Control de Calidad de Vacunas Monovalentes, Vivas, Nacionales y Extranjeras, Contra La Enfermedad de Newcastle, Mediante Pruebas de Esterilidad y Titulación de Virus

I.
INTRODUCCIÓN
1.1. Enunciado del problema
Control de calidad de vacunas monovalentes, vivas, nacionales y
extranjeras, contra la enfermedad de Newcastle, mediante pruebas de
esterilidad y titulación de virus.
1.2. Descripción del problema
No tenemos una evaluación constante de la calidad, no sólo libre de
patógenos sino su capacidad inmunogénica, por lo que no podemos estar
completamente seguros de que las empresas productoras de las vacunas
sigan cumpliendo con las normas de calidad y lo que indica su etiqueta en
cada lote que producen.
1.3. Justificación del trabajo
1.3.1. Aspecto General
La EN, como otras enfermedades de las aves, en nuestro país
constituye riesgo de presentación similar a una bomba de tiempo
para la avicultura comercial, la que puede explotar en cualquier
momento y afectar a los productores avícolas, si no se tomaran las
medidas preventivas adecuadas para contrarrestar dicha posibilidad.
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En Latinoamérica han sucedido en los últimos años brotes severos
con esta enfermedad, por tal razón se han implementado agresivos
programas de vacunación los que han ayudado a disminuir
considerablemente estos brotes.
1.3.2. Aspecto Tecnológico
El uso de pruebas de esterilidad y titulación en vacunas contra la EN
son técnicas altamente confiables para controlar la calidad y
asegurar que un producto contiene la cantidad de antígeno
establecido en la orden de producción.
1.3.3. Aspecto Social
Teniendo en conocimiento la calidad de las vacunas, mediante las
pruebas de esterilidad y títulos antigénicos, permitiéndose tomar
medidas para modificar el programa de vacunación de ser necesario,
obteniéndose una inmunización más eficaz, se está beneficiando a
los productores avícolas, reduciendo probablemente los índices de
mortalidad en las aves, disminuyendo un poco su preocupación,
obteniendo una mejor calidad de vida.
1.3.4. Aspecto Económico
La manifestación clínica de esta enfermedad tiene un importante
impacto económico, no sólo por el incremento en la mortalidad, la
conversión alimenticia o el aumento en el número de aves retrasadas,
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sino por las implicaciones en la movilización y comercialización que
comprometen la viabilidad económica, no sólo de una empresa sino
de toda una región y de un país.
1.3.5. Importancia
La importancia del presente trabajo radica en el conocimiento de la
calidad para verificar que un producto está libre de microorganismos
viables contaminantes y el reconocimiento de la cantidad de
partículas virales presentes en la vacuna.
1.4. Objetivos
1.4.1. Objetivo General
Determinar mediante pruebas de esterilidad y titulación la calidad de
las vacunas monovalentes, vivas, contra la EN.
1.4.2. Objetivos específicos
Mediante la prueba de esterilidad, constatar que las vacunas se hallan
libres de contaminantes bacterianos y fúngicos.
Mediante la titulación, asegurar que las vacunas contienen la
cantidad de antígeno establecido en la orden de producción.
1.5. Planteamiento de la hipótesis
Dado que las vacunas de uso avícola contra la enfermedad de Newcastle
contienen antígenos inmunogénicos, es probable probar su calidad.
3
II. MARCO TEÓRICO O CONCEPTUAL
2.1.Análisis bibliográfico
Las cepas del virus de Newcastle varían ampliamente en cuanto a la
severidad de la enfermedad que pueden provocar en las aves. Las cepas
menos patógenas pueden inducir una enfermedad grave si se exacerban por
la presencia de otros organismos o mediante condiciones ambientales
adversas. El método preferido de diagnóstico es el aislamiento del virus y
su subsiguiente caracterización.
Una de las propiedades más características de las cepas diferentes del virus
de la EN es su enorme variación respecto a la patogenicidad para los
pollos. Las cepas del virus de la EN se agrupan en cinco patotipos sobre la
base de los signos clínicos observados en los pollos infectados. Estos son:
1. Velogénico viscerotrópico: es muy patogénica en la que se observan
frecuentemente lesiones intestinales hemorrágicas;
2. Velogénico neurotrópico: se presenta con mortalidad elevada,
habitualmente seguida de signos respiratorios y nerviosos;
3. Mesogénico: se presenta con signos respiratorios y signos nerviosos
ocasionales pero baja mortalidad;
4. Lentogénico o respiratorio: se presenta con una infección
respiratoria leve o subclínica;
5. Entérico asintomático: normalmente consiste en una infección
entérica subclínica.
4
Raramente los agrupamientos en patotipos son claros, e incluso en
infecciones de aves SPF, se puede apreciar un considerable encubrimiento.
Además, puede tener lugar una exacerbación de los signos clínicos
inducida por las cepas más benignas si se superponen infecciones de otros
organismos o cuando se presentan condiciones medioambientales
adversas.
DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA
Desde su reconocimiento en 1926, la EN se considera endémica en
muchos países. La vacunación profiláctica se practica en casi todos los
países productores de aves de corral a escala comercial.
ETIOLOGÍA
La EN es causada por el paramixovirus aviar de tipo I (APMV-1), que es
un serotipo del género Avulavirus perteneciente a la subfamilia
Paramyxovirinae, familia Paramyxoviridae. Los paramixovirus aislados
procedentes de especies aviares se han clasificado mediante pruebas
serológicas en nueve serotipos designados desde APMV-1 a APMV-9; el
virus de la EN se ha denominado APMV-1. (Blood y Radostis, 1996)
EPIDEMIOLOGÍA
Parece probable que la gran mayoría de las aves sea susceptible a la
infección con virus de la EN tanto de virulencia alta como de virulencia
baja para los pollos, aunque los signos clínicos observados en aves
infectadas con el virus de la EN varían ampliamente y dependen de
factores tales como: el virus, la especie hospedadora, la edad del
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hospedador, la infección con otros organismos, el estrés medioambiental y
el estado inmune. Bajo algunas circunstancias la infección con los virus
extremadamente virulentos puede provocar una mortalidad repentina alta
con signos clínicos relativamente escasos. Así que los signos clínicos son
variables y están influidos por otros factores de modo que ninguno puede
considerarse patognomónico.
Incluso en los hospedadores susceptibles, tales como los pollos, los virus
de la EN muestran un rango considerable de virulencia. Generalmente, la
variación consiste en grupos alrededor de los dos extremos en pruebas
utilizadas para valorar la virulencia, pero, por diversas razones, algunos
virus pueden mostrar virulencia intermedia.
La variación enorme en la virulencia y en los signos clínicos implica la
necesidad de definir cuidadosamente lo que constituye la EN para los
propósitos de comercio, políticas y medidas de control. (Ocadiz, 1998)
PATOGENIA
La variación extrema en la virulencia de los diferentes aislamientos víricos
de la EN y el uso generalizado de vacunas vivas implica que la
identificación de un aislamiento como virus de la EN a partir de aves que
muestren signos clínicos no confirma un diagnóstico de la EN, por lo que
también se requiere una valoración de la virulencia del aislado. Se
investigan por parte de varios grupos en todo el mundo varias pruebas in
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vitro potenciales para establecer la virulencia normalmente relacionada
con la base molecular de la patogenicidad. Hasta la fecha, una valoración
definitiva de la virulencia del virus se basa habitualmente en una o más de
las siguientes pruebas in vivo, aunque la definición actual de la OIE
permite una valoración molecular de la virulencia:
• Tiempo medio de muerte en huevos
i) Se diluye el líquido alantoideo infectivo, estéril y fresco en
solución salina estéril para preparar diluciones decimales en
serie comprendidas entre 10-6 y 10-9.
ii) Para cada dilución se inocula 0.1ml en la cavidad alantoidea de
cada uno de los cinco huevos embrionados de aves SPF de 9-
10 días de edad y entonces se incuban a 37ºC.
iii) Las diluciones víricas restantes se mantienen a 4ºC y se
inoculan otros cinco huevos con 0.1ml de cada dilución 8
horas más tarde y se incuban a 37ºC.
iv) Cada huevo se examina dos veces al día durante 7 días y se
registran los tiempos a los que muere cada embrión.
v) La dosis letal mínima es la dilución vírica más alta que causa
la muerte de todos los embriones inoculados por ella.
vi) El tiempo medio de muerte (MDT) es el tiempo en horas en el
que la dosis letal mínima provoca la muerte de todos los
embriones inoculados.
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vii) El MDT se ha utilizado para clasificar las cepas del virus de la
EN dentro de los grupos siguientes; velogénico (tarda menos
de 60 horas en matar); mesogénico (tarde entre 60 y 90 horas
en matar); y lentogénico (tarda más de 90 horas en matar).
• Índice de patogenicidad intracerebral
i) El líquido alantoideo infectivo y fresco con un título HA>24
(>1/16) se diluye 1/10 en solución salina isotónica estéril sin
aditivos, tales como antibióticos.
ii) Se inyectan por vía intracerebral 0.05ml del virus diluido en
diez polluelos procedentes de huevos de un grupo de aves SPF.
En el momento de la inoculación, estos polluelos deben tener
más de 24 horas y menos de 48 horas.
iii) Las aves se examinan cada 24 horas durante 8 días.
iv) En cada observación, las aves se puntúan: 0 si es normal, 1 si
está enferma, y 2 si está muerta. (Los individuos muertos
deben puntuarse como 2 en cada una de las observaciones
diarias siguientes a la muerte).
v) El índice de patogenicidad intracerebral (ICPI) es la
puntuación media por ave y por observación durante el
período de 8 días.
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Los virus más virulentos presentarán índices que se aproximan a la
puntuación máxima de 2.0, mientras que las cepas lentogénicas
presentarán valores próximos a 0.0.
• Índice de patogenicidad intravenosa
i) El líquido alantoideo infectivo recogido en fresco (que no
debería tener más de 24-48 horas y que debería demostrarse
que está exento de contaminación bacteriana) con un título
HA>24 (>1/16) se diluye 1/10 en solución salina isotónica
estéril.
ii) Se inyecta por vía intravenosa 0.1ml del virus diluido en diez
pollos SPF de seis semanas.
iii) Se examinan las aves a intervalos de 24 horas durante 10 días
y se anota con el siguiente score cada observación: 0 si es
normal, 1 si está enferma, 2 si está paralizada o muestra
algunos signos nerviosos, y 3 si está muerta. (Los individuos
muertos deben puntuarse como 3 en cada una de las
observaciones diarias siguientes a la muerte).
iv) El índice de patogenicidad intravenosa (IVPI) es la puntuación
media por ave y por observación durante el período de 10 días.
Las cepas lentogénicas y algunas cepas mesogénicas tendrán valores
IVPI de 0, mientras que los índices de las cepas virulentas se
aproximarán a 3.0.
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Se han recomendado algunas variaciones en estas pruebas. El muestreo
de la cloaca y de la conjuntiva de pollos de 8 semanas con líquido
alantoideo no diluido se ha sustituido por la prueba IVPI. La intención
es distinguir entre los virus velogénicos viscerotrópicos y velogénicos
neurotrópicos.
• Interpretación de los índices de patogenicidad
No resulta sencilla la interpretación de los índices de patogenicidad
obtenidos con vistas a un comercio impositivo, o a restricciones en el
movimiento u otras políticas. El objetivo es controlar las cepas que son
significativamente más virulentas que las cepas lentogénicas, tales
como la Hitchner-B1 o La Sota. Como los virus capaces de producir una
enfermedad bastante severa pueden tener valores IVPI de 0, se utiliza la
prueba ICPI con más frecuencia para tales valoraciones. Sin embargo,
como en esta prueba cepas diferentes muestran un rango de valores
desde 0.00 hasta 2.00, está claro que cualquier valor utilizado para
definirlas debe regirse por el sentido práctico.
TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
En el diagnóstico de la EN es importante entender que la demostración de
