ARTIGO ORIGINAL

3 Consenso Brasileiro para pesquisa de autoanticorpos em clulas HEp-2 (FAN). Recomendaes para padronizao do ensaio de pesquisa de autoanticorpos em clulas HEp-2, controle de qualidade e associaes clnicas
Alessandra dellavance(1), Alexandre Gabriel Jnior(2), Barbara Nuccitelli(3), Ben Hur Taliberti(4), Carlos Alberto von Mhlen(5), Carlos david Arajo Bichara(6), Cludio Henrique Ramos dos Santos(7), Cleonice Bueno(8), Cristiane Martinez Yano(9), Cristvo Luis Pitangueira Mangueira(10), darlene Gonalves Carvalho(11), Elizngela Cardoso(12), Elosa Bonf(13), Flvia Ikeda e Arajo(14), Gustavo Gabriel Rassi(15), Hugo Mendona Mundim(16), Izidro Bendet(17), Jozlia Rego(18), Lisiane Maria Enriconi dos Anjos vieira(19), Luis Eduardo Coelho Andrade(20), Maria Ordlia Ferro Barbosa(21), Mitiko Sugiyama(22), Mittermayer Barreto Santiago(23), Natasha Slhessarenko(24), Nilzio Antnio da Silva(25), Paulo Luiz Carvalho Francescantonio(26), Renata Jarach(27), Roberto Suda(28), Roger Abramino Levy(29), Silvia Oliveira Sampaio(30), Suzane Pretti Figueiredo Neves(31), Wilson de Melo Cruvinel(32), Wilton Silva dos Santos(33), Yanna K. de M. Nbrega(34)

Recebido em 17/11/2008. Aprovado, aps reviso, em 14/01/09. O 3 Consenso Brasileiro recebeu auxlio dos Fundos de Auxlio Pesquisa, da Sociedade Brasileira de Reumatologia. 1. Ps-graduanda em nvel de Doutorado na disciplina de Reumatologia pela Universidade Federal de So Paulo (UNIFESP); Assessora cientfica do Setor de Imunologia do Fleury Medicina Diagnstica 2. Ps-doutorado pela Scripps Medical Center La Jolla La USA; Coordenador mdico da AFIP-Medicina Laboratorial e Centro Imuno-Reumatolgico de So Paulo 3. Biomdica do Padro Laboratrio Clnico 4. Ps-doutorado na Reumaklinik Aachen-Alemanha; Professor titular de clnica mdica da Universidade Federal de Uberlndia; Coordenador do servio de reumatologia do HCUFU 5. Professor de Reumatologia da Faculdade de Medicina da PUCRS; Doutor em Medicina pela Faculdade de Medicina da Rheinisch-Westfalische Technische Hochschule/Aachen, Alemanha; Ps-Doutorado no The Scripps Research Institute, La Jolla, EUA; Diretor Tcnico do Metanalysis Centro de Diagnsticos Mdicos, Porto Alegre 6. Mdico e Biomdico; Especialista em Patologia Clnica; Especialista em Sade Pblica; Mestrando em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitrios/UFPA; Supervisor Tcnico do Laboratrio Amaral Costa; Professor de Patologia Clnica do CESEP/PA 7. Assessor cientfico da NewLife Comrcio de Produtos Laboratoriais 8. Laboratrios de Investigao Mdica do Hospital das Clnicas da FMUSP 9. Mestra em Medicina Tropical pela Universidade Federal de Gois; Professora assistente da disciplina de Imunologia da Universidade Catlica de Gois 10. Mdico Patologista Clnico e Reumatologista; Doutor em Patologia pela Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo (FMUSP); Mdico da Seo de Imunologia da Diviso de Laboratrio Central (LIM 03) do Hospital das Clnicas da FMUSP; Gerente Mdico do Departamento de Patologia Clnica (Diretoria de Medicina Diagnstica e Preventiva) do Hospital Israelita Albert Einstein 11. Mdica Patologista Clnica - Imunologia do Instituto Hermes Pardini 12. Biologia Celular e Molecular; Suporte Tcnico Cientfico da Biometrix Diagnstica 13. Professora Titular de Reumatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo 14. Mestra em Cincias Ambientais e Sade pela Universidade Catlica de Gois (UCG); Professora Assistente I de Imunologia do curso de Biomedicina da Universidade Catlica de Gois; Coordenadora do Laboratrio de Apoio Didtico do Departamento de Biomedicina UCG 15. Mdico Patologista Clnico do Laboratrio Atalaia 16. Exame Medicina Laboratorial. Distrito Federal 17. Mdico Patologista Clnico e Virologista; Ps-graduao em Biologia Parasitria pela FIOCRUZ; Consultor Cientfico do Setor de Imunoensaios do Srgio Franco Medicina Diagnstica 18. Mdica Reumatologista e Coordenadora do Laboratrio de Imuno-Reumatologia do Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Gois 19. Mestra em Cincias Mdicas pela Universidade Federal de Santa Catarina; Professora da Universidade do Sul de Santa Catarina; Professora da Universidade do Vale do Itaja; Patologista Clnica do Laboratrio Mdico Santa Luzia
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20. Professor associado - livre docente da disciplina de Reumatologia na UNIFESP; Coordenador do Programa de Ps-Graduao da disciplina de Reumatologia da Universidade Federal de So Paulo; Assessor mdico do Setor de Imunologia do Fleury Medicina e Sade 21. Mestra em Biomedical Science pela San Francisco State University, Califrnia; Bioqumica dos Laboratrios Sade e Hospital e Maternidade e Jardim Amrica 22. Assessora cientfica da Hemagen Diagnsticos 23. Ps-Doutorado pela University of Calgary; Mdico Reumatologista da Universidade Federal da Bahia; Professor adjunto da Fundao Bahiana para Desenvolvimento das Cincias e Chefe do servio de reumatologia do Hospital Santa Izabel 24. Mdica Patologista Clnica; Mestra em Medicina (Pediatria) pela Universidade de So Paulo; Professora da Universidade Federal de Mato Grosso 25. Doutor em Medicina (Reumatologia) pela Universidade de So Paulo; Professor Titular de Reumatologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Gois 26. Mestre em Cincias Ambientais e Sade pela Universidade Catlica de Gois (UCG); Professor Assistente I de Imunologia dos cursos de Biomedicina e Medicina da Universidade Catlica de Gois; Coordenador do 3 Consenso Brasileiro para pesquisa de autoanticorpos 27. Mestra em Medicina Tropical pela Universidade Federal de Gois; Biomdica do Padro Laboratrio Clnico 28. Assessor Cientfico da Alka. 29. Doutor em Cincias Biolgicas (Biofsica) pela Universidade Federal do Rio de Janeiro; Estatutrio da Universidade do Estado do Rio de Janeiro; Professor Adjunto de Reumatologia da UERJ; Coordenador do Centro de Autoimunidades do Hospital Pr-cardaco RJ e Consultor cientfico do Diagnsticos da Amrica SA 30. Doutora em Imunologia pelo Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo; formada pela Faculdade de Medicina da USP-SP (FMUSP) com Especializao em Reumatologia pela FMUSP; Mdica do setor de Imunologia do Laboratrio Diagnsticos da Amrica SA 31. Mdica Patologista Clnica; Doutora em Cincias pela Fundao Oswaldo Cruz; Professora Adjunta da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais; Coordenadora de Setor de Soro-Imunologia do Servio de Medicina Laboratorial do Hospital das Clnicas-UFMG 32. Ps-graduando em nvel de Doutorado na disciplina de Reumatologia pela Universidade Federal de So Paulo (UNIFESP); Professor Assistente de Imunologia nos cursos de Biomedicina e Medicina da Universidade Catlica de Gois (UCG); Secretrio do 3 Consenso Brasileiro para pesquisa de autoanticorpos 33. Mdico Reumatologista; Coordenador do Laboratrio de Reumatologia do Hospital Universitrio de Braslia e Doutor em Reumatologia pela UNIFESP 34. Mestra em Patologia Molecular/Imunologia pela Universidade de Braslia (UnB); professora da Unio Educacional do Planalto Central e do Centro Universitrio Unieuro; Assessora Cientfica da Imunotech Sistemas Diagnsticos Importao e Exportao Endereo para correspondncia: Laboratrio de Apoio Didtico. Departamento de Biomedicina - Universidade Catlica de Gois. Avenida Universitria, 1069. Setor Universitrio, CEP:74605-010, Goinia - Gois. Tel.: (62) 3946-1393. E-mail: lad@ucg.br

