se esqueça de ilustrar o que você observou!) QUESTIONÁRIO 1. Esperar 4 minutos para que haja ação do anti-séptico e passar na área desinfectada um terceiro cotonete umedecido com solução fisiológica.

MATERIAIS “Swab” estéril. no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar uniformemente semeado com o microrganismo. devendo-se realizar a coloração de Gram.Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um teste qualitativo. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível.atividade de novos agentes. régua. 1. A droga se difunde no ágar e produz inibição do agente sensível. Após incubação determina-se MIC e/ou MBC. − Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias. A densidade do inóculo deve corresponder a turbidez 0. placas de Petri. pinças. ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration). alguns fatores são essenciais: − Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton. 33 . formando um halo de inibição que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. com meio Mueller-Hinton sólido. Para a garantia desta técnica. intermediário ou resistente. cultura líquida fresca de Eschirichia coli. retirar o excesso de líquido comprimindo a ponta do “swab” nas paredes do tubo. OBJETIVO Analisar pelo método de difusão a ressitência de E. Introduzir nas culturas um “swab” estéril. coli a alguns antibióticos. que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas.5 na escala padrão de turbidez (Escala de MacFarland).Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de diluição: consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. PROCEDIMENTO 1. e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias resistentes. discos de papel com antibióticos. 2.

Faça um esquema da parede de uma bactéria Gram-positiva e de uma bactéria Gram-negativa? 34 . Esperar a cultura sobre o agar secar bem ( 2 minutos). 6. 5. 4. Espalhar bem. 3. de modo a obter um “tapete” de bactérias em toda a superfície do meio sólido. 3. Medir os halos formados (em mm). Espalhar o conteúdo do “swab” sobre o meio de cultura sólido distribuído numa placa de Petri (meio Mueller-Hinton). por 16 a 24 horas. Incubar em estufa a 37ºC .2. 4. Colocar os discos de papel contendo os antibióticos sobre a cultura seca (usar pinças). coli testada? Por que? 5. 2. registrar os dados obtidos e relacionar com a tabela abaixo: Bactéria Oxacilina OX (1µg/mL) Carbemicilina CB (100µg/mL) Discos com antibióticos Kanamicina K (30µg/mL) Rifampicina RIF (30µg/mL) Sulfonamida SUL (300µg/mL) Estreptomicina EST (10µg/mL) Escherichia coli Leituras (mm) Resultados Padrões R< 10 S> 13 R< 13 S> 17 R< 12 S> 15 R< 16 S> 20 R< 12 S> 17 R< 11 S> 15 Relate os resultados obtidos e interprete comentando. QUESTIONÁRIO 1. O que é antibiograma e para que serve? Quais são os antibióticos beta-lactâmicos? Qual o seu modo de ação? Qual a diferença entre agente bactericida e bacteriostático? Dos antibióticos testados na experiência acima qual seria o mais indicado para o tratamento da infecção causada pela linhagem E.

Alho e cebola. Mergulhar o cotonete na suspensão do microrganismo. Cotonetes. QUESTIONÁRIO Pesquise e relato algum outro antimicrobiano natural . OBJETIVO Estudar a presença de compostos antimicrobianos em vegetais. 4. separadamente. Discos de papel de filtro. 3. Culturas: Staphylococcus sp e E. coli. Pode ser algum já relatado na literatura ou algum de conhecimento popular. Um importante exemplo deste processo é o alho. Espalhar sobre a superfície do meio com o próprio cotonete embebido na cultura. em graal. MATERIAL Placas de ágar Sabouraud. Graal e pistilo.PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS. Macerar o alho e a cebola. RESULTADOS Descreva as observações feitas ao final da incubação. 35 .PRÁTICA 8 . A presença de substâncias antimicrobianas pode ser verificada através de extratos ou partes homogeneizadas de vegetais colocados frente a culturas de microrganismos. PROCEDIMENTO 1. 5. 2. INTRODUÇÃO Muitos vegetais contêm compostos que são inibidores de crescimento de microrganismos e exercem papel importante na resistência destes vegetais a patógenos. Incubar a 25°C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibição. Embeber os discos de papel de filtro no macerado e colocá-los sobre a superfície do meio semeado.

