Unidade I Mtodos convencionais em microbiologia

Margarida Casal, Dorit Schuller, Georgina Rodrigues e Clia Pais

1. Consideraes gerais sobre segurana no laboratrio 2. Agentes de desinfeco e de esterilizao 2.1. Agentes qumicos 2.2. Agentes fsicos 3. Preparao de culturas microbianas 3.1. Procedimentos asspticos 3.2. Preparao de meios de cultura 3.3. Preparao de culturas microbianas 4. Manuteno e utilizao de culturas microbianas puras

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Unidade I

Ao iniciar os seus estudos em microbiologia dever ter presente um conjunto de regras e de conceitos muito elementares que o vo ajudar a realizar os trabalhos laboratoriais. Nesta primeira Unidade vamos apresentar de uma forma simplificada, algumas noes que se iro revelar de muita utilidade ao executar os trabalhos propostos ao longo deste Manual. Assim, e se esta tambm a sua primeira experincia no laboratrio, ser conveniente que realize os trabalhos prticos que lhe propomos nesta Unidade.

1. Consideraes gerais sobre segurana no laboratrio

A segurana num laboratrio de microbiologia envolve implementao de procedimentos particulares, associados s metodologias necessrias para manipular culturas microbianas. Por um lado, devido s reduzidas dimenses das clulas, que para ns so imperceptveis, e por outro, pela necessidade de trabalhar com culturas celulares puras, as quais podem conter um nmero elevadssimo de clulas microbianas, o laboratrio dever estar organizado de forma a garantir a boa execuo dos trabalhos que lhe vamos propor. Em qualquer espao laboratorial, os procedimentos a seguir devem incluir o cumprimento de regras de funcionamento, de medidas de segurana obrigatrias e o manuseamento correcto e cuidadoso do material, dos reagentes qumicos e do equipamento laboratorial. Atender a estes princpios contribui para a preveno de acidentes e para impedir a existncia de fontes de contgio ou de perigo no local de trabalho. Descrevem-se, seguidamente, um conjunto de regras bsicas cujo cumprimento deve ser obrigatrio num laboratrio de microbiologia. Utilizar sempre uma bata limpa Limpar a bancada de trabalho convenientemente com lcool etlico a 70% (v/v) e manter o material em ordem Lavar as mos no incio e no final de cada sesso de trabalho experimental Manter os bicos de Bunsen e as lamparinas acesas apenas enquanto so necessrios No comer, beber ou fumar no laboratrio Identificar todo o material utilizando para isso marcadores de vidro apropriados

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No manuseamento de compostos qumicos considerados perigosos, evitar o contacto cutneo ou a sua inalao, recorrendo ao uso de uma hote, de luvas, mscara ou culos de proteco, consoante as caractersticas dos compostos No pipetar com a boca Estabelecer regras bem definidas para o circuito do material de vidro e de plstico no laboratrio, assim como para a sua lavagem Manusear com muita precauo certos materiais e aparelhos frgeis e/ou muito sensveis e mant-los devidamente limpos. o caso dos termmetros, cabeas de aquecimento termostatizadas, aparelhos de medio de pH e balanas, entre outros Nunca usar aparelhos sem conhecer em pormenor o procedimento de utilizao Colocar as pipetas de vidro sujas em contentores de plstico com uma soluo com detergente e devidamente identificados para esse fim Colocar as pontas sujas das pipetas automticas num recipiente devidamente identificado para esse fim Antes de colocar na pia de lavagem do laboratrio material de vidro sujo contendo solues/suspenses, deixar informao sobre os riscos do seu contedo, de modo a ficar claro o destino que se lhe deve dar Colocar todo o material de vidro/plstico contendo suspenses de microrganismos, no local indicado para posterior autoclavagem Colocar num local bem visvel e acessvel: os chuveiros (utilizados para uma primeira e rpida descontaminao), os extintores e o nmero do telefone de emergncia (112) ou a extenso do guarda de segurana Antes de se abandonar o laboratrio, verificar se todas as janelas se encontram devidamente fechadas e se todos os aparelhos (placas de aquecimento, bicos de Bunsen, lamparinas, autoclaves, microscpios) se encontram desligados

