Universidade de São Paulo

Instituto de Ciências Biomédicas Departamento de Microbiologia
BMM121 – Microbiologia Básica

Apostila de Aulas Práticas Profa. Elisabete José Vicente bevicent@usp.br 3091.7350 2004

MICROBIOLOGIA NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA É indispensável o uso de avental no laboratório. O avental deve ser comprido, de mangas compridas e estar abotoado; Não comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratório; O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material necessário ao trabalho prático, como: roteiro de aula, papel e lápis ou caneta para anotações; Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, aspiração de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o técnico responsável pela aula prática; Descarte de material: a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios, existentes nos laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias; b) Placas de petri deverão ser deixadas tampadas sobre a bancada; c) Lâminas fornecidas para visualização deverão ser deixadas sobre as bancadas; d) Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes. Prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes Terminados os trabalhos práticos: a) b) c) d) e) f) Esterilizar alças e fios de platina; Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas; Desligar lâmpadas e microscópios; Limpar microscópios e cobri-los com a capa; Tirar o avental e guardar; Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou anti-séptico.

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Módulo I Introdução à microbiologia

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Módulo I ......................................................................................................................... 4 Introdução à microbiologia ............................................................................................. 4 Prática 1 - NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA ................................................................. 7 Técnica de semeadura ............................................................................................... 7 Objetivo .................................................................................................................... 10 Material ..................................................................................................................... 10 Procedimento e Resultados...................................................................................... 10 Questionário ............................................................................................................. 11 PRÁTICA 2 - COLORAÇÃO DE GRAM........................................................................... 12 Fixação e coloração de microrganismos................................................................... 12 Preparação de esfregaços e coloração pelo método de gram.................................. 13 A técnica ................................................................................................................... 15 Objetivo .................................................................................................................... 16 Material ..................................................................................................................... 16 Procedimento:........................................................................................................... 16 Resultados:............................................................................................................... 18 Questionário ............................................................................................................. 18 PRÁTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA..... 19 Objetivo .................................................................................................................... 19 Materiais ................................................................................................................... 19 Procedimento e resultados ....................................................................................... 19 A. Visualização de bactérias:.................................................................................... 19 B. Visualização de fungos......................................................................................... 20 PRÁTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO .................................................................... 21 Crescimento Bacteriano ........................................................................................... 21 Curvas de crescimento ............................................................................................. 22 Objetivo .................................................................................................................... 25 Material ..................................................................................................................... 25 Procedimento............................................................................................................ 25 Resultados................................................................................................................ 25 Questionário ............................................................................................................. 25 PRÁTICA 5 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO................................................................................................................... 26 Estimativa do número de células viáveis .................................................................. 26 Problema: ................................................................................................................. 27 5

...................PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS.............................. 31 Procedimento.............................................................................................................................................................................................................................Verificação de entendimento: ............................................................................... 35 Questionário ........... 35 Procedimento..................................... 37 Material ........................................................................................................ 35 Introdução........ 34 PRÁTICA 8 .........................................................................................AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ......................................................................................................................... 40 Abordagem clássica ........................................... 39 PRÁTICA 10 ............................... 40 6 ..................................................................... 31 Material . 28 PRÁTICA 6 ............................................ 32 Resultados............................ 32 Teoria .............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................. 29 Objetivos........................................................................................... ...................POSTULADO DE KOCH.......... 32 PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA .... 38 Resultados..................................................................................................... 32 Questionário ................................................ 36 Introdução............................................................................................................................................................ 29 Anti-sépticos e desinfetantes ......................................................................................................................................................................................................... 33 Procedimento................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................. 35 Resultados... 35 PRÁTICA 9 ............CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS........................ 35 Material ............................................................ 37 Procedimento.................................................. 35 Objetivo ............................................................................................ 33 Questionário ..... 33 Materiais ........................................................................ 36 Objetivo . 32 Objetivo .......................

e evitar acidentes laboratoriais. Flambagem da alça ou fio de platina: Tanto a alça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura.NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA Alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminação do manipulador como também dos meios de cultura empregados e das culturas microbianas. Toda vez que fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio. deve-se flambar a 7 . Esta deverá ser esfriada na parte interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de petri. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes. 1. A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45o em relação à mesa de trabalho (Figura 1). seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura. Para retirar o material. Figura 1. Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. esfriar previamente a alça.Posição correta para a flambagem da alça 2. TÉCNICA DE SEMEADURA Toda a vez que se fizer uma semeadura é importante seguir as regras abaixo mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura por microrganismos presentes no ambiente.PRÁTICA 1 .

e introduzi-la na cultura de bactéria. da mão que está segurando a alça ( Figura 2). torcer o papel na região central da pipeta. após flambar a alça até o rubro. flambar novamente a boca do tubo e colocar a tampa. Esta deverá ser mantida segura pelo dedo mínimo. Figura 2 – Removendo o tampão de algodão 3. a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba contendo solução desinfetante. 5. Para uso. Uma vez utilizada.boca dos mesmos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de algodão).3). As pipetas utilizadas em microbiologia são previamente esterilizadas. 4. retirar primeiramente o papel da parte superior e depois a parte inferior (correspondente à ponta da pipeta). Esta seqüência evite que a pipeta seja contaminada pelas mãos do operador. Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo. Após a retirada do material com a alça. Na semeadura usando placas de Petri. são oferecidas embrulhadas em papel (às vezes. 8 . dentro de um cilindro metálico). As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para evitar contaminação com germes do ar. semear na placa de Petri (fig. Não pousar os tampões sobre a bancada!!! Flambar a alça após o uso.

antes de colocar a alça em contato com a cultura. Figura 4 – Semedura em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias = eficiência no isolamento de colônias Não esqueça!!!!!! Sempre resfrie a alça (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo. Após a primeira estria. ou num pedaço do ágar sem cultura). 9 . flambar novamente a alça. e depois guardadas a 4˚C até a próxima aula. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes (Figura 4) Essa técnica é conhecida também por esgotamento. lembre-se: ela está muito QUENTE!!! Antes e depois da semeadura em placa mantenha a mesma. 7. sempre invertida. girar a placa cerca de 30˚ e puxar nova estria.Figura 3 – Semeadura em placa: primeiro conjunto de estrias 6. As placas serão incubadas a 37˚C por 24h.

tubo de ensaio com meio completo líquido placa de Petri com meio completo sólido. e obter colônias isoladas MATERIAL alça de platina.OBJETIVO Fazer semeaduras em meios líquido e sólido de cultura de Eschirichia coli. tubo de ensaio com cultura de Eschirichia coli. PROCEDIMENTO E RESULTADOS Descreva o que foi realizado em cada uma das etapas abaixo. não esquecendo de ilustrar os resultados obtidos A) SEMEADURA EM MEIO LÍQUIDO B) SEMEADURA EM PLACAS CONTENDO MEIO SÓLIDO 10 .

