LAPORAN RESMI FARMAKOLOGI EKSPERIMENTAL II

PENETAPAN WAKTU PENGAMBILAN CUPLIKAN, ASUMSI MODEL KOMPARTEMEN DAN PEMILIHAN DOSIS DALAM FARMAKOKINETIKA

Dosen pembimbing Asisten koreksi Tanggal praktikum

: : Widi dan Ummi : 2 Desember 2011

Disusun oleh: Golongan IV Kelompok 4 1. Muthyahara Addunya ( FA/08651 ) 2. Tintani Bunga Restika ( FA/08654 ) 3. R. Arindra Hanuraga ( FA/08657 ) 4. Rifki Bahtiar ( FA/08660 )

LABORATORIUM FARMAKOLOGI DAN TOKSIKOLOGI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS GADJAH MADA

YOGYAKARTA 2011

PENETAPAN WAKTU PENGAMBILAN CUPLIKAN DAN ASUMSI MODEL KOMPARTEMEN SERTA PEMILIHAN DOSIS DALAM FARMAKOKINETIK
I. TUJUAN
1. Agar mahasiswa mampu memperkirakan model kompartemen berdasarkan kurva semilogaritmik kadar obat dalam plasma/darah lawan waktu. 2. Agar mahasiswa mampu menetapkan jadwal dan jumlah pencuplikan untuk pengukuran parameter farmakokinetik berdasarkan model kompartemen suatu obat. 3. Agar mahasiswa mampu menggunakan dosis yang tepat untuk subyek uji.

II. DASAR TEORI

Model Farmakokinetik merupakan suatu hubungan matematik yang menggambarkan perubahan konsentrasi terhadap waktu dalam sistem yang diperiksa (Mutschler, 1991). Metode analisis kompartemental digunakan untuk memperkirakan dan menentukan secara kuantitatif apa yang terjadi terhadap obat sebagai fungsi waktu dari saat diberikan sampai waktu dimana obat tersebut sudah tidak ada lagi di dalam tubuh. Model-model kompartemen merupakan salah satu model farmakokinetik dengan pointpoint sebagai berikut : 1. Tubuh dinyatakan sebagai suatu susunan atau sistem dari kompartemen-kompartemen yang berhubungan secara timbal balik. 2. Suatu kompartemen bukan suatu daerah fisiologis/anatomi yang nyata, tetapi dianggap sebagai suatu jaringan yang memiliki perfusi dan afinitas obat yang sama. 3. Obat didistribusikan secara merata dalam kompartemen. 4. Pencampuran obat dalam kompartemen terjadi secara cepat dan homogen. Tiap molekul mempunyai kemungkinan yang sama untuk meninggalkan kompartemen. 5. Obat keluar masuk secara dinamik. 6. Tetapan laju reaksi digunakan untuk menyatakan semua laju obat masuk dan keluar kompartemen. 7. Model merupakan suatu sistem terbuka jika dapat dieliminasi dari sistem itu. Eliminasi selalu terjadi dari kompartemen sentral. Variabel dalam farmakokinetik terdapat dua macam, yaitu variabel tergantung dan variabel bebas. Dalam praktek parameter farmakokinetik tidak ditentukan secara langsung, tetapi ditentukan melalui percobaan dari sejumlah variabel tergantung dan bebas, yang secara

bersama dikenal sebagai data. Melalui data dapat diperkirakan model farmakokinetik yang kemudian diuji kebenarannya dan selanjutnya diperoleh parameter-parameter farmakokinetiknya. Variabel bebas meliputi variabel interval dan variabel eksternal. Kedua variabel ini secara langsung mempengaruhi parameter primer, yang terdiri dari Ka (kecepatan absorpsi), Vd (volume distribusi) dan Cl (clearance). Parameter primer mempengaruhi parameter sekunder dan parameter turunan. Parameter sekunder terdiri dari T1/2 (waktu paruh eliminasi) dan F eliminasi. Parameter turunan terdiri dari AUC (Area Under Curve), F oral dan Css (kadar obat dalam darah). Sehingga parameter primer, parameter sekunder dan parameter turunan merupakan variabel tergantung. Parameter primer meliputi : 1. Ka (kecepatan absorpsi) Merupakan tetapan kecepatan absorpsi yang ditentukan oleh : a. Variabel internal Meliputi surface area (luas permukaan absorpsi), perfusi darah, kecepatan peristaltik usus dan kecepatan pengososngan lambung. b. Variable eksternal Meliputi sifat obat itu sendiri (lipofilik atau hidrofilik) dan makanan/minuman. 2. Vd (volume distribusi) Merupakan parameter yang menerangkan seberapa luas suatu obat terdistribusi dalam tubuh. Volume ini tidak bermakna faal atau tidak ada kaitannya dengan faal. Volume distribusi dipengaruhi oleh : a. Perfusi darah Yaitu seberapa cepat dan banyak obat masuk dalam darah. b. Lipofilitas obat c. Seberapa kuat obat terikat oleh protein plasma, protein darah maupun protein jaringan. 3. Cl (clearance/klirens) Merupakan parameter yang menerangkan pembersihan kandungan obat dalam suatu volume distribusi dalam satuan volume atau waktu (ml/menit, ml/jam, liter/jam). Parameter ini menunjukkan kemampuan tubuh untuk mengeliminasi obat. Cl = Cl hepar + Cl renal + Cl lain-lain Cl dapat berubah yang dapat disebabkan oleh : a. Kegagalan ginjal, b. Perubahan enzim, c. Aliran darah yang masuk organ eliminasi, d. Kekuatan organ/kapasitas organ eliminasi. Parameter sekunder meliputi : 1. T1/2 eliminasi (waktu paruh eliminasi)

Adalah waktu yang diperlukan untuk mengubah jumlah obat dalam tubuh menjadi separuhnya selama eliminasi dan merupakan parameter kedua setelah klirens. 2. F el (fraksi eliminasi) Merupakan fraksi dari dosis obat yang mencapai peredaran darah dalam bentuk aktif setelah eliminasi (bioavailibilitas). Jumlah parameter yang diperlukan untuk menggambarkan model bergantung pada kerumitan proses dan rute pemberian obat. Dalam praktek, terdapat suatu batasan pada jumlah data yang mungkin diperoleh. Bila jumlah parameter yang dinilai bertambah maka ketelitian penghitungan parameter ini menjadi lebih sulit. Agar parameter-parameter menjadi sahih, jumlah titik-titik data seharusnya selalu melebihi jumlah parameter dalam model (Shargel, 1995). Pada percobaan ini diperlukan penetapan model farmakokinetik karena model farmakokinetik memiliki beberapa kegunaan, untuk : 1. Memperkirakan kadar obat dalam plasma, jaringan dan urin pada berbagai pengaturan dosis. 2. Menghitung pengaturan dosis optimum untuk tiap penderita secara individual. 3. Memperkirakan kemungkinan akumulasi obat dan atau metabolit-metabolit. 4. Menghubungkan konsentrasi obat dengan aktivitas farmakologik atau toksikologik. 5. Menilai perbedaan laju atau tingkat availibilitas antar formulasi (bioekivalensi). 6. Menggambarkan perubahan faal atau penyakit yang mempengaruhi absorpsi, distribusi atau eliminasi obat. 7. Menjelaskan interaksi obat. (Shargel, 1998) Macam-macam model kompartemen : a. Model Mammillary Model Mammillary merupakan model kompartemen yang paling umum digunakan dalam farmakokinetika. Model terdiri atas satu atau lebih kompartemen perifer yang dihubungkan ke suatu kompartemen sentral. Kompartemen sentral mewakili plasma dan jaringan-jaringan yang perfusinya tinggi dan secara cepat berkesetimbangan dengan obat. Model Mammillary dapat dianggap sebagai suatu sistem yang berhubungan secara erat, karena jumlah obat dalam setiap kompartemen dalam sistem tersebut dapat diperkirakan setelah obat dimasukkan ke dalam suatu kompartemen tertentu. Bila suatu obat diberikan secara IV, obat secara langsung masuk ke dalam kompartemen sentral. Eliminasi obat dari kompartemen sentral terjadi oleh karena organ-organ yang terlibat dalam eliminasi obat terutama ginjal dan hati, merupakan jaringan yang diperfusi secara baik. Tetapan laju dari farmakokinetika dinyatakan dengan huruf K. Kompartemen satu mewakili plasma atau kompartemen sentral, sedamgkan kompartemen dua mewakili kompartemen jaringan. Penggambaran model ini mempunyai tiga kegunaan, yaitu : - memungkinkan ahli farmakokinetika merumuskan persaman diferensial untuk menggambarkan perubahan konsentrasi obat dalam masing-masing kompartemen, - memberikan suatu gambaran nyata dari laju proses, dan

menunjukkan berapa banyak tetapan menggambarkan proses secara memadai.

