Universidade de São Paulo

Instituto de Ciências Biomédicas Departamento de Microbiologia
BMM121 – Microbiologia Básica

Apostila de Aulas Práticas Profa. Elisabete José Vicente bevicent@usp.br 3091.7350 2004

MICROBIOLOGIA NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA É indispensável o uso de avental no laboratório. O avental deve ser comprido, de mangas compridas e estar abotoado; Não comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratório; O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material necessário ao trabalho prático, como: roteiro de aula, papel e lápis ou caneta para anotações; Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, aspiração de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o técnico responsável pela aula prática; Descarte de material: a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios, existentes nos laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias; b) Placas de petri deverão ser deixadas tampadas sobre a bancada; c) Lâminas fornecidas para visualização deverão ser deixadas sobre as bancadas; d) Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes. Prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes Terminados os trabalhos práticos: a) b) c) d) e) f) Esterilizar alças e fios de platina; Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas; Desligar lâmpadas e microscópios; Limpar microscópios e cobri-los com a capa; Tirar o avental e guardar; Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou anti-séptico.

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Módulo I Introdução à microbiologia

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Módulo I ......................................................................................................................... 4 Introdução à microbiologia ............................................................................................. 4 Prática 1 - NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA ................................................................. 7 Técnica de semeadura ............................................................................................... 7 Objetivo .................................................................................................................... 10 Material ..................................................................................................................... 10 Procedimento e Resultados...................................................................................... 10 Questionário ............................................................................................................. 11 PRÁTICA 2 - COLORAÇÃO DE GRAM........................................................................... 12 Fixação e coloração de microrganismos................................................................... 12 Preparação de esfregaços e coloração pelo método de gram.................................. 13 A técnica ................................................................................................................... 15 Objetivo .................................................................................................................... 16 Material ..................................................................................................................... 16 Procedimento:........................................................................................................... 16 Resultados:............................................................................................................... 18 Questionário ............................................................................................................. 18 PRÁTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA..... 19 Objetivo .................................................................................................................... 19 Materiais ................................................................................................................... 19 Procedimento e resultados ....................................................................................... 19 A. Visualização de bactérias:.................................................................................... 19 B. Visualização de fungos......................................................................................... 20 PRÁTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO .................................................................... 21 Crescimento Bacteriano ........................................................................................... 21 Curvas de crescimento ............................................................................................. 22 Objetivo .................................................................................................................... 25 Material ..................................................................................................................... 25 Procedimento............................................................................................................ 25 Resultados................................................................................................................ 25 Questionário ............................................................................................................. 25 PRÁTICA 5 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO................................................................................................................... 26 Estimativa do número de células viáveis .................................................................. 26 Problema: ................................................................................................................. 27 5

.... 32 Objetivo ....................................................................................................................................................................PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS..........................POSTULADO DE KOCH...................................................................................................................................................................................... 37 Procedimento................................................................................................. 32 Questionário ............................................................................................................. 40 Abordagem clássica ........ 40 6 .......................................................... 38 Resultados.............................................CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS.............................................................................................................................. 31 Material ................................................................................................ 28 PRÁTICA 6 .... 32 PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA .............................................................................................AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE .............. 33 Procedimento.................................... 35 Questionário ............................................ 35 Introdução............................................................................................................................................................................ 35 Objetivo ............................Verificação de entendimento: ......................................................................................................................................................................................................... 32 Teoria ............................ 39 PRÁTICA 10 ........................................................................................... 33 Questionário ................................................................................................................ 31 Procedimento........................... 34 PRÁTICA 8 ..................................................................................................................................................... 35 Material ................................................... 35 PRÁTICA 9 .................................................................................................................................................................................................... 29 Anti-sépticos e desinfetantes ............. 37 Material ... 29 Objetivos................................................................................................................................................................................................................................................................................................. 35 Procedimento.................................... ............................................................................................................................................................ 35 Resultados............................................................................................................ 33 Materiais ......................... 36 Objetivo ........................................... 36 Introdução.................................... 32 Resultados............................

Toda vez que fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes.Posição correta para a flambagem da alça 2. Para retirar o material. Flambagem da alça ou fio de platina: Tanto a alça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura. Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura. 1. TÉCNICA DE SEMEADURA Toda a vez que se fizer uma semeadura é importante seguir as regras abaixo mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura por microrganismos presentes no ambiente. Esta deverá ser esfriada na parte interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de petri. e evitar acidentes laboratoriais. deve-se flambar a 7 . Figura 1.PRÁTICA 1 . esfriar previamente a alça.NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA Alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminação do manipulador como também dos meios de cultura empregados e das culturas microbianas. A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45o em relação à mesa de trabalho (Figura 1).

Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo. são oferecidas embrulhadas em papel (às vezes. e introduzi-la na cultura de bactéria. 5. Figura 2 – Removendo o tampão de algodão 3. Não pousar os tampões sobre a bancada!!! Flambar a alça após o uso. semear na placa de Petri (fig. flambar novamente a boca do tubo e colocar a tampa. As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para evitar contaminação com germes do ar. Após a retirada do material com a alça. torcer o papel na região central da pipeta. 8 . a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba contendo solução desinfetante. As pipetas utilizadas em microbiologia são previamente esterilizadas.3). da mão que está segurando a alça ( Figura 2). retirar primeiramente o papel da parte superior e depois a parte inferior (correspondente à ponta da pipeta). Esta seqüência evite que a pipeta seja contaminada pelas mãos do operador. Na semeadura usando placas de Petri. Esta deverá ser mantida segura pelo dedo mínimo. Para uso. dentro de um cilindro metálico). 4. Uma vez utilizada. após flambar a alça até o rubro.boca dos mesmos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de algodão).

ou num pedaço do ágar sem cultura). flambar novamente a alça. As placas serão incubadas a 37˚C por 24h. antes de colocar a alça em contato com a cultura. 9 . lembre-se: ela está muito QUENTE!!! Antes e depois da semeadura em placa mantenha a mesma. e depois guardadas a 4˚C até a próxima aula. 7. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes (Figura 4) Essa técnica é conhecida também por esgotamento. Figura 4 – Semedura em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias = eficiência no isolamento de colônias Não esqueça!!!!!! Sempre resfrie a alça (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo. Após a primeira estria. girar a placa cerca de 30˚ e puxar nova estria.Figura 3 – Semeadura em placa: primeiro conjunto de estrias 6. sempre invertida.