la presencia del virus con múltiples aminoácidos básicos en el punto de
escisión de F0 confirma la presencia de virus virulentos o potencialmente
virulentos, pero la falta de detección de virus o la detección de virus de la
EN sin múltiples aminoácidos básicos en el punto de escisión de F0
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empleando técnicas moleculares no confirma la ausencia de virus
virulentos. Una primera correspondencia mala o la posibilidad de que en
una misma población estén mezclados virus virulentos y avirulentos,
implica que todavía será necesario el aislamiento del virus y una
valoración in vivo de la virulencia. (Merck, 2004)
IDENTIFICACIÓN DEL AGENTE
a) Muestras para el aislamiento vírico
Cuando las investigaciones de la EN son el resultado de la aparición
de la enfermedad severa y mortalidad elevada en grupos de aves, es
corriente intentar el aislamiento del virus a partir de aves muertas
recientemente o aves moribundas que se sacrifican de forma indolora.
Las muestras procedentes de aves muertas deberían consistir en frotis
oronasales, tanto como muestras procedentes de tejidos de pulmón,
riñones, intestino (incluyendo contenidos), bazo, cerebro, hígado y
corazón. Pueden ser recogidos separadamente o en conjunto, aunque,
habitualmente, las muestras intestinales se procesan de forma separada
de otras muestras.
Las muestras procedentes de aves vivas deberían incluir tanto frotis
traqueales como cloacales; las últimas deberían estar visiblemente
cubiertas de material fecal. Los pájaros pequeños y delicados pueden
dañarse por el muestreo pero la recogida de heces frescas puede servir
como alternativa adecuada.
En el caso de que sean limitadas las oportunidades de obtener
muestras, es importante que se examinen los frotis cloacales (o
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fecales) y los frotis traqueales (o tejido traqueal) tanto como los
órganos o tejidos más afectados o asociados con la enfermedad
clínica. Las muestras deberían tomarse en las etapas tempranas de la
enfermedad.
Se tendrían que colocar las muestras en solución salina isotónica
tamponada con fosfato (PBS), pH 7.0-7.4, que contenga antibióticos.
Los antibióticos pueden variar de acuerdo a las condiciones locales,
pero podría ser, por ejemplo, penicilina (2,000 unidades/ml);
estreptomicina (2mg/ml); gentamicina (50µg/ml); y micostatina
(1,000 unidades/ml) para frotis traqueales y de tejidos, pero a
concentraciones cinco veces superiores para frotis cloacales y de
heces. Es importante reajustar la solución a pH 7.0-7.4 después de la
adición de los antibióticos. Las heces y los tejidos tomados finamente
deberían prepararse como suspensiones al 10-20% (p/v) en la solución
de antibiótico. Las suspensiones deberían procesarse tan pronto como
fuera posible después de una incubación durante 1-2 horas a
temperatura ambiente. Cuando es impracticable el procesamiento
inmediato, las muestras pueden conservarse a 4ºC hasta 4 días.
b) Cultivo del virus
Los líquidos sobrenadantes de las heces o las suspensiones de tejidos
obtenidos mediante la clarificación por centrifugación a 1,000g
durante aproximadamente 10 minutos a una temperatura que no
exceda los 25ºC se inoculan en volúmenes de 0.2ml en la cavidad
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alantoidea de cada uno de al menos cinco huevos embrionados de aves
SPF de 9-11 días de incubación. Después de la inoculación, se incuban
a 35-37ºC durante 4-7 días. Los huevos que contengan embriones
muertos o moribundos cuando surgen, y todos los huevos que
permanezcan hasta el final del período de incubación, deberían
enfriarse primero a 4ºC y probar los líquidos alantoideos para detectar
actividad de hemaglutinación (HA). Los líquidos que den una reacción
negativa deberían ser pasados en al menos un lote posterior de huevos.
c) Identificación del virus
La actividad HA detectada en líquidos bacteriológicamente estériles
recogidos a partir de huevos inoculados puede deberse a la presencia
de cualquiera de los 15 subtipos de hemaglutininas de los virus de la
gripe A o de los 8 restantes serotipos de paramixovirus. (El líquido no
estéril podría contener actividad HA bacteriana). El virus de la EN
puede confirmarse empleando antisuero específico en una prueba de
inhibición de la hemaglutinación (HI). Habitualmente se utiliza el
antisuero de pollo preparado contra una de las cepas del virus de la
EN.
Las reacciones cruzadas en las pruebas HI entre el virus de la EN y
algunos otros APMVs, especialmente los virus de los serotipos
APMV-3 y APMV-7 pueden causar algunos problemas que pueden
resolverse empleando controles adecuados de antígeno y antisuero.
PRUEBAS SEROLÓGICAS
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El virus de la EN puede emplearse como un antígeno en una variedad
de pruebas serológicas, lo que permite que se utilicen las técnicas de
neutralización o de enzimoinmunoensayo (ELISA) para el
diagnóstico. En la actualidad, la prueba HI es la más ampliamente
utilizada. Los sueros de pollo raramente dan reacciones positivas no
específicas en esta prueba y es innecesario cualquier pretratamiento de
los sueros. Los sueros procedentes de especies distintas a las de los
pollos a veces pueden causar aglutinación de los eritrocitos (RBC) de
pollo, así que esta propiedad debería determinarse primero, y
posteriormente extraer mediante adsorción del suero con RBC de
pollo. Esto se realiza adicionando 0.025ml de RBC de pollo
empacados a cada 0.5ml de antisueros, agitando suavemente y
dejándolos durante al menos 30 minutos; a continuación los RBC se
precipitan mediante centrifugación a 800g durante 2-5 minutos y se
decantan los sueros adsorbidos.
En diferentes laboratorios se practican variaciones de los
procedimientos para las pruebas HA y HI. Los siguientes ejemplos
recomendados emplean placas de microtitulación de plástico y fondo
en V en las que el volumen final para ambos tipos de prueba es de
0.075ml. Los reactivos necesarios para estas pruebas son PBS
isotónico (0.1 M), pH 7.0-7.2, y RBC procedentes de un mínimo de
tres pollos SPF y agrupados en un volumen igual de solución de
Alsever. (Si no se dispone de pollos SPF, se puede emplear sangre
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procedente de aves no vacunadas que se controlen regularmente y
muestren estar libres de anticuerpos frente al virus de la EN). Las
células se deberían lavar tres veces en PBS antes de usarlas como
suspensión al 1% (células empacada v/v). Debería realizarse en cada
prueba, de modo apropiado, un control positivo y negativo de los
antígenos y de los antisueros.
a) Pruebas de hemaglutinación y de inhibición de la hemaglutinación
• Pruebas de hemaglutinación
i) Se distribuyen 0.025ml de PBS en cada pocillo de una placa
de microtitulación de plástico y fondo en V.
ii) A cada pocillo se adicionan 0.025ml de la suspensión vírica
(p. ej. Líquido alantoideo infectivo). Para una determinación
precisa del contenido de HA, se debería hacer partir de una
serie de diluciones muy cercanas a una inicial, p. ej. 1/3, 1/5,
1/7, etc.
iii) A lo largo de toda la placa se practican diluciones al doble de
la suspensión vírica en volúmenes de 0.025ml.
iv) Posteriormente se adicionan a cada pocillo 0.025ml de PBS.
v) En cada pocillo se dispensan 0.025ml de RBC de pollo al
1% (v/v).
vi) La solución se mezcla golpeando suavemente la placa. Se
dejan estáticos los RBC durante unos 40 minutos a
temperatura ambiente, p. ej. aproximadamente a 20ºC, o
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durante 60 minutos a 4ºC si las temperaturas son altas,
considerando que los RBC control deberían sedimentar de
una forma distinta.
vii) La HA se determina inclinando la placa y observando la
presencia o ausencia de una corriente en forma de lágrima de
los RBC. Debería leerse la titulación a la dilución más alta a
la que se de una HA completa (sin corriente); esto representa
1 unidad HA (HAU) y puede calcularse de forma precisa a
partir del rango inicial de diluciones.
• Prueba de inhibición de la hemaglutinación
i) Se dispensan 0.025ml de PBS en cada pocillo de una placa
de microtitulación de plástico y fondo en V.
ii) Se adicionan 0.025ml de suero en el primer pocillo de la
placa.
iii) A lo largo de la placa se realizan diluciones dobles de suero
en volúmenes de 0.025ml.
iv) A cada pocillo se añaden 4 HAU de virus/antígeno en
0.025ml y la placa se deja durante un mínimo de 30 minutos
a temperatura ambiente, p. ej. en torno a 20ºC, ó 60 minutos
a 4ºC.
v) A cada pocillo se añaden 0.025ml de RBC de pollo al 1%
(v/v) y, después de mezclar suavemente, los RBC se dejan
estáticos unos 40 minutos a temperatura ambiente, p. ej. en
16
torno a 20ºC, o durante unos 60 minutos a 4ºC si las
temperaturas del ambiente son altas, considerando que los
RBC control deberían sedimentar de una forma distinta.
vi) El título de HI es la dilución mayor de suero que causa la
inhibición completa de 4 HAU de antígeno. La aglutinación
se valora inclinando las placas. Debería considerarse que
muestran inhibición sólo aquellos pocillos en los que la
corriente de RBC se produce a la misma velocidad que los
pocillos control (que contienen 0.025ml de RBC y 0.05ml de
PBS).
vii) La validez de los resultados debería evaluarse frente a un
suero control negativo, que no debería presentar un título
>1/4 (>22 ó >log2 2 cuando se expresa como el recíproco), y
un suero control positivo para el cual el título debería
encontrarse entre una de las diluciones del título conocido.
El valor de la serología en el diagnóstico está relacionado claramente
con el estado inmune esperado de las aves afectadas. Los títulos de HI
pueden considerarse positivos si hay inhibición a una dilución del
suero de 1/16 (24 ó log2 4 cuando se expresa como el recíproco) o
superior contra 4 HAU de antígeno. Algunos laboratorios prefieren
usar 8 HAU en las pruebas de HI. Mientras esto se permita, afectará a
la interpretación de los resultados de modo que un título positivo será
1/8 (23 ó log2 3) o superior. Se debería incluir una nueva titulación del
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antígeno en todas las pruebas para verificar el número de HAU
utilizadas.
Los títulos de HI pueden emplearse para evaluar el estado inmune de
un grupo de aves. En grupos vacunados que estén siendo controlados
serológicamente, es posible identificar respuestas anamnésicas como
resultado de una infección de desafía con el virus de campo, pero se
debería proceder con gran cautela porque se pueden producir
variaciones por otras causas. Por ejemplo, se ha demostrado que las
infecciones por el virus APMV-3 de pavos vacunados contra el virus
de la EN darán por resultado títulos sustancialmente elevados frente al
virus de la EN.
Se dispone comercialmente de una variedad de kits de pruebas de
ELISA que se basan en diversas estrategias para la detección de
anticuerpos contra el virus de la EN, incluyendo ELISA indirecto, tipo
sándwich y de bloqueo o competitivo, que emplean MAbs. Al menos
uno de los kits utiliza una subunidad antigénica. Habitualmente estas
pruebas se han validado y evaluado por el fabricante y, por tanto, es
importante que para su uso, se sigan cuidadosamente las instrucciones
especificadas. (OIE, 2004)
REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE
DIAGNÓSTICO
Las cepas víricas de la EN empleadas en las vacunas comerciales de virus
vivos se encuadran en dos grupos: vacunas lentogénicas tales como
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Hitchner-B1, La Sota, V4, NDW, I2 y F, y vacunas mesogénicas, tales
como Roakin, Mukteswar y Komarov. Las cepas de ambos grupos han
sido seleccionadas y clonadas para satisfacer los diferentes criterios en su
producción y aplicación. Todos los virus de vacunas mesogénicas tienen
dos pares de aminoácidos básicos en el punto de escisión F0 y valores
ICPI de aproximadamente 1.4. Esto significa que las infecciones de aves
con estos virus entrarían dentro de la definición propuesta para la EN, pero
como estas vacunas se emplean principalmente en países donde la EN es
endémica, este hecho puede que no excluya necesariamente su uso.
El servicio de producción de vacunas debería operar bajo los