C) OBTENÇÃO DE CULTURAS PURAS QUESTIONÁRIO 1. contendo meio sólido? 11 . Qual a finalidade de se fazer várias estrias. Por que deve-se manter sempre que possível a placa de Petri com meio sólido invertida? 3. Por que deve-se flambar os tubos antes e depois de cada transferência? 2. na semeadura em placa.

Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares.COLORAÇÃO DE GRAM FIXAÇÃO E COLORAÇÃO DE MICRORGANISMOS A morfologia individual e as reações tintoriais constituem. é chamado de radical cromóforo. 2) Coloração diferencial . os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. Quanto aos tipos de coloração temos: 1) Coloração simples . em geral. portanto atrai corantes básicos. azul de metileno e safranina . eventualmente. o microrganismo deve ser fixado à lâmina. enquanto que os ácidos tem a cor do seu íon negativo. Os corantes básicos mais comuns são: cristal violeta. além de facilitar sua observação.cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis. já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos. permite a visualização de determinadas estruturas. veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia.PRÁTICA 2 . A célula bacteriana é negativamente carregada. Então. no estudo dos microrganismos. através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama. Os corantes são sais compostos de um íon positivo e um íon negativo. os corantes conhecidos como básicos tem a cor do seu íon positivo. Existem inúmeros métodos para coloração.nessa coloração o corante reage diferentemente com 12 . por quatro razões principais: Permitem uma visualização melhor das células. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que. Um desse íons. Porém. identificar alguns grupos. Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e Podem. A introdução de colorações. o que dá a cor. antes de ser corado.

Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram(-) (Fig.diferentes tipos de bactérias. é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias. em 1884. PREPARAÇÃO DE ESFREGAÇOS E COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram. fixado pelo calor. etanolacetona e fucsina básica.ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais. 3) Coloração especial . Essas substâncias são chamadas mordentes. frente ao Gram. Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo). e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano. A coloração de Gram não está relacionada com os constituintes químicos da parede celular. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo). Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração. o que confere a característica de positividade ao Gram. A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. e é o caso do iodo na coloração de Gram. 5). flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas.são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos. 13 . com os reagentes cristal violeta. iodo. Essa maneira de reagir diferentemente. A coloração de Gram e a álcool . mas sim com sua estrutura física.

mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. 14 . e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CVIodo. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil. Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptideoglicano. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante. a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas. Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana. que não consegue reter o complexo. Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta. que é maior que a molécula de CV que penetrou.Parede celular constituída de uma camada grossa de peptídeoglicano Gram positiva Membrana plasmática Complexo de membrana externa. com inclusões de lipopoliproteínas e lipossacarídeos Parede celular constituída de uma camada fina de peptídeoglicano Membrana plasmática Gram negativa Figura 5 – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente. quando corretamente realizada e interpretada.

com um corante primário. podendo produzir resultados falsos. porosidade e integridade. pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. Ao microscópio. que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. a fucsina básica. adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo. o cristal violeta. densidade. tornando-as impermeáveis ao complexo. A retenção ou não do corante primário é. Em seguida. insolúvel. o uso de material fresco é importante. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador. O corante cristal violeta pode ser substituído. o corante primário é retido e as células permanecem coradas. decorando as células. Portanto. devem ser capazes de distinguir formas e arranjos. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido. o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Grampositivas e provoca a contração dos poros do peptidioglicano. portanto. 15 . A etapa da descoloração é crítica. Paralelamente.A TÉCNICA O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. O objetivo desta prática é demonstrar a importância desta coloração e fazer com que os alunos sejam capazes de distinguir entre Gram (+) e Gram (-). mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina. células velhas. O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%. seguido de tratamento com um fixador. o etanol-acetona (1:1 v:v). pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. Células de bactérias Gram-positivas. em seus citoplasmas. Por outro lado. Por outro lado. o lugol. dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. a amostra é tratada com um corante secundário. com os mesmos resultados. resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido.

cristal violeta a 1%. pelo método de Gram. 2) Flambar novamente a alça 16 . 8) Realizar a coloração. lugol. 4) Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca. passando a lâmina algumas vêzes pela chama. PREPARO DO ESFREGAÇO Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido 1) Flambar a alça corretamente 2) Esfriá-la nas paredes do tubo 3) Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça. tubo de ensaio com cultura de microrganismo em meio líquído. já flambada.OBJETIVO Coloração de microrganismos provenientes de meios. OBS. lâmina de vidro. Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido 1) Colocar com a própria alça. placa de Petri com cultura de microrganismo em meio sólido. solução diferenciadora. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixá-lo. sólido e líquido. fucsina básica. 5) Espalhar o material sobre a lâmina. 7) Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen. MATERIAL alça de platina. uma gota de água de torneira no centro da lâmina de vidro. procurando obter um esfregaço fino. 6) Secar à tempetatura ambiente. PROCEDIMENTO: A.

