INSTITUI-O

DE

PESQUISAS

ENERGÉTICAS

E

NUCLEARES

AUTARQUIA ASSOCIADA Â UNIVERSIDADE DE SÂO PAULO

COMPARAÇÃO DO TESTE DA CLONIDINA COM 0 TESTE DE TOLERÂNCIA k INSULINA NA AVALIAÇÃO DE PACIENTES COM BAIXA ESTATURA

MARCELO CIDADE BATISTA

Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de Doutor em Tecnologia Nuclear.

Orientador: Prof. Dr. tflilan Nicolau

SAO PAULO 1986

AOS HEUS

PAIS

JOÃO E DILZA

A LENA

cujo carinho e apoio se encontram escritos trabalho. em cada página deste

tOM!5SíO MAClONAL DE tr.e I. P. £. ,.

•••r:.3AR/SP

AGRADECIMENTOS

Esta tese resultou da colaboração t influência de várias pessoas, is quais expresso minha gratidão: Ao Prof. Dr. Wilian Nicolau, orientador e sobretudo amigo, cujo estimulo e participação pessoal foram de fun damentai importância para o meu desenvolvimento na área de Endocrinologia e Radioimunoensaio, culminando, agora, com a realização deste trabalho. Ao Dr. Júlio Kieffer (in memorian), ex-orientador e responsável por minha formação em Medicina Nuclear, por me Incentivar a ingressar no curso de pôs-graduação. Ã Dra. Constância Pagano Gonçalves da Silva, ex-orientadora, pelo apoio dado durante a realização dos cursos e seminários de area. Ao Dr. Walter Bloise, Dra. Berenice Bilharinho de Mendonça e Dr. Ivo Jorge Prado Arnhold, responsáveis por minha formação clinica na área de Endocrinologia. Suas valiosas sugestões contribuíram multo para a elaboração deste tra balho. Ao Dr. Francisco Homero D'Abronzo, que me auxiliou e orientou no desenvolvimento da parte metodológica d e s t e trabalho.

''-Wll-l DE Vr~

• • • - "A" SP

mino. Ao Dr.A Maria Angel» Henrfques Zanella Fortes. em especial i Dra. Ã FAPESP . Isabel Cristina de Hello Guazzelii e Antonio CSneíido Pinheiro Palodesenvolvi- Ã Dra. 5niornar Madurcira estimulo. pelo apoio financeiro concedido durante a realização deste trabalho. • • ••) ire.s estagiários e residentes trabalharam na Unidade d* òo>adas e Intersexo 1985-86. e Norma no e ano Dra. Débora Gonçalves de Carvalho e esterôides.. pelo forneci^ mento de preparações hormonais de referenda. pela participação na dosagem do: hormônios pepndicos e soBatonedina C. Maria Beatriz da Fonte Kohec. pela na análise estatística dos Cherem. A todos os méoic:. • • • ^ «J r . ~\r „ k " " • . Sandra Ma>*a Villares. Paulo Lu<z k^iirrt Costa. que de Edna Regina Nakandakare. pela participação rt dpsagem dos hormônios peptfdicos colaboração Ao Dr. i I . pela colaboração têc»!cõ indispensável no mento do radioimunoensaio ás SH.Fuhdeçao de Amparo i Pesquisa do Estado de SSo Paulo. : . A Valeria S*"iuel Undo. Rui Montei 10 de Barros Maciel. pelo afilio na realização dos testes de T3nid Cecilio Silva.

ij.Este trabalho foi realizado na Divisão de CHnica Médica I do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina da Universidade de Sio Paulo. . SP . . r-íL DE ENERGIA U\CLEAR. r\ E.

.""^. " .EAR/ .MATERIAL E MÉTODOS -RESULTADOS -DISCUSSÃO -CONCLUSÕES 1 5 9 19 21 23 87 125 138 X .ÍNDICE I II III IV V V VII VIII IX -RESUMO -ABSTRACT -INTRODUÇÃO -OBJETIVOS -CASUÍSTICA . . li. Z. '.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 140 ••'•" -'•' • • • ~~ C F : E R G : A • • .

I - RESUMO J ! .

?:Cíí'. 0. 45. A especificidade foi considerada adequada com . 8. .7 e 4. 8. 90 e 120 minutos. 60. com idade entre 2. A sensibilidade do método foi de 1.2 ng/ml.0375 mg/m* de superfície corpórea por via oral.4. (2) teste da cionidina (TCLO): cionidina 0. O.5 anos e altura entre 1.3 e 8. 0 6H foi dosado em soro por método de radioimunoensaio desenvo^ vido em nosso laboratório e padronizado por comparação com preparaçio de referência fornecida pelo "National Institutes of Health". .3 e 25.6% para amostras-controie de 6H contendo 1. 30. 30. 4. com coletas de sangue nos tempos de -30.5 desvios-padrões da média para sexo e idade.1 ± 0. com coletas de sangue nos tempos de -30. • •. respectivamente. Todos foram submetidos a 2 testes de liberação de GH: (1) teste de tolerância ã insulina (ITT): insulina simples 0. 15. _*.08 ng / ml (média + erro padrío da média). 60 e 90 minutos.7 e 12.6.9.2Y e a interensaio de de 19.P/3P1 :.9 abaixo e 17. a variação 1ntraensa1o 5.1 U/kg de peso por via endovenosa..COMPARAÇÃO DO TESTE DA CLONIDINA COM O TESTE DE TOLERÂNCIA A INSULINA NA AVALIAÇÃO DE PACIENTES COM BAIXA ESTATURA MARCELO CIDADE BATISTA RESUMO Foram estudados 31 pacientes.

7 (média . erro padrSo da média) e 15. mal-estar geral e sonoièri cia. que apresentavam sinais típicos de nanismo hipofisário e/ou ritmo de crescimento diminuído.3 + 1.3 + 2. ritmo de crescimento normal. No .0 ng/ml) nos Grupos IA e IB foi de rs o ITT * de 11.0 ng/ml em pelo menos um teste de estimulo (ITT ou TCLO). os picos de liberação de GH foram de 10. . respectivamente.2 + 3.0 ng/ml nos 2 testes provocativos (ITT e TCLO). Estes valores nío foram considerados estatisticamente diferentes (p > 0. SmC baixa e pico de GH menor do que 5.6 e 9. os únicos efeitos colaterais observados foram Mpotensão e sonolência discretas.1 e 58.3X par* o TCLO. Nos Grupos IA e 16. Fora» considerados normais quanto à secreção de 6H 9 crianças (Grupo IA) e 12 adolescentes (Grupo IB) que preen^ chiam 3 ou mais dos seguintes critérios: ausência de sinais típicos de nanismo hipofisário. n&useas. dosagem sérica normal de somatomedina C (SmC) e pico de libe raçSo de GH maior do que 7.8 • 2. A Incidência de resultados faiso-negativos 28. ao passo que todos os pacientes apresentaram hípogíicemia (< 45 mg/dl) no ITT. acompanhada por sudorese. respecti_ _ vamente.05) quando comparados pelo teste "IP de Mann-Whitney. Foi estabelecida deficiência de GH em 8 crianças (Grupo ZA) e 2 adolescentes (Grupo 2B). No TCLO.5 ng/ml no TCLO.8 ng/ml _ * _ no ITT e de 14.19 p* (pico < 7.base ea estudos de Imunorreatividade cruzada e dos efeitos não específicos do meio de Incubaçâo.4 e 12.

5 ng/ml no ITT e 1. já que este era constituído por apenas ? pacientes. respectivamente. Deve. o TCLO foi menos eficiente do que o ITT para excluir deficiência de GH. que engloba a maioria dos pacientes com déficit de crescimento. respectivamente. . ser considerado o teste de eleição para excluir o diagnóstico de nanismo hipofisário na idade prê-puberal. Não foi calculada a média dos picos no Grupo 2B. devendo ser utilizado apenas teste complementar. sugerindo que esta deva ser a conduta preferida naqueles com clinica desta patologia.7 e 4.9 e 3. Quando ambos cs testes são como realizados hipofisSrio em um mesmo paciente. suspeita . o diagnóstico de nanismo pode ser estabelecido com segurança próxima a 100%.-: • r '} -. os picos de GH observados no ITT e TCLü foram de 0.08 e 1.3 ng/ml em nenhum teste.8 ng/ml no TCLO.08 ng/ml.05) do que os do Grupo IA e não ultrapassando 2. Et» adolescentes.89 + 0. portanto. sendo signj^ _ ficantemente menores (p < 0. Conclui-se que o TCLO apresenta maior eficiência de causar de liberação de GH do que o ITT em crianças. cujos valores máximos foram de 0. •' •• .1 • 0. além efeitos colaterais menos graves. no entanto.Grupo 2A.

II - ABSTRACT .

5 years. respectively. 45.08 ng/mi (mean + standard error of the mean).COMPARISON OF THt CLONIDINE TEST WITH THE INSULIN TOLERANCE TEST IN THE EVALUATION OF PATIENTS WITH SHORT STATURE MARCELO CIDADE BATISTA ABSTRACT He studied 31 patients aged 2. 8. with heights from 1.1 U/kg body weight» with samples drawn at -30.3 and 25.9. 0. with samples drawn -30.1 + 0.3 to 8. 4.0375 mg/m* surface area. _ and 4.2 ng/ml. An adequate specificity was demonstrated by cros$-react1v1ty studies and by assays designed to test non-specific effects . Serum GH was measured by a rad1o1mmunoassay method developed in our own laboratory and calibrated against a reference preparation provided by the National Institutes of Health. 60.7 and control samples of 1. 90 and 120 minutes. All underwent 2 6H provocative tests: Insulin tolerance test (ITT): Intravenous regular Insulin 0.5 standard deviations below the mean (1) for age and sex.6.4. 60 and 90 minutes.2* and an 12. 30. 8. The sensitivity of the method was 1.61 for quality with an Intraassay precision of 5. 15. 0. 30.7 Interassay precision of 19. (2) clonidine test (CLOT): oral at clonidine 0.9 to 17.

respectively.08 ng/ml.1 • 0.of the medium used for Incubation. associated with nausea. respectively.0 ng/ml) Groups 1A and IB were 28.6 and 9. False-negative results (peak i 7.0 ng/mi GH response to 2 provocative tests (ITT and CLOT).7 (mean + standard tr. Eight children (Group 2A) and 2 adolescents (Group 2B) were diagnosed as GH deficient by the presence of typical signs of pituitary dwarfism and/or reduced growth rate. peak 6H responses for ITT and CLOT were 0. normal serum somatomedin C (SmC) measurement and peak GH responses greater than 7.8 • 2. respectively. These values were not statistically test of Mannfor different (p > 0. who had 3 or more of the following features: absence of typical signs of pituitary dwarf 1 sin.3 ng/ml. only had sweating. normal growth rate.3X for CLOT.or of the mean) and 15. low serum SmC and a less than 5.05) when compared by the "U" -Whitney. In Group 2A.U for ITT and 11.89 * 0.4 and 12.0 ng/mi In at least one provocative test (ITT or CLOT). peak GH responses were 10.5 ng/ml for CLOT.8 ng/rol for ITT and 14. whereas all patients hypoglycemia (< 45 mg/dl) in ITT.3 + 1. malaise and drowsiness. Slight hypotension and drowsiness were the side-effects observed during CLOT.1 and 58. In Groups 1A and IB.2 + 3. A normal GH secretory reserve was established In 9 children (Group 1A) and 12 adolescents (Group IB). with no response greater than 2. These values were .3 £ 2.08 and 1.