procedimientos y prácticas apropiados de bioseguridad. Si la EN se utiliza
para la producción de vacunas o para estudios de desafío de la vacuna, la
parte del servicio donde se realice el trabajo debería cumplir los requisitos
para los patógenos del nivel de Contención del Grupo 4 (organismos que
causan enfermedades exóticas o enzoóticas, sujetos a control oficial y con
alta posibilidad de propagarse a partir de un laboratorio).
La mayoría de vacunas con virus vivos crecen en la cavidad alantoidea de
huevos embrionados de aves pero algunas, notablemente algunas cepas
mesogénicas, se ha adaptado a una variedad de sistemas de cultivo de
tejidos.
Las vacunas con virus vivos pueden administrarse a las aves
incorporándolas en el agua de bebida, administrándose como un spray
grueso o mediante instilación conjuntival o intranasal. Algunas cepas
mesogénicas se obtienen por inoculación intradérmica en la membrana del
19
ala. Se han preparado vacunas que dan resultados óptimos mediante la
aplicación de vías específicas. En general, las vacunas vivas más
inmunogénicas son más virulentas y, por tanto, es más probable que
causen efectos secundarios adversos. Por ejemplo, la vacunación con la
cepa La Sota causará problemas considerablemente mayores en aves
susceptibles jóvenes que la cepa Hitchner-B1, aunque La Sota induce una
respuesta inmune más fuerte.
Las vacunas inactivadas se consideran más caras que las vacunas vivas y
su empleo entraña la manipulación e inyección de aves individuales. Se
preparan a partir de líquido alantoideo al que se inactiva su infectividad
mediante la adición de formaldehído o beta-propiolactona. Se incorpora en
una emulsión con aceite mineral y se administra por vía intramuscular o
subcutánea. Así las aves individuales reciben una dosis estándar. No se
produce la propagación subsiguiente del virus ni reacciones respiratorias
adversas. Se utilizan tanto cepas virulentas como avirulentas como inóculo
vírico aunque, desde el punto de vista del control de la seguridad, el uso de
éstas últimas parece menos adecuado. Como después de la administración
no se produce la multiplicación vírica, se requiere una cantidad de
antígeno para la inmunización mucho mayor que en el caso de la
vacunación con virus vivos.
La duración de la inmunidad depende del programa de vacunación elegido.
Una de las consideraciones más importantes que afectan a los programas
de vacunación es el nivel de inmunidad maternal de los pollos jóvenes que
pueden variar considerablemente de granja en granja, de lote a lote y entre
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pollos individuales. Por esta razón, se emplean diversas estrategias. O las
aves no se vacunan hasta las 2-4 semanas de vida cuando la mayoría de
ellos será susceptible, o se vacunan con 1 sólo día de vida por instilación
conjuntival o mediante la aplicación de un spray grueso. Se establecerá
una infección activa en algunas aves que persistirá hasta que la inmunidad
maternal decrezca. Entonces, se llevará a cabo una revacunación 3-4
semanas más tarde. Se ha demostrado que las vacunas inactivadas también
pueden ser empleadas adecuadamente para vacunar polluelos de 1 día que
tienen cierto grado de inmunidad maternal, y los mejores resultados se han
obtenido cuando a los polluelos maternalmente inmunes de 1 día se les da
una combinación de vacunas viva e inactivada, comparada con vacunas
vivas o inactivadas dadas de forma separada. La vacunación de aves de 1
día totalmente susceptibles, incluso con las vacunas vivas más suaves,
puede provocar enfermedad respiratoria, especialmente si están presentes
en cantidad significativa bacterias patógenas comunes.
Normalmente se practica una vacunación después de 3 semanas de vida
sólo en gallinas de crianza y gallinas de puesta. Se debería llevar a cabo
con intervalos de suficiente frecuencia para mantener una inmunidad
adecuada. Los programas de vacunación emplean con frecuencia vacunas
con virus vivos un poco más patogénicos para reforzar la inmunidad de las
usadas inicialmente. También pueden usarse estas vacunas vivas más
patogénicas después de una vacunación inicial con vacunas inactivadas en
emulsión de aceite.
21
Cuando se diseña un programa de vacunación, debería tenerse en
consideración el tipo de vacuna utilizada, el estado inmune y de
enfermedad de las aves a vacunar y el nivel de protección requerido en
relación a cualquier posibilidad de infección con el virus de campo bajo las
condiciones locales. Aquí se indican dos ejemplos de programas de
vacunación que pueden utilizarse en diferentes circunstancias de
enfermedad. Para el primer ejemplo, cuando la enfermedad es leve y
esporádica se sugiere que se adopte el siguiente orden de vacunación:
vacuna viva Hitchner-B1 mediante administración conjuntival o de spray a
1 día de edad; vacuna viva Hitchner-B1 o La Sota a los 18-21 días de vida
en el agua de bebida; vacuna viva La Sota en el agua de bebida a las 10
semanas de vida y una vacuna inactivada en emulsión de aceite en el
momento de la puesta. Para el segundo ejemplo, cuando la enfermedad es
severa y más extendida, se adopta el mismo protocolo ya indicado hasta
los 21 días de vida y a esto le sigue la revacunación a los 35-42 días de
vida con la vacuna viva La Sota en el agua de bebida o como spray; esta
revacunación se repite a las 10 semanas de vida con una vacuna inactivada
(o una vacuna viva mesogénica) y de nuevo se repite en el momento de la
puesta. (Shortridge, 1982)
1. Control del inóculo
a) Características del inóculo
El primer principio a considerar cuando se selecciona una cepa para
una vacuna viva del virus de la EN es si se va a usar como vacuna
22
primaria o secundaria, siendo su patogenicidad la principal
consideración. Los métodos de aplicación y frecuencia de uso son
consideraciones válidas. El uso de MAb ha demostrado una
variación considerable en la antigenicidad de cepas diferentes. Esto
puede indicar la necesidad de adaptar las vacunas más
cuidadosamente a virus antigénicamente relacionados con cualquier
virus de campo predominante.
Se ha introducido una vacuna viva basada en la cepa V4 del virus
de la EN, seleccionada por su estabilidad al calor, para combatir los
problemas específicos asociados con la crianza del pollo campero
en los países en desarrollo. La intención es que esta vacuna puede
estar protegida por el alimento para los pollos que se alimentan de
restos. Hasta la fecha, los ensayos realizados en diferentes países
han producido resultados mezclados; bien puede ser que los
factores locales sean extremadamente importantes afectando al
éxito de esta estrategia. Más recientemente se ha desarrollado la
vacuna I2 termoestable específicamente para la vacunación de los
pollos camperos; actualmente se recomienda que esta vacuna se
suministre mediante gota al ojo.
La consideración más importante en la selección de un inóculo para
preparar una vacuna inactivada es la cantidad de antígeno
producida cuando crece en huevos embrionados; raramente es
rentable concentrar el virus. Se han usado tanto cepas virulentas
como lentogénicas para preparar vacunas inactivadas, pero las
23
primeras ofrecen un riesgo innecesario porque supone la
manipulación de grandes cantidades de virus virulentos así como el
peligro de una inactivación inadecuada y la posible contaminación
consiguiente.
b) Método de cultivo
Se establece un inóculo original y a partir del mismo un inóculo de
trabajo. Si la cepa se ha clonado mediante dilución limitante o
selección en placa, el establecimiento de un cultivo maestro sólo
puede implicar la producción de un gran volumen de líquido
alantoideo infectivo (como mínimo 100ml), que puede conservarse
en forma de alícuotas liofilizadas (0.5ml).
c) Validación como vacuna
A los virus del inóculo de origen desconocido se les debería
realizar pases a través de huevos SPF y ser clonados antes de
producir el inóculo original. También puede ser conveniente algún
pase a través de pollos SPF. En cualquier caso, después de su
preparación, del inóculo original se debería comprobar su
esterilidad, seguridad, potencia y presencia de agentes extraños.
2. Método de producción
Para la producción de la vacuna, primero se establece un inóculo de
trabajo, a partir de cualquiera de los lotes de vacuna producidos,
24
mediante la expansión de una alícuota del inóculo original hasta un
volumen suficiente para permitir la producción de la vacuna durante
12-18 meses. Es mejor conservar el inóculo de trabajo de forma
líquida a una temperatura de -60ºC o inferior porque el virus
liofilizado no siempre se multiplica hasta un título alto en el primer
pase subsiguiente.
La mayoría de las vacunas de la EN se producen en huevos
embrionados de ave y las vacunas de virus vivos deberían producirse
en huevos SPF. El método de producción es la propagación de virus
aséptica y a gran escala; todos los procedimientos se llevan a cabo
bajo condiciones de esterilidad.
Es habitual diluir el inóculo de trabajo en PBS estéril, pH 7.2, de
modo que aproximadamente se inoculan 103-104 EID50/0.1ml en la
cavidad alantoidea de huevos embrionados SPF de 9 ó 10 días de
vida. A continuación se incuban a 37ºC. Se deberían desechar los
huevos que contengan embriones muertos en las 24 horas. El tiempo
de incubación dependerá de la cepa vírica utilizada y se
predeterminará para asegurar una producción máxima con el número
de muerte de embriones.
Los huevos infectados deberían enfriarse a 4ºC antes de recogerse. Se
quitan las partes superiores de los huevos y se aspiran los líquidos
alantoideos después de la eliminación del embrión. Debería evitarse la
inclusión de cualquier resto de yema o de albúmina. Se deberían
25
conservar todos los líquidos inmediatamente a 4ºC y comprobar la
ausencia de contaminación bacteriana antes de preparar grandes
cantidades para la liofilización o inactivación. Normalmente, las
vacunas vivas se liofilizan. La metodología depende de los aparatos
utilizados y de la pericia de los fabricantes, pero esta es una etapa
muy importante ya que una liofilización inadecuada resulta tanto en
pérdidas de título como en un período de validez reducido.
En la producción de vacunas inactivadas, se trata el líquido alantoideo
recogido con formaldehído (una concentración final típica es 1/1000)
o beta-propiolactona (una concentración final típica es 1/2000-
1/4000). El tiempo requerido debe ser suficiente para asegurar que
esté libre de virus vivos. La mayoría de vacunas inactivadas no se
concentran; el líquido alantoideo inactivado normalmente se
emulsiona con aceite mineral o vegetal.
Generalmente, las vacunas inactivadas basadas en aceite se preparan
como emulsiones primarias de agua en aceite. Habitualmente, la fase
oleosa consiste en nueve volúmenes de aceite mineral altamente
refinado, tal como Marcol 52, Drakeol 6VR y BayolF, más un
volumen de agente emulsinante, tal como Arlacel A, Montanide 80 y
Montanide 888. La fase acuosa es el virus inactivado al que se le
adiciona un emulsionante no iónico como Tween 80. Normalmente la
relación fase oleosa a fase acuosa es de 1:1 hasta 1:4. Los fabricantes
se esfuerzan para conseguir un balance entre el efecto adyuvante, la
viscosidad y la estabilidad. Si la viscosidad es demasiado alta, la
26
vacuna será difícil de inyectar; si es demasiado baja, la vacuna es
inestable.
3. Control del proceso
Cada lote de vacuna con virus vivo debe probarse en cuanto a su
viabilidad y potencia. Para aquellas producidas en huevos, el control
más importante del proceso es comprobar la ausencia de
contaminación bacteriana y fúngica. Esto es necesario debido a la
aparición de huevos en estado de putrefacción que pueden no ser
detectados hasta el momento de la recogida.
Para las vacunas inactivadas debe probarse la eficacia del proceso de
inactivación en huevos embrionados, tomando 25 alícuotas (0.2ml) de
cada lote y realizando pases cada tres veces a través de embriones
SPF.
4. Control de lotes
Es necesario probar la infectividad de las vacunas con virus vivos para
conseguir que se administren los niveles adecuados de virus.
Habitualmente se titula el virus en huevos embrionados de aves hasta
conseguir la EID50. Esto implica realizar diluciones a la décima del
virus; se inoculan 0.1ml de cada dilución en cinco a siete huevos
embrionados de aves de 9-10 días de vida. Después de 5-7 días de