4) Lavar rapidamente em água corrente. Evitar estas culturas! 17 . tomando o cuidado de não remover o esfregaço. 7) Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos. não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada. COLORAÇÃO 1) Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração. devendo ser filtrada para a remoção de precipitados. com bactérias G (+) apresentando-se como G(-) e bactérias G(-) corando-se fracamente. 4) Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano. 3) Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto. 9) Secar a lâmina.3) Esfriá-la na tampa da placa de Petri. 7) Fixar o esfregaço. B. Os esfregaços não devem ser muito espessos. ou no meio sólido numa região sem colônia. 6) Lavar rapidamente em água corrente. Porém. 8) Lavar novamente em água corrente. A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada. Ela deve ser efetuada rapidamente. rapidamente. A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. pois são mais difíceis de descorar e de permitir observações. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!! 2) Lavar rapidamente em água corrente. 10) Observar ao microscópio com objetiva de imersão. 5) Lavar uma ou duas vezes. 6) Secar a lâmina por exposição ao ar. Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram. com a solução diferenciadora: álcool ou acetona. cuidando para obter uma suspensão pouco densa e sem grumos. 5) Homogeneizar este material com a gota de água.

Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas? 2. Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram.RESULTADOS: ___________________ ____________________ __________________ ___________________ QUESTIONÁRIO 1. podendo inclusive levar a erros? 18 .

A. Streptococcus pyogenes e dois tipos de fungos). MATERIAIS Lâminas de placas com microrganismos diferentes (Staphylococcus aureus. Repita o procedimento para os fungos apresentados. Microscópio ótico. Bacillus subtilis.MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA OBJETIVO Visualização das colônias crescidas em placas contendo meio sólido e análise por microscopia óptica e Morfologia de bactérias e de fungos . PROCEDIMENTO E RESULTADOS Faça um esboço das características morfológicas e suas propriedades tintoriais de cada uma das bactérias apresentadas. Visualização de bactérias: b) Cocos Gram + : Staphylococcus aureus c) Bacilos Gram + : Bacillus subtilis d) Bacilos Gram .: Pseudomonas aeruginosa 19 .PRÁTICA 3 . Pseudomonas aeruginosa.

Visualização de fungos Filamentosos Leveduras 20 .e) Cocos Gram + : Streptococcus pyogenes B.

Devido aos tempos de geração muito curtos. seja em ambientes naturais (in vivo) ou em culturas de laboratório (in vitro). o crescimento pode ser entendido como: aumento de tamanho de uma célula individual. cada novo indivíduo pode catalisar a biossíntese de material celular adicional. Nos organismos unicelulares. O tempo de geração refere-se ao tempo requerido para uma célula bacteriana duplicar seu DNA e dividir-se. pode-se presumir que a maioria delas esteja se dividindo ao mesmo tempo e a cada nova geração (e. A evolução ocorre através de mutações genéticas que produzem variações na descendência de um organismo e o ambiente determina que mutações são vantajosas no sentido de aumentar suas chances de sobrevivência e de sucesso reprodutivo (adaptação). o número de unidades catalíticas (células) aumenta com o tempo e. a cada 20 minutos uma nova geração de indivíduos é produzida. cada célula bacteriana é uma unidade catalítica.. como conseqüência. aumento da massa total de uma população. A maior vantagem de um tempo de reprodução tão rápido é que as bactérias podem evoluir muito rapidamente e esta e a razão do seu sucesso no mundo vivo. Em uma população composta por milhares de bactérias em crescimento ativo. aumento do número de células de uma população.PRÁTICA 4 . a cada 20 minutos) a população dobra de tamanho. biomassa é sintetizada em uma taxa progressiva na população em crescimento. Quando uma bactéria se divide. Assim.g. Uma característica importante do crescimento bacteriano é o fato de que a maioria das espécies de bactérias é capaz de crescer em taxas bastante rápidas.CURVA DE CRESCIMENTO CRESCIMENTO BACTERIANO O crescimento de qualquer organismo pode ser definido como o aumento do número de suas células ou o aumento de sua massa. as bactérias podem testar 21 . no qual o número de indivíduos dobra a cada geração. muitas espécies bacterianas apresentam um tempo de geração médio de 20 minutos. O aumento em tamanho de uma célula bacteriana conduz à divisão celular e conseqüente aumento do número de indivíduos na população. Este tipo de crescimento populacional é denominado de crescimento exponencial ou logarítmico. Sob condições ótimas de crescimento. Do ponto de vista bioquímico. aumento da massa de uma célula individual. ou seja.

osmolaridade. pH. pH. Figura 6 – Curva de crescimento bacteriano padrão em sistema fechado 22 .bilhões de mutações em pequenos intervalos de tempo. Cada grupo bacteriano tem uma faixa de condições nas quais seu crescimento atinge uma taxa ótima. Estas são representações gráficas do aumento do número de indivíduos em um determinado período de tempo. tais como fontes de nutrientes. quando se inocula uma população bacteriana em um frasco contendo uma quantidade inalterável de meio de cultura (sistema fechado). osmolaridade. O crescimento de uma cultura bacteriana pode ser monitorado através do aumento da biomassa total em determinados intervalos de tempo (através de curvas de crescimento) ou da estimativa do número de células viáveis presentes na população (método de determinação do número de unidades formadoras de colônia). Em condições experimentais. presença ou ausência de oxigênio e temperatura de incubação. Não há método perfeito. dependendo do ponto no qual o processo do crescimento seja interrompido pelo experimentador. o crescimento dessa população passa por quatro fases características. Para se estudar o crescimento de uma bactéria é preciso cultivá-la. temperatura. A escolha do método depende da situação particular que se apresente. oxigênio e luz. o crescimento bem sucedido de uma população bacteriana reflete seu grau de adaptação a um determinado ambiente e depende primariamente de sua composição: condições nutricionais. ambos os métodos apresentam vantagens e desvantagens. As distintas espécies bacterianas diferem no âmbito de fatores dentro dos quais podem crescer. CURVAS DE CRESCIMENTO Uma das abordagens mais comuns no estudo do crescimento bacteriano é a obtenção de curvas de crescimento. Essas quatro fases estão representadas na Figura 6. Portanto. em meios de cultura e condições ambientais que variam em condições químicas e físicas. como cultura pura.

