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Apostila de Microbiologia Aulas Praticas

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  • PRÁTICA 1 - NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA
  • TÉCNICA DE SEMEADURA
  • OBJETIVO
  • PROCEDIMENTO E RESULTADOS
  • QUESTIONÁRIO
  • PRÁTICA 2 - COLORAÇÃO DE GRAM
  • PROCEDIMENTO:
  • RESULTADOS:
  • PRÁTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA
  • A. Visualização de bactérias:
  • PRÁTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO
  • CRESCIMENTO BACTERIANO
  • CURVAS DE CRESCIMENTO
  • MATERIAL
  • PRÁTICA 5 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO
  • PROBLEMA:
  • VERIFICAÇÃO DE ENTENDIMENTO:
  • PRÁTICA 6 - AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE
  • ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES
  • OBJETIVOS
  • PROCEDIMENTO
  • RESULTADOS
  • PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA
  • TEORIA
  • MATERIAIS
  • PRÁTICA 8 - PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS
  • PRÁTICA 9 - CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS
  • PRÁTICA 10 - POSTULADO DE KOCH
  • ABORDAGEM CLÁSSICA

Universidade de São Paulo

Instituto de Ciências Biomédicas Departamento de Microbiologia
BMM121 – Microbiologia Básica

Apostila de Aulas Práticas Profa. Elisabete José Vicente bevicent@usp.br 3091.7350 2004

MICROBIOLOGIA NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA É indispensável o uso de avental no laboratório. O avental deve ser comprido, de mangas compridas e estar abotoado; Não comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratório; O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material necessário ao trabalho prático, como: roteiro de aula, papel e lápis ou caneta para anotações; Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, aspiração de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o técnico responsável pela aula prática; Descarte de material: a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios, existentes nos laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias; b) Placas de petri deverão ser deixadas tampadas sobre a bancada; c) Lâminas fornecidas para visualização deverão ser deixadas sobre as bancadas; d) Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes. Prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes Terminados os trabalhos práticos: a) b) c) d) e) f) Esterilizar alças e fios de platina; Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas; Desligar lâmpadas e microscópios; Limpar microscópios e cobri-los com a capa; Tirar o avental e guardar; Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou anti-séptico.

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Módulo I Introdução à microbiologia

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Módulo I ......................................................................................................................... 4 Introdução à microbiologia ............................................................................................. 4 Prática 1 - NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA ................................................................. 7 Técnica de semeadura ............................................................................................... 7 Objetivo .................................................................................................................... 10 Material ..................................................................................................................... 10 Procedimento e Resultados...................................................................................... 10 Questionário ............................................................................................................. 11 PRÁTICA 2 - COLORAÇÃO DE GRAM........................................................................... 12 Fixação e coloração de microrganismos................................................................... 12 Preparação de esfregaços e coloração pelo método de gram.................................. 13 A técnica ................................................................................................................... 15 Objetivo .................................................................................................................... 16 Material ..................................................................................................................... 16 Procedimento:........................................................................................................... 16 Resultados:............................................................................................................... 18 Questionário ............................................................................................................. 18 PRÁTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA..... 19 Objetivo .................................................................................................................... 19 Materiais ................................................................................................................... 19 Procedimento e resultados ....................................................................................... 19 A. Visualização de bactérias:.................................................................................... 19 B. Visualização de fungos......................................................................................... 20 PRÁTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO .................................................................... 21 Crescimento Bacteriano ........................................................................................... 21 Curvas de crescimento ............................................................................................. 22 Objetivo .................................................................................................................... 25 Material ..................................................................................................................... 25 Procedimento............................................................................................................ 25 Resultados................................................................................................................ 25 Questionário ............................................................................................................. 25 PRÁTICA 5 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO................................................................................................................... 26 Estimativa do número de células viáveis .................................................................. 26 Problema: ................................................................................................................. 27 5

.................................................................................... 33 Questionário .................................................................................................... 37 Material ......... 37 Procedimento......................... 32 Objetivo ................................................POSTULADO DE KOCH...................................... 29 Objetivos.......................... 35 Resultados................................................................................................................................................................... 34 PRÁTICA 8 ....... 28 PRÁTICA 6 ..........................................................................................................................................Verificação de entendimento: .......................................... 40 6 .................... 36 Objetivo ......................CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS. 32 PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA .................................................................................................. 32 Questionário ..................... 31 Procedimento............................................................................................................................................ 35 PRÁTICA 9 ......................................................................................................................................................................................................................................AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ....................................................................................................... 32 Teoria .................................................................................................. 35 Material ...................................................................................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................. 32 Resultados................................ 36 Introdução.............................................................................................................................................................................. 31 Material ....................................................................................... 35 Objetivo ........................................................................................................... 33 Procedimento.......... 39 PRÁTICA 10 ................................... 33 Materiais ......... 35 Questionário ............................................................................. 40 Abordagem clássica .................................... 35 Procedimento......................................................... 38 Resultados.................... 29 Anti-sépticos e desinfetantes .......................... 35 Introdução..........................................................................................................................................................................................PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS..............................................................................................................................................................................................................................................

TÉCNICA DE SEMEADURA Toda a vez que se fizer uma semeadura é importante seguir as regras abaixo mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura por microrganismos presentes no ambiente. Toda vez que fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio. e evitar acidentes laboratoriais. 1. Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. esfriar previamente a alça.Posição correta para a flambagem da alça 2.NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA Alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminação do manipulador como também dos meios de cultura empregados e das culturas microbianas. Flambagem da alça ou fio de platina: Tanto a alça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura. seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura. Figura 1. Para retirar o material. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes. deve-se flambar a 7 . Esta deverá ser esfriada na parte interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de petri.PRÁTICA 1 . A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45o em relação à mesa de trabalho (Figura 1).

torcer o papel na região central da pipeta. Não pousar os tampões sobre a bancada!!! Flambar a alça após o uso. Esta deverá ser mantida segura pelo dedo mínimo. retirar primeiramente o papel da parte superior e depois a parte inferior (correspondente à ponta da pipeta).boca dos mesmos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de algodão). dentro de um cilindro metálico). Após a retirada do material com a alça. As pipetas utilizadas em microbiologia são previamente esterilizadas. após flambar a alça até o rubro. Uma vez utilizada. a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba contendo solução desinfetante. flambar novamente a boca do tubo e colocar a tampa. semear na placa de Petri (fig. Para uso. da mão que está segurando a alça ( Figura 2). 4. Figura 2 – Removendo o tampão de algodão 3. 5. As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para evitar contaminação com germes do ar. Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo.3). Esta seqüência evite que a pipeta seja contaminada pelas mãos do operador. e introduzi-la na cultura de bactéria. 8 . são oferecidas embrulhadas em papel (às vezes. Na semeadura usando placas de Petri.

Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes (Figura 4) Essa técnica é conhecida também por esgotamento. girar a placa cerca de 30˚ e puxar nova estria. Após a primeira estria.Figura 3 – Semeadura em placa: primeiro conjunto de estrias 6. flambar novamente a alça. sempre invertida. 9 . antes de colocar a alça em contato com a cultura. ou num pedaço do ágar sem cultura). lembre-se: ela está muito QUENTE!!! Antes e depois da semeadura em placa mantenha a mesma. 7. e depois guardadas a 4˚C até a próxima aula. Figura 4 – Semedura em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias = eficiência no isolamento de colônias Não esqueça!!!!!! Sempre resfrie a alça (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo. As placas serão incubadas a 37˚C por 24h.

não esquecendo de ilustrar os resultados obtidos A) SEMEADURA EM MEIO LÍQUIDO B) SEMEADURA EM PLACAS CONTENDO MEIO SÓLIDO 10 . tubo de ensaio com cultura de Eschirichia coli. tubo de ensaio com meio completo líquido placa de Petri com meio completo sólido.OBJETIVO Fazer semeaduras em meios líquido e sólido de cultura de Eschirichia coli. e obter colônias isoladas MATERIAL alça de platina. PROCEDIMENTO E RESULTADOS Descreva o que foi realizado em cada uma das etapas abaixo.

Por que deve-se manter sempre que possível a placa de Petri com meio sólido invertida? 3. na semeadura em placa. Qual a finalidade de se fazer várias estrias. Por que deve-se flambar os tubos antes e depois de cada transferência? 2. contendo meio sólido? 11 .C) OBTENÇÃO DE CULTURAS PURAS QUESTIONÁRIO 1.

o que dá a cor. os corantes conhecidos como básicos tem a cor do seu íon positivo. além de facilitar sua observação. A introdução de colorações. por quatro razões principais: Permitem uma visualização melhor das células. em geral. Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares. identificar alguns grupos.PRÁTICA 2 .cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que. Os corantes são sais compostos de um íon positivo e um íon negativo. Os corantes básicos mais comuns são: cristal violeta. já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos. azul de metileno e safranina . Existem inúmeros métodos para coloração. portanto atrai corantes básicos. Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e Podem. os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. eventualmente.nessa coloração o corante reage diferentemente com 12 . através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama. o microrganismo deve ser fixado à lâmina. é chamado de radical cromóforo. antes de ser corado. Então. enquanto que os ácidos tem a cor do seu íon negativo. veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia. no estudo dos microrganismos. A célula bacteriana é negativamente carregada.COLORAÇÃO DE GRAM FIXAÇÃO E COLORAÇÃO DE MICRORGANISMOS A morfologia individual e as reações tintoriais constituem. Um desse íons. Porém. permite a visualização de determinadas estruturas. Quanto aos tipos de coloração temos: 1) Coloração simples . 2) Coloração diferencial .

é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias. Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram(-) (Fig. Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração. Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo). mas sim com sua estrutura física. com os reagentes cristal violeta.são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos. etanolacetona e fucsina básica. frente ao Gram.diferentes tipos de bactérias. flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas. Essa maneira de reagir diferentemente. enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo). 13 . A coloração de Gram e a álcool . Essas substâncias são chamadas mordentes. A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano.ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais. iodo. 5). e é o caso do iodo na coloração de Gram. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. o que confere a característica de positividade ao Gram. A coloração de Gram não está relacionada com os constituintes químicos da parede celular. fixado pelo calor. em 1884. PREPARAÇÃO DE ESFREGAÇOS E COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram. 3) Coloração especial .

14 . e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CVIodo. a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas. com inclusões de lipopoliproteínas e lipossacarídeos Parede celular constituída de uma camada fina de peptídeoglicano Membrana plasmática Gram negativa Figura 5 – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente. que é maior que a molécula de CV que penetrou. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante. que não consegue reter o complexo. Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana. Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta.Parede celular constituída de uma camada grossa de peptídeoglicano Gram positiva Membrana plasmática Complexo de membrana externa. Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptideoglicano. quando corretamente realizada e interpretada. mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo.

o corante primário é retido e as células permanecem coradas. densidade. tornando-as impermeáveis ao complexo. com um corante primário. O corante cristal violeta pode ser substituído. Portanto. devem ser capazes de distinguir formas e arranjos. as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos. células velhas. 15 . podendo produzir resultados falsos. o lugol. A etapa da descoloração é crítica. resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido. em seus citoplasmas. adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo. a amostra é tratada com um corante secundário. com os mesmos resultados. o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Grampositivas e provoca a contração dos poros do peptidioglicano. insolúvel. A retenção ou não do corante primário é. decorando as células. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido. porosidade e integridade. O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. Por outro lado. dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. Paralelamente. a fucsina básica. tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. Em seguida. Células de bactérias Gram-positivas. pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. o cristal violeta. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina. seguido de tratamento com um fixador. Por outro lado. Ao microscópio. o etanol-acetona (1:1 v:v). Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador. que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. portanto.A TÉCNICA O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. O objetivo desta prática é demonstrar a importância desta coloração e fazer com que os alunos sejam capazes de distinguir entre Gram (+) e Gram (-). o uso de material fresco é importante.

placa de Petri com cultura de microrganismo em meio sólido. pelo método de Gram. lugol. 2) Flambar novamente a alça 16 . lâmina de vidro.OBJETIVO Coloração de microrganismos provenientes de meios. já flambada. Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido 1) Colocar com a própria alça. tubo de ensaio com cultura de microrganismo em meio líquído. sólido e líquido. 7) Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen. OBS. 4) Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca. 5) Espalhar o material sobre a lâmina. MATERIAL alça de platina. uma gota de água de torneira no centro da lâmina de vidro. passando a lâmina algumas vêzes pela chama. solução diferenciadora. fucsina básica. procurando obter um esfregaço fino. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixá-lo. PREPARO DO ESFREGAÇO Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido 1) Flambar a alça corretamente 2) Esfriá-la nas paredes do tubo 3) Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça. 8) Realizar a coloração. cristal violeta a 1%. 6) Secar à tempetatura ambiente. PROCEDIMENTO: A.