incubación a 37ºC, los huevos se enfrían y se prueban para demostrar
27
su actividad hemaglutinante, que es una indicación de la presencia del
virus vivo. La EID50 a punto final se calcula empleando una fórmula
estándar tal como la de Spearman-Kärber.
a) Esterilidad
La esterilidad se define como la ausencia de organismos vivos. Se
logra por calentamiento, por filtración, mediante tratamiento con
óxido de etileno o por radiaciones ionizantes, y realizando
asépticamente cualquier proceso posterior. La ausencia de
contaminación se define como la falta de seres vivos concretos.
Esto se puede obtener seleccionando los materiales a partir de
fuentes que carezcan de los organismos concretos y realizando
asépticamente cualquier proceso posterior. Solo con un control
adecuado de los materiales primarios empleados y de los procesos
que se siguen, así como del almacenamiento, se puede conseguir
una adecuada seguridad de esterilidad y de ausencia de
contaminación. Se requiere la realización de pruebas sobre el
producto para comprobar que se ha logrado este control.
Los materiales originales deben obtenerse de fuentes que estén
libres de contaminación y que sean manejadas de tal modo que se
reduzca la contaminación y la posibilidad de que cualquier
contaminante se multiplique.
Los materiales que puedan esterilizarse sin que sus propiedades
biológicas resulten excesivamente afectadas deben esterilizarse
28
mediante un método efectivo para tales materiales concretos. El
método debe reducir el nivel de contaminación hasta que ésta sea
indetectable, según determine una prueba de esterilidad adecuada.
Si se emplea un procedimiento de esterilización, deberá ser
validado para demostrar su conveniencia y ser controlado de modo
adecuado para demostrar que ha funcionado correctamente en
cada ocasión.
Los materiales que no se han esterilizado y aquellos sometidos a
manipulación tras la esterilización han de ser manejados
asépticamente. El ambiente en que se realiza cualquier
manipulación aséptica ha de mantenerse en un estado de limpieza
protegido de fuentes externas de contaminación, y debe estar
controlado para reducir al mínimo la contaminación interna.
Los materiales de origen animal deben ser esterilizados, u
obtenidos de animales sanos que, en la medida de lo posible,
deberían de estar libres de patógenos que puedan transmitirse de la
especie de origen a la especie que va a ser vacunada, o a cualquier
otra especie en contacto con ellas, o el material debe estar exento
de tales patógenos.
Los virus del inóculo inicial y los de cualquier línea celular
continua empleada para el crecimiento de los virus deben estar
libres de bacterias, hongos, micoplasmas, virus no relacionados y
otros patógenos que puedan transmitirse de la especie de origen a
29
la especie que va a ser vacunada, o a cualquier otra especie en
contacto con ellas.
Cada lote de vacuna debe superar una prueba de esterilidad similar
a la de métodos publicados, además debe superar pruebas
adecuadas para demostrar que la vacuna está exenta de virus
contaminados (tales pruebas incluyen ensayos en cultivos
celulares que sean sensibles a los virus de la especie a vacunar,
pruebas sobre huevos embrionados, y, cuando sea necesario,
pruebas en animales).
Puede ser necesaria la realización de pruebas para determinar la
ausencia de algunas bacterias específicas, por ejemplo Salmonella
pullorum, Mycobacterium tuberculosis y M. paratuberculosis,
Brucella spp. y Leptospira spp. Algunos países exigen que cada
lote de vacuna supere una prueba de ausencia de micoplasmas.
b) Inocuidad
El uso de pollos para la comprobación de las vacunas supone la
inoculación de diez o más aves de la edad indicada que procedan
de un grupo SPF. Se administrarán diez dosis de vacuna viva por
vía supraconjuntival a cada ave y a continuación las aves se
mantendrán en observación durante 21 días. Ningún pollo debería
mostrar signos clínicos serios y ninguno debería morir por causas
atribuibles a la vacuna.
30
En el caso de vacunas inactivadas se administrará una dosis doble
por la vía recomendada a diez aves de 3 semanas de edad y se
mantendrán en observación durante 2 semanas para comprobar la
ausencia de signos clínicos de enfermedad o lesiones locales.
c) Potencia
Se han propuesto varios métodos para comprobar la potencia de
las vacunas del virus de la EN. Se ha subrayado la importancia de
usar una adecuada cepa de desafío para la valoración. Una cepa
adecuada es la Herts 33. Para las vacunas vivas, el método
recomendado supone la vacunación de 20 aves SPF u otras
completamente susceptibles a la mínima edad recomendada por
vía sugerida, empleando la dosis mínima recomendada. Después
de 14-21 días, cada ave vacunada y diez aves control se desafían
por vía intramuscular con 105 LD50 (dosis letal 50%) del virus de
desafío de la EN. La vacuna para la prueba si al cabo de 10 días el
90% de los pollos vacunados sobrevive sin síntomas de
enfermedad, pero todos los controles mueren en 6 días.
Para las vacunas inactivadas, se emplean pollos SPF o
susceptibles de 21-28 días. Se inyectan por vía intramuscular tres
grupos de 20 aves con volúmenes de vacuna equivalentes a 1/25,
1/50 y 1/100 de una dosis. Se mantiene un grupo de diez pollos
como control. Se desafían todas las aves mediante inyección
intramuscular de 106 LD50 del virus de desafío de la EN, 17-21
31
días más tarde. Se observan los pollos durante 21 días. La PD50
(dosis protectora 50%) se calcula mediante métodos estadísticos
estándar. La prueba sólo es válida si todas las aves control de
desafío mueren en 6 días. La vacuna cumple con la prueba si la
PD50 no es menos que 50 por dosis y si el límite de confianza
menor no es menos que 35 PD50 por dosis. Algunas autoridades de
control aceptan una prueba sólo a 1/50, por razones de sanidad
animal.
No es necesario repetir la prueba de potencia en cada lote si se ha
demostrado que ha pasado la prueba un lote representativo del
producto final procedente del inóculo original.
d) Duración de la inmunidad
El nivel de inmunidad alcanzado con cualquier dosis única o
régimen de vacunación de la EN, variará enormemente tanto con
la vacuna como con la especie hospedadora. Es extremadamente
complejo y difícil de evaluar el nivel de inmunidad requerido en
un hospedador dado (p. ej. para proteger contra la muerte, la
enfermedad, las pérdidas de producción de carne o huevos).
Generalmente, se debería hacer alguna evaluación de la
longevidad de los anticuerpos del suero y adoptarse regímenes de
vacunación para mantener éstos por encima de un nivel aceptable.
e) Estabilidad
32
El producto o vacuna final, cuando se almacena bajo las
condiciones recomendadas, debería mantener su potencia durante
al menos 1 año. Las pruebas de estabilidad acelerada, tales como
la reducción de la infectividad seguida de la incubación a 37ºC
durante 7 días, pueden utilizarse como una guía para las
capacidades de almacenaje de un lote de vacuna viva. Las vacunas
en emulsión de aceite, también deberían someterse a un agente
acelerador mediante almacenamiento a 37ºC, durante un mínimo
de un mes, sin separación de las fases acuosa y oleosa. Las
vacunas con virus vivos deben emplearse inmediatamente después
de su reconstitución. Las vacunas inactivadas no se deben
congelar.
f) Conservantes
Para las vacunas vivas no se deben incluir conservantes en el
producto liofilizado, pero los conservantes antimicrobianos
pueden incorporarse en el diluyente utilizado para reconstituir la
vacuna.
g) Precauciones (riesgos)
Las vacunas vivas de la EN pueden representar un riesgo para los
humanos. Se ha informado de que los virus de la EN, tanto los
virulentos como los poco virulentos para los pollos, han infectado
a humanos, causando normalmente conjuntivitis aguda después de
la introducción al ojo. Habitualmente, las infecciones son
33
transitorias y no afectan a la córnea. Las vacunas en emulsión de
aceite mineral representan un riesgo serio para el vacunador. La
inyección accidental de humanos debería tratarse con prontitud
mediante la incisión y el lavado de la zona, como para el caso de
una herida por “inyección de grasa”. (OIE, 2004)
34
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1.Materiales
3.1.1. Localización del trabajo
a) Localización espacial.
El trabajo de laboratorio de la presente investigación se
desarrollará en las instalaciones del laboratorio de sanidad animal
del SENASA, localizado en la Av. La Molina 1915, distrito de La
Molina, provincia de Lima, departamento de Lima.
Ubicación y límites geográficos:
12° 00° 03° a 12° 00° 07° Latitud Sur
76° 57° 00° a 76° 51 ° 00° Longitud Oeste
Tiene una altitud de 350 a 900 m.s.n.m. Presentando los
siguientes límites geográficos:
• Por el norte con el distrito de Ate Vitarte.
• Por el este con el distrito de Pachacámac.
• Por el sur con el distrito de Villa María del Triunfo.
• Por el oeste con los distritos de Ate Vitarte y Monterrico.
Fuente: http://www.munimolina.gob.pe/m1.htm
35
b) Localización temporal.
El trabajo de recolección de muestra se llevará a cabo durante los
meses de Enero a Julio del 2008 y el trabajo de laboratorio se
realizara dentro de los meses de Julio y Agosto del 2008.
3.1.2. Material biológico
• Muestras de vacunas monovalentes, vivas, nacionales y
extranjeras contra la EN.
• Huevos libres de patógenos específicos (SPF), obtenidos del
Laboratorio FARVET, Chincha, Perú.
3.1.3. Equipos y maquinarias
• Computadora Personal.
• Cámara digital.
• Estufa incubadora 37.5°C.
• Estufa de medios 23ºC.
• Estufa de medios 36ºC.
• Ovoscopio.
• Agitador de tubos.
• Refrigeradora 4ºC
• Autoclave.
• Cámara de bioseguridad tipo II.
36
• Minitaladro.
3.1.4. Materiales de laboratorio
• Placas petri.
• Tubos de ensayo.
• Propipetas.
• Pipetas de 1ml, 2ml, 5ml, 10ml.
• Jeringas descartables de 1ml, 3ml, 5ml.
• Balones y matraces para reactivos.
• Gradillas
• Agua destilada estéril.
• PBS.
• Caldo BHI.
• Caldo Thioglicolato.
• Agar TSA.
• Agar Sangre.
• Agar Sabouraud.
• Algodón.
• Alcohol.
37
• Lejía.
• Yodo.
• Gorro.
• Mascarilla.
• Guantes estériles.
• Marcador de tinta indeleble.
• Pegamento universal (Uhu).
• Tijera.
• Lápiz.
• Película autosellante, moldeable (Parafilm M).
3.2.Métodos
3.2.1. Muestreo
a) Universo.
Empresas productoras de vacunas contra la EN
Nacionales Extranjeras
2 10
b) Tamaño de la Muestra.
38
Debido al tamaño reducido del universo el tamaño de la muestra
será el universo completo.
c) Procedimiento de Muestreo.
Se adquirirán 2 muestras de un lote de cada empresa productora
de las vacunas mencionadas, siendo en total 24 muestras.
A las cuales se les realizarán los exámenes de control de calidad
(esterilidad, titulación).
3.2.2. Métodos de Evaluación
a) Metodología de la Experimentación.
Las vacunas que no estén siendo utilizadas en ese momento deben
ser conservadas en el refrigerador a 4ºC, así mismo los medios y
caldos de cultivo.
ESTERILIDAD:
Esta prueba consiste en determinar que el producto está libre de
cualquier contaminante microbiológico.
1) Retirar del refrigerador los medios y caldos de cultivo (uno
por cada vacuna y un control, BHI adicional para reconstituir
las vacunas) y colocarlos en la estufa a 36ºC por
aproximadamente 30 minutos para temperarlos.
2) Marcar con plumón indeleble en cada medio y caldo la vacuna
que será sembrada en cada uno.
39
3) Colocar en la cabina de bioseguridad los medios y caldos de
cultivo, pipetas, jeringas, propipeta, vortex, gradilla, envase
con desinfectante, algodón y alcohol. Someterlos a rayos UV
por 15 minutos.
4) Apagar los rayos UV, retirar la tapa de la cabina, encender la
corriente de aire y la luz de la cabina.
5) Desinfectarse las manos con alcohol. Colocar la vacuna
dentro de la cabina.
6) Colocarse el gorro, mascarilla y guantes estériles.
7) Retirar el precinto de la vacuna. Cargar 5ml de agar BHI en la
jeringa para reconstituir la vacuna. Observar que por presión
negativa (vacío) el líquido debe absorberse rápidamente al
frasco de la vacuna, y la pastilla (vacuna liofilizada) debe
disolverse en aproximadamente 10 segundos lo que indica una
buena liofilización de la vacuna.
8) Retirar la tapa de la vacuna y con una pipeta extraer la vacuna
disuelta, aplicar 1ml a cada caldo de cultivo y 0.2ml a cada
medio de cultivo (colocados al borde del medio de cultivo).