O número de células viáveis entra em declínio progressivo até a completa extinção da população. mas parte das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito próxima da taxa de morte celular. Cada medida obtida corresponde à densidade óptica (DO) da cultura em um dado momento do crescimento. o metabolismo celular está direcionado para sintetizar as enzimas requeridas para o crescimento nas novas condições ambientais encontradas pelas células. Fase estacionária: fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente devido às condições limitantes do meio. acúmulo de metabólitos tóxicos e limitação de espaço.Fase lag: fase de adaptação metabólica ao novo ambiente. as condições ambientais tornam-se desfavoráveis pela escassez de nutrientes essenciais. A fase lag será tão mais longa quanto maiores as diferenças de composição do ambiente anterior ou se a população for constituído de bactérias esporuladas. Para a construção de uma curva de crescimento bacteriano. mede-se o aumento da biomassa total de uma cultura bacteriana em crescimento em meio líquido através de medidas da densidade óptica da cultura. Esta taxa de crescimento não pode ser mantida indefinidamente em um sistema fechado. 23 . Desta forma pode-se construir um gráfico representativo do progresso do crescimento. O número de indivíduos não aumenta nesta fase. A curva de crescimento atinge um platô. A absorbância aumenta proporcionalmente ao aumento do número de células (biomassa) na população. relacionando-se a DO pelo tempo. Fase de declínio: fase de declínio exponencial do número de células viáveis: a taxa de morte celular torna-se maior que a taxa de divisão. A duração da fase estacionária depende do balanço entre a taxa de divisão celular e o número de células que vão se tornando inviáveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido às condições ambientais tornarem-se progressivamente desfavoráveis. Para tal utiliza-se um espectrofotômetro onde o branco é o meio de cultura utilizado. A duração dessa fase depende das condições ambientais nas quais as células se encontravam anteriormente. As células continuam metabolizando e se dividindo. Fase exponencial ou logarítmica: fase na qual o número de células da população dobra a cada geração. A taxa de crescimento da população diminui e segue-se a fase estacionária. Alíquotas da cultura em crescimento são retiradas em determinados intervalos de tempo e mede-se a absorbância da cultura contra um comprimento de onda de 600 nm. ausente de inóculo. o que mantém constante o número de células viáveis na população. podendo até mesmo decrescer. Após um determinado período de crescimento exponencial.

Se a leitura de uma amostra for maior que 2. Para a plotagem dos dados no gráfico deve-se multiplicar a DO obtida por 10. reduzindo a introdução de erros experimentais por parte do operador. Quadro 1.0. Acima disto as leituras perdem a confiabilidade.0 deve-se fazer uma diluição 10-1 dessa amostra e registrar sua DO.Só são confiáveis medidas de DO até 2. Vantagens e desvantagens do método de medidas da densidade óptica Vantagens simplicidade da metodologia. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura interferem na obtenção de resultados . possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em gráfico). medidas prontamente obtidas: o resultado do experimento é conhecido ao seu final.0. Desvantagens e limitações não é possível a estimativa do número de células/ml da população. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais. células bacterianas agrupadas após a divisão celular não prejudicam os resultados. acima disto as leituras perdem a confiabilidade. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas. células inviáveis. a introdução de erros experimentais pelo operador é menor. reduzida quantidade de material utilizado. o experimento não é cansativo. 24 . só se obtêm leituras acuradas da DO até o valor de 2.

Pipetas. RESULTADOS A) Construir um gráfico a partir dos pontos obtidos. Tubos de ensaio. 25 . Espectofotômetro. os demais pontos serão medidos pelos monitores e repassados para os grupos. e suas unidades!!!) B) Identificar cada uma das fases de crescimento no gráfico. E. coli MATERIAL Cultura bacteriana pura. Quais os problemas observados na construção dos gráficos (em que etapa do crescimento)? Você diria que todos os pontos são confiáveis? Justifique sua resposta.(Não se esqueça de identificar os eixos.OBJETIVO Obter uma curva de crescimento bacteriano de uma cultura pura de através de medidas de densidade óptica. QUESTIONÁRIO 1. Solução salina. PROCEDIMENTO Durante a aulas serão obtidos apenas alguns pontos experimentais.

ou seja. muitos indivíduos viáveis podem não se replicar.DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO ESTIMATIVA DO NÚMERO DE CÉLULAS VIÁVEIS A estimativa do número de células viáveis comumente é feita através de diluições seriadas de uma cultura bacteriana. aquelas capazes de formarem colônias. prejudicando o cálculo se as células da bactéria estudada mantém-se agrupadas após a divisão celular (cada colônia em meio sólido seria formada por mais de uma célula) se as diluições não forem homogeneizadas adequadamente se um número muito pequeno ou muito grande de colônias for usado na contagem se o operador não fizer o espalhamento rapidamente e de forma possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em um gráfico) pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais 26 . em solução salina. no espalhamento. células bacterianas individuais ocuparão posições separadas na superfície do meio de maneira que cada uma dê origem a uma colônia bacteriana isolada. Esta técnica baseia-se na hipótese de que. As colônias crescendo no meio de cultura podem ser visualizadas e contadas pelo experimentador. o resultado da contagem das colônias multiplicado pela quantidade de diluições decimais é a estimativa do número de bactérias presentes em um ml da cultura original. seguido da semeadura de uma alíquota de cada diluição em placas de Petri contendo meio bacteriológico sólido. Vantagens e desvantagens do método da contagem de células viáveis Vantagens permite uma estimativa do número de células viáveis/ml da população Desvantagens e limitações detecta somente as células viáveis e que se repliquem. A célula individual que originou uma colônia é denominada de "Unidade Formadora de Colônia" ou UFC.PRÁTICA 5 . Como cada colônia supostamente originou-se da multiplicação um único indivíduo. Esse procedimento é repetido em diferentes intervalos de tempo e com os resultados pode-se construir um gráfico representando o progresso do crescimento Quadro 2.

células inviáveis.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. o que prejudica a estimativa a grande quantidade de material utilizado a acuracidade dos resultados está diretamente relacionada à quantidade de material (principalmente placas de Petri) a limitação de material impõe um aumento do erro experimental o resultado do experimento é só conhecido após o crescimento das colônias isoladas nas placas de Petri A) BACTERIANA A determinanção da concentração de bactérias é feita geralmente pela técnica de determinação do Número de UFC (unidades formadoras de colônias). VOCE PRECISA RECUPERAR SUA BACTÉRIA SUPER MELHORADA GENETICAMENTE.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey ______ lac+ e contaminação e _________lac_________lac_________lac_________lac- 3. Mas digamos que você precisa ou deseja conhecer o nível de que a bactéria contaminante seja lac-. Neste caso você poderá: 0. Você fez um cultivo em meio liquido e tem suspeita que a cultura esta contaminada.1ml (diluição 10-3) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. Qual é a concentração de E. PROBLEMA: 1. coli número de (UFC/ml da cultura original)? (X)_________ 27 . fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura não interferem na obtenção de resultados adequada. a cada diluição um erro experimental é introduzido pela instrumentação e pelo experimentador este método detecta apenas um número muito reduzido de células. Você tem um estoque de uma super bactéria Escherichia coli (lac+). QUE FAZER? 2.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey ______ lac+ e 0.