PROCEDIMENTO E RESULTADOS Descreva o que foi realizado em cada uma das etapas abaixo.OBJETIVO Fazer semeaduras em meios líquido e sólido de cultura de Eschirichia coli. e obter colônias isoladas MATERIAL alça de platina. não esquecendo de ilustrar os resultados obtidos A) SEMEADURA EM MEIO LÍQUIDO B) SEMEADURA EM PLACAS CONTENDO MEIO SÓLIDO 10 . tubo de ensaio com meio completo líquido placa de Petri com meio completo sólido. tubo de ensaio com cultura de Eschirichia coli.

contendo meio sólido? 11 . Por que deve-se flambar os tubos antes e depois de cada transferência? 2.C) OBTENÇÃO DE CULTURAS PURAS QUESTIONÁRIO 1. Qual a finalidade de se fazer várias estrias. na semeadura em placa. Por que deve-se manter sempre que possível a placa de Petri com meio sólido invertida? 3.

eventualmente. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que. no estudo dos microrganismos.PRÁTICA 2 . Quanto aos tipos de coloração temos: 1) Coloração simples . o que dá a cor. já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos. Existem inúmeros métodos para coloração. enquanto que os ácidos tem a cor do seu íon negativo. Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e Podem. Então. portanto atrai corantes básicos. 2) Coloração diferencial . A célula bacteriana é negativamente carregada. Os corantes básicos mais comuns são: cristal violeta. permite a visualização de determinadas estruturas. azul de metileno e safranina . identificar alguns grupos. Porém.nessa coloração o corante reage diferentemente com 12 .cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis. A introdução de colorações. em geral. Um desse íons. os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama. veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia. é chamado de radical cromóforo. o microrganismo deve ser fixado à lâmina.COLORAÇÃO DE GRAM FIXAÇÃO E COLORAÇÃO DE MICRORGANISMOS A morfologia individual e as reações tintoriais constituem. antes de ser corado. Os corantes são sais compostos de um íon positivo e um íon negativo. além de facilitar sua observação. por quatro razões principais: Permitem uma visualização melhor das células. Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares. os corantes conhecidos como básicos tem a cor do seu íon positivo.

13 . flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas. PREPARAÇÃO DE ESFREGAÇOS E COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram. com os reagentes cristal violeta. Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração. o que confere a característica de positividade ao Gram. etanolacetona e fucsina básica.diferentes tipos de bactérias. A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. iodo. No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. frente ao Gram. em 1884. 5). e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano. enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo). Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo). mas sim com sua estrutura física.ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais. A coloração de Gram não está relacionada com os constituintes químicos da parede celular. 3) Coloração especial . A coloração de Gram e a álcool . Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. fixado pelo calor. e é o caso do iodo na coloração de Gram. Essa maneira de reagir diferentemente.são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos. Essas substâncias são chamadas mordentes. é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias. Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram(-) (Fig.

quando corretamente realizada e interpretada.Parede celular constituída de uma camada grossa de peptídeoglicano Gram positiva Membrana plasmática Complexo de membrana externa. Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil. Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptideoglicano. que não consegue reter o complexo. que é maior que a molécula de CV que penetrou. mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante. com inclusões de lipopoliproteínas e lipossacarídeos Parede celular constituída de uma camada fina de peptídeoglicano Membrana plasmática Gram negativa Figura 5 – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente. 14 . e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CVIodo. Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta. a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas.

o etanol-acetona (1:1 v:v). tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. 15 . Por outro lado. O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%. Em seguida. A etapa da descoloração é crítica. o cristal violeta. O corante cristal violeta pode ser substituído. O objetivo desta prática é demonstrar a importância desta coloração e fazer com que os alunos sejam capazes de distinguir entre Gram (+) e Gram (-). Portanto. Por outro lado. decorando as células. que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. A retenção ou não do corante primário é. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador. pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. porosidade e integridade. devem ser capazes de distinguir formas e arranjos. adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo. densidade. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Grampositivas e provoca a contração dos poros do peptidioglicano. com um corante primário. a fucsina básica. dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. Células de bactérias Gram-positivas. o corante primário é retido e as células permanecem coradas. Paralelamente.A TÉCNICA O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido. o lugol. seguido de tratamento com um fixador. Ao microscópio. as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. células velhas. em seus citoplasmas. tornando-as impermeáveis ao complexo. portanto. podendo produzir resultados falsos. a amostra é tratada com um corante secundário. o uso de material fresco é importante. pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. com os mesmos resultados. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido. insolúvel. mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina.

procurando obter um esfregaço fino. sólido e líquido. placa de Petri com cultura de microrganismo em meio sólido. cristal violeta a 1%. lugol. fucsina básica. PROCEDIMENTO: A. tubo de ensaio com cultura de microrganismo em meio líquído. 8) Realizar a coloração. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixá-lo. 7) Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen. 4) Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca. 6) Secar à tempetatura ambiente. Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido 1) Colocar com a própria alça. lâmina de vidro. OBS. PREPARO DO ESFREGAÇO Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido 1) Flambar a alça corretamente 2) Esfriá-la nas paredes do tubo 3) Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça. passando a lâmina algumas vêzes pela chama. 5) Espalhar o material sobre a lâmina. já flambada. uma gota de água de torneira no centro da lâmina de vidro.OBJETIVO Coloração de microrganismos provenientes de meios. 2) Flambar novamente a alça 16 . MATERIAL alça de platina. solução diferenciadora. pelo método de Gram.