1 k

farmakokinetik

yang

diperlukan

untuk

Model 1. Model kompartemen satu terbuka, injeksi IV

Ka 1 K

Model 2. Model kompartemen satu terbuka denagn absorpsi order kesatu

K12 1 K21 2

Model 3. Model kompartemen dua terbuka, injeksi IV

Ka K12 1 K21 2

Model 4. Model kompartemen dua terbuka dengan absorpsi order kesatu B. Model Catenary Dalam farmakokinetika model mammillary harus dibedakan dengan macam model kompartemen yang lain yang disebut model catenary. Model Catenary terdiri atas kompartemen-kompartemen yang bergabung satu dengan yang lain menjadi satu deretan kompartemen. Sebaliknya, model mammillary terdiri atas satu atau lebih kompartemen yang mengelilingi suatu kompartemen sentral seperti satelit. Oleh karena itu model catenary tidak dapat dipakai pada sebagia besar organ yang fungsional dalam tubuh yang secara langsung berhubungan dengan plasma, model ini digunakan tidak sesering model mammillary.

K21 K12 1 2

K23

Ka

K32

C. Model Fisiologi Model fisiologi juga dikenal sebagai model aliran darah atau model perfusi, merupakan model farmakokinetik yang didasarkan atas data anatomik dan fisiologik yang diketahui. Perbedaan utama antara model perfusi dan model kompartemen yang lazim adalah sebagai berikut. Pertama, tidak dibutuhkan data yang tepat dalam model perfusi. Konsentrasi obat dalam berbagai jaringan diperkirakan melalui ukuran jaringan organ, aliran darah, dan melalui percobaan ditentukan perbandingan obat dalam jaringan darah (yakni partisi obat antara jaringan dan darah). Kedua, aliran darah, ukuran jaringan dan perbandingan obat dalam jaringan darah dapat berbeda sehubungan dengan kondisi patofisiologik tertentu. Oleh karena itu, dalam model fisiologik pengaruh perubahan-perubahan ini terhadap distribusi obat harus diperhitungkan. Ketiga, dan yang terpenting dari semuanya, model farmakokinetik dengan dasar fisiologik dapat diterapkan pada beberapa spesies, dan dengan beberapa data obat pada manusia dapat diekstrapolasikan. Jumlah kompartemen jaringan dalam suatu model perfusi berbeda-beda bergantung obatnya. Sebagai ciri khas, jaringan atau organ yang tidak ditembus obat dikeluarkan dari model ini. Dengan demikian organ-organ seperti otak, tulang-tulang, dan bagian-bagian lain sistem saraf pusat sering tidak dimasukkan dalam model karena hampir semua obat mempunyai daya tembus yang kecil ke dalam organ-organ tersebut. Makna yang nyata dari model fisiologik adalah dapat digunakannya model ini dalam memprakirakan farmakokinetik pada manusia dari data hewan. Besarnya berbagai organ tubuh atau jaringan, tingkat ikatan protein, kapasitas metaboisme obat, dan aliran darah pada manusia dan spesies lain seringkali telah diketahui atau dapat ditentukan. Jadi, parameterparameter, fisiologik dan anatomik dapat digunakan untuk memprakirakan efek obat pada manusia berdasar efek obat pada hewan. Waktu pengambilan obat dalam media cairan hayati (waktu sampling) dan perkiraan model kompartemen memiliki hubungan keterkaitan. Keterkaitan kedua faktor ini sedemikian rupa sehingga apabila terjadi kesalahan waktu pengambilan cuplikan, maka dapat menyebabkan kesalahan pula pada penentuan model kompartemen. Untuk menghindari kesalahan dalam penetapan model farmakokinetik, terutama untuk obat yang diberikan secara intravena, waktu sampling hendaknya dilakukan sedini mungkin sesudah pemberian obat. Untuk percobaan pendahuluan lama pengambilan cuplikan perlu diperhatikan. Jika sebagai cuplikan digunakan darah, pencuplikan dilakukan 3-5 kali T1/2 eliminasi obat karena diasumsikan kadar obat yang dapat dianalisis pada waktu tersebut mencapai 90-95% kadar obat total. Jika digunakan urin, pencuplikan dilakukan 7-10 kali T1/2 eliminasi obat berdasarkan asumsi bahwa pada waktu tersebut kadar obat yang diekskresikan sudah mencapai 99% kadar

obat total. Sedangkan pada percobaan pendahuluan sebaiknya waktu sampling dicari setelah pemberian intravena. Dalam waktu sampling perlu ditetapkan interval pengambilan dan lamanya waktu pengambilan sampling. Untuk hasil terbaik pada ektravaskuler, perlu diambil pada dua belas titik, yaitu tiga titik pada tiap tahap absorpsi, sekitar puncak, distribusi dan eliminasi, untuk model dua kompartemen. Sedangkan untuk model satu kompartemen, diambil pada sembilan titik yaitu tiga titik pada tiap tahap absorpsi, sekitar puncak dan eliminasi. Data yang diperoleh dari hasil percobaan pendahuluan tersebut selanjutnya digunakan untuk memperkirakan model kompartemen suatu obat dalam farmakokinetiknya, yaitu dengan memplotkan kadar obat dalam darah vs waktu pada kertas semilogaritma atau plot log kecepatan ekskresi (dDE/dt) vs waktu pada kertas grafik normal jika digunakan data urin. Satu kompartemen
Dua kompartemen

INTRA VASKULER

EKSTRA VASKULER

1. Model 1 kompartemen Tubuh dianggap sebagai 1 kompartemen tempat obat menyebar dengan seketika dan merata ke seluruh cairan dan jaringan tubuh. Model ini terlalu disederhanakan sehingga untuk kebanyakan obat kurang tepat. 2. Model 2 kompartemen Tubuh dianggap terdiri atas kompartemen sentral dan perifer. Kompartemen sentral terdiri dari darah dan berbagai jaringan yang banyak dialiri darah seperti jantung, hati ginjal dan kelenjar-kelenjar endokrin. Obat tersebar dan mencapai kesetimbangan dengan cepat. Komponen perifer adalah berbagai jaringan yang kurang dialiri darah misalnya otot, kulit, dan jaringan lemak, sehingga obat lambat masuk ke dalamnya. Model ini prinsipnya sama dengan model 1

kompartemen, bedanya hanya dalam proses distribusi karena adanya kompartemen perifer; eliminasi tetap dari kompartemen sentral. Model ini cocok untuk banyak obat. 3. Model 3 kompartemen Kompartemen perifer dibagi atas kompartemen perifer yang dangkal (kompartemen 2) dan kompartemen perifer yang dalam (kompartemen 3). Untuk perhitungan regimen dosis klinik, biasanya digunakan model 1 kompartemen untuk pemberian peroral dan kompartemen 2 untuk pemberian intravena. Pada pemberian bolus intravena, biasanya fase distribusi terlihat jelas (menandakan 2 kompartemen), sedangkan pada pemberian oral, fase distribusinya sering tertutup oleh fase absorpsi. Dalam model kompartemen terbuka, tubuh diasumsikan sebagai kompartemen terbuka, seluruh kompartemen badan dianggap sebagai kompartemen sentral. Dalam hal ini kompartemen sentral didefinisikan sebagai jumlah seluruh bagian tubuh (organ dan jaringan atau bagian lainnya) dimana kadar obat segera berada dalam kesetimbangan dengan yang ada dalam plasma/darah. Model dua kompartemen terbuka berarti badan diasumsikan terbagi menjadi dua bagian kompartemen yaitu kompartemen sentral dan kompartemen perifer. Kompartemen perifer merupakan jumlah seluruh bagian tubuh (organ dan jaringan atau bagian lainnya) kemana obat akhirnya akan menyebar tetapi tidak segera dalam kesetimbangan. Pemberian dosis harus diperhatikan karena berkaitan dengan salah satu syarat metode yaitu sensitifitas metode. Hal ini disebabkan karena besarnya dosis yang digunakan harus memungkinkan obat dapat terdeteksi. Di samping itu ada juga beberapa obat yang kinetikanya tergantung dari dosis sehingga harus ditetapkan jumlah dosis yang akan diberikan agar memperoleh efek terapeutik. Pemilihan dosis dapat mengacu pada LD50 obat yang akan diuji. Perbandingan harga LD50 oral lawan intravena dapat digunakan untuk memperoleh gambaran tentang absorbabilitas obat sebagai fungsi dari pemberian peroral. Jika informasi ini tidak tersedia dapat digunakan dosis awal 5-10 % dari LD50 intravena (Kaplan, 1973). Hal yang perlu diperhatikan adalah apakah metode analisis mendukung besaran dosis tersebut sehingga fase eliminasi kadar obat masih dapat dimonitor. Dosis awal ini kemudian dinaikkan menurut besaran tertentu untuk mendeteksi timbulnya kinetika tergantung dosis (dose dependent farmacocinetic). Untuk obat-obat yang mudah mengalami saturasi dalam sistem transportasi dan eliminasinya (misalnya fenitoin, warfarin, dan seftriakson), kenaikan nilai-nilai parameter kinetiknya (misalnya AUC, T1/2) tidak sebanding dengan kenaikan dosis. Pemilihan dosis juga harus memperhatikan adanya fenomena kinetika yang tergantung dosis, yaitu fenomena yang menunjukkan adanya perubahan parameter farmakokinetika obat bila dosisnya berubah. Keadaan ini berkaitan dengan asumsi orde kinetika obat tersebut. Kinetika diasumsikan mengikuti orde nol bila menunjukkan fenomena tergantung dosis (dependent dose). Tapi bila parameter farmakokinetik obat tidak dipengaruhi oleh perubahan dosis (independent dose), maka dianggap mengikuti orde pertama. Hal ini dapat diketahui

dengan membandingkan harga waktu paruh eliminasi (T1/2) obat setelah pemberian beberapa dosis yang berbeda. Jika harga T1/2 yang diperoleh berbeda akibat perbedaan dosis yang diberikan, maka kinetik obat tersebut menunjukkan fenomena tergantung dosis (dependent dose).