rapidamente. 6) Lavar rapidamente em água corrente. ou no meio sólido numa região sem colônia. 4) Lavar rapidamente em água corrente. tomando o cuidado de não remover o esfregaço. não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada. COLORAÇÃO 1) Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. Os esfregaços não devem ser muito espessos.3) Esfriá-la na tampa da placa de Petri. cuidando para obter uma suspensão pouco densa e sem grumos. 6) Secar a lâmina por exposição ao ar. 8) Lavar novamente em água corrente. com bactérias G (+) apresentando-se como G(-) e bactérias G(-) corando-se fracamente. devendo ser filtrada para a remoção de precipitados. 3) Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto. A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. Ela deve ser efetuada rapidamente. 7) Fixar o esfregaço. 9) Secar a lâmina. B. 10) Observar ao microscópio com objetiva de imersão. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!! 2) Lavar rapidamente em água corrente. A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada. Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram. Porém. Evitar estas culturas! 17 . 7) Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos. pois são mais difíceis de descorar e de permitir observações. Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração. com a solução diferenciadora: álcool ou acetona. 5) Homogeneizar este material com a gota de água. 4) Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano. 5) Lavar uma ou duas vezes.

Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram. podendo inclusive levar a erros? 18 .RESULTADOS: ___________________ ____________________ __________________ ___________________ QUESTIONÁRIO 1. Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas? 2.

Bacillus subtilis. Pseudomonas aeruginosa. MATERIAIS Lâminas de placas com microrganismos diferentes (Staphylococcus aureus. A. Visualização de bactérias: b) Cocos Gram + : Staphylococcus aureus c) Bacilos Gram + : Bacillus subtilis d) Bacilos Gram .MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA OBJETIVO Visualização das colônias crescidas em placas contendo meio sólido e análise por microscopia óptica e Morfologia de bactérias e de fungos . Streptococcus pyogenes e dois tipos de fungos). Repita o procedimento para os fungos apresentados.PRÁTICA 3 .: Pseudomonas aeruginosa 19 . PROCEDIMENTO E RESULTADOS Faça um esboço das características morfológicas e suas propriedades tintoriais de cada uma das bactérias apresentadas. Microscópio ótico.

e) Cocos Gram + : Streptococcus pyogenes B. Visualização de fungos Filamentosos Leveduras 20 .

a cada 20 minutos uma nova geração de indivíduos é produzida. as bactérias podem testar 21 . Nos organismos unicelulares. A maior vantagem de um tempo de reprodução tão rápido é que as bactérias podem evoluir muito rapidamente e esta e a razão do seu sucesso no mundo vivo. Assim. Em uma população composta por milhares de bactérias em crescimento ativo. Do ponto de vista bioquímico. aumento do número de células de uma população. o número de unidades catalíticas (células) aumenta com o tempo e. a cada 20 minutos) a população dobra de tamanho.g. Sob condições ótimas de crescimento. Uma característica importante do crescimento bacteriano é o fato de que a maioria das espécies de bactérias é capaz de crescer em taxas bastante rápidas. O tempo de geração refere-se ao tempo requerido para uma célula bacteriana duplicar seu DNA e dividir-se. cada célula bacteriana é uma unidade catalítica. o crescimento pode ser entendido como: aumento de tamanho de uma célula individual.CURVA DE CRESCIMENTO CRESCIMENTO BACTERIANO O crescimento de qualquer organismo pode ser definido como o aumento do número de suas células ou o aumento de sua massa. como conseqüência. aumento da massa de uma célula individual. pode-se presumir que a maioria delas esteja se dividindo ao mesmo tempo e a cada nova geração (e.. seja em ambientes naturais (in vivo) ou em culturas de laboratório (in vitro). A evolução ocorre através de mutações genéticas que produzem variações na descendência de um organismo e o ambiente determina que mutações são vantajosas no sentido de aumentar suas chances de sobrevivência e de sucesso reprodutivo (adaptação). Devido aos tempos de geração muito curtos. Este tipo de crescimento populacional é denominado de crescimento exponencial ou logarítmico.PRÁTICA 4 . cada novo indivíduo pode catalisar a biossíntese de material celular adicional. no qual o número de indivíduos dobra a cada geração. ou seja. Quando uma bactéria se divide. aumento da massa total de uma população. biomassa é sintetizada em uma taxa progressiva na população em crescimento. muitas espécies bacterianas apresentam um tempo de geração médio de 20 minutos. O aumento em tamanho de uma célula bacteriana conduz à divisão celular e conseqüente aumento do número de indivíduos na população.

Estas são representações gráficas do aumento do número de indivíduos em um determinado período de tempo. pH. As distintas espécies bacterianas diferem no âmbito de fatores dentro dos quais podem crescer. O crescimento de uma cultura bacteriana pode ser monitorado através do aumento da biomassa total em determinados intervalos de tempo (através de curvas de crescimento) ou da estimativa do número de células viáveis presentes na população (método de determinação do número de unidades formadoras de colônia). o crescimento dessa população passa por quatro fases características. temperatura. ambos os métodos apresentam vantagens e desvantagens. Para se estudar o crescimento de uma bactéria é preciso cultivá-la. presença ou ausência de oxigênio e temperatura de incubação. Em condições experimentais. osmolaridade. como cultura pura. Cada grupo bacteriano tem uma faixa de condições nas quais seu crescimento atinge uma taxa ótima. dependendo do ponto no qual o processo do crescimento seja interrompido pelo experimentador. Essas quatro fases estão representadas na Figura 6. pH. tais como fontes de nutrientes. osmolaridade. Figura 6 – Curva de crescimento bacteriano padrão em sistema fechado 22 . Não há método perfeito.bilhões de mutações em pequenos intervalos de tempo. em meios de cultura e condições ambientais que variam em condições químicas e físicas. CURVAS DE CRESCIMENTO Uma das abordagens mais comuns no estudo do crescimento bacteriano é a obtenção de curvas de crescimento. o crescimento bem sucedido de uma população bacteriana reflete seu grau de adaptação a um determinado ambiente e depende primariamente de sua composição: condições nutricionais. Portanto. quando se inocula uma população bacteriana em um frasco contendo uma quantidade inalterável de meio de cultura (sistema fechado). oxigênio e luz. A escolha do método depende da situação particular que se apresente.

