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DISCIPLINA: ANLISE BACTERIOLGICA DA GUA PROFESSORA MARIA DAS DORES COSTA DUARTE

RELATRIO DE AULA: QUANTIFICAO DE BACTRIAS HETEROTRFICAS MESFILAS; ISOLAMENTO DE BACTRIAS (TCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS); MTODO DE GRAM.

Drio Macedo Lima e Jos Eduardo da Silva Castro Curso Tcnico Integrado em Controle Ambiental 3ano

Joo Pessoa Novembro de 2011

Autores: Drio Macedo Lima e Jos Eduardo da Silva Castro

RELATRIO DE AULA: QUANTIFICAO DE BACTRIAS HETEROTRFICAS MESFILAS; ISOLAMENTO DE BACTRIAS (TCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS); MTODO DE GRAM.

Relatrio de aula destinado disciplina de Anlise Bacteriolgica da gua, ministrada pela Professora Maria das Dores Costa Duarte.

Joo Pessoa Novembro de 2011


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SUMRIO
1. INTRODUO______________________________________________________4 2. OBJETIVOS_________________________________________________________6 2.1. Quantificao de bactrias heterotrficas mesfilas___________________6 2.2. Isolamento de bactrias (tcnica de semeadura por estrias)_____________6 2.3. Mtodo de Gram______________________________________________6 3. METODOLOGIA____________________________________________________7 3.1. Quantificao de bactrias heterotrficas mesfilas___________________7 3.1.1. Preparao da amostra e diluies_____________7 3.1.1.1. Material_________________7 3.1.1.2. Procedimento____________7 3.1.2. Preparao do gar Padro para Contagem (PCA)________________________________________________________________8 3.1.2.1. Material_________________8 3.1.2.2. Procedimento____________9 3.1.3. Plaqueamento em profundidade_______________9 3.1.3.1 Material_________________9 3.1.3.2 Procedimento_____________9 3.1.4. Plaqueamento em superfcie_________________10 3.1.4.1. Material________________10 3.1.4.2. Procedimento___________10 3.1.5 Contagem das colnias e clculo dos resultados _11 3.2. Isolamento de bactrias (tcnica de semeadura por estrias)____________14 3.2.1. Material_________________________________14 3.2.2. Procedimento_____________________________14 3.3. Mtodo de Gram_____________________________________________16 3.2.1 Material__________________________________16 3.2.2. Procedimento_____________________________16 4. CONSIDERAES FINAIS___________________________________________17 5. REFERNCIAS_____________________________________________________18

1. INTRODUO
A importncia de se conhecer a composio microbiolgica da gua nos dias atuais indiscutvel, uma vez, que vivenciamos uma realidade na qual grande parte dos recursos hdricos existentes so atingidos pela ao antrpica inconseqente. De acordo com a OMS (Organizao Mundial da Sade), em todo o mundo, as doenas transmitidas pela gua esto entre as principais causas de bito de crianas com idade abaixo de 5 anos e, a cada ano, mais pessoas morrem em conseqncia da gua insegura que por todas as formas de violncia, incluindo as guerras. A qualidade da gua est intimamente relacionada com a sade humana, animal e de ecossistemas. Neste contexto, surge a necessidade de se realizar anlises que possam averiguar a potabilidade dos ecossistemas de gua doce para potencializar aes de proteo sade humana e de preservao do meio ambiente. Nessa avaliao da qualidade microbiolgica da gua so usualmente empregadas as bactrias do grupo coliforme, que se for encontrada na gua pode evidenciar o risco da presena de organismos patognicos. Mas alm desse aspecto, outras anlises, como a contagem de bactrias heterotrficas mesfilas tambm se fazem necessrias. Compreende-se como heterotrficas as bactrias que requerem um ou mais compostos orgnicos, sem ser o dixido de carbono (CO2), para a sntese de seu protoplasto. A maioria das bactrias, incluindo muitas das bactrias associadas a sistemas de gua potvel, so heterotrficas. Quantificar a presena dessas bactrias na gua importante quando se quer manter o controle sob a populao bacteriana geral, uma vez que densidades muito elevadas de microorganismos na gua podem provocar a perda da sua qualidade, com desenvolvimento de odores e sabores desagradveis e produo de limo ou pelcula. Alm disso, a elevada concentrao desses organismos na gua pode representar um risco sade humana, pois embora a maioria das bactrias da flora normal da gua no seja patognica, algumas delas podem atuar como patgenos oportunistas. Nesse sentido, bactrias patognicas oportunistas como a Pseudomonas e a Elavobacterium, quando presentes em elevado grau na gua potvel podem constituir um risco sade de pacientes debilitados em hospitais, creches, berrios, casas de repouso, etc. O nmero elevado de bactrias heterotrficas mesfilas tambm pode inibir a presena de coliformes, impedindo a deteco dos mesmos, conseqncia da produo de fatores de inibio ou de um desenvolvimento mais intenso sobrepujando uma menor populao de coliformes. A portaria 518 do Ministrio da Sade determina que densidades de bactrias heterotrficas no podem estar acima de 500 UFC/ml pela possibilidade de provocarem interferncia na deteco de coliformes. De acordo com o livro Comentrios sobre a portaria MS N. 518/2004 a contagem de bactrias heterotrficas presta-se, portanto, a um certo controle de qualidade dos resultados de coliformes e cumpre ainda um papel auxiliar de indicador da estabilidade do sistema de distribuio. As elevaes bruscas ou acima do usual na densidade de bactrias heterotrficas devem ser interpretadas como suspeita da ocorrncia de anomalias. Em termos de aplicao, a determinao da densidade de bactrias heterotrficas em guas um importante instrumento auxiliar no controle bacteriolgico para: avaliao das condies higinicas e de proteo de poos, fontes, reservatrios, piscinas e sistemas de distribuio de gua para o consumo humano; avaliao da eficincia na remoo de bactrias das diversas etapas de operao de estaes de tratamento de gua; estimativa da biomassa de bactrias heterotrficas presentes em