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2. Agentes de desinfeco e de esterilizao

No sentido de impedir a contaminao das culturas microbianas com que se pretendem desenvolver os trabalhos prticos de microbiologia, deve proceder-se desinfeco e esterilizao dos objectos necessrios e do ambiente. A desinfeco de um determinado objecto ou ambiente, consiste na destruio, inibio ou remoo de agentes microbianos causadores de doenas ou de outros problemas, como por exemplo a degradao de alimentos, com recurso a agentes fsicos ou a agentes qumicos. Neste processo so eliminadas as clulas vegetativas, mas no se promove a destruio de esporos. Muitos dos produtos de limpeza domstica tais como a amnia e a lixvia, so desinfectantes. Os desinfectantes domsticos, na sua grande maioria, so fortes agentes oxidantes. Os sabes, sais biliares e fenis, actuam por alterao da tenso superficial na interface clula/meio. O xido de etileno, o glutaraldedo ou o formaldedo so os agentes qumicos de maior utilizao a nvel industrial. Outros agentes como os lcoois promovem a desnaturao de protenas e a solubilizao de lpidos.

Duas regras importantes na utilizao de desinfectantes so: 1. Usar sempre a forma mais concentrada que cause o mnimo prejuzo ao tecido ou superfcie inerte a desinfectar; 2. Caso seja necessria a utilizao prolongada do produto, deve aplicar-se uma combinao de agentes ou intercalar com outros agentes eficazes.

A esterilizao de um determinado objecto ou ambiente, significa a destruio completa de toda e qualquer clula viva em crescimento activo, numa forma vegetativa ou em latncia, incluindo os esporos. Os processos usados envolvem o recurso a agentes fsicos e qumicos, como adiante se descreve.

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2.1. Agentes qumicos

- Hipoclorito de sdio Trata-se de um composto muito apropriado para a desinfeco de superfcies e de ambientes. A concentrao mais comum para essa finalidade a de 1% (p/v). Revela-se corrosivo para alguns metais e o contacto no deve exceder 30 minutos. Aps esse perodo deve proceder-se lavagem e secagem das superfcies ou ambientes desinfectados.

- Compostos fenlicos Os compostos fenlicos so muito eficazes na remoo completa de restos orgnicos. O triclosan dotado de actividade bactericida de amplo espectro, com excepo para a Pseudomonas aeruginosa.

- Iodo O iodo um dos desinfectantes mais antigos para aplicao na pele e mucosas. Actualmente, devido sua aco germicida e menor efeito custico, so aconselhados os compostos libertadores de iodo (iodforos).

- Glutaraldedos Os glutaraldedos so compostos que apresentam actividade mxima a diferentes valores de pH. Conseguem ser efectivos contra todos os microrganismos incluindo mesmo o bacilo da tuberculose. Embora sejam excelentes desinfectantes e esterilizantes, no funcionam como anti-spticos. Na medida em que provocam irritaes na pele, o contacto directo no deve ocorrer.

- lcoois Os lcoois etlico e isoproplico so normalmente utilizados para desinfeco de superfcies e anti-sepsia da pele. So compostos bactericidas de baixa potncia e, embora possam destruir o bacilo da tuberculose e o vrus do herpes simples, no actuam contra vrus do tipo hidrfilo, como o da hepatite B. No podem ser considerados como

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agentes de limpeza efectivos. Quando deixados por perodos prolongados em contacto com a pele, tornam-se irritantes.

2.2. Agentes fsicos

Os agentes fsicos mais utilizados na esterilizao e desinfeco de ambientes ou objectos so: o calor hmido, o calor seco, a filtrao e as radiaes (Tabela 1.1). Estas so sobretudo muito teis para esterilizao de espaos, salas, instrumentos e materiais que no suportam as temperaturas exigidas pelas tcnicas do calor.