6) Secar a lâmina por exposição ao ar. 3) Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto. 7) Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos. Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram. COLORAÇÃO 1) Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. cuidando para obter uma suspensão pouco densa e sem grumos. com a solução diferenciadora: álcool ou acetona. 10) Observar ao microscópio com objetiva de imersão. rapidamente. 9) Secar a lâmina. 5) Lavar uma ou duas vezes. 6) Lavar rapidamente em água corrente. Porém. A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada. 4) Lavar rapidamente em água corrente. 7) Fixar o esfregaço. pois são mais difíceis de descorar e de permitir observações. devendo ser filtrada para a remoção de precipitados. Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração. Ela deve ser efetuada rapidamente. tomando o cuidado de não remover o esfregaço. 5) Homogeneizar este material com a gota de água. Evitar estas culturas! 17 .3) Esfriá-la na tampa da placa de Petri. ou no meio sólido numa região sem colônia. A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. Os esfregaços não devem ser muito espessos. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!! 2) Lavar rapidamente em água corrente. 8) Lavar novamente em água corrente. com bactérias G (+) apresentando-se como G(-) e bactérias G(-) corando-se fracamente. B. não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada. 4) Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano.

podendo inclusive levar a erros? 18 . Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas? 2.RESULTADOS: ___________________ ____________________ __________________ ___________________ QUESTIONÁRIO 1. Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram.

Streptococcus pyogenes e dois tipos de fungos). Microscópio ótico.PRÁTICA 3 . Pseudomonas aeruginosa.: Pseudomonas aeruginosa 19 . A. Bacillus subtilis. PROCEDIMENTO E RESULTADOS Faça um esboço das características morfológicas e suas propriedades tintoriais de cada uma das bactérias apresentadas. MATERIAIS Lâminas de placas com microrganismos diferentes (Staphylococcus aureus. Visualização de bactérias: b) Cocos Gram + : Staphylococcus aureus c) Bacilos Gram + : Bacillus subtilis d) Bacilos Gram .MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA OBJETIVO Visualização das colônias crescidas em placas contendo meio sólido e análise por microscopia óptica e Morfologia de bactérias e de fungos . Repita o procedimento para os fungos apresentados.

e) Cocos Gram + : Streptococcus pyogenes B. Visualização de fungos Filamentosos Leveduras 20 .

aumento da massa de uma célula individual. biomassa é sintetizada em uma taxa progressiva na população em crescimento. cada novo indivíduo pode catalisar a biossíntese de material celular adicional. Em uma população composta por milhares de bactérias em crescimento ativo. O tempo de geração refere-se ao tempo requerido para uma célula bacteriana duplicar seu DNA e dividir-se. a cada 20 minutos uma nova geração de indivíduos é produzida. a cada 20 minutos) a população dobra de tamanho. aumento da massa total de uma população.g. Sob condições ótimas de crescimento. como conseqüência. A evolução ocorre através de mutações genéticas que produzem variações na descendência de um organismo e o ambiente determina que mutações são vantajosas no sentido de aumentar suas chances de sobrevivência e de sucesso reprodutivo (adaptação). seja em ambientes naturais (in vivo) ou em culturas de laboratório (in vitro). Nos organismos unicelulares. O aumento em tamanho de uma célula bacteriana conduz à divisão celular e conseqüente aumento do número de indivíduos na população. as bactérias podem testar 21 . pode-se presumir que a maioria delas esteja se dividindo ao mesmo tempo e a cada nova geração (e. o número de unidades catalíticas (células) aumenta com o tempo e. no qual o número de indivíduos dobra a cada geração. Devido aos tempos de geração muito curtos. Assim. cada célula bacteriana é uma unidade catalítica. aumento do número de células de uma população. ou seja. o crescimento pode ser entendido como: aumento de tamanho de uma célula individual. Do ponto de vista bioquímico. Quando uma bactéria se divide.PRÁTICA 4 . Uma característica importante do crescimento bacteriano é o fato de que a maioria das espécies de bactérias é capaz de crescer em taxas bastante rápidas.CURVA DE CRESCIMENTO CRESCIMENTO BACTERIANO O crescimento de qualquer organismo pode ser definido como o aumento do número de suas células ou o aumento de sua massa. muitas espécies bacterianas apresentam um tempo de geração médio de 20 minutos.. Este tipo de crescimento populacional é denominado de crescimento exponencial ou logarítmico. A maior vantagem de um tempo de reprodução tão rápido é que as bactérias podem evoluir muito rapidamente e esta e a razão do seu sucesso no mundo vivo.

CURVAS DE CRESCIMENTO Uma das abordagens mais comuns no estudo do crescimento bacteriano é a obtenção de curvas de crescimento. presença ou ausência de oxigênio e temperatura de incubação. quando se inocula uma população bacteriana em um frasco contendo uma quantidade inalterável de meio de cultura (sistema fechado). Para se estudar o crescimento de uma bactéria é preciso cultivá-la. o crescimento bem sucedido de uma população bacteriana reflete seu grau de adaptação a um determinado ambiente e depende primariamente de sua composição: condições nutricionais. A escolha do método depende da situação particular que se apresente. As distintas espécies bacterianas diferem no âmbito de fatores dentro dos quais podem crescer. temperatura. ambos os métodos apresentam vantagens e desvantagens. O crescimento de uma cultura bacteriana pode ser monitorado através do aumento da biomassa total em determinados intervalos de tempo (através de curvas de crescimento) ou da estimativa do número de células viáveis presentes na população (método de determinação do número de unidades formadoras de colônia). osmolaridade. tais como fontes de nutrientes. Em condições experimentais. Portanto. Estas são representações gráficas do aumento do número de indivíduos em um determinado período de tempo.bilhões de mutações em pequenos intervalos de tempo. Essas quatro fases estão representadas na Figura 6. o crescimento dessa população passa por quatro fases características. Cada grupo bacteriano tem uma faixa de condições nas quais seu crescimento atinge uma taxa ótima. como cultura pura. osmolaridade. Figura 6 – Curva de crescimento bacteriano padrão em sistema fechado 22 . pH. oxigênio e luz. Não há método perfeito. em meios de cultura e condições ambientais que variam em condições químicas e físicas. dependendo do ponto no qual o processo do crescimento seja interrompido pelo experimentador. pH.