III. ALAT DAN BAHAN Alat yang digunakan : labu takar 100 ml pipet volume 0.1; 0,2; 1; 2 ml tabung reaksi /flakon pipet ukur 5 ml spektrofotometer UV-VIS kuvet skapel/silet alat pemusing/sentrifuge stopwatch tempat tikus (rat holder) ependorf alat injeksi alat untuk peroral kalkulator kertas grafik numerik dan semilog vortex Bahan yang digunakan : - darah tikus - urine probandus - heparine - sulfametoksazol - asam trikloroasetat (TCA) 20% - natrium nitrit (NaNO2) 0,1% - ammonium sulfamat 0,5% -NED 0,1%

D. CARA KERJA 1. Pembuatan kurva baku darah Buat seri kadar baku SMZ yaitu : 5,10,25,50,100 dan 200 g/ml dengan mengencerkan larutan SMZ 1,0 mg/ml menggunakan aquadest

Ambillah masing-masing kadar SMZ diatas sebanyak 0,25 ml kemudian masukkan dalam tabung reaksi.

Tambah aquadest dan Tambahkan TCA 10% 0,2 ml lalu vortex dan disentifugasi 10 menit 2500rpm

Tambahkan NaNO2 0,1% 0,1 ml dan diamkan selama 3 menit Tambahkan ammonium sulfamat 0,5% 0,2 ml dan diamkan selama 2 menit

Tambahkan NED 0,1% 0,2 ml dan diamkan selama 5 menit Baca absorbansinya pada 545 nm pada spektrofotometer

Dibuat persamaan kurva baku : absorbansi terkoreksi vs kadar Y=Bx + A

2. Penentuan Model Kompartemen SMZ Kelinci ditimbang

Dibersihkan bulu disekitar telinga

Diambil 0,25 ml darah dari vena pada telinga kelinci untuk blangko

Disuntuikkan SMZ secara peroral dengan dosis 50 mg/kg BB dan 100 mg/kgBB Diambil cuplikan (0,25 ml darah) 2 jam setelah penyuntikkan, yaitu : 5, 10,15, 30. 45, 60, 75, 90, 120

Kadar SMZ diukur (metode Bratton-Marshall) yaitu: sampel + TCA 10% 0,2 ml, lalu divortex 30 detik kemudian sentrifuge 2500 rpm selama 10 menit

Beningan diambil 0,2 ml, dimasukkan ke flakon bersih

Ditambah NaNO2 0,1% 0,5 ml lalu diamkan selama 3 menit Ditambah Ammonium sulfamat 0,5 % 0,5 ml lalu diamkan selama 2 menit

Ditambah NED 0,1 % sebanyak 2 ml lalu diamkan selama 5 menit Dibaca serapannya pada 545 nm dengan spektrofotometer

Dibuat kurva waktu vs kadar ( dari persamaan kurva baku)

Dihitung parameter-parameter farmakokinetiknya

Tentukan model kompartemen dan jadwal pencupikan yang tepat

IV.DATA DAN PERHITUNGAN

Kurva Baku Kelinci : Kadar Absorbansi 5 0.023 10 0.020 25 0.033 50* 0.848 100* 0.888 200 0.894 Data diatasdicariregresiliniernya, tetapipada data 50 dan 100 di reject, menjadi,

Kurva baku Kelinci

1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 -0.1 0

Kadar Linear (Kadar) y = 0.0046x - 0.0347 R = 0.9937

50

100

150

200

250

Data PercobaanKelompok : - PerhitunganDosis LarutanStok : 50 mg/ml dan 25 mg/ml DosisSulfametosazol : 50 mg/kgBBdan 100 mg/kgBB Berattikus : 2,33 kg dan 2,4 kg Dosis yang diberikandapatdihitungdenganrumus : ( ) ( ) ( ( ) )

HasilPengamatanSampelDarah Absorbansi 50 100 0 0 0.094 0.155 0.134 0.129 0.08 0.131 0.077 0.127 0.089 0.167 0.146 0.118 Kadar (Cp)(g/ml) 50 100 0 0 32.00 47.25 42.00 40.75 28.50 41.25 27.75 40.25 30.75 50.25 45.00 38.00 Ln Cp 50 100 0 0 3.465736 3.855453 3.737670 3.707456 3.349904 3.719651 3.323236 3.695110 3.425890 3.917011 3.806662 3.637586 -

Waktu 0 5 10 15 30 45 60 75 90 120 -

ProfilKurvaObatDalamdarah :

Profil Obat kadar 50

100

10

log Cp

1 0' 10' 20' 30' 40' 50'

Profil Obat kadar 100

100

10

log Cp

Perhitungan Parameter-Parameter Farmakokinetikapadadosis 50 mg/kgBB : 0' 20' 40' 60' 80'

# Persamaan regresi linear antara Ln Cp vs t ( pada saat fase eliminasi, yaitu saat t10, t30, t45)

*Data pada t15 di reject

Kurva Ln Cp vs t dosis 50
3.80 3.75 3.70 3.65 3.60 3.55 3.50 3.45 3.40 3.35 3.30 0 10 20

y = -0.0095x + 3.7661 R = 0.6032

Ln Cp Linear (Ln Cp)

30

40

50

Persamaankurvabaku yang didapatadalah y = -0,0095x + 3,7661 Persamaanawalnyaadalah, Sehingga, K = 0,0095/ menit Ln B = 3,7661 B = 43.206

# Untukfaseabsorbsidigunakan data padasaat t5, t15, dan t30

Untuk t5 : Ln Cp = 3,7661 0,0095 ( 5 ) Ln Cp = 3,7186 Cp = 41,207

, Cr = Cp - Cp Cr = 41,207 32,000 Cr = 9,21, ln Cr = 2,220 , Cr = Cp - Cp Cr = 37,472 28,500 Cr = 8.97, ln Cr = 2.194 , Cr = Cp - Cp Cr = 32,495 27,750 Cr = 4,75, ln Cr = 1,557

Untuk t15 : Ln Cp = 3,7661 0,0095( 15 ) Ln Cp = 3,6236 Cp = 37,472

Untuk t30 : Ln Cp = 3,7661 0,0095( 30 ) Ln Cp = 3,4811 Cp = 32,495

Kurva Ln Cr vs t
2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 10 20 30 40 y = -0.0278x + 2.4532 R = 0.8663 Ln Cr Linear (Ln Cr)

Persamaankurvabaku yang didapatadalah y = -0,0278x + 2,4532 Persamaanawalnyaadalah, Sehingga, Ka = 0,0278/ menit

# ParameterFarmakokinetik :

Ln A = 2,4532

A = 11.625

ataudengancaralain, ( ( ) ( ) ( ) ( ( ) ) )

AUC0-~ = Jumlah AUC0-5 AUC45-~ = 4559,717g menit/ml t sampling yang baikuntuksampeldarah = 3 5 kali t1/2 eliminasi = (3 x 72,9629) menit s/d (5 x 72,9629) menit = 218,889 menit s/d 364,814 menit K12 = Ka + K K + K21 = 0,0278 + 0,0095 0,0111 + 0,0239 = 0,0723
# Penentuan model kompartemen berdasarkan persamaan notary :
( ) ( )

Jika K21 + K12< 20 K , maka merupakan model 2 kompartemen Jika K21 + K12> 20 K , maka merupakan model 1 kompartemen Berdasarkan hasil perhitungan terhadap data pada dosis 50 mg/kgBB : 0,0239 + 0,0723< 20 . 0,0111 0,0962< 0,222 , sehingga didapatkan model 1 kompartemen

Perhitungan Parameter-Parameter Farmakokinetikapadadosis 100 mg/kgBB :

# Persamaan regresi linear antara Ln Cp vs t ( pada saat fase eliminasi, yaitu saat t45, t60, t75)

Kurva Ln Cp vs t dosis 100

3.95 3.90 3.85 3.80 3.75 3.70 3.65 3.60 0 20 40 60 80 y = -0.0093x + 4.3459 R = 0.9855 Ln Cp Linear (Ln Cp)

