Universidade de São Paulo

Instituto de Ciências Biomédicas Departamento de Microbiologia
BMM121 – Microbiologia Básica

Apostila de Aulas Práticas Profa. Elisabete José Vicente bevicent@usp.br 3091.7350 2004

MICROBIOLOGIA NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA É indispensável o uso de avental no laboratório. O avental deve ser comprido, de mangas compridas e estar abotoado; Não comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratório; O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material necessário ao trabalho prático, como: roteiro de aula, papel e lápis ou caneta para anotações; Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, aspiração de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o técnico responsável pela aula prática; Descarte de material: a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios, existentes nos laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias; b) Placas de petri deverão ser deixadas tampadas sobre a bancada; c) Lâminas fornecidas para visualização deverão ser deixadas sobre as bancadas; d) Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes. Prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes Terminados os trabalhos práticos: a) b) c) d) e) f) Esterilizar alças e fios de platina; Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas; Desligar lâmpadas e microscópios; Limpar microscópios e cobri-los com a capa; Tirar o avental e guardar; Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou anti-séptico.

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Módulo I Introdução à microbiologia

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Módulo I ......................................................................................................................... 4 Introdução à microbiologia ............................................................................................. 4 Prática 1 - NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA ................................................................. 7 Técnica de semeadura ............................................................................................... 7 Objetivo .................................................................................................................... 10 Material ..................................................................................................................... 10 Procedimento e Resultados...................................................................................... 10 Questionário ............................................................................................................. 11 PRÁTICA 2 - COLORAÇÃO DE GRAM........................................................................... 12 Fixação e coloração de microrganismos................................................................... 12 Preparação de esfregaços e coloração pelo método de gram.................................. 13 A técnica ................................................................................................................... 15 Objetivo .................................................................................................................... 16 Material ..................................................................................................................... 16 Procedimento:........................................................................................................... 16 Resultados:............................................................................................................... 18 Questionário ............................................................................................................. 18 PRÁTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA..... 19 Objetivo .................................................................................................................... 19 Materiais ................................................................................................................... 19 Procedimento e resultados ....................................................................................... 19 A. Visualização de bactérias:.................................................................................... 19 B. Visualização de fungos......................................................................................... 20 PRÁTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO .................................................................... 21 Crescimento Bacteriano ........................................................................................... 21 Curvas de crescimento ............................................................................................. 22 Objetivo .................................................................................................................... 25 Material ..................................................................................................................... 25 Procedimento............................................................................................................ 25 Resultados................................................................................................................ 25 Questionário ............................................................................................................. 25 PRÁTICA 5 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO................................................................................................................... 26 Estimativa do número de células viáveis .................................................................. 26 Problema: ................................................................................................................. 27 5

....................................... 32 PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA ............................................................................................................................................................................................................................................................................. 35 Objetivo ................................................................................................................................................................................................................................................ 31 Material ............................................................................................................................................................. 39 PRÁTICA 10 .................................................................................................. 33 Questionário ..................................................................................... 40 Abordagem clássica .................. 35 Resultados.................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................. 35 Material ......CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS........................................................................................................ 34 PRÁTICA 8 ...................... 28 PRÁTICA 6 .......... 32 Objetivo ..........................................................PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS..................................................................................................... 32 Questionário .................... 35 Introdução........................................................................................................................................................... 36 Introdução... 29 Anti-sépticos e desinfetantes ........................................................................................................................... 37 Material ................................................................................................... 32 Resultados............................. 35 Questionário .......................................................................................................................................................................... 32 Teoria ............... 33 Procedimento..............................POSTULADO DE KOCH............................................................. 33 Materiais .............AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ......................... 37 Procedimento............... 31 Procedimento............................................................................................. 29 Objetivos........................Verificação de entendimento: ........................................... 40 6 ................... ........................................................................................................................................................... 35 Procedimento......................................................... 38 Resultados........................................................................... 35 PRÁTICA 9 ......................................................... 36 Objetivo ........................................

A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45o em relação à mesa de trabalho (Figura 1). seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura. Toda vez que fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio.PRÁTICA 1 . TÉCNICA DE SEMEADURA Toda a vez que se fizer uma semeadura é importante seguir as regras abaixo mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura por microrganismos presentes no ambiente. Figura 1. Esta deverá ser esfriada na parte interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de petri. Para retirar o material. e evitar acidentes laboratoriais.NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA Alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminação do manipulador como também dos meios de cultura empregados e das culturas microbianas. esfriar previamente a alça. deve-se flambar a 7 . 1.Posição correta para a flambagem da alça 2. Flambagem da alça ou fio de platina: Tanto a alça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura. Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes.

Uma vez utilizada.boca dos mesmos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de algodão). Não pousar os tampões sobre a bancada!!! Flambar a alça após o uso. semear na placa de Petri (fig. torcer o papel na região central da pipeta. As pipetas utilizadas em microbiologia são previamente esterilizadas. após flambar a alça até o rubro. 5. Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo. Na semeadura usando placas de Petri. a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba contendo solução desinfetante. Para uso. 8 . Após a retirada do material com a alça. flambar novamente a boca do tubo e colocar a tampa. As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para evitar contaminação com germes do ar. retirar primeiramente o papel da parte superior e depois a parte inferior (correspondente à ponta da pipeta). Esta deverá ser mantida segura pelo dedo mínimo. são oferecidas embrulhadas em papel (às vezes. dentro de um cilindro metálico). Figura 2 – Removendo o tampão de algodão 3. Esta seqüência evite que a pipeta seja contaminada pelas mãos do operador. 4. da mão que está segurando a alça ( Figura 2). e introduzi-la na cultura de bactéria.3).

antes de colocar a alça em contato com a cultura. flambar novamente a alça. Figura 4 – Semedura em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias = eficiência no isolamento de colônias Não esqueça!!!!!! Sempre resfrie a alça (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo. 9 .Figura 3 – Semeadura em placa: primeiro conjunto de estrias 6. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes (Figura 4) Essa técnica é conhecida também por esgotamento. ou num pedaço do ágar sem cultura). As placas serão incubadas a 37˚C por 24h. lembre-se: ela está muito QUENTE!!! Antes e depois da semeadura em placa mantenha a mesma. sempre invertida. girar a placa cerca de 30˚ e puxar nova estria. 7. Após a primeira estria. e depois guardadas a 4˚C até a próxima aula.