corpos de gua; e avaliao das condies higinicas e da eficincia de operaes de piscinas. Na identificao da composio microbiolgica da gua tambm valido realizar o mtodo de Gram. O teste baseado na colorao de bactrias foi desenvolvido em 1884 pelo mdico dinamarqus Hans Christian Gram. O mtodo de Gram permite dividir as bactrias em duas classes: Gramnegativas e Gram-positivas. Essa diferenciao fez do mtodo uma referncia quanto ferramenta na classificao e estudo de bactrias. A classificao da bactria nesse teste depender da parede celular do organismo. Se for estruturalmente simples a colorao ser positiva, se for estruturalmente complexa a colorao ser ento negativa. A reao das bactrias tcnica de Gram expressa diferentes caractersticas, de modo especial no que diz respeito composio qumica, estrutura, permeabilidade da parede celular, fisiologia, metabolismo e patogenicidade. Os organismos gramnegativos, por exemplo, so constitudos por uma endotoxina denominada LPS (lipopolissacardeo), que causadora da patogenicidade. A colorao de Gram , portanto, uma etapa de confirmao, que tem por objeto confirmar as caractersticas morfolgicas das bactrias. Entre as bactrias gram-negativas esto: Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Bdellovibrio e Legionella. So bactrias gram-positivas: bactrias do filo firmicutes (Bacilos, Estreptococos, Estafilococos, Enterococos, Actinobacteria, Listeria). A execuo do mtodo de Gram e de qualquer outro processo de caracterizao e estudo de bactria exige que estes organismos estejam disponveis como uma cultura pura isolada. O termo cultura pura quer dizer que todas as clulas da cultura tm uma origem comum, isto , so descendentes da mesma clula. A tcnica aplicada na obteno dessas colnias isoladas a de semeadura por estrias, tambm chamada de esgotamento de ala, esgotamento em estrias, estrias mltiplas ou ainda estrias de esgotamento. Mas existem outras tcnicas que fazem esse isolamento. Neste relatrio descreveremos alguns mtodos de anlise bacteriolgica da gua, como a contagem de bactrias heterotrficas, o mtodo de Gram e a tcnica de isolamento de bactrias.