9 and 3.5 ng/ml ITT and 1. When both tests are performed in test a single patient.7 and 4. suggesting that this should be the preferred this disorder Is clinically suspected. Their peak GH responses were 0. observed in It was not possible to calculate mean peak levels this for for Group 2B. E . We conclude that the clonidine test with a low-oral dose of 0.8 significantly lower (p < 0. W . since only 2 patients were included in group. besides being associated dangerous side effects.0375 mg/m* is more effective than ITT in promoting GH release in children. approach when COMISSÃO KMiQML OE EKERGiA NUCLEAR/SP !. which encompasses patients with growth retardation. '<•'.05) than the ones Group 1A. provocative test It should be considered the diagnosis of with less the best pituitary most to exclude dwarfism in the prepubertal age. pituitary dwarfisn is very rarely nisdiagnosed.8 ng/ml for CLOT. the clonidine test is less effective than ITT to exclude GH deficiency in adolescents and should be used only as a complementary In pubertai patients. Nevertheless. respectively.

Ill - INTRODUÇÃO .

estando presente em quantidades de 5 a 10 mg em cada glândula. identificados por seu tamanho ou carga (42). Ele é sintetizado e armazenado nas células somatotrõficas. contendo 191 aminoácidos e com peso molecular de 22. desaparecendo do pias ma com uma meia vida de 20 a 25 minutos (12). cálcio. potássio.10 A somatotrofina (GH) é o hormônio «ais abundante da hipófise humana. Seu ritmo de secreção diário é de 1 a 2 mg. ponente fisiológico predominante consiste em uma cadeia polj^ peptfdica única. associado a balanços positivos de nitrogênio. 0 papel primordial do 6H consiste no controle do crescimento somático pós-natal. embora alguns estudos . Quando administrado a criaji ças com hipopituitarismo. 0 GH presente em extratos hipofisários e no plasma corresponde a uma mistura heterogênea de pelo menos 6 pe£ 0 com tideos. correspondentes a 35 a 45* da pituitária e localizadas predominantemente nas suas asas laterais. Acredita-se que esta açio seja mediada principalmente pela geraçlo das somatomedinas (57). ele estimula o crescimento proporcionado do esqueleto e tecidos moles. fósforo e nagnésio.000 daitons.

Esta característica per_ mite que os níveis séricos de somatomedina C (SmC). possam ser utilizados como índice de secreçio da somatotrofina (75)'. cuja secr£ ção é diretamente controlada pelo GK. •gentes estimilador e inibidor da secreçio h1pof1sir1a de GH. respectivamente. Circulam no sangue ligadas a proteínas carregadoras de alto peso molecular (145. concentrações séricas de 6H e somatomedinas atuam diretjs mente sobre o hipotfilamo. dencainados "insulin-like growth factors" I (somatomedina C) e II.500 daitons (57). São sintetizadas principalmente no ffgado e sua ação sobre o crescimento somático consiste em promove** a mitogenese e estimular a síntese de colãgeno e proteoglican. Através de mecanismo de "feedback" negativo. A secreçio de GH ê regulada pelo hi potalamo através de 2 peptideos sintetizados ao nível dos núcleos ventromediai e arqueado: a somatocrinina (6RH) e a somatostatina (SS). As somatomedinas também agem ao nível da h1p6- .000 daltons). têm peso mole cuiar de 7. formando complexos proteicos que as protegem contra a proteõlise e as conferem mela vida maior e flutuação sangüínea menor do que •s dos demais hormônios peptidicos. aumentando ou reduzindo a liberação de 6RH e SS. As somatomedinas corresponde* a una família de pe£ tideos cujos 2 principais componentes.11 "1n vitro" tenhas demonstrado UM possível efeito estimuiatõrio direto do 6H sobre r crescimento longitudinal dos ossos (34).

decorrente da defj_ ciência deste hormônio. A ativação dos receptores «-adrenérgicos e serotoninèrgicos centrais promove a liberação de 6RH e. 0 nanismo hipofisário corresponde a uma causa rara de retardo de crescimento em crianças. ciminuindo a resposta das células somatotrõficas ao 6RH (44). sendo responsá- vel por menos de IX destes casos. ou a acromegalia. Distúrbios da secreção de 6H podem resultar em patologias tais como o nanismo hipofisário. provocada por tumor produtor de 6H. Por outro lado. atualmente. o seu d1agnÓ£ tico ê multo Importante.0 ng/ml. de 6H (44) ao passo que o bloquei o dos receptores colinérgicos inibe esta resposta (13). a es timulação dos receptores e-adrenérgicos centrais provoca 1n^ biçSo da secreção de 6H (44). Mecanismos de controle neural exerce» importante ação sobre o hipotâlamo. por as con centrações sêricas deste hormônio situam-se em nível Inferior • 3. de . C O M 1 a 2 picos moderados ocorrendo 2 a 4 horas apôs as refeições. Os valores máximos são detectados aproxi nadamente 1 hora após início do sono profundo (estádio III ou IV). caracterizada pulsos de duração limitada. conseqüentemente. participando também d? regulação da secreção de GH.12).\2 fise. já que se dispSe. com picos Menores ocorrendo posteriormente durante as fases mais tardias do sono (9. Entretanto. A secreção de 6H é episódica. Na maior part* do dia.

praticamente excluindo a presença de nanismo hipofi sirio quando normal (75). Entretanto. j£ que sua secreção ê episódica e mantêm co£ centrações séricas baixas durante a maior parte do dia (28). testes provocativos de liberação de GH foram desenvolvidos. teste que consistentemente promova uma resposta hormonal ade quada em todo paciente sem déficit de GH. inferior a 3 desvios-padrões em relação de i média para sexo e idade (11). Estes também são necessários em crianças abaixo de 5 anos de Idade. diferenciar entre crianças com e sem deficiência deste hormônio. Em crianças acima de 5 anos idade» a dosagem sérica de SmC corresponde a um bom teste de triagem. quando os níveis encontram-se diminuídos. Isto ocorre por- que os diversos estímulos agem ao nível do hipotllamo através .na maioria das vezes. Nio existe. no entanto. com o Intuito de se poder avaliar a reserva nenhum hipofisiria deste hormônio. nas quais não ê possível uma boa discriminação entre valores normais e baixos de SmC (75).13 terapêutica adequada para esta doença. Por este motivo. A dosagem sérica basal de GH não permite. como o GK extraído de hipófises humanas ou produzido por engenharia genética (12). o diagnóstico de déficit de GH precisa ser confirmado por estudos da secreção deste hormônio. A possibilidade de déficit de GH deve ser considerada em todas as crianças que se apresentarem con baixa esta tura proporcionada. o que pode ser ocasionado por outras doenças como desnutrição e hipotireoidismo.

apresentam u*a incidência relativamente alta (ao redor de 30X) de resultados falso-negativos (Indivíduos sem deficiência derte hormônio mas com resposta subnormal ao teste) e. Modificando a secreçâo de SRH e/ou somatostatina. Ape sar de seren fisiológicos. direto Por estas ra sobre as células somatotróficas hipofisárias. zões. o diagnóstico de nanismo hipofisário deve se basear na demonstração de resposta subnormal do 6H a pelo menos 2 testes provocativos (32). portanto. f - M . só são utilizados a nível ambuiatoriai para excluir o diagnóstico de nanismo hipofisSrio em pacientes com baixa suspeita clinica desta patologia. o efeito não é. convenientes.14 de Mecanismos neurals monoaainérgicos. Os testes de estimulo pode* ser divididos em 2 gran des grupos (17): 1t) TESTES DE TRIAGEM Estes testes consiste» na dosage» do GH em una única amostra de sangue coletada 20 a 40 minutos apôs o inicio do exercido fisico ou 1 hora após o inicio do sono. 21) TE8TES DEFINITIVOS Estes testes Implicam na dosagem de 6H em amostras seriadas de sangue coletadas antes e após administração de -. de baixo custo e se» efeitos colaterais. porisso.

20.0. 1-dnpa.59. Apesar de apresentarem uma menor incidência de resultados falso-negativos (variável de 10 a 30%). a clonidina. Nos vários estudos prévios sobre o ITT (18. Recentemente. o teste de tolerância â insulina (ITT). foi Introduxida como novo agente capaz de estimular a secreçio . Acredita-se que a hipoglicemia promova a secreção de 6H por estimulação de receptores o-adrenérgicos centrais.36. nSo foi observada liberação de 6H nenhum paciente com deficiência deste hormônio. argi nina ou glucagon.55.64. a incidência de resultados falso-negativos variou de 8 a 265. embora associado ás conseqüências perigose a um teste de sas da hipoglicemia.56. Entre os testes definitivos. já que o bloqueio destes receptores por drogas como a fentolamina inj^ be esta liberação (44). 7.0 ou 10 ng/ml).35. um agonista o-adrenérem gico central utilizado como snt1-h1pertens1vo (37. por vezes severos e perigosos. parece ser o mais eficiente no que refere i liberação de 6H.69). Em todos.15 mi estimulo farmacolõgico como a insulina. sendo considerado por muitos autores o teste padrão C O R O qual os demais devem ser comparados (48). São indica dos em pacientes com características clinicas de nanismo hipofisârio e/ou resposta subnormal triagem.72.77). todos estão associados a efeitos colaterais desagradáveis. dependendo do nível de GH •cima do qual a resposta foi considerada normal (5.

Outra evidência por da da ação a-adrenérgica central da clonidina foi relatada Ganong e col. que observaram que. em 1979. õpós transsecção •edula espinhal. G1l-Ad e col. não houve aumento estatisticamente signify i cante dos níveis de 6H (máximo de 2.15 mg/m* de superfície corpôrea. o uso da clonidina como agente liberador de GH para excluir o diagnóstico de nanismo hipofisário em crianças adolescentes com baixa estatura. (22). (38) em 1975. Estudos mais recentes em animais indicaram a clonidina promove a liberação de GH por estimular neurônios hipotalãmicos secretores de GRH (44). que a administração de piperoxane. Em 1978. Esta ação da clonidina.5 ng/mi). com exceçSo de .16 de 6H. (26) demonstraram. inicialmente demonstrada adultos normais por Lal e col. Gold e col.-adrenérgicos centrais. a resposta do GH a esta droga permanecia que Inalterada. bloqueia o aumento da secreção de GH induzido pela clonidina. os autores e oral demonstra- ram uma elevação significante da concentração de GH em todos os pacientes sem déficit deste hormônio. Em estudos realizados em macacos Rhesus (5 ). Chambers e Brown comprovaram que a clonidina atua ao nível de receptores o-adrenêrgicos centrais. nestes Mesmos animais. Utilizando uma dose de 0. n3o tendo qualquer efeito sobre receptores dopaminérgicos ou serotoninérgicos. (23) foram os primeiros a descrever. Nos 7 pacientes com hipopUuitarismo. eu provavelmente se deve à estimulação de receptores a. um a-antagonista.