tubo de ensaio com meio completo líquido placa de Petri com meio completo sólido.OBJETIVO Fazer semeaduras em meios líquido e sólido de cultura de Eschirichia coli. não esquecendo de ilustrar os resultados obtidos A) SEMEADURA EM MEIO LÍQUIDO B) SEMEADURA EM PLACAS CONTENDO MEIO SÓLIDO 10 . tubo de ensaio com cultura de Eschirichia coli. PROCEDIMENTO E RESULTADOS Descreva o que foi realizado em cada uma das etapas abaixo. e obter colônias isoladas MATERIAL alça de platina.

na semeadura em placa. Qual a finalidade de se fazer várias estrias. Por que deve-se flambar os tubos antes e depois de cada transferência? 2. Por que deve-se manter sempre que possível a placa de Petri com meio sólido invertida? 3.C) OBTENÇÃO DE CULTURAS PURAS QUESTIONÁRIO 1. contendo meio sólido? 11 .

azul de metileno e safranina . os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. A célula bacteriana é negativamente carregada. eventualmente. veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia. enquanto que os ácidos tem a cor do seu íon negativo. antes de ser corado.nessa coloração o corante reage diferentemente com 12 . O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que. por quatro razões principais: Permitem uma visualização melhor das células. Então. Os corantes básicos mais comuns são: cristal violeta. Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares. Os corantes são sais compostos de um íon positivo e um íon negativo. portanto atrai corantes básicos. A introdução de colorações. permite a visualização de determinadas estruturas. além de facilitar sua observação.PRÁTICA 2 . no estudo dos microrganismos. identificar alguns grupos. Porém. Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e Podem. 2) Coloração diferencial . o que dá a cor. já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos.cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis. é chamado de radical cromóforo.COLORAÇÃO DE GRAM FIXAÇÃO E COLORAÇÃO DE MICRORGANISMOS A morfologia individual e as reações tintoriais constituem. através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama. Quanto aos tipos de coloração temos: 1) Coloração simples . os corantes conhecidos como básicos tem a cor do seu íon positivo. o microrganismo deve ser fixado à lâmina. Existem inúmeros métodos para coloração. Um desse íons. em geral.

Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração. 5). Essas substâncias são chamadas mordentes. Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo). em 1884. A coloração de Gram e a álcool . é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias. e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano. A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo). Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico.ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais. o que confere a característica de positividade ao Gram. fixado pelo calor. 13 . Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram(-) (Fig. Essa maneira de reagir diferentemente.diferentes tipos de bactérias.são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos. e é o caso do iodo na coloração de Gram. frente ao Gram. iodo. A coloração de Gram não está relacionada com os constituintes químicos da parede celular. PREPARAÇÃO DE ESFREGAÇOS E COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram. etanolacetona e fucsina básica. 3) Coloração especial . flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas. com os reagentes cristal violeta. mas sim com sua estrutura física.

Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptideoglicano. 14 . que é maior que a molécula de CV que penetrou. e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CVIodo. a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas. Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta. que não consegue reter o complexo. quando corretamente realizada e interpretada. Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana. com inclusões de lipopoliproteínas e lipossacarídeos Parede celular constituída de uma camada fina de peptídeoglicano Membrana plasmática Gram negativa Figura 5 – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente.Parede celular constituída de uma camada grossa de peptídeoglicano Gram positiva Membrana plasmática Complexo de membrana externa. mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante.

com um corante primário. O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%. o lugol. A retenção ou não do corante primário é. Ao microscópio. o corante primário é retido e as células permanecem coradas. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador. dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. com os mesmos resultados. podendo produzir resultados falsos. pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. devem ser capazes de distinguir formas e arranjos. Por outro lado. 15 . células velhas. O objetivo desta prática é demonstrar a importância desta coloração e fazer com que os alunos sejam capazes de distinguir entre Gram (+) e Gram (-). A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina. as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. portanto. o uso de material fresco é importante. A etapa da descoloração é crítica. o etanol-acetona (1:1 v:v). Células de bactérias Gram-positivas. em seus citoplasmas. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido. decorando as células. tornando-as impermeáveis ao complexo. Por outro lado. a amostra é tratada com um corante secundário. tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. Em seguida. densidade. que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. porosidade e integridade. o cristal violeta. Portanto. a fucsina básica. mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos. Paralelamente. o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Grampositivas e provoca a contração dos poros do peptidioglicano.A TÉCNICA O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido. seguido de tratamento com um fixador. O corante cristal violeta pode ser substituído. insolúvel. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo.

pelo método de Gram. 2) Flambar novamente a alça 16 . tubo de ensaio com cultura de microrganismo em meio líquído. passando a lâmina algumas vêzes pela chama. 5) Espalhar o material sobre a lâmina. sólido e líquido. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixá-lo. Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido 1) Colocar com a própria alça. 8) Realizar a coloração. fucsina básica. OBS. placa de Petri com cultura de microrganismo em meio sólido. cristal violeta a 1%. 6) Secar à tempetatura ambiente. procurando obter um esfregaço fino. MATERIAL alça de platina. 4) Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca. já flambada. lâmina de vidro. uma gota de água de torneira no centro da lâmina de vidro. lugol. PREPARO DO ESFREGAÇO Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido 1) Flambar a alça corretamente 2) Esfriá-la nas paredes do tubo 3) Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça. solução diferenciadora.OBJETIVO Coloração de microrganismos provenientes de meios. 7) Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen. PROCEDIMENTO: A.

