Ecole Suprieure des Sciences et Techniques de Tunis

Dpartement de Physique et de Chimie

PFE n05/10 PROJET DE FIN DETUDES Matrise : 2MST PA LE CENTRE TECHNIQUE DE LAGROALIMENTAIRE ET SON ROLE DANS LA QUALITE DES PRODUITS ALIMENTAIRES Les corps gras alimentaires Caractrisation des matires grasses

Sujet :

Ralis par : MGAIDIA Wafa OUERHANI Amira Encadr par : Mr .MATHLOUTHI Hamadi Mr. RAZGALLAH Lazhar Soutenu le :

Composition du Jury :

Anne Universitaire : 2009 / 2010

5, Avenue Taha Hussein Tunis B. P. 56, Bab Menara 1008

Tel. : 71. 496. 066 : Fax : 71 . 391. 166:

5 1008 . . : 65

Ddicaces
Avec lexpression de ma reconnaissance, je ddie ce modeste travail ceux qui, quels que soient les termes embrasss, je narriverais jamais leur exprimer mon amour sincre.

A lhomme, mon prcieux offre du dieu, qui doit ma vie, ma russite et tout mon respect : mon cher pre Mohammed. A la femme qui a souffert sans me laisser souffrir, qui na jamais dit non mes exigences et qui na pargn aucun effort pour me rendre heureuse : mon adorable mre Halima. A ma chre sur Faten et mon fianc Chawqui qui nont pas cesse de me conseiller, encourager et soutenir tout au long de mes tudes. Que Dieu les protge et leurs offre la chance et le bonheur. A mon adorable petite sur Olfa qui sait toujours comment procurer la joie et le bonheur pour toute la famille. A mes grands-mres, mes oncles et mes tantes. Que Dieu leur donne une longue et joyeuse vie. A tous les cousins, les voisins et les amis que jai connu jusqu maintenant. Merci pour leurs amours et leurs encouragements. Sans oublier mon binme Amira pour son soutien moral, sa patience et sa comprhension tout au long de ce projet.

WAFA

Ddicaces
Ce travail est tant attendu par ma famille et mes proches pour couronner mes tudes. Je tends ddier ce modeste projet de fin dtudes : A mes trop chers parents qui mont bien appris lalphabet de la vie A ma raison dtre Lla ma seule source de joie, de volont et de courage. Que Dieu la protge et la fait jouir dune bonne sant pour sa prire et sa supplication A mon cher pre Mustapha que jaime bien en exprimant ma fiert pour ses nombreux sacrifices, ses prcieuses directives, sa patience et son amour qui en font sa grandeur et pour tout ce quil ma donn et quil my est impossible de le lui rendre A ma chre mre Aziza que jaime bien en rendre grce ses conseils pertinents, ses innombrables efforts, son affection, sa tendresse et son amour quelle na pas cess de me lexprimer. A mes deux chers surs Imen et Marwa pour leurs soutiens inestimables A mes chers oncles Ahmed Hafedh, Mohamed Habib et Mohamed Tawfik pour leurs encouragements, leurs rconforts et leurs supports pertinents. Que Dieu les prservent tous de tout mal et leurs rserve la vie laquelle ils rvent A mes chers neveux Jade et Lina qui font le printemps de ma vie. A ma chre et aimable amie Doussa pour son amour cordial et son appui moral. Cest la bont elle-mme, cest lamiti au vrai sens du mot. Elle restera ternellement grave dans ma mmoire. Que Dieu lui fait gouter tout le bonheur du monde et lui offre le paradis. A mes chers amies Wafa, Safa, Hanen , que jadore de tout mon cur car elles sont la hauteur du mot Amiti et elles ont partag avec moi aussi bien les pires moments que les meilleurs A tous ceux qui me sont chers, je dis : je vous aime de tout mon cur pour la vie. Vous tes comme une fleur dans mon cur. A tous : un grand Merci.

AMIRA

Remerciement
Nous tenons tout dabord exprimer nos sincres reconnaissances envers nos
encadreurs : Monsieur. Hamadi MATHLOUTHI ; professeur de physique lcole suprieure des sciences et techniques de Tunis et Monsieur . Lazhar RAZGALLAH, directeur au centre technique dagroalimentaire, qui ont dirig le prsent travail. La richesse de leurs renseignements et leurs expriences nous ont longues t dune grande utilit pour mener terme nos

connaissances de ce travail dans ces mois.

Aussi, nous adressons tous nos remerciements galement toute lquipe du

laboratoire du CTAA (Centre Technique dAgro-alimentaires) qui nous a supports tout au long de ltude exprimentale. Nos remerciements vont galement chaque personne qui nous a donn laide, le soutien et la formation assure lors de la ralisation de ce projet.

Mes respectueux remerciements sadressent galement la direction de notre

cole ESSTT qui nous a offert loccasion et la chance deffectuer notre P.F.E dans des conditions favorables. Nous tenons compte remercier tous nos enseignants.

Que les membres du Jury trouvent aussi nos hautes considrations pour avoir
accepter dvaluer notre travail malgr leurs agendas chargs en cette fin danne universitaire.

Sommaire
Chap. 1 : Prsentation du Centre Technique Agro-alimentaire (CTAA)...11

1. 2. 3. 4. 5. 1. 2.
2.1. 2.2. 2.3. 2.4.

Introduction .............................................................................................. 11 Statut ......................................................................................................... 11 Missions et Activit du CTAA .................................................................11 Les Laboratoires du CTAA ...................................................................... 12 CTAA et Secteur des Industries Alimentaires .......................................... 13 Principe ..................................................................................................... 14 Schma dappareillage.............................................................................. 15
Le four (type chaleur tournante).... 15 Le systme d'injection 16 La colonne (capillaire ou remplie) 19 Le systme de dtection...21

Chap. 2 : Chromatographie en phase gazeuse (CPG).14

2.5. Le systme de dtendeur-rgulateur pour les gaz utiliss (hlium, hydrogne, azote et air comprim)... 23

3.
3.1. 3.2.

Nature des Phases ..................................................................................... 24

Phase mobile... 24 Phases stationnaires 24

4.
Chap. 3 :

Principe de fonctionnement ...................................................................... 24

Les tapes de la Caractrisation de la matire grasse par CPG..27

1.
1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6.

Extraction de la matire grasse en vue de sa caractrisation .................... 27

Domaine dapplication 27 Dfinition 27 Principe 28 Ractifs 28 Appareillage 28 Mode opratoire.. 29

2.
2.1. 2.2.

Prparation des esters mthyliques dacides gras ..................................... 32

Objectifs.. 32 Mthodes de remplacement (applicable aux corps gras neutres. 32

3.
3.1. 3.2. 3.3. 3.4.

Analyse par CPG des esters mthyliques dAG ....................................... 34

Ractifs 34 Appareillage 35 Mode Opratoire. 37 Expressions des rsultats. 39
6

Chap. 4 : Rsultats d'analyses de la MG de certains produits alimentaires ..41

1. Dtermination des acides Gras isomres : Analyser par CPG sur colonne capillaire ............................................................................................................ 41
1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. Objet et champ d'application... 41 Principe... 41 Objectif de l'essai 41 Appareillage 41 Ractifs et matriel.. 42 Mode opratoire...43

2. Analyse chromatographique des esters mthyliques d'acides gras du beurre (CPG) ..................................................................................................... 47
2.1. 2.2. 2.3. 2.4. Prparation de la matire grasse.. 47 Prparation des esters mthyliques. 47 Etude par CPG 47 Analyse des rsultats... 48

3. Dtermination de la MG laitire de produits laitiers enrichis en AG omga-3 et omga-6 par chromatographie gaz liquide ..................................... 49
3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. Principe.... 49 Ractifs 50 Appareillage 50 Prparation de lchantillon 51 Mode Opratoire. 52

Liste des figures

Figure 1 : Laboratoires du CTAA ......................................................................... 12 Figure 2 : lappareil CPG..................................................................................... 14 Figure 3 : schma d'appareillage ......................................................................... 15 Figure 4 : Vannes d'injection ................................................................................ 16 Figure 5 : Chambre d'injection ............................................................................. 17 Figure 6 : Injecteur vaporisation directe ........................................................... 18 Figure 7 : Injecteur avec systme de fuite ............................................................ 19 Figure 8 : grains sphriques ................................................................................. 20 Figure 9 : Montage des thermistances .................................................................. 22 Figure 10 : Dtecteur ionisation de flamme ...................................................... 23 Figure 11 : Systme de dtecteur-rgulateur ........................................................ 24 Figure 12 : Exemple de chromatogramme (obtenu par CPG) ............................. 26 Figure 13 : Chromatogramme-type relatif la dtermination des acides gras trans, effectue sur colonne capillaire .................................................................. 46 Figure 14 : Chromatographie de drivs d'acides gras de la matire grasse du beurre. ................................................................................................................... 48 Figure 15 : chromatogramme gaz-liquide dEMAG avec agrandissement de la zone dlution des pics -3 et -6 et ALC obtenu dans les conditions isothermes ............................................................................................................................... 53