30. levando os autores a chamar atenção para esta possível complicação do teste.1 mg (40) ou com a dose de 0. 1-dopa (62. Em todos estes estti dos. Com o objetivo de minimizar os efeitos colaterais.17 1 (pico de 5.62.63. parcial de EM estudos Mais recentes. foii observada hipotensão severa Em u.15 «g/m*. fora» observadas sonolência e hipotensio Multo mais d1s_ cretas do que com 0.23. ela provoca sonolêrt cia e hipotensão moderadas. o teste da clonidina rea Uzado com a dose de 0. C O M provivel deficiência GH.66.5 ng/ml).71). havendo decréscimo de 5 a 15 wwHg .035 mg/m* (11).05 ou 0.n relato (47). 0. alguns autores tentaram realizar o teste da clonidina com d£ ses menores e fixas tais como 0. sendo em todos obser vado um maior pico de liberação de 6H e uma menor incidência de resultados falso-negativos no primeiro teste. houve redução dos níveis pressôricos que variou de 15 a 25 mmHg para a sistól^ ca e de 10 a 15 mmHg para a diastólica. associada a choque. Em apenas um trabalho (30).15 mg/m* foi comparado com o ITT (16. Embora a clonidina na dose de 0. os resultados obtidos no ITT foram equivalentes aos do teste da clonidina no que diz respeito i efi— ciência de liberação de GH.71) e arginina (71). que res a pondeu ã expansão de volume. Em todos os estudos realizados com esta dose (16.66). 39.15 mg/»* seja um excelente estimulador da secreção de GH.39.025 mg (41).

os resultados no que diz respeito ã eficiência de liberação de GH foram muito discrepantes e não relacionados magnitude da dose.6 + 1. estudou-se um grupo misto constituído por crianças e adolescentes. t mister. no estudo de Laron e col. jã que ele nujn ca foi avaliado em grupo constituído apenas por pacientes p£ beres. estes valores foram de 30.6 + 8. ou seja.3X. Utilizando 0. . (41) com a dose 0. _ enquanto que. à Lanes e coi. na época da puberdade.18 na pressão sistôlica e de 2 a 7 mmHg na diastólica. no segundo (41). a um consenso geral sobre qual a dose de clonidina a ser utilizada nos testes provocativos. (40) obtiveram picos de GH de 11. portanto. a r e s posta do GH aos estímulos provocativos clássicos é maior que a observada na infância. Estas diferenças talvez possam ser explica das pelo fato de que.025 mg.6 ng/ml {média _ + erro padrão da média) e resultados falso-negativos de 361. ainda. Isto não foi ainda. que outros estudos sejam realizados para esclarecer esta dúvida. Sabe-se que. a dose mínima que promova uma estimuiaçao eficiente da secreçSo de 6H associada a uma baixa Incidência de efeitos colaterais. apenas pacientes pré-púberes foram avaliados. NSo se chegou. demonstrado para o teste da clonidina. devido ao aumento da do secreção de testosterona e estradiol (19).8 ng/ml _ e de 8. respectivamente.050 ng de clonidina. no e£ tanto. no primeiro trabalho (40). Entre- tanto. ao passo que.

IV - OBJETIVOS .

. Incidência de efeitos colaterais indesejáveis.0375 mg/m* de superfície cor pórea com o teste de tolerância â insulina em grupos de entes pré-púberes e púberes no que diz respeito 2: Is) 28) Eficiência de liberação de GH.20 Comparar o teste da clonidina realizado com a admi nistração oral de uma dose de 0.

/S? : : . N. n? EKERCA Í:I.CLEA?.\ E..V - CASUÍSTICA ••: MAC-:: .. .

9 e 17.statada uma estatura abaixo da média para sexo e idade. Dezenove pacientes que se apresentaram com forte suspeita clinica de déficit de GH foram Internados por aproximadamente 5 dias na enfermaria da Divisão de Clinica Médica I do HC-FMU3P.5 anos.5 desvios-padrões (DP). com Idade entre 2. variando entre 1. Em todos. laboni torial e radiolõgica realizada neste período. Os outros 12 pacientes foram estudados a nível ambulatorial. sendo toda a avaliação clinica. compietando-se a investigação diagnostica em um período máximo de 4 meses. foi ccr. que procuraram o Serviço de Éndocrinologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC-FMUSP) com queixa de déficit de crescimento.3 e 8. sendo 22 do sexo majs culino e 9 do sexo feminino.Foram estudados 31 pacientes. .

VI - MATERIAL E MÉTODOS .

fraqueza Muscular. peso. creatinina. dispnéia. nictúria. giicemia de jejum. poliúria.iia. potássio. sinais de raquitismo.25 sença de cefalêia. tosse. polidipsia. hematúria. uréia. de Cushing ou de déficit de 6H. as quais avaliados foram e utilizadas para o calculo dos respectivos desvios-padrões idade estatura!. desmaios. as te. de hipotireoidismo. edema. (45). cllcio. AVALIAÇÃO LABORATORIAL E RADIOLÕGICA GERAL Os exames laboratoriais gerais Incluíram hemograma completo. presença de estigmas somáticos. cianose. tamanho de pènis e testículos. 1.relação púbis-vértex/púbis-chão. disúria. presença de pelos axilares e pu bianos. dores ôsteo-articulares. sonolència e intolerância ao frio. Os graus de pubarca e teiarca foram clas- sificados de acordo com os parâmetros de Tanner (46). distúrbios neurológicos. A estatura e o peso dos pacientes foram segundo as tabelas de Marques e coi. f) exame ffsico: altura (média de 3 medidas feitas por UM único médico era estadiôraetro construído de acordo con as recomendações de Underwood e Van Hyk (74)). anormalidades cardio- -respiratórias e gastrointestinais. convulsões. caimbras. alterações visuais. verminose. dosagens séricas de sódio. diarréia. desenvolvimento mamãrio. proteínas totais.2. . albumina.

deixado em repouso por 3 horas a . TESTES FARMACOLÓGICOS DE ESTÍMULO Todos os testes Mveram início is 8:00 horas da »£ nhi. parasitolõgico de fezes e eventualmente cariôtipo. 1. sendo a punçlo realizada pelo menos 60 minutos antes da primeira coleta.4. tiroxina (T.) em meninas foram realizadas em todos os pacientes.).26 fósforo. For»» também realizados Rx e de tõrax. Niveis sêricos basais de hormônio luteinizante (LH) e hormônio foiiculo-estimulante (FSH) foram determinados apenas nas meninas púberes. Amostras seriadas de sangue foram coletadas através de veia canuiada com "butterfly"» mantida com solução fisiológica 0.91. 1. Rx de crânio para visualização da sela türcica Rx de *5os e punhos para avaliação da idade õssea conforme o Atlas de Greulich & Pyie (29). te£ tosterona (T) em meninos e estradiol (E. urin» tipo 1 . U a paciente foi submetida a m tomografia computadorizada de crinio.3. triiodotironina (T ) . com o paciente repousando em decúbito dorsal por pelo menos 1 hora e em jejum por um período mínimo de 8 horas. tireotrofina (TSH). AVALIAÇÃO HORMONAL BASAL Dosagens séricas basais de somatomedina C (SmC). 0 sangue para dosagen5 hormonais foi colocado •m tubo de vidro simples. fosfatase alcalina.

1 U/kg de peso. os quais foram encaminhados ao laboratório Imediatamente após o término do teste.A.30. glicernia e cortisol (este último determinado apenas em pacientes com sus peita clinica de panhipopituitarismo) foram coletadas nos tem pos de . Montes Claros. a seguir. MG) na dose de 0. sendo realizada. 0. tendo-se sempre 3 disposição solução de glicose h1 per tônica a 50X (20 m U a qual era sistematicamente Injetada por via endovenosa no final do teste ou durante este se ocorresse perda de consciên cia. a administração endovenosa em bolo de insulina simples (U-40 Biobrãs . . a) TESTE DE . centrifugado a 1000 rpm por 10 minutos. no tempo zero. 45.OLERÂNCIA À INSULINA (ITT) Amostras de sangue para dosagem de GH.. 30.temperatura ambiente para que houvesse retração do coágulo e. Foram ntonitorizados sintomas e sinais de hipoglicemia durante todo o teste. aliquotado em volumes de 1 a 2 ml e congelado a -20°C até a hora do ensaio.Bioquímica do Brasil S. A coleta de glicemia durante o teste de tolerância i insulina foi realizada em tubos contendo fluoreto de sódio. 60 e 90 minutos. 15. 0 soro foi então separado.

Seguiu-se lavagem da seringa com ãgua por 2 vezes para remoçio de possíveis resíduos da droga retidos nas paredes de plástico. sendo a igua aspirada e administrada ao paciente da mesma maneira que a solução de clonidina. a adminis— . 90 e 120 minutos. sendo a clonidina administrada por via oral. 0. 45 e 60 minutos. no tempo zero. De Angeli. SP) foi esmagado e dissolvido em 10 ml de ãgua resultando eu solução de 0. Medidas do pulso e pressão arterial foram realizadas em cada tempo do teste.28 b) TESTE DA CLONIDINA Amostras de sangue para dosages de 6H foram coleta das nos tempos de -30. Itapecerica da Serra. O comprimido de 0. na dose de 0.1 mg (Atensina 0. 0 volume correspondente è dose calcula da para cada paciente foi então aspirado em seringa de plástico e injetado diretamente na boca. no tempo zero. sendo realizada.1 mg. 30.01 mg/rol. c) TE8TE DO HORMÔNIO LZBERADOR DO TSH (TRH) ASSOCIADO AO TESTE DO HORMÔNIO LIBERADOR DAS GONADOTROFINAS (LHRH) Amostras de sangue para dosagem de LH. TSH e proiactina (PRL) foram coletadas nos tempos de -30. 15. FSH. 30. sendo também observados quaisquer outros efeitos colaterais. 60. 0. solicitando-se ao paciente que succionasse e engolisse todo o liquido durante o pro cedimento.0375 mg/m* de superfície corpõrea.

1. SP).. um ensaio adequado is CC. ü E Ef. 2. ao passo que o teste de do TRH associado ao LHRH só foi realizado naqueles com suspeita clinica de panhipopituitarisao. São Paulo. . Todos os pacientes fora» submetidos aos testes tolerância i insulina e clonidina. de Todos os aspectos da técnica foram cuidadosamente analisados e coji troiados de modo a se obter. prestou-se particular atenção ao ritmo de crescimento e início ou evolução do desenvolvimento puberal.5. no final.V. DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS SÉRICOS DE 6H Todas as dosagens de 6H foram realizadas em triply cata por método de radioimunoensaio (RIE) desenvolvido a pajr tir de reagentes Inteiramente preparados no Laboratório Pesquisas da Divisão de Clinica Médica I do HC-FMUSP. SEGUINENTO AHBULATORIAL Todos os pacientes foram avaliados em ambulatório a cada 3 meses por um período mínimo de 6 meses.-:«'. SP) associado na mesma seringa a 100 | g i de LHRH (Ayerst.tração endovenosa em bolo de ZOO ug de TRH (Escola Paulista de Medicina.. 1..• . Nestas consul^ tas.ERC A r • ^ f ^ / s • : . São Paulo.. METODOLOGIA LABORATORIAL 2.

Extração e purificação do GH-HC 0 6K utilizado na preparação de padrões p£ ra radiolodação e curva de deslocamento (a seguir designado GH-HC) foi extrafdo a partir de um lote de 100 hipófises con geladas. cujo pH foi ajustado a 8. foi segui da de homogenização em liqüidificador durante 3 minutos com 200 ml de tampão Tr1s-fosfato (50 mM Tris. baseado no método de Chapman e col. com agitação constante. coletadas durante autópsias de rotina pelo Serviço de Anatomia Patológica da FHUSP.3 pela adiçlo de 4cIdo acético • 50X. previamente obtidas de cadáveres humanos.5 (ajustado com NaOH) e submetido aos mesmos processos das etapas anteriores. realizada a 4*C assim como todas as demais etapas. foram conservadas a -20°C. Os sobrenadantes das frações foram combinados. A suspensão foi então centrifugada . 10 mM Na 2 HPO 4> 5 mM EDTA.7 com HC1 concentrado (Fig. SP) por 2 horas e depois centrifugado a 10. filtrados em li de vidro e o pH re duzido a 6. envoltas individualmente em papel alumínio até o seu processamento. A dissecção das glândulas. (6) com pequenas modificações (53).000 g por 1 hora. As hipófises. 0 precipitado foi retomado. ]).1.30 finalidades deste projeto.. rehomogeneizado com 60 «1 de tam pão Tris-fosfato pH 9.1. 0 homogeneizado foi colocado em agitador magnético (Fanem Ltda. gota a gota. São Paulo. 2. 1 mH feniimetanossulfonilfluoreto).