RESUMO
Objetivo: O 3 Consenso Brasileiro para pesquisa de autoanticorpos em Clulas HEp-2 (FAN) teve como propsito avaliar as dificuldades de implantao do 2 Consenso ocorrido no ano de 2002, discutir estratgias para controlar a qualidade do ensaio e promover a atualizao das associaes clnicas dos diversos padres. Mtodos: Participaram do encontro em Goinia nos dias 13 e 14 de abril de 2008 pesquisadores e especialistas de diversos centros universitrios e laboratrios clnicos de diferentes regies do Brasil, com o propsito de discutir e aprovar as recomendaes que visam melhor padronizao, interpretao e utilizao do ensaio pelos clnicos. Representantes comerciais de diferentes empresas produtoras de insumos para realizao do teste de FAN foram convidados como ouvintes. Resultados e Concluses: O 3 Consenso enfatizou a necessidade do controle de qualidade em imunofluorescncia dada a heterogeneidade de microscpios e reagentes disponveis no mercado, promoveu adequaes na terminologia utilizada para classificar os diferentes padres e, finalmente, atualizou as associaes clnicas com finalidade de facilitar cada vez mais o melhor uso do ensaio pelos clnicos. Palavras-chave: autoanticorpos, clulas HEp-2, anticorpos antincleo, imunofluorescncia.

INTRODUO
Perspectiva histrica da pesquisa de autoanticorpos em HEp-2 no Brasil
A evoluo cientfico-tecnolgica promove mudanas em exames laboratoriais que afetam parmetros importantes para a interpretao clnica, como os valores preditivos positivo e negativo, a sensibilidade e a especificidade. Um timo exemplo desse tipo de situao o exame para pesquisa de anticorpos antincleo (ANA) pela tcnica de imunofluorescncia indireta (IFI), tambm conhecido como fator antincleo (FAN), hoje denominado pesquisa de anticorpos contra antgenos celu90