Liste des Tableaux

Tableau 1 : Branches d'activit..............................................................................13 Tableau 2 : Diffrents types de dtecteurs .............................................................21 Tableau 3 : Exemple de rapport d'essai .................................................................40 Tableau 4 : Composition obtenue du beurre..........................................................48 Tableau 5: conditions applicables pour une sparation correcte des EMAG w- 351

Introduction Gnrale
Notre projet de fin dtudes a port sur une filire importante du secteur agroalimentaire, savoir les matires grasses (MG). Nous nous sommes intresss leurs caractrisations et dterminer par consquent les diffrentes gammes de matires grasses. On distingue deux grandes catgories de matires grasses, savoir: Les matires grasses animales (par ex. le beurre, la crme) Les matires grasses vgtales (par ex. les huiles et les margarines) Ces matires grasses, peuvent tre dites visibles lorsqu'elles sont ajoutes l'aliment, ou encore tre dites caches ou invisibles pour celles dj contenues dans l'aliment (viande, charcuterie, fromage...), et surtout celles contenues dans les produits transforms par l'industrie alimentaire. Les matires grasses sont des lipides qui sont eux-mmes composs de diffrents acides gras classs en 3 groupes : Les acides gras saturs (AGS) sont surtout prsents dans les produits dorigine animal (gras de viande, charcuterie, jaune duf) ; Les acides gras mono-insaturs (AGMI) sont plutt dorigine vgtale et sont neutres pour lorganisme. Les acides gras polyinsaturs (AGPI) appels encore Acides Gras Essentiels, notre organisme ne peut pas les synthtiser et ne peut se les procurer que par lalimentation, ils peuvent tre dorigine vgtale ou animale. Pour tout cela, il savre indispensable de caractriser les matires grasses et connaitre les acides quils les composent. Pour se faire, notre PFE va renfermer deux parties, savoir : Une tude thorique, elle comprend deux chapitres: la prsentation du centre technique de lagroalimentaire (CTAA) la technique de Chromatographie en phase gazeuse.
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Introduction gnrale

Une tude pratique, elle renferme deux chapitres: les tapes ou les mthodes de caractrisation de la matire Grasse ; les rsultats danalyse effectus sur deux produits alimentaires : le lait et le Beurre

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Chap. 1 : Prsentation du Centre Technique Agro-alimentaire (CTAA)

1. Introduction
Premier et unique centre technique agroalimentaire tunisien, le CTAA dveloppe des expertises pertinentes et vient pour soutenir ses clients dans la dynamique de restructuration, de comptitivit, dintgration et de croissance de leurs entreprises dans le contexte actuel de libre change. Son objectif est daccompagner les entreprises agro alimentaires pour consolider davantage leurs acquis et faire face aux nouveaux enjeux commerciaux et rglementaires du march local et des marchs extrieurs.

2. Statut
Le Centre Technique dAgro-alimentaire (CTAA) est un organisme technique au service des professionnels de lagro-alimentaire. Il a t cre par arrt du ministre de lindustrie du 29 fvrier 1996, conformment la loi n 94-123 du 28 novembre 1994, relative aux centres techniques dans les secteurs industriels Il est sous tutelle du Ministre de lIndustrie et de la technologie ; et a pour mission lassistance technique aux industriels du secteur des industries agro-alimentaires.

3. Missions et Activit du CTAA

Les principales missions du CTAA sont : 1. Collecte et diffusion de l'information technique, industrielle 2. Assistance aux industriels pour la modernisation des mthodes de production 3. technologique et la matrise de la qualit 4. Coordination avec les centres spcialiss dans les actions de formation professionnelles 5. Elaboration de toute tude et prospection pour le dveloppement et la promotion des exportations
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Chap. 1 : Prsentation du Centre Technique Agro-alimentaire (CTAA)

6. Ralisation d'expertises et analyses confies par les professionnels ou les tribunaux 7. Aide aux entreprises pour l'amlioration de l'utilisation de leur potentiel technique et humain en production, dveloppement de nouveaux produits et tablissement de programmes d'investissement 8. Cration de laboratoires d'analyses et d'essais 9. Collaboration et coordination avec des organismes de recherche et les autres centres techniques pour l'amlioration de la qualit, de l'emballage et pour l'optimalisation des procds de fabrication 10. Promotion des innovations

4. Les Laboratoires du CTAA

Le CTAA a install un ensemble de laboratoires modernes, lui permettant doffrir une gamme assez complte d : Analyses micro biologiques Analyses physico-chimiques Analyses sensorielles

Figure 1 : Laboratoires du CTAA

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Chap. 1 : Prsentation du Centre Technique Agro-alimentaire (CTAA)

5. CTAA et Secteur des Industries Alimentaires

Le secteur des industries alimentaires occupe une place de choix dans les orientations politiques du pays. Lindustrie agro-alimentaire en Tunisie compte environ 5 100 units de transformation et de production en grande majorit de petites et moyennes entreprises (prs de 77 % sont des boulangeries et des huileries). Le secteur des Industries Agroalimentaires est caractris par des filires et branches dactivits trs varies et des entreprises de petites tailles, il compte 924 entreprises industrielles employant 10 personnes et plus . Parmi elles, 116 produisent totalement pour lexportation. [1] Branche dactivit

Entreprises T.E

Entreprises N.T.E

Total

Crales et drivs Huiles et corps gras Industries lgumes Entreposage frigorifique des F&L Lait et drivs Sucres et drivs Boissons Viandes Poissons Industries diverses des fruits et

6 11 8

288 240 51

294 251 59

38

69

107

39 2 3 28 45 22 36 16 29 56

39 30 48 22 65 72 Source : API

Tableau 1 : Branches d'activit T.E : Totalement Exportatrice N.T.E : Non Totalement Exportatrice API : Agence de Promotion de lIndustrie

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Chap. 2 : Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

1. Principe
La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est comme toutes les techniques de chromatographie, une technique qui permet de sparer des molcules d'un mlange ventuellement trs complexe de nature trs diverses. Elle s'applique principalement aux composs gazeux ou susceptibles d'tre vaporiss par chauffage sans dcomposition. Elle est de plus en plus utilise dans les principaux domaines de la chimie. Le mlange analyser est vaporis l'entre d'une colonne, qui renferme une substance active solide ou liquide appele phase stationnaire, puis il est transport travers celleci l'aide d'un gaz porteur (ou gaz vecteur). Les diffrentes molcules du mlange vont se sparer et sortir de la colonne les unes aprs les autres aprs un certain laps de temps qui est fonction de l'affinit de la phase stationnaire avec ces molcules.

Figure 2 : lappareil CPG

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Chap. 2 : Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

2. Schma dappareillage

Figure 3 : schma d'appareillage Les appareils de chromatographie gazeuse sont appels chromatographes. Ils sont principalement composs de: 2.1. Le four (type chaleur tournante) Les colonnes sont places dans des enceintes chauffes appeles four bain dair, quip de rsistances chauffantes et dun systme de ventilation( systme de refroidissement rapide) et de brassage pour lhomognisation de la temprature, il permet une programmation de temprature ;Cette rgulation est assure par un thermocouple, grce auquel la variation nexcde pas 0,2C, pour un intervalle de fonctionnement dbullition. La temprature du four peut-tre : stable et identique du dbut la fin de la manipulation (= conditions isothermes) programme par palier successif (= en gradients) Au lieu de maintenir la temprature constante dans lenceinte, on peut lastreindre suivre une loi de variation donne, gnralement linaire, pour obtenir allant de 20 C (-100 C pour certains systmes) 450 C .Sa

temprature est en gnral de 20C infrieure celle du solut de plus bas point

une chromatographie temprature programme. Un chromatographe comporte

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Chap. 2 : Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

souvent une enceinte pour assurer la rgulation de la temprature de linjecteur, et quelquefois une autre pour contenir le dtecteur, surtout lorsquil sagit dun catharomtre. 2.2. Le systme d'injection Il permet : lintroduction de lchantillon, son vaporation et son entranement par le gaz vecteur vers la colonne : un volume prcis est inject dans linjecteur qui va vaporiser le liquide et permettre le transfert de lchantillon vaporis vers la colonne de chromatographie. Cette injection est faite dans un tube chauff. Le gaz vecteur arrive par lune des extrmits du tube et entrane les soluts vaporiss vers la colonne raccorde lautre extrmit c'est--dire il sert rendre volatil l'chantillon analyser. Deux systmes sont essentiellement utiliss: les vannes dinjection et le systme utilisant une seringue : i. Vannes dinjection

Ce sont des systmes de robinets voies multiples qui permettent, par un simple mouvement de rotation, de faire passer un chantillon de gaz, partir dun circuit parallle, dans le circuit gazeux du chromatographe. Le volume de la boucle dchantillonnage est de quelques centimtres cubes environ. Ce systme est trs utilis en HPLC.