A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. 5) Lavar uma ou duas vezes. 5) Homogeneizar este material com a gota de água. 7) Fixar o esfregaço. Os esfregaços não devem ser muito espessos. não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada. B. pois são mais difíceis de descorar e de permitir observações. Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração. Porém. com a solução diferenciadora: álcool ou acetona. com bactérias G (+) apresentando-se como G(-) e bactérias G(-) corando-se fracamente. 3) Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto. 10) Observar ao microscópio com objetiva de imersão. A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada. 4) Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano. Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram. devendo ser filtrada para a remoção de precipitados. Ela deve ser efetuada rapidamente. 9) Secar a lâmina.3) Esfriá-la na tampa da placa de Petri. COLORAÇÃO 1) Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. Evitar estas culturas! 17 . ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!! 2) Lavar rapidamente em água corrente. 4) Lavar rapidamente em água corrente. cuidando para obter uma suspensão pouco densa e sem grumos. 6) Lavar rapidamente em água corrente. ou no meio sólido numa região sem colônia. 6) Secar a lâmina por exposição ao ar. tomando o cuidado de não remover o esfregaço. rapidamente. 8) Lavar novamente em água corrente. 7) Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos.

RESULTADOS: ___________________ ____________________ __________________ ___________________ QUESTIONÁRIO 1. podendo inclusive levar a erros? 18 . Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas? 2. Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram.

Visualização de bactérias: b) Cocos Gram + : Staphylococcus aureus c) Bacilos Gram + : Bacillus subtilis d) Bacilos Gram .PRÁTICA 3 . MATERIAIS Lâminas de placas com microrganismos diferentes (Staphylococcus aureus.: Pseudomonas aeruginosa 19 . Repita o procedimento para os fungos apresentados.MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA OBJETIVO Visualização das colônias crescidas em placas contendo meio sólido e análise por microscopia óptica e Morfologia de bactérias e de fungos . PROCEDIMENTO E RESULTADOS Faça um esboço das características morfológicas e suas propriedades tintoriais de cada uma das bactérias apresentadas. Microscópio ótico. Streptococcus pyogenes e dois tipos de fungos). Pseudomonas aeruginosa. Bacillus subtilis. A.

e) Cocos Gram + : Streptococcus pyogenes B. Visualização de fungos Filamentosos Leveduras 20 .

o número de unidades catalíticas (células) aumenta com o tempo e. pode-se presumir que a maioria delas esteja se dividindo ao mesmo tempo e a cada nova geração (e. O aumento em tamanho de uma célula bacteriana conduz à divisão celular e conseqüente aumento do número de indivíduos na população. Uma característica importante do crescimento bacteriano é o fato de que a maioria das espécies de bactérias é capaz de crescer em taxas bastante rápidas. Nos organismos unicelulares. a cada 20 minutos uma nova geração de indivíduos é produzida. biomassa é sintetizada em uma taxa progressiva na população em crescimento.CURVA DE CRESCIMENTO CRESCIMENTO BACTERIANO O crescimento de qualquer organismo pode ser definido como o aumento do número de suas células ou o aumento de sua massa. como conseqüência. A maior vantagem de um tempo de reprodução tão rápido é que as bactérias podem evoluir muito rapidamente e esta e a razão do seu sucesso no mundo vivo. cada novo indivíduo pode catalisar a biossíntese de material celular adicional. aumento da massa total de uma população. ou seja. aumento da massa de uma célula individual. no qual o número de indivíduos dobra a cada geração. A evolução ocorre através de mutações genéticas que produzem variações na descendência de um organismo e o ambiente determina que mutações são vantajosas no sentido de aumentar suas chances de sobrevivência e de sucesso reprodutivo (adaptação). cada célula bacteriana é uma unidade catalítica. Do ponto de vista bioquímico. Devido aos tempos de geração muito curtos. Quando uma bactéria se divide. as bactérias podem testar 21 .PRÁTICA 4 . Assim. muitas espécies bacterianas apresentam um tempo de geração médio de 20 minutos. o crescimento pode ser entendido como: aumento de tamanho de uma célula individual. seja em ambientes naturais (in vivo) ou em culturas de laboratório (in vitro). Sob condições ótimas de crescimento. Este tipo de crescimento populacional é denominado de crescimento exponencial ou logarítmico. Em uma população composta por milhares de bactérias em crescimento ativo. aumento do número de células de uma população.g. O tempo de geração refere-se ao tempo requerido para uma célula bacteriana duplicar seu DNA e dividir-se. a cada 20 minutos) a população dobra de tamanho..

osmolaridade. como cultura pura. osmolaridade. Cada grupo bacteriano tem uma faixa de condições nas quais seu crescimento atinge uma taxa ótima. o crescimento dessa população passa por quatro fases características. Para se estudar o crescimento de uma bactéria é preciso cultivá-la. A escolha do método depende da situação particular que se apresente. ambos os métodos apresentam vantagens e desvantagens. Não há método perfeito. dependendo do ponto no qual o processo do crescimento seja interrompido pelo experimentador. oxigênio e luz. As distintas espécies bacterianas diferem no âmbito de fatores dentro dos quais podem crescer. o crescimento bem sucedido de uma população bacteriana reflete seu grau de adaptação a um determinado ambiente e depende primariamente de sua composição: condições nutricionais. Em condições experimentais. O crescimento de uma cultura bacteriana pode ser monitorado através do aumento da biomassa total em determinados intervalos de tempo (através de curvas de crescimento) ou da estimativa do número de células viáveis presentes na população (método de determinação do número de unidades formadoras de colônia). em meios de cultura e condições ambientais que variam em condições químicas e físicas. quando se inocula uma população bacteriana em um frasco contendo uma quantidade inalterável de meio de cultura (sistema fechado). CURVAS DE CRESCIMENTO Uma das abordagens mais comuns no estudo do crescimento bacteriano é a obtenção de curvas de crescimento. presença ou ausência de oxigênio e temperatura de incubação. temperatura. Essas quatro fases estão representadas na Figura 6. Portanto.bilhões de mutações em pequenos intervalos de tempo. Estas são representações gráficas do aumento do número de indivíduos em um determinado período de tempo. pH. Figura 6 – Curva de crescimento bacteriano padrão em sistema fechado 22 . pH. tais como fontes de nutrientes.