lares (PAAC) em soro de pacientes com suspeita de doena autoimune. Trata-se de um excelente exame de rastreamento de autoanticorpos que ao longo das ltimas dcadas foi tecnicamente modificado de forma a conferir sensibilidade progressivamente maior. Como consequncia, a pesquisa de anticorpos contra antgenos celulares passou tambm a apresentar menor especificidade.1 O aumento na sensibilidade do teste de PAAC-IFI em HEp-2, entretanto, trouxe tambm um prejuzo na especificidade, pois alguns indivduos sem evidncia clnica ou laboratorial aparentes de doena autoimune tambm passaram a apresentar resultados positivos em clulas HEp-2,
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exigindo uma interpretao bastante criteriosa dos achados sorolgicos.2 A alta frequncia de resultados positivos do teste em indivduos saudveis ou com manifestaes clnicas vagas tem trazido tona uma situao denominada por alguns de Sndrome do Anticorpo Antincleo Idioptico.1 A perda de especificidade do teste agravou-se tambm pelo fato de que uma vasta gama de especialistas mdicos passou a utiliz-lo. Inicialmente, os reumatologistas e nefrologistas eram os grandes usurios desse exame e, em decorrncia de sua familiaridade com o mesmo e das caractersticas de sua clientela, tinham maior chance de solicitar o exame a quem realmente tivesse quadro autoimune. Hoje, o PAAC-IFI em HEp-2 um exame solicitado com menos critrio por grande variedade de especialistas, que obviamente atendem uma clientela distinta, na qual o diagnstico de doena reumtica autoimune menos prevalente. Assim, a chance de resultados positivos em indivduos saudveis ou com apresentaes clnicas pouco expressivas tornou-se maior. Alguns elementos so importantes para a valorizao adequada do teste do PAAC-IFI em HEp-2. Em primeiro lugar, o exame deve ser solicitado apenas quando houver suspeita convincente de doena autoimune. Sua solicitao frente a um paciente com queixas vagas, frequentemente trar mais confuso ao raciocnio clnico, visto que um resultado positivo no implica necessariamente autoimunidade. Um segundo ponto a ser considerado o ttulo do PAAC-IFI em HEp-2: em geral, os pacientes autoimunes tendem a apresentar ttulos moderados (1/160 e 1/320) e elevados ( 1/640), enquanto os indivduos sadios com PAAC-IFI em HEp-2 positivo tendem a apresentar baixos ttulos (1/80).3 Entretanto, em ambas as situaes pode haver excees.4 Um outro ponto importante o padro de fluorescncia que fornece uma indicao da identidade do(s) autoanticorpo(s) em questo 5 e deve ser analisado com bastante cautela, levando-se em considerao a experincia e expertise do observador bem como a capacidade de se reproduzir o padro por parte do kit que pode ser de diferentes fabricantes. Autoanticorpos contra alguns antgenos tm associao bastante especfica com determinadas doenas autoimunes ou ao estado de autoimunidade em si, enquanto outros ocorrem indiscriminadamente em indivduos autoimunes e no autoimunes. Dessa forma, determinados padres de fluorescncia so mais especficos de doena autoimune enquanto outros ocorrem com frequncia em indivduos sadios ou em pacientes com outras enfermidades no autoimunes.1 Outro ponto a se considerar que o nvel de autoimunidade fisiolgica, ou basal, pode flutuar na dependncia de sobrecargas a que o sistema imunolgico seja exposto. Est
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bem demonstrada a presena de autoanticorpos desencadeada transitoriamente por infeces, por medicamentos e por neoplasias. Tem sido demonstrada claramente alta prevalncia de autoanticorpos em pacientes infectados pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV) e por outros vrus linfotrpicos.6 Portanto, outra considerao a ser feita ante um paciente com um achado positivo de PAAC-IFI em HEp-2 refere-se possibilidade de infeces virais recentes, uso de medicamentos e processos neoplsicos. vrias evidncias demonstram que os autoanticorpos frequentemente precedem a ecloso clnica das doenas autoimunes.7 Um teste de PAAC-IFI em HEp-2 positivo pode preceder o aparecimento clnico do LES em at nove anos. Cerca de 80% dos pacientes com LES apresentam PAAC-IFI em HEp-2 positivo antes do aparecimento dos primeiros sintomas. O mesmo vlido, embora em menor porcentagem, para os vrios autoanticorpos especficos dessa enfermidade, como anti-dNA nativo e anti-Sm. Portanto, outra possibilidade a se considerar em presena de um achado clinicamente inconsistente de PAAC-IFI em HEp-2 positivo a de que o paciente poder vir a desenvolver uma doena autoimune nos prximos anos. No entanto, alguns indivduos podem seguir dcadas com autoanticorpos circulantes sem desenvolver qualquer sinal de enfermidade autoimune.8 Perante um resultado positivo de PAAC-IFI em HEp-2 imprescindvel que se caracterize essa reatividade, buscando a presena de anticorpos peculiares de patologias autoimunes atravs de tcnicas especficas. Essa avaliao deve ser subsidiada por evidncia clnica ou laboratorial de doena autoimune sistmica. Alm do exame clnico apurado, importante verificar possveis alteraes em hemograma, urina I, protena C-reativa e velocidade de hemossedimentao (vHS), que podem ser considerados extenses do exame clnico. Em alguns casos, pode ser vlido investigar enzimas hepticas e musculares. Sintomas vagos, como artralgia e astenia, com exames laboratoriais gerais normais no so suficientes para oferecer subsdio para um achado laboratorial de PAAC-IFI em HEp-2 em ttulo baixo e com padro de fluorescncia pouco especfico. Nesses casos, o exerccio do bom senso com o acompanhamento da situao clnica do paciente em consultas regulares pode ser a melhor conduta. Os dois primeiros Consensos contriburam para o aperfeioamento das leituras e interpretao dos padres de PAAC-IFI em HEp-2 a partir da criao de critrios morfolgicos a serem seguidos durante a leitura do teste, da combinao dos critrios formando os grupos principais (ncleo, nuclolo, citoplasma, aparelho mittico e mistos), levando-se em considerao a grande diversidade de terminologias que eram utilizadas para
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caracterizar os diferentes padres. Foram ainda abordadas as informaes sobre as principais associaes clnicas dos diferentes padres e sugerida uma nova denominao para o teste que expressasse a sua dimenso diagnstica. Aps o segundo Consenso, surgiram questes que necessitariam de maior discusso e de melhor orientao. Um dos problemas observados diz respeito classificao do padro nuclear homogneo quanto reatividade dos nuclolos e em relao classificao dos padres mistos englobando mltiplas reatividades dentro do mesmo grupo, por exemplo, um padro com dois ou mais autoanticorpos contra antgenos nucleares. Outro aspecto relevante foi a necessidade de alertar quanto heterogeneidade dos substratos a comear pelo ttulo dos conjugados. Uma vez que alguns laboratrios no esto habituados a titular o conjugado contra um padro absoluto ou consensual, um mesmo teste realizado em kits de marcas diferentes pode apresentar ttulos divergentes. Esses problemas, em seu conjunto, so responsveis pela heterogeneidade de resultados entre os vrios laboratrios e precisam ser mais bem discutidos. Finalmente, ao longo dos anos sentiu-se necessidade de revisar as associaes clnicas dos diferentes padres estabelecidas no 2 Consenso. desse modo, o 3 Consenso Brasileiro para pesquisa de autoanticorpos em Clulas HEp-2 teve como propsito avaliar as dificuldades de implantao do 2 Consenso ocorrido no ano de 2002, discutir estratgias para controlar a qualidade do ensaio e promover a atualizao das associaes clnicas dos padres de fluorescncia.