- Calor hmido A esterilizao por calor hmido pode ser conseguida atravs da fervura, autoclavagem ou pasteurizao. O calor hmido conduz destruio rpida de organismos por coagulao das protenas constituintes das suas clulas. O aparelho mais utilizado na esterilizao de materiais e meios de cultura o autoclave. Geralmente os autoclaves de laboratrio funcionam sob a presso de 1 atm e temperatura de 121C. A durao do tempo de esterilizao est relacionada no s com a temperatura, como tambm com a relao superfcie/volume da massa do material a esterilizar, ou seja, com o tempo de penetrao do calor. Para a mesma temperatura, os tempos de tratamento trmico so tanto maiores quanto maior for o volume do material a esterilizar. De uma forma geral, os materiais ficam esterilizados em 20-40 minutos. O material a esterilizar deve ser devidamente preparado. Assim, os frascos a esterilizar devem ser tapados com rolhas de algodo. Se apresentam tampas com rosca, estas devem ser pouco apertadas para que haja sada de ar quente e entrada de vapor, de modo a evitar o seu rebentamento no autoclave.

- Calor seco A esterilizao pelo calor seco pode ser alcanada pelos seguintes mtodos: flamejao, incinerao ou estufa de ar quente. As estufas de ar quente atingem temperaturas da ordem de 160-180C, que provocam a oxidao e a desnaturao das protenas destruindo quer as clulas vegetativas, quer os esporos. Contudo deve ter-se

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em ateno que o uso de temperaturas muito elevadas e um tempo de exposio muito prolongado podem interferir na estabilidade de alguns materiais, de que o ao exemplo, ou mesmo causar a sua deteriorao, como o caso de materiais como a borracha e os tecidos. Como o poder de penetrao do calor seco baixo, este mtodo s deve ser utilizado quando o contacto com o vapor inadequado, nomeadamente com materiais de vidro, outros materiais slidos termoestveis ou alguns componentes do laboratrio.

- Filtrao o mtodo mais usado quando se pretendem esterilizar solues contendo compostos qumicos termo-sensveis como, por exemplo, vitaminas ou antibiticos. Neste caso, procede-se em primeiro lugar preparao de solues stock que so esterilizadas por filtrao. Em seguida deixa-se arrefecer o meio de cultura para valores de temperatura inferiores a 50C e adicionam-se ento as solues de vitaminas ou antibiticos previamente esterilizadas. Actualmente, os filtros encontrados no mercado so de acetato de celulose ou policarbonato e permitem filtraes com elevado grau de preciso. Existem filtros com dimenso de dimetro de poro varivel, no entanto, os mais utilizados para efeitos de esterilizao tm poros de 0,45 ou de 0,2 m, os quais retm, respectivamente, as clulas e vrus presentes nas solues. Para esterilizar uma soluo por filtrao, deve passar-se a soluo atravs de um filtro, como por exemplo um filtro de seringa, e o filtrado tem que ser recolhido em condies de asspsia para que no ocorra contaminao do lquido esterilizado. A esterilizao de ar tambm pode ser conseguida por filtrao. Uma cmara de fluxo laminar possui um sistema de filtrao de ar por membrana. Esse ar filtrado pressionado para o interior da cmara em feixes paralelos, obrigando o ar do interior a sair pelos poros da caixa inferior (cmara de fluxo vertical) ou pela abertura anterior (cmara de fluxo horizontal). Fica assim criado no interior da cmara, um ambiente estril.

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Tabela 1.1 - Controlo dos microrganismos por mtodos fsicos. Mecanismo de aco Uso preferencial Comentrios

Mtodo Calor hmido Fervura

Desnaturao de protenas

Mtodo de uso comum

Destri bactrias, muitos vrus, fungos e esporos; alguns esporos bacterianos e vrios vrus no so destrudos

Autoclave

Desnaturao de protenas

Meios de cultura, solues, materiais e instrumentos resistentes a temperatura e presso elevadas Indstria alimentar, na produo de produtos lcteos, bebidas e conservas

Mtodo eficaz esterilizao

de

Pasteurizao

Desnaturao de protenas

Destri bactrias; dependendo da temperatura e do tempo de exposio pode esterilizar

Calor seco Flamejao Incinerao

Reduo a cinzas de todo o material, por oxidao

Ansa, espalhador, agulha de platina Papis, carcaas de animais, restos de curativos (algodo, gaze) Materiais de vidro e outros materiais resistentes a altas temperaturas Usada na eliminao de microrganismos de lquidos termossensveis e do ar