9 PRECIPITADO E DISSOLVIDO EM TAMPÃO TRIS-ACETATO 50mM pH 8.S E PRL I PRECIPITADO p RETIRADO RESÍDUO DE ETANOL COM TAMPÃO TRIS-ACETATO 50mM pH 4 . « „ « . PRECIPITAÇÃO ISOELETRICA EM pH 4 . 9 REALIZADA EM ETANOL ( 1 = 7 ) u PRECIPITADO C COLETA .. ACÉTICO A 5 0 % .7 (CONTENDO 1. lOmM No 2 HPO4 . 3 I CONGELAÇÃO DO GH A . 0 COM AC.31 HIPÓFISES DISSECADAS I HOMOGENEIZADOS EM TAMPÃO TRIS-HCL 5 0 mM pH 8.« „ SOBRENADANTE E 1 l SOBRENADANTE RESÍDUO INSOLUVEL FILTRAÇÃO EM SEPHADEX G-IOO PROTEÍNAS DE ALTO PESO MOLECULAR P|CO ' h e H PIC0 DEh 6 H CROMATOGRAFIA EM DEAE CELULOSE GH ELUÍDO EM TAMPÃO ACETATO DE AMÕNJA 2 0 0 mM pH 8 . «. 1 .ESQUEMA RESUMIDO DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO DO GH-HC .1 9 8 » C FIG. .0 mM FENILME TILSULFONILFLUORETO.5mM EDTA) SOBRENADANTE A r RESÍDUO A REEXTRAIDO SOBRENAOANTE B RESÍDUO B i n I COMBINAÇÃO SOBRENADANTE A + B PRECIPITAÇÃO EM pH 6 .. FILTRADO E CONCENTRADO EM MILLIPORE SOBRENADANTE D COLETAM-SE AS 6 30PR0TEÍNAS .»*.5.

FSH. A fração sobrenadante foi decantada e separada para eventual extração de LH. A solução resultante foi filtrada e concentrada utilizando-se Membrana de Millipore 10 K a um volume de 90 ml. sendo o precipitado separado para eventual extração da prolactina.000 g.9 com HC1 concentrado contendo etanol 12. previamente equi.5 contendo ciortw tanol 0. Esta fração homogeneizada foi adicionada ao sobrenadante anterior e centrifugada a 8. cujo pH foi ajustado a 4. A solução resultante repousou então por 12 horas antes de ser centrifugada a 15. de icido acêtico a 50X e etanol absoluto (volume 1:7).5%. gota a go ta. 0 precipitado.5.000 g por 1 hora. Suécia). A suspensão foi então centrifugada a 15.100 (PharMacia Fine Chemicals. A eluição foi realizada com este Mesmo tampão (fluxo 75 ml/min) e o efluente da coluna monitorizado com .32 por 18 horas a 8. üpsalla. librada com tampão Tris-acetato 50 mM pH 8. que continha o 6H. TSH e lipotrofinas.. seguida de decantaçio do sobrenadante e ressuspensão do precipitado com 50 ai de tampão Tris-fos fato cujo pH foi ajustado a 6. foi lava do C O M 50 ml de tampão Tris-fosfato.000 g por 1 hora e o precipitado dissolvido em 500 ml de tampão Tris-acetato 50 mN pH 8. A fração sobrenadante foi aplicada a uma coluna (5 x 100 cm) de Sephadex 6.000 g por 1 hora.3 con HC1 concentrado. 0 pH do sobrenadante foi reduzido a 4.000 g por 1 hor?. coa agitação constante.9 pela adição seqüencial. o qual foi centrifugado a 15.021.

2A). obtendo-se em média um de 1. NJ.5 (fluxo 80 ml/hora) em um gradiente crescente de concentração até 200 mM. o efluente da coluna de Sephadex foi conectado diretamente a outra coluna (2 x 60 cm) de dietilaminoetil ce lulose DEAE .05 M pH 8. 0 conteúdo de uma destas alíquotas foi sub metido a testes de controle de qualidade que consistiram em: a) determinação da concentração de proteínas pelo método de Schacterie & Pollack (68).c 52 (Whatman. Quando o GH nonõnero começou a ser eluido. Apôs receber o 6H.000 até valor 1/3.15 mg/ml. Clifton.46 mg/ml. utilizando-se 6 diluições progressivas (1/200. EUA).3. 2B). a coluna foi lavada com 350 ml de tampão acetato de amônio 50 mM pH 8. preequilibra da com tampão acetato de amorno 0. Quando o pico principal do GH começou a ser eluido. aliquotada em volumes de 0. Los Angeles.33 absorb&ncia a 280 nm (Fig.000 em tampão de ensaio) como amostras desconhecidas e obtendo-se em média um valor de 1. mantendo-se o mesmo volume e monitorizando-se o efluente com absorbãncia a 280 nm (Fig.1 ml e congelada em ni trogênio líquido (-198°C).200. CA. b) quantificação do GH-HC por "kit" comercial de RIE (Diagnostic Products Corporation. a em sua fração central (8 ml) foi coletada em frasco imerso gelo seco. c) estimativa da atividade biológica do GH-HC por método de . EUA).

34 ABSORBANCIA ABSORBANCIA Inn) 100 • 90 60 70 60 50 : 40 30 20 10 (nm) t \ \ / \ MONO MERO 100 »0 80 FRAÇÃO CENTRAL COLETADA r~i í\ 1\ / \A 70 60 50 • 40 30 20 • 10 IDÍMERoA U 7\ 1000 (A) ^ V y J / ^V 100 (B) \ x. 2 . 200 2000 VOLUME (ml) VOLUME (ml) FIG.c 52 ( B).IOO(A) E EM D E A E . .CR0MAT06RAFIA DO GH-HCEM SEPHADEX G.

a qual demonstrou ter o GH-HC padrão de isohormônios com predominância forma fl semelhante ao do GH-NIH. EUA): TSH < 3 uUI/ral. EUA (GH-NIH) por ele troforese em gel de poliacrilamida (8). St Louis. uma alíquota foi descongelada e utilizada para: a) preparação de padrões para radioiodação contendo 5 ug de GH em 50 ul de tampão fosfato (TF) 0. b) preparação de padrões para curva de deslocamento contendo 1 ug de GH em da 1 ml de tampão borato (TB) 0. cujo re sultado foi de 2. MD. d) comparação do GH-HC com padrão fornecido pelo National Institutes of Health. Cambridge. Sygma Chemical Company.1 U/ml. MA. Neste perfodo. EUA) e azida sôdica 0.2 M pH 7. mo dia utilizados para marcação e a seguir desprezados.1% (a seguir designa do tamplo de ensaio). A cada 45 dias aproximadamente. e) determinação da contaminação por outros hormônios hipofi sérios através de "kits" comerciais de RIE (Clinical Assays.35 radiorreceptor em fígado de mulher grávida (10). . Bethesda.5 com albumina séHca bovina (BSA. PRL = 3 ng/mg. FSH * 82 mUI/mg e LH = 641 mUI/mg.5 ml e congelados a -20*C por 30 dias. MD.1 M pH 8. Estes foram no mes. 0 GH-HC foi conservado em nitrogênio liqui do por um período de 9 meses. Estes foram aliquotados em volumes de 0.4 preparado com fosfato de potássio monobásico.

RJ) contendo 1. A eficiência de radioiodação foi determine da de maneira grosseira pelo denominado teste do carvão.4) homogenização final da mistura. 2.. 50 ul do padrão para radioiodação (preparado no mesmo dia) 125 contendo 5 ug de GH-HC.2 M pH 7.4 ml de tampão e . no qual 1 ul do material radioiodado. Radioiodação do GH-HC A radioiodação do GH-HC foi realizada de acordo com o método clássico de Greenwood e Hunter (27) com apenas algumas modificações (51).diluído em 2.2 M pH 7. Procedeu-se então a nova agitação suave por 10 segundos antes da adição de 0.4 mg/ml em TF 0. 10.5.25.e 1 mC1 de I sob a forma de lodeto de sódio livre de carreador (Amersham International plc.4. em tubo de vidro 12 x 60 mm. Após homogenização.0 mg/ml em TF 0.0. Inglaterra).A.1. sendo todas desprezadas apôs o término do RIE. 20 e 40 ng/ml de GH "frio" em tampão de en saio. Rio de Janeiro. foram pipetados 20 ul de solução de cloramina T (Merck S. adidonaram-se seqüencialmente. Buckinghamshire.2 M pH 7.2. com no mínimo 100 mC1/ml.36 uma alíquota foi descongelada na hora de cada ensaio utilizada para a preparação de soluções contendo e 1. 5.4. seguidos de agitação suave por 10 segundos e adi^ ção de 20 pi de solução de metabissulfito de sódio (Merck) contendo 2. 2. Em cada processo de marca ção.2 ml de solução de lodeto de sódio (10 mg/ml em TF 0.

a eluição foi iniciada com TB 0. LKB.75 zada em coluna de vidro (1 x 55 cm) contendo Sephadex (Pharmacia) deareada e previamente equilibrada com TB 0.. sendo os primeiros 6 ml do eluTdo desprezados. logo após sua penetração no Sephadex.05 M pH8. A seguir.1%.1 N pH 8.5 ml de suspensão de carvão (carvão Merck a 100 mg/ml em TB 0.6 com BSA 0.37 de ensaio.1* e azida sõdica 0. Bromma.foi adicionado em duplicata a 0.3 ml de solução de lodeto de sódio (10 mg/ml). Apôs horaogenização em "Vôrtex" e centrifugação por 15 minutos a 1000 rpm. 0 restante foi coletado em alíquotas de 1 ml a cada 2 minutos (2070 Ultrorac II.1% e azida sódica 0. Beckman Instruments Inc. Suécia) em 80 tubos de vidro (15 x 100 mm) contendo 0.1 ml de solução de .1%. Considerou-se uma boa eficiência de marca ção quando 60X ou mais da radioatividade total encontrava-se no precipitado (correspondente ao GH-HC 1 25 I).5 ml/minuto. Todo o conteúdo do tubo de radioiodação foi colocado no topo da coluna e. A cromatografia do GH-HC - I foi realiG.05 H pH 6.6 com BSA 0. Irvine. CA. com fluxo de 0. o teste do carvão de permitiu também escolher o material com maior eficiência marcação. Como.5). EUA). o qual foi em seguida submetido a purificação. o sobrenadante foi separado do precipitado por decantação e a radioatividade de ambos determinada em contador de cintilação de poço (Gamma 4000. foram adicionados 0. em cada processo. 2 alíquotas do mesmo padrão de GH-HC foram si multaneamente submetidas a radioiodação.

125 I p u j rificado consistiu em: *) DETERMINAÇÃO DO GRAU DE CONTAMINAÇÃO POR TESTE DO CARVÃO 1 25 I LIVRE PELO Este teste foi realizado da mesma maneira que antes da cromatografia.1X.1 2 5 I integro. I integro e o segundo ao Praticamente não foi observado pico de agregados do hormônio Marcado. Os conteúdos dos tubos que acusaram as 3 maiores ati vidcdes no primeiro pico foram misturados de modo a se obter. Para que o hormônio marcado fosse conside_ rado de boa qualidade.05 M) pH 8. 0 controle de qualidade do GH-HC .38 BSA 21 em TB 0.4 ml de tampão de ensaio ã suspensão de carvão.Í 2 5 I diluídos em 2. 2 picos foram constatados: pondendo ao 6H-HC o primeiro corres I livre. só que agora adicionando-se 10 ul de GH-HC . 3 ) . . a porcentagem de radioatividade total 125 presente no sobrenadante (correspondente ao I livre) deve ria s1tuar-se abaixo de 20X (51).1 ml e congelado a -20°C por um período de 30 dias. Apôs construção do gráfico expressando a distribuição da radioatividade ao longo do volume eluído (Fig. aliquotado em volumes de 0. A radioatividade dos 80 tubos foi determinada por contagem de 10 | l do conteúdo de cada tubo em dete£ i tor de cintilação gama. 3 ml de GH-HC . a seguir. Este foi.6 con azida sódica 0. no final.

3-CROMATOGRAFIA DO G H .75.H C .I 2 5 I ÍNTEGRO 60 60 VOLUME (ml ) FIG.I 2 5 I EM SEPHADEX G. .39 CP» . (XIO3) G H .H C .