A absorbância aumenta proporcionalmente ao aumento do número de células (biomassa) na população. A duração dessa fase depende das condições ambientais nas quais as células se encontravam anteriormente. A taxa de crescimento da população diminui e segue-se a fase estacionária. Alíquotas da cultura em crescimento são retiradas em determinados intervalos de tempo e mede-se a absorbância da cultura contra um comprimento de onda de 600 nm.Fase lag: fase de adaptação metabólica ao novo ambiente. Fase estacionária: fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente devido às condições limitantes do meio. A curva de crescimento atinge um platô. Fase de declínio: fase de declínio exponencial do número de células viáveis: a taxa de morte celular torna-se maior que a taxa de divisão. A duração da fase estacionária depende do balanço entre a taxa de divisão celular e o número de células que vão se tornando inviáveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido às condições ambientais tornarem-se progressivamente desfavoráveis. relacionando-se a DO pelo tempo. Esta taxa de crescimento não pode ser mantida indefinidamente em um sistema fechado. Após um determinado período de crescimento exponencial. As células continuam metabolizando e se dividindo. O número de células viáveis entra em declínio progressivo até a completa extinção da população. o que mantém constante o número de células viáveis na população. as condições ambientais tornam-se desfavoráveis pela escassez de nutrientes essenciais. Cada medida obtida corresponde à densidade óptica (DO) da cultura em um dado momento do crescimento. Para tal utiliza-se um espectrofotômetro onde o branco é o meio de cultura utilizado. podendo até mesmo decrescer. acúmulo de metabólitos tóxicos e limitação de espaço. A fase lag será tão mais longa quanto maiores as diferenças de composição do ambiente anterior ou se a população for constituído de bactérias esporuladas. mede-se o aumento da biomassa total de uma cultura bacteriana em crescimento em meio líquido através de medidas da densidade óptica da cultura. Desta forma pode-se construir um gráfico representativo do progresso do crescimento. mas parte das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito próxima da taxa de morte celular. o metabolismo celular está direcionado para sintetizar as enzimas requeridas para o crescimento nas novas condições ambientais encontradas pelas células. 23 . Fase exponencial ou logarítmica: fase na qual o número de células da população dobra a cada geração. O número de indivíduos não aumenta nesta fase. Para a construção de uma curva de crescimento bacteriano. ausente de inóculo.

Para a plotagem dos dados no gráfico deve-se multiplicar a DO obtida por 10. Se a leitura de uma amostra for maior que 2. o experimento não é cansativo. reduzindo a introdução de erros experimentais por parte do operador. células bacterianas agrupadas após a divisão celular não prejudicam os resultados. reduzida quantidade de material utilizado. Desvantagens e limitações não é possível a estimativa do número de células/ml da população. Acima disto as leituras perdem a confiabilidade.Só são confiáveis medidas de DO até 2. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura interferem na obtenção de resultados . a introdução de erros experimentais pelo operador é menor. Quadro 1. Vantagens e desvantagens do método de medidas da densidade óptica Vantagens simplicidade da metodologia.0. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais. medidas prontamente obtidas: o resultado do experimento é conhecido ao seu final. acima disto as leituras perdem a confiabilidade.0.0 deve-se fazer uma diluição 10-1 dessa amostra e registrar sua DO. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas. células inviáveis. só se obtêm leituras acuradas da DO até o valor de 2. 24 . possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em gráfico).

25 . PROCEDIMENTO Durante a aulas serão obtidos apenas alguns pontos experimentais. coli MATERIAL Cultura bacteriana pura. os demais pontos serão medidos pelos monitores e repassados para os grupos. e suas unidades!!!) B) Identificar cada uma das fases de crescimento no gráfico. QUESTIONÁRIO 1. Tubos de ensaio. RESULTADOS A) Construir um gráfico a partir dos pontos obtidos. Espectofotômetro.(Não se esqueça de identificar os eixos.OBJETIVO Obter uma curva de crescimento bacteriano de uma cultura pura de através de medidas de densidade óptica. Pipetas. E. Quais os problemas observados na construção dos gráficos (em que etapa do crescimento)? Você diria que todos os pontos são confiáveis? Justifique sua resposta. Solução salina.

no espalhamento.DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO ESTIMATIVA DO NÚMERO DE CÉLULAS VIÁVEIS A estimativa do número de células viáveis comumente é feita através de diluições seriadas de uma cultura bacteriana. prejudicando o cálculo se as células da bactéria estudada mantém-se agrupadas após a divisão celular (cada colônia em meio sólido seria formada por mais de uma célula) se as diluições não forem homogeneizadas adequadamente se um número muito pequeno ou muito grande de colônias for usado na contagem se o operador não fizer o espalhamento rapidamente e de forma possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em um gráfico) pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais 26 . Esse procedimento é repetido em diferentes intervalos de tempo e com os resultados pode-se construir um gráfico representando o progresso do crescimento Quadro 2. aquelas capazes de formarem colônias. seguido da semeadura de uma alíquota de cada diluição em placas de Petri contendo meio bacteriológico sólido. Esta técnica baseia-se na hipótese de que. Vantagens e desvantagens do método da contagem de células viáveis Vantagens permite uma estimativa do número de células viáveis/ml da população Desvantagens e limitações detecta somente as células viáveis e que se repliquem. muitos indivíduos viáveis podem não se replicar. em solução salina.PRÁTICA 5 . o resultado da contagem das colônias multiplicado pela quantidade de diluições decimais é a estimativa do número de bactérias presentes em um ml da cultura original. A célula individual que originou uma colônia é denominada de "Unidade Formadora de Colônia" ou UFC. As colônias crescendo no meio de cultura podem ser visualizadas e contadas pelo experimentador. Como cada colônia supostamente originou-se da multiplicação um único indivíduo. ou seja. células bacterianas individuais ocuparão posições separadas na superfície do meio de maneira que cada uma dê origem a uma colônia bacteriana isolada.