Mtodo eficaz esterilizao Mtodo eficaz esterilizao

de

de

Estufa

Oxidao de todo o material

Mtodo eficaz esterilizao

de

Filtrao

Remoo mecnica de microrganismos

Remoo de bactrias e fungos (pode no remover alguns vrus)

Radiaes Ionizantes (raios gama) No-ionizantes (UV)

Destruio de DNA, formao de radicais livres Mutao do DNA, formao de dmeros Material sensvel ao calor (plsticos) Centros cirrgicos, laboratrios Mtodo eficaz esterilizao de

Uso restrito; controlo dos microrganismos do ar

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- Radiaes As radiaes so muito teis para a esterilizao de espaos, de salas, de instrumentos e de materiais que no suportam as temperaturas exigidas pelas tcnicas do calor. A esterilizao por radiao ionizante uma tcnica altamente eficiente, econmica e segura. As radiaes de alta energia so utilizadas na esterilizao de materiais cuja sensibilidade ao calor exige condies particulares de tratamento. A radiao ionizante promove a quebra das cadeias moleculares e induz reaces dos fragmentos com o oxignio atmosfrico ou com compostos oxigenados, originando a morte das clulas. As radiaes utilizadas incluem os raios gama, produzidos a partir de cobalto-60 ou csio-139, e de raios catdicos produzidos em geradores e aceleradores de electres. Os raios gama so radiaes com poder ionizante que promovem a alterao de compostos celulares. Estes raios tm elevado poder de penetrao sendo ideais para aplicao em objectos volumosos. Problemas tcnicos dificultam ainda a sua aplicao corrente em microbiologia. A irradiao com luz ultravioleta (UV) uma forma pouco satisfatria de esterilizao devido fraca capacidade de penetrao nos materiais e produtos a esterilizar. A energia das radiaes absorvida por molculas como o DNA, conduzindo a alteraes da estrutura molecular que podero ser letais para os microrganismos. Os raios UV so frequentemente utilizados na diminuio do nvel de contaminao de espaos pequenos. Deve ter-se sempre presente que a lmpada UV s deve estar ligada na ausncia de pessoas no laboratrio.

3. Preparao de culturas microbianas

A preparao de culturas microbianas, e em particular a inoculao da estirpe ou estirpes microbianas que pretendemos fazer crescer, envolvem uma srie de procedimentos asspticos que devero ocorrer em condies apropriadas. Estas questes vo ser de seguida abordadas.

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3.1. Procedimentos asspticos

H certas precaues que devem ser tomadas durante a inoculao de uma cultura microbiana de modo a evitar a contaminao das culturas, das pessoas ou do ambiente:

Certificar-se de que ao dar incio s operaes, todo o material necessrio est ao alcance imediato, de forma a realizar o trabalho o mais rapidamente possvel Desinfectar e arrumar convenientemente a bancada de trabalho Os recipientes devem estar abertos o mnimo tempo possvel e, enquanto abertos, todo o trabalho deve ser realizado junto chama do bico de Bunsen Uma vez abertos os recipientes, como tubos, bales e frascos, o seu bocal deve ser flamejado de imediato A fim de evitar as contaminaes durante as manipulaes que envolvam caixas de Petri, a exposio das superfcies internas estreis deve durar o mnimo de tempo possvel A extremidade das pipetas estreis que vai ser colocada em contacto com as culturas celulares, ou com os recipientes estreis, no deve ser tocada nem entrar em contacto com superfcies no estreis, como o caso da roupa, superfcie da rea de trabalho, o exterior de tubos, de bales ou quaisquer outros materiais

A utilizao das ansas, pipetas e espalhadores, assim como a manipulao de frascos, bales e tubos de ensaio, em condies de assepsia, envolve alguns cuidados particulares.

- Ansas As ansas so esterilizadas pela passagem na chama do bico de Bunsen, antes e depois de serem utilizadas (Figura 1.1). Devem ser aquecidas at ficarem ao rubro para assegurar que todos os esporos sejam destrudos. Devem ser agarradas quase pelo topo num ngulo praticamente vertical. O dedo mindinho deve ficar livre para segurar a tampa do recipiente.