2. OBJETIVOS 2.1. Quantificao de Bactrias Heterotrficas Mesfilas


O mtodo tem como objetivo quantificar a presena de bactrias heterotrficas (genericamente definidas como microorganismos que requerem carbono orgnico como fonte de nutrientes), fornecendo informaes sobre a qualidade bacteriolgica da gua de uma forma ampla. O teste inclui a deteco, inespecfica, de bactrias ou esporos de bactrias, sejam de origem fecal, componentes da flora natural da gua ou resultantes da formao de biofilmes no sistema de distribuio, sendo que algumas podem ser patognicas oportunistas. (COMENTRIOS PORT. 518, 2004)

2.2. Isolamento de Bactrias (Tcnica de Semeadura por Estrias)


O mtodo tem como objetivo a obteno de colnias isoladas, adquirindo culturas puras. A disponibilidade dessas culturas puras um pr-requisito para a caracterizao de uma espcie microbiana no laboratrio de microbiologia. As colnias obtidas so usadas, por exemplo, para determinao do gram da bactria por meio do mtodo de Gram.

2.3. Mtodo de Gram


O mtodo tem como objetivo classificar as bactrias como Gram-negativas ou Gram-positivas a partir de processos de colorao conhecidos como colorao de Gram. Esta categorizao permite distinguir os mais variados tipos de bactrias e que tipo de parede celular elas tem (se mais simples ou mais complexas, com mais ou menos peptideoglicanos principal componente da parede celular bacteriana).

3. METODOLOGIA 3.1. Quantificao de Bactrias Heterotrficas Mesfilas


A contagem pode ser feita utilizando-se os mtodos de plaqueamento em profundidade (pour plate), superfcie (spread plate) e filtrao em membrana. Este ltimo no foi executado durante as aulas prticas, por isso, este relatrio descrever apenas os dois primeiros.

3.1.1. Preparao da amostra e diluies


A amostra pode ser inoculada pura ou diluda. A amostra diluda quando se subtende que gua est contaminada, uma vez que o resultado de UFC (Unidades Formadoras de Colnias) deve estar entre 25 e 250 colnias. A gua Peptonada 0,1% (H2Op) o diluente que se costuma usar em anlise de bactrias heterotrficas em gua e sua preparao, juntamente com o processo de diluio, esto descritos a seguir. A Soluo de Estoque A e Soluo de Estoque B tambm podem ser usadas como diluentes nessa metodologia.

3.1.1.1. Material
y y y y y y y y y y y y Peptona. Balana Digital. Vidro de Relgio. Esptula. Becker. Basto de vidro. gua destilada. Proveta. Frascos de diluio. Autoclave. Pipetas de 10 ml esterilizadas. Bico de Bunsen.

3.1.1.2. Procedimento
Diluir 1 g de Peptona em 1000 ml de gua destilada. Se desejar um volume menor de H2 Op , proporcional ao que vai ser utilizado, necessita-se, portanto, de efetuar uma regra de trs relacionando a quantidade que vai ser usada proporo dada. Somase o volume gasto de H2 Op nas trs diluies (90 ml em cada frasco) e preparamos a soluo baseados naquele nmero: Exemplo: 3 frascos x 90 ml de soluo = 270 ml As solues de diluio so preparadas em quantidade um pouco acima do necessrio por medida de precauo a eventuais desperdcios.
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A partir da calcula-se a massa de Peptona a ser utilizada em uma soluo de 300 ml de gua Peptonada como no exemplo a seguir. A proporo de Peptona a ser usada geralmente dada na embalagem do produto. 1g ________________1000 ml X ________________300 ml X = 0,3 g de Peptona Aps a pesagem, diluio da Peptona em gua destilada e distribuio dos 90 ml de gua Peptonada em cada frasco de diluio, autoclava-se os mesmos durante 15 minutos a 121 C. Aps esterilizados, um dos frascos deve receber, com o auxlio de uma pipeta estreo, 10 ml da amostra a ser analisada, ele ser etiquetado como frasco de diluio 10-1. Em seguida, deve-se homogeneizar a diluio. Com outra pipeta estrea, deve-se passar, novamente, 10 ml da amostra j diluda em 10-1 para outro frasco, que ser rotulado como de diluio 10-2. Homogeneizar a diluio. Para diluir novamente seguese o mesmo processo. Vale lembrar que a diluio da amostra deve ser realizada com os cuidados e tcnicas que j so de praxe: y Bancada sanitizada; y Utilizao de luvas, mscara e toca; y Bico de Bunsen ligado e o mais prximo possvel de onde est se realizando a tcnica. Nota: Na preparao da gua Peptonada, seguir sempre as instrues do fabricante, que vem estampada no rtulo do frasco.