1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey ______ lac+ e contaminação e _________lac_________lac_________lac_________lac- 3. a cada diluição um erro experimental é introduzido pela instrumentação e pelo experimentador este método detecta apenas um número muito reduzido de células.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey ______ lac+ e 0.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. QUE FAZER? 2. o que prejudica a estimativa a grande quantidade de material utilizado a acuracidade dos resultados está diretamente relacionada à quantidade de material (principalmente placas de Petri) a limitação de material impõe um aumento do erro experimental o resultado do experimento é só conhecido após o crescimento das colônias isoladas nas placas de Petri A) BACTERIANA A determinanção da concentração de bactérias é feita geralmente pela técnica de determinação do Número de UFC (unidades formadoras de colônias). Você fez um cultivo em meio liquido e tem suspeita que a cultura esta contaminada.células inviáveis. Neste caso você poderá: 0. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura não interferem na obtenção de resultados adequada. Qual é a concentração de E. Você tem um estoque de uma super bactéria Escherichia coli (lac+). Mas digamos que você precisa ou deseja conhecer o nível de que a bactéria contaminante seja lac-. coli número de (UFC/ml da cultura original)? (X)_________ 27 . PROBLEMA: 1.1ml (diluição 10-3) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. VOCE PRECISA RECUPERAR SUA BACTÉRIA SUPER MELHORADA GENETICAMENTE.

Qual é a concentração da bactéria lac.contaminante (UFC/ml da cultura original)? ( Y) _________ Qual é porcentagem da contaminação? _( Y) / (X)_____________________ B) DE LEVEDURAS Pela técnica de contagem em câmara de ¨Neubauer¨ VERIFICAÇÃO DE ENTENDIMENTO: Várias técnicas podem ser empregadas para atingir o objetivo desta Prática.4. Você saberia discutir por que as aqui empregadas foram escolhidas em cada um dos casos? 28 .

O tempo de contato entre o microorganismo e o antimicrobiano. evitando a infecção. A presença ou não de resistência bacteriana ao agente antimicrobiano. mel. compressas cirúrgicas. concentração da droga e temperatura. A diferença entre um anti-séptico e um desinfetante pode ser uma questão de tempo de reação. A presença ou não de uma limpeza mecânica prévia. O aumento da concentração de um agente anti-séptico pode irritar e talvez. As substâncias anti-sépticas são aplicadas ao tecidos para suprimir ou impedir a infecção bacteriana. Os anti-sépticos são valiosos no tratamento de infecções locais causadas por microrganismos refratários a quimioterapia sistêmica. em relação aos processos de embalsamento. CONCEITOS GERAIS Um desinfetante é uma substância usada para destruir bactérias ou outros microrganismos infectantes. além do fato de os vinhos e vinagres continuarem a serem utilizados durante a Idade Média ao recobrimento de feridas e. Os desinfetantes possuem atividade bactericida ou germicida e costumam ser aplicados em superfícies inanimadas. Tais como: O microorganismo.AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES HISTÓRIA O uso de anti-sépticos e desinfetantes evolui desde o Antigo Egito. Coube a Lister. mura. instrumental cirúrgico e anti-sepsia das feridas. A prévia remoção ou não de detritos e impurezas da superfície ou tecidos através do uso de sabões ou detergentes. bálsamo. tais como óleos voláteis. a divulgação dos métodos de esterilização de bandagens. em 1865. inicialmente desenvolvidos com o intuito da preservação do corpo à ressurreição. Anos mais tarde Pasteur explicou sobre a fermentação bacteriana e a existência de agentes infectantes como responsáveis por processos patológicos. até matar o tecido normal do hospedeiro. Bem como as células bacterianas. A descoberta do cloro na Idade Média foi amplamente utilizada como substância desodorante e anti-séptica. Uma substância anti–séptica não mata o microrganismo.PRÁTICA 6 . número de microrganismos. consequentemente. vinagres. O agente microbiano e sua respectiva concentração. Os egípcios e outros povos utilizaram várias misturas. mas inibe sua velocidade de crescimento. seu número e sua suscetibilidade. 29 . A concentração de anti-séptico em geral é baixa para evitar a lesão e irritação tecidual indesejáveis. sendo utilizado em 1847-49 em um hospital vienense quanto à demonstração prática da ação benéfica da anti-sepsia. interferindo assim com o crescimento normal do tecido de granulação na cicatrização de feridas. vinhos. resinas oleosas. USOS TERAPÊUTICOS DE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES Vários fatores podem influenciar na eficácia e/ou eficiência dos procedimentos ou agentes microbianos.

Gram negativas. são inodoros. METAIS PESADOS 30 . a concentração eficiente e a eficácia antibacteriana. 2º. podem ser usados em soluções com água e álcool. em ordem decrescente: 1º. Um pH maior do que 9 inibirá a maioria das bactérias. As atividades em soluções livres de matéria orgânica são. os detergentes catiônicos não possuem ação virucida. não agem na presença de matéria orgânica e podem causar irritação quando em contato prolongado com a pele. 3º. de apresentarem baixo custo e praticamente serem atóxicos. não possuírem ação residual e não devem ser utilizados para limpezas de ferimentos abertos. São potentes bactericidas contra micobactérias. mucosas e trato respiratório. Apesar de possuírem efeitos limitados sobre os vírus. HALOGÊNIOS Possuem efeitos antibacterianos potentes devido à alta afinidade pelo protoplasma. Gram positivas. diminuindo assim. Os surfactantes são adsorvidos em um grau significativo pelo algodão. pela borracha e materiais porosos. fungos patogênicos. anti-sépticos e desinfetantes. muitos vírus e não em esporos. SURFACTANTES É um composto químico que diminui a tensão superficial de uma solução aquosa. A presença de água é fundamental para a atividade dos álcoois (50-70%) e são mais eficazes na ausência de sujeiras e matéria orgânica. São utilizados isoladamente ou combinados com outros agentes. Não-iônicos. São antibacterianos contra microrganismos Gram negativos e ácido-resistentes. na presença de matéria orgânica o mais ativo é o Iodo. Iodo. baixa penetrabilidade. Vantagens: Não são em geral irritantes para a pele e tecidos. Cloro. há três tipos: Aniônicos : Os sabões são os mais importantes. Vantagens apresentadas referem-se ao fato de serem ótimos solventes em relação a outros agentes germicidas. baixa toxicidade. Já. Desvantagens: São neutralizados por surfactantes aniônicos (sabões). desidratantes. Bromo. ÁLCOOIS Os álcoois alifáticos comuns são bons solventes. fungicida ou esporocida. de terem ação rápida. O mecanismo de ação está relacionado à concentração do íon hidroxila. Catiônicos : Os compostos de amônio quaternário são os principais.ÁLCALIS Os álcalis foram utilizados como desinfetantes desde a antigüidade. Com base na posição hidrofóbica da molécula. mas em geral. eles são eficientes contra bactérias Gram positivas e Gram negativas. As desvantagens são: baixa atividade fungicida e virucida.