ausente de inóculo. acúmulo de metabólitos tóxicos e limitação de espaço. Para tal utiliza-se um espectrofotômetro onde o branco é o meio de cultura utilizado. 23 . O número de indivíduos não aumenta nesta fase. As células continuam metabolizando e se dividindo. Após um determinado período de crescimento exponencial. Esta taxa de crescimento não pode ser mantida indefinidamente em um sistema fechado. as condições ambientais tornam-se desfavoráveis pela escassez de nutrientes essenciais.Fase lag: fase de adaptação metabólica ao novo ambiente. A curva de crescimento atinge um platô. Para a construção de uma curva de crescimento bacteriano. Fase de declínio: fase de declínio exponencial do número de células viáveis: a taxa de morte celular torna-se maior que a taxa de divisão. A absorbância aumenta proporcionalmente ao aumento do número de células (biomassa) na população. podendo até mesmo decrescer. mas parte das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito próxima da taxa de morte celular. A duração dessa fase depende das condições ambientais nas quais as células se encontravam anteriormente. Cada medida obtida corresponde à densidade óptica (DO) da cultura em um dado momento do crescimento. O número de células viáveis entra em declínio progressivo até a completa extinção da população. Alíquotas da cultura em crescimento são retiradas em determinados intervalos de tempo e mede-se a absorbância da cultura contra um comprimento de onda de 600 nm. Desta forma pode-se construir um gráfico representativo do progresso do crescimento. relacionando-se a DO pelo tempo. o que mantém constante o número de células viáveis na população. Fase exponencial ou logarítmica: fase na qual o número de células da população dobra a cada geração. A duração da fase estacionária depende do balanço entre a taxa de divisão celular e o número de células que vão se tornando inviáveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido às condições ambientais tornarem-se progressivamente desfavoráveis. o metabolismo celular está direcionado para sintetizar as enzimas requeridas para o crescimento nas novas condições ambientais encontradas pelas células. mede-se o aumento da biomassa total de uma cultura bacteriana em crescimento em meio líquido através de medidas da densidade óptica da cultura. A fase lag será tão mais longa quanto maiores as diferenças de composição do ambiente anterior ou se a população for constituído de bactérias esporuladas. A taxa de crescimento da população diminui e segue-se a fase estacionária. Fase estacionária: fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente devido às condições limitantes do meio.

fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura interferem na obtenção de resultados . Se a leitura de uma amostra for maior que 2.0. acima disto as leituras perdem a confiabilidade. medidas prontamente obtidas: o resultado do experimento é conhecido ao seu final. reduzida quantidade de material utilizado.0 deve-se fazer uma diluição 10-1 dessa amostra e registrar sua DO. só se obtêm leituras acuradas da DO até o valor de 2. possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em gráfico). a introdução de erros experimentais pelo operador é menor. células inviáveis. 24 . o experimento não é cansativo. células bacterianas agrupadas após a divisão celular não prejudicam os resultados.Só são confiáveis medidas de DO até 2. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais. Quadro 1. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas. Vantagens e desvantagens do método de medidas da densidade óptica Vantagens simplicidade da metodologia. Para a plotagem dos dados no gráfico deve-se multiplicar a DO obtida por 10.0. reduzindo a introdução de erros experimentais por parte do operador. Desvantagens e limitações não é possível a estimativa do número de células/ml da população. Acima disto as leituras perdem a confiabilidade.

e suas unidades!!!) B) Identificar cada uma das fases de crescimento no gráfico. os demais pontos serão medidos pelos monitores e repassados para os grupos.OBJETIVO Obter uma curva de crescimento bacteriano de uma cultura pura de através de medidas de densidade óptica. Espectofotômetro.(Não se esqueça de identificar os eixos. Pipetas. Quais os problemas observados na construção dos gráficos (em que etapa do crescimento)? Você diria que todos os pontos são confiáveis? Justifique sua resposta. Tubos de ensaio. Solução salina. QUESTIONÁRIO 1. coli MATERIAL Cultura bacteriana pura. PROCEDIMENTO Durante a aulas serão obtidos apenas alguns pontos experimentais. RESULTADOS A) Construir um gráfico a partir dos pontos obtidos. E. 25 .

As colônias crescendo no meio de cultura podem ser visualizadas e contadas pelo experimentador.DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO ESTIMATIVA DO NÚMERO DE CÉLULAS VIÁVEIS A estimativa do número de células viáveis comumente é feita através de diluições seriadas de uma cultura bacteriana.PRÁTICA 5 . ou seja. no espalhamento. em solução salina. o resultado da contagem das colônias multiplicado pela quantidade de diluições decimais é a estimativa do número de bactérias presentes em um ml da cultura original. seguido da semeadura de uma alíquota de cada diluição em placas de Petri contendo meio bacteriológico sólido. células bacterianas individuais ocuparão posições separadas na superfície do meio de maneira que cada uma dê origem a uma colônia bacteriana isolada. Esta técnica baseia-se na hipótese de que. Vantagens e desvantagens do método da contagem de células viáveis Vantagens permite uma estimativa do número de células viáveis/ml da população Desvantagens e limitações detecta somente as células viáveis e que se repliquem. Esse procedimento é repetido em diferentes intervalos de tempo e com os resultados pode-se construir um gráfico representando o progresso do crescimento Quadro 2. prejudicando o cálculo se as células da bactéria estudada mantém-se agrupadas após a divisão celular (cada colônia em meio sólido seria formada por mais de uma célula) se as diluições não forem homogeneizadas adequadamente se um número muito pequeno ou muito grande de colônias for usado na contagem se o operador não fizer o espalhamento rapidamente e de forma possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em um gráfico) pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais 26 . A célula individual que originou uma colônia é denominada de "Unidade Formadora de Colônia" ou UFC. aquelas capazes de formarem colônias. muitos indivíduos viáveis podem não se replicar. Como cada colônia supostamente originou-se da multiplicação um único indivíduo.