3.1.2. Preparao do gar Padro para Contagem (PCA)


o meio de cultura onde a amostra ser inoculada. gar R2A ou NWRI tambm so meios de cultura usados em contagem de bactrias heterotrficas em gua.

3.1.2.1. Material
y y y y y y y y y y y y
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gar Padro para Contagem ou Plate Count Agar desidratado. Balana Digital. Vidro de Relgio. Esptula. Becker. Basto de vidro. gua destilada. Proveta. Balo de fundo chato ou tubos de ensaio com tampas rosqueveis. Algodo. Papel de Alumnio. Autoclave.

3.1.2.2. Procedimento
Pesar 20,5 gramas do meio de cultura desidratado e dissolver em 1000 ml de gua destilada fria. Se desejado a obteno de um volume menor de PCA, realizar uma regra de trs tomando como base a proporo dada. Aps a diluio preciso deixar a soluo em repouso durante 5 minutos. Em seguida, deve-se aquec-la, agitando freqentemente com basto de vidro, at completa dissoluo do meio (durante o aquecimento no deixar entrar em ebulio). Se necessrio, ajustar o pH para 7,0 com Hidrxido de Sdio soluo normal (NaOH 1N). Por fim distribuir o PCA em tubos de ensaio com tampa rosquevel (12 ml em cada tubo) ou transferi-lo para um balo de fundo chato tampado com algodo e papel alumnio. A esterilizao deve ser feita a 121 C (1 Kg/cm2 de presso) em autoclave durante 15 minutos. Notas: 1. Este meio, depois de frio, se solidifica. Fundir em banho-maria antes de us-lo. 2. Devido variedade de meios de cultura existentes no mercado, seguir sempre as instrues do fabricante, que vem estampada no rtulo do frasco.

3.1.3. Plaqueamento em profundidade


A tcnica consiste em pipetar primeiro a amostra na placa de Petri e em seguida adicionar o meio de cultura fundido. Apresenta desvantagens porque o meio de cultura previamente fundido e a uma temperatura de 44C a 46C pode causar choque trmico nas bactrias debilitadas, e o meio de cultura nutricionalmente rico pode afetar a recuperao dessas bactrias.

3.1.3.1. Material
y y y y y y Placas de Petri estreis. Pipetas de 1 ml e 15 ml estreis. Bico de Bunsen. PCA. Estufa Bacteriolgica. Lupa e contador de clonias

3.1.3.2. Procedimento
Selecionar trs diluies adequadas da amostra e inolucar 1ml de cada diluio em placas de Petri separadas, estreis e vazias. Em seguida, adiciona-se o meio de cultura. O mtodo consiste em entreabir a placa e adicionar de 12 a 15 ml de PCA, previamente fundido e resfriado a 44-46C. Misturar o inculo com o meio de cultura movimentando suavemente as placas, numa superfcie plana, em movimentos circulares moderados em forma de oito (8), em torno de dez vezes consecutivas. Quando o meio de cultura se solidificar, incubar a placa em posio invertida a 35 0,5 C durante 48 3 horas.
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A inoculao deve ser executada com os cuidados e tcnicas que j so de praxe: y Bancada sanitizada; y Utilizao de luvas, mscara e toca; y Bico de Bunsen ligado e o mais prximo possvel de onde est se realizando a tcnica.

3.1.4. Plaqueamento em superfcie


A tcnica consiste em inocular primeiramente o meio de cultura e depois adicionar a amostra de gua na superfcie do PCA j slido. Nesse mtodo o choque trmico da tcnica do pour plate eliminado e, adicionalmente, todas as colnias se desenvolvem na superfcie do meio de cultura, o que facilita a visualizao e contagem, alm de permitir a pronta distino entre as mesmas partculas ou bolhas de ar. A tcnica se limita ao fato de o volume da amostra utilizada ser pequeno (no mximo de 0,5 ml).

3.1.4.1. Material
y y y y y y y Placas de Petri estreis. Pipetas de 0,1 ml e 15 ml estreis. Bico de Bunsen. PCA. Ala Drigalski. Estufa Bacteriolgica. Lupa e contador de colnias.