ela deve conter um plasmídio conjugativo (elemento extra-cromossômico). Um exemplo de plasmídio mobilizável é o plasmído natural ColE1 ou colicinogênico que codifica as atividades dos genes mob e seu oriT. cujos produtos promovem a transferência deste plasmídio para uma célula aceptora. Ambas servem como molde para sintetizar a fita complementar. os genes tra. bem como. descoberta por Lederberg e Tatum (1946) é o processo “sexual"de transferência de genes de uma bactéria doadora para outra receptora. Experimentos genéticos demonstraram que todas as três classes de funcões de 36 .PRÁTICA 9 . Contudo. os produtos dos genes mob preparam o DNA para serem transferidos. Os autotransmissíveis carregam um conjunto de genes. somente um dos conjuntos das funções encontradas nos plasmídios auto-transmissíveis para concluir a transferência. Os genes tra podem ser divididos em dois grandes grupos: um grupo.CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS INTRODUÇÃO A conjugação bacteriana. os quais especificam proteínas envolvidas na mobilização do DNA. Esta célula doadora é diferenciada durante a conjugação pela presença de um apêndice na sua superfície chamado de pili F. Por outro lado. refere-se aos genes mob. coli K12 e o elemento extra-cromossômico responsável foi chamado de fator F (de fertilidade) ou plasmídio F. pode ser transferida para a célula aceptora e a outra fita permanece na célula doadora. o sítio de oriT deve ser compatível com as funcões mob presentes nas células doadoras. para que o plasmídio possa ser transferido. Para que uma linhagem bacteriana seja doadora. O processo de conjugação foi descoberto em E. ainda que os produtos dos genes tra promovem o contacto das células doadora-aceptora e promovem um contexto físico (formação dos poros) para esta transferência. especifica proteínas envolvidas não só na interação superficial (contacto) entre as células doadora e aceptora. chamado de oriT e catalisa o desenrolamento da dupla hélice. Como a interação mob-oriT é específica. somente uma fita. Concluindo. o plasmídio mobilizável deve conter um ori T. os plasmídios mobilizáveis codificam. em um sítio específico. Há dois tipos de plasmídios conjugativos: os plasmídios auto-transmissíveis e os mobilizáveis. Como resultado. O outro grupo. A transferência do DNA é iniciada pela ação de um gene mob que tem a atividade em romper (nicking) em uma única fita da molécula do DNA. na formação dos poros na membrana.

a linhagem bacteriana é chamada de F+ e no segundo Hfr ( a integração do fator F parece ser mediada por pequenas sequências chamadas de elementos IS). tra. Placas com meio sólido. o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. Por outro lado. OBJETIVO Tranferir de Salmonella typhimurium o plasmídio que carrega o gene que confere resistência a tetraciclina. Os plasmídios conjugativos após serem transferidos e replicados podem permanecerem livres (autônomos) ou integrarem-se ao cromossomo bacteriano (chamados de estado integrado). Neste estado.. transferem em alta frequência para esta última uma réplica ou cópia do plasmídio F. Hospeda um plasmídio que carrega o marcador que confere resistência a tetraciclina (Tcr ). As células F+ após contato com as células F-. tornando-a F+. O fator F também é raramente transferido. Raramente. O fenótipo de resistência ao ácido Nalidíxico deve-se a uma mutação cromossomal. mas podem ser mobilizados por outros plasmídios conjugativos. Estes plasmídios ColE1 codificam proteínas chamadas de colicinas que matam algumas linhagens sensíveis de E. mob e oriT devem estar presentes para que ocorra conjugação entre bactérias e bactérias e leveduras. outros plasmídios conjugativos foram sendo descobertos como é o caso dos fatores ou plasmídios R ou RTF (fator de transferência de resistência). 37 . Raramente. normalmente no cromossomo bacteriano. Estes plasmídios possuem marcadores para a resistência às drogas antibacterianas e não integram-se. transfere. Alguns plasmídios não promovem conjugação. b) Receptora: Linhagem de Escherichia coli K12 (lac+ . MATERIAL Tubos de ensaio . a linhagem Hfr cujo fator F está integrado ao cromossomo bacteriano. coli. Linhagens a) Doadora: Linhagem de Salmonella typhimurium MG031 ( lac. Nalr). sequencialmente marcadores ou fragmentos deste cromossomo.conjugação. No primeiro caso. o fator F media a transferência do cromossoma da célula Hfr para a célula F-. Após a descoberta do fator F. Tetr ). para a Escherichia coli K12 . o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido.

0 ml da linhagem S. coli K12 (receptora) 2.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Tc 3.3 Mistura de conjugação (Transconjugantes): 0. Adicionar em um tubo de ensaio contendo 1. Fazer as seguintes semeaduras em placa contendo meio sólido: 3.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey -Tc 0. 2°Dia 1. 38 .1ml (sem diluição) em meio YT-Nal-Tc 0. Incubar à temperatura de 37°C por uma noite.2 Célula receptora: E. typhimurium MG031 (doadora) e 1.1ml (diluição 10-4 ) em meio MacConkey -Nal 0. Incubar em estufa à temperatura de 37°C por 16-24 horas (durante uma noite). coli K12 0. typhimurium MG031 0.0 ml da linhagem E. Agitar bem e incubar por 1 hora sem agitação à temperatura de 37°C.0ml de TSB ou LB as seguintes culturas: 1.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Tc 0.1ml (sem diluição) em meio MacConkey-Nal 0. Fazer os pré-inóculos das linhagens doadoras e receptoras em 4. 3.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Nal 0.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Nal 3.1ml (diluição 10-2) em meio MacConkey -Nal-Tc 4.1ml (sem diluição) em meio MacConkey -Nal-Tc 0.1 Célula doadora: S.1ml (diluição 10-1) em meio MacConkey -Nal-Tc 0.0ml de meio TSB.Antibióticos a) Ácido Nalidíxico (Nal) usar a concentração de 10µg/ml b) Tetraciclina (Tc) usar a concentração de 50 µg/ml PROCEDIMENTO 1° Dia 1.