Persamaankurvabaku yang didapatadalah y = -0,0093x + 4.3459 Persamaanawalnyaadalah, Sehingga, K = 0,0093/ menit Ln B = 4,3459 B = 77,161

# Untukfaseabsorbsidigunakan data padasaat t5, t10, t15, dan t30

Untuk t5 : Ln Cp = 4,3459 0,0093( 5 ) , Cr = Cp - Cp Ln Cp = 4,2994 Cp = 73,655 Cr = 73,655 47,250 Cr = 26,41, ln Cr = 3.273 , Cr = Cp - Cp Cr = 70,309 40,750 Cr = 29,56, ln Cr = 3,386 , Cr = Cp - Cp Cr = 67,114 41,250 Cr = 29,56, ln Cr = 3,386 , Cr = Cp - Cp

Untuk t10: Ln Cp = 4,3459 0,0093( 10 ) Ln Cp = 4,253 Cp = 70,309

Untuk t15: Ln Cp = 4,3459 0,0093( 15 ) Ln Cp = 4,206 Cp = 67,114

Untuk t30 : Ln Cp = 4,3459 0,0093 ( 30 ) Ln Cp = 4,067 Cp = 58,376

Cr = 58,376 40,250 Cr = 18,13, ln Cr = 2.897

Kurva Ln Cr vs t
3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3 2.9 2.8 0 10 20 30 40 y = -0.0243x + 3.624 R = 0.9994 Ln Cr Linear (Ln Cr)

Persamaankurvabaku yang didapatadalah y = -0,0243x + 3,624 Persamaanawalnyaadalah, Sehingga, Ka = 0,0243/menit

# ParameterFarmakokinetik :
( ) ( )

Ln A = 3,624

A = 37.487

ataudengancaralain, ( ( ) ( ) ( ) ( ( ( ) ) ) )

AUC0-~ = Jumlah AUC0-5 AUC60-75 = 7080,021g menit/ml t sampling yang baikuntuksampeldarah = 3 5 kali t1/2 eliminasi = (3 x 74,5161) menit s/d (5 x 74,5161) menit = 233,548 menit s/d 372,5805menit K12 = Ka + K K + K21 = 0,0243 + 0,0093 0,0116 + 0,0194 = 0,0414
# Penentuan model kompartemen berdasarkan persamaan notary :
( ) ( )

Jika K21 + K12< 20 K , maka merupakan model 2 kompartemen Jika K21 + K12> 20 K , maka merupakan model 1 kompartemen Berdasarkan hasil perhitungan terhadap data pada dosis 100 mg/kgBB : 0,0194 + 0,0414< 20 . 0,0116 0,0608< 0,232 , sehingga didapatkan model 1 kompartemen

V. PEMBAHASAN Pemerian bahan: 1. Sulfametoksazol Sulfametoxazol mengandung tidak kurang dari 99,0 % dan tidak lebih dari 101,0 % C10H11N3O3S, dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan. Pemerian : serbuk hablur, putih sampai hampir putih; praktis tidak berbau, titik lebur antara 168o- 172o C Kelarutan : praktis tidak larut dalam air, dalam eter dan kloroform; mudah larut dalam aseton dan larutan natrium hidroksida encer; agak sukar larut dalam etanol. ( Farmakope edisi IV 1995 ) Sulfametoxazol merupakan derivat isoksazol dengan pengikatan protein 65 %. Plasma t1/2 nya kurang lebih 10 jam dan dieksresi dalam kemih, 25 %-nya dalam keadaan utuh dan 60 %-nya sebagai metabolit asetilnya. Zat ini sering digunakan terkombinasi dengan trimetoprim. Kotrimoksazol merupakan kombinasi dari sulfametoxazol dan trimetoprim dalam perbandingan 5:1 bersifat bakterisid dengan spektrum kerja lebih lebar dibandingkan sulfonamid. ( Obat-obat Penting 2002 ) Sulfametoxazol mempunyai waktu paruh 9-12 jam dengan konsentrasi maksimal dalam plasma tercapai 4 jam setelah pemberian. Sulfametoxazol dapat diabsorbsi hampir sempurna sampai 95 %, 24 jam setelah pemberian 25-50 % berada di urin dan setelah 78 jam, 85 % dieksresikan melalui urin dalam bentuk utuh. Sulfametoksazol diabsorpsi dan diekskresi lebih lambat dari sulfadiazin. Sulfonamid biasa digunakan untuk antimikroba, contoh lainnya adalah trimetoprim, asam p-aminosalisilat (PAS) dan sulfon. Mekanisme kerjanya sebagai antimikroba yang menghambat metabolisme sel mikroba dan diperoleh efek bakteriostatik. Mikroba memerlukan PABA (p-amino benzoic acid) untuk membentuk asam folat yang diperlukan dalam sintesis protein demi kelangsungan hidupnya. Segolongan mikroba dapat memanfaatkan asam folat yang terdapat dalam lingkungannya, sedangkan segolongan lagi tidak, sehingga harus mensintesisnya sendiri. Sulfonamid aktif terhadap golongan terakhir ini. Sulfonamid dan sulfon merupakan penghambat bersaing PABA. Efek antibakteri sulfonamid dihambat oleh darah, nanah dan jaringan nekrotik, karena kebutuhan bakteri akan asam folat berkurang dalam media yang mengandung basa purin dan pirimidin. Sel-sel mamalia tidak dipengaruhi oleh sulfonamida karena menggunakan folat jadi yang terdapat dalam makanan ( tidak mensintesis senyawa folat sendiri ). Dalam proses sintesis asam folat, bila PABA digantikan oleh sulfonamida maka akan terbentuk analog asam folat yang nonfungsional, akibatnya kehidupan

mikroba akan terganggu. Untuk dapat bekerja, asam folat harus diubah menjadi bentuk aktifnya yaitu asam tetrahidrofolat (THFA) dalam dua tahap. Pada tahap terakhir enzim dihidrofolat reduktase dihambat oleh trimetoprim, sehingga asam dihidrofolat tidak dapat direduksi menjadi asam tetrahidrofolat yang fungsional. Dehidropteroat sintetase PABA Sulfonamid berkompetisi dengan PABA

Asam dihidrofolat

Trimetoprim

Dihidrofolat sintetase Asam tetrahidrofolat (THFA)

Purin

DNA

( Farmakologi dan Terapi 1995) 2. Heparin Heparin adalah garam natrium dari glukosaminoglikan sulfat dari campuran mukopolisakarida dengan bobot molekul baervariasi. Terdapat dalam jaringan tubuh mamalia dan umumnya diperoleh dari mukosa usus halus atau jaringan tubuh lain yang sesuai dari mamalia yang dapat dimakan oleh manusia. Terdiri dari komponen polimer dari turunan berseling D-glukosamina(Ntersulfatasi atau N-terasetilasi) dan asam uronat (asam Liduronat atau D-glukoronat) berikatan dengan ikatan glikosida. Merupakan campuran zat aktif yang mempunyai sifat memperlambat waktu jendal darah terutama melalui pembentukan kompleks dengan protein plasma, Antitrombin III, dan memperkuat inaktivasi Trombin dan memperkuat inaktivasi Trombin dan menghambat enzim protease koagulasi seperti Faktor X teraktivasi dalam urutan penjendalan. Potensi heparin-natrium dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan, tidak kurang dari 140 unit Heparin F1 per mg dan tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket. Pemerian: serbuk amorf putih atau pucat, tidak berbau atau praktis tidak berbau, higroskopis.