Figure 4 : Vannes d'injection

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Chap. 2 : Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

ii.

Chambre dinjection pour liquides ou solutions

Cest le systme le plus utilis. La figure ci-contre le dcrit dans son principe essentiel: le gaz porteur, de prfrence prchauff, entre dans une chambre chauffe, obture par une pastille dlastomre, le septum, qui assure ltanchit. laide dune seringue hypodermique de petite capacit, on pique au travers du septum, de telle manire que lextrmit de laiguille arrive au-dessous du niveau de larrive du gaz porteur, puis on pousse le piston pour raliser linjection.

Figure 5 : Chambre d'injection Il faut que la chambre dinjection ait un volume aussi petit que possible, pour limiter les volumes morts du chromatographe. Pour assurer la vaporisation instantane de lchantillon, linjecteur est habituellement maintenu une temprature denviron 20C suprieure celle du solut de plus haut point dbullition. Le septum doit tre capable de supporter cette temprature. Si lon observe des baisses de pression dans le circuit gazeux, cela indique souvent quil faut changer le septum, us par les multiples injections.
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Chap. 2 : Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

Injecteur vaporisation directe

Figure 6 : Injecteur vaporisation directe Pour les colonnes remplies et les colonnes capillaires de gros diamtre. Tout lchantillon introduit par la seringue est entirement entran dans la colonne Pour les colonnes capillaires faible dbit, les quantits de composs dans la colonne doivent tre trs petites pour viter la saturation des colonnes. Les volumes injects doivent tre trs faibles (saturation mme pour des v
injects

= 0,1L). Or les volumes

injects ne peuvent tre infrieurs 0,1 L et lutilisation de solutions trs dilues entrane des perturbations dues lexcs de vapeur de solvant. Il existe donc diffrents injecteurs permettant de rsoudre ce problme : Injecteur avec systme de fuite Une grande partie de lchantillon inject, vaporis et mlang au gaz vecteur est limine de linjecteur par une vanne de fuite. Ainsi, une petite fraction du mlange pntre dans la colonne. Il existe deux modes selon que lon injecte vanne de fuite ouverte (mode split) ou vanne ferme pendant environ 1 minute aprs linjection (mode splitless)

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Chap. 2 : Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

Figure 7 : Injecteur avec systme de fuite Injecteur temprature programmable (PTV) Le mlange est introduit liquide dans linjecteur froid puis linjecteur est chauff en mode split ou splitless pour vaporiser les composs Injection froid dans la colonne

Le mlange est inject directement froid et liquide dans la colonne 2.3. La colonne (capillaire ou remplie) Sur laquelle les diffrentes molcules de l'chantillon inject vont se sparer suivant leurs affinits avec la phase stationnaire; Elles se prsentent sous forme de tubes fins enrouls ; Il existe deux types de colonnes : Les colonnes remplies Ce sont des colonnes remplissage proprement dit, constitues dune tubulure en verre, acier ou autre mtal (les plus frquentes sont en acier inoxydables), dont les dimensions varient de 2 6 mm pour le diamtre intrieur et de 1 10 m pour la longueur. Elles sont remplies dun support poreux et inerte sous forme de grains sphriques (denviron 0,2 mm de diamtre) sur lequel est imprgne la phase stationnaire.
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Chap. 2 : Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

Figure 8 : grains sphriques

Les colonnes capillaires ( tube ouvert) formes dun tube de mtal, de verre, de silice fondue ou de quartz, dont le diamtre intrieur est de lordre de 0,2 0,5 mm et la longueur de 50 100 m, Ladsorbant y est fix sous forme dune fine couche colle la paroi du tube, ou bien la phase stationnaire est directement dpose sur la paroi interne de la colonne(film mince de 0,05 5 m.), sans support, sur cette mme paroi. Dans tous les cas, ces colonnes comportent un canal central largement ouvert, offrant peu de pertes de charge la progression du gaz porteur. Silice fondue revtement extrieur phase stationnaire

Remarque Avant sa premire utilisation : il faut la dbarrasser des traces de solvant et des produits volatils quelle peut contenir en la maintenant au moins 12 h au voisinage de sa temprature limite dutilisation sans brancher le dtecteur pour viter son encrassement (maturation) Aprs une longue priode dutilisation : remettre la colonne maturation pendant 2h. Une colonne doit toujours tre parcourue par le gaz vecteur

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Chap. 2 : Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

2.4. Le systme de dtection Il va permettre de mesurer le signal mis par les diffrentes molcules et de pouvoir les identifier. Pour l'enregistrement du signal mis par le dtecteur, des logiciels sur PC remplacent avantageusement les enregistreurs analogiques sur papier. Il existe diffrents types de dtecteurs comme le montre le tableau ci-dessous : DETECTEUR Gaz vecteur Catharomtre H2/He He/N2 N2 N2 N2/H2 105 107 104 104 103 1 10 ng Linarit QMD Slectivit (spcificit) NS Tous composs FID Capture de20 100 pg NS Composs organiques 0,1 pg S Composs halogns Thermoionique Photomtrie de flamme P :1 pg / N :10 pg P : 10 pg S : 1 ng S S Composs avec N ou P Composs avec S ou P Applications

Tableau 2 : Diffrents types de dtecteurs Pratiquement toute proprit physique, et quelquefois chimique, des soluts peut servir constituer un systme de dtection. Nous nen citerons que trois types: le Catharomtre, le dtecteur ionisation de flamme (FID) et celui capture dlectrons. Catharomtre Cest un appareil simple et robuste, rponse universelle, mais relativement peu sensible. Il est fond sur une comparaison continuelle entre le flux de chaleur emport par le gaz vecteur pur et le flux de chaleur emport par le gaz vecteur charg des
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Chap. 2 : Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

molcules de solut. Ces flux de chaleurs sont produits par des thermistances, parcourues par un courant continu de tension fixe, dans une enceinte thermostat avec prcision. Les thermistances sont montes en pont de Wheastone et celui-ci permet de suivre lvolution du courant en fonction de la variation des rsistances conscutive aux variations de temprature autour des filaments. Un galvanomtre ou un potentiomtre enregistreur suivent le courant dans le pont.

Figure 9 : Montage des thermistances Pour obtenir la plus grande rponse pour un solut donn, il est donc ncessaire quil y ait la plus grande diffrence possible entre la conductivit de ce solut et celle du gaz porteur. cet effet, on utilise pratiquement toujours lhydrogne (danger dexplosion) ou lhlium comme gaz vecteur. Dtecteur ionisation de flamme Cest un dtecteur beaucoup plus sensible que le catharomtre, mais moins universel, car il ne donne de rponse quaux composs organiques. Il a aussi linconvnient, contrairement au catharomtre, de dtruire le solut qui le traverse, car son principe est de brler, dans une flamme dhydrogne, leffluent apport par de lazote (gaz vecteur). Sous leffet dun champ lectrostatique, il se forme des ions carbones de charge positive qui sont prcipits sur une lectrode o ils crent un courant dionisation que lon amplifie grce un lectromtre amplificateur. Sur un enregistreur, on obtient par consquent un signal proportionnel au dbit - masse du solut dans le dtecteur. En fait, il nest pas exactement proportionnel au nombre
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Chap. 2 : Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

datomes de carbone du compos concern, car il y a une influence dfavorable des autres atomes que C et H. Par contre, il est inutile de placer ce dtecteur dans une enceinte thermostate.

Figure 10 : Dtecteur ionisation de flamme Dtecteur capteur d'lectrons (ECD) Une source radioactive met des particules d'un courant d'azote. Ces lectrons produisent un courant constant qui diminue lors du passage de composs contenant un halogne (F, Cl, Br) car ces composs captent une partie des lectrons; la diminution du courant se traduit par un pic. 2.5. Le systme de dtendeur-rgulateur pour les gaz utiliss

(hlium, hydrogne, azote et air comprim) Sur les chromatographes modernes, on trouve des systmes lectroniques pour la rgulation des gaz qui sont galement purifis par des cartouches filtrantes.