Se- guiu-se a centrifugação a 3000 rpm por 30 minutos a 4*C e de cantação do sobrenadante.consistiu na adição de 1.utilizado neste co«o em todos os demais ensaios deste projeto.05) 125 I PELO Os seguintes reagentes foram Incubados. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: tampão de ensaio (100 pi). 1/50 e 1/25 em tampão de ensaio. em triplicata. 1/75. Após contagem do precipitado. Sygma). o foi grau de ligação máxima do hormônio mar ado ao anticorpo determinado pela razão (radioatividade do precipitado/radio^ tividade total x 100). devendo situar-se acima de 80% que o GH-HC 125 I fosse considerado de boa qualidade. pre parada em tampão de ensaio sem BSA e conservada a 4°C.0 ml de solução de polietilenoglicol a 17X (PEG S000. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) concentrações crescentes de hormônio marcado (100 ul de solu_ çôes 1/100.49. 0 método de separação do complexo antfgeno -anticorpo do antfgeno livre. em triplicata.40 b) AVALIAÇÃO DA IMUNORREATIVIOADE MAXIMA DO GH-HC PELA ADIÇÃO DE EXCESSO DE ANTICORPO 125 I Os seguintes reagentes foram incubados. para C) ESTIMATIVA DA ATIVIDADE ESPECÍFICA DO GH-HC MÉTODO DO AUTODESLOCAMENTO (25. cujas &ti_ . I (100 pi de solução 1/200 em tampão de ensaio). (1) (2) anti-soro 72 (100 ul de solu (3) GH-KC 1Z5 ção 1/1000 em tampão de ensaio).

20 e 40 ng/ml em tampão de ensaio). respectivamente. Em 3 tubos (N5B). (2) anti-soro 72 (100 pi de solução 1/90. A seguir. NSB * radioatividade do precipitado correspondente ao NSB. Todos os tubos foram contados antes e apôs precipitação com PEG para determinação da radioatividade total e do precipitado.000 em (3) GH-HC 125 tampão de ensaio). foi calculada para cada padrão de GH "frio" e amostra desconhecida pela equação: B T onde: Bi (ou Bn) * radioatividade do precipitado correspondente ao padrão 1 ng/ml de GH "frio" (Bi) ou & desconhecida n (Bn). incubou-se tampão de ensaio (200 pi) e hormônio marcado (100 pi) determinação da ligação inespecffica. 4.25. I (100 | l de solução 1/200 i apenas para em tampão de ensaio). 10.41 vidades foram previamente determinadas.0. 5. 2. a seguir denominadas amostras desconhecidas) e de hormônio "frio" (100 pi de solu ções contendo 0. tubo amostra Bi (ou Bn) . 1. T * radioatividade total.NSB T x 100 . a razão ra dioatividade ligada/radioatividade total (B/T). utilizada p^ ra construção da curva dose-resposta da Fig.5.

0 10 20 40 LOG [ 6 H ] (ng/ml) FIG.25 2.CONCENTRAÇÃO DEGH-HC.I 2 5 I PRESENTE NA AMOSTRA DESCONHECIDA 1. 4 .5 5.CAlCULO DA MASSA DE GH-HC J 2 5 I PRESENTE EM UMA AMOSTRA DESCONHECIDA PELA TÉCNICA DO AUTO-DESLOCAMENTO. .

correspondente ao tubo NSB). 5. as porcentagens de ligação total (XBo total). sua «assa. Foi possível. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) tampão de ensaio (100 ul). d) DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE DO GH-HC. (3) GH-HC-125I (100 ul de solução 1/200).1 2 5 ! 4°C E A -20»C CONSERVADO A Os seguintes reagentes foram incubados. correlacionar a massa e atividade do traçador presente em cada amostra e construir o grafico da Fig. (2) anti-soro 72 (100 ul de s o U ção 1/90. em triplicate.foi entio determinada por interpolação de suas respectivas razões B/T a partir da curva dose-resposta.43 A concentração do hormônio Marcado e. dessa Maneira. correspondente ao tubo Bo) ou tampão de ensaio (100 pi. inespe cffica (XHSB) e especifica (XBo especifica) foram calculadas pelas equações: . conseqüentemente.000. a partir do qual a atividade especifica foi calculada pela reciproca da inclinação da reta obtida por regressão linear simples. Apôs separação com PEG e contagem do precj^ pitado. presente nas diferentes amostras desconhecidas.

0 4#0 6.985 • / 6.0 r« 0. 2.0 y^ r ATIVIDADE ESPECÍFICA» — • i i i V 1 ».I 2 5 I E SUA RESPECTIVA MASSA DETERMINADA PELA TÉCNICA DO AUTODESLOCAMENTO.0 2.MASSA DO TRAÇADOR 8.0 8. 5 -RELAÇÃO ENTRE A ATIVIDADE DE UMA AMOSTRA DE G H .0 4.10'2) FIG.H C .0 10 ATIVIDADE DO TRAÇADOR (jiCi. .

sendo desprezadas após o término deste. sendo esta redu Ção U M pouco «ais acentuada a 4*C do que a -20"C. por esta razão.IB o total . por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) padrões de GH "frio" (100 pi de soluções contendo desde 0 até 40 ng/»l>.000).XNSB Medidas seriadas ao longo de 30 dias após radiolodação (Fig. 6) revelara» uma redução lenta e discreta dos 3 parâmetros ao longo de todo o período. (2) anti-soro 72 (100 ui de solução 1/90. as alíquotas de 6H-HCI conservadas a -20*C passara* a ser descongeladas e diluídas apenas na hora do ensaio.125 I . Estes dados demonstrara* uaa aaior perda de Imunorreatividade do h o m ô nio «arcado a 4*C e. (3) GH-HC.4$ radioatividade do precipitado do tubo Bo XBo total « radioatividade total x 100 radioatividade do precipitado do tubo RSB MSB = x 100 radioatividade total « o específica . «) COMPARAÇÃO DO GH-HC - 12 *I COM GH-NIH - 125 I (PREPARAÇÃO PARA RADIOIODAÇAO FORNECIDA PELO NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH E MARCADA NO HC-FMUSP) 0s seguintes reagentes foram Incubados» em triplicate.

6 .LI6.VARIAÇÃO DA PORCENTAGEM DE LIGAÇÃO TOTAL ( • ) . 80 46 60 4O 20 10 15 20 25 30 DIAS PO'S RADIOIODAÇAO DO GH-H( (A) %DE LI6. INESPECÍFICA ( • ) E ESPECÍFICA ( â ) AO LONGO DE 3 0 DIAS APÔS RADIOIODAÇAO DO GH-HC COM ESTE CONSERVADO A 4 * C ( A ) OU A . . éo 60 40 20 5 10 15 (B) 20 25 30 DIAS POS RADIOIODAÇAO DO GH-HC FIG.2 0 * C ( B ).

1 2 5 I . o grau de contaminação com 125 I entre 4 e 15%. 7 ) . porisso. as curvas dose-resposta para cada hormônio marcado fo ram elaboradas e comparadas entre si (Fig. Em 3 tubos (NSBX incubou-se apenas tampão de ensaio (200 pi) e hormônio sarca do (100 |il). 0 paralelismo observado entre elas confirmou o comportamento do GH-HC 1Z5 idêntico I em relação ao GH-HIH . . GH-HC 125 I Não houve deterioração significante de n<e nhum destes parâmetros ao longo dos 9 meses. Indicando ser o nitrogênio liquido eficiente meio de conservação para o GH-HC. (76). o material rja dioiodado não foi submetido a purificação.47 OU GH-NIH - I (100 pi de solução 1/200).1. Em dois. Produção de anti-soro anti-GH A técnica de Imunização empregada para a produção de anti-soro anti-GH baseou-se primariamente no método de Va1tukat1s e coi. demonstrando a boa qualidade do para fins de RIE. Apôs separação com PEG e contagem do preci pitado. a eficiência de marcação determinada pelo teste do carvão foi inferior a 501 e. Nos outros 6 pro cessos. a imunorreativj^ dade máxima entre 82 e 94% e a atividade específica entre 124 e 157 uCi/ug. a eficiência de marcação situou-se entre 64 e 71%. um a cada 45 dias aproximada mente. 2. Oito processos de radioiodação foram reali zados em um período de 9 meses.3.

7 .RESPOSTA PREPARADAS COM GH -HC -'25l ( • .48 L06IT0 B/Bo (%) 80 50 20 1.* J E GH-NIN-125! (A-*).5 5.COMPARAÇÃO ENTRE CURVAS DOSE . .0 10 20 40 LOG [GH] (ng/ml) FIG.25 2.

Após raspagem dos pelos do dorso. O QUAL FOI DEFINIDO COMO A DILUI . foi realizada nova imunização nas mesmas condições que a primeira. A cada 3 semanas. seguido de separação do soro e diluição do mesmo com tampão de ensaio na proporção de 1:1. sõ que com emu Isão preparada com adjuvante incompleto Freund.emulsão contendo 3 mg de GH (Kabi Diagnostica. 3 coelhos da Nova Zelândia (idade média de 3 meses) foram imunizados. foi finalmente obtido um anti-soro (anti-soro 72). 0 sangue coletado foi deixado em repouso a 4°C por 48 a 72 horas para que houvesse retração do coágulo. Suécia). seguida de homogenizaçao em Vórtex e repouso por 24 horas a 4°C para confirmar a não separação das partes.inicialmente. cada animal recebendo 30 aplicações intradérmicas de 0. Apôs a quarta imunização de um dos animais. cujas excelen- tes características foram demonstradas pelos testes de c o n trole de qualidade. Procedeu-se entco 3 titulação do anti- -soro para se determinar a necessidade ou nãu de novas 1munj[ zações. correspondendo a 0. Estocolmo. Estes consistiram em: a) DETERMINAÇÃO DO TÍTULO. 9 ml de so lução salina e 6 ml de adjuvante completo de Freund.6 mg de 6H. Amostras de sangue foram colhidas através de da punçSo da veia central da orelha 10 dias após cada Imunização.1 ml da emu1 são em diferentes pontos do dorso.49 Preparou-se.

por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) concentrações crescentes de GH "frio" (100 pi de soluções cojt tendo desde 0 até 40 ng/mi). seja.50 ÇÃO FINAL DO ANTI-SORO CAPAZ DE LIGAR BOX DO (54) HORMÔNIO MARCADO EM CONDIÇÕES PRÉ-ESTABELECIDAS Os seguintes reagentes foram incubados.000) (2) anti-soro 72 (100 ul de so 125 e (3) GH-HC I (100 ul de soluçlo 1/200). Apôs separação com PEG e contagem do precj^ pitado.000 em 125 tampão de ensaio). b) CÁLCULO DA CONSTANTE DE AFINIDADE (K) PELO MÉTODO DE SCATCHARD (67) Os seguintes reagentes foram Incubados. luçío 1/90.000. (3) GH-HC I (100 ul de solução 1/200). incubou-se apenas tampão de ensaio (200 ul) hormônio marcado (100 pi). (1) (2) diluições progressivas do anti-soro 72 (100 pi de solução 1/30. os valores da %Bo especifica para cada diluição do e anti-soro foram calculados e expressos no gráfico da Fig. em triplicate. . 8.000 até 1/1. Em 3 tubos (NSB). 0 titulo do anti-soro 72 foi então determinado pela diluição final correspondente a 501 de ligação especifica. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: tampão de ensaio (100 ul). Em 3 tubos. ou 1/640. em triplicata.920. Incubou-se apenas tampão de ensaio (200 pi) e hormônio marcado (100 ul).

8-CURVA DE TITULAÇÃO DO ANTI-SORO 72. .51 % DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA 70 30 20 10 TITULO DO ANTI-SORO O o o 6 C D — o o _O d fO o o o o o o d ~d C M — O O O -d CD o o o -d C O oi DILUIÇÃO FINAL DO ANTI-SORO (LOG) FIG.