RECOMENDAES GERAIS
A classificao dos nuclolos no padro nuclear homogneo passa a ser no reagente
O 3 Consenso reitera a classificao atual dos padres de fluorescncia nos quatro compartimentos celulares (citoplasma, ncleo, nuclolo e aparelho mittico). Ademais, foram feitas algumas definies para situaes de possvel ambiguidade ou indefinio. Nos casos em que o ncleo uniformemente corado e no se destaca a regio do nuclolo, os membros do Consenso entendem que no h reatividade precpua contra o nuclolo, portanto, o mesmo deve ser descrito como no reagente. Obviamente, o nuclolo ser tambm descrito como no reagente nos casos em que o mesmo se mostrar no corado. Quando da existncia de um padro nuclear, o nuclolo somente ser descrito como reagente quando sua colorao sobressair sobre a colorao do ncleo (Figura 1B). Registra-se o exemplo abaixo do laudo do padro nuclear homogneo: Paciente: F.C.O.F. Ensaio: Pesquisa de Anticorpos contra Antgenos Celulares (PAAC) Ncleo: reagente. Nuclolo: no reagente. Citoplasma: no reagente. Aparelho mittico: no reagente. Placa metafsica cromossmica: positiva Padro: nuclear homogneo

MTODO DE TRABALHO
Participaram do encontro em Goinia nos dias 13 e 14 de Abril de 2008 pesquisadores e especialistas de diversos centros universitrios e laboratrios clnicos de diferentes regies do Brasil com o propsito de discutir e aprovar as recomendaes que visam a melhor padronizao, interpretao e utilizao do ensaio pelos clnicos. Representantes comerciais de diferentes empresas produtoras de insumos para realizao do teste de PAAC-IFI em HEp-2 foram convidados como ouvintes. Os problemas abordados pelo grupo foram a necessidade de controlar a qualidade do ensaio, a definio de alguns aspectos controversos na classificao proposta no 2 Consenso, o relato de novos padres de fluorescncia e a reviso das associaes clnicas. Os problemas foram apresentados para os componentes da assemblia e discutidos amplamente com vistas obteno de consenso entre os diversos participantes. As discusses foram embasadas por prvia reviso da literatura referente aos diversos temas, bem como apresentao de dados prprios pelos participantes.
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Padres mistos
Foi retificada a definio de Padres Mistos. Foram categorizados como padres mistos todos os casos em que foram observadas a colorao de compartimentos celulares distintos (ncleo, nuclolo, citoplasma ou aparelho mittico) ou de diferentes padres de fluorescncia em um mesmo compartimento celular. Assim, por exemplo, o padro NuMA-1 considerado um padro misto, pois cora o ncleo e o aparelho mittico. Outro exemplo representado por um soro com uma mistura de autoanticorpos que corem simultaneamente o ncleo com padro pontilhado fino e padro pontilhado centromrico.

Padro nuclear pontilhado com pontos isolados

O 3 Consenso alterou a deliberao do 2 Consenso quanto necessidade de subclassificao do nmero de pontos no padro nuclear pontilhado do tipo pontos isolados em maior que 10 e menor que 10. A denominao do padro ficou esRev Bras Reumatol 2009;49(2):89-109

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tabelecida como Padro nuclear pontilhado do tipo pontos isolados. Essa mudana decorre do fato de que o nmero de corpos nucleares corados por anticorpos anti-p80-coilina e anti-sp-100 sofre considervel variao conforme o substrato celular em uso. Embora, o observador experiente consiga, na maior parte dos casos, sugerir com segurana o autoanticorpo mais provvel, o nmero de pontos por ncleo no um critrio absoluto.

Padres no caracterizados ou com caractersticas novas

Os membros do Consenso reconhecem que h padres no caracterizados ou com caractersticas no definidas conforme a classificao existente. Nesses casos, a recomendao que se descreva morfologicamente o padro observado e que se acrescente uma observao especificando que o mesmo no faz parte da nomenclatura do Consenso e que suas associaes imunolgicas e clnicas ainda no esto definidas. Nesses casos, de fundamental importncia que o laboratrio teste o suposto novo padro em kit comercial de marca diferente daquela em que originalmente observou o padro, evitando assim que condies artefatuais induzam uma falsa interpretao. Foram comunicados dois novos padres de fluorescncia por participantes do Consenso. vrios outros membros testemunharam j haver observado esses padres. O primeiro trata-se de um padro nuclear pontilhado fino, aproximando-se da textura homognea, e com placa metafsica corada da mesma forma. Sua associao clnica e identidade imunolgica no esto definidas. Sua importncia deriva do fato de que pode ser facilmente confundido com o padro pontilhado fino denso e com o padro homogneo (Figura 1). O segundo trata-se de um padro citoplasmtico em forma de pequenos bastes (rods) e crculos (rings) que, aparentemente, est associado infeco pelo HCv. H estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a finalidade de estabelecer sua identidade imunolgica (Figura 2). Como ainda no esto definitivamente caracterizados, esses dois novos padres foram considerados preliminares e o 3 Consenso recomendou que os mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na prxima verso do Consenso.