9) Homogenizar con el vortex los caldos de cultivo en los que se
acaba de sembrar.
10) Con una pipeta distinta para cada vacuna y para cada medio se
hace el sembrado por agotamiento, en forma de estrías.
Esperar a que seque. Cada pipeta usada se coloca en el
recipiente con desinfectante.
40
11) Colocar los medios de cultivo Sabouraud en la estufa de 23ºC
(especial para crecimiento de hongos y levaduras), los demás
medios y caldos en la estufa de 36ºC por 14 días.
12) Al 7mo día se realizan los pasajes de los caldos a medios de
cultivo. Para lo que extraemos del refrigerador un medio de
cada tipo para cada caldo de cada vacuna, más uno de cada
tipo para el control.
13) Temperamos los medios en la estufa a 36ºC por 30 minutos y
luego con el plumón indeleble marcamos la vacuna y caldo
para la que serán destinados.
14) Colocamos en la cabina de bioseguridad los medios de
cultivo, pipetas, propipeta, gradilla, vortex, envase con
desinfectante, algodón y alcohol. Los sometemos a rayos UV
por 15 minutos.
15) Apagamos los rayos UV, retiramos la tapa de la cabina,
encendemos la corriente de aire y la luz interna de la cabina.
16) Nos desinfectamos las manos y colocamos los caldos
sembrados hace 7 días en la cabina. Nos colocamos el gorro,
mascarilla y guantes estériles.
17) Extraemos con una pipeta 0.6ml de cada caldo, para colocar
0.2ml en cada medio de cultivo.
18) Sembramos en cada medio de la misma manera descrita
anteriormente. Esperar a que seque.
41
19) Colocamos el medio Sabouraud en la estufa de 23ºC, y los
demás medios y caldos en la estufa de 36ºC por 7 días.
20) Al completarse el tiempo señalado se revisan todos los caldos
y medios de cultivo. Los caldos deben verse traslúcidos y no
debe haber crecimiento de ninguna bacteria u hongo en los
medios de cultivo sólidos. (Protocolo SENASA)
TITULACIÓN:
Determinación del contenido viral de cada una de las vacunas por
utilizar en el presente trabajo, mediante la titulación en huevos
SPF de pollo.
1) Apenas se reciben los huevos deben ser colocados en la
incubadora a 37.5ºC para evitar que se enfríen y mueran los
embriones. Es importante que sean colocados con la cámara
de aire hacia arriba. Se usarán 30 huevos por cada vacuna.
2) Con el ovoscopio revisar cada huevo para verificar que el
embrión esté vivo, marcar con un lápiz el límite de la cámara
de aire y el lugar a perforar (lugar no irrigado cerca del cordón
umbilical). Volver a colocarlos en la incubadora.
3) Colocar en la cabina de bioseguridad tubos de ensayo, pipetas,
jeringas, gradillas, PBS, agua destilada estéril, propipetas,
42
vortex, tijera, algodón, plumón indeleble y alcohol. Los
sometemos a rayos UV por 20 minutos.
5) Nos desinfectamos las manos con alcohol. Colocamos la
vacuna dentro de la cabina. Nos colocamos el gorro,
mascarilla y guantes estériles.
6) Se reconstituye (repontenciar) la vacuna en un tubo de ensayo
con PBS de acuerdo a la dosis de la vacuna. Ejm: si la dosis
indicada es de 0.03ml (una gota) por ave, y el frasco es para
1000 dosis, entonces se reconstituirá con 30ml de PBS.
7) Por cada vacuna se tendrán 10 tubos de ensayo con 9ml de
agua destilada estéril en cada uno para realizar las diluciones
de la vacuna. Los tubos deben estar rotulados indicando la
vacuna y dilución que les corresponde (de 10-1 a 10-10).
8) En el primer tubo colocar con una pipeta 1ml de la vacuna
reconstituída, homogenizar con el vortex.
9) De la primera dilución extraer 1ml con otra pipeta y colocarlo
en el siguiente tubo de ensayo, homogenizar en el vortex. Se
sigue esta sucesión hasta el último tubo.
43
10) De acuerdo al título que figura en el frasco de la vacuna se
escogerá la dilución con ese título además de 2 diluciones
inmediatamente superiores y 2 inmediatamente inferiores.
Ejm: si la vacuna indica un título de 10-7, utilizaremos las
diluciones de 10-5 a 10-9.
11) Vaciamos la cabina de bioseguridad y la desinfectamos con
abundante alcohol.
12) Colocamos nuevamente en la cabina el vortex, jeringas de
1ml, minitaladro, plumón indeleble, alcohol y algodón. Los
sometemos a rayos UV por 20 minutos.
14) Nos desinfectamos las manos con alcohol, colocar en la
cabina las diluciones a usar de cada vacuna y los huevos. Nos
colocamos otros guantes estériles.
15) Rociamos con alcohol los huevos, cubriendo la zona a
perforar. Con el plumón indeleble marcar cada huevo con la
vacuna y dilución que le será inoculada. Se inocularán 5
huevos por cada dilución y se reservará 1 huevo control por
cada dilución.
44
16) Con el minitaladro se perforará en el lugar marcado
previamente con lápiz, se deberá tener mucho cuidado de sólo
perforar la cáscara, no la cutícula.
17) Se homogeniza con el vortex la primera dilución a inocular,
con una jeringa se extrae 1ml de la dilución. Se inyecta 0.2ml
de la dilución en cada huevo.
18) Se repite el mismo procedimiento anterior para cada dilución.
Al terminar de inocular se procede a tapar con Uhu el agujero
perforado.
19) Colocar los huevos nuevamente en la incubadora con la
cámara de aire hacia arriba.
20) Se deberán revisar diariamente los huevos, procurando que
sea a la misma hora, y se deberán ir descartando los muertos,
teniendo un registro de lo que sucede cada día.
21) Los huevos muertos al igual que el sobrante de las vacunas
deben ser colocadas en la cámara fría para su posterior
incineración. (Protocolo Agencia de Cooperación
Internacional del Japón y Universidad Nacional de La Plata)
45
b) Recopilación de información.
• En el laboratorio:
Mediante pruebas de control de calidad: Esterilidad y
Titulación.
• En la biblioteca:
Revisión bibliográfica de antecedentes de investigación tesis,
artículos de revistas científicas, libros de la especialidad, etc.
• Otros ambientes generadores de información científica:
Artículos en revistas electrónicas, documentos de internet y
comunicaciones, y consulta personal con expertos en el área
temática.
3.2.3. Variables de respuesta
a) Variables independientes.
• Empresa de la que proviene la muestra.
b) Variables dependientes.
• Presencia de contaminantes.
• Título adecuado.
46
3.3.Evaluación Estadística
3.3.1. Diseño experimental
3.3.1.1.Unidades experimentales
Cada vacuna muestreada es considerada una unidad
experimental.
3.4.Análisis estadístico
3.4.1. Análisis de Frecuencia
El análisis estadístico se desarrollará mediante la Estadística
descriptiva y cálculos en distribución de frecuencias.
47
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1.Características Físico-cualitativas
Cuadro Nº01. Características Físico-cualitativas.
hidrataciónSignos de
fácilmenteDesprende
Buena liofilización
Pastilla liofilizada
Carame-lización
Impurezas
Precinto
Vacuna
Título
Vacío
Dosis
Cepa
No La
N-01 Crema Sí No No No 1000 10-7  
gira Sota
No La No
N-02 Crema Sí No No No 1000  
gira Sota figura
No Clone
E-01 Crema Sí No No No 1000 10-6  
gira 30
No Clone
E-02 Crema Sí No No No 1000 >10-7.2  
gira 30
No La
E-03 Azul Sí No No No 1000 ≥10-6.2  
gira Sota
No La
E-04 Crema Sí No No No 1000 ≥10-6.5  
gira Sota
No La
E-05 Azul Sí No No No 1000 ≥10-5.5  
gira Sota
PHY.
No
E-06 Azul Sí No No No 1000 LMV. ≥10-5.5  
gira
42
No La
E-07 Crema Sí No No No 2500 10-6.2  
gira Sota
No La No
E-08 Crema Sí No No No 1000  
gira Sota figura
No VG/
E-09 Crema Sí No No No 2000 ≥10-5.5  
gira GA
No Verde
E-10 Sí No No No 5000 B1 ≥10-6.4  
gira agua
Previamente a las pruebas de esterilidad y titulación de virus se debe
observar detenidamente las características de las vacunas, con el fin de
realizar un mejor control de su calidad.
48
En el cuadro Nº01 se observa que el precinto de todas las vacunas se
encuentra en buen estado, ya que en ningún caso gira. Se observan
distintos colores de presentación de las vacunas, debiéndose a la presencia
de colorantes en el caso de las pastillas liofilizadas azules y verde agua.
También se observa que en el caso de todas las vacunas muestreadas, la
pastilla liofilizada se desprende fácilmente del frasco que la contiene;
además ninguna presenta signos de hidratación, impurezas o
caramelización. Nueve de las vacunas (N-01, N-02, E-01, E-02, E-03, E-
04, E-05, E-06 y E-08) contienen una cantidad de dosis total de 1000, una
vacuna (E-09) de 2000 dosis, una (E-07) de 2500 dosis, y por último una
(E-10) de 5000 dosis. Siete de las vacunas muestreadas (N-01, N-02, E-03,
E-04, E-05, E-07 y E-08) son de la cepa La Sota, dos (E-01 y E-02) de la
cepa Clone 30, una (E-10) de la cepa B1, una (E-06) de la cepa
PHY.LMV.42 (cepa enterotrópica apatógena), y una (E-09) de la cepa
VG/GA (cepa enterotrópica lentogénica). Correspondiente al título que
indica el frasco de cada vacuna observamos que tres de las vacunas
muestreadas presentarían un título ≥10-5.5 (E-05, E-06 y E-09), una de 10-6
(E-01), una ≥10-6.2 (E-03), una de 10-6.2 (E-07), una ≥10-6.4 (E-10), una ≥10-
6.5
(E-04), una de 10-7 (N-01), una >10-7.2 (E-02), y en el caso de dos de las
vacunas muestreadas (N-02 y E-08) no figura el título. Por último
observamos que todas las vacunas muestreadas presentan buenas
condiciones de vacío y liofilización.
Gráfico Nº01. Porcentaje de las cepas de las vacunas.
49
En el gráfico Nº01 se observa el porcentaje de uso de las cada cepa en las
vacuna muestreadas, obteniéndose como resultado 58.33% de La Sota,
16.67% de Clone 30, 8.33% de B1, 8.33% de PHY.LMV.42, y 8.33% de
VG/GA. Dándose una notoria diferencia hacia la inclinación de la mayor
parte de laboratorios productores de las vacunas muestreadas a utilizar la
cepa La Sota para la elaboración de las mismas.
4.2.Prueba de Esterilidad
Las pruebas de esterilidad son procedimientos que hacen parte del control
de calidad microbiológico en manufactura y sirven para demostrar que el
producto es estéril, determinando la ausencia o presencia de
microorganismos contaminantes en este.
Cuadro Nº02. Prueba de esterilidad.
Medio de Pasajes
Vacuna 7 días 14 días
cultivo BHI Thyogl.
50
Sabouraud Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin crec.
Agar sangre Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin crec.
N-01 TSA Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin crec.
BHI Sin cambio Sin cambio
Thyoglicolato Sin cambio Sin cambio
N-02 TSA Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin crec.
E-01 TSA Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin crec.
51
En el cuadro Nº02 se observa que, en absolutamente todas las vacunas
muestreadas no hubo crecimiento de microorganismos (bacterias, hongos o
levaduras) en los medios de cultivo sólidos al 7mo ó 14to día, en los
caldos de cultivo tampoco se observó ningún cambio al 7mo ó 14to día, de
igual manera no se registró crecimiento bacteriano o fúngico en los
cultivos realizados de los caldos de cultivo (pasajes).
Realizada la prueba de esterilidad para las 12 muestras se obtuvieron los
resultados mostrados en el siguiente cuadro.
Cuadro Nº03. Resultados de la Prueba de Esterilidad, medios de cultivo.
Medio de cultivo Sin crecimiento Contaminado
52
Sabouraud 12 0
Agar Sangre 12 0
TSA 12 0
PORCENTAJE TOTAL 100% 0%
Podemos observar en el cuadro Nº03 que el 100% de las muestras fueron
interpretadas como estériles es los medios de cultivo sólidos, frente a un
0% de muestras contaminadas. Esto indica que todas las vacunas
muestreadas superaron esta prueba de control de calidad microbiológico
satisfactoriamente.
Cuadro Nº04. Resultados de la Prueba de Esterilidad, caldos de cultivo.
Caldos de cultivo Sin cambio Contaminado
BHI 12 0
Thyoglicolato 12 0
PORCENTAJE TOTAL 100% 0%
En el cuadro Nº04 se observa que el 100% de las muestras fueron
interpretadas como estériles es los caldos de cultivo, frente a un 0% de
muestras contaminadas. Esto indica que todas las vacunas muestreadas
superaron esta prueba de control de calidad microbiológico
satisfactoriamente.
53
Queda en evidencia con estos resultados que la totalidad de las vacunas
muestreadas son estériles, demostrándose por la ausencia de contaminantes
bacterianos y/o fúngicos en los medios de cultivo.
4.3.Titulación de Virus
Se realiza con el fin de determinar el contenido viral de cada una de las
vacunas y, por ende, controlar la cantidad de antígeno a aplicar a cada ave
para producir los anticuerpos necesarios para lograr la inmunización, y no
ocasionar la muerte del animal.
Cuadro Nº05. Método de Reed y Muench