Você fez um cultivo em meio liquido e tem suspeita que a cultura esta contaminada. PROBLEMA: 1. Qual é a concentração de E.1ml (diluição 10-3) em meio MacConkey ______ lac+ e 0.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey ______ lac+ e 0.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey ______ lac+ e contaminação e _________lac_________lac_________lac_________lac- 3. VOCE PRECISA RECUPERAR SUA BACTÉRIA SUPER MELHORADA GENETICAMENTE.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. Você tem um estoque de uma super bactéria Escherichia coli (lac+).células inviáveis. QUE FAZER? 2. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura não interferem na obtenção de resultados adequada. o que prejudica a estimativa a grande quantidade de material utilizado a acuracidade dos resultados está diretamente relacionada à quantidade de material (principalmente placas de Petri) a limitação de material impõe um aumento do erro experimental o resultado do experimento é só conhecido após o crescimento das colônias isoladas nas placas de Petri A) BACTERIANA A determinanção da concentração de bactérias é feita geralmente pela técnica de determinação do Número de UFC (unidades formadoras de colônias). Mas digamos que você precisa ou deseja conhecer o nível de que a bactéria contaminante seja lac-. a cada diluição um erro experimental é introduzido pela instrumentação e pelo experimentador este método detecta apenas um número muito reduzido de células. coli número de (UFC/ml da cultura original)? (X)_________ 27 . Neste caso você poderá: 0.

Qual é a concentração da bactéria lac.contaminante (UFC/ml da cultura original)? ( Y) _________ Qual é porcentagem da contaminação? _( Y) / (X)_____________________ B) DE LEVEDURAS Pela técnica de contagem em câmara de ¨Neubauer¨ VERIFICAÇÃO DE ENTENDIMENTO: Várias técnicas podem ser empregadas para atingir o objetivo desta Prática. Você saberia discutir por que as aqui empregadas foram escolhidas em cada um dos casos? 28 .4.

As substâncias anti-sépticas são aplicadas ao tecidos para suprimir ou impedir a infecção bacteriana. CONCEITOS GERAIS Um desinfetante é uma substância usada para destruir bactérias ou outros microrganismos infectantes. interferindo assim com o crescimento normal do tecido de granulação na cicatrização de feridas. 29 . consequentemente. além do fato de os vinhos e vinagres continuarem a serem utilizados durante a Idade Média ao recobrimento de feridas e.AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES HISTÓRIA O uso de anti-sépticos e desinfetantes evolui desde o Antigo Egito. seu número e sua suscetibilidade. O aumento da concentração de um agente anti-séptico pode irritar e talvez. tais como óleos voláteis. mel. sendo utilizado em 1847-49 em um hospital vienense quanto à demonstração prática da ação benéfica da anti-sepsia. Os desinfetantes possuem atividade bactericida ou germicida e costumam ser aplicados em superfícies inanimadas. O agente microbiano e sua respectiva concentração. A descoberta do cloro na Idade Média foi amplamente utilizada como substância desodorante e anti-séptica. vinagres. A presença ou não de resistência bacteriana ao agente antimicrobiano. instrumental cirúrgico e anti-sepsia das feridas. evitando a infecção. até matar o tecido normal do hospedeiro. número de microrganismos. Anos mais tarde Pasteur explicou sobre a fermentação bacteriana e a existência de agentes infectantes como responsáveis por processos patológicos.PRÁTICA 6 . Tais como: O microorganismo. bálsamo. USOS TERAPÊUTICOS DE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES Vários fatores podem influenciar na eficácia e/ou eficiência dos procedimentos ou agentes microbianos. mas inibe sua velocidade de crescimento. A diferença entre um anti-séptico e um desinfetante pode ser uma questão de tempo de reação. A presença ou não de uma limpeza mecânica prévia. A concentração de anti-séptico em geral é baixa para evitar a lesão e irritação tecidual indesejáveis. vinhos. resinas oleosas. Bem como as células bacterianas. inicialmente desenvolvidos com o intuito da preservação do corpo à ressurreição. mura. concentração da droga e temperatura. Os egípcios e outros povos utilizaram várias misturas. em relação aos processos de embalsamento. Os anti-sépticos são valiosos no tratamento de infecções locais causadas por microrganismos refratários a quimioterapia sistêmica. em 1865. a divulgação dos métodos de esterilização de bandagens. O tempo de contato entre o microorganismo e o antimicrobiano. compressas cirúrgicas. Coube a Lister. A prévia remoção ou não de detritos e impurezas da superfície ou tecidos através do uso de sabões ou detergentes. Uma substância anti–séptica não mata o microrganismo.

são inodoros. Apesar de possuírem efeitos limitados sobre os vírus. O mecanismo de ação está relacionado à concentração do íon hidroxila. 2º. ÁLCOOIS Os álcoois alifáticos comuns são bons solventes. Catiônicos : Os compostos de amônio quaternário são os principais. em ordem decrescente: 1º. de apresentarem baixo custo e praticamente serem atóxicos. Vantagens apresentadas referem-se ao fato de serem ótimos solventes em relação a outros agentes germicidas. Com base na posição hidrofóbica da molécula. não possuírem ação residual e não devem ser utilizados para limpezas de ferimentos abertos. fungicida ou esporocida. Um pH maior do que 9 inibirá a maioria das bactérias. Iodo.ÁLCALIS Os álcalis foram utilizados como desinfetantes desde a antigüidade. São antibacterianos contra microrganismos Gram negativos e ácido-resistentes. mucosas e trato respiratório. eles são eficientes contra bactérias Gram positivas e Gram negativas. na presença de matéria orgânica o mais ativo é o Iodo. a concentração eficiente e a eficácia antibacteriana. baixa toxicidade. METAIS PESADOS 30 . 3º. Os surfactantes são adsorvidos em um grau significativo pelo algodão. HALOGÊNIOS Possuem efeitos antibacterianos potentes devido à alta afinidade pelo protoplasma. fungos patogênicos. mas em geral. não agem na presença de matéria orgânica e podem causar irritação quando em contato prolongado com a pele. São potentes bactericidas contra micobactérias. pela borracha e materiais porosos. anti-sépticos e desinfetantes. Já. Gram negativas. Cloro. baixa penetrabilidade. Desvantagens: São neutralizados por surfactantes aniônicos (sabões). SURFACTANTES É um composto químico que diminui a tensão superficial de uma solução aquosa. Bromo. muitos vírus e não em esporos. desidratantes. há três tipos: Aniônicos : Os sabões são os mais importantes. podem ser usados em soluções com água e álcool. Gram positivas. os detergentes catiônicos não possuem ação virucida. Não-iônicos. diminuindo assim. São utilizados isoladamente ou combinados com outros agentes. de terem ação rápida. As desvantagens são: baixa atividade fungicida e virucida. As atividades em soluções livres de matéria orgânica são. A presença de água é fundamental para a atividade dos álcoois (50-70%) e são mais eficazes na ausência de sujeiras e matéria orgânica. Vantagens: Não são em geral irritantes para a pele e tecidos.