Wadah dan penyimpanan: dalam wadah tertutup rapat. Simpan dibawah suhu 400C, sebaiknya pada suhu antara 15-300C, kecuali jika dinyatakan lain oleh pabrik pembuat (Anonim,1995) 3. TCA (Three Chloro-acetic Acid/ Asam Trikloroasetat) CCl3COOH Asam trikloroasetat mengandung tidak kurang dari 98,0% CCl3COOH Pemerian: hablur atau massa hablur, sangat rapuh, tidak berwarna, rasa lemah atau getir dan khas. Kelarutan: sangat mudah larut dalam air, dalam etanol(95%)P, dan dalam eter P. (Anonim,1979) 4. Ammonium Sulfamate

Formula Nama lain Pemerian Kelarutan

: H6N2O3S : Sulfamic acid monoammonium salt; AMS; Amcide; Ammte : kristak higroskopis : luar biasa larut air, cairan ammonia; sedikit larut dalam etanol cukup larut dalam gliserol, glikol, formamide, Ph dari larutan 0,2 M dalam air adalah 4,9; larutan encer stabil saat mendidih. Terbuat dari ammonia dan asam sulfamat. (Merck Index vol 10) 5. Natrium nitrit Nama lain : sodium nitrit, nitrous acid sodium salt, erinitrit, NaNO2 Pemerian : putih atau sedikit kuning, granul higroskopis, batang atau serbuk, sangat lambat teroksidasi menjadi nitrit di udara. Kelarutan : larut dalam 1,5 bagian air dingin; 0,6 bagian air mendidih; sedikit larut dalam alcohol; membusuk oleh asam lemah dengan evolusi dari uap coklat N2O3; larutan encer bersifat alkalis, pH sekitar 9. (Anonim,1996) Obat berada dalam keadaan dinamik dalam tubuh. Efek obat dalam tubuh pada dasarnya merupakan akibat interaksi obat dengan reseptornya; maka secara teoritis intensitas efek obat, baik efek terapi maupun efek toksik, tergantung dari kadar obat di tempat reseptor atau tempat kerjanya. Oleh karena kadar obat di tempat kerja belum dapat diukur, maka sebagai penggantinya diambil kadar obat dalam plasma atau serum yang umumnya dalam

keseimbangan dengan kadarnya di tempat kerja. Pada kebanyakan obat, terdapat hubungan linear antara efek farmakologik obat dengan kadarnya dalam plasma atau serum. Tetapi tidak demikian halnya antara efek dengan dosis obat. Hal ini disebabkan karena kadar obat dalam plasma ditentukan tidak hanya oleh dosis obat, tetapi juga oleh faktor-faktor farmakokinetik yang ternyata sangat bervariasi antar individu. Dalam suatu sistem biologik, peristiwa-peristiwa yang dialami obat sering terjadi secara serentak. Dalam menggambarkan sistem biologik yang kompleks tersebut, dibuat penyederhanaan anggapan pergerakan obat dalam tubuh dengan model yang disusun secara matematik yang memberi arti singkat dari pernyataan hubungan kuantitatif. Farmakokinetik menggunakan model tersebut untuk menguraikan proses-proses absorpsi, distribusi, biotransformasi dan ekskresi, dan mempekirakan besarnya kadar obat dalam plasma sebagai fungsi dari besarnya dosis, interval pemberian dan waktu. Suatu model kompartemen dapat digunakan untuk mengetahui dan memprediksi nasib obat dalam tubuh. Dalam sistem kompartemen, obat dianggap didistribusi secara merata, dengan aliran darah dan afinitas obat yang sama. Secara konsepsual, obat bergerak masuk dan keluar kompartemen secara dinamik. Model merupakan suatu sistem terbuka jika obat dapat dieliminasi dari sistem tersebut. Model kompartemen mana yang cocok untuk suatu obat tergantung obatnya dan dapat diperkirakan dari profil hasil pemplotan data kadar obat dalam plasma terhadap waktu pada kertas semilog. Dengan demikian, praktikan mampu menetapkan jadwal dan jumlah sampling untuk pengukuran parameter farmakokinetik berdasarkan model kompartemen obat. Pada percobaan ini dilakukan analisis kadar senyawa obat Sulfametoxazol dalam cairan hayati. Darah menjadi pilihan utama dalam penelitian farmakokinetika karena: 1. Darah merupakan tempat paling mudah dan cepat dicapai obat, serta paling logis bagi penetapan kadar obat dalam tubuh. Dianggap paling logis karena darahlah yang mentransportasikan obat dari tempat absorbsi, mendistribusikan ke jaringan sasaran, serta menghantarkan ke organ eliminasi. 2. Bagi kebanyakan obat, bentuk obat yang tidak pernah berubah merupakan senyawa yang memiliki aktivitas farmakologis. Oleh karena itu, analisis obat dalam cuplikan darah akan memberikan suatu indikasi langsung beruap kadarnya yang mencapai sirkulasi. Metode analisis yang digunakan adalah metode Bratton-Marshall. Metode BrattonMarshall menggunakan prinsip kolorimetri dimana akan terbentuk suatu senyawa berwarna yang intensitasnya dapat diukur dengan spektrofotometri visible. Dasarnya adalah terjadinya reaksi diazotasi. Penetapan kadar obat golongan SMZ menggunakan Bratton-Marshall karena obat-obat golongan ini memiliki struktur amin aromatik primer yang dapat direaksikan dengan gugus nitro membentuk senyawa diazonium dan dapat direaksikan lebih lanjut dengan N-(1-naftil) etilendiamin membentuk kopling berwarna. Selain itu metode BrattonMarshall digunakan karena dapat menetapkan kadar sulfa saja, sedangkan metabolitnya tidak ikut ditetapkan (selektivitas tinggi). Percobaan dengan sampel darah kelinci Analisis mula-mula dilakukan dengan membuat seri kadar larutan baku dari stok SMZ yaitu 0, 5, 10, 25, 50, 100, dan 200 g/ml dengan mengencerkan stok 1 mg/ml menggunakan aquadest. Hewan yang digunakan pada kelompok kami adalah kelinci, sehingga masing-masing kadar diambil 0,25 ml, kemudian dimasukkan ke dalam tabung

reaksi. Lalu ditetapkan serapannya dengan metode Bratton-Marshall, yaitu dengan menambahkan TCA 10% sebanyak 0,2 ml ke dalam tabung, campur homogen dengan vortex selama 30 detik, kemudian disentrifuge dengan kecepatan 2500 rpm selama 10 menit.Sebelum ditambah dengan TCA 10%, ditambah dahulu dengan aquadest 2,5 ml, lalu divortex 30 detik. Diambil jernihan sebanyak 0,25 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang bersih. Ditambahkan natrium nitrit 0,1% sebanyak 0,5 ml dan didiamkan 5 menit. Selanjutnya ditambahkan ammonium sulfamat 0,5% sebanyak 0,5 ml dan didiamkan 5 nenit. Dan terakhir ditambahkan N-(1-naftil) etilendiamin 0,1% sebanyak 2 ml dan didiamkan 5 menit lalu dibaca absorbansinya pada 545 nm dengan spektrofotometer. Serapan yang didapat digunakan untuk membuat kurva baku SMZ dengan sampel darah kelinci. Karena nilai absorban untuk kadar 50 dan 100 g/ml jelek maka pada pembuatan persamaan kurva baku tidak diikutkan sehingga diperoleh persamaan kurva baku y = 0.004x - 0.034 Sementara itu dilakukan preparasi terlebih dahulu untuk mendapatkan cairan hayati darah. Sebelumnya tikus ditempatkan dalam rabbit holder , kemudian bulu-bulu sekitar 2-3 cm dari telinga dicukur bersih secara melingkar, hal ini untuk mempermudah pengambilan, karena bila bulu tersebut tidak dihilangkan, maka darah yang keluar dapat merembes ke bulubulu dan juga untuk menghindari penjendalan di bulu-bulu tersebut yang berakibat darah yang terambil sedikit. Pengambilan darah dilakukan dengan cara menyayat pembuluh vena marginalis pada telinga kelinci, diambil bagian telinga kelinci karena letak vena dekat dengan permukaan kulit sehingga darah mudah didapat dan resiko kematian kecil. Vena yang terlihat dapat disayat dengan posisi menyilang atau lebih baik searah dengan aliran darah sehingga resiko pembuluh darah terputus lebih kecil. Darah diambil sebanyak 0,25 ml sebelum obat dimasukkan, darah ini digunakan sebagai blangko. Pengambilan darah blangko berguna untuk mendukung salah satu syarat metode analisis yaitu selektivitas/ spesivitas. Setelah itu obat diberikan kepada kelinci secara per oral sesuai dengan volume pemberiannya berdasarkan bobot badan. Dalam pecobaan ini obat diberikan secara per oral, hal ini memungkinkan adanya first passs effect yang menyebabkan beberapa bagian obat mengalami metabolisme menjadi metabolit SMZ diantaranya melalui reaksi asetilasi. Di sini keberadaan metabolit diabaikan dan dianggap bahwa hanya SMZ aktif yang terukur kadarnya melalui metode Bratton-Marshall. Pengambilan darah kedua dilakukan setelah menit ke 15 dari pemberian karena dalam waktu ini diperkirakan terjadi absorbsi obat. Pengambilan cuplikan untuk selanjutnya berselang 15 atau 30 menit dimaksudkan untuk mendapatkan profil distribusi dan eliminasi obat SMZ dalam tubuh kelinci. Pencuplikan darah setelah pemberian obat dilakukan pada menit ke 15, 30,45, 60, 90, dan 120, banyak 0,25 ml tiap pencuplikan. Dosis sulfametoksazol yang diberikan adalah 50 dan 100 mg/kgBB. Tetesan darah ditampung dalam ependorf 2,0 ml yang sebelumnya sudah diberi 2-3 tetes heparin. Hal ini dimaksudkan untuk mencegah adanya penjendalan. Jika darah dibiarkan menjendal maka yang terambil pada saat sudah dilakukan sentrifugasi adalah serumnya, sedang yang dibutuhkan adalah plasmanya, karena obat akan berinteraksi dengan protein plasma untuk membentuk suatu kompleks makromolekul yang dikenal dengan ikatan obatprotein. Jadi beda plasma dengan serum, dalam serum tidak terdapat zat antikoagulan karena sudah digunakan untuk pembekuan darah, sedangkan dalam plasma masih mengandung protein faktor penjendalan seperti fibrin dan fibrinogen.