4. Você saberia discutir por que as aqui empregadas foram escolhidas em cada um dos casos? 28 . Qual é a concentração da bactéria lac.contaminante (UFC/ml da cultura original)? ( Y) _________ Qual é porcentagem da contaminação? _( Y) / (X)_____________________ B) DE LEVEDURAS Pela técnica de contagem em câmara de ¨Neubauer¨ VERIFICAÇÃO DE ENTENDIMENTO: Várias técnicas podem ser empregadas para atingir o objetivo desta Prática.

PRÁTICA 6 . até matar o tecido normal do hospedeiro. mura. além do fato de os vinhos e vinagres continuarem a serem utilizados durante a Idade Média ao recobrimento de feridas e. Os egípcios e outros povos utilizaram várias misturas. O agente microbiano e sua respectiva concentração. As substâncias anti-sépticas são aplicadas ao tecidos para suprimir ou impedir a infecção bacteriana. número de microrganismos. Os desinfetantes possuem atividade bactericida ou germicida e costumam ser aplicados em superfícies inanimadas. evitando a infecção. A prévia remoção ou não de detritos e impurezas da superfície ou tecidos através do uso de sabões ou detergentes. USOS TERAPÊUTICOS DE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES Vários fatores podem influenciar na eficácia e/ou eficiência dos procedimentos ou agentes microbianos. concentração da droga e temperatura. seu número e sua suscetibilidade. A diferença entre um anti-séptico e um desinfetante pode ser uma questão de tempo de reação. compressas cirúrgicas. sendo utilizado em 1847-49 em um hospital vienense quanto à demonstração prática da ação benéfica da anti-sepsia. mel. instrumental cirúrgico e anti-sepsia das feridas. A presença ou não de uma limpeza mecânica prévia.AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES HISTÓRIA O uso de anti-sépticos e desinfetantes evolui desde o Antigo Egito. 29 . Tais como: O microorganismo. Anos mais tarde Pasteur explicou sobre a fermentação bacteriana e a existência de agentes infectantes como responsáveis por processos patológicos. bálsamo. CONCEITOS GERAIS Um desinfetante é uma substância usada para destruir bactérias ou outros microrganismos infectantes. resinas oleosas. consequentemente. Bem como as células bacterianas. vinagres. A presença ou não de resistência bacteriana ao agente antimicrobiano. a divulgação dos métodos de esterilização de bandagens. vinhos. O aumento da concentração de um agente anti-séptico pode irritar e talvez. mas inibe sua velocidade de crescimento. tais como óleos voláteis. Os anti-sépticos são valiosos no tratamento de infecções locais causadas por microrganismos refratários a quimioterapia sistêmica. O tempo de contato entre o microorganismo e o antimicrobiano. inicialmente desenvolvidos com o intuito da preservação do corpo à ressurreição. interferindo assim com o crescimento normal do tecido de granulação na cicatrização de feridas. Uma substância anti–séptica não mata o microrganismo. em 1865. Coube a Lister. em relação aos processos de embalsamento. A concentração de anti-séptico em geral é baixa para evitar a lesão e irritação tecidual indesejáveis. A descoberta do cloro na Idade Média foi amplamente utilizada como substância desodorante e anti-séptica.

Gram positivas. anti-sépticos e desinfetantes. pela borracha e materiais porosos. eles são eficientes contra bactérias Gram positivas e Gram negativas. de terem ação rápida. diminuindo assim. a concentração eficiente e a eficácia antibacteriana. Os surfactantes são adsorvidos em um grau significativo pelo algodão. Desvantagens: São neutralizados por surfactantes aniônicos (sabões). METAIS PESADOS 30 . os detergentes catiônicos não possuem ação virucida. O mecanismo de ação está relacionado à concentração do íon hidroxila. na presença de matéria orgânica o mais ativo é o Iodo. fungicida ou esporocida. não possuírem ação residual e não devem ser utilizados para limpezas de ferimentos abertos. São antibacterianos contra microrganismos Gram negativos e ácido-resistentes. São utilizados isoladamente ou combinados com outros agentes. Catiônicos : Os compostos de amônio quaternário são os principais. Já. mas em geral. não agem na presença de matéria orgânica e podem causar irritação quando em contato prolongado com a pele. Bromo. Um pH maior do que 9 inibirá a maioria das bactérias. ÁLCOOIS Os álcoois alifáticos comuns são bons solventes. baixa toxicidade. Cloro. de apresentarem baixo custo e praticamente serem atóxicos. Iodo. em ordem decrescente: 1º. 2º. muitos vírus e não em esporos. podem ser usados em soluções com água e álcool. baixa penetrabilidade. SURFACTANTES É um composto químico que diminui a tensão superficial de uma solução aquosa. Com base na posição hidrofóbica da molécula. mucosas e trato respiratório. fungos patogênicos. Vantagens apresentadas referem-se ao fato de serem ótimos solventes em relação a outros agentes germicidas. 3º. HALOGÊNIOS Possuem efeitos antibacterianos potentes devido à alta afinidade pelo protoplasma. São potentes bactericidas contra micobactérias. há três tipos: Aniônicos : Os sabões são os mais importantes. desidratantes. Gram negativas. Vantagens: Não são em geral irritantes para a pele e tecidos. são inodoros.ÁLCALIS Os álcalis foram utilizados como desinfetantes desde a antigüidade. Não-iônicos. Apesar de possuírem efeitos limitados sobre os vírus. As atividades em soluções livres de matéria orgânica são. As desvantagens são: baixa atividade fungicida e virucida. A presença de água é fundamental para a atividade dos álcoois (50-70%) e são mais eficazes na ausência de sujeiras e matéria orgânica.