anti-sépticos comerciais (anti-sépticos em geral disponíveis 1 para cada grupo. Alça de Platina . Os preparados de Prata coloidal não são corrosivos nem irritantes e são usados sobre tecidos sensíveis. 31 . OBJETIVOS Verificar a ação de anti-sépticos no crescimento bacteriano. Microscópio óptico.Derivados do mercúrio Parecem ser primariamente bacteriostáticos e apenas levemente bactericidas. A prata metálica precipita as proteínas e produz efeito irritante. bateria de Gram. a sua efervescência vai remover o pus e restos celulares e confere atividade germicida limitada. A solução de Peróxido de Hidrogênio libera Oxigênio livre rapidamente ao entrar em contato com mucosas e superfícies sem pêlos que fornecem a enzima catalase. Inibem por pouco tempo o crescimento de microrganismos anaeróbicos. 3 cotonetes embrulhados em papel alumínio autoclavados. Compostos de Prata Produzem efeitos cáusticos. adstringentes. bico de Bunsen. O uso para anti-sepsia de superfícies e objetos inanimados parece imprudente já que há agentes com um modo de ação mais eficiente. As soluções possuem uma grande ação antibacteriana. mertiolate. sabão. 4 zaragatoas (“Swab”) estéreis. antibacterianos pela ação do íon de prata livre e produz desnaturação de proteínas. podendo haver repetições). AGENTES OXIDANTES São compostos germicidas de ação breve sobre algumas bactérias aeróbicas Gram+ e Gram-. lâminas. mas não destroem esporos bacterianos. Liberam Oxigênio que se combina com a matéria orgânica se tornando inativos. A sua ação antibacteriana está relacionada à inibição reversível da atividade enzimática essencial da bactéria e à capacidade de se combinar com íons de compostos metálicos orgânicos e inorgânicos. O Permanganato de Potássio libera Oxigênio em contato com a matéria orgânica. ou + 3 zaragatoas estéreis. Quando é distribuído sobre ferida com exsudato. É valioso para limpar e desodorizar o tecido infectado. Possuem pouca atividade esporicida e são inativados por restos orgânicos. álcool iodado. MATERIAL 4 Placas com Ágar-sangue : Meio base para ágar sangue ou TSB enriquecido com 5% sangue desfibrinado de carneiro.

Descreva duas situações: uma em que você usaria um anti-séptico e uma em que usaria um desinfetante. 4. PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA TEORIA Antibiogramas são bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de bactérias aos antimicrobianos. (Não se esqueça de ilustrar o que você observou!) QUESTIONÁRIO 1. em estufa a 37°C. Umedecer um cotonete estéril em solução fisiológica e esfregar vigorosamente sobre as costas de uma das mãos. Espalhar sobre a metade A da placa contendo meio Ágar sangue. 2. o nome comercial. 3. e o uso .Nesta lista deve conter o principal composto ativo. 2. Observar os resultados e anotar. RESULTADOS Na quinta-feira: 1.PROCEDIMENTO 1. Espalhar o conteúdo do terceiro cotonete sobre a metade D da placa contendo ágar-sangue. Esperar 4 minutos para que haja ação do anti-séptico e passar na área desinfectada um terceiro cotonete umedecido com solução fisiológica. Marcar na placa o anti-séptico utilizado e o número do grupo que realizou o experimento. 2. 7. Umedecer um segundo cotonete com tintura de iodo ou mertiolato e esfregar nas costas da outra mão. Estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a 32 . Incubar a placa por 24h. Faça uma lista com pelo menos seis anti-sépticos e seis desinfetantes. Tomar cuidado para não atingir a região não desinfectada. 5. Procurar cobrir aproximadamente 4 cm de diâmetro. Analisar a Morfologia MACROSCÓPICA das colônias e MICROSPICA das bactérias após coloração de Gram. numa área de mesmo diâmetro da primeira. 6.

atividade de novos agentes. formando um halo de inibição que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. intermediário ou resistente. coli a alguns antibióticos. A droga se difunde no ágar e produz inibição do agente sensível. MATERIAIS “Swab” estéril. que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas. 33 .5 na escala padrão de turbidez (Escala de MacFarland). pinças. OBJETIVO Analisar pelo método de difusão a ressitência de E. PROCEDIMENTO 1. retirar o excesso de líquido comprimindo a ponta do “swab” nas paredes do tubo. A densidade do inóculo deve corresponder a turbidez 0. com meio Mueller-Hinton sólido. no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar uniformemente semeado com o microrganismo. régua. discos de papel com antibióticos. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível. placas de Petri. Após incubação determina-se MIC e/ou MBC. 2. 1. e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias resistentes.Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um teste qualitativo.Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de diluição: consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration). cultura líquida fresca de Eschirichia coli. Introduzir nas culturas um “swab” estéril. alguns fatores são essenciais: − Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton. − Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias. Para a garantia desta técnica. devendo-se realizar a coloração de Gram.