ausente de inóculo. Fase exponencial ou logarítmica: fase na qual o número de células da população dobra a cada geração. as condições ambientais tornam-se desfavoráveis pela escassez de nutrientes essenciais. A taxa de crescimento da população diminui e segue-se a fase estacionária. As células continuam metabolizando e se dividindo. o que mantém constante o número de células viáveis na população. podendo até mesmo decrescer. Para a construção de uma curva de crescimento bacteriano. A curva de crescimento atinge um platô. relacionando-se a DO pelo tempo. A duração da fase estacionária depende do balanço entre a taxa de divisão celular e o número de células que vão se tornando inviáveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido às condições ambientais tornarem-se progressivamente desfavoráveis. Fase de declínio: fase de declínio exponencial do número de células viáveis: a taxa de morte celular torna-se maior que a taxa de divisão. Após um determinado período de crescimento exponencial. Fase estacionária: fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente devido às condições limitantes do meio. Para tal utiliza-se um espectrofotômetro onde o branco é o meio de cultura utilizado. acúmulo de metabólitos tóxicos e limitação de espaço. 23 . mede-se o aumento da biomassa total de uma cultura bacteriana em crescimento em meio líquido através de medidas da densidade óptica da cultura. Cada medida obtida corresponde à densidade óptica (DO) da cultura em um dado momento do crescimento. A fase lag será tão mais longa quanto maiores as diferenças de composição do ambiente anterior ou se a população for constituído de bactérias esporuladas. A duração dessa fase depende das condições ambientais nas quais as células se encontravam anteriormente. o metabolismo celular está direcionado para sintetizar as enzimas requeridas para o crescimento nas novas condições ambientais encontradas pelas células. O número de indivíduos não aumenta nesta fase. mas parte das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito próxima da taxa de morte celular. O número de células viáveis entra em declínio progressivo até a completa extinção da população. A absorbância aumenta proporcionalmente ao aumento do número de células (biomassa) na população. Alíquotas da cultura em crescimento são retiradas em determinados intervalos de tempo e mede-se a absorbância da cultura contra um comprimento de onda de 600 nm.Fase lag: fase de adaptação metabólica ao novo ambiente. Esta taxa de crescimento não pode ser mantida indefinidamente em um sistema fechado. Desta forma pode-se construir um gráfico representativo do progresso do crescimento.

Acima disto as leituras perdem a confiabilidade.Só são confiáveis medidas de DO até 2. Vantagens e desvantagens do método de medidas da densidade óptica Vantagens simplicidade da metodologia. Quadro 1. só se obtêm leituras acuradas da DO até o valor de 2. células bacterianas agrupadas após a divisão celular não prejudicam os resultados. células inviáveis. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais. Para a plotagem dos dados no gráfico deve-se multiplicar a DO obtida por 10. reduzida quantidade de material utilizado. acima disto as leituras perdem a confiabilidade.0 deve-se fazer uma diluição 10-1 dessa amostra e registrar sua DO.0. a introdução de erros experimentais pelo operador é menor. Se a leitura de uma amostra for maior que 2. Desvantagens e limitações não é possível a estimativa do número de células/ml da população.0. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura interferem na obtenção de resultados . o experimento não é cansativo. reduzindo a introdução de erros experimentais por parte do operador. medidas prontamente obtidas: o resultado do experimento é conhecido ao seu final. 24 . possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em gráfico).

RESULTADOS A) Construir um gráfico a partir dos pontos obtidos. QUESTIONÁRIO 1.(Não se esqueça de identificar os eixos. coli MATERIAL Cultura bacteriana pura. E. Espectofotômetro. Tubos de ensaio. Solução salina.OBJETIVO Obter uma curva de crescimento bacteriano de uma cultura pura de através de medidas de densidade óptica. Quais os problemas observados na construção dos gráficos (em que etapa do crescimento)? Você diria que todos os pontos são confiáveis? Justifique sua resposta. PROCEDIMENTO Durante a aulas serão obtidos apenas alguns pontos experimentais. os demais pontos serão medidos pelos monitores e repassados para os grupos. 25 . e suas unidades!!!) B) Identificar cada uma das fases de crescimento no gráfico. Pipetas.

ou seja. seguido da semeadura de uma alíquota de cada diluição em placas de Petri contendo meio bacteriológico sólido. Esse procedimento é repetido em diferentes intervalos de tempo e com os resultados pode-se construir um gráfico representando o progresso do crescimento Quadro 2. células bacterianas individuais ocuparão posições separadas na superfície do meio de maneira que cada uma dê origem a uma colônia bacteriana isolada.DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO ESTIMATIVA DO NÚMERO DE CÉLULAS VIÁVEIS A estimativa do número de células viáveis comumente é feita através de diluições seriadas de uma cultura bacteriana. o resultado da contagem das colônias multiplicado pela quantidade de diluições decimais é a estimativa do número de bactérias presentes em um ml da cultura original. Vantagens e desvantagens do método da contagem de células viáveis Vantagens permite uma estimativa do número de células viáveis/ml da população Desvantagens e limitações detecta somente as células viáveis e que se repliquem. em solução salina.PRÁTICA 5 . Como cada colônia supostamente originou-se da multiplicação um único indivíduo. muitos indivíduos viáveis podem não se replicar. no espalhamento. prejudicando o cálculo se as células da bactéria estudada mantém-se agrupadas após a divisão celular (cada colônia em meio sólido seria formada por mais de uma célula) se as diluições não forem homogeneizadas adequadamente se um número muito pequeno ou muito grande de colônias for usado na contagem se o operador não fizer o espalhamento rapidamente e de forma possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em um gráfico) pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais 26 . As colônias crescendo no meio de cultura podem ser visualizadas e contadas pelo experimentador. A célula individual que originou uma colônia é denominada de "Unidade Formadora de Colônia" ou UFC. aquelas capazes de formarem colônias. Esta técnica baseia-se na hipótese de que.

coli número de (UFC/ml da cultura original)? (X)_________ 27 . Qual é a concentração de E. Você fez um cultivo em meio liquido e tem suspeita que a cultura esta contaminada. VOCE PRECISA RECUPERAR SUA BACTÉRIA SUPER MELHORADA GENETICAMENTE. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura não interferem na obtenção de resultados adequada. PROBLEMA: 1.1ml (diluição 10-3) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. Mas digamos que você precisa ou deseja conhecer o nível de que a bactéria contaminante seja lac-. Você tem um estoque de uma super bactéria Escherichia coli (lac+). Neste caso você poderá: 0.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey ______ lac+ e 0.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey ______ lac+ e contaminação e _________lac_________lac_________lac_________lac- 3. QUE FAZER? 2.células inviáveis. a cada diluição um erro experimental é introduzido pela instrumentação e pelo experimentador este método detecta apenas um número muito reduzido de células. o que prejudica a estimativa a grande quantidade de material utilizado a acuracidade dos resultados está diretamente relacionada à quantidade de material (principalmente placas de Petri) a limitação de material impõe um aumento do erro experimental o resultado do experimento é só conhecido após o crescimento das colônias isoladas nas placas de Petri A) BACTERIANA A determinanção da concentração de bactérias é feita geralmente pela técnica de determinação do Número de UFC (unidades formadoras de colônias).1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey ______ lac+ e 0.