Plasma membawa sejumlah besar protein penting seperti albumin, gamma globulin, dan faktor koagulasi. Albumin membantu regulasi kadar air dalam jaringan dan darah. Gamma globulin terdiri dari ribuan antibodi unik yang menghancurkan organisme infektan. Baik plasma maupun serum mudah untuk disimpan dan memiliki banyak kegunaan medis. Sebagian obat di dalam darah diikat secara reversible pada protein plasma. Zat yang bersifat asam terikat terutama pada albumin yang jumlahnya jauh lebih besar daripada zat putih telur lainnya. Zat basa mengikat diri pada pada glikoprotein asam, seperti globulin atau juga pada sel-sel darah merah. Bagian obat yang terikat akan hilang aktivitas farmakologisnya dan menjadi inaktif, tetapi belum mengalami biotransformasi atau eksresi. Antara molekul yang bebas dan yang terikat terdapat perbandingan yang tetap, konstan asosiasi adalah spesifik bagi tiap obat, seperti yang telah disinggung di muka, prosentase pengikatan protein oleh sulfametoxazol berkisar 60 %. Pengikatan ini dapat dianggap sebagai suatu cara untuk menyimpan obat karena bagian yang terikat tidak dirombak atau disekresi, segera bila kadar obat menurun, komplek obat-protein pecah dan obat terlepas kembali. Pada percobaan agar protein plasma ini tidak mengganggu analisa maka dilakukan denaturasi dan pengendapan. Heparin digunakan sebagai antikoagulan, merupakan suatu mukopolisakarida yang terdiri dari D-glukosamin dan D-asam glukuronat yang mengandung asam sulfat. Zat ini terdapat di dalam sel mast kapiler dan pembuluh darah kecil, terutama di dalam hati, dan dibebaskan bersama histamin dalam keadaan syok. Heparin kadar tinggi juga terdapat pada paru dan intestinal. Mekanisme kerjanya sebagai antikoagulan dengan menghambat pembentukan trombin dari protrombin. Caranya yaitu dengan mengikat antitrombin III membentuk komplek heparin-antitrombin yang berafinitas lebih besar daripada antitrombin III sendiri, heparin mempercepat inaktivasi faktor pembekuan darah aktif (trombin dan faktor Xa). Sediaan heparin dengan berat molekul rendah (5000 dalton) berafinitas anti Xa kuat dan antitrombin sedang. Sediaan heparin dengan berat molekul tinggi (50.000 dalton) berafinitas anti Xa sedang dan antitrombin kuat. Ikatan heparin dengan antitrombin III menginaktivasi faktor Xa dan mencegah protrombin menjadi trombin, sehingga pembekuan darah tidak terjadi. Heparin dalam jumlah lebih besar bersama antitrombin III akan menghambat pembekuan dengan mengaktivasi trombin dan faktor-faktor pembekuan sebelumnya, sehingga mencegah perubahan fibrinogen menjadi benang-benang fibrin. Heparin juga bekerja menginaktivasi faktor penstabil fibrin (faktor XIIIa) dan mencegah terbentuknya bekuan fibrin yang stabil, efek antikoagulan timbul cepat dan bertahannya efek tergantung pada dosis. Efek maksimal diperoleh 10 menit setelah suntikan intravena dan berakhir setelah 3-4 jam. Bila ditambahkan pada darah, heparin tidak mengubah hasil pemeriksaan rutin kimia darah. Heparin sebagai koagulan yang familiar ditemukan oleh Dr John Laragh dari Columbia University untuk beberapa kasus hipertensi. Heparin + Anti trombin III + Faktor penggumpalan Kompleks terner Protrombin Trombin

Kemudian darah dipindahkan ke tabung reaksi. Pengukuran kadar SMZ menggunakan spektrofotometer, sehingga ikatan antar protein-SMZ harus diputus guna memisahkan bagian

protein dan SMZ, karena adanya protein dapat mengganggu jalannya proses absorbansi sinar UV-visibel oleh senyawa Sulfametoksazol dan dikhawatirkan data yang diperoleh kurang valid. Pemisahan ini dilalukan dengan penambahan TCA yaitu senyawa yang bersifat asam yang dapat mendenaturasi protein. TCA 10% yang ditambahkan sebanyak 0,2 ml dan proses pendenaturasian disempurnakan dengan memvortexnya selama 30 detik. Kemudian disentrifuge dengan kecepatan 2500 rpm dselama 10 menit, Asam trikloro asetat (TCA) merupakan suatu asam organik yang sangat kuat. TCA mempunyai fungsi sebagai pemberi suasana asam bagi reaksi diazotasi, sebagai donor proton untuk reaksi selanjutnya. TCA sebagai asam kuat akan menghentikan kerja enzim pemetabolisme obat yang ada dalam darah dan mengakibatkan terjadinya denaturasi protein, mengkoagulasikan dan mengendapkannya. Denaturasi protein dapat terjadi bila pH, ionic strength berubah atau terjadi dehidratasi yang mengubah struktur level tersier dan sekunder protein, akibatnya bagian hidrofobiknya jadi terpapar keluar dan proteinnya mengendap.

Keterangan gambar: Mekanisme denaturasi protein didasarkan proses pengubahan konformasi sekunder, tersier maupun kuarterner protein sehingga bagian yang hidrofil tidak lagi terekspos keluar dan kelarutannya berkurang. Pada suatu reaksi diazotasi yang biasa digumakan adalah HCl sebagai pemberi suasana asam, tetapi pada kasus ini tidak digunakan HCl karena HCl berefek memecah protein menjadi asam aminonya sehingga pada saat sentrifugasi asam amino tersebut tidak akan memisah dari plasmanya karena terlalu kecil untuk ikut diendapkan. Asam-asam amino tersebut akan mengganggu pembacaan absorbansi karena ikut memberikan serapan. Setelah disentrifugasi maka akan didapatkan dua lapisan, lapisan atas berupa beningan/ supernatan, dan lapisan bawah berupa endapan yang terdiri dari protein yang terdenaturasi. Supernatan yang berisi obat yang bebas dari protein plasma, diambil sejumlah 0,15 ml, sedangkan obat yang terikat pada protein plasma tidak aktif secara farmakologi sehingga tidak perlu disertakan dalam pengambilan. Kemudian dilakukan reaksi diazotasi dan kopling. Prosedur reaksi diazotasi dan kopling.

Sulfametoxazol memiliki struktur dasar amina aromatik primer sehingga dapat dilakukan reaksi diazotasi, kemudian dikopling dengan beberapa pereaksi sehingga menghasilkan senyawa berwarna yang dapat dideteksi dengan spektofotometer. Senyawa berwarna tersebut terbentuk dari hasil reaksi antara amina aromatik primer dengan gugus nitro membentuk ion diazonium. Ion ini direaksikan lebih lanjut dengan N-1-naftil etilendiamin membentuk senyawa kopling berwarna ungu dan dapat dideteksi dengan spektrofotometri visible. Kondisi ideal untuk reaksi diazotasi yaitu pH sekitar 3-4, pada kondisi tersebut pembentukan garam diazonium dapat lebih cepat dan NED dapat bekerja lebih efektif. Suasana asam pada percobaan diberikan oleh penambahan TCA. Syarat lain bagi reaksi diazotasi adalah dilakukan pada suhu rendah. Supernatan yang telah diambil ditambah NaNO2 0,1 % sebanyak 0,5 ml dan didiamkan selama 5 menit. NaNO2 akan bereaksi dengan sulfametoxazol dan gugus amina primer mengalami diazotasi dan terbentuk garam diazonium yang sangat reaktif. Reaksi diazotasi terjadi sangat lambat, oleh karena itu setiap penambahan reagen perlu didiamkan beberapa menit. Pendiaman selama 5 menit dimaksudkan agar semua amina primer sudah mengalami diazotasi. Pemakaian NaNO2 lebih baik daripada HNO2, karena HNO2 bersifat tidak stabil, dengan adanya H2O pada darah dan urin, maka akan terbentuk HNO2 dan NaOH. HNO2 akan membentuk ion nitronium dengan adanya suasana asam dari TCA. Ion nitronium inilah yang akan mengalami reaksi diazotasi. Reaksi amina aromatik dengan asam nitrit akan membentuk garam diazonium dan pembentukannya dipercepat dalam suasana asam ( pH 0-3 ) yang diberikan melalui penambahan TCA. Garam diazonium yang sudah terbentuk direaksikan dengan reagen kopling. Reagen kopling yang khas dalam metode Bratton-Marshall adalah N-1-naftil etilendiamin (NED), NED lebih disukai untuk analisis kuantitatif karena produk biasanya lebih larut air dan punya absorptivitas yang tinggi. NED bekerja pada suasana asam, pada percobaan ini digunakan TCA yang membuat suasana menjadi asam. HNO2 bersifat sebagai oksidator dan dapat mengoksidasi kopling yang terbentuk antara garam diazonium dengan NED. Bila senyawa kopling pecah maka akan tidak muncul warna dan akibatnya senyawa tidak dapat dianalsis dengan spektro, sehingga kelebihan HNO2 harus dihilangkan dengan penambahan ammonium sulfamat 0,5 % sebanyak 0,5 ml, jika tidak, nitrit dapat merusak garam diazonium sehingga reaksi kopling berjalan lambat atau bahkan tidak berjalan sama sekali. Hilangnya kelebihan asam ditandai dengan hilangnya gelembung gas yang timbul (gas nitrogen) Penambahan NED 0,1 % sebagai pereaksi kopling sebanyak 2 ml. Hasilnya akan terbentuk senyawa kopling dengan ikatan rangkap terkonjugasi lebih panjang, sehingga mempunyai absorptivitas molar yang lebih besar. Ikatan rangkap terkonjugasi ini mempunyai kemampuan untuk menyerap warna tertentu sehingga akan menyebabkan senyawa berwarna. Warna yang timbul tergantung panjang ikatan rangkap terkonjugasi yang dimiliki suatu senyawa. Makin panjang makin gelap pula warna yang dimiliki senyawa tersebut. Kemudian biarkan di tempat yang gelap selama kurang lebih 5 menit agar pembentukan warna menjadi sempurna, waktu ini merupakan perkiraan operating time yang ditandai dengan serapan sampel yang konstan bila dibaca pada spektrofotometer visible. Analit harus disimpan pada tempat yang gelap karena produk kopling yang terjadi dapat menyerap sinar tampak dan tereksitasi dini serta untuk menghidari terjadinya reaksi oksidasi garam diazonium oleh nitrit dengan adanya sinar matahari.