A - Nuclear pontilhado fino tendendo a homogneo

B - Nuclear homogneo

C - Nuclear pontilhado fino denso

Figura 1. (A) Padro nuclear pontilhado fino tendendo a homogneo. As clulas apresentam nucleoplasma com textura finamente pontilhada de tendncia homognea e placa metafsica corada na mesma textura. No deve ser confundido com padro nuclear homogneo e com pontilhado fino denso, pois no h reatividade contra o DNA nativo e a protena LEDGF/75KDa, respectivamente. Nas figuras B e C podem ser observados os padres nuclear homogneo e nuclear pontilhado fino denso, respectivamente. Imagens obtidas por imunofluorecncia indireta em clulas HEp-2.

Substratos a base de clulas geneticamente modificadas

O 3 Consenso no realizou estudos sistematizados com substratos geneticamente modificados, sendo este estudo possvel objeto de debate nos prximos encontros.
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Citoplasmtico em bastes e anis Figura 2. Padro citoplasmtico com fluorescncia em forma de bastes e anis (rods and rings). Aparentemente associado infeco pelo HCv e tratamento com interferon. Os antgenos alvos desses anticorpos ainda esto sendo definidos.

CONTROLE DE qUALIDADE
O 3 Consenso incentiva e recomenda a busca por programas de controle de qualidade. Essa recomendao visa fazer frente s dificuldades em garantir a qualidade do teste, dada a necessidade de profissionais com treinamento especializado, heterogeneidade dos kits comerciais e no padronizao de equipamentos pticos entre laboratrios. Entre os programas de qualidade institucionais, foram citados o do College of American Pathologists (CAP) e o programa educativo PAAC-IFI em HEp-2 da Controlab. Tambm foram citados programas e reagentes para controle de qualidade de empresas privadas, como o PCQAUTO da GMK diagnsticos, o Conexo HEp-2 da Hemagen diagnsticos e a lmina FITC-QC da ALKA Tecnologia em diagnsticos. Foi recomendada ainda a realizao por parte dos laboratrios da titulao do conjugado como medida fundamental para ajustar a quantidade de fluorocromo de acordo com a potncia da lmpada, equiparando os diferentes servios. Foi ressaltando ainda que esse procedimento deve ser realizado para cada novo kit de lote diferente. A manuteno dessa titulao nos kits do mesmo lote pode ser realizada a partir do uso de controles de baixa intensidade. Nesse quesito, ressalta a utilidade de lminas comerciais com micro-esferas pr-calibradas para diversas intensidades de fluorescncia e que podem ser utilizadas para treinamento e calibrao interna da leitura. Com o intuito de estimular a obteno de resultados fidedignos, o 3 Consenso recomenda que os laboratrios adiram aos programas de controle de qualidade e faam sistematicamente o controle de qualidade tcnico. de fundamental importn94

cia recordar que a reao de IFI depende de cinco fatores: o sistema ptico (microscpio), a potncia da lmpada (20, 50 ou 100W), a concentrao do conjugado, os soros controles de reatividade mnima (1/80) e o observador. A concentrao do conjugado permite equiparar sistemas pticos diferentes, lmpadas de potncias diferentes e a leitura do observador. Exemplo, se a potncia da lmpada baixa, recomendada a utilizao de um conjugado mais concentrado para se obter a mesma fluorescncia de uma lmpada de potncia maior. Para estabelecer a concentrao ideal do conjugado (ttulo do conjugado), devemos utilizar a tcnica de titulao em bloco em que vrias diluies do conjugado so cruzadas com diversas concentraes de um soro de referncia, procurando a maior diluio do conjugado capaz de reproduzir o ttulo nominal do soro de referncia. O soro de referncia pode acompanhar o kit pronto e o laboratrio passar a se referenciar ao sistema ptico, lmpada e leitor de acordo com o padro estabelecido pelo fabricante. O soro de referncia pode tambm ser adquirido comercialmente, obtido de instituies de controle de qualidade ou ainda o laboratrio poder enviar o seu soro a um laboratrio de sua referncia e, de posse dos resultados, passar a se referenciar a esse laboratrio. Uma vez feita a primeira referncia, o laboratrio poder armazenar semanalmente alquotas de soros de ttulos determinados no prprio laboratrio. O laboratrio dever manter em sua soroteca amostras para controle com ttulo de reatividade mnima (1/80), a serem diludas em 1/40, 1/80, 1/160 e 1/320. A cada bateria diria o laboratrio dever processar o controle baixo e dever considerar a bateria vlida se a variao de ttulos for de mais ou menos uma diluio. Se for observada inconformidade do controle; por exemplo, se uma amostra com ttulo mdio de 1/80 apresentarse como negativo, a bateria dever ser invalidada. Utilizando o controle de reatividade mnima (1/80), uma bateria de testes somente ser validada com a leitura de um ttulo a mais ou a menos de 80. No caso de ocorrer queda superior a 1(um) ttulo, provvel que o sistema tenha entrado em instabilidade. Recomenda-se, ento, que seja verificado, primeiramente, se houve problema na alquota armazenada, nesse caso repetindo o teste com a alquota armazenada na semana anterior. Se ao trmino da repetio o ttulo encontrado foi o previsto, chegaremos concluso de que a alquota do controle em uso havia se deteriorado. Se a nova alquota apresentou tambm queda do ttulo de mais de uma diluio, deveremos checar o sistema ptico (deteriorao do filtro UV, inundao da objetiva com glicerina tamponada e desempenho da lmpada). Caso no seja encontrada alterao nesses componentes e no nmero de horas de uso da lmpada, a causa mais provvel ser degradao do
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conjugado, que deve ento ser submetido a novo processo de titulao, como descrito anteriormente.

Observaes
1. Recomenda-se controle do conjugado a cada 15 dias. 2. Quando um novo kit for aberto, deve ser realizada nova titulao do conjugado. 3. As objetivas e os filtros do microscpio interferem na definio do ttulo do conjugado, devendo ser checados rotineiramente. 4. Alm da checagem do tempo de lmpada, necessrio checar se a lmpada est centrada. Isso pode ser feito utilizando uma folha de papel branca colocada na mesa do microscpio e observado com objetiva de 10 se a lmpada est centrada. Caso seja observado escurecimento de parte do campo, o manuseio dos botes de centragem direita e esquerda, superior e inferior e foco da lmpada devero ser acionados a fim de realizar o ajuste.