Qual é a concentração da bactéria lac.contaminante (UFC/ml da cultura original)? ( Y) _________ Qual é porcentagem da contaminação? _( Y) / (X)_____________________ B) DE LEVEDURAS Pela técnica de contagem em câmara de ¨Neubauer¨ VERIFICAÇÃO DE ENTENDIMENTO: Várias técnicas podem ser empregadas para atingir o objetivo desta Prática. Você saberia discutir por que as aqui empregadas foram escolhidas em cada um dos casos? 28 .4.

29 . concentração da droga e temperatura. em relação aos processos de embalsamento. Tais como: O microorganismo. sendo utilizado em 1847-49 em um hospital vienense quanto à demonstração prática da ação benéfica da anti-sepsia. além do fato de os vinhos e vinagres continuarem a serem utilizados durante a Idade Média ao recobrimento de feridas e. Os egípcios e outros povos utilizaram várias misturas. A concentração de anti-séptico em geral é baixa para evitar a lesão e irritação tecidual indesejáveis. até matar o tecido normal do hospedeiro. A presença ou não de resistência bacteriana ao agente antimicrobiano. A diferença entre um anti-séptico e um desinfetante pode ser uma questão de tempo de reação. mas inibe sua velocidade de crescimento. resinas oleosas. A descoberta do cloro na Idade Média foi amplamente utilizada como substância desodorante e anti-séptica. tais como óleos voláteis. evitando a infecção. a divulgação dos métodos de esterilização de bandagens. inicialmente desenvolvidos com o intuito da preservação do corpo à ressurreição. O agente microbiano e sua respectiva concentração. mura. em 1865. Coube a Lister.AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES HISTÓRIA O uso de anti-sépticos e desinfetantes evolui desde o Antigo Egito. O aumento da concentração de um agente anti-séptico pode irritar e talvez. A presença ou não de uma limpeza mecânica prévia. vinagres. A prévia remoção ou não de detritos e impurezas da superfície ou tecidos através do uso de sabões ou detergentes. Anos mais tarde Pasteur explicou sobre a fermentação bacteriana e a existência de agentes infectantes como responsáveis por processos patológicos. seu número e sua suscetibilidade. bálsamo. As substâncias anti-sépticas são aplicadas ao tecidos para suprimir ou impedir a infecção bacteriana.PRÁTICA 6 . número de microrganismos. CONCEITOS GERAIS Um desinfetante é uma substância usada para destruir bactérias ou outros microrganismos infectantes. consequentemente. Uma substância anti–séptica não mata o microrganismo. O tempo de contato entre o microorganismo e o antimicrobiano. compressas cirúrgicas. Os desinfetantes possuem atividade bactericida ou germicida e costumam ser aplicados em superfícies inanimadas. instrumental cirúrgico e anti-sepsia das feridas. mel. vinhos. Bem como as células bacterianas. Os anti-sépticos são valiosos no tratamento de infecções locais causadas por microrganismos refratários a quimioterapia sistêmica. USOS TERAPÊUTICOS DE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES Vários fatores podem influenciar na eficácia e/ou eficiência dos procedimentos ou agentes microbianos. interferindo assim com o crescimento normal do tecido de granulação na cicatrização de feridas.

Com base na posição hidrofóbica da molécula. podem ser usados em soluções com água e álcool. não agem na presença de matéria orgânica e podem causar irritação quando em contato prolongado com a pele. Catiônicos : Os compostos de amônio quaternário são os principais. são inodoros. eles são eficientes contra bactérias Gram positivas e Gram negativas. os detergentes catiônicos não possuem ação virucida. de apresentarem baixo custo e praticamente serem atóxicos. Gram negativas. pela borracha e materiais porosos. Um pH maior do que 9 inibirá a maioria das bactérias. As atividades em soluções livres de matéria orgânica são. Iodo. METAIS PESADOS 30 . Vantagens: Não são em geral irritantes para a pele e tecidos. baixa toxicidade. São potentes bactericidas contra micobactérias. Não-iônicos. O mecanismo de ação está relacionado à concentração do íon hidroxila. 3º. fungos patogênicos. ÁLCOOIS Os álcoois alifáticos comuns são bons solventes. mas em geral. SURFACTANTES É um composto químico que diminui a tensão superficial de uma solução aquosa. As desvantagens são: baixa atividade fungicida e virucida. Desvantagens: São neutralizados por surfactantes aniônicos (sabões). desidratantes. A presença de água é fundamental para a atividade dos álcoois (50-70%) e são mais eficazes na ausência de sujeiras e matéria orgânica. São antibacterianos contra microrganismos Gram negativos e ácido-resistentes. Gram positivas. Apesar de possuírem efeitos limitados sobre os vírus. Bromo. não possuírem ação residual e não devem ser utilizados para limpezas de ferimentos abertos. há três tipos: Aniônicos : Os sabões são os mais importantes. São utilizados isoladamente ou combinados com outros agentes. Cloro. fungicida ou esporocida. baixa penetrabilidade. em ordem decrescente: 1º. Vantagens apresentadas referem-se ao fato de serem ótimos solventes em relação a outros agentes germicidas. Já.ÁLCALIS Os álcalis foram utilizados como desinfetantes desde a antigüidade. diminuindo assim. HALOGÊNIOS Possuem efeitos antibacterianos potentes devido à alta afinidade pelo protoplasma. 2º. mucosas e trato respiratório. de terem ação rápida. muitos vírus e não em esporos. a concentração eficiente e a eficácia antibacteriana. anti-sépticos e desinfetantes. Os surfactantes são adsorvidos em um grau significativo pelo algodão. na presença de matéria orgânica o mais ativo é o Iodo.