Compostos de Prata Produzem efeitos cáusticos. bico de Bunsen. MATERIAL 4 Placas com Ágar-sangue : Meio base para ágar sangue ou TSB enriquecido com 5% sangue desfibrinado de carneiro. mertiolate. Alça de Platina . ou + 3 zaragatoas estéreis. mas não destroem esporos bacterianos. 31 . a sua efervescência vai remover o pus e restos celulares e confere atividade germicida limitada. OBJETIVOS Verificar a ação de anti-sépticos no crescimento bacteriano. Microscópio óptico.Derivados do mercúrio Parecem ser primariamente bacteriostáticos e apenas levemente bactericidas. antibacterianos pela ação do íon de prata livre e produz desnaturação de proteínas. Possuem pouca atividade esporicida e são inativados por restos orgânicos. adstringentes. Os preparados de Prata coloidal não são corrosivos nem irritantes e são usados sobre tecidos sensíveis. sabão. AGENTES OXIDANTES São compostos germicidas de ação breve sobre algumas bactérias aeróbicas Gram+ e Gram-. O uso para anti-sepsia de superfícies e objetos inanimados parece imprudente já que há agentes com um modo de ação mais eficiente. podendo haver repetições). anti-sépticos comerciais (anti-sépticos em geral disponíveis 1 para cada grupo. As soluções possuem uma grande ação antibacteriana. lâminas. O Permanganato de Potássio libera Oxigênio em contato com a matéria orgânica. A sua ação antibacteriana está relacionada à inibição reversível da atividade enzimática essencial da bactéria e à capacidade de se combinar com íons de compostos metálicos orgânicos e inorgânicos. álcool iodado. A solução de Peróxido de Hidrogênio libera Oxigênio livre rapidamente ao entrar em contato com mucosas e superfícies sem pêlos que fornecem a enzima catalase. Liberam Oxigênio que se combina com a matéria orgânica se tornando inativos. É valioso para limpar e desodorizar o tecido infectado. Quando é distribuído sobre ferida com exsudato. 4 zaragatoas (“Swab”) estéreis. A prata metálica precipita as proteínas e produz efeito irritante. bateria de Gram. Inibem por pouco tempo o crescimento de microrganismos anaeróbicos. 3 cotonetes embrulhados em papel alumínio autoclavados.

Faça uma lista com pelo menos seis anti-sépticos e seis desinfetantes. 7. Analisar a Morfologia MACROSCÓPICA das colônias e MICROSPICA das bactérias após coloração de Gram. Descreva duas situações: uma em que você usaria um anti-séptico e uma em que usaria um desinfetante. Espalhar o conteúdo do terceiro cotonete sobre a metade D da placa contendo ágar-sangue. Estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a 32 . PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA TEORIA Antibiogramas são bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de bactérias aos antimicrobianos. em estufa a 37°C. 4. 2. Espalhar sobre a metade A da placa contendo meio Ágar sangue. numa área de mesmo diâmetro da primeira. Incubar a placa por 24h. Umedecer um segundo cotonete com tintura de iodo ou mertiolato e esfregar nas costas da outra mão. Esperar 4 minutos para que haja ação do anti-séptico e passar na área desinfectada um terceiro cotonete umedecido com solução fisiológica. 2. Procurar cobrir aproximadamente 4 cm de diâmetro. 3. o nome comercial.Nesta lista deve conter o principal composto ativo. RESULTADOS Na quinta-feira: 1. Marcar na placa o anti-séptico utilizado e o número do grupo que realizou o experimento.PROCEDIMENTO 1. e o uso . 5. Tomar cuidado para não atingir a região não desinfectada. Observar os resultados e anotar. 6. (Não se esqueça de ilustrar o que você observou!) QUESTIONÁRIO 1. 2. Umedecer um cotonete estéril em solução fisiológica e esfregar vigorosamente sobre as costas de uma das mãos.

alguns fatores são essenciais: − Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton. − Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias. ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration). Para a garantia desta técnica. A droga se difunde no ágar e produz inibição do agente sensível. no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar uniformemente semeado com o microrganismo. 33 . devendo-se realizar a coloração de Gram.atividade de novos agentes. retirar o excesso de líquido comprimindo a ponta do “swab” nas paredes do tubo. placas de Petri. e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias resistentes. coli a alguns antibióticos. que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas.5 na escala padrão de turbidez (Escala de MacFarland). intermediário ou resistente. 1. Introduzir nas culturas um “swab” estéril.Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um teste qualitativo. OBJETIVO Analisar pelo método de difusão a ressitência de E. pinças. formando um halo de inibição que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível. 2. cultura líquida fresca de Eschirichia coli. discos de papel com antibióticos.Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de diluição: consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. régua. PROCEDIMENTO 1. A densidade do inóculo deve corresponder a turbidez 0. com meio Mueller-Hinton sólido. MATERIAIS “Swab” estéril. Após incubação determina-se MIC e/ou MBC.

por 16 a 24 horas. Espalhar bem. Faça um esquema da parede de uma bactéria Gram-positiva e de uma bactéria Gram-negativa? 34 . 3. O que é antibiograma e para que serve? Quais são os antibióticos beta-lactâmicos? Qual o seu modo de ação? Qual a diferença entre agente bactericida e bacteriostático? Dos antibióticos testados na experiência acima qual seria o mais indicado para o tratamento da infecção causada pela linhagem E. Colocar os discos de papel contendo os antibióticos sobre a cultura seca (usar pinças). registrar os dados obtidos e relacionar com a tabela abaixo: Bactéria Oxacilina OX (1µg/mL) Carbemicilina CB (100µg/mL) Discos com antibióticos Kanamicina K (30µg/mL) Rifampicina RIF (30µg/mL) Sulfonamida SUL (300µg/mL) Estreptomicina EST (10µg/mL) Escherichia coli Leituras (mm) Resultados Padrões R< 10 S> 13 R< 13 S> 17 R< 12 S> 15 R< 16 S> 20 R< 12 S> 17 R< 11 S> 15 Relate os resultados obtidos e interprete comentando. Esperar a cultura sobre o agar secar bem ( 2 minutos). Incubar em estufa a 37ºC . 2. QUESTIONÁRIO 1. 4. 4. coli testada? Por que? 5. 5. Medir os halos formados (em mm).2. 6. Espalhar o conteúdo do “swab” sobre o meio de cultura sólido distribuído numa placa de Petri (meio Mueller-Hinton). 3. de modo a obter um “tapete” de bactérias em toda a superfície do meio sólido.