Em sua vasta maioria, as associaes anteriormente descritas foram acordadas por unanimidade entre os participantes do Consenso. Nos raros casos em que no houve unanimidade, acatou-se a opinio majoritria. Essa iniciativa reflete a vigorosa atividade de pesquisa no campo de autoanticorpos em geral, e de anticorpos antincleo em particular, em nosso pas. deve ser enfatizado que essa atividade tem proporcionado uma evoluo progressiva e marcante de nossa comunidade cientfica e profissional, firmando uma posio nacional independente em relao forma de realizar e interpretar o ensaio para determinao de autoanticorpos em clulas HEp-2. Essa caracterstica tem beneficiado tambm os clnicos que lanam mo desse exame laboratorial e, por conseguinte, os pacientes que a eles recorrem. Finalmente, necessrio que fique claro que esse um processo de amadurecimento contnuo e progressivo e que o mesmo depende da interao de toda a comunidade envolvida com as vrias etapas do processo.

ASSOCIAES CLNICAS E DESCRIO DOS PADRES

Os membros do 3 Consenso procederam a uma ampla discusso para validao e reavaliao das associaes clnicas e imunolgicas referentes aos padres de PAAC-IFI em HEp-2. As recomendaes advindas dessa atividade esto listadas na Tabela 1.

AGRADECIMENTOS
Sociedade Brasileira de Reumatologia (SBR) Sociedade Brasileira de Patologia Clnica e Medicina Laboratorial (SBPC) Sociedade Brasileira de Anlises Clnicas (SBAC) Conselho Regional de Biomedicina 3 regio (CBRM-3)

Tabela 1 Padres de PAAC-IFI em HEp-2, descrio, principais autoanticorpos associados e associaes clnicas mais frequentes
Padres Nuclear tipo membrana nuclear Descrio O padro caracterizado por uma fluorescncia em toda a membrana nuclear (podendo ser emitida com informao adicional em aspecto contnuo ou pontilhado). No observamos fluorescncia em nuclolos e citoplasma; a clula em diviso em todos os estgios apresenta-se no fluorescente. No confundir com o antigo padro perifrico observado em fgado de rato onde o DNA de dupla hlice se encontrava ancorado s protenas da membrana nuclear, dando seu aspecto caracterstico. Relevncias clnicas por autoanticorpos Anticorpo contra protenas do envelope nuclear. Cirrose biliar primria, hepatites autoimunes, raramente associado a doenas reumticas. Algumas formas de lpus eritematoso sistmico e esclerodermia linear, sndrome do anticorpo antifosfolpide. Esse padro pode ser observado em indivduos sem evidncia aparente de autoimunidade, principalmente quando em baixos ttulos. Anticorpo anti-gp210 especfico para cirrose biliar primria. Outros autoanticorpos associados a esse padro: anti-p62 (nucleoporina), anti-lamin A, anti-lamin B, anti-lamin C, anti-LBP.9
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Nuclear homogneo

Nucleoplasma fluorescente de forma homognea e regular. No possvel distinguir a rea de nuclolo e este considerado no reagente. Placa metafsica cromossmica intensamente corada, de aspecto hialino, com decorao homognea dos cromossomos, tambm positiva na anfase e telfase. Citoplasma normalmente no fluorescente.

Anticorpo anti-DNA nativo. Marcador de lpus eritematoso sistmico. Anticorpo anti-histona. Marcador de lpus eritematoso sistmico induzido por drogas, lpus eritematoso sistmico idioptico, artrite reumatoide, artrite idioptica juvenil, importante associao com uvete na forma oligoarticular, sndrome de felty e hepatite autoimune.10 Anticorpo anticromatina (DNA/Histona, nucleossomo). Lpus eritematoso sistmico.11

Nuclear pontilhado grosso

Nucleoplasma com grnulos de aspecto grosseiro, heterogneos em tamanho e brilho, sendo que sobressaem alguns poucos grnulos maiores e mais brilhantes (1 a 6/ncleo) que correspondem ao corpo de Cajal, rico em ribonucleoprotenas do spliceossomo. Nuclolo, clula em diviso e citoplasma no fluorescentes. Nucleoplasma com granulao fina. Nuclolo, clula em diviso e citoplasma no fluorescentes.

Anticorpo anti-Sm. Marcador para lpus eritematoso sistmico.12 Anticorpo anti-Rnp. Critrio obrigatrio no diagnstico da doena mista do tecido conjuntivo, tambm presente no lpus eritematoso sistmico e esclerose sistmica.12 Anticorpo anti-SS-A/Ro. Sndrome de Sjgren primria, lpus eritematoso sistmico, lpus neonatal, e lpus cutneo subagudo, esclerose sistmica, polimiosite e cirrose biliar primria.13 Anticorpo anti-SS-B/La. Sndrome de Sjgren primria, lpus eritematoso sistmico, lpus neonatal.13

Nuclear pontilhado fino

Nuclear pontilhado fino denso

Nucleoplasma da clula em intrfase apresenta-se como um pontilhado peculiar, de distribuio heterognea, nuclolo no fluorescente. A clula em diviso apresenta decorao em pontilhado intenso e grosseiro dos cromossomos na placa metafsica, com citoplasma no fluorescente.