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Chap. 2 : Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

Figure 11 : Systme de dtecteur-rgulateur

3. Nature des Phases

3.1. Phase mobile Elle constitue le gaz vecteur. Il sagit dun gaz inerte et pur tel que lhlium, le di azote ou le dihydrogne. La nature du gaz ne modifie pas de manire significative la sparation des composants du fait de labsence dinteraction entre le gaz et les soluts, seul le facteur temprature est important. 3.2. Phases stationnaires On distingue les phases apolaires et les phases polaires. Les premires sont base dhydrocarbures aliphatiques saturs ou de silicones (squalane, apiezon,...). Les secondes sont des polymres possdant des fonctions polaires: polyols, polyesters, polyamides. En gnral, les phases polaires retiennent plus les composs polaires, alors que ceux-ci sortent plus rapidement des colonnes apolaires que les composs du mme nom. [2]

4. Principe de fonctionnement
L'chantillon (un liquide volatil) est d'abord introduit en tte de colonne par l'intermdiaire d'une micro seringue qui va traverser une pastille en caoutchouc,
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Chap. 2 : Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

appele septum, pour se retrouver dans une petite chambre en amont de la colonne appele injecteur. L'injecteur est travers par le gaz porteur et port une temprature approprie la volatilit de l'chantillon. Les quantits injectes peuvent varier de 0.2 5.0 l. Ensuite, une fois rendus volatils, les diffrents composs de l'chantillon vont tre emports par le gaz porteur (ou gaz vecteur) travers la colonne et se sparer les uns des autres en fonction de leur affinit avec la phase stationnaire. La phase stationnaire peut tre un liquide non (ou peu) volatil (chromatographie gazliquide) ou un solide adsorbant (chromatographie gaz-solide), dans les deux cas la phase stationnaire va provoquer un phnomne de rtention chromatographique avec les diffrents composs (appels soluts). Plus le compos a d'affinit avec la phase stationnaire, plus il mettra de temps sortir de la colonne. La grandeur exprimentale brute est appele temps de rtention. C'est le temps qui s'coule entre l'injection de l'chantillon et l'apparition du signal maximum du solut au dtecteur. Pour favoriser le transport de tous les composs travers la colonne (lution), il faut dterminer la bonne temprature du four. En gnral, la temprature doit tre suprieure la temprature d'bullition des composs. On peut travailler en isotherme, cest--dire avec une temprature fixe durant toute l'analyse ou avec un programme de temprature qui varie. A la sortie de la colonne, les composs rencontrent un lment essentiel qui est appel dtecteur. Cet lment value en continu la quantit de chacun des constituants spars au sein du gaz porteur grce la mesure de diffrentes proprits physiques du mlange gazeux. Le dtecteur envoie un signal lectronique vers un enregistreur (sorte d'imprimante) qui dessinera les courbes de chaque pic en fonction de leur intensit (courbe de type Gaussienne). L'ensemble des pics est appel chromatogramme (reprsente l'volution d'un paramtre signal lectrique provenant du dtecteur li la concentration instantane du constituant solut, en fonction du temps. Le chromatogramme est une reprsentation graphique o des pics mergent de la ligne de base, trac obtenu en l'absence de composs.)

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Chap. 2 : Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

Actuellement et de plus en plus, les logiciels remplacent avantageusement les enregistreurs papiers pour l'interprtation des signaux envoys par les dtecteurs. [3]

Figure 12 : Exemple de chromatogramme (obtenu par CPG

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Chap. 3 :

Les tapes de la Caractrisation de la matire grasse par CPG

La caractrisation de la matire grasse (MG) se fait en 3 tapes indispensables :

1. Extraction de la matire grasse en vue de sa caractrisation

1.1. Domaine dapplication La prsente norme dcrit une mthode gnrale dextraction de la matire grasse totale partir dun produit alimentaire labor. La nature des solvants choisis (mlange dhexane et disopropanol) permet dextraire les lipides neutre (triglycrides) et les lipides dits polaire (glycrides partiels, acides gras libres, composs de linsaponifiable, phospholipides, composs doxydation. Le protocole opratoire ne comporte aucune tape de chauffage et /ou dhydrolyse, tapes qui pourraient entrainer une dgradation partielles des lipides extraits. Cette mthode permet dobtenir un extrait lipidique non altr sur lequel peut tre valablement ralise toute dtermination sur la composition et la qualit. La mthode est applicable au produit tel quel. Pour les produits secs ou lyophiliss (teneur en eau < 5%) et les produits liquides (teneur en eau >70 %), il est ncessaire de tenir compte des modifications du protocole opratoire s indiques dans la norme. Dans le cas des produits laitiers, lacide lactique est extrait simultanment avec les acides gras libres. 1.2. Dfinition Lextrait lipidique obtenu dans les conditions de la mthode dcrite ici est par convention appel matire grasse . Il serait plus rigoureux de parler dextractible au mlange hexane /isopropanol 3 :2 (V /V) . C'est--dire de lensemble des

substances extraites selon le mode opratoire spcifi.

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Chap. 3 :

Les tapes de la Caractrisation de la matire grasse par CPG

1.3. Principe Extraction de la matire grasse froid laide du mlange de solvants hexane /isopropanol par dispersion et agitation. Filtration et schage de lextrait sur colonne de Clite et de sulfate de sodium anhydre. Elimination des solvants et schage de lextrait ainsi obtenu. 1.4. Ractifs Tous les ractifs utilises doivent tre analytique reconnue. n-hexane Propanol-2(isopropanol) Sulfate de sodium pur anhydre (Na2 SO4 >99%) sch ltuve 103C2C puis refroidi avant emploi temprature ambiante dans un dessiccateur. Clite 545 pour laboratoire, granulomtrie 10-40 m.

1.5. Appareillage Matriel courant de laboratoire, et notamment : Rpe mnagre. Broyeur mcanique couteaux. Bcher de 100 ml. Balance analytique au 1 /10 mg. Tubes en verre de 100 ml pour centrifugeuse. Colonne en verre de 20 cm de hauteur et de 20 mm de diamtre, munie dun robinet en polyttrafluorothylne (tflon) et dun verre fritt sa base. Filtre papier plat pour usage gnral. Ballon en verre de 250 ml. Etuve rgle 103C2C. Dessiccateur. Barreau aimant recouvert de polyttrafluorothylne (tflon)
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Chap. 3 :

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Broyeur pulvrisateur axe vertical ayant les caractristiques suivantes : -Vitesse dagitation : 8 000-24 000 tr /min -Arbre de dispersion en acier inoxydable -Finesse de dispersion : 5-25m

Agitateur magntique. Centrifugeuse. Evaporateur rotif sous vide quip dun bain thermostat. Entonnoir en verre.

Filtre en fibre de verre borosilicat, qualit trs haute rtention : environ 1m.

1.6. Mode opratoire

1.6.1. Prparation de lchantillon pour essai

Lorsquil existe une norme spcifique de prparation de lchantillon pour analyses concernant le produit trait, suivre le protocole prconis. Dans les autres cas, procder comme indiqu ci-aprs :

Cas des chantillons solides homognes (chocolat, biscuit.) :

Couper finement ou rper un chantillon reprsentatif du produit analyser (tel quil est habituellement consomm). Dans certains cas (fromages), il est prfrable de travailler sur un produit pralable congel. Cas des chantillons htrognes (pt, viande) :

Broyer un chantillon reprsentatif du produit analyser (tel quil est habituellement consomm) laide dun broyeur couteaux jusqu obtention dun broyat homogne. Cas des liquides (sauce, yaourt, boisson) :

Agiter la spatule un chantillon reprsentatif du produit analyser (tel quil est habituellement consomm) jusqu homognisations correcte.

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Chap. 3 :

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1.6.2. Prise dessai

- Dans un bcher, peser 1 mg prs, environ 5g de lchantillon obtenu.

1.6.3. Prparation du mlange de solvants

- Prparer une quantit suffisante du mlange de solvants hexane /isopropanol 3 :2 (V/V), soit 300 ml dhexane pour 200 ml disopropanol.
1.6.4. Prparation de la colonne

- Placer au fond de la colonne, sur le fritt, une rondelle de papier filtre de 20mm de diamtre. Verser environ 20g de sulfate de sodium anhydre. Placer une seconde rondelle de papier filtre au dessus de la couche de sulfate de sodium. Verser environ 5g de Clite. - Rincer la colonne avec 30ml du mlange de solvants. Laisser scouler les solvants (dbit maximum). Arrter lcoulement quand le niveau atteint la surface suprieure de la Clite.
1.6.5. Prparation des ballons

- Peser 1mg prs, un ballon, pralablement sch ltuve et refroidi pendant au moins 1h dans un dessiccateur.
1.6.6. Dtermination

i.

