O mtodo de GRAM.

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS/FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA

A tcnica de Gram ou colorao de Gram uma tcnica de colorao de preparaes histolgicas para observao ao microscpio ptico, utilizada para corar diferencialmente microorganismos com base na composio qumica e integridade da sua parede celular. Consoante a cor que adquirem, so classificados em gram positivos (roxo) ou gram negativos (rosa). Tal mtodo se deve ao mdico dinamarqus Hans Christian Joachim Gram . Geralmente as bactrias gram negativas so mais patognicas, possuindo ainda lipopolissacardeos na sua membrana exterior, que agravam a infeco.

Na tcnica de Gram, colora-se bactrias com um corante violeta especial. A bactria que assim obtiver uma cor roxa, ser gram positiva e a que obtiver colorao rsea, gram negativa. A gram positiva ganha colorao roxa porque sua camada mais externa, a parede celular, formada por peptidoglicano, absorve a tinta. J a gram negativa rsea porque, apesar de tambm ter parede celular, esta fica abaixo de uma membrana adicional, parecida com a mebrana plasmtica, tpica deste grupo de bactrias, logo no ocorrendo absoro.

PROCEDIMENTO
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Confeccionar o esfregao; Corar com violeta de cristal por 60 Lavar com esguicho de gua destilada; Cubrir com Iodo de Gram ou Lugol por 60 Lavar com esguicho de gua destilada; Descorar com lcool a 95%, ou acetona, 10-20 segundos; Lavar com esguicho de gua destilada; Corar com safranina por 60 segundos Lavar com gua destilada, secar e observar ao microscpio. Resultados: Gram (+) coram de roxo, gram (-) cor de rosa

Pseudomonas aeruginosa: Bacilos gram-negativos

As caractersticas estruturais da parede bacteriana esto na base da tcnica de Gram que funciona da seguinte forma. y O primeiro corante (cristal-de-metila) penetra na bactria assim como o mordente (Soluto de Lugol). Intracelularmente forma-se um complexo corante-iodo, insolvel em gua, que vai corar o protoplasma e a parede celular. A camada de peptidoglicano maior em bactrias gram positivas, as gram negativas, por sua vez possuem pouco peptidoglicano e so coradas pelo vermelho de safranina.
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A lavagem com lcool 99,5 GL dissolve o complexo corante-iodo, e a se a parede celular for permevel a este, arrasta-o para fora da clula. As bactrias capazes de preservar a colorao roxa do 1 corante, o violeta de Genciana, designam-se por Gram positivas. As bactrias que, aps a lavagem com lcool-acetona, so incapazes de reter o violeta de Genciana, designam-se por Gram negativas, corando pela fucsina diluda que se fixa apenas nas bactrias Gram-negativas. Resumindo, as bactrias Gram positivas coram de roxo e as Gram negativas coram de vermelho. Esta tcnica de colorao permite ento a distino entre bactrias com parede celular mais ou menos rica em peptidoglicanos. De referir que embora uma bactria Gram negativa nunca possa corar positivamente pelo Gram, uma bactria estruturalmente Gram positiva pode corar negativamente se a sua parede de peptidoglicano for destruda ou danificada (ex. envelhecimento celular ou aco de lisozimas).

PREPARAO PARA A COLORAO

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Na observao microscpica ps colorao o material a observar deve ser previamente fixado, o que facilita a observao de bactrias, uma vez que tm reduzidas dimenses, fraco contraste e algumas refringncia e mobilidade. A fixao a coagulao do protoplasma bacteriano com o mnimo de deformao e sua colagem lmina. Como exemplos de agentes fixadores temos o calor, o formol e o ter. A preparao de coloraes policromticas segue um protocolo constante. Assim, sobre um esfregao (clulas fixadas pelo calor), aplica-se:

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O primeiro corante O mordente O diferenciador gua (vai parar a diferenciao) Segundo corante (vai ser contrastante) O que se verifica, quando se observam as diferentes bactrias sujeitas a esta colorao ao microscpio, que estas tm um comportamento diferente face colorao de Gram, o que permite classific-las em:

Bactrias Gram-negativas (apresentam cor rosa) e Bactrias Gram positivas (apresentam cor roxo) y Estudos de microscopia electrnica e anlises bioqumicas permitiram concluir que a parede celular bacteriana a estrutura
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