A sua ação antibacteriana está relacionada à inibição reversível da atividade enzimática essencial da bactéria e à capacidade de se combinar com íons de compostos metálicos orgânicos e inorgânicos. mertiolate. 4 zaragatoas (“Swab”) estéreis. Microscópio óptico.Derivados do mercúrio Parecem ser primariamente bacteriostáticos e apenas levemente bactericidas. É valioso para limpar e desodorizar o tecido infectado. Alça de Platina . mas não destroem esporos bacterianos. Possuem pouca atividade esporicida e são inativados por restos orgânicos. OBJETIVOS Verificar a ação de anti-sépticos no crescimento bacteriano. álcool iodado. O Permanganato de Potássio libera Oxigênio em contato com a matéria orgânica. antibacterianos pela ação do íon de prata livre e produz desnaturação de proteínas. A solução de Peróxido de Hidrogênio libera Oxigênio livre rapidamente ao entrar em contato com mucosas e superfícies sem pêlos que fornecem a enzima catalase. Inibem por pouco tempo o crescimento de microrganismos anaeróbicos. podendo haver repetições). 31 . a sua efervescência vai remover o pus e restos celulares e confere atividade germicida limitada. lâminas. ou + 3 zaragatoas estéreis. Os preparados de Prata coloidal não são corrosivos nem irritantes e são usados sobre tecidos sensíveis. Compostos de Prata Produzem efeitos cáusticos. AGENTES OXIDANTES São compostos germicidas de ação breve sobre algumas bactérias aeróbicas Gram+ e Gram-. Quando é distribuído sobre ferida com exsudato. As soluções possuem uma grande ação antibacteriana. sabão. O uso para anti-sepsia de superfícies e objetos inanimados parece imprudente já que há agentes com um modo de ação mais eficiente. bateria de Gram. MATERIAL 4 Placas com Ágar-sangue : Meio base para ágar sangue ou TSB enriquecido com 5% sangue desfibrinado de carneiro. anti-sépticos comerciais (anti-sépticos em geral disponíveis 1 para cada grupo. 3 cotonetes embrulhados em papel alumínio autoclavados. Liberam Oxigênio que se combina com a matéria orgânica se tornando inativos. A prata metálica precipita as proteínas e produz efeito irritante. bico de Bunsen. adstringentes.

PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA TEORIA Antibiogramas são bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de bactérias aos antimicrobianos. Procurar cobrir aproximadamente 4 cm de diâmetro. e o uso . Espalhar sobre a metade A da placa contendo meio Ágar sangue. Umedecer um segundo cotonete com tintura de iodo ou mertiolato e esfregar nas costas da outra mão. 2. 5. Tomar cuidado para não atingir a região não desinfectada. 6.PROCEDIMENTO 1. Faça uma lista com pelo menos seis anti-sépticos e seis desinfetantes. Espalhar o conteúdo do terceiro cotonete sobre a metade D da placa contendo ágar-sangue. numa área de mesmo diâmetro da primeira. 2. 2. 7. Observar os resultados e anotar. o nome comercial. 3. (Não se esqueça de ilustrar o que você observou!) QUESTIONÁRIO 1.Nesta lista deve conter o principal composto ativo. Esperar 4 minutos para que haja ação do anti-séptico e passar na área desinfectada um terceiro cotonete umedecido com solução fisiológica. 4. Marcar na placa o anti-séptico utilizado e o número do grupo que realizou o experimento. Incubar a placa por 24h. Analisar a Morfologia MACROSCÓPICA das colônias e MICROSPICA das bactérias após coloração de Gram. RESULTADOS Na quinta-feira: 1. Descreva duas situações: uma em que você usaria um anti-séptico e uma em que usaria um desinfetante. em estufa a 37°C. Estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a 32 . Umedecer um cotonete estéril em solução fisiológica e esfregar vigorosamente sobre as costas de uma das mãos.

Após incubação determina-se MIC e/ou MBC. discos de papel com antibióticos. ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration).Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de diluição: consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. 33 . intermediário ou resistente. OBJETIVO Analisar pelo método de difusão a ressitência de E. pinças. Introduzir nas culturas um “swab” estéril. A densidade do inóculo deve corresponder a turbidez 0.Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um teste qualitativo. PROCEDIMENTO 1. A droga se difunde no ágar e produz inibição do agente sensível.5 na escala padrão de turbidez (Escala de MacFarland). com meio Mueller-Hinton sólido. coli a alguns antibióticos. − Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias. Para a garantia desta técnica. 2. devendo-se realizar a coloração de Gram. no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar uniformemente semeado com o microrganismo. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível. alguns fatores são essenciais: − Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton. retirar o excesso de líquido comprimindo a ponta do “swab” nas paredes do tubo. placas de Petri. formando um halo de inibição que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas.atividade de novos agentes. régua. que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas. 1. cultura líquida fresca de Eschirichia coli. MATERIAIS “Swab” estéril. e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias resistentes.