Anticorpo antiprotena p75 (cofator de trascrio) denominado LEDGF/p75. um dos padres mais frequentes encontrados na rotina, cuja correlao clnica ainda no est bem estabelecida, sendo frequentemente encontrado em indivduos sem evidncia objetiva de doena sistmica. Encontrado raramente em doenas reumticas autoimunes, processos inflamatrios especficos e inespecficos. Existem relatos na literatura do encontro desse padro em pacientes com cistite intersticial, dermatite atpica, psorase e asma.14 Anticorpo anti-p80 coilina. No possui associao clnica definida.15 Anticorpo anti-Sp100 anti-p95. Descrito principalmente na cirrose biliar primria.16 Anticorpo anticentrmero (protenas CENP-A, CENP-B e CENP-C). Esclerose sistmica forma CREST (calcinose, fenmeno de Raynaud, disfuno motora do esfago, esclerodactilia e telangiectasia), cirrose biliar primria e sndrome de Sjgren. Raramente observado em outras doenas autoimunes. Pode preceder a forma CREST por anos.17,18 Anticorpo contra ncleo de clulas em proliferao (AntiPCNA). Encontrado especificamente em pacientes com lpus eritematoso sistmico.19

Nuclear pontilhado pontos isolados

Nucleoplasma apresenta-se com pontos fluorescentes isolados (podendo ser fornecida como informao adicional o numero de pontos maior ou igual a 10 ou menos do que 10 pontos por ncleo). Nuclolo, clula em diviso e citoplasma no fluorescentes. Nucleoplasma da clula em intrfase, apresentando-se pontilhado com um nmero constante de 46 pontos. Nuclolo normalmente no fluorescente, clula em diviso apresenta concentrao dos pontos na placa metafsica. Citoplasma no fluorescente. O nucleoplasma apresenta-se totalmente no fluorescente na clula em fase G1 da intrfase, passando a pontilhado com grnulos variando de grosso, fino a fino denso na medida em que a clula evolui para as fases S e G2. Nuclolo e citoplasma no fluorescentes. Esse padro sugestivo de anticorpos anti-PCNA. Nuclolo homogneo, clula em diviso e citoplasma no fluorescentes.

Nuclear pontilhado centromrico

Nuclear pontilhado pleomrfico

Nucleolar homogneo

Anticorpo anti-To/Th. Ocorre na esclerose sistmica.20 Anticorpo antinucleolina. Muito raro, descrito no lpus eritematoso sistmico, doena enxerto versus hospedeiro e na mononucleose infecciosa. Anticorpo anti-B23 (nucleofosmina). Descrito na esclerose sistmica, alguns tipos de cncer sndrome do anticorpo antifosfolpide e doena enxerto versus hospedeiro.

Nucleolar aglomerado

O nuclolo se apresenta com grumos de intensa fluorescncia (como cachos de uva). Citoplasma e ncleo no fluorescentes. A clula em diviso apresenta-se amorfa, com colorao delicada em volta dos cromossomos da placa metafsica.

Anticorpo antifibrilarina (U3-nRNP). Associado esclerose sistmica, especialmente com comprometimento visceral grave, entre elas a hipertenso pulmonar.21

Continua

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Nucleolar pontilhado

Decorao pontilhada nucleolar e 5 a 10 pontos distintos e brilhantes ao longo da placa metafsica cromossmica. Ncleo e citoplasma no corados.

Anticorpo anti-NOR 90. Inicialmente descrito na esclerose sistmica. Atualmente descrito em outras doenas do tecido conjuntivo, porm sem relevncia clnica definida.21 Anticorpo anti-RNA polimerase I. Esclerose sistmica de forma difusa com tendncia para comprometimento visceral mais frequente e grave.21 Anticorpo anti-ASE (anti-sense to ERCC-1). Frequentemente encontrado em associao a anticorpos anti-NOR-90. A associao mais frequente parece ser o lpus eritematoso sistmico.

Citoplasmtico fibrilar linear

Fibras de estresses que constituem o citoesqueleto decoradas de forma retilnea, cruzando toda a extenso da clula e no respeitando os limites nucleares. Ncleos e nuclolos no fluorescentes.

Anticorpo antiactina. Encontrado em hepatopatias: hepatite autoimune, cirrose. Anticorpo antimiosina. Hepatite C, hepato-carcinoma, miastenia gravis. quando em ttulos baixos ou moderados podem no ter relevncia clnica definida.22,23

Citoplasmtico fibrilar filamentar

Decorao de filamentos com acentuao uni ou bipolar em relao membrana nuclear. Ncleos e nuclolos no fluorescentes.

Anticorpo antivimentina e antiqueratina. Anticorpo antiqueratina o anticorpo mais importante em doena heptica alcolica. Descritos em vrias doenas inflamatrias e infecciosas. quando em ttulos baixos ou moderados podem no ter relevncia clnica definida.24 Antialfa-actinina, antivinculina e antitropomiosina. Anticorpos encontrados na miastenia gravis, doena de Crohn e colite ulcerativa. quando em ttulos baixos ou moderados podem no ter relevncia clnica definida.24 Anticorpo antigolginas (cisternas do aparelho de Golgi). Raro no lpus eritematoso sistmico, sndrome de Sjgren primria e outras doenas autoimunes sistmicas. Relatado em ataxia cerebelar idioptica, degenerao cerebelar paraneoplsica e infeces virais pelo vrus Epstein Barr (EBV) e pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV). quando em ttulos baixos ou moderados podem no ter relevncia clnica definida.25,26 Anticorpo anti-EEA1 e antifosfatidilserina. No h associaes clnicas bem definidas. Anticorpo anti-GWB. Associado sndrome Sjgren primria, embora observado tambm em diversas outras condies clnicas.27

Citoplasmtico fibrilar segmentar

Apenas segmentos curtos das fibras de estresse se encontram fluorescentes. Ncleo e nuclolos negativos. Nas clulas em diviso, podemos observar eventualmente mltiplos grnulos intensamente fluorescentes que correspondem forma globular das protenas do citoplasma. Esse tambm um laudo obrigatrio, pois evidencia cisternas do aparelho de Golgi. A decorao apenas citoplasmtica em pontos agrupados de situao perinuclear, normalmente em apenas um plo nuclear. Ncleo, nuclolo e clula em diviso no fluorescentes.

Citoplasmtico pontilhado polar

Citoplasmtico pontilhado pontos isolados

Pontos definidos de nmero varivel por toda a extenso do citoplasma. Ncleo, nuclolo e clula em diviso no fluorescentes.