T ' radioatividade total. respectivamente.1 .52 Todos os tubos fora» contados antes e após precipitação com PEG para determinação da radioatividade total e do precipitado.(Bi-NSB)] (Bi-NSB) b » concentração de GH "frio" x onde: Bi * radioatividade do precipitado correspondente â concentração 1 ng/ml de GH "frio". de 2 K reta . Os parâmetros radioatividade ligada/radioatividade livre (B/F) e concentração de hormônio ligado ao anticorpo (b) forem calculados para ca da padrão de 6H "frio" pelas equações: B F (Bi .NSB) IT . 9 ) . NSB = radioatividade do precipitado correspondente ao tubo NSB. • A partir do grafico relacionando estes parâmetros (grafico de Scatchard. IO 1 0 l/mole) foi determinado pela inclinação da obtida por regressão linear simples. Fig. o valor (2.

DETERMINAÇÃO DA CONSTANTE DE AFINIDADE ( K ) PELO GRA'FICO DE SCATCHARD.0 1.IO* 12 ) FIG.S3 B/F 2.985 1.5 r= 0. .0 0. 9 .5 25 50 75 100 b(Mol/I.

por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) concentrações crescentes de hormônio "frio" em tampão de ensaio (100 ui) tais como 6H (0 até 40 ng/mi). . Após separação com PEG e contagem do preci^ pitado.54 c) DETERMINAÇÃO DA IMUNORREATIVIOADE CRUZADA COM PADRÕES PUROS DE LH. PRL E HORMÔNIO LACTOGÊNICO PLACEN TÂRIO (HPL) FORNECIDOS PELO NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH (PREPARAÇÕES PARA RADIOIODAÇÃO) Os seguintes reagentes foram incubados.000 ng/ml cada um).i) «arcado 6H-HC . HPL (até 10. TSH (até 2500 ng/ml). FSH e PRL (até 2.000) e '. FSH. TSH. e» triplicate.1 2 5 I (100 ul de solução 1/200) e hormônio (100 ul). o grau de inibição da ligação maxima (B/Bo) foi d e terminado para cada hormônio pela equação: B — « (Bi-NSB) r x 100 Be (Bo-NSB) onde: BI • radioatividade do precipitado correspondente i concentração 1 ng/ml de hormônio "frio". Bo * radioatividade do precipitado correspondente i concentração zero.000 ng/ml) e LH. (2) anti-soro 72 (100 ul de solução 1/90. NSB « radioatividade do precipitado correspondente ao tubo NSB.

55 A porcentagem de imunorreatividade cruzada do anti-soro 72 para cada hormônio foi então determinada pela razão entre a concentração de 6H "frio" e a do hormônio estu dado necessárias para provocar 50% de inibicão ( 2 ) . conservadas a 4°C e utilizadas nos ensaios durante este período. Este agente provoca a redução da quantidade de Sgua livre do sistema. uma foi re constituída e diluída 1/10 em tampão de ensaio.4.3X. As características do anti-soro 72.1 ml e recongelada a -20°C.3X.1. PRL . descrita em 1971 por Desbuquois e Aurbach (14).U. soluções 1/90.3t.1 ml foram liofilizadas e pos teriormente conservadas a -20°C. resultando em diminuição da solubilidade e precipitação . comparáveis âs descritas na literatura para anticorpos anti-GH de comprovada eficácia (50). B/Bo * 50X (Fig. realiquotada eu volumes de 0. 10). confirmaram a sua excelente qualidade. HPL < 0.000 em tampão de ensaio foram preparadas a cada 30 dias. Método de separação do complexo antígeno-anticorpo do antigeno livre A separação do complexo antígeno-anticorpo do antigeno livre foi realizada pela técnica do polietilenoglicol. 2.0. Os seguintes valores foram encontrados: LH < 0. A cada 6 meses. permitindo que ele fosse utilizado em todos os ensaios deste projeto.6*. Alíquotas de 0. FSH < 0. TSH < 0. A partir destas últimas alíquotas. ou seja.

.0.5 5.DETERMINAÇÃO DO 6RAU OE IMUNORREATIVIDADI CRUZADA DO ANTI-S0R0 72 COM A PRL.6 % LOG 1 TO B/Bo(%) PRL 20 1.25 2.imunuirnc Ml IVIUAUt .0 10 20 40 250 500 1000 2000 LOG [ H ] (ng/m.) FIG. CRUZADA Ill4ng/ml X 100 . 1 0 .

000.0 ml do mesmo imediatamente apôs adição soro humano (100 ul). por 20 a 24 horas a temperatura ambiente. precipitação foi realizada com diferentes concentrações nais de PEG (2 a 20%) diluído em tampão de ensaio sem ao A fiBSA. correspondente tubo NS6). dos seguintes reagentes: (1) tampão de ensaio (100 ul). correspondente ao tubo Bo) ou tampão de ensaio (100 ul. o PEG foi escolhido como método de separação. (3) GH-HC . eficiente do complexo antigeno-anticorpo do antígeno livre. como é o caso do RIE de senvolvido neste projeto. Uma vez contados os precipitados. 0 grau re lativamente alto de ligação inespecífica. Inespecífica e especifica foram determinadas para cada concentração de PEG e expressas . de p1petando-se 1. ao invés de técnicas mais so fisticadas tais como precipitação com segundo anticorpo. promover a separação instantânea e e. A concentração de PEG a ser adicionada ao as ensaio foi determinada por experimento que consistiu na incu bação em triplicata. não parece comprometer signi ficantemente a precisão de ensaios em que a capacidade de li gação total é maior do que 50X ( 7 ).1 2 5 I (100 ul de solução 1/200). Por estas razões. (2) anti-soro 72 (100 ul de solução 1/90.57 do complexo antfgeno-anticorpo ( 7 ). Suas principais vantagens consistem em ser um método simples e de baixo custo no caso do GH. quais exigem maior custo e complexicidade. as porcentagens de ligação total. citado como a prin^ cipai desvantagem deste método.

. II-VARIAÇÃO DA PORCENTAGEM DE LIGAÇÃO TOTAL ( • ) .% DE LIGAÇÃO 60 50 40 30 20 10 4 8 12 16 20 CONCENTRAÇÃO FINAL DE PEG (%) FIG. INESPECÍFICA(o) E ESPECÍFICA ( â ) EM FUNÇÃO DA CONCENTRAÇÃO FINAL DE PEG.

_J..j. . inespecffica e especifica foram calculadas para cada volume de soro adicionado an tes do PEG e expressas no grafico da Fig. 11. Por esta razão.IX. aumentando substancialmente após adição de 25 pi de soro. de monstrando não haver vantagem alguma em se utilizar concen- trações muito maiores do que 10X. _.0 ml de PEG (concentração final 12.0 g/dl. seguido da adição de 1.. r . sifilis e Chagas) foi acrescentado ã mistura de incubação em volumes crescen— tes variando de 0 até 200 pi.59 no gráfico da Fig. a concentração final de PEG foi fixada em 12. imunologicamente negativo para hepatite B.It). ao i i passo que a XBo especifica permaneceu praticamente constante. 12. A Influência da concentração proteica do valor •elo sobre o grau de precipitação do complexo antigeno-anticorpo provocado pelo PEG foi estudada em ensaio no qual realizou-se incubação idêntica ã do experimento anterior.^ I ••! •• "I- • -*^ "• •*• "' ' I l— I . Após contagem do precipitado. Na ausência de soro. sendo este utilizado em todos os ensaios deste projeto. Incrementos a partir deste volume resulta ram em aumentos progressivos da XBo total e XNSB. a precipitação do complexo antigeno-anticorpo com PEG foi multo pequena. o incremento da concentração de PEG acima de 10X resultou em aumentos muito pequenos da XBo espe cífica associados a elevações mais significativas da XNSB. as porcentagens de ligação total. Soro humano ("pool" com concentração proteica total = 7. Estes dados demonstraram claramente a necessidade de uma concentra _.L- .

12 . INESPECÍFICA ( © ) .30 20 10 50 100 150 200 VOLUME DE SORO ( j i l ) FIG. E ESPECÍFICA ( â ) EM FUNÇÃO DO VOLUME DE SORO ADICIONADO IMEDIATAMENTE ANTES DO PEG (CONCENTRAÇÃO FINAL 12. .VARIAÇÃO DA PORCENTAGEM DE LIGAÇÃO TOTAL ( • ) .1%).

des crito na Tabela I.0 g/dl) nos tubos correspondentes â curva-padrão (diluída em tampão de ensaio). antes do PEG. seria adicionado. Protocolo do RIE de GH A elaboração do protocolo do RIE de GH. foi estc*>e1ecido que. Com a finalidade de se igualar a concentra ção de proteínas séricas em todos os tubos de um determinado ensaio.61 çSo mini«a de proteínas séricas (1. sendo pipetados 100 ul de tampão de ensaio nos tubos correspondentes aos controles e amostras desconhecidas. CONTROLES E AMOSTRAS Um padrão de GH contendo 1 ug/ml (preparado no dia da radioiodação) foi descongelado na hora do RIE e diluído progressivamente em tampão de ensaio até obtenção de .1. Nos casos em que houvesse necessidade de diluir estas amostras com tampão de ensaio antes de sua dosagem. envolveu o estudo de diversos fatores: • ) PREPARAÇÃO DOS PADRÕES DE 6H " F R I O " . antes da precipitação com PEG. o 2.0 e 8.2 «g/ml) para que a preci pitação do complexo antigeno-anticorpo pelo PEG fosse comple ta. seriam acrescentados 100 ul de soro humano ("pool" com c o n centração proteica total variando entre 6.5. soro diluído em tampão de modo a completar volume de soro presente em cada tubo a 100 ul.

anílise dos dados obtidos atravfs do prograaa de coaputador RIA CALC.0 ng/»l) (padrio 10 ng/al) (padrio 20 ng/al) (padrio 40 ng/al) (a«ostra) (aaostra) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 1OO 100 100 100 (soro) (soro) (saro) (soro) Uor«) (soro) (soro) (soro) (taapio) (ta»pl>. de taapio d* ensaio/padrio/aaostra.0 1. anti-soro 72 e GH-HC.0 1.0 1.0 1.000) «u.Protocolo do RIE de GH Tubo Taapio/Padrio/Aaostra Anti-soro 72 (1/90. centrifugasio a 3000 rpa por 30 ainutos a 4»C. b) c) ú\ a) f) g) .62 Tabela I . ia triplicata.25 ng/al) (padrão 2.0 1. seguida de hoaojenização ea Vártex.I .5 ng/al) (padrio 5.0 1. eentagea do precipitado por 1 ainute ea detector de cintilaçlo gata.0 •SB Bo A B C D E F Controla Aaostra 200 100 100 100 100 100 100 100 100 100 (taaplo) (taapio) (padrio 1. adiçio seqüencial de taapio/soro e PEG. iocubaçio por 20 a 24 horas a teaperatura aabitnte.0 1. aspiraçio do sobrenadante. seguida de hoaogeninçâo ea Yírtei. a) adiçio seqüencial.0 1.c-mi (1/200) (pi) Taspio/Sora (Ml) PEG (in) (HD Total W) (•D 1.0 1.

63 todos os pontos da curva (padrões "frios" contendo 1. Desta solução.5. Alíquotas de 0.0. permitindo assim a repetição da dosagem caso esta fosse necessária. 20 e 40 ng/ml). 7 a 10 e 1 a 3 ng/ml. As amostras de soro a serem dosadas. 5. Após o término do ensaio. mantidas a -20°C desde a sua coleta.23 ng de traçado»* por ml da mistura de Incubação. .25.com concentrações de GH variando entre 20 a 25. 10. foram descongeladas no início do ensaio e recongeladas apôs o término deste. correspondendo * uma massa de 0. b) CONCENTRAÇÃO DO QH-HC - 125 I Uma solução 1/200 em tampão de ensaio foi preparada na hora do RIE a partir de uma alíquota de 100 ul de GH-HC I conservada a -20°C desde o dia da radioloda- ção. sendo ambas desprezadas apôs o término do ensaio. Os controles (alto. 2. médio e baixo). resultando em uma concentração f^ nal de 0.000 cpm. incluí^ dos no início e no final de cada ensaio.07 ng e a uma atividade aproximada de 15. foram preparados a partir de 3 "pools" obtidos pela mistura de soros previamente dosados. respectivamente. estas so luções foram todas desprezadas. sendo desprezadas a seguir. foi pipetjj do em cada tubo do ensaio.5 ml de cada controle foram conservadas a -20°C até sua utilização no ensaio. um volure de 100 ul.