de muertosAcumulado
Dilución de la vacuna
de vivosAcumulado
/TotalMuertos
muertos% de
Título (DL50)
# de muertos
# de vivos
Vacuna
DP
10-5 5 0 13 0 13/13 100

10-6 5 0 8 0 8/8 100
0.88 10-6.9
N-01 10-7 1 4 3 4 3/7 43
10-8 0 5 2 9 2/11 18
10-9 2 3 2 12 2/14 14
10-3 1 4 5 4 5/9 56
0.26 10-3.3
10-4 1 4 4 8 4/12 33
N-02 10-5 1 4 3 12 3/15 20
10-6 2 3 2 15 2/17 12
10-7 0 5 0 20 0/20 0
10-3 5 0 16 0 16/16 100
10-4 5 0 11 0 11/11 100
E-01 10-5 4 1 6 1 6/7 86
0.68 10-6.7
10-6 2 3 2 4 2/6 33
10-7 0 5 0 9 0/9 0
54
10-4 5 0 14 0 14/14 100
10-5 5 0 9 0 9/9 100
E-02 10-6 3 2 4 2 4/6 67
0.32 10-6.3
10-7 1 4 1 6 1/7 14
10-8 0 5 0 11 0/11 0
10-4 5 0 14 0 14/14 100
10-5 5 0 9 0 9/9 100
E-03 10-6 4 1 4 1 4/5 80
0.375 10-6.4
10-7 0 5 0 6 0/6 0
10-8 0 5 0 11 0/11 0
10-4 5 0 14 0 14/14 100
10-5 5 0 9 0 9/9 100
E-04 10-6 3 2 4 2 4/6 67
0.32 10-6.3
10-7 1 4 1 6 1/7 14
10-8 0 5 0 11 0/11 0
10-3 5 0 13 0 13/13 100
10-4 5 0 8 0 8/8 100
E-05 10-5 3 2 3 2 3/5 60
0.17 10-5.2
10-6 0 5 0 7 0/7 0
10-7 0 5 0 12 0/12 0
10-3 5 0 13 0 13/13 100
10-4 5 0 8 0 8/8 100
E-06 10-5 3 2 3 2 3/5 60
0.17 10-5.2
10-6 0 5 0 7 0/7 0
10-7 0 5 0 12 0/12 0
10-4 3 2 9 2 9/11 82
10-5 3 2 6 4 6/10 60
0.37 10-5.4
E-07 10-6 3 2 3 6 3/9 33
10-7 0 5 0 11 0/11 0
10-8 0 5 0 16 0/16 0
10-3 5 0 14 0 14/14 100
10-4 5 0 9 0 9/9 100
E-08 10-5 4 1 4 1 4/5 80
0.375 10-5.4
10-6 0 5 0 6 0/6 0
10-7 0 5 0 11 0/11 0
10-3 5 0 16 0 16/16 100
10-4 4 1 11 1 11/12 92
E-09 10-5 4 1 7 2 7/9 78
0.7 10-5.7
10-6 2 3 3 5 3/8 38
10-7 1 4 1 9 1/10 10
10-4 5 0 15 0 15/15 100
10-5 5 0 10 0 10/10 100
E-10 10-6 3 2 5 2 5/7 71
0.46 10-6.5
10-7 1 4 2 6 2/8 25
10-8 1 4 1 10 1/11 9
En el cuadro Nº04 se observa según el método de Reed y Muench que, en
la vacuna N-01 el título se halla entre las diluciones 10-6 y 10-7, entre ellas
55
la DP es 0.88 (DP= % infectados por encima del 50% - 50% / % infectados
por encima del 50% - % infectados por debajo del 50%), obteniendo como
resultado un título de 10-6.9 (se suman los decimales obtenidos de la DP
entre las diluciones en las que se hallaría el 50%); en la vacuna N-02 el
título se halla entre las diluciones 10-3 y 10-4, la DP es 0.26, obteniendo
como título 10-3.3; en la vacuna E-01 el título se halla entre las diluciones
10-6 y 10-7, la DP es 0.68, obteniendo como título 10-6.7; en la vacuna E-02
el título se halla entre las diluciones 10-6 y 10-7, la DP es 0.32, obteniendo
10-5 y 10-6, la DP es 0.7, obteniendo como título 10-5.7; en la vacuna E-10 el
título se halla entre las diluciones 10-6 y 10-7, la DP es 0.46, obteniendo
como título 10-6.5.
56
Cuadro Nº06. Comparación entre el título obtenido y el que figura en el frasco.
Vacuna Título del frasco Título obtenido