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- Pipetas Para transferir culturas, meios e solues estreis devem utilizar-se pipetas graduadas ou pipetas de Pasteur estreis de acordo com as normas a seguir descritas. 1. Remover a pipeta de vidro do pacote pela extremidade que contm o tampo de algodo, tendo o cuidado para no tocar mais do que o necessrio de modo a segurar firmemente. 2. Colocar a pompete. 3. Segurar a pipeta como uma caneta mas no apertar a pompete. O dedo mindinho deve ficar livre para segurar na rolha de algodo/ tampa do tubo/ frasco. 4. Apertar a pompete com cuidado e retirar a quantidade de fluido necessria mas que no atinja nem molhe o tampo de algodo. 5. Colocar a pipeta usada num contentor de plstico com desinfectante, devidamente identificado para esse fim. 6. A pompete no deve ser retirada at a pipeta estar dentro do contentor de plstico, de modo a evitar que gotas de cultura contaminem a superfcie de trabalho.

Figura 1.1 - Esterilizao de uma ansa por flamejao chama do bico de Bunsen.

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- Frascos, bales e tubos de ensaio Quando se pretendem manipular frascos, bales ou tubos de ensaio em condies asspticas, deve proceder-se do seguinte modo (Figura 1.2): 1. Desapertar a tampa dos frascos/bales ou tubos de ensaio de modo a poder ser retirada facilmente. 2. Segurar o frasco/ tubo com a mo esquerda. 3. Retirar a tampa/ rolha de algodo com o dedo mindinho da mo direita. 4. No pousar a tampa/ rolha de algodo. 5. Flamejar o gargalo do frasco/ tubo fazendo-o passar pela chama do bico de Bunsen. 6. Recolocar a tampa do recipiente.

Figura 1.2 - Flamejao do gargalo de um frasco.

- Espalhadores Os espalhadores so usados para distribuir inculos sobre a superfcie de placas j preparadas com meios de cultura (Figura 1.3). Podem ser esterilizados em estufa uma vez empacotados, ou por flamejao com lcool.

- Esterilizao com lcool A esterilizao de espalhadores com lcool envolve os procedimentos que se encontram ilustrados na Figura 1.4, nomeadamente:

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1. Mergulhar a extremidade do espalhador num pequeno volume de lcool a 70% (v/v) contido num recipiente com tampa ou coberto com papel de alumnio. 2. Passar rapidamente atravs da chama do bico de Bunsen; o lcool vai arder esterilizando o vidro. 3. Afastar o espalhador ligeiramente da chama at o lcool parar de arder. 4. Pousar o espalhador numa superfcie estril como uma caixa de Petri ou um copo graduado.

Figura 1.3 - Espalhamento de uma suspenso de microrganismos superfcie do meio slido na placa de Petri. O espalhamento deve ser feito mantendo o espalhador de vidro na posio vertical.

Figura 1.4 - Esterilizao de espalhadores com lcool.

3.2. Preparao de meios de cultura

A possibilidade de cultivar um determinado microrganismo em laboratrio essencial para o seu isolamento e caracterizao do ponto de vista morfolgico, fisiolgico, bioqumico ou gentico. Deve ter-se em considerao que, dependendo das

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condies de cultura, o microrganismo em estudo vai revelar diferentes caractersticas. Assim, a cultura de um microrganismo em laboratrio constitui o primeiro passo que vai conduzir ao seu estudo. tambm a partir desta cultura que este pode ser classificado e se pode proceder identificao da espcie a que pertence. S assim se podem encontrar novas espcies, e/ou mesmo encontrar novas associaes taxonmicas. Os meios de cultura que se utilizam em laboratrio e em condies controladas, podem ser slidos ou lquidos. A sua preparao um processo simples mas requer a aplicao de certas regras: O material de vidro utilizado deve estar bem lavado para evitar a contaminao com detergentes ou outros qumicos As esptulas utilizadas na pesagem de componentes devem estar limpas A gua deve ser colocada previamente no recipiente e s depois se devem adicionar os componentes para dissoluo. Uma adio da gua posterior colocao dos componentes pode originar a formao de agregados que se colam ao fundo do frasco dificultando a sua dissoluo Se o meio contm muitos componentes, estes devem ser dissolvidos individualmente antes de efectuar a mistura. O agar s deve ser adicionado mistura aps os outros componentes terem sido dissolvidos Os meios s devem ser preparados no momento em que vo ser esterilizados Os frascos com meio de cultura para autoclavar no devem exceder a metade da sua capacidade. As rolhas/ tampas devem estar pouco apertadas durante a autoclavagem