5. 3. Incubar em estufa a 37ºC . 2. registrar os dados obtidos e relacionar com a tabela abaixo: Bactéria Oxacilina OX (1µg/mL) Carbemicilina CB (100µg/mL) Discos com antibióticos Kanamicina K (30µg/mL) Rifampicina RIF (30µg/mL) Sulfonamida SUL (300µg/mL) Estreptomicina EST (10µg/mL) Escherichia coli Leituras (mm) Resultados Padrões R< 10 S> 13 R< 13 S> 17 R< 12 S> 15 R< 16 S> 20 R< 12 S> 17 R< 11 S> 15 Relate os resultados obtidos e interprete comentando.2. O que é antibiograma e para que serve? Quais são os antibióticos beta-lactâmicos? Qual o seu modo de ação? Qual a diferença entre agente bactericida e bacteriostático? Dos antibióticos testados na experiência acima qual seria o mais indicado para o tratamento da infecção causada pela linhagem E. de modo a obter um “tapete” de bactérias em toda a superfície do meio sólido. Espalhar o conteúdo do “swab” sobre o meio de cultura sólido distribuído numa placa de Petri (meio Mueller-Hinton). 4. 4. por 16 a 24 horas. Esperar a cultura sobre o agar secar bem ( 2 minutos). Faça um esquema da parede de uma bactéria Gram-positiva e de uma bactéria Gram-negativa? 34 . 3. QUESTIONÁRIO 1. Medir os halos formados (em mm). coli testada? Por que? 5. 6. Espalhar bem. Colocar os discos de papel contendo os antibióticos sobre a cultura seca (usar pinças).

3. Cotonetes. OBJETIVO Estudar a presença de compostos antimicrobianos em vegetais. 4. Macerar o alho e a cebola. Discos de papel de filtro. Culturas: Staphylococcus sp e E. INTRODUÇÃO Muitos vegetais contêm compostos que são inibidores de crescimento de microrganismos e exercem papel importante na resistência destes vegetais a patógenos. MATERIAL Placas de ágar Sabouraud. em graal. Graal e pistilo. RESULTADOS Descreva as observações feitas ao final da incubação.PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS.PRÁTICA 8 . Pode ser algum já relatado na literatura ou algum de conhecimento popular. Embeber os discos de papel de filtro no macerado e colocá-los sobre a superfície do meio semeado. A presença de substâncias antimicrobianas pode ser verificada através de extratos ou partes homogeneizadas de vegetais colocados frente a culturas de microrganismos. Alho e cebola. Espalhar sobre a superfície do meio com o próprio cotonete embebido na cultura. QUESTIONÁRIO Pesquise e relato algum outro antimicrobiano natural . 2. coli. Incubar a 25°C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibição. separadamente. PROCEDIMENTO 1. 5. Mergulhar o cotonete na suspensão do microrganismo. 35 . Um importante exemplo deste processo é o alho.

os genes tra. os quais especificam proteínas envolvidas na mobilização do DNA. o plasmídio mobilizável deve conter um ori T. Concluindo. pode ser transferida para a célula aceptora e a outra fita permanece na célula doadora. Um exemplo de plasmídio mobilizável é o plasmído natural ColE1 ou colicinogênico que codifica as atividades dos genes mob e seu oriT. A transferência do DNA é iniciada pela ação de um gene mob que tem a atividade em romper (nicking) em uma única fita da molécula do DNA. refere-se aos genes mob. Há dois tipos de plasmídios conjugativos: os plasmídios auto-transmissíveis e os mobilizáveis. Os autotransmissíveis carregam um conjunto de genes. Os genes tra podem ser divididos em dois grandes grupos: um grupo. coli K12 e o elemento extra-cromossômico responsável foi chamado de fator F (de fertilidade) ou plasmídio F. Como resultado.CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS INTRODUÇÃO A conjugação bacteriana. O processo de conjugação foi descoberto em E. os produtos dos genes mob preparam o DNA para serem transferidos. ainda que os produtos dos genes tra promovem o contacto das células doadora-aceptora e promovem um contexto físico (formação dos poros) para esta transferência. para que o plasmídio possa ser transferido. somente uma fita. Para que uma linhagem bacteriana seja doadora. Por outro lado. Experimentos genéticos demonstraram que todas as três classes de funcões de 36 . O outro grupo. em um sítio específico. descoberta por Lederberg e Tatum (1946) é o processo “sexual"de transferência de genes de uma bactéria doadora para outra receptora. na formação dos poros na membrana. Esta célula doadora é diferenciada durante a conjugação pela presença de um apêndice na sua superfície chamado de pili F. ela deve conter um plasmídio conjugativo (elemento extra-cromossômico). Como a interação mob-oriT é específica. somente um dos conjuntos das funções encontradas nos plasmídios auto-transmissíveis para concluir a transferência. Ambas servem como molde para sintetizar a fita complementar. os plasmídios mobilizáveis codificam. especifica proteínas envolvidas não só na interação superficial (contacto) entre as células doadora e aceptora. Contudo. chamado de oriT e catalisa o desenrolamento da dupla hélice. bem como.PRÁTICA 9 . o sítio de oriT deve ser compatível com as funcões mob presentes nas células doadoras. cujos produtos promovem a transferência deste plasmídio para uma célula aceptora.

normalmente no cromossomo bacteriano. sequencialmente marcadores ou fragmentos deste cromossomo. Raramente. Tetr ). mas podem ser mobilizados por outros plasmídios conjugativos. a linhagem bacteriana é chamada de F+ e no segundo Hfr ( a integração do fator F parece ser mediada por pequenas sequências chamadas de elementos IS). Estes plasmídios possuem marcadores para a resistência às drogas antibacterianas e não integram-se. Linhagens a) Doadora: Linhagem de Salmonella typhimurium MG031 ( lac. transferem em alta frequência para esta última uma réplica ou cópia do plasmídio F. O fenótipo de resistência ao ácido Nalidíxico deve-se a uma mutação cromossomal. Nalr). Neste estado. Alguns plasmídios não promovem conjugação. O fator F também é raramente transferido. Os plasmídios conjugativos após serem transferidos e replicados podem permanecerem livres (autônomos) ou integrarem-se ao cromossomo bacteriano (chamados de estado integrado). transfere. mob e oriT devem estar presentes para que ocorra conjugação entre bactérias e bactérias e leveduras. outros plasmídios conjugativos foram sendo descobertos como é o caso dos fatores ou plasmídios R ou RTF (fator de transferência de resistência). Após a descoberta do fator F. Hospeda um plasmídio que carrega o marcador que confere resistência a tetraciclina (Tcr ). o fator F media a transferência do cromossoma da célula Hfr para a célula F-. OBJETIVO Tranferir de Salmonella typhimurium o plasmídio que carrega o gene que confere resistência a tetraciclina.. b) Receptora: Linhagem de Escherichia coli K12 (lac+ . No primeiro caso. Raramente. o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. As células F+ após contato com as células F-. tra. Estes plasmídios ColE1 codificam proteínas chamadas de colicinas que matam algumas linhagens sensíveis de E. coli. Placas com meio sólido. para a Escherichia coli K12 . 37 . a linhagem Hfr cujo fator F está integrado ao cromossomo bacteriano. MATERIAL Tubos de ensaio . o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido.conjugação. tornando-a F+. Por outro lado.