10-7
N-01 10-6.9
No figura
N-02 10-3.3
10-6
E-01 10-6.7
>10-7.2
E-02 10-6.3
≥10-6.2
E-03 10-6.4
≥10-6.5
E-04 10-6.3
≥10-5.5
E-05 10-5.2
≥10-5.5
E-06 10-5.2
10-6.2
E-07 10-5.4
No figura
E-08 10-5.4
≥10-5.5
E-09 10-5.7
≥10-6.4
E-10 10-6.5
En el cuadro Nº05 se observa que cuatro de las vacunas (E-02, E-04, E-05
y E-06) cumplen con el título que figura en su respectivo frasco, seis de las
vacunas muestreadas (N-01, E-01, E-03, E-07, E-09 y E-10) no cumplen
con el título que figura en su frasco, y dos vacunas (N-02 y E-08) no
indican el título en el frasco por lo que no es posible su comparación y
control.
Cuadro Nº07. Resultados de cumplimiento de título que figura en el frasco de la vacuna.
Resultado Frecuencia Porcentaje
Cumple con el título indicado 4 33%
57
No cumple con el título indicado 6 50%
Título no figura 2 17%
En el cuadro Nº06 se observa que sólo el 33% de las vacunas muestreadas
cumplen con el título que figura en el frasco, el 50% de las vacunas
muestreadas no cumple con el título que indica el frasco, y en el 17% de
las vacunas muestreadas no figura el título de la vacuna. Con los datos
previos se obtiene el siguiente gráfico.
Gráfico Nº02. Porcentaje de vacunas que cumplen el título indicado en el frasco.
58
V. CONCLUSIONES
1. Todas las vacunas muestreadas aprobaron satisfactoriamente el análisis
Físico-cualitativo al que fueron sometidas.
2. En la prueba de Esterilidad, las 12 vacunas, que representan el 100% de las
muestras analizadas, no presentaron ningún signo de contaminación al no
existir crecimiento microbiológico (bacterias u hongos) en ninguno de los
medios y caldos en los que fueron sembradas.
3. En la Titulación de Virus, 6 vacunas, que representan el 50% de las
muestras, no cumplieron con el título indicado por el propio fabricante,
siendo la diferencia con esa misma muy pequeña aún así no cumplen lo que
figura en el frasco, pudiendo deberse esta diferencia a la falta de cuidado
debido a que no existe un control de calidad obligatorio de cada lote por las
entidades del estado. Sólo 4 vacunas, representando el 33% de las muestras
tituladas, cumplieron el título indicado en su etiqueta; y 2 vacunas,
representando el 17% de las muestras, no presentaba el título de la vacuna
en el frasco, imposibilitando así el control de calidad del título del virus.
59
VI. RECOMENDACIONES
1. Se sugiere realizar controles de calidad a cada lote de cada empresa de las
vacunas contra esta y otras enfermedades aviares.
2. Complementar estas pruebas con otras pruebas de control de calidad, tales
como inocuidad, pureza o potencia.
3. Realizar pruebas de las vacunas en las aves de corral para probar la
efectividad y respuesta a la vacuna.
4. Se sugiere que todos los laboratorios tengan como norma indicar el título
de la vacuna en el frasco.
60
VII. BIBLIOGRAFIA
7.1.Principal
1. Blood, D.C. y Radostis, O.M. Medicina Veterinaria. Editorial
Interamericana McGraw-Hill. 8va Edición. España. 1996.
2. Mendo Rubio, Manuel. Lecciones de Microbiología y Medios de
Cultivo. Manual de Laboratorio. Ediciones Laborales S.R.L. Lima,
Perú. 1995.
3. MERCK. Manual de Medicina Veterinaria.Editorial Océano. Segunda
edición. 2004.
4. OIE. Control of infectious Animal Diseases by Vaccination. Buenos
Aires, Argentina. 2004.
5. OIE. Manual de la OIE sobre Animales Terrestres 2004. Buenos Aires,
Argentina. 2004.
6. OIE. Manual de las pruebas de diagnóstico y de las vacunas para los
animales terrestres (mamíferos, aves y abejas). Quinta edición.
Volumen I. Paris, Francia. 2004.
7. Ocadiz G., Javier. Epidemiología en Animales domésticos. Editorial
Trillas. México. 1998.
8. Shortridge K.F., Allan W. H., Alexander D. J. Newcastle Disease
Laboratory Diagnosis and Vaccine Evaluation. Hong Kong University
Press. Hong Kong, China. 1982.
61
7.2.Internet
a. Eficiencia en vacunas contra Newcastle. Descargado el 02/09/2006.
http://encolombia.com/veterinaria/fenavi9102sanidad.htm
b. Estrategia de inmunización contra la enfermedad de Newcastle.
Descargado el 27/11/2006.
http://www.iia.cu/pdf/v27_89.pdf
c. Norma Oficial Mexicana NOM-052-ZOO-1995, Requisitos
mínimos para las vacunas empleadas en la prevención y control de
la enfermedad de Newcastle. Descargado el 26/11/2006.
http://www.ipfsaph.org/cds_upload/kopool_data/FAOLEX_0/es_mex17
848.doc
d. Vacunación Segura y Eventos Adversos. Descargado el 03/07/2008.
http://www.buenosaires.gov.ar/areas/salud/a_primaria/programas/inmu
nizacion/archivos/man_eventos_adversos.pdf
e. Requisitos mínimos para las vacunas empleadas en la prevención y
control de la enfermedad de Newcastle. Descargado el 26/08/2008.
http://www.sagarpa.gob.mx/ganaderia/NOM/052zoo.pdf
f. Validación de la prueba de esterilidad para vacunas virales
preparadas en vehículos oleoso y acuoso. Descargado el 21/09/2008.
http://www.saber.ula.ve/db/ssaber/Edocs/pubelectronicas/revistafarmaci
a/vol45/cortes_a.pdf
62
63
GLOSARIO DE ABREVIATURAS
APMV : Paramixovirus aviar.
BHI : Caldo infusión cerebro corazón.
EID : Enfermedad infecciosa emergente.
EN : Enfermedad de Newcastle.
HA : Hemaglutinación.
HAU : Unidad de hemaglutinación.
HI : Inhibición de la hemaglutinación.
ICPI : Índice de patogenicidad intracerebral.
IVPI : Índice de patogenicidad intravenosa.
F0 : Precursor de la proteína viral de fusión.
LD : Dosis letal.
MAb : Anticuerpo monoclonal.
PBS : Solución tampón de fosfato salino.
PD : Dosis protectora.
RBC : Eritrocitos.
SENASA : Servicio Nacional de Sanidad Agraria.
SPF : Sin patógenos específicos.
TSA : Agar Tripticasa de Soya.
64
RECOPILACIÓN DE DATOS PARA LA TITULACIÓN DE VIRUS
Cuadro Nº08. Cantidad de embriones muertos tras inoculación de la vacuna N-01.
Vacuna: N-01
Dilución Días post-inoculación (# muertos)
de la Total
1 2 3 4 5 6 7
vacuna
10-5 1 - - - 4 - - 5
10-6 - - - - 5 - - 5
10-7 - - - - 1 - - 1
10-8 - - - - - - - 0
10-9 2 - - - - - - 2
Total 3 0 0 0 10 0 0 13
Cuadro Nº09. Cantidad de embriones muertos tras inoculación de la vacuna N-02.
Vacuna: N-02
de la Total
1 2 3 4 5 6 7
vacuna
10-3 1 - - - - - - 1
10-4 1 - - - - - - 1
10-5 - - - - 1 - - 1
10-6 1 1 - - - - - 2
10-7 - - - - - - - 0
Total 3 1 0 0 1 0 0 5
65
Cuadro Nº10. Cantidad de embriones muertos tras inoculación de la vacuna E-01.
Vacuna: E-01
de la Total
1 2 3 4 5 6 7
vacuna
10-3 - - - - 2 2 1 5
10-4 - - - - 3 1 1 5
-5
10 - - - - 2 - 2 4
-6
10 - - - - 2 - - 2
-7
10 - - - - - - - 0
Total 0 0 0 0 9 3 4 16
Vacuna: E-02
de la Total
1 2 3 4 5 6 7
vacuna
10-4 - - - - 3 1 1 5
10-5 - 1 - - 1 2 1 5
10-6 - - - - 3 - - 3
10-7 - 1 - - - - - 1
10-8 - - - - - - - 0
Total 0 2 0 0 7 3 2 14
66
Vacuna: E-03
de la Total
1 2 3 4 5 6 7
vacuna
10-4 - - - - 3 - 2 5
10-5 1 - - - 1 2 1 5
-6
10 - - - - 3 1 - 4
-7
10 - - - - - - - 0
-8
10 - - - - - - - 0
Total 1 0 0 0 7 3 3 14
Vacuna: E-04
de la Total
1 2 3 4 5 6 7
vacuna
10-4 - - - - 2 2 1 5
10-5 1 - - - 2 1 1 5
10-6 2 - - - - 1 - 3
10-7 - - - - 1 - - 1
10-8 - - - - - - - 0
Total 3 0 0 0 5 4 2 14
67
Vacuna: E-05
de la Total
1 2 3 4 5 6 7
vacuna
10-3 - - - - 1 3 1 5
10-4 - - - - 2 1 2 5
-5
10 - - - - 1 1 1 3
-6
10 - - - - - - - 0
-7
10 - - - - - - - 0
Total 0 0 0 0 4 5 4 13
Vacuna: E-06
de la Total
1 2 3 4 5 6 7
vacuna
10-3 - - - - 3 1 1 5
10-4 - - - - 1 2 2 5
10-5 - - - - 1 - 2 3
10-6 - - - - - - - 0
10-7 - - - - - - - 0
Total 0 0 0 0 5 3 5 13
68
Vacuna: E-07
de la Total
1 2 3 4 5 6 7
vacuna
10-4 - - - - - 1 2 3
10-5 - - - - 1 2 - 3
-6
10 - - - - 2 1 - 3
-7
10 - - - - - - - 0
-8
10 - - - - - - - 0
Total 0 0 0 0 3 4 2 9
Vacuna: E-08
de la Total
1 2 3 4 5 6 7
vacuna
10-3 - - - - 2 1 2 5
10-4 - - - - 2 2 1 5
10-5 - - - - - 4 - 4
10-6 - - - - - - - 0
10-7 - - - - - - - 0
Total 0 0 0 0 4 7 3 14
69
Vacuna: E-09
de la Total
1 2 3 4 5 6 7
vacuna
10-3 - - - - 1 3 1 5
10-4 - - - - 2 2 - 4
-5
10 - - - - 2 2 - 4
-6
10 - - - - 2 - - 2
-7
10 - - - - 1 - - 1
Total 0 0 0 0 8 7 1 16
Vacuna: E-10
de la Total
1 2 3 4 5 6 7
vacuna
10-4 - - - - 1 - 4 5
10-5 - - - - 3 2 - 5
10-6 - - - - 1 - 2 3
10-7 - - - - 1 - - 1
10-8 - - - - - - 1 1
Total 0 0 0 0 6 2 7 15
70
FOTOS
Foto Nº01. Cabina de Bioseguridad
71
Foto Nº02. Material listo para empezar la prueba de Esterilidad
72
Foto Nº03. Estufa de medios de 36ºC
73
Foto Nº04. Estufa de medios de 23ºC
74
Foto Nº05. Sembrando vacunas en los medios de cultivo.
75
Foto Nº06. Caldos de cultivo después de haber sembrado las vacunas.
76
Foto Nº07. Incubadora a 37.5ºC
77
Foto Nº08. Huevos SPF con el punto de inoculación señalado.
78
Foto Nº09. Perforando los huevos en el punto de inoculación.
79
Foto Nº10. Inoculando las diluciones de la vacuna en los huevos SPF.
80