A sementeira de amostras recolhidas em ambientes naturais contm em regra, populaes mistas de microrganismos, pelo que devem utilizar-se meios de cultura complexos que permitam o crescimento do maior nmero possvel de isolados. Contudo, mesmo nestas circunstncias no possvel detectar-se mais do que uma pequena percentagem dos indivduos presentes na populao inicial. Uma vez isolado um determinado microrganismo, torna-se necessria a sua caracterizao. Em estudos de nutrio, inibio, toxicidade ou outros, so utilizados de meios de composio definida. Os meios de cultura slidos so usados para contagem de colnias de microrganismos e para a multiplicao, isolamento e conservao dos microrganismos isolados. O isolamento de determinados microrganismos conseguido com maior rapidez e eficcia se for realizado em meios de cultura selectivos/diferenciais. Os meios

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de cultura lquidos possibilitam o desenvolvimento de espcies contidas em populaes mistas e permitem a realizao de estudos de crescimento e nutrio.

- Meio YEPD O meio YEPD (Yeast Extract-Peptone-Dextrose) o meio rico mais utilizado para o crescimento de fungos e em particular de leveduras, sempre que no so necessrias condies especiais para o seu cultivo. Fornece um excesso de carbono e azoto, assim como de aminocidos, precursores de nucletidos, vitaminas e metabolitos essenciais para um ptimo crescimento celular. Composio do meio YEPD* Extracto de levedura Peptona Glucose Agar 5 g/l 10 g/l 20 g/l 20 g/l (para meios de cultura slidos)

*Pode usar-se a mesma receita reduzindo as concentraes para metade, excepto o agar. O agar apenas adicionado na preparao de meios de cultura slidos.

Preparao de meio YEPD 1. Medir o volume necessrio de gua desionizada para um balo Erlenmeyer. 2. Pesar o extracto de levedura, a peptona e a glucose. 3. Adicionar ao balo e agitar at dissolver. 4. Adicionar o agar e agitar at homogeneizar. 5. Perfazer o volume final desejado, adicionando gua e agitar. 6. Esterilizar o meio de cultura no autoclave a 120 C durante 20 minutos.

A soluo de glucose tambm pode ser esterilizada por filtrao (filtros estreis de poro 0,45 m) em condies asspticas. Posteriormente, tambm em condies asspticas, a soluo de glucose pode ser adicionada outra soluo j esterilizada. Por fim, o meio vertido em placas esterilizadas e deixado solidificar.

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- Meio LB O meio LB (Luria-Bertani broth) utilizado para crescimento e manuteno de bactrias.

Composio do meio LB Triptona Extracto de levedura Cloreto de sdio Agar 10 g/l 5 g/l 10 g/l 20 g/l (para meios de cultura slidos)

Preparao de meio LB 1. Medir o volume necessrio de gua desionizada para um balo Erlenmeyer. 2. Pesar o extracto de levedura, a triptona e o cloreto de sdio. 3. Adicionar ao balo e agitar at dissolver. 4. Adicionar o agar e agitar at homogeneizar. 5. Perfazer o volume final desejado, adicionando gua e agitar. 6. Esterilizar o meio de cultura no autoclave a 120 C durante 20 minutos.

Verter meios em placas de Petri 1. Retirar o frasco de meio com agar derretido do autoclave e deixar arrefecer at aos 50 C, de preferncia num banho-maria. 2. Segurar o frasco com a mo esquerda junto chama do bico de Bunsen e retirar a rolha com a mo direita. 3. Passar o gargalo pela chama. 4. Retirar ligeiramente a tampa da caixa de Petri com a mo direita, verter o meio estril na caixa e recolocar a tampa (normalmente colocam-se 15-20 ml de meio por caixa de Petri); a base da caixa deve ficar coberta, o agar no deve tocar na tampa da caixa e a superfcie deve ficar sem bolhas. 5. Passar o gargalo pela chama e recolocar a rolha.