3.1.4.2. Procedimento
Preparar previamente placas de PCA, distribuindo de 12 a 15 ml do meio em cada placa de Petri. Aguardar o meio de cultura se solidificar. Selecionar trs diluies adequadas da amostra e inocular 0,1 ml de cada diluio na superfcie do PCA. Usando uma ala de Drigalski, espalhar o inculo por toda a superfcie do meio, at que o excesso de lquido seja absorvido. Se o nvel de contaminao esperado da amostra for baixo, inocular um volume maior (1 ml) da primeira diluio, distribuindo esse volume por quatro placas (trs placas com 0,3 ml e uma placa com 0,1 ml). Aguardar que as placas sequem (mnimo 15min), inverter e incubar a 35 0,5 C durante 48 3 horas. A inoculao deve ser executada com os cuidados e tcnicas que j so de praxe: y Bancada sanitizada; y Utilizao de luvas, mscara e toca; y Bico de Bunsen ligado e o mais prximo possvel de onde est se realizando a tcnica.
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3.1.5. Contagem das colnias e clculo dos resultados


No final do perodo de incubao devem-se selecionar as placas com 25 a 250 colnias e contar as colnias com o auxlio de uma lupa, em um contador de colnias. Calcular o nmero de unidades formadoras de colnia (UFC) por grama ou mililitro da amostra multiplicando o nmero de colnias pelo inverso da diluio inoculada. Exemplo: N placas/ diluio 1 10-1 INC 10-2 230 10-3 21 Contagem (UFC/ml ou g) 230 = 2,3 x 104 10-2

Usar notao exponencial e apenas uma casa decimal depois da vrgula, na apresentao de todos os resultados. Caso tenham sido utilizadas mais de uma placa por diluio (duplicata ou triplicata), considerar como nmero de colnias a mdia aritmtica da contagem obtida em cada uma das placas da duplicata ou triplicata. Exemplo: N placas/ diluio 2 10-1 INC INC 10-2 230 250 10-3 21 23 Contagem (UFC/ml ou g) 230 + 250 = 2,4 x 104 2 x 10-2

O mtodo de contagem vlido tanto para o plaqueamento em profundidade quanto para o plaqueamento em superfcie, porm, preciso multiplicar o resultado do spread plate por dez, para levar em conta o volume dez vezes menor inoculado. Exemplo: N placas/ diluio 1 10-1 INC 10-2 25 10-3 14 Contagem (UFC/ml ou g) 25 = 25 x 102 x 10 = 2,5 x 104 10-2

Se foi feita a distribuio de 1 ml da primeira diluio em quatro placas, o nmero de colnias dessa diluio a soma das quatro placas. Se o clculo do resultado for feito com a contagem dessa diluio, ento no necessrio multiplicar por dez. Se todas as placas apresentarem mais de 250 colnias o tcnico nunca dever apresentar o resultado como incontvel, pois h trs alternativas para estimar o nmero de UFC/ml ou g. 1) Se for possvel contar todas as colnias da placa, deve-se contar, calcular o nmero de UFC a partir da contagem obtida e apresentar o resultado como contagem estimada. Exemplo:

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N placas/ diluio 1

10-1 INC

10-2 INC

10-3 370

Contagem (UFC/ml ou g) 370= 3,7 x 105 (est) 10-3

2) Se no for possvel contar todas as colnias da placa, mas o nmero de colnias/cm2 estiver abaixo de 10, contar as colnias e, 12 quadrados de 1cm2, 6 quadrados consecutivos na vertical e 6 consecutivos na horizontal, utilizando os quadrados demarcados no contador de colnias. Calcular o nmero mdio de colnias/cm e, a partir da mdia/cm, determinar o nmero total de colnias na placa (65cm2, no caso das placas de dimetro externo 100mm). Utilizar esse nmero total de colnias para calcular o nmero de UFC que deve ser apresentado como contagem estimada. Exemplo: N placas/ diluio 1 10-1 INC 10-2 INC 10-3 8/cm Contagem (UFC/ml ou g) 8 x 65 = 5,2 x 105 (est) 10-3

3) Se o nmero de colnias/cm for maior que 10, contar as colnias em 4 quadrados representativos da distribuio das colnias nas placas, tirar a mdia, represent-la em colnias/cm e calcular o nmero de UFC da mesma forma utilizada no caso de 12 quadrados, multiplicando a mdia por 65cm. O resultado tambm deve ser expresso como contagem estimada. Exemplo: N placas/ diluio 1 10-1 INC 10-2 INC 10-3 21/cm Contagem (UFC/ml ou g) 21 x 65 = 1,4 x 106(est) 10-3