Reaksi kopling memerlukan solven yang polar untuk dapat mengakomodasi intermediet ion yang terbentuk dari reaksi diazotasi, sehingga pelarut yang digunakan dalam regen kopling NED adalah air. Untuk reaksi kopling pH yang baik berkisar 5-9, karena pada kondisi yang terlalu asam arilamin dapat berubah menjadi ion anilin dan menghambat reaksi kopling. Oleh karenanya, pada praktikum cukup dilakukan pembatasan penambahan asam dan penghilangan gas nitrit. Mekanisme-mekanisme reaksi diazotasi dan kopling : HNO2 + H+ cepat H2O + NO+
NO
N CH2 H2N SO2NH

N SO2NH

O CH2

lambat
NO N H SO2NH N O CH2

N OH N N SO2NH

O CH2

cepat

H
+

N N N SO2NH

O CH2

O CH2

O H

SO2NH

cepat OH
O CH2 SO2NH

HNO2 + H2N SO2

cepat

H2SO4 + H2O + N2
H2N (CH2)2 NH

Asam sulfamat
N

+ N-( 1-naftil ) etilen diamin

H2N

(CH2)2

NH

SO2 NH

N O

CH3

Senyawa berwarna ungu Pengukuran kadar obat dengan metode Bratton-Marshall dilakukan dengan spektrofotometer visible pada 545 nm. Panjang gelombang tersebut merupakan panjang gelombang maksimal untuk kopling turunan sulfonamida. Digunakannya max karena pada max absorbansi yang dihasilkan akan maksimal dan kesalahan pembacaan adalah yang paling rendah. Hal ini terjadi karena pada max terdapat keseimbangan antara energi yang

diperlukan untuk eksitasi dengan energi yang diberikan untuk eksitasi. Pembacaan serapan harus dilakukan segera mungkin setelah 5 menit untuk menghindari pembacaan setelah degradasi kompleks warna yang berakibat pengukuran pada max tidak memberikan absorbansi maksimum. Selain itu yang perlu diperhatikan juga adalah adanya buih-buih atau gelembung udara pada larutan yang dapat menyebabkan reaksi dan produk yang terbentuk tidak stabil, oleh karena itu buih-buih tersebut harus dihilangkan dengan mengocoknya agar tidak mengganggu pada saat pembacaan absorbansi. Saat pembacaan absorban, gelembung udara harus dihilangkan karena dapat mengganggu pembacaan yaitu dengan diketuk-ketuk atau dengan menuangkan ke dalam kuvet lewat dinding. Nilai absorban yang dipakai adalah absorban terkoreksi yaitu absorban yang terbaca dikurangi absorban blangko. Hal ini dikarenakan dalam darah terdapat banyak komponen yaitu metabolit, senyawa endogen dan obatnya sendiri, untuk senyawa endoogen bisa dieliminasi dengan memperhitungkan absorban blangko. Kadar SMZ dalam waktu tertentu dapat diketahui setelah memplotkan data absorbansi tersebut dengan kurva baku yang telah dibuat sebelumnya. Dari kurva log kadar SMZ vs waktu belum bisa didapatkan model kompartemen obat. Tetapi dengan perhitungan rumus Notary dimana kinetika obat mengikuti model satu kompartemen terbuka karena k12 + k21 < 20 kel. Perhitungan parameter farmakokinetik dilakukan dengan metode Wagner-Nelson yang menganggap suatu model satu komparteman. Perhitungan k12 dan k21 digunakan untuk melihat model kompartemen berdasarkan persamaan Notary. K12 adalah tetapan distribusi dari kompartemen sentral ke kompartemen perfier, sedangkan k21 adalah kebalikannya. Untuk menghitung k12 dan k21 harus diketahui nilai B, , A,dan . B dan diperoleh dari persamaan regresi linier t vs ln Cp pada titik-titik di fase eliminasi. Sedangkan A dan diperoleh dengan metode residual karena tidak ada titiktitik di fase distribusi. adalah tetapan laju reaksi untuk fase distribusi dan B adalah tetapan laju reaksi untuk fase eliminasi. Besaran-besaran , k12, k21 bersama-sama dengan Vd digunakan untuk mengkaji pola distribusi obat (kecepatan, jumlah, luas distribusi). Volume distribusi adalah volume perkiraan dalam tubuh di mana obat terlarut. Hasil perhitungan memberikan hasil bahwa untuk kelinci I Vd kadar 50 mg/kg BB adalah 1,894 ml, sedangkan pada kadar 100 mg/kg BB adalah 1,092 ml. Ikatan obat dengan protein mempengaruhi Vd. Jika suatu obat terikat oleh protein plasma dalam jumlah besar, atau tinggal dalam vaskuler, maka Cp menjadi lebih tinggi yang mengakibatkan Vd yang lebih kecil. Kurang lebih 65% SMZ terikat pada protein plasma. Nilai Vd yang relatif besar menunjukkan bahwa jumlah SMZ dalam kompartemen jaringan atau ekstravaskuler juga relatif besar. Berdasarkan rumus Notary, SMZ mengikuti model satu kompartemen, maksudnya Tubuh dianggap sebagai 1 kompartemen tempat obat menyebar dengan seketika dan merata ke seluruh cairan dan jaringan tubuh. Parameter Ka, Cpmax (kadar puncak), Tmax (waktu untuk mencapai kadar puncak), Fa (fraksi obat yang diabsorbsi) dan AUC dapat digunakan untuk mengkaji pola absorbsi (keepatan dan jumlah obat yang diabsorbsi). Dari perhitungan diperoleh nilai: Kadar obat 50 mg/kg BB Ka = 0,0278/jam Tmax = 58,6745 jam