INTRODUÇÃO Muitos vegetais contêm compostos que são inibidores de crescimento de microrganismos e exercem papel importante na resistência destes vegetais a patógenos. 35 . QUESTIONÁRIO Pesquise e relato algum outro antimicrobiano natural . Incubar a 25°C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibição. separadamente. MATERIAL Placas de ágar Sabouraud. Culturas: Staphylococcus sp e E. A presença de substâncias antimicrobianas pode ser verificada através de extratos ou partes homogeneizadas de vegetais colocados frente a culturas de microrganismos. 4. Mergulhar o cotonete na suspensão do microrganismo. em graal. OBJETIVO Estudar a presença de compostos antimicrobianos em vegetais. Graal e pistilo. coli. PROCEDIMENTO 1. 5. Discos de papel de filtro. Alho e cebola.PRÁTICA 8 . 3. Embeber os discos de papel de filtro no macerado e colocá-los sobre a superfície do meio semeado. RESULTADOS Descreva as observações feitas ao final da incubação. Cotonetes. 2. Pode ser algum já relatado na literatura ou algum de conhecimento popular. Macerar o alho e a cebola. Um importante exemplo deste processo é o alho. Espalhar sobre a superfície do meio com o próprio cotonete embebido na cultura.PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS.

os plasmídios mobilizáveis codificam. Há dois tipos de plasmídios conjugativos: os plasmídios auto-transmissíveis e os mobilizáveis. Por outro lado. O processo de conjugação foi descoberto em E. somente um dos conjuntos das funções encontradas nos plasmídios auto-transmissíveis para concluir a transferência. coli K12 e o elemento extra-cromossômico responsável foi chamado de fator F (de fertilidade) ou plasmídio F. Como a interação mob-oriT é específica. Os genes tra podem ser divididos em dois grandes grupos: um grupo. os quais especificam proteínas envolvidas na mobilização do DNA. Os autotransmissíveis carregam um conjunto de genes. Para que uma linhagem bacteriana seja doadora. bem como. refere-se aos genes mob.CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS INTRODUÇÃO A conjugação bacteriana. cujos produtos promovem a transferência deste plasmídio para uma célula aceptora. Como resultado. para que o plasmídio possa ser transferido. O outro grupo. Um exemplo de plasmídio mobilizável é o plasmído natural ColE1 ou colicinogênico que codifica as atividades dos genes mob e seu oriT. Concluindo. Contudo. Ambas servem como molde para sintetizar a fita complementar. os genes tra. pode ser transferida para a célula aceptora e a outra fita permanece na célula doadora. especifica proteínas envolvidas não só na interação superficial (contacto) entre as células doadora e aceptora. em um sítio específico. descoberta por Lederberg e Tatum (1946) é o processo “sexual"de transferência de genes de uma bactéria doadora para outra receptora. o plasmídio mobilizável deve conter um ori T. Experimentos genéticos demonstraram que todas as três classes de funcões de 36 . ainda que os produtos dos genes tra promovem o contacto das células doadora-aceptora e promovem um contexto físico (formação dos poros) para esta transferência. chamado de oriT e catalisa o desenrolamento da dupla hélice.PRÁTICA 9 . somente uma fita. o sítio de oriT deve ser compatível com as funcões mob presentes nas células doadoras. ela deve conter um plasmídio conjugativo (elemento extra-cromossômico). os produtos dos genes mob preparam o DNA para serem transferidos. A transferência do DNA é iniciada pela ação de um gene mob que tem a atividade em romper (nicking) em uma única fita da molécula do DNA. Esta célula doadora é diferenciada durante a conjugação pela presença de um apêndice na sua superfície chamado de pili F. na formação dos poros na membrana.

coli. Raramente. Linhagens a) Doadora: Linhagem de Salmonella typhimurium MG031 ( lac. Por outro lado. Nalr). tornando-a F+. Placas com meio sólido. o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. b) Receptora: Linhagem de Escherichia coli K12 (lac+ . Estes plasmídios possuem marcadores para a resistência às drogas antibacterianas e não integram-se. 37 . tra. outros plasmídios conjugativos foram sendo descobertos como é o caso dos fatores ou plasmídios R ou RTF (fator de transferência de resistência). As células F+ após contato com as células F-. O fator F também é raramente transferido. transferem em alta frequência para esta última uma réplica ou cópia do plasmídio F. Raramente. transfere. normalmente no cromossomo bacteriano. Hospeda um plasmídio que carrega o marcador que confere resistência a tetraciclina (Tcr ). a linhagem Hfr cujo fator F está integrado ao cromossomo bacteriano. O fenótipo de resistência ao ácido Nalidíxico deve-se a uma mutação cromossomal. Alguns plasmídios não promovem conjugação. o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. Os plasmídios conjugativos após serem transferidos e replicados podem permanecerem livres (autônomos) ou integrarem-se ao cromossomo bacteriano (chamados de estado integrado). para a Escherichia coli K12 . a linhagem bacteriana é chamada de F+ e no segundo Hfr ( a integração do fator F parece ser mediada por pequenas sequências chamadas de elementos IS). o fator F media a transferência do cromossoma da célula Hfr para a célula F-. sequencialmente marcadores ou fragmentos deste cromossomo. mob e oriT devem estar presentes para que ocorra conjugação entre bactérias e bactérias e leveduras. MATERIAL Tubos de ensaio . Tetr ). No primeiro caso. Após a descoberta do fator F. OBJETIVO Tranferir de Salmonella typhimurium o plasmídio que carrega o gene que confere resistência a tetraciclina. Neste estado..conjugação. Estes plasmídios ColE1 codificam proteínas chamadas de colicinas que matam algumas linhagens sensíveis de E. mas podem ser mobilizados por outros plasmídios conjugativos.