4) Se o nmero de colnias/cm for maior que 100, apresentar o resultado como maior que 6.500/diluio e como contagem estimada. Exemplo: N placas/ diluio 1 10-1 INC 10-2 INC 10-3 >100/cm Contagem (UFC/ml ou g) >6.500 ou > 6,5 x 106(est) 10-3

Quando nenhuma placa atinge 25 colnias, deve-se contar as colnias nas placas com nmero mais prximo de 25, calcular o nmero de UFC e apresentar o resultado como contagem estimada. Exemplo: N placas/ diluio 1 10-1 13 10-2 2 10-3 0 Contagem (UFC/ml ou g) 13 = 1,3 x 102 (est) 10-1

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Se no crescerem colnias em nenhuma placa o resultado deve se apresentado como menor que 1/diluio e valor estimado. Exemplo: N placas/ diluio 1 10-1 0 10-2 0 10-3 0 Contagem (UFC/ml ou g) <1 ou < 10 (est) 10-1

Placas em duplicata, uma com UFC entre 25 250 e a outra com nmero de colnias inferior a 25: considerar o nmero de colnias de ambas as placas, utilizando a mdia para calcular o nmero de UFC. Exemplo: N placas/ diluio 2 10-1 27 21 10-2 2 3 10-3 0 0 Contagem (UFC/ml ou g) 27 + 21= 2,4 x 102 2 x 10-1

Placas em duplicata, uma com UFC entre 25 250 e a outra com nmero de colnias superior a 250: considerar o nmero de colnias de ambas as placas, utilizando a mdia para calcular o nmero de UFC. Exemplo: N placas/ diluio 2 10-1 INC INC 10-2 INC INC 10-3 237 263 Contagem (UFC/ml ou g) 237 + 263= 2,5 x 105 2 x 10-3

Quando em duas diluies consecutivas se obtiver nmero de colnias entre 25 e 250 deve-se calcular o nmero de UFC de cada diluio e comparar os resultados, como descrito a seguir: 1) Se um dos resultados for maior que o dobro do outro, considera-se apenas o maior. Exemplo: N placas/ diluio 1 10-1 INC 10-2 140 32 X 2 = 64 < 140 2) Se um dos resultados no ultrapassar o dobro do outro, ento se considera ambos os resultados, apresentado a mdia como resultado final. Exemplo: N placas/ diluio 1 10-1 INC 10-2 50 10-3 25 Contagem (UFC/ml ou g) 50 + 25 10-2 10-3 = 1,5 x 104 2 10-3 32 Contagem (UFC/ml ou g) 140= 1,4 x 104 (est) 10-2

As placas com espalhamentos podem ser divididas em dois tipos: espalhamentos resultantes da desintegrao de agrupamentos de clulas, durante a
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mistura do inoculo com o meio de cultura, ou espalhamentos resultantes da inadequada mistura do inoculo com o meio, levando formao de filmes de umidade na superfcie do meio ou entre o meio e o fundo da placa. A distino entre os dois tipos facilmente visualizada, porque nos espalhamentos do primeiro tipo sempre se pode observar o crescimento de colnias individuais, enquanto no outro, a massa de crescimento contnua, no h ocorrncia de colnias individuais. As placas com espalhamento podero ser contadas nas seguintes condies: - Se nenhuma das zonas de espalhamento individuais tiver tamanho superior a 25% da rea da placa e, ainda, se a rea total coberta por zonas de espalhamentos no ultrapassar 50% da placa. Para contar placas com zonas de espalhamento do primeiro tipo, cada zona deve ser contada como uma UFC. No conte as colnias individuais dentro dessas zonas. Para contar placas com zonas de espalhamento do segundo tipo, selecionar uma regio da placa, livre de espalhamentos e contar as colnias em diversos quadrados de 1cm. Calcular a mdia de colnias/cm, multiplicar pela rea total da placa (65cm no caso de placas com dimetro externo de 100mm) e utilizar este valor estimado para calcular o nmero de UFC. O resultado deve constar como contagem estimada. Situaes de anlises em que o crescimento de UFC foi maior nas maiores diluies podem indicar: y Presena de substncias inibidoras na amostra (esta concluso, entretanto, depende de confirmao e, ao menos que a confirmao seja feita, o resultado deve ser apresentado como acidente de laboratrio, caso no seja possvel repetir a anlise); y Contaminao acidental da amostra durante o plaqueamento.