Premire extraction

- Verser 50 ml du mlange de solvants dans le rcipient dextraction. - Placer laxe du broyeur-pulvrisateur dans le rcipient dextraction, et broyer lchantillon pendant au moins 2 min, jusqu obtention dune dispersion ou dune suspension fine et homogne. - Placer dans le rcipient dextraction, un barreau aimant. - Rincer soigneusement laxe de loutil dispersion avec le mlange de solvants et rcuprer le mlange de solvants de rinage dans le rcipient dextraction

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- Agiter sur plaque magntique pendant environ 10min. Les particules solides doivent rester en suspension dans les solvants sans adhrer aux parois en verre du rcipient dextraction. - A la fin de lagitation, laisser dcanter les particules en suspension dans le fond du bcher. Pou les chantillons liquides, attendre sparation entre la phase organique et la phase aqueuse. - Si ncessaire, centrifuger le contenu du tube pour amliorer la dcantation. - Transvaser soigneusement le micella (surnageant) dans la colonne. ; dazote (0.50 bar) et rcuprer lliant dans le ballon tar.
ii. Deuxime extraction

- Reprendre le rsidu de lchantillon par 50 ml du mlange de solvants. Agiter pendant environ 10min. - Si lchantillon ne se redisperse pas correctement nouveau lchantillon comme prcdemment. - Laisser dcant et transverser le surnageant dans la colonne comme prcdemment.
iii. Troisime extraction

dans les solvants, broyer

- Effectuer une troisime extraction du rsidu de lchantillon comme prcdemment. - Rincer le rcipient dextraction et la colonne avec plusieurs volumes du mlange de solvants.
iv. Elimination des solvants et schage de lextrait

Eliminer les solvants par distillation sous vide une temprature infrieure 40C. Si lextrait obtenu est trouble, liminer par filtration : reprendre lextrait dans quelques millilitres dhexane et filtrer sur filtre en microfibre de verre. Rcuprer dans un nouveau ballon tar. Eliminer dhexane rsiduel sous courant dazote une temprature< 40C. Aprs refroidissement, peser lextrait 1 mg prs. Sassurer que lextraction est acheve en effectuant une quatrime extraction du rsidu de lchantillon, dans les conditions de la troisime extraction et en
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Chap. 3 :

Les tapes de la Caractrisation de la matire grasse par CPG

rcuprant lluant dans un nouveau ballon tar. Gnralement, trois extractions successives rcuprer la totalit de la matire grasse. Raliser immdiatement les analyses sur lextrait obtenu.

2. Prparation des esters mthyliques dacides gras

2.1. Objectifs Les esters mthyliques ainsi obtenus peuvent tre utilis dans diverses mthodes danalyses dont on choisit une, ils exigent une telle transformation. La mthode quon va procder est applicable la prparation des esters mthyliques des acides gras ayant 6 atomes de Carbone ou plus, partir de tous les types de corps gras et dacide gras dorigines animale ou vgtale. En prsence dacide gras 6 ou 8 atomes de carbone et, dans notre cas de prparation par chromatographie en phase gazeuse, il est essentiel que le solvant ne soit pas limin de la solution des esters mthyliques. Acide + Alcool Ester + eau

2.2. Mthodes de remplacement (applicable aux corps gras neutres

2.2.1. Principe

Mthanolyse des glycrides en milieu alcalin.

2.2.2. Ractifs

Sauf indication contraire, les ractifs doivent tre de qualit analytique et leau utilise doit tre de leau distille ou de qualit quivalente. Mthanol : ne contenant pas plus de 0.5% (m /m) deau. Hydroxyde de potassium : solution mthanolique environ 1N. Dissoudre 5.6 g dhydroxyde de potassium dans 100ml de mthanol. Heptane : pour chromatographie Sulfate de sodium : anhydre
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Azote : contenant moins de 5mg /kg doxygne.

2.2.3. Appareillage

Matriel courant de laboratoire, et notamment : Agitateur permettant une agitation rapide, et dispositif de chauffage appropri (par exemple agitateur magntique chauffant). Fiole de 100 ml, col rod. Tubulure pour barbotage dazote. Rfrigrant dbullition Ampoule dcanter : de 250ml. Fiole conique de 50ml, ouverture troite.

2.2.4. Mode opratoire Prparation de lchantillon pour essais

i.

Lchantillon pour essai doit tre sec et limpide, et en chauffant lchantillon juste audessus de son point de fusion.
ii. Prise dessai

Peser environ 4g de lchantillon pour essais.

iii. Prparation des Esters Mthyliques

Introduire la prise dessais dans la fiole. Ajouter environ 40 ml de mthanol, 0 .5ml de la solution mthanolique dhydroxyde de potassium et le rgularisateur dbullition. Adapter le rfrigrant reflux la fiole. Porter lbullition, la solution doit devenir limpide. La raction est normalement terminer au bout de 5 10 min. Refroidir la fiole sous courant deau, et transvaser le contenu de la fiole dans une ampoule dcanter.

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Rincer la fiole avec 20ml dheptane et les verser dans lampoule. Ajouter environ 40 ml deau, agiter et laisser dcanter. Les esters se rassemblent dans la phase heptanique suprieure. Soutirer la phase aqueuse dans une seconde ampoule dcanter et lextraire nouveau par 20 ml dheptane. Runir les deux extraits et laver deux fois avec 20 ml deau. Laisser dcanter puis scher sur sulfate de sodium la solution desters, filtrer sur coton et vaporer jusqu 20 ml environ le solvant au bain deau bouillante, avec barbotage dazote, dans une fiole conique de 50 ml.

3. Analyse par CPG des esters mthyliques dAG

Dans ce paragraphe on va donner des directives gnrales pour la dtermination par chromatographie en phase gazeuse de la composition qualitative et quantitative d'un mlange desters mthyliques d'acides gras obtenu selon lISO 5509 en utilisant des colonnes rempiles ou capillaires. 3.1. Ractifs

3.1.1. Gaz Vecteur

Gaz inerte (azote, hlium, argon, hydrogne .) soigneusement dessch et contenant moins de 10 mg/kg d'oxygne. L'hydrogne que l'on utilise comme gaz vecteur uniquement avec les colonnes capillaires: permet de doubler la vitesse d'analyse mais prsente des dangers. Il existe cependant des dispositifs de scurit.
3.1.2. Gaz auxiliaires

Hydrogne (de puret >99. 9 %) ne contenant pas d'impurets organiques Air ou oxygne ne contenant pas dimpurets organiques

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Chap. 3 :

Les tapes de la Caractrisation de la matire grasse par CPG

3.1.3. Produits d'talonnage

Cest un mlange desters-: mthyliques d'acides gras purs, ou esters mthyliques d'un corps gras de composition connue si possible voisine de celle du corps gras analyser. 3.2. Appareillage

Les prescriptions fournies concernent les appareils usuels de chromatographie en phase gazeuse utilisant des colonnes remplies et/ou capillaires et un dtecteur ionisation de flamme
3.2.1. Appareil de chromatographie en phase gazeuse

L'appareil de chromatographie en phase gazeuses doit comprendre les lments suivants :

Dispositif d'injection

Soit avec des colonnes remplies le dispositif ayant le plus faible volume mort possible (dans ce cas il doit pouvoir tre port une temprature suprieure de 20C 50C celle de la colonne) ; Soit avec de s colonnes capillaires auquel le dispositif doit tre spcialement conu pour l'utilisation de telles colonnes.
Le four

Il doit tre en mesure de porter la colonne une temprature d'au moins 260C Cette dernire caractristique est particulirement importante lorsqu'on utilise un tube en silice fondue. L'utilisation d'un appareil quip dun programmateur de temprature est recommande dans tous les ces et en particulier en prsence dacides gras moins de 16 atomes de carbone.
Colonne remplie

Colonne en matriau inerte vis--vis des corps analyser: verre, acier inoxydable
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Les tapes de la Caractrisation de la matire grasse par CPG

ayant les dimensions suivantes : - Longueur : de 1 m 3 m. Une colonne relativement courte sera utilise dans le cas o les acides gras longue chaine (>C20) sont prsents. Dans 1e cas de 1a dtermination des acides en C4et en C6, il est recommand d'utiliser une colonne de 2 m. - Diamtre intrieur : de 2 mm 4 mm.

Remplissage: comprenant les lments suivants : - Support : dont la dimension moyenne tant lie au diamtre intrieur et la longueur de la colonne. - Phase stationnaire: phase polaire de type polyester (par exemple polysuccinate de dithylneglycol, polysuccinate de butanidiol.. etc.), ou toute autre phase permettant la sparation chromatographique.

Colonne capillaire

- Tube : en matriau inerte vis--vis des corps analyser gnralement en verre ou en silice fondue. Le diamtre interne doit tre compris entre 0,2 mm et 018 mm. - Phase stationnaire : principalement de type poly glycols - Montage et conditionnement de la colonne : Respecter les prcautions habituelles de montage des colonnes capillaires c'est--dire la disposition de la colonne dans le four (support), le choix et le montage des joints. Le positionnement des extrmits de la colonne dans l'injecteur et le dtecteur (rduction des volumes morts). Mettre la colonne sous gaz vecteur (par exemple 0.3bar (30 kPa) pour une colonne de 25 m de longueur et d'un diamtre intrieur de 0 3 mm). Conditionner la colonne par programmation de la temprature du four 3C/min depuis la temprature ambiante jusqu' une temprature infrieure 10C la limite de dcomposition de la phase stationnaire. Maintenir cette temprature 1h, jusqu stabilisation de la ligne de base. Revenant 180C pour travailler dans des conditions isothermes.

Dtecteurs

De prfrence capable d'tre port une temprature suprieure celle de la colonne.