Espalhar o conteúdo do “swab” sobre o meio de cultura sólido distribuído numa placa de Petri (meio Mueller-Hinton). 4. 2. registrar os dados obtidos e relacionar com a tabela abaixo: Bactéria Oxacilina OX (1µg/mL) Carbemicilina CB (100µg/mL) Discos com antibióticos Kanamicina K (30µg/mL) Rifampicina RIF (30µg/mL) Sulfonamida SUL (300µg/mL) Estreptomicina EST (10µg/mL) Escherichia coli Leituras (mm) Resultados Padrões R< 10 S> 13 R< 13 S> 17 R< 12 S> 15 R< 16 S> 20 R< 12 S> 17 R< 11 S> 15 Relate os resultados obtidos e interprete comentando. por 16 a 24 horas. Esperar a cultura sobre o agar secar bem ( 2 minutos).2. QUESTIONÁRIO 1. 5. Medir os halos formados (em mm). 4. coli testada? Por que? 5. Incubar em estufa a 37ºC . Faça um esquema da parede de uma bactéria Gram-positiva e de uma bactéria Gram-negativa? 34 . 6. Espalhar bem. O que é antibiograma e para que serve? Quais são os antibióticos beta-lactâmicos? Qual o seu modo de ação? Qual a diferença entre agente bactericida e bacteriostático? Dos antibióticos testados na experiência acima qual seria o mais indicado para o tratamento da infecção causada pela linhagem E. 3. Colocar os discos de papel contendo os antibióticos sobre a cultura seca (usar pinças). 3. de modo a obter um “tapete” de bactérias em toda a superfície do meio sólido.

A presença de substâncias antimicrobianas pode ser verificada através de extratos ou partes homogeneizadas de vegetais colocados frente a culturas de microrganismos. QUESTIONÁRIO Pesquise e relato algum outro antimicrobiano natural . Culturas: Staphylococcus sp e E. Mergulhar o cotonete na suspensão do microrganismo. Macerar o alho e a cebola. Discos de papel de filtro. em graal. Incubar a 25°C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibição. Espalhar sobre a superfície do meio com o próprio cotonete embebido na cultura. RESULTADOS Descreva as observações feitas ao final da incubação. Graal e pistilo. Cotonetes. 2. Alho e cebola. separadamente. Pode ser algum já relatado na literatura ou algum de conhecimento popular. OBJETIVO Estudar a presença de compostos antimicrobianos em vegetais.PRÁTICA 8 . 5. coli. 35 . PROCEDIMENTO 1. 4. 3. Um importante exemplo deste processo é o alho. INTRODUÇÃO Muitos vegetais contêm compostos que são inibidores de crescimento de microrganismos e exercem papel importante na resistência destes vegetais a patógenos.PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS. Embeber os discos de papel de filtro no macerado e colocá-los sobre a superfície do meio semeado. MATERIAL Placas de ágar Sabouraud.

os plasmídios mobilizáveis codificam. em um sítio específico. somente um dos conjuntos das funções encontradas nos plasmídios auto-transmissíveis para concluir a transferência. Para que uma linhagem bacteriana seja doadora. Experimentos genéticos demonstraram que todas as três classes de funcões de 36 . Os genes tra podem ser divididos em dois grandes grupos: um grupo. Como a interação mob-oriT é específica. chamado de oriT e catalisa o desenrolamento da dupla hélice. ainda que os produtos dos genes tra promovem o contacto das células doadora-aceptora e promovem um contexto físico (formação dos poros) para esta transferência. A transferência do DNA é iniciada pela ação de um gene mob que tem a atividade em romper (nicking) em uma única fita da molécula do DNA. Contudo. descoberta por Lederberg e Tatum (1946) é o processo “sexual"de transferência de genes de uma bactéria doadora para outra receptora. O processo de conjugação foi descoberto em E. Por outro lado. Concluindo. os genes tra.PRÁTICA 9 . os quais especificam proteínas envolvidas na mobilização do DNA. Um exemplo de plasmídio mobilizável é o plasmído natural ColE1 ou colicinogênico que codifica as atividades dos genes mob e seu oriT. o sítio de oriT deve ser compatível com as funcões mob presentes nas células doadoras. bem como. pode ser transferida para a célula aceptora e a outra fita permanece na célula doadora. especifica proteínas envolvidas não só na interação superficial (contacto) entre as células doadora e aceptora.CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS INTRODUÇÃO A conjugação bacteriana. Os autotransmissíveis carregam um conjunto de genes. o plasmídio mobilizável deve conter um ori T. coli K12 e o elemento extra-cromossômico responsável foi chamado de fator F (de fertilidade) ou plasmídio F. ela deve conter um plasmídio conjugativo (elemento extra-cromossômico). Esta célula doadora é diferenciada durante a conjugação pela presença de um apêndice na sua superfície chamado de pili F. Como resultado. refere-se aos genes mob. os produtos dos genes mob preparam o DNA para serem transferidos. Há dois tipos de plasmídios conjugativos: os plasmídios auto-transmissíveis e os mobilizáveis. na formação dos poros na membrana. O outro grupo. somente uma fita. cujos produtos promovem a transferência deste plasmídio para uma célula aceptora. Ambas servem como molde para sintetizar a fita complementar. para que o plasmídio possa ser transferido.

Alguns plasmídios não promovem conjugação. tra. transferem em alta frequência para esta última uma réplica ou cópia do plasmídio F. Nalr). Raramente. normalmente no cromossomo bacteriano. No primeiro caso. O fenótipo de resistência ao ácido Nalidíxico deve-se a uma mutação cromossomal. outros plasmídios conjugativos foram sendo descobertos como é o caso dos fatores ou plasmídios R ou RTF (fator de transferência de resistência). o fator F media a transferência do cromossoma da célula Hfr para a célula F-. O fator F também é raramente transferido. Linhagens a) Doadora: Linhagem de Salmonella typhimurium MG031 ( lac. Após a descoberta do fator F. Raramente. Estes plasmídios ColE1 codificam proteínas chamadas de colicinas que matam algumas linhagens sensíveis de E. Os plasmídios conjugativos após serem transferidos e replicados podem permanecerem livres (autônomos) ou integrarem-se ao cromossomo bacteriano (chamados de estado integrado). sequencialmente marcadores ou fragmentos deste cromossomo. Estes plasmídios possuem marcadores para a resistência às drogas antibacterianas e não integram-se.. 37 . coli. Por outro lado. b) Receptora: Linhagem de Escherichia coli K12 (lac+ . Placas com meio sólido. para a Escherichia coli K12 . transfere. Tetr ).conjugação. tornando-a F+. Hospeda um plasmídio que carrega o marcador que confere resistência a tetraciclina (Tcr ). Neste estado. As células F+ após contato com as células F-. mas podem ser mobilizados por outros plasmídios conjugativos. o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. mob e oriT devem estar presentes para que ocorra conjugação entre bactérias e bactérias e leveduras. OBJETIVO Tranferir de Salmonella typhimurium o plasmídio que carrega o gene que confere resistência a tetraciclina. o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. MATERIAL Tubos de ensaio . a linhagem Hfr cujo fator F está integrado ao cromossomo bacteriano. a linhagem bacteriana é chamada de F+ e no segundo Hfr ( a integração do fator F parece ser mediada por pequenas sequências chamadas de elementos IS).