3.2. Isolamento de Bactrias (Tcnica de Semeadura por Estrias)


possvel obter uma cultura pura atravs da transferncia de uma clula para um meio de cultura adequado. Essa transferncia pode ser feita atravs da Tcnica de inoculao por estrias de esgotamento para obter culturas puras, na superfcie do gar nutriente.

3.2.1. Material
y y y y y y Ala de inoculao. Agar Nutriente. Cultura da bactria a ser isolada. Placa de Petri esterilizada. Bico de Bunsen. Estufa Bacteriolgica.

3.2.2. Procedimento
As estrias so feitas da seguinte forma: com uma ala de inoculao, transferir uma alada da cultura para um ponto da superfcie do meio slido em placa. A partir desse ponto, puxar a ala em movimento vai-e-vem, fazendo linhas bem prximas umas das outras, em metade da placa, conforme mostrado na figura logo abaixo. As linhas
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no devem encostar umas nas outras, sendo mantido um pequeno ngulo entre uma e outra. Atingida a metade da placa, flambar a ala, aguardar resfriar e tocar em um ponto da metade inoculada, prximo parede da placa. A partir desse ponto, puxar o inoculo para fora da metade inoculada e descrever novas linhas, ocupando um quarto da placa. As novas linhas no devem tocar as primeiras. Flambar novamente a ala, aguardar esfriar e, a partir da segunda srie de estrias, puxar novamente o inoculo para o ltimo quarto no inoculado da placa, descrevendo novas linhas em toda a rea restante. No tocar nenhuma das estrias feitas anteriormente. A cada srie de estrias o inoculo menor, porque foi sendo esgotado na srie anterior. Assim, no ltimo quadrante inoculado, provvel a obteno de colnias isoladas.

Placa de Petri com meio de cultura Ala de inoculao

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Vale lembrar que a metodologia deve ser realizada em concordncia com os cuidados e tcnicas abaixo descritos: y Bancada sanitizada; y Utilizao de luvas, mscara e toca; y Bico de Bunsen ligado e o mais prximo possvel de onde est se realizando a tcnica.

3.3. Mtodo de Gram


3.3.1. Material
y Reagentes: Soluo de violeta de genciana, soluo de Lugol (Iodeto de Potssio KI), soluo de safranina, lcool. y Suspenso bacteriana. y Lminas. y Lamnulas. y Ala de Inoculao. y Bico de Bunsen. y Pinas. y Microscpio. y leo de imerso. y Pipeta Pasteur.

3.3.2. Procedimento
 Preparao do esfregao bacteriano Limpar bem a lmina de vidro com um algodo embebido de lcool. Quando for uma cultura de meio slido, colocar uma gota de gua destilada sobre a lmina e com uma ala bacteriana, colher uma pequena quantidade de crescimento bacteriano da superfcie do Agar e suspend-la na gota de gua destilada, espalhando suficientemente para obter um esfregao fino.

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Fixar o esfregao, ao ar ou passando trs vezes sobre a chama e deixar a lmina esfriar.  Mtodo de Colorao de Gram O coramento feito da seguinte forma: y Cobrir o esfregao seco e fixado com a soluo de violeta de genciana (corante bsico) e manter contato por um minuto. y Lavar em gua corrente ou destilada (fluxo de gua bem leve) para remover o excesso da soluo de violeta de genciana. y Cobrir o esfregao com soluo de Lugol e deixar agir durante um minuto. y Escorrer o Lugol, lavar em gua corrente e secar com leno de papel ou filtro, tocando levemente, sem esfregar. y Lavar em seguida com etanol (99,5 GL) at que no haja mais desprendimento de corante. y Lavar em gua corrente e cobrir com Soluo de Safranina, deixando agir por 30 segundos. y Lavar em gua corrente e esperar a lmina secar naturalmente ao ar livre, ou enxug-la delicadamente com papel filtro, sem esfregar, apenas tocando o esfregao com o papel. y Colocar uma gota de leo de imerso sobre o esfregao.  Microscopia Observar ao microscpio ptico com objetiva de imerso (100 X). As clulas das bactrias Gram positivas vo ficar coradas de roxo e as das Gram negativas de vermelho, podendo tambm ser observadas a morfologia e o arranjo das clulas. A parede celular das bactrias Gram negativas tem um teor em lipdios elevado na sua membrana externa, para alm de uma camada fina de peptidioglicano que circunda a membrana plasmtica. Em conseqncia, durante o passo de diferenciao pelo lcool, parte dos lipdios dissolvida pelo lcool, formando-se poros na parede por onde o corante primrio (violeta de cristal) sai das clulas. Estas clulas ficam transparentes aps o passo de diferenciao pelo lcool, sendo posteriormente coradas com o corante secundrio (safranina). A parede celular das bactrias Gram positivas constituda principalmente por uma camada grossa de peptidioglicano e o seu teor em lipdios nulo ou muito baixo (em poucas espcies bacterianas). A camada de peptidioglicano atua, assim, como uma barreira impedindo a sada do corante primrio e estas clulas ficam coradas de violeta escuro.