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Chap. 3 :

Les tapes de la Caractrisation de la matire grasse par CPG

Seringue

La seringue doit avoir une capacit de 40 l au maximum et tre gradue en 11

Enregistreur

Lorsque la courbe enregistre est utilise pour calculer la composition du mlange analys, lenregistrement doit tre un appareil lectronique de grande prcisions, compatible avec l'appareillage utilis et ayant les caractristiques suivantes: a) vitesse de rponse infrieure 1.5 s, de prfrence 1s (1a vitesse de rponse est le temps ncessaire pour que la plume de l'enregistreur aille de 0 % 90% lors d e lintroduction soudaine dun signa1 de 100 %)

b) largeur des papiers 20 cm minimum ;

c)

Vitesse de droulement du papier rglable des valeurs comprises entre 0.4cm/min et 2.5 cm/min.

Intgrateur ou calculateur (facultatif)

L'emploi d'un intgrateur lectronique ou d'un calculateur permet un calcul rapide et prcis. 3.3. Mode Opratoire Les dtails opratoires concernant lemploi dun dtecteur ionisation de flamme (FID).
3.3.1. Choix des conditions optimales de travail Sur colonne remplie : Pour choisir les conditions de travail, il y a lieu de tenir

compte des variables suivantes:

1. la longueur et le diamtre de la colonne 2. 3. la nature et la quantit de la phase stationnaire La temprature de la colonne

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Chap. 3 :

Les tapes de la Caractrisation de la matire grasse par CPG

4. dbit du gaz vecteur 5. La rsolution souhaite 6. La dure de lanalyse

Sur colonne capillaire : Les caractristiques d'efficacit et de permabilit des

colonnes capillaires font que la sparation entre constituants et 1a dure de l'analyse sont trs dpendantes du dbit de gaz vecteur de la colonne. Il y aura ncessaire doptimiser les conditions opratoires selon que lon recherche, soit amliorer les sparations, soit faire de lanalyse rapide.
3.3.2. Prise d'essai

A l'aide de la seringue, prlever de 0.1 1 2l de la solution d'esters mthyliques obtenue selon lISO 5509 et les injecter dans la colonne. Dans le cas des esters exemples de solvants. Prparer une solution 100 mg/ml environ dans de l'heptane pour chromatographie en phase gazeuse et injecter 0, 1 l 1 l de cette solution. Pour la recherche de constituants prsents l'tat de trace, cette prise d'essai pourra tre augmente (jusqu' dix fois).
3.3.3. Analyse

Toutefois, il est possible d'oprer avec une temprature de colonne plus basse, dans le cas o il est ncessaire de doser des acides gras dont le nombre d'atomes de carbone est infrieur 12, ou plus leve dans le cas ou il est ncessaire de doser des acides gras dont le nombre d'atomes de carbone est suprieur 20. Eventuellement, il est possible d'oprer en temprature programme dans les deux cas. Par exemple, si l'chantillon contient des esters mthyliques dacides gras moins de 12 atomes de carbone, injecter lchantillon 100C(ou 50C 60C si l'acide butyrique est prsent) et programmer immdiatement un dbit de 4 C/min 8C/min jusqu' la temprature optimale. Dans certains cas, les deux procds peuvent tre combins.
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Chap. 3 :

Les tapes de la Caractrisation de la matire grasse par CPG

3.3.4. Prparation du chromatogramme de rfrence et des courbes de rfrence

Analyser le mlange tmoin dans les conditions opratoires identiques celles de l'essai, et dterminer les temps de rtention ou les distances de rtention pour les acides gras constitutifs. Les courbes donnant le logarithme du temps de rtention ou de la distance de rtention en fonction du nombre d'atomes de carbone dans des conditions isothermes. 3.4. Expressions des rsultats

3.4.1. Analyse qualitative

Pour l'essai, identifier les pics du mthyle ester en se reportant aux courbes prpares au besoin en interpolant.
3.4.2. Analyse quantitative

La dtermination de la composition se fait en utilisant la mthode de normalisation interne (sauf exceptions), c'est--dire admettre que la totalit des constituants prsents dans l'chantillon reprsente sur le chromatogramme, donc que la somme des aires des pics reprsente 100 % des constituants. Si l'appareillage comporte un intgrateur, utiliser les chiffres fournis par celui-ci, dterminer l'aire de chaque pic en multipliant la hauteur du pic par sa largeur mihauteur en tenant compte des diverses attnuations ventuellement utilises au cours de l'enregistrement.
3.4.3. Rapport dessai

Le rapport d'essai doit indiquer les mthodes utilises pour 1a prparation des esters mthyliques et pour lanalyse par chromatographie en phase gazeuse, ainsi que les rsultats obtenus. Il doit en outre, mentionner tous les dtails opratoires non prvus dans la prsente Norme internationale. Le rapport d'essai doit donner tous 1es renseignements ncessaires lidentification complte de lchantillon. [4]
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Chap. 3 :

Les tapes de la Caractrisation de la matire grasse par CPG

Exemple de rapport dessai dans le tableau suivant : Variable Colonne Valeur/Condition Longueur : 2m 4m ; Diamtre intrieur : 4m Support Taux dimprgnation de la phase stationnaire Gaz vecteur Gaz auxiliaires Temprature de linjecteur Hlium Nant De 40C 60C suprieure celle de la colonne Temprature de la colonne Dbit du gaz vecteur 180C 200C Gnralement compris entre 60 ml/minet 80 ml/min Quantits injectes Gnralement comprise entre 0.5l et 2l Granulomtrie entre160m et 200m 15%(m/m)

Tableau 3 : Exemple de rapport d'essai

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Chap. 4 : Rsultats d'analyses de la MG de certains produits alimentaires

1. Dtermination des acides Gras isomres : Analyser par CPG sur colonne capillaire

1.1. Objet et champ d'application La prsente norme dcrit un procd de dtermination de la teneur en acides gras trans dans les matires grasses vgtales par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire. La mthode est applicable aux matires grasses dont les acides gras ont un nombre d'atomes de carbone compris entre 10 et 24 1.2. Principe Les esters mthyliques d'acides gras sont prpars partir de la matire grasse, puis analyss par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire. Les acides gras sont identifis en fonction de leurs temps de rtention. Leur taux est dtermin par le rapport entre l'aire des pics correspondants et la somme des aires des pics de tous les acides gras. 1.3. Objectif de l'essai Dterminer les isomres trans des acides gras insaturs 18 atomes de carbone susceptibles d'tre prsents des concentrations dfinies dans les matires grasses vgtales naturelles et dans celles soumises un processus de raffinage. 1.4. Appareillage

1.4.1. Chromatographe en phase gazeuse

Appropri au fonctionnement sur colonne capillaire, quip d'un systme de fractionnement, constitu de :

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Chap. 4 : Rsultats d'analyses de la MG de certains produits alimentaires

Enceinte thermostatique pour la colonne, permettant de maintenir la temprature dsire avec une prcision d'environ 0,1 C. Ensemble d'injection thermo rglable. Dtecteur ionisation de flamme et convertisseur-amplificateur. Rgulateurs de dbit pour le gaz vecteur et les gaz auxiliaires.

1.4.2. Colonne capillaire

En verre ou en silice fondue, au diamtre intrieur de 0,25 0,32 mm, de 50 m de long, recouverte de cyanopropylsilicone (Des colonnes chromatographiques prtes lemploi sont disponibles dans le commerce) avec une paisseur comprise entre 0,1 et 0,3 m.
1.4.3. Enregistreur-intgrateur

Appropri au fonctionnement avec le convertisseur amplificateur, avec un temps de rponse non suprieur 1 seconde et une vitesse de droulement du papier variable.
1.4.4. Micro seringue

Pour chromatographie en phase gazeuse de 10 l.

1.4.5. vaporateur rotatif

1.5.

Ractifs et matriel

1.5.1. Gaz vecteur

Hlium et hydrogne purs pour chromatographie.

1.5.2. Gaz auxiliaire

Air et hydrogne pour chromatographie.

1.5.3. chantillons de rfrence
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Chap. 4 : Rsultats d'analyses de la MG de certains produits alimentaires

Esters mthyliques d'acides gras purs, en particulier des isomres cis et trans des acides octadcnoques ; octadcadinoques ; et octadcatrinoques (talon).
1.5.4. n-hexane

1.6.

Mode opratoire

1.6.1. Prparation des esters mthyliques

Utiliser un procd prvoyant la catalyse basique. Les matires grasses dont l'acidit libre est suprieure 3% doivent tre pralablement neutralises.
1.6.2. Contrle du chromatographe et conditionnement de la colonne

Aprs excution des contrles prliminaires de l'ensemble d'injection et de l'enregistreur, procder au montage de la colonne sur le chromatographe en phase gazeuse, sans toutefois relier l'extrmit de sortie au dtecteur. Faire passer un lger courant du gaz vecteur (1-2 ml/min.) travers la colonne et commencer un chauffage graduel jusqu' atteindre, au bout de 4 heures au minimum, la temprature de 210C.