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6. Agitar suavemente a caixa para assegurar que o meio fica uniformemente distribudo. 7. Deixar o meio solidificar na placa. 8. Guardar a placa em posio invertida.

3.3. Preparao de culturas microbianas

Uma vez que as leveduras, em particular Saccharomyces cerevisiae, se encontram entre os organismos eucariontes cuja biologia celular tem sido melhor estudada, este grupo de microrganismos foi seleccionado para exemplificar os procedimentos que se seguem. Esta escolha prende-se tambm com a sua importncia industrial, pois como do conhecimento geral as leveduras tm um papel fundamental em processos de grande importncia econmica, como so o fabrico do vinho e da cerveja e a produo de levedura para panificao. Por outro lado, a simplicidade da sua organizao celular e o seu rpido crescimento em condies controladas de laboratrio, fazem das leveduras e em particular a espcie S. cerevisiae, modelos experimentais particularmente eficazes.

Preparao de uma cultura em estria de leveduras em meio slido 1. Marcar a parte marginal da base de uma placa de Petri com as seguintes indicaes: meio de cultura, organismo, data, identificao do grupo de trabalho. 2. Esterilizar uma ansa chama e retirar uma ansada da cultura a isolar, fazendo deslizar a ansa sem danificar a superfcie do agar. 3. Espalhar a poro de cultura, riscando a superfcie da placa e seguindo as setas como se indica na Figura 1.5; entre cada novo riscado, passar a ansa na chama, realizar esta operao fazendo deslizar a ansa sem danificar a superfcie do agar. 4. Em vez de usar um ansa pode ser utilizado um palito autoclavado, neste caso utilizar um palito novo por cada srie de riscas. 5. Incubar as placas em posio invertida, durante 2 a 3 dias temperatura ambiente. Observar as placas e registar a existncia de colnias isoladas.

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Figura 1.5 Isolamento de microrganismos pela tcnica de cultura em estria. A) Diagrama de uma placa de isolamento. B) Aspecto de uma placa de Petri com colnias isoladas.

Inoculao de uma cultura de leveduras por espalhamento em meio slido Antes de proceder sementeira das placas, estas devem ser convenientemente marcadas na parte marginal do fundo de modo a conter os seguintes dados: nmero do grupo de trabalho, microrganismo, diluio da suspenso e data do ensaio. A sementeira pode ser feita em meio YEPD.

Preparao de uma srie de diluies decimais de uma cultura de leveduras 1. Preparar tubos de ensaio contendo 9 ml de gua desionizada. 2. Esterilizar em autoclave durante 20 minutos a 120C e a 1 atmosfera. 3. Preparar uma suspenso densa da levedura S. cerevisiae num tubo contendo gua estril (Figura 1.6). 4. Agitar o tubo de ensaio no vortex (cerca de 5 segundos). 5. Com uma pipeta estril de 1 ml ou usando uma pipeta automtica com pontas estreis, retirar assepticamente 1 ml da suspenso microbiana. 6. Introduzir o volume de 1ml da suspenso no primeiro tubo de diluio (10 ). 7. Homogeneizar a suspenso por agitao no vortex. 8. Com uma nova pipeta estril retirar 1 ml da diluio 10 e transferir para outro tubo para obter a diluio 10 .
-2 -1 -1

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9. Continuar este procedimento at obter a diluio 10 .

-6

Inoculao de uma cultura de leveduras por espalhamento em meio slido

1. Antes de proceder sementeira das placas de Petri, estas devem ser marcadas na parte marginal da sua base com as seguintes indicaes: meio de cultura, organismo, diluio, data do ensaio, identificao do grupo de trabalho. 2. Seleccionar as trs ltimas diluies da suspenso de S. cerevisiae 10-4,10-5 e 10-6. 3. Agitar vigorosamente cada um dos tubos de ensaio contendo a diluio antes de proceder sua inoculao em meio slido. 4. Entreabrir trs caixas de Petri com meio YEPD e colocar 0,1 ml de cada uma das trs diluies (Figura 1.6). 5. Mergulhar o espalhador no copo contendo lcool puro e pass-lo na chama do bico de Bunsen ou da lamparina. Deixar a chama apagar no espalhador e esperar cerca de 30 segundos at ele arrefecer. 6. Passar o espalhador sobre a superfcie do meio rodando as caixas de Petri com cuidado. Aps algum tempo nota-se uma certa resistncia na movimentao do espalhador, o que indica que o inculo foi absorvido pelo meio. 7. Todas as placas de Petri inoculadas devem ser incubadas temperatura ambiente, durante 24 a 48 horas. Verificar se todas as placas esto devidamente identificadas antes de se colocarem na estufa (25 a 30 C).