Compostos de Prata Produzem efeitos cáusticos. mertiolate. 31 . lâminas. sabão. O Permanganato de Potássio libera Oxigênio em contato com a matéria orgânica. Os preparados de Prata coloidal não são corrosivos nem irritantes e são usados sobre tecidos sensíveis. Alça de Platina . Inibem por pouco tempo o crescimento de microrganismos anaeróbicos. mas não destroem esporos bacterianos. bico de Bunsen. Quando é distribuído sobre ferida com exsudato. ou + 3 zaragatoas estéreis. Liberam Oxigênio que se combina com a matéria orgânica se tornando inativos. álcool iodado. A prata metálica precipita as proteínas e produz efeito irritante. podendo haver repetições). antibacterianos pela ação do íon de prata livre e produz desnaturação de proteínas. AGENTES OXIDANTES São compostos germicidas de ação breve sobre algumas bactérias aeróbicas Gram+ e Gram-. bateria de Gram. a sua efervescência vai remover o pus e restos celulares e confere atividade germicida limitada.Derivados do mercúrio Parecem ser primariamente bacteriostáticos e apenas levemente bactericidas. A solução de Peróxido de Hidrogênio libera Oxigênio livre rapidamente ao entrar em contato com mucosas e superfícies sem pêlos que fornecem a enzima catalase. adstringentes. 3 cotonetes embrulhados em papel alumínio autoclavados. A sua ação antibacteriana está relacionada à inibição reversível da atividade enzimática essencial da bactéria e à capacidade de se combinar com íons de compostos metálicos orgânicos e inorgânicos. anti-sépticos comerciais (anti-sépticos em geral disponíveis 1 para cada grupo. O uso para anti-sepsia de superfícies e objetos inanimados parece imprudente já que há agentes com um modo de ação mais eficiente. As soluções possuem uma grande ação antibacteriana. É valioso para limpar e desodorizar o tecido infectado. MATERIAL 4 Placas com Ágar-sangue : Meio base para ágar sangue ou TSB enriquecido com 5% sangue desfibrinado de carneiro. OBJETIVOS Verificar a ação de anti-sépticos no crescimento bacteriano. Possuem pouca atividade esporicida e são inativados por restos orgânicos. Microscópio óptico. 4 zaragatoas (“Swab”) estéreis.

7.Nesta lista deve conter o principal composto ativo. (Não se esqueça de ilustrar o que você observou!) QUESTIONÁRIO 1. 2. Tomar cuidado para não atingir a região não desinfectada. Umedecer um cotonete estéril em solução fisiológica e esfregar vigorosamente sobre as costas de uma das mãos. Analisar a Morfologia MACROSCÓPICA das colônias e MICROSPICA das bactérias após coloração de Gram. RESULTADOS Na quinta-feira: 1. Esperar 4 minutos para que haja ação do anti-séptico e passar na área desinfectada um terceiro cotonete umedecido com solução fisiológica. PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA TEORIA Antibiogramas são bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de bactérias aos antimicrobianos. 3. Faça uma lista com pelo menos seis anti-sépticos e seis desinfetantes. Umedecer um segundo cotonete com tintura de iodo ou mertiolato e esfregar nas costas da outra mão. Incubar a placa por 24h. o nome comercial. Marcar na placa o anti-séptico utilizado e o número do grupo que realizou o experimento. Espalhar o conteúdo do terceiro cotonete sobre a metade D da placa contendo ágar-sangue. em estufa a 37°C. Observar os resultados e anotar. 5. e o uso . 2. Espalhar sobre a metade A da placa contendo meio Ágar sangue.PROCEDIMENTO 1. 4. Procurar cobrir aproximadamente 4 cm de diâmetro. Descreva duas situações: uma em que você usaria um anti-séptico e uma em que usaria um desinfetante. numa área de mesmo diâmetro da primeira. 6. 2. Estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a 32 .

atividade de novos agentes. − Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias. A densidade do inóculo deve corresponder a turbidez 0. MATERIAIS “Swab” estéril. coli a alguns antibióticos. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível. cultura líquida fresca de Eschirichia coli. formando um halo de inibição que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. discos de papel com antibióticos. intermediário ou resistente. retirar o excesso de líquido comprimindo a ponta do “swab” nas paredes do tubo. que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas. A droga se difunde no ágar e produz inibição do agente sensível. 1. placas de Petri. OBJETIVO Analisar pelo método de difusão a ressitência de E.Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de diluição: consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e em seguida semear a bactéria em estudo.5 na escala padrão de turbidez (Escala de MacFarland). Introduzir nas culturas um “swab” estéril. régua. com meio Mueller-Hinton sólido. Para a garantia desta técnica. no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar uniformemente semeado com o microrganismo.Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um teste qualitativo. pinças. 2. ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration). Após incubação determina-se MIC e/ou MBC. devendo-se realizar a coloração de Gram. e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias resistentes. PROCEDIMENTO 1. 33 . alguns fatores são essenciais: − Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton.

por 16 a 24 horas. 3. O que é antibiograma e para que serve? Quais são os antibióticos beta-lactâmicos? Qual o seu modo de ação? Qual a diferença entre agente bactericida e bacteriostático? Dos antibióticos testados na experiência acima qual seria o mais indicado para o tratamento da infecção causada pela linhagem E. 6. Espalhar o conteúdo do “swab” sobre o meio de cultura sólido distribuído numa placa de Petri (meio Mueller-Hinton). Medir os halos formados (em mm). 4. 3. registrar os dados obtidos e relacionar com a tabela abaixo: Bactéria Oxacilina OX (1µg/mL) Carbemicilina CB (100µg/mL) Discos com antibióticos Kanamicina K (30µg/mL) Rifampicina RIF (30µg/mL) Sulfonamida SUL (300µg/mL) Estreptomicina EST (10µg/mL) Escherichia coli Leituras (mm) Resultados Padrões R< 10 S> 13 R< 13 S> 17 R< 12 S> 15 R< 16 S> 20 R< 12 S> 17 R< 11 S> 15 Relate os resultados obtidos e interprete comentando. QUESTIONÁRIO 1. Esperar a cultura sobre o agar secar bem ( 2 minutos). Incubar em estufa a 37ºC . 2. coli testada? Por que? 5. Espalhar bem. de modo a obter um “tapete” de bactérias em toda a superfície do meio sólido. Faça um esquema da parede de uma bactéria Gram-positiva e de uma bactéria Gram-negativa? 34 . 4. Colocar os discos de papel contendo os antibióticos sobre a cultura seca (usar pinças). 5.2.