13B).OOO. Baseado nesta premissa.7 ng/ml. situan do-se em nível igual ou inferior a 10% para concentrações de GK "frio" acima de 1.000 e 1/90.000 foi nitidamente superior â obtida com a solução 1/60. A sensibilidade. resultando em diluições finais do anticorpo de 1/180. também foi melhor com a 1/90.8 ng/ml) do que com 1/60.000 solução Estes resuitava foi em melhores características do ensaie e. definida como a dose mínima detectável. a diluição do anticorpo a ser utilizada em um determinado ensaio deve resultar em ligação específica ao redor de 651. respectivamente. A precisão intraensaio obtida com a diluição 1/90. As carac terfsticas das curvas dose-resposta assim obtidas (Fig.64 C) DILUIÇÃO DO ANTI-SORO ANTI-GH De acordo com Hunter (33).000 (1. as soluções 1/60.000 e 1/27O. fo ram incubadas com antígeno "frio" e marcado de acordo com o protocolo da Tabela I.000 do anti-soro 72. ela escolhida e utilizada em todos os RIEs de GH realizados neste projeto.3 ng/ml). dados permitiram concluir que a solução 1/90. . porisso.000 (0. cujas respectivas <Bo especifica correspondiam a 65 e 62X.000. 13A) foram comparadas pelos seus respectivos perfis de precisão (Fig. elaborados segundo os critérios de Rodbard (60).

13 .7 5.2 LOG [GH] (ng/ml) 1.8 21.000 ( * .4 (B) 10.000 ( • — ) DO ANTI-SORO 72.6 43.65 L06IT0 B/Bo(%) 80 50 20 5.2 LOG [ G H ] ( n 9 / m l ) FIG.4 (A) 10.35 2.CURVAS DOSE-RESPOSTA ( A) E PERFIS DE PRECISÃO (B) PARA RIEs DE GH REALIZADOS COM DILUIÇÕES 1/60.* ) E 1/90.6 43. .8 21.

Neste experimento. definido como a incubação do antigeno "frio" com anticorpo sem a adição do traçador. Por esta razão.7 e 0.000. respectivamente. comparadas com 0. A introdução de prê-i£ cubaçâo por 1 hora. (3) GH-HC . (2) anti-soro 72 (100 ul (1) tampão de solução 1/90. levou a uma redução muito discreta da dose mínima detectável (0. seguida de contagem do precipitado. Apôs diferentes períodos de Incubação (0 a 48 horas). realizada a temperatura ambiente ou a 37"C. o tempo de incubação necessário para que a reação atingisse o equílí^ brio foi determinado em diferentes condições de temperatura. os RIEs de GH deste projeto passaram a ser realizados sem perÍ£ do de pré-incubação. associada a urna piora Importante da precisão intraensaio para concentrações de GH "frio" acima de 10 ng/nl. Apôs adição do hormônio marcado. correspondente ao tubo Bo) ou tampão de ensaio 125 (100 ul. 14B). temperatura ambiente e a 37°C: de ensaio (100 ul). 0 cálculo da porcentagem de ligação . obtida sem período de pré-incubação).a 4°C.6 ng/mi. correspondente ao tubo NSB).em tr1p!1cata. os seguintes reagentes foram incubados. foi efetuada a separação com PEG.66 d) TEMPO DE INCU3AÇÃO As características das curvas dose-resposta elaboradas com e sem período de pré-incubação (Fig.9 ng/ml. 14A1.I (100 pi de solução 1/200). foram comparadas pelos seus respec tivos perfis de precisão (Fig.

.b/ao(%j 67 80 50 20 CV 1.5 5. .5 5.• ) .0 (A) 10 20 40 LOG [GH] (ng/ml) 50 40 30 20 10 1.CURVAS DOSE-RESPOSTA ( A ) E PERFIS DE PRECISÃO ( B) PARA RIEt DE GH REALIZADOS SEM PERÍODO DE PRÉ. 14 .INCUBAÇÃO ( — .25 2.) E COM PERÍODO DE PRÉ-INCUBAÇÃO POR 1 HORA A TEMPERATURA AMBIENTE (à-k) OU A 37° C ( • .0 (B) 10 20 40 LOG [GH] (ng/ml) FIG.25 2.

Em todos os ensaios (exceto os correspon- dentes ao cálculo da atividade especifica e da constante de afinidade). Este programa ba seia-se na transformação Iog1to-log. nestas condições. e a e) PROCESSAMENTO E ANÁLISE DOS DADOS OBTIDOS Os cálculos da curva dose-resposta e da con centração das amostras desconhecidas foram efetuados por um programa de computação denominado RIA CALC. a XBo especifica era maior XNSB permanecia em níveis aceitáveis. Gianeila (comunicação pessoal) em 1982. 15) permitiu concluir que (1) a reação atingiu o equilíbrio mais rapidamente a 37*C (12 horas) do que a 4°C ou a temperatura ambiente (16 horas para ambos). a curva dose-resposta foi ajustada a uma reta por regressão linear não ponderada a partir das equações: . inespecifica e especifica para cada tempo e temperatu ra de Incubaçâo (Fig.68 total. formulado por D. segundo os critérios pr£ postos por Rodbard e col. respectivamente). A partir destes dados. ficou estabelecido que a incubaçâo dos RIEs de 6H seria realizada a temperatura ambiente por 20 a 24 horas. (3) a XNSB durante incubaçâo a 4°C e a temperatura ambiente foi semelhante (ao redor de 16X). (2) a XBo especifica observada no equilíbrio durante incubaçSo a temperatura ambiente (47X) foi maior do que a 4* e 37°C (43 e 41X.51). mas inferior ã observada a 37°C (ao redor de 17. já que. (61).

INFLUÊNCIA DO TEMPO t TEMPERATURA DE INCUBAÇÃO SOBRE AS PORCENTAGENS DE LIGAÇÃO T O T A L Í O .69 4#C TEMPERATURA AMBIENTE 37 # C 10 20 30 40 50 10 20 30 40 50 10 20 3 0 40 51 HORA! FI6. 1 5 . INESPECÍFICA ( o ) . . E ESPECÍFICA ( A ) .

as curvas dose-resposta para cada hormônio foram compara ' •••• ! .1.6. Caracterização do RIE de GH a) COMPARAÇÃO COM PADRÃO INTERNACIONAL PARA DETERMINAÇÃO DE PARALELISMO E POTÊNCIA Em 3 ensaios diferentes. 2. Após separação com PEG e contagem do precipita do.70 Logito (B/Bo X) « a • b. Bo ou NSB = radioatividade do precipitado correspondente aos tubos Bo e NSB. concentrações crescentes de GH-NIH (preparação de referência fornecida pelo National Institutes of Health) e GH-HC "frios" foram Incuba125 das com anti-soro 72 e GH-HC I.logi B —% Bo Bi-NSB = Bo-NSB x 100 onde: BI = radioatividade do precipitado correspondente à concen— tração 1 ng/ml do padrão de GH "frio". respectivamente. As concentrações das amostras desconhecivalores das foram determinadas pelo cálculo dos respectivos logito (B/Bo %) e interpolação a partir da curva dose-respos ta. obedecendo ao protocolo da Tabela I.

71

das entre si para determinação de paralelismo (confirmada por inclinações idênticas das curvas) e potência. Esta última

foi calculada pela razão entre as concentrações de GH-HC e 6H-NIH necessárias para provocar 50% de inibição da ligação máxima, ou seja, B/Bo = 50% (21). A Fig. 16 mostra claramente o paralelismo entre as 2 curvas, confirmando o comportamento idêntico dos 2 hormônios. O cálculo da potência revelou ser o GH-HC, em média, 7% mais potente do que o GH-NIH, permitindo dessa maneira a calibração correta dos padrões "frios" de GH-HC.

b)

SENSIBILIDADE

A sensibilidade, definida como a dose mfnj^ ma detectávei (DHD), f o i determinada pela concentração de G H que resultou em valor B/Bo estatisticamente Assim, diferente do

obtido para a dose zero ( 1 5 ) .

'(Bo-NSB) - 2 DP
D D * concentração de G correspondente ao logito N H

(Bo-NSB) onde: Bo - média das contagens do precipitado em 9 replicatas tubo Bo; DP • desvio-padrão de B~õ; NSB « contagens do precipitado do tubo NSB. do

LOGITO B/Bo(%)

80

50

20

1,25

2,5

5,0

10

20

40 LOG [GH] (ng/ml)

FIG. 16-COMPARAÇÃO DAS CURVAS DOSE-RESPOSTA PREPARADAS COM PADRÕES DE GH - HC (•—•) E GH- NIH ( * ~ á ) "FRIOS*.

73

A sensibilidade, calculada e» 12 ensaios, foi de 1,1 + 0,08 ng/ml (média • erro padrão da média), do considerada adequada para o estudo dos testes de ção de 6H. sen

libera-

c)

PRECISÃO

A variação intraensaio intraamostra foi de terminada pelo perfil de precisão (Figs. 13B e 14B), elabora do de acordo com os critérios propostos por Rodbard (60). e col.

0 coeficiente de variação (CV) para uma determinada de hormônio "frio" foi calculado pela equação:

concentração

«y CVx = dy/dx onde: íy = desvio-padrão da resposta B/Bo correspondente à concentração x (determinada em triplicata); dy/dx • inclinação da curva dose-resposta no ponto correspo^ dente i concentração x> x 100

Em todos os RIEs de 6H, a variação ensaio situou-se em nível igual ao Inferior a 10X para centrações de GH acima de 1,5 - 2,0 ng/ml e permaneceu redor de 5% para valores entre 10 a 30 ng/ml,

intraconao

Intervalo que

A variação interensaio intraamostra calculada por dosagens repetidas dos controles baixo. definida como o grau interferência provocado por substâncias estranhas sobre de a reação antigeno-anticorpo.2 ng/ml. 4.3 e 25.3 no/ml). 8. resultando em valores de 19. foi estabelecida de acordo com os critérios propostos por Yalow & Berson (78): d ) Estudo dos efeitos não específicos do meio de incubação Uma possível dúvida surgida na elaboração do RIE de 6H consistiu na diferença existente entre a composição do melo de Incubação dos pontos da curva-padrSo (apenas tampão de ensaio) e das amostras desconhecidas (tampão de ensaio mais soro).9.6* para concentrações de 1.3 ng/ml) fora» dosadas cialmente em um único RIE. demonstrando a estabilidade do RIE.respectivamente.4. seqüenfoi de •êdio (8.0 ng/ml) e alto (22. 8.2%. respectivamente. o coeficiente de variação 5.7 e 4.6. d) ESPECIFICIDADE A especificidade.74 compreende a maioria dos picos de 6H obtidos nos testes liberação. foi médio e alto em 12 ensaios sucessivos. de Quando 9 replicatas do controle baixo (2. o que poderia Invalidar a comparação da .7 e 12. Não houve alteração signi- ficativa destes valores quando 4 replicatas foram determinadas no inicio e 4 no final do ensaio.

excluindo dessa maneira a presença de efeitos não específicos do soro sobre a reação antígeno-anticorpo e validando o protocolo do RIE de GH. A Fig. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente. não foi significantemente diferente da calculada pela incubação de soro. Estes dados demonstraram a validade de se utilizar o mesmo NSB para o calculo da curva-padrão e das amostras desconhecidas.2 ng/ml). padrões de GH "frio" (100 ul de soluções contendo desde 1.3%.1 2 5 I (100 pi) por 20 a 24 horas a temperatura ambiente. com anti-soro 72 (50 pi de solução 1/45. tampão de ensaio e hormônio marcado (100 ul de cada).25 até 40 ng/ml em tampão de ensaio) foram Incubados em trip!icata. Para se avaliar esta possibilidade. Neste mesmo experimento. 17 revela a identidade entre estas 2 curvas.75 razão B/Bo das amostras desconhecidas como as da curva-padrão.9 e 14. determinada pela Incubação de tampão de ensaio (200 pi) e GH-HC .000 em tampão de ensaio) e GH-HC 25 I (50 ul . foram comparadas curvas dose-resposta preparadas com padrões GH-HC "frio" diluídos em tampão de ensaio e em r de stripper" (soro com concentração de GH < 1. a porcentagem de ligação Inespecífica. exibindo valores de 14. d ) Recuperação quantitativa Neste experimento. respectivamente. obedecendo ao pro tocolo da Tabela I.