Maintenir la colonne cette temprature pendant au moins une nuit, puis laisser refroidir; relier par la suite l'extrmit de sortie au dtecteur et, aprs avoir contrl la stabilit de la connexion, reporter l'ensemble d'injection la temprature de conditionnement. Insrer le dtecteur et l'enregistreur et, au bout de 3-4 heures, contrler si la linarit et la dviation du trac de la ligne de base, oprant une sensibilit au moins quatre fois suprieure celle prvue pour l'excution de l'analyse, sont satisfaisantes (une dviation positive suprieure 5% du fond de l'chelle/heure indique un conditionnement insuffisant de la colonne).
1.6.3. Choix des conditions opratoires

Les conditions opratoires gnrales sont les suivantes: temprature de la colonne de 150 200C, ventuellement temprature programme (par ex. 165C pendant 15 minutes, puis augmentation de 5C/min. jusqu' la temprature de 200C)
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Chap. 4 : Rsultats d'analyses de la MG de certains produits alimentaires

temprature de l'injecteur: 250C temprature du dtecteur: de 260 280C volume de gaz vecteur (hlium ou hydrogne): 1,2 ml/min. quantit de la substance injecte: 1 l de solution 2 pour cent dans 1'hexane. Ces conditions peuvent tre modifies en fonction des caractristiques de la colonne et des conditions de ralisation de la chromatographie en phase gazeuse de faon obtenir un profil chromatographique en phase gazeuse similaire celui faisant 1'objet de la Figure 13.

Contrler que le pic de 1'acide linolique (C 18:3) est compltement rsolu immdiatement avant l'apparition du pic de l'acide lecosnoque (C 20:1); si cela nest pas le cas, il convient de modifier la temprature du four et/ou utiliser une colonne polarit diffrente.

Pour la vrification des conditions prcites, injecter plusieurs fois des masses gales de la prise d'essai du mlange d'esters mthyliques et modifier opportunment la temprature et le dbit du gaz vecteur jusqu' obtenir la meilleure sparation. En outre, vrifier le pouvoir de rsolution en diminuant ventuellement la prise d'essai et en augmentant la sensibilit jusqu' obtenir la meilleure rsolution des pics. Si l'on obtient la sparation de tous les acides gras prsents et un indice de rsolution suprieur 2, considrer la colonne comme approprie et maintenir les conditions opratoires choisies pour la ralisation de toutes les dterminations suivantes. Dans le cas contraire, la colonne n'est pas considrer comme efficace.
1.6.4. Excution de l'analyse

l'aide de la micro seringue de 10 l, prlever 1 l d'hexane, aspirer 0,5 l d'air et, par la suite, 0,5 1 l de la solution de l'chantillon; tirer encore le piston de la seringue de faon ce que 1'aiguille soit vide. Introduire l'aiguille travers la membrane de 1'ensemble d'injection et, aprs 2 secondes, injecter rapidement, puis extraire lentement
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Chap. 4 : Rsultats d'analyses de la MG de certains produits alimentaires

l'aiguille au bout de 5 secondes. Procder l'enregistrement jusqu' lution complte des esters mthyliques prsents.
1.6.5. Identification des pics

Les esters mthyliques des acides gras apparaissent sur le chromatogramme selon une progression qui est fonction directe de leur nombre d'atomes de carbone. Les esters insaturs sont lus aprs les esters saturs correspondants et leur lution est fonction directe du nombre de doubles liaisons. Les esters des acides gras trans sont lus avant les isomres cis correspondants. Lidentification des esters mthyliques individuels est effectue ensuite travers la mesure des temps de rtention qui sont compars aux temps de rtention de mlanges de rfrence.
1.6.6. valuation quantitative

Procder au calcul des aires de chacun des pics 1'aide de 1'intgrateur lectronique. Pour obtenir une sensibilit analytique approprie, la hauteur du pic correspondant l'ester mthylique de l'acide arachidique ne doit pas tre infrieure 20% du fond de l'chelle. Pour l'huile d'arachide, cette hauteur ne doit pas tre infrieure 50%. Le pourcentage de chaque acide gras est calcul partir du rapport entre l'aire du pic correspondant et la somme des aires de tous les pics prsents*100. [5]
1.6.7. Evaluation qualitative

Pour lessai, identifier les pics du mthyle ester en se reportant aux courbes de rfrences (talon) au besoin en interpolant Le chromatogramme obtenu dans ces conditions est le suivant :

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Chap. 4 : Rsultats d'analyses de la MG de certains produits alimentaires

Figure 13 : Chromatogramme-type relatif la dtermination des acides gras trans, effectue sur colonne capillaire

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Chap. 4 : Rsultats d'analyses de la MG de certains produits alimentaires

2. Analyse chromatographique des esters mthyliques d'acides gras du beurre (CPG)

2.1. Prparation de la matire grasse

Les dterminations qui suivent sont faites sur le beurre total, en effet La matire grasse du beurre tudi reprsente 84 % en masse. Pour obtenir la matire grasse seule on fait fondre lchantillon, le laisser reposer 55C pendant 2 3 h. Extraire la phase grasse et filtrer sur un papier filtre sec.
2.2. Prparation des esters mthyliques

Dans un tube avec bouchon vis introduire: une masse m voisine de 20 mg de matire grasse (ou un volume apportant la masse quivalente) 0,5 ml d'heptane Agiter. 0,2 ml de NaOH 2 mol/L dans le mthanol port au bain thermostat 60C pendant 30s 1 min. Agiter 10 s. 0,2 ml de HCl 2 mol/L. Prlever 100 L de la phase suprieure Mettre dans un tube en verre et faire vaporer en milieu ventil; Reprendre par 50 L d'heptane ou de chloroforme (Extrait B) Agiter et transvaser dans un petit tube en verre puis laisser dcanter.

2.3. Etude par CPG

Phase stationnaire Temprature: 180C (ou gradient de 170C 200C) Dtecteur: FID Solvant: heptane ou hexane Injecter un mlange d'esters mthyliques tmoins.
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Chap. 4 : Rsultats d'analyses de la MG de certains produits alimentaires

Injecter l'extrait B.

2.4. Analyse des rsultats

Faire l'analyse qualitative des chromatogrammes. En dduire la nature des acides gras prsents dans les triacylglycrols du beurre. Calculer le % reprsent par chaque type d'acides gras. Comparer les rsultats avec ceux obtenus par les indices.

La composition obtenue du beurre est une Composition riche en acide butyrique. [6]

C4-C14 C16 C18 C18-1 Autres insaturs

25% 30% 10% 30% 5%

Tableau 4 : Composition obtenue du beurre

Figure 14 : Chromatographie de drivs d'acides gras de la matire grasse du beurre.

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Chap. 4 : Rsultats d'analyses de la MG de certains produits alimentaires

Les pics numrots de 1 8 correspondent aux acides gras saturs 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 et 18 atomes de Carbonne : le pic n9 correspond lacide olique. 3. Dtermination de la MG laitire de produits laitiers enrichis en AG omga-

3 et omga-6 par chromatographie gaz liquide Cette analyse spcifie une mthode de dtermination de la teneur en AG omga-3 et omga-6 de la matire grasse laitire anhydre extraite de produits laitiers supplments ou naturellement enrichis en ces constituants.
3.1. Principe

Un talon interne est ajout la matire grasse laitire anhydre. Les esters mtalliques d'acides gras (EMAG) sont prpars par transestrification. Les EMAG sont spars et dtermins par chromatographie en phase gazeuse sur colonnes capillaires. Les acides gras (w-3) et (w-6) sont quantifis par rapport l'talon interne.

Figure 15: Chromatogramme de rfrence dEMAG de la matire grasse laitire

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Chap. 4 : Rsultats d'analyses de la MG de certains produits alimentaires

3.2. Ractifs

a. n-Hexane [CH3(CH2)4(CH3)]. b. E MAG C 23: 0 (tricosanoique), de puret 99 % en fraction massique. c. Solution talon d'EMAG C23:0 EMAG C23:0 Peser avec prcision environ 25 mg de C23:0 dans une fiole jauge un trait de 25ml, diluer jusqu'au trait avec du n-hexane et mlanger. d. EMAG(EPA) C20:5 w- 3, de puret 99 % en fraction massique EMAG (EPA) C20:5 w-3 : Peser avec prcision environ 10 mg de C20:5 w-3 dans une fiole jauge un trait de 10ml, diluer jusqu'au trait avec du n-hexane et mlanger. e. EMAG (LA) C 1 8 : 2 w -6 de puret 99 % en fraction massique Solution talon dEMAG C18:2 w- 6 : Peser exactement environ 10 mg de C 1 8 :2 w - 6 dans une fiole jauge un trait de 10 ml Diluer jusqu'au trait avec du nhexane et mlanger. f. Mlange de rfrence compos d'estocs mtalliques d'acides gras pour une valuation qualitative c'est--dire une identification des temps de rtention.