As diluies decimais realizadas a partir de suspenses densas de leveduras, se forem adequadas, permitem-nos obter, em placas com YEPD, colnias perfeitamente isoladas o que possibilita a sua contagem com maior rigor. fundamental que o nmero de colnias desenvolvidas nas placas no seja demasiado grande porque algumas clulas podero no formar colnias e a contagem no ser correcta. Tambm no deve ser demasiado pequeno de modo a inviabilizar o significado estatstico da contagem. A prtica usual mais vlida, consiste em contar colnias apenas nas placas que tenham entre 20 e 200 colnias.

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Cultura me

1ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

9 ml Diliuio: 10-1 Plaquear: 0,1 ml 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Figura 1.6 - Diluies decimais de uma cultura microbiana e inoculao por espalhamento em meio de cultura slido.

Inoculao de uma cultura de leveduras em meio de cultura lquido

1. Utilizando uma proveta estril, verter para um balo Erlenmeyer de 250 ml estril, 100 ml de meio YEPD. 2. Com a ajuda de uma ansa estril, adicionar em condies de asspsia, o microrganismo proveniente de uma placa de isolamento previamente preparada (Figura 1.7). 3. Tapar o balo e coloca-lo no agitador orbital durante 24 horas, temperatura de 25 a 30 C. 4. Observar e registar as alteraes de turbidez da cultura ao longo do tempo.

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Figura 1.7 - Inoculao de uma cultura microbiana em meio de cultura lquido.

4. Manuteno e utilizao de culturas microbianas puras

- Obteno de culturas puras A capacidade de manter no laboratrio culturas puras, fundamental para uma boa prtica microbiolgica. A concretizao eficaz deste mtodo crucial por razes de segurana e manuteno da qualidade dos trabalhos a desenvolver. Quando uma cultura aparecer contaminada, no aconselhvel tentar remediar a situao tirando um inculo de uma nica colnia da placa da cultura misturada, pois h a possibilidade de no se ser capaz de distinguir a cultura contaminada da cultura original. Deve recorrer-se coleco de culturas do laboratrio, tendo o cuidado de manter o stock em condies de asspsia.

- Manuteno de culturas conveniente manter uma cultura pura em stock. A maioria das culturas que so consideradas apropriadas para uso, so tambm facilmente mantidas por sub-cultivo em meio de cultura para crescimento. Para evitar os sub-cultivos, as culturas devem ser mantidas em criotubos contendo meio lquido ao qual se adiciona glicerol (30%, p/v, concentrao final), e congeladas a -70C (Figura 1.8). Na ausncia deste equipamento, podem manter-se a -20C. O laboratrio deve organizar a sua coleco de

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Unidade I

microrganismos, elaborando para isso um registo de cada uma das espcies, o meio de cultura apropriado, bem como da sua origem. Para retirar um novo inculo basta remover um pouco da cultura (por exemplo com um palito estril), e inocular pelo mtodo do riscado numa placa de Petri com o meio de cultura adequado.

Figura 1.8 Manuteno de culturas microbianas. A) Criotubo utilizado na manuteno de culturas microbianas a temperaturas baixas. B) Caixa de criotubos.

Bibliografia

Alcntara, F.; Cunha, M.A.; Almeida, M.A. (2 edio).Microbiologia: Prticas Laboratoriais. Edies Universidade de Aveiro, Portugal. Lopes, A. M. e Fonseca, A. (1996) Biologia Microbiana. Universidade Aberta; Portugal. Madigan, M. T., Martinko, J. M. e Parker, J. (10 edio). Brock - Biology of Microorganisms. Prentice Hall international, New Jersey.

WWW http://www.asmusa.org/edusrc/labcore.htm