Cpmax = 22,5687 g/ml T = 72,9679 jam AUC = 4559,717 g/ml K eliminasi = 0,0111/jam Kadar obat 100 mg/kg BB Ka = 0,0243/jam Tmax = 63,279 jam Cpmax = 34,3817 g/ml T = 74,5161 jam AUC = 7080,021 g/ml K eliminasi = /jam Ka menyatakan tetapan kecepatan absorbsi karena pemberian secara peroral. Parameter AUC menyatakan jumlah SMZ yang masuk ke dalam tubuh. Kecepatan dan jumlah obat yang diabsorbsi lewat saluran cerna tergantung pada : Luas permukaan tempat absorbsi Kecepatan pengosongan lambung Motilitas saluran cerna Aliran di tempat absorbsi Dari literatur dinyatakan bahwa SMZ merupakan obat golongan Sulfonilamid yang mempunyai waktu paruh menengah yaitu antara 10 5 jam. Absorbsi secara per oral dan ekskresinya lambat. Pola eliminasi suatu obat dapat dikaji dari parameter dan tetapan kecepatan eliminasi (kel atau K). Eliminasi obat ditentukan oleh proses metabolisme dan ekskresi. Laju eliminasi pada umumnya merupakan proses order kesatu. Waktu paruh (t) menyatakan waktu yang diperlukan oleh sejumlah obat atau konsentrasi obat untuk berkurang menjadi separuhnya. Tolok ukur paling baik untuk mengevaluasi pola eliminasi obat adalah parameter klirens total (ClT ), yaitu pada kadar 50 mg/kg BB adalah ml/jam, dan kadar 100 mg/kg BB adalah ml/jam, yang menggambarkan volume distribusi kompartemen sentral yang dibersihkan dari obat setiap satuan waktu. Karena model kompartemen SMZ diperkirakan sebagai model satu kompartemen terbuka dengan pemberian per oral maka dianjurkan distribusi pencuplikan pada : 3 titik pada tahap absorbsi = menit ke 5,10,15 3 titik di sekitar puncak = menit ke 30,45,60 3 titik di sekitar eliminasi = menit ke 75,90,120 Namun percobaan hanya memberikan 5 dan 7 data, maka ada beberapa data yang kami gunakan untuk menghitung titik eliminasi sekaligus absorbsi. Hal ini dilakukan untuk mendapatkan kurva yang mendekati sebenarnya. Setelah waktu pencuplikan ditetapkan maka dipilih dosis yang akan diberikan pada subjek uji percobaan selanjutnya. Pemilihan ini dapat didasarkan atas beberapa hal diantaranya :

 mengacu pada LD 50 (toksisitas akut) obat yang diuji Jika tidak ada informasi lengkap, dapat digunakan dosis awal 5-10 % dari LD 50 % intravena (Kaplan,1973) Kecepatan metode analisis Apakah metode analisis mempunyai kepekaan yang mendukung besaran dosis tersebut hingga pada fase eliminasi, kadar obat masih dapat dimonitor Ketepatan dan ketelitian Berkenan dengan lamanya hasil yang didapatkan dengan suatu metode. Menurut teori, sulfametoksazol termasuk obat dengan model kompartmen 1 terbuka. Jadi hasil percobaan sudah sesuai dengan teori, bahwa sulfametoksazol termasuk obat kompartmen 1 terbuka.Walaupun data pencuplikan yang didapat hanya 5-7 data ternyata sudah cukup mewakili untuk menentukan model kompartmen obat tersebut. Untuk hasil percobaan pencuplikan darah tikus adalah sebagai berikut:

Penetapan waktu sampling didasarkan pada t1/2 eliminasi obat yaitu waktu yang diperlukan obat untuk tereliminasi setengahnya. T1/2 eliminasi bukanlah indeks yang baik untuk melihat kecepatan eliminasi obat, namun dapat dijadikan patokan waktu yang baik untuk mencvapai keadaan steady state sehingga dapat ditentukan intyerval dosisnya. Menurut percobaan, percobaan sulfametoksazol termasuk farmakokinetika tidak tergantung dosis, hal ini sesuai teori yang mengatakan bahwa sulfametoksazol merupakan obat yang tidak tergantung dosis, mengikuti orde 1 karena perubahan dosis tidak berpengaruh signifikan terhadap perubahan waktu sampling. Rekomendasi dosis yang akan digunakan untuk percobaan selanjutnya adalah tetap mengikuti dosis yang sebelumnya sudah digunakan karena sulfametoksazol termasuk farmakokinetika yang tidak bergantung dosis. Sehingga sudah sesuai dengan teori. Waktu sampling yang diperoleh dilihat dari kurva konsentrasi obat dalam plasma(Cp) vs waktu (t) perlu dilakukan penambahan waktu sampling karena dari kurva yang diperoleh belum dapat menggambarkan model kompartmen obat tersebut. Hal ini dikarenakan saat praktikum data yang diperoleh tidak sesuai yang diharapakan karena saat praktikan kan melakukan absorbansi terhadap sampel terdapat gangguan berupa aliran listrik yang terputus. Penyimpangan-penyimpangan yang terjadi pada masing-masing parameter antara lain disebabkan oleh : 1. Ketika pengambilan darah ada penjendalan dalam ependorf sehingga serumnya keluar. Hal ini dapat mengacaukan pengukuran karena yang diukur adalah kadar obat dalam plasma. 2. Karena tikus pada kelompok kami sudah lemah dan sulit mengeluarkan darah sehingga darah dicampur dengan darah tikus lain, hal ini memungkinkan terjadinya penggumpalan pada sampel darah. 3. Kurang tepat dalam pengambilan setiap larutan reagen

4. Kurang teliti dalam mengambil supernatan sehingga endapannya ikut terambil, hal ini akan mengganggu dalam pembacaan absorbansi 5. Pada saat penambahan NED tidak dilakukan di ruangan gelap sehingga terjadi eksitasi dini dan produk kopling menyerap sinar tampak dalam jumlah banyak 6. Adanya gelembung pada saat penambahan ammonium sulfamat yang dapat menyebabkan senyawa menjadi tidak stabil. Seharusnya gelembung-gelembung tersebut dihilangkan dengan cara mengocok-kocok tabung reaksi sehingga nilai absorbansi menjadi stabil dan tidak berubah-ubah. 7. Waktu pada saat penambahan NED yang kurang tepat, karena waktu ini merupakan perkiraan operating time. Jika waktunya kurang, larutan yang akan diukur kemungkinan belum stabil dan dapat mengacaukan pembacaan absorbansi. 8. Heparin hanya bertahan 3-4 jam, sedangkan setiap kelompok harus menunggu antrian saat mengukur absorbansi dengan spektrofotometer. Hal ini dapat mengganggu pengukuran bila cairan yang semula plasma berubah menjadi serum akibat adanya penjedalan. 9. Sensitivitas alat yang rendah sehingga absorbansi yang didapat kurang tepat. 10. Reagen atau pereaksi yang digunakan kualitasnya sudah berkurang. 11. Pengambilan cupikan darah yang tidak tepat waktu karena darah yang keluar sedikit, 12. Dari faktor tikusnya sendiri misalnya adanya gangguan absorbansi, first pass effect, kecepatan pengosongan lambung pergerakan saluran cerna, aliran yang mungkin terganggu akibat perlakuan tikus yang kurang baik dapat berpengaruh terhadap kadar SMZ yang terukur, 13. Gangguan terputusnya listrik saat praktikan akan mengukur absorbansi sampel. G. KESIMPULAN 1. Sulfametoxazol dapat ditetapkan kadarnya dalam cairan hayati dengan metode Bratton- Marshall yang telah dimodifikasi. 2. Cairan hayati yang digunakan yaitu darah 3. Model kompartemen farmakokinetika suatu obat dapat ditentukan berdasarkan kurva semilogaritmik kadar obat dalam plasma darah lawan waktu. Kurva yang terlihat dari SMZ berbentuk trifasik. 4. Model farmakokinetik untuk sulfametoksazol mengikuti model kompartemen dua terbuka 5. Parameter-parameter farmakokinetik yang didapat dari sampel darah tikus adalah : Kadar obat 50,4 mg/kg BB Ka = 2,93/jam Tmax = 0,608 jam Cpmax = 90,961 g/ml T = 0,86 jam AUC = 209,361 g/ml K eliminasi = 0,806/jam

Kadar obat 100,8 mg/kg BB Ka = 3,307/jam Tmax = 0,624 jam Cpmax = 204,058 g/ml T = 1,123 jam AUC = 520,313 g/ml K eliminasi = 0,617/jam 6. Waktu sampling untuk dosis 50 mg/kg BB pada sampel darah adalah 3-5 T yaitu 2,58 jam 4,3 jam

H. DAFTAR PUSTAKA Anonim. 1995. Farmakope Indonesia edisi IV. Departemen Kesehatan RI. Jakarta Brunzel, Nancy A. Fundamental of Urine and Body Fluid Analysis. W. B Saunders. Philadelphia. William, D. 1995. Prinsip-prinsip Kimia Medisinal jilid I edisi II. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta Gan, S. 1980. Farmakologi dan Terapi edisi 2. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta Gan, S. 1995. Farmakologi dan Terapi edisi IV. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Gaya Baru : Jakarta Guyton, Arthur. 1993. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta Shargel, L dkk. 1988. Biofarmasetika Dan Farmakokinetika Terapan. Airlangga University Press: Surabaya Schumann, G.B and Tebbs R.D. 1986. Comparison of Slide Used for Standardized Routine Microscopic Urinalysis. J Medical Technology. Florida. Sudjadi dan Abdul Rohman. 2004. Analisis Obat dan Makanan. Pustaka Pelajar. Yogyakarta Tjay, Tan Hoan dan Kirana Rahardja. 2002. Obat-Obat Penting edisi V. Elex Media Komputindo. Jakarta.

Mengetahui Asisten,

Yogyakarta, 9 Desember 2011 Praktikan, 2. Muthyahara Addunya ( FA/08651 )

2. Tintani Bunga Restika ( FA/08654 ) 3. R. Arindra Hanuraga ( FA/08657 ) 4. Rifki Bahtiar ( FA/08660 )