typhimurium MG031 (doadora) e 1.1ml (diluição 10-4 ) em meio MacConkey -Nal 0.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Nal 3.3 Mistura de conjugação (Transconjugantes): 0. Fazer as seguintes semeaduras em placa contendo meio sólido: 3. Agitar bem e incubar por 1 hora sem agitação à temperatura de 37°C.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Nal 0.0ml de TSB ou LB as seguintes culturas: 1. 38 .1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Tc 0.0 ml da linhagem E.2 Célula receptora: E. Adicionar em um tubo de ensaio contendo 1.0ml de meio TSB. Fazer os pré-inóculos das linhagens doadoras e receptoras em 4. 2°Dia 1. coli K12 (receptora) 2.1ml (sem diluição) em meio YT-Nal-Tc 0.1ml (sem diluição) em meio MacConkey -Nal-Tc 0.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey -Tc 0. typhimurium MG031 0.1ml (diluição 10-2) em meio MacConkey -Nal-Tc 4. Incubar à temperatura de 37°C por uma noite.Antibióticos a) Ácido Nalidíxico (Nal) usar a concentração de 10µg/ml b) Tetraciclina (Tc) usar a concentração de 50 µg/ml PROCEDIMENTO 1° Dia 1.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Tc 3.0 ml da linhagem S.1 Célula doadora: S.1ml (sem diluição) em meio MacConkey-Nal 0. 3.1ml (diluição 10-1) em meio MacConkey -Nal-Tc 0. coli K12 0. Incubar em estufa à temperatura de 37°C por 16-24 horas (durante uma noite).

RESULTADOS 3°Dia Analisar os resultados e determinar a freqüência de conjugação. A freqüência é determinada dividindo o número de células transconjugantes pelo número total de células receptoras. 39 .

O segundo postulado enfatiza a obtenção de culturas puras do patógeno. 4. a bactéria ou seus produtos devem ser encontrados nas partes do corpo afetados pela doença. Os postulados de Koch implicam que a virulência é uma característica exclusiva das bactérias e independente do hospedeiro. 3. 1. Os postulados de Koch foram originalmente desenvolvidos para identificar bactérias causadoras de epidemias como a cólera e a tuberculose. uma série de limitações devido ao precário conhecimento. A mesma bactéria deve ser re-isolada em cultura pura dos indivíduos intencionalmente infectados. A mesma bactéria pode ou não satisfazer os postulados de Koch dependendo da sub-população usada como ponto de referência. Estes postulados apresentam. 2. a susceptibilidade do hospedeiro é tão ou mais importante que as características de virulência da bactéria: Indivíduos cujo sistema imunológico esteja seriamente comprometido por quimioterapia anti-câncer. dos mecanismos que regem a infectividade bacteriana. A cultura pura quando inoculada em voluntário humano susceptível ou animal experimental deve produzir os sintomas da doença. ABORDAGEM CLÁSSICA Robert Koch (1877) formulou um conjunto de quatro postulados os quais afirmava deveriam ser adotados para que se aceitasse uma relação casual entre um microrganismo em particular e uma doença. infecção por HIV ou diabetes e que podem ser infectados por bactérias incapazes de causar infecção em pessoas sadias. Epidemiologia e da Genética Molecular. Estes se constituíram nas primeiras abordagens que forneceram bases científicas para o estudo das doenças infecciosas. A bactéria deve ser isolada de lesões de uma pessoa infectada e mantida em culturas puras. Na realidade. contudo. 1. Há algumas 40 . tratamento com corticosteróides. ao tempo de Koch. A bactéria deve ser encontrada em todas as pessoas com a doença.PRÁTICA 10 .POSTULADO DE KOCH Como provar que um microrganismo é responsável por uma doença? A resposta clássica é um conjunto de quatro postulados formulados por Robert Koch e posteriormente revisados com o desenvolvimento da Microbiologia. 2.

Alguns patógenos humanos não causam doenças em animais ou provocam sintomas diferentes daqueles observados em humanos. Antibióticos que causam o desaparecimento de sintomas também causam a eliminação da bactéria do tecido infectado. A combinação das tecnologia da reação em cadeia da polimerase (PCR) com as de seqüenciamento de ácidos nucléicos possibilita a detecção e identificação de bactérias não-cultiváveis e revela o agente causativo de muitas doenças. 3. respectivamente. 4. diferentes linhagens de uma espécie bacteriana não somente variam consideravelmente em virulência como podem causar doenças distintas. se houver um disponível.doenças cujo agente causativo não pode ser cultivado em meios de laboratório ou cujo meio adequando não é. 41 . o cultivo de uma bactéria em meio de laboratório pode causar a "perda" do fator de virulência: não expressão dos genes nas condições ambientais do meio. Em muitos casos não é possível a utilização de voluntários humanos e a única alternativa é a utilização de um modelo animal. os mesmos sintomas podem ser causados por diferentes espécies de bactérias e há doenças cujas lesões são causados por uma mistura de diferentes linhagens (infecções polimicrobianas). O terceiro postulado requer que a bactéria seja reinoculada em um voluntário humano ou em um animal experimental e que a reinoculação cause os sintomas da doença. Há também. ainda. os casos nos quais uma única espécie de bactéria é a única responsável por uma doença parece mais uma exceção do que uma regra. Os segundo e quarto postulados consideram que todos os membros de uma espécie bacteriana são igualmente virulentos e que somente uma única espécie causa uma determinada doença. disponível: Há consideráveis evidências para implicar as bactérias Treponema pallidum e Mycobacterium leprae como causadoras da sífilis e hanseníase. uma resposta imunológica dos indivíduos infectados contra os antígenos de superfície das bactérias observadas nas lesões provocadas pela doença.