Control de Calidad de Vacunas Monovalentes, Vivas, Nacionales y Extranjeras, Contra La Enfermedad de Newcastle, Mediante Pruebas de Esterilidad y Titulación de Virus

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Control de Calidad de Vacunas Monovalentes, Vivas, Nacionales y Extranjeras, Contra La Enfermedad de Newcastle, Mediante Pruebas de Esterilidad y Titulación de Virus

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I.

1.1. Enunciado del problema

Control de calidad de vacunas monovalentes, vivas, nacionales y

extranjeras, contra la enfermedad de Newcastle, mediante pruebas de

esterilidad y titulación de virus.

1.2. Descripción del problema

No tenemos una evaluación constante de la calidad, no sólo libre de

patógenos sino su capacidad inmunogénica, por lo que no podemos estar

completamente seguros de que las empresas productoras de las vacunas

sigan cumpliendo con las normas de calidad y lo que indica su etiqueta en

cada lote que producen.

1.3. Justificación del trabajo

1.3.1. Aspecto General

La EN, como otras enfermedades de las aves, en nuestro país

constituye riesgo de presentación similar a una bomba de tiempo

para la avicultura comercial, la que puede explotar en cualquier

momento y afectar a los productores avícolas, si no se tomaran las

medidas preventivas adecuadas para contrarrestar dicha posibilidad.

con esta enfermedad, por tal razón se han implementado agresivos

programas de vacunación los que han ayudado a disminuir

considerablemente estos brotes.

1.3.2. Aspecto Tecnológico

El uso de pruebas de esterilidad y titulación en vacunas contra la EN

son técnicas altamente confiables para controlar la calidad y

asegurar que un producto contiene la cantidad de antígeno

establecido en la orden de producción.

1.3.3. Aspecto Social

Teniendo en conocimiento la calidad de las vacunas, mediante las

pruebas de esterilidad y títulos antigénicos, permitiéndose tomar

medidas para modificar el programa de vacunación de ser necesario,

obteniéndose una inmunización más eficaz, se está beneficiando a

los productores avícolas, reduciendo probablemente los índices de

mortalidad en las aves, disminuyendo un poco su preocupación,

obteniendo una mejor calidad de vida.

1.3.4. Aspecto Económico

La manifestación clínica de esta enfermedad tiene un importante

impacto económico, no sólo por el incremento en la mortalidad, la

conversión alimenticia o el aumento en el número de aves retrasadas,

comprometen la viabilidad económica, no sólo de una empresa sino

de toda una región y de un país.

La importancia del presente trabajo radica en el conocimiento de la

calidad para verificar que un producto está libre de microorganismos

viables contaminantes y el reconocimiento de la cantidad de

partículas virales presentes en la vacuna.

1.4.1. Objetivo General

Determinar mediante pruebas de esterilidad y titulación la calidad de

las vacunas monovalentes, vivas, contra la EN.

1.4.2. Objetivos específicos

Mediante la prueba de esterilidad, constatar que las vacunas se hallan

libres de contaminantes bacterianos y fúngicos.

Mediante la titulación, asegurar que las vacunas contienen la

cantidad de antígeno establecido en la orden de producción.

1.5. Planteamiento de la hipótesis

Dado que las vacunas de uso avícola contra la enfermedad de Newcastle

contienen antígenos inmunogénicos, es probable probar su calidad.

Las cepas del virus de Newcastle varían ampliamente en cuanto a la

severidad de la enfermedad que pueden provocar en las aves. Las cepas

menos patógenas pueden inducir una enfermedad grave si se exacerban por

la presencia de otros organismos o mediante condiciones ambientales

adversas. El método preferido de diagnóstico es el aislamiento del virus y

de la EN es su enorme variación respecto a la patogenicidad para los

pollos. Las cepas del virus de la EN se agrupan en cinco patotipos sobre la

1. Velogénico viscerotrópico: es muy patogénica en la que se observan