1ml (diluição 10-1) em meio MacConkey -Nal-Tc 0. Agitar bem e incubar por 1 hora sem agitação à temperatura de 37°C.1ml (diluição 10-4 ) em meio MacConkey -Nal 0.1ml (sem diluição) em meio YT-Nal-Tc 0. coli K12 (receptora) 2.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Tc 0. Adicionar em um tubo de ensaio contendo 1. Fazer os pré-inóculos das linhagens doadoras e receptoras em 4.0ml de meio TSB.0 ml da linhagem E. coli K12 0.Antibióticos a) Ácido Nalidíxico (Nal) usar a concentração de 10µg/ml b) Tetraciclina (Tc) usar a concentração de 50 µg/ml PROCEDIMENTO 1° Dia 1.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Tc 3. 2°Dia 1.0ml de TSB ou LB as seguintes culturas: 1. Fazer as seguintes semeaduras em placa contendo meio sólido: 3.1ml (sem diluição) em meio MacConkey -Nal-Tc 0. 38 . 3.1 Célula doadora: S.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey -Tc 0.2 Célula receptora: E. typhimurium MG031 (doadora) e 1.3 Mistura de conjugação (Transconjugantes): 0.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Nal 0. Incubar à temperatura de 37°C por uma noite.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Nal 3. Incubar em estufa à temperatura de 37°C por 16-24 horas (durante uma noite).1ml (sem diluição) em meio MacConkey-Nal 0. typhimurium MG031 0.1ml (diluição 10-2) em meio MacConkey -Nal-Tc 4.0 ml da linhagem S.

A freqüência é determinada dividindo o número de células transconjugantes pelo número total de células receptoras. 39 .RESULTADOS 3°Dia Analisar os resultados e determinar a freqüência de conjugação.

contudo. a bactéria ou seus produtos devem ser encontrados nas partes do corpo afetados pela doença. ao tempo de Koch. Estes se constituíram nas primeiras abordagens que forneceram bases científicas para o estudo das doenças infecciosas.PRÁTICA 10 . Epidemiologia e da Genética Molecular. 1. A bactéria deve ser isolada de lesões de uma pessoa infectada e mantida em culturas puras. A bactéria deve ser encontrada em todas as pessoas com a doença. A cultura pura quando inoculada em voluntário humano susceptível ou animal experimental deve produzir os sintomas da doença. 2. O segundo postulado enfatiza a obtenção de culturas puras do patógeno. 3. A mesma bactéria deve ser re-isolada em cultura pura dos indivíduos intencionalmente infectados. 4.POSTULADO DE KOCH Como provar que um microrganismo é responsável por uma doença? A resposta clássica é um conjunto de quatro postulados formulados por Robert Koch e posteriormente revisados com o desenvolvimento da Microbiologia. a susceptibilidade do hospedeiro é tão ou mais importante que as características de virulência da bactéria: Indivíduos cujo sistema imunológico esteja seriamente comprometido por quimioterapia anti-câncer. Os postulados de Koch implicam que a virulência é uma característica exclusiva das bactérias e independente do hospedeiro. infecção por HIV ou diabetes e que podem ser infectados por bactérias incapazes de causar infecção em pessoas sadias. uma série de limitações devido ao precário conhecimento. Há algumas 40 . 2. dos mecanismos que regem a infectividade bacteriana. 1. tratamento com corticosteróides. Os postulados de Koch foram originalmente desenvolvidos para identificar bactérias causadoras de epidemias como a cólera e a tuberculose. ABORDAGEM CLÁSSICA Robert Koch (1877) formulou um conjunto de quatro postulados os quais afirmava deveriam ser adotados para que se aceitasse uma relação casual entre um microrganismo em particular e uma doença. A mesma bactéria pode ou não satisfazer os postulados de Koch dependendo da sub-população usada como ponto de referência. Na realidade. Estes postulados apresentam.

se houver um disponível. Antibióticos que causam o desaparecimento de sintomas também causam a eliminação da bactéria do tecido infectado. O terceiro postulado requer que a bactéria seja reinoculada em um voluntário humano ou em um animal experimental e que a reinoculação cause os sintomas da doença. Alguns patógenos humanos não causam doenças em animais ou provocam sintomas diferentes daqueles observados em humanos.doenças cujo agente causativo não pode ser cultivado em meios de laboratório ou cujo meio adequando não é. Os segundo e quarto postulados consideram que todos os membros de uma espécie bacteriana são igualmente virulentos e que somente uma única espécie causa uma determinada doença. o cultivo de uma bactéria em meio de laboratório pode causar a "perda" do fator de virulência: não expressão dos genes nas condições ambientais do meio. os casos nos quais uma única espécie de bactéria é a única responsável por uma doença parece mais uma exceção do que uma regra. A combinação das tecnologia da reação em cadeia da polimerase (PCR) com as de seqüenciamento de ácidos nucléicos possibilita a detecção e identificação de bactérias não-cultiváveis e revela o agente causativo de muitas doenças. Há também. os mesmos sintomas podem ser causados por diferentes espécies de bactérias e há doenças cujas lesões são causados por uma mistura de diferentes linhagens (infecções polimicrobianas). 41 . Em muitos casos não é possível a utilização de voluntários humanos e a única alternativa é a utilização de um modelo animal. 4. disponível: Há consideráveis evidências para implicar as bactérias Treponema pallidum e Mycobacterium leprae como causadoras da sífilis e hanseníase. uma resposta imunológica dos indivíduos infectados contra os antígenos de superfície das bactérias observadas nas lesões provocadas pela doença. 3. respectivamente. ainda. diferentes linhagens de uma espécie bacteriana não somente variam consideravelmente em virulência como podem causar doenças distintas.

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