3.3. Appareillage

a. Balance analytique : permettant de peser 0. 1 mg prs. b. tuve de schage: permettant de maintenir une temprature de 60C c. Fioles jauges: un trait de 10 ml, 25 ml et 50 rnl de capacit d. Pipettes un trait, de 1ml et 5 ml de capacit e. Pipette gradue, de 5 ml de capacit, ISC 835 E3l classe A. f. Tube essai de capacit 10 ml. muni d'un bouchon vis revtu de polyttrafluorothylne. g. Chromatographe gaz-liquide : quip d'un dtecteur ionisation de flamme et d'un systme capillaire d'injection fuite ou injecteur en tte de colonne. h. Gaz vecteur : hydrogne ou hliurn dune puret d'au moins 99 999 % en fraction massique. i. Colonne capillaire : ayant une phase stationnaire effectivement adapte la sparation des EMAG. j. conditions de chromatographie en phase gazeuse : La temprature du four et
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Chap. 4 : Rsultats d'analyses de la MG de certains produits alimentaires

de l'coulement du gaz vecteur dpendent du choix de la colonne ainsi que du gaz vecteur employ. Dans tous les cas. les conditions choisies doivent permettre d'obtenir une sparation satisfaisante d'une part du w-3 et de l'acide linolique d'autre part

EXEMPLE En utilisant lhlium comme gaz vecteur et dans les conditions de chauffage

isothermes, les conditions applicables pour une sparation correcte des EMAG w- 3, et w- 6 sont illustres dans le tableau qui suit : Gaz vecteur Pression en tte de colonne Colonne Hlium un dbit de 1.8ml/min 120KPa Capillaire en silice fondue Longueur : 30m Diamtre interne : 0.32mm Epaisseur du film : 0.25m

Phase stationnaire Temprature du four Temprature du dtecteur et de linjecteur Rapport de fuite Volume dchantillon inject

Polythyneglycol 200C 260C

100 :1 1l

Tableau 5: conditions applicables pour une sparation correcte des EMAG w- 3

3.4. Prparation de lchantillon

Il convient que le laboratoire reoive un chantillon reprsentatif qui n'a pas t endommag ou modifi pendant le transport ou le stockage. Aprs lextraction de la matire grasse laitire il faut liminer compltement le solvant de lextraction en chauffant la matire grasse une temprature maximale de 60C afin d'viter la dcomposition des acides gras polyinsaturs.
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Chap. 4 : Rsultats d'analyses de la MG de certains produits alimentaires

3.5. Mode Opratoire

3.5.1. Prise dessai

Faire fondre l'chantillon pour essai 50C. Agiter l'chantillon fondu pendant 1 min afin d'obtenir un chantillon pour essai homogne. Peser 1 mg prs 100 mg de l'chantillon homogne dans un tube essai. Avant de prparer les EMAG conformment I'ISO 15884IFIL 182 traverser l'aide d'une pipette 1 ml de solution talon dEMAG C23:0. Par consquent ajouter seulement 4 ml de n-hexane au lieu des 5 ml spcifis dans I'ISO 15884 IFI 182. La quantit dtalon interne (EMAG C23 :0) est d'environ 1 % de matire grasse en fraction massique. ce qui est adquat pour quantifier des teneurs en acides gras w-3 w- 6 de 0.5 % en fraction massique 4 % en fraction massiques (cas des produits supplmenter avec des bulles de poisson). A la fin de la mthylation traverser 2 ml de surnageant limpide dans un tube essai ou directement dans un flacon pour chantillonneur automatique. Cette solution est prte pour une analyse par chromatographie er phase gazeuse ou peut tre conserve dans un rfrigrateur pendant 2 jours.
3.5.2. Dtermination qualitative

Injecter 1 l du mlange de rfrence (2.f) dans le chromatogramme en phase gazeuse. Enregistrer les temps de rtention des pics attribuables l'talon interne de C23:0.[7] Un chromatogramme gaz liquide obtenu dans ces conditions est prsent dans la figure suivante :

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Chap. 4 : Rsultats d'analyses de la MG de certains produits alimentaires

Figure 16 : chromatogramme gaz-liquide dEMAG avec agrandissement de la zone dlution des pics -3 et -6 et ALC obtenu dans les conditions isothermes

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Conclusion gnrale
Nous avons considr dans notre projet ltude pratique des matires grasses, les mthodes de caractrisations et lexploitation des rsultats danalyses effectus sur deux produits alimentaires (beurre et lait). Le problme essentiellement concern par le sujet est focalis sur lextraction de la matire grasse de ces produits ensuite la prparation des esters mthyliques et enfin lanalyse des chromatogrammes et des courbes de rfrences. Au dbut, comme requiert toute autre tude, nous avons pass par une tape de synthse de lessentiel des lments en relation avec le sujet. Dans ce cadre, Nous citons notamment limportance du rle du la CTAA qui a mis notre disposition les moyens ncessaires qui nous ont permis dacqurir une meilleure matrise de sujet . Le principal intrt du secteur agro-alimentaire est de garantir le mieux que possible la production daliments de qualit adapts la sant de ltre humain. Notre objectif global est datteindre une meilleure matrise de divers paramtres technologiques de quelques aliments. Ces paramtres sont susceptibles dtre la base de la stabilit physique et chimique des systmes lipidiques, qui par raction de drivation et en masquant les fonctions polaires permettent daugmenter la volatilit, la stabilit et la dtectabilit des lipides ce qui mne lquilibre de notre organisme corporel. Cette tape est acheve par se prononcer sur la prparation des acides gras avant leurs passages par la CPG pour analyser les chromatogrammes obtenus chaque temps de rtention et connatre les acides prsents dans la matire grasse dsigne. La phase finale a t consacre aux essais dexploitation relle de la matire grasse par CPG. Les diverses analyses nous ont permis de se prononcer globalement sur limportance du travail demand sur le plan agro-alimentaire et hygine. Le rapport d'essai obtenu a donn tous les renseignements ncessaires lidentification complte de lchantillon, ce qui mne lamlioration du produit mis en uvre. Quoi que les rsultats obtenus soient encourageant, nous ne pouvons pas prtendre la conformit totale et dfinitive la norme. Nous esprons ici avoir rpondu au travail demand. Certes, la reprise de ce travail sous un angle plus professionnel est possible. Quoi quil en soit, nous pouvons confirmer que le travail sur un tel dispositif tait bnfique et passionnant.
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Les sites Web [1] : http://www.ctaa.com.tn/ [2] : http://fr.wikipedia.org/wiki/Chromatographie_en_phase_gazeuse [3] http://www.ac-nancy-tz.fr/enseign/physique/chim/jumber/CPG/chromato_gaz.htm [6] : http://www.ac-reims.fr/datice/biochimie/resbioch/lipides/tpbeurre.pdf

Documentations

[4] : HARA A .RADIN N.S. Analyt.Biochem.1978, 90,420 WOLFF R.L CASTERA A.F.M Revue franaise corps gras, 1987, 34,123 Informations provenant de la base le rfrentiel , version Septembre 1998 Norme.. ISO 5509 [5] : ISO 5725-1:1994 Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et mthodes de mesure Partie 1: Principes gnraux et dfinitions ISO 5725-2: 1994 Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et mthodes de mesure Partie 2: Mthode de base pour la dtermination de la la reproductibilit et de la reproductibilit dune mthode de mesure normalise ISO 5725-5: 1998 Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et mthodes de mesure Partie 5: Mthodes alternatives pour la dtermination de la fidlit dune mthode de mesure normalise ISO 5725-6:1994 Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et mthodes de mesure Partie 6: Utilisation dans la pratique des valeurs dexactitude [7] : ISO 648, Verrerie de Laboratoire Pipettes un volume ISO 707 FIL 50 Lait et produits laitiers-Lignes directrices pour lchantillonnage ISO 835 Verrerie de Laboratoire Pipettes gradues ISO 1042 Verrerie de Laboratoire fioles jauges un trait ISO 5725-1:1994 Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et mthodes de mesure Partie 1: Principes gnraux et dfinitions
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ISO 5725-2: 1994 Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et mthodes de mesure Partie 2: Mthode de base pour la dtermination de la reproductibilit et de la reproductibilit dune mthode de mesure normalise CONTARNI,G . Determination (of omega-3 and omega-6| fatty acid content by gas-liqui chromatography in milk fat from enriched products - Interlaboratory collaborative studies. Bull. int. Dairy fed. 2008,(4281) .pp. 1-1 7

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Rsum
En effectuant les travaux demands dans le cahier de charges du PFE/05/2009/2010, nous tions formes essentiellement sur les principaux axes suivants : La chromatographie en phase gazeuse, utilise pour la caractrisation exprimentale des produits et surtout des aliments que mange ltre humain. La normalisation, prsente dans les modes opratoires et les valeurs limites des constituants de chaque matire. Le centre technique agroalimentaire et son rle pour soutenir les industriels dans le domaine agroalimentaire. Une compagne de mthodes pour lextraction et la prparation des esters mthyliques a t prsente et commente dans ce rapport avec des modes opratoires qui justifie globalement la validation du travail demand. Nous estimons que ce travail pourrait tre perfectionn et avoir des progrs reconnus dans le secteur agro-alimentaire.