4. Consideraes Finais
As bactrias formam o grupo de seres vivos mais numerosos do planeta, desenvolvendo diversos papis fundamentais na manuteno da dinmica e do equilbrio da natureza. Na gua, esses microorganismos se alimentam de matria orgnica e consomem a carga poluidora lanada, fazendo a autodepurao. Algumas bactrias so prprias da flora normal da gua, porm outras so lanadas s fontes hdricas pela ao do ar, solo ou mesmo pelo prprio homem. Rios, riachos e lagos esto sujeitos a freqente poluio por esgoto domstico, agricultura, dejetos industriais, etc. E essa gua quando consumida pelo homem, pode desencadear inmeras doenas:
Doenas Agentes patognicos

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A realizao das metodologias aqui descritas tem relao direta com a avaliao da qualidade da gua que corre por nossos rios e que pode estar sendo ingerida por inmeras pessoas e animais. O papel do tcnico em Controle Ambiental analisar essa gua e comparar aos padres de potabilidade regidos pela legislao em vigor, a fim fomentar aes que visem reduo dos fatores de risco, gerados pela gua, e que podem causar prejuzos sade humana e aos ecossistemas, da a importncia de se conhecer e entender essas anlises aqui descritas.

4. Referncias
Agncia Nacional de guas (Brasil). Cuidando das guas: solues para melhorar a qualidade dos recursos hdricos / Agncia Nacional de guas; Programa das Naes Unidas para o Meio Ambiente Braslia: ANA, 2011. Brasil. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. CoordenaoGeral de Vigilncia em Sade Ambiental. Comentrios sobre a Portaria MS n. 518/2004: subsdios para implementao / Ministrio da Sade, Secretaria de Vigilncia em Sade, Coordenao-Geral de Vigilncia em Sade Ambiental Braslia: Editora do Ministrio da Sade, 2005. Brasil. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilnica em Sade. CoordenaoGeral de Vigilncia em Sade Ambiental. Portaria MS n. 518/2004 / Ministrio da Sade, Secretaria de Vigilncia em Sade, Coordenao-Geral de Vigilncia em Sade Ambiental Braslia: Editora do Ministrio da Sade, 2005.

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Brasil. Fundao Nacional de Sade. Manual prtico de anlise de gua. 2 ed. rev. - Braslia: Fundao Nacional de Sade, 2006. CEBALLOS, B.S.O; KONIG, A. Manual de Tcnicas de Laboratrio para Anlise de guas Residurias Brutas e Tratadas. Laboratrio de Saneamento AESA UFPB. 1996. INFOESCOLA. Bactrias Gram positivas e gram negativas. Disponvel em <http://www.infoescola.com/microbiologia/bacterias-gram-positivas-e-gramnegativas/> Acesso: 14/11/11. MOURA, Alexandre Carvalho de. Microbiologia: aulas prticas para o curso de farmcia. Cascavel: Faculdade Assis Gurgacz, 2010. PELCZAR, Jr. ET AL. Microbiologia: conceitos e aplicaes. Vol. II, 2a Ed. So Paulo: Makron Books, 1996. 517p. Silva, N. da Amstalden, V.C. Manual de mtodos de anlise microbiolgica de alimentos. So Paulo: Livraria Varela, 1997. SILVA, N. da; AMSTALDEN, V.C. Manual de Mtodos de Anlise Microbiolgica de Alimentos e gua. So Paulo: Livraria Varela Editora, 2010.

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