RESULTADOS 3°Dia Analisar os resultados e determinar a freqüência de conjugação. A freqüência é determinada dividindo o número de células transconjugantes pelo número total de células receptoras. 39 .

PRÁTICA 10 . 4. a susceptibilidade do hospedeiro é tão ou mais importante que as características de virulência da bactéria: Indivíduos cujo sistema imunológico esteja seriamente comprometido por quimioterapia anti-câncer. Estes postulados apresentam. A mesma bactéria pode ou não satisfazer os postulados de Koch dependendo da sub-população usada como ponto de referência. ABORDAGEM CLÁSSICA Robert Koch (1877) formulou um conjunto de quatro postulados os quais afirmava deveriam ser adotados para que se aceitasse uma relação casual entre um microrganismo em particular e uma doença. Na realidade. tratamento com corticosteróides. 3. 2. contudo. O segundo postulado enfatiza a obtenção de culturas puras do patógeno. ao tempo de Koch. Os postulados de Koch implicam que a virulência é uma característica exclusiva das bactérias e independente do hospedeiro. infecção por HIV ou diabetes e que podem ser infectados por bactérias incapazes de causar infecção em pessoas sadias. A bactéria deve ser encontrada em todas as pessoas com a doença. dos mecanismos que regem a infectividade bacteriana. Há algumas 40 . Estes se constituíram nas primeiras abordagens que forneceram bases científicas para o estudo das doenças infecciosas. Epidemiologia e da Genética Molecular.POSTULADO DE KOCH Como provar que um microrganismo é responsável por uma doença? A resposta clássica é um conjunto de quatro postulados formulados por Robert Koch e posteriormente revisados com o desenvolvimento da Microbiologia. Os postulados de Koch foram originalmente desenvolvidos para identificar bactérias causadoras de epidemias como a cólera e a tuberculose. a bactéria ou seus produtos devem ser encontrados nas partes do corpo afetados pela doença. uma série de limitações devido ao precário conhecimento. A bactéria deve ser isolada de lesões de uma pessoa infectada e mantida em culturas puras. 1. 2. A mesma bactéria deve ser re-isolada em cultura pura dos indivíduos intencionalmente infectados. 1. A cultura pura quando inoculada em voluntário humano susceptível ou animal experimental deve produzir os sintomas da doença.

ainda. Alguns patógenos humanos não causam doenças em animais ou provocam sintomas diferentes daqueles observados em humanos.doenças cujo agente causativo não pode ser cultivado em meios de laboratório ou cujo meio adequando não é. se houver um disponível. 41 . os mesmos sintomas podem ser causados por diferentes espécies de bactérias e há doenças cujas lesões são causados por uma mistura de diferentes linhagens (infecções polimicrobianas). Os segundo e quarto postulados consideram que todos os membros de uma espécie bacteriana são igualmente virulentos e que somente uma única espécie causa uma determinada doença. Em muitos casos não é possível a utilização de voluntários humanos e a única alternativa é a utilização de um modelo animal. 4. 3. Há também. os casos nos quais uma única espécie de bactéria é a única responsável por uma doença parece mais uma exceção do que uma regra. Antibióticos que causam o desaparecimento de sintomas também causam a eliminação da bactéria do tecido infectado. diferentes linhagens de uma espécie bacteriana não somente variam consideravelmente em virulência como podem causar doenças distintas. disponível: Há consideráveis evidências para implicar as bactérias Treponema pallidum e Mycobacterium leprae como causadoras da sífilis e hanseníase. respectivamente. uma resposta imunológica dos indivíduos infectados contra os antígenos de superfície das bactérias observadas nas lesões provocadas pela doença. A combinação das tecnologia da reação em cadeia da polimerase (PCR) com as de seqüenciamento de ácidos nucléicos possibilita a detecção e identificação de bactérias não-cultiváveis e revela o agente causativo de muitas doenças. o cultivo de uma bactéria em meio de laboratório pode causar a "perda" do fator de virulência: não expressão dos genes nas condições ambientais do meio. O terceiro postulado requer que a bactéria seja reinoculada em um voluntário humano ou em um animal experimental e que a reinoculação cause os sintomas da doença.

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