0 ml da linhagem E.0ml de meio TSB. 38 . coli K12 (receptora) 2. typhimurium MG031 (doadora) e 1.1ml (diluição 10-1) em meio MacConkey -Nal-Tc 0.1 Célula doadora: S.0 ml da linhagem S. Fazer os pré-inóculos das linhagens doadoras e receptoras em 4. 3. Agitar bem e incubar por 1 hora sem agitação à temperatura de 37°C.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Tc 3.1ml (sem diluição) em meio MacConkey-Nal 0.1ml (sem diluição) em meio YT-Nal-Tc 0.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Nal 3.1ml (diluição 10-4 ) em meio MacConkey -Nal 0.2 Célula receptora: E. Fazer as seguintes semeaduras em placa contendo meio sólido: 3.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey -Tc 0.3 Mistura de conjugação (Transconjugantes): 0. typhimurium MG031 0. coli K12 0. Incubar em estufa à temperatura de 37°C por 16-24 horas (durante uma noite).Antibióticos a) Ácido Nalidíxico (Nal) usar a concentração de 10µg/ml b) Tetraciclina (Tc) usar a concentração de 50 µg/ml PROCEDIMENTO 1° Dia 1. Adicionar em um tubo de ensaio contendo 1.1ml (diluição 10-2) em meio MacConkey -Nal-Tc 4.0ml de TSB ou LB as seguintes culturas: 1.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Tc 0.1ml (sem diluição) em meio MacConkey -Nal-Tc 0. 2°Dia 1. Incubar à temperatura de 37°C por uma noite.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Nal 0.

RESULTADOS 3°Dia Analisar os resultados e determinar a freqüência de conjugação. 39 . A freqüência é determinada dividindo o número de células transconjugantes pelo número total de células receptoras.

infecção por HIV ou diabetes e que podem ser infectados por bactérias incapazes de causar infecção em pessoas sadias. ABORDAGEM CLÁSSICA Robert Koch (1877) formulou um conjunto de quatro postulados os quais afirmava deveriam ser adotados para que se aceitasse uma relação casual entre um microrganismo em particular e uma doença. O segundo postulado enfatiza a obtenção de culturas puras do patógeno. 4. A cultura pura quando inoculada em voluntário humano susceptível ou animal experimental deve produzir os sintomas da doença. tratamento com corticosteróides. 1. contudo. A mesma bactéria pode ou não satisfazer os postulados de Koch dependendo da sub-população usada como ponto de referência. Na realidade. a bactéria ou seus produtos devem ser encontrados nas partes do corpo afetados pela doença. Há algumas 40 . A bactéria deve ser isolada de lesões de uma pessoa infectada e mantida em culturas puras. ao tempo de Koch. 2. Os postulados de Koch foram originalmente desenvolvidos para identificar bactérias causadoras de epidemias como a cólera e a tuberculose. Estes postulados apresentam.POSTULADO DE KOCH Como provar que um microrganismo é responsável por uma doença? A resposta clássica é um conjunto de quatro postulados formulados por Robert Koch e posteriormente revisados com o desenvolvimento da Microbiologia. A mesma bactéria deve ser re-isolada em cultura pura dos indivíduos intencionalmente infectados. 2. A bactéria deve ser encontrada em todas as pessoas com a doença. Estes se constituíram nas primeiras abordagens que forneceram bases científicas para o estudo das doenças infecciosas. 1. a susceptibilidade do hospedeiro é tão ou mais importante que as características de virulência da bactéria: Indivíduos cujo sistema imunológico esteja seriamente comprometido por quimioterapia anti-câncer. Epidemiologia e da Genética Molecular. uma série de limitações devido ao precário conhecimento. 3. Os postulados de Koch implicam que a virulência é uma característica exclusiva das bactérias e independente do hospedeiro. dos mecanismos que regem a infectividade bacteriana.PRÁTICA 10 .

uma resposta imunológica dos indivíduos infectados contra os antígenos de superfície das bactérias observadas nas lesões provocadas pela doença. Os segundo e quarto postulados consideram que todos os membros de uma espécie bacteriana são igualmente virulentos e que somente uma única espécie causa uma determinada doença. o cultivo de uma bactéria em meio de laboratório pode causar a "perda" do fator de virulência: não expressão dos genes nas condições ambientais do meio. Alguns patógenos humanos não causam doenças em animais ou provocam sintomas diferentes daqueles observados em humanos. A combinação das tecnologia da reação em cadeia da polimerase (PCR) com as de seqüenciamento de ácidos nucléicos possibilita a detecção e identificação de bactérias não-cultiváveis e revela o agente causativo de muitas doenças. Em muitos casos não é possível a utilização de voluntários humanos e a única alternativa é a utilização de um modelo animal.doenças cujo agente causativo não pode ser cultivado em meios de laboratório ou cujo meio adequando não é. os casos nos quais uma única espécie de bactéria é a única responsável por uma doença parece mais uma exceção do que uma regra. 3. respectivamente. diferentes linhagens de uma espécie bacteriana não somente variam consideravelmente em virulência como podem causar doenças distintas. 41 . Há também. O terceiro postulado requer que a bactéria seja reinoculada em um voluntário humano ou em um animal experimental e que a reinoculação cause os sintomas da doença. 4. ainda. Antibióticos que causam o desaparecimento de sintomas também causam a eliminação da bactéria do tecido infectado. disponível: Há consideráveis evidências para implicar as bactérias Treponema pallidum e Mycobacterium leprae como causadoras da sífilis e hanseníase. se houver um disponível. os mesmos sintomas podem ser causados por diferentes espécies de bactérias e há doenças cujas lesões são causados por uma mistura de diferentes linhagens (infecções polimicrobianas).

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