MATERIAL Placas de ágar Sabouraud. Um importante exemplo deste processo é o alho. A presença de substâncias antimicrobianas pode ser verificada através de extratos ou partes homogeneizadas de vegetais colocados frente a culturas de microrganismos. Embeber os discos de papel de filtro no macerado e colocá-los sobre a superfície do meio semeado.PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS. Pode ser algum já relatado na literatura ou algum de conhecimento popular. 35 . Graal e pistilo. OBJETIVO Estudar a presença de compostos antimicrobianos em vegetais. INTRODUÇÃO Muitos vegetais contêm compostos que são inibidores de crescimento de microrganismos e exercem papel importante na resistência destes vegetais a patógenos. 2. QUESTIONÁRIO Pesquise e relato algum outro antimicrobiano natural . Espalhar sobre a superfície do meio com o próprio cotonete embebido na cultura. em graal. Mergulhar o cotonete na suspensão do microrganismo. PROCEDIMENTO 1. Cotonetes. coli. 5. 4. 3. Discos de papel de filtro. RESULTADOS Descreva as observações feitas ao final da incubação. Culturas: Staphylococcus sp e E.PRÁTICA 8 . separadamente. Incubar a 25°C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibição. Macerar o alho e a cebola. Alho e cebola.

os plasmídios mobilizáveis codificam. somente um dos conjuntos das funções encontradas nos plasmídios auto-transmissíveis para concluir a transferência. ela deve conter um plasmídio conjugativo (elemento extra-cromossômico). O outro grupo. para que o plasmídio possa ser transferido. refere-se aos genes mob. Para que uma linhagem bacteriana seja doadora. Por outro lado. Como resultado. em um sítio específico. Os autotransmissíveis carregam um conjunto de genes. o sítio de oriT deve ser compatível com as funcões mob presentes nas células doadoras. somente uma fita. cujos produtos promovem a transferência deste plasmídio para uma célula aceptora. Contudo. ainda que os produtos dos genes tra promovem o contacto das células doadora-aceptora e promovem um contexto físico (formação dos poros) para esta transferência. A transferência do DNA é iniciada pela ação de um gene mob que tem a atividade em romper (nicking) em uma única fita da molécula do DNA. descoberta por Lederberg e Tatum (1946) é o processo “sexual"de transferência de genes de uma bactéria doadora para outra receptora. chamado de oriT e catalisa o desenrolamento da dupla hélice. Experimentos genéticos demonstraram que todas as três classes de funcões de 36 . Ambas servem como molde para sintetizar a fita complementar. na formação dos poros na membrana. coli K12 e o elemento extra-cromossômico responsável foi chamado de fator F (de fertilidade) ou plasmídio F.CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS INTRODUÇÃO A conjugação bacteriana. os genes tra. Os genes tra podem ser divididos em dois grandes grupos: um grupo. Um exemplo de plasmídio mobilizável é o plasmído natural ColE1 ou colicinogênico que codifica as atividades dos genes mob e seu oriT. os quais especificam proteínas envolvidas na mobilização do DNA. especifica proteínas envolvidas não só na interação superficial (contacto) entre as células doadora e aceptora. bem como. pode ser transferida para a célula aceptora e a outra fita permanece na célula doadora. O processo de conjugação foi descoberto em E. Como a interação mob-oriT é específica. o plasmídio mobilizável deve conter um ori T. os produtos dos genes mob preparam o DNA para serem transferidos. Esta célula doadora é diferenciada durante a conjugação pela presença de um apêndice na sua superfície chamado de pili F. Há dois tipos de plasmídios conjugativos: os plasmídios auto-transmissíveis e os mobilizáveis.PRÁTICA 9 . Concluindo.

outros plasmídios conjugativos foram sendo descobertos como é o caso dos fatores ou plasmídios R ou RTF (fator de transferência de resistência). tornando-a F+. Tetr ). o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. Raramente. b) Receptora: Linhagem de Escherichia coli K12 (lac+ . coli. o fator F media a transferência do cromossoma da célula Hfr para a célula F-. a linhagem Hfr cujo fator F está integrado ao cromossomo bacteriano. Raramente. Após a descoberta do fator F. transfere. tra. Linhagens a) Doadora: Linhagem de Salmonella typhimurium MG031 ( lac. o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. 37 . No primeiro caso. Estes plasmídios ColE1 codificam proteínas chamadas de colicinas que matam algumas linhagens sensíveis de E.. normalmente no cromossomo bacteriano. Estes plasmídios possuem marcadores para a resistência às drogas antibacterianas e não integram-se. As células F+ após contato com as células F-. Placas com meio sólido. MATERIAL Tubos de ensaio . O fenótipo de resistência ao ácido Nalidíxico deve-se a uma mutação cromossomal. O fator F também é raramente transferido. Alguns plasmídios não promovem conjugação. OBJETIVO Tranferir de Salmonella typhimurium o plasmídio que carrega o gene que confere resistência a tetraciclina. Os plasmídios conjugativos após serem transferidos e replicados podem permanecerem livres (autônomos) ou integrarem-se ao cromossomo bacteriano (chamados de estado integrado). sequencialmente marcadores ou fragmentos deste cromossomo. mob e oriT devem estar presentes para que ocorra conjugação entre bactérias e bactérias e leveduras. a linhagem bacteriana é chamada de F+ e no segundo Hfr ( a integração do fator F parece ser mediada por pequenas sequências chamadas de elementos IS). Nalr). para a Escherichia coli K12 . Por outro lado. Neste estado. transferem em alta frequência para esta última uma réplica ou cópia do plasmídio F. mas podem ser mobilizados por outros plasmídios conjugativos.conjugação. Hospeda um plasmídio que carrega o marcador que confere resistência a tetraciclina (Tcr ).