Citoplasmtico pontilhado fino denso

Fluorescncia de pontos finos, densos e confluentes, chegando quase homogeneidade. O ncleo no est corado, mas pode ou no apresentar uma leve decorao homognea na rea do nuclolo. A clula em diviso no fluorescente. No caso de haver fluorescncia concomitante de citoplasma e nuclolo, o padro classificado como misto.

Anticorpo anti-PL7/PL12.Esse padro de fluorescncia pode raramente estar associado a anticorpos encontrados na polimiosite.20 Anticorpo antiprotena P-ribossomal. Esse padro ocorre no lpus eritematoso sistmico e est particularmente associado ao anticorpo antiprotena P-ribossomal.28 Anticorpo anti-histidil t RNA sintetase (Jo1). Anticorpo marcador de polimiosite no adulto. Descrito raramente na dermatomiosite. Outros anticorpos anti-tRNA sintetases podem gerar o mesmo padro.20 Anticorpo antimitocndria. Marcador da cirrose biliar primria. Raramente encontrado na esclerose sistmica. Devido ao encontro relativamente comum de padro assemelhado e no relacionado a anticorpos antimitocndria, fundamental a confirmao por teste especfico.29,30
Continua

Citoplasmtico pontilhado fino Pontos definidos em grande nmero e densidade, clula em diviso e nuclolo no fluorescentes.

Citoplasmtico pontilhado reticulado

Fluorescncia em mltiplos pontos dispostos sob forma de retculo irradiando a partir da periferia do ncleo por todo o citoplasma. Ncleo, nuclolo e clula em diviso no fluorescentes.

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Aparelho mittico tipo centrolo

Ponto fluorescente isolado no citoplasma em um plo na clula em repouso (intrfase) que se divide em dois e migra ao plo oposto do ncleo medida que a clula entra em diviso. Antgenos que formam a unio entre clulas me/filha ao final da telfase. Podem ser observados com fluorescncia intensa na ponte citoplasmtica que sofrer clivagem ao final da diviso celular.

Anticorpo antialfa-enolase. Em baixos ttulos no tm associao clnica definida. Em altos ttulos pode estar associado esclerose sistmica. Anticorpo antibeta-tubulina. Podem ser encontrados no lpus eritematoso sistmico e na doena mista do tecido conjuntivo. Outros anticorpos ainda no bem definidos podem gerar o mesmo padro. Associado a diversas condies autoimunes com baixa especificidade tendo relevncia clnica somente em altos ttulos.32 Anticorpo anti-HsEg5/NuMA-2. Associado a diversas condies autoimunes com baixa especificidade, tendo relevncia clnica somente em altos ttulos.36

Aparelho mittico tipo ponte intercelular

Aparelho mittico tipo fuso mittico (NuMa-2)

Clulas em intrfase se encontram no fluorescentes em todas as suas estruturas. H decorao extensa e grosseira nos plos mitticos das clulas em metfase e as pontes intercelulares so positivas na telfase. Citoplasma no fluorescente. As clulas em intrfase apresentam o ncleo corado como um pontilhado bem fino, geralmente em alto ttulo. Clulas mitticas em metfase e anfase apresentam colocao bem definida e delicada da regio pericentrossmica e das partes proximais do fuso mittico. Na telfase j se v novamente a colorao pontilhada dos ncleos neoformados e no se v colorao da ponte intercelular. Clulas em intrfase apresentam o ncleo corado como pontilhado grosso e o nuclolo corado de forma homognea. Na metfase h colorao ao redor da placa metafsica. Clulas em intrfase apresentam o ncleo corado de forma pontilhada fina e o nuclolo sobressai tambm com padro pontilhado fino. Na metfase, a placa metafsica apresenta padro pontilhado fino. Clulas em intrfase apresentam o ncleo corado de forma pontilhada fina delicada e sobressaindo o nuclolo corado com padro pontilhado (pontos individuais). O citoplasma no corado. Na metfase, observam-se 5 a 10 pontos isolados e brilhantes na placa metafsica, correspondentes s regies organizadoras de nuclolo (NOR). O ncleo totalmente no corado e o nuclolo corado fracamente. O citoplasma apresenta intensa colorao com pontilhado muito fino e muito denso, quase homogneo. As clulas mitticas no so coradas.

Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescncia do aparelho mittico

Anticorpo anti-NuMa1. Associado sndrome de Sjgren, podendo ocorrer tambm em outras condies autoimunes ou inflamatrias crnicas. quando em ttulos baixos ou moderados, pode no estar associado evidncia objetiva de doena inflamatria sistmica.32

Misto do tipo nuclear pontilhado grosso e nucleolar homogneo Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado fino com placa metafsica corada

Anticorpo anti-KU. Marcador de superposio, polimiosite e esclerose sistmica. Podem ocorrer no lpus eritematoso sistmico e esclerodermia.33 Anticorpo anti-DNA topoisomerase I (Scl-70). Associado a esclerose sistmica forma difusa, em que indica formas de maior comprometimento visceral. Mais raramente pode ocorrer na sndrome CREST e superposio.34 Anticorpos anti-RNA polimerase I e II. Esses dois autoanticorpos usualmente aparecem em combinao, sendo a RNA pol I responsvel pela distribuio nucleolar e em NOR, enquanto a RNA pol II responde pela distribuio nuclear. Anti-RNA pol I considerado marcador de esclerose sistmica e anti-RNA pol II aparece em diversas condies autoimunes.34 Anticorpo anti-rRNP (antiprotena P ribossomal). Marcador de lpus eritematoso sistmico e mais frequentemente relacionado psicose lpica. Tambm parece estar associado atividade da doena.28,35

Misto do tipo nuclear pontilhado fino e nucleolar pontilhado.

Misto do tipo citoplasmtico pontilhado fino denso a homogneo e nucleolar homogneo

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