1ml (sem diluição) em meio MacConkey-Nal 0. Incubar em estufa à temperatura de 37°C por 16-24 horas (durante uma noite). 3.Antibióticos a) Ácido Nalidíxico (Nal) usar a concentração de 10µg/ml b) Tetraciclina (Tc) usar a concentração de 50 µg/ml PROCEDIMENTO 1° Dia 1.1 Célula doadora: S.1ml (diluição 10-1) em meio MacConkey -Nal-Tc 0. Adicionar em um tubo de ensaio contendo 1. typhimurium MG031 0.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Nal 0.3 Mistura de conjugação (Transconjugantes): 0. 2°Dia 1. Agitar bem e incubar por 1 hora sem agitação à temperatura de 37°C. Fazer as seguintes semeaduras em placa contendo meio sólido: 3. coli K12 0.0 ml da linhagem S.1ml (sem diluição) em meio YT-Nal-Tc 0.0ml de meio TSB.1ml (diluição 10-4 ) em meio MacConkey -Nal 0. coli K12 (receptora) 2.2 Célula receptora: E. Fazer os pré-inóculos das linhagens doadoras e receptoras em 4.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Tc 3.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Tc 0.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey -Tc 0.1ml (diluição 10-2) em meio MacConkey -Nal-Tc 4. Incubar à temperatura de 37°C por uma noite.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Nal 3.0ml de TSB ou LB as seguintes culturas: 1.1ml (sem diluição) em meio MacConkey -Nal-Tc 0. 38 .0 ml da linhagem E. typhimurium MG031 (doadora) e 1.

A freqüência é determinada dividindo o número de células transconjugantes pelo número total de células receptoras.RESULTADOS 3°Dia Analisar os resultados e determinar a freqüência de conjugação. 39 .

Estes postulados apresentam. 1. A cultura pura quando inoculada em voluntário humano susceptível ou animal experimental deve produzir os sintomas da doença. tratamento com corticosteróides. 2. Estes se constituíram nas primeiras abordagens que forneceram bases científicas para o estudo das doenças infecciosas. Os postulados de Koch foram originalmente desenvolvidos para identificar bactérias causadoras de epidemias como a cólera e a tuberculose. infecção por HIV ou diabetes e que podem ser infectados por bactérias incapazes de causar infecção em pessoas sadias. dos mecanismos que regem a infectividade bacteriana.PRÁTICA 10 . a susceptibilidade do hospedeiro é tão ou mais importante que as características de virulência da bactéria: Indivíduos cujo sistema imunológico esteja seriamente comprometido por quimioterapia anti-câncer. Na realidade. A bactéria deve ser isolada de lesões de uma pessoa infectada e mantida em culturas puras. 2.POSTULADO DE KOCH Como provar que um microrganismo é responsável por uma doença? A resposta clássica é um conjunto de quatro postulados formulados por Robert Koch e posteriormente revisados com o desenvolvimento da Microbiologia. a bactéria ou seus produtos devem ser encontrados nas partes do corpo afetados pela doença. 1. contudo. 4. ao tempo de Koch. A bactéria deve ser encontrada em todas as pessoas com a doença. ABORDAGEM CLÁSSICA Robert Koch (1877) formulou um conjunto de quatro postulados os quais afirmava deveriam ser adotados para que se aceitasse uma relação casual entre um microrganismo em particular e uma doença. O segundo postulado enfatiza a obtenção de culturas puras do patógeno. Os postulados de Koch implicam que a virulência é uma característica exclusiva das bactérias e independente do hospedeiro. A mesma bactéria pode ou não satisfazer os postulados de Koch dependendo da sub-população usada como ponto de referência. 3. Epidemiologia e da Genética Molecular. Há algumas 40 . uma série de limitações devido ao precário conhecimento. A mesma bactéria deve ser re-isolada em cultura pura dos indivíduos intencionalmente infectados.

A combinação das tecnologia da reação em cadeia da polimerase (PCR) com as de seqüenciamento de ácidos nucléicos possibilita a detecção e identificação de bactérias não-cultiváveis e revela o agente causativo de muitas doenças. diferentes linhagens de uma espécie bacteriana não somente variam consideravelmente em virulência como podem causar doenças distintas. respectivamente. Alguns patógenos humanos não causam doenças em animais ou provocam sintomas diferentes daqueles observados em humanos. O terceiro postulado requer que a bactéria seja reinoculada em um voluntário humano ou em um animal experimental e que a reinoculação cause os sintomas da doença. o cultivo de uma bactéria em meio de laboratório pode causar a "perda" do fator de virulência: não expressão dos genes nas condições ambientais do meio. uma resposta imunológica dos indivíduos infectados contra os antígenos de superfície das bactérias observadas nas lesões provocadas pela doença. disponível: Há consideráveis evidências para implicar as bactérias Treponema pallidum e Mycobacterium leprae como causadoras da sífilis e hanseníase.doenças cujo agente causativo não pode ser cultivado em meios de laboratório ou cujo meio adequando não é. 4. os mesmos sintomas podem ser causados por diferentes espécies de bactérias e há doenças cujas lesões são causados por uma mistura de diferentes linhagens (infecções polimicrobianas). ainda. se houver um disponível. Há também. os casos nos quais uma única espécie de bactéria é a única responsável por uma doença parece mais uma exceção do que uma regra. Em muitos casos não é possível a utilização de voluntários humanos e a única alternativa é a utilização de um modelo animal. 41 . Os segundo e quarto postulados consideram que todos os membros de uma espécie bacteriana são igualmente virulentos e que somente uma única espécie causa uma determinada doença. 3. Antibióticos que causam o desaparecimento de sintomas também causam a eliminação da bactéria do tecido infectado.

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