.76 LOGITO B/Bo (%) 60 50 20 1.25 2.• ) OU EM "STRIPPER" ( * . 17.* ) .COMPARAÇÃO ENTRE CURVAS DOSE RESPOSTA PREPARADAS COM PADRÕES DE GH "FRIO" DILUÍDOS EM TAMPÃO DE ENSAIO ( • .5 5.0 10 20 40 LOG [GH ] ( n g / m l ) FIG.

Simultaneamente. Apôs separação com PEG e contigem do precj^ pitado. completando-se o volu me final a 300 ul com tampão de ensaio. excluiu a presença de substâncias estranhas que pudessem Interferir com a reação antigeno-anticorpo nestas condições.3 ng/ntl) e volumes idênticos de anticorpo e hormônio marcado. os mesmos padrões de 6H "frio" foram incubados com quantidade fixa e conhecida de GH (100 ul de soro contendo 5. do) Construção de curva dose-resposta com diluições progres sivas de soro de paciente acrompgálico Neste experimento.77 de solução 1/100 em tampão de ensaio). A identidade entre estas 2 curvas. e utilizados para construção de curvas dose-resposta. 18) confirmou a identidade entre e s _ tes 2 parâmetros e excluiu novamente a presença de efeitos não específicos do soro sobre a reação antigeno-anticorpo.1 ng/mi de GH fo125 ran Incubados com anti-soro 72 e GH-HC I. sendo tra tados como se fossem amostras desconhecidas. .X entre as concentrações esptí radas e observadas (Fig. A existência de uma relação linear tipo Y . demonstra da na F1g. as concentrações de GH presentes nestas amostras foram determinadas por interpolação a partir da curva dose-res posta e comparadas cem os valores esperados. obedecendo ao protocolo da Tabela I. 19. padrões de GH "frio" e diluições progressivas (1/2 até 1/32 em tampão de ensaio) de soro de paciente acromegãiico contendo 43.

18-RELAÇÃO ENTRE AS CONCENTRAÇÕES ESPERADAS E OBSERVADAS DE GH EM ENSAIO DENOMINADO RECUPERAÇÃO QUANTITATIVA.2.994 30 20 . .78 CONCENTRAÇÃO OBSERVADA ( ng/ml) 50 40 r * 0. 10 10 20 30 40 50 CONCENTRAÇÃO ESPERADA ( n g / m l ) FIG.

0 10 20 40 LOG [ G H ] ( n g / m l ) FIG.5 5.LOGITO B/Bo (%) 60 50 20 1. 19.25 2. .COMPARAÇÃO ENTRE CURVAS DOSE .RESPOSTA PREPARADAS COM PADRÕES DE GH "FRIO" (•—•) OU COM DILUIÇÕES PROGRESSIVAS DE SORO DE PACIENTE ACROMEGAllCO í A—*).

Tr Cambridge. EUA). foram dosados em duplicata no soro por "kits" ciais de RIE. .4 e 9.sensibilidade: 0.sensibilidade: 9 ng/dl: . 9. . respectivamente.1» para concentrações de 89.variação interensaio: 11. separa- TU .33.2. 3.1 U/ml.Genentech Diagnostics. .80 2. EUA).6 e 3. CA.50 U/ml.2 U/ml. . DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS SÉRICOS DOS DEMAIS HORHÕ NIOS Todos os outros hormônios. com exceção da testoste rona.0% para concentrações de 0. 1.variação intra e interensaio: 5. .9. ção por segundo anticorpo. MA.2S para concentrações de 0."kit": "Sm-C Radioimmunoassay Kit" (Nichols comer- Institute Diagnostics.3 e 3.variaçío Intrasnsaio: 7."kit" "GAMMACOAT (" ^ X1 T Radioimmunoassay Kit" (Clinical Assays. San Juan Capistrano. 169 e 449 ng/dl. .2.70 e 1. a) SmC . no! . . respectivamente.0 e 5. respectivamente.características: dosagem sem extração prévia.características: fase sólida (anticorpo ligado 3 parede do tubo).

81 - "kit": "GAMMACOAT l""'1J » ' Free/Total T 4 Radioimmuno — assay Kit" (Clinical Assays).1 e 12.1 e 5. 4. . respectivamente. 5.6. respectivamente.7 e 13. . 5.8 e 3.3 e 5.34 iiUI/ml.6.2X para concen- . e) PRL .05 para concen- 13. . .8.sensibilidade: 0.sensibilidade: 0.6 e 14.características: separação por segundo anticorpo.2% para concen- trações de 2."kit": "GAMMADAB R P ij Prolactin Radioimmunoassay Kit" (Clinical Assays). .3.características: separação por segundo anticorpo.2 pUI/ml.variação interensaio: 7. trações de 2. 3. 7.6 e 5.2 e 4.0. respectivamente.3. 5.8. respectivamente. . trações de 2.3* para concentrações de 3. d) TSH .0 ug/dl.variação Interensaio: 7. 7. .2 ug/dl.1.características: fase sólida (anticorpo ligado à parede do tubo). ."kit": "GAMMADAB HS V N Ij hTSH Radioimmunoassay Kit' (Clinical Assays).variação intraensaio: 7.5 ug/dl.8 pUI/ml.variação Intraensaio: 4. .

.4 e 9.características: separação por segundo anticorpo. 40.5 mUI/ml.características: separação por segundo anticorpo.2% para concen- trações de 11. . . 41.35 para concen- trações de 16.sensibilidade: 0.6. 41.0 e 118 ng/ml.7.variação intraensaio: 6.4 e 8.0.2 e 7.3X para concen— trações de 16.valores normais: calibrados pelo padrão da WHO 2 n d IRP-HMG.variação interens2io: 7. respectivamente. respectivamente.6 e 150 mUI/ml. . .4 e 116 ng/ml.9 e 5.6 mUI/ml.8. .6 ng/ml.. . . g) FSH _ "kit": "GAMMADAB N I' ij FSH Radioimmunoassay Kit' (Clinical Assays).sensibilidade: 1. 8.variação interensaio: 5. 5."kit": "GAMMADAB R ['"ij LH Radioimmunoassay Kit" (Clinical Assays). .8% para concen- trações de 16.9. 4. .7 e 172 mUI/ml. .valores normais: calibrados pelo padrão da WHO 1st IRP 75/504.sensibilidade: 1.variação intraensaio: 5. 2.1.7. 38. respectivamente. f) LH . respectivamente.0.

variação Intraensaío: 6.Count Estradiol" (Diagnostic Products Corporation. CA. . 6."kit": "GAMMACOAT Cortisol Radioimmunoassay Kit" (Clinical Assays). respectivamente. trações de 3. .A .2 e 4.45 para concen- 39.1 e 5.4% para concentra 23.4. 1) Estradioi . . . .sensibilidade: 0.7.4.6.valores normais: calibrados pelo padrão da WHO 2nd IRP-HHG.24 pg/dl.6 e 3."kit": "Coat . 11.variação Intraensaio: 11.9. respectivamente.variação interensaio: 8.1. trações de 3.6X para concen- 24.4 e ug/dl.8.4 e 51. 11.variação interensaio: 9. EUA).0 38.8. h) Cortisol TM |125 I l l\ .4 e 49.9 mUI/ml.5 e 9.características: dosagem sem extração prévia.2* para concen- .características: fase sólida (anticorpo ligado à parede do tubo). ções de 8.8% para concen- . te.variação intraensaio: 7.7 e 2. 4. respectivamente.6 »UI/ml.6 e 5. . 5.1 f/g/dl.4. Los Angeles. . .sensibilidade: 10 pg/mi. respectivamen- 5. trações de 8.83 . fase sólida (anticorpo ligado ã parede do tubo).

respectivamente.3. EUA) foi testado.6 a 6. Antes de ser utilizado.84 trações de 37. CA.0 e 5. o anti-soro (Radioassay Systems Laboratories. . 2.5 a 6.nersham. a variação intraensaio de 5. sen do a sua especificidade considerada adequada. 125 e 300 pg/ml. Inc. 7. Carson. A sensibilidade variou de 5.31): a) hemograma completo: a contagem global foi realizada em contador automatizado e a específica em lâmina após colo ração com mistura de Romanowsky (Leishman). sódio e potássio séricos: espectrofotometria de chamai .51 para concentrações de 81.7% e a interensaio de 12 a 15%. Os padrões "frios" foram obtidos da Sygma e o hormônio trici ado da A.5 ng/dl.variação interensaio: 13.. 111 e 295 pg/ml.7. após extração do soro com acetato de etila: hexana (3:2) e sem cromatogra fia prévia. j) Testosterona Os níveis séricos de testosterona foram determina dos por RIE segundo o método de Abraham ( 1 ). respectivamente.4. b) c) gileemia piasmática: método enzimático automatizado. OUTRAS DETERMINAÇÕES LABORATORIAIS Todos os outros exames laboratoriais foram incluídos na rotina do Laboratório Central do HC-FMUSP e determina dos por técnicas consagradas na literatura (3.

70). i) fósforo sérico: método de Fiske-Subbarow. m) exame parasitoiogico de fezes: método de Faust e Hoffmann[ f n) cariótipo: analise em cultura de linfócitos. l 3. j) fosfatase alcalina: método enzimãtico e cinêtico. 1) urina tipo I: microscopia óptica. h) cálcio sérico: espectrofotometria de absorção atômica. As diferenças foram consideradas significativas ao nível de 5% (p < 0.85 d) uréia sêrica: método enzimãtico da urease. eficiência de Este teste foi escolhido por se tratar comparaçío entre variáveis Independentes. albumina sérica: método do verde bromocresol. com poder de de 95% (43. o equivalente nSo pararnétrico do "t" de Student. MÉTODOS ESTATÍSTICOS Os níveis de GH observados nos testes de tolerân- cia á insulina e clonidina foram comparados e estatisticameni te analisados pelo teste H ü" de Mann-Whitney. e) creatinina sérica: método colorimétrico. cuja distribuição não era p r e — viamente conhecida.05). f) g) proteínas séricas totais: método do biureto. . com número relativamente pequeno de amostras.

.86 Todos os valores foram expressos como média + _ 1 à erro padrão da média (EPM). inclusive os dados referentes literatura.

VII - RESULTADOS .

d) pico de liberação de GH maior do que 7. Os principais fatores que contribuíram para a baixa estatura destes pacientes foram: a) déficit de crescimento Intrauterino.0 ng/ml menos uit teste de estímulo (ITT ou clonidina).500 g ao nascimento para gestações a termo: 4 pacientes (FCS. .88 Os pacientes foram divididos em 2 grupos. de acordo C O M os dados obtidos na avaliação clínica. GRUPO 1: PACIENTES SEM DÉFICIT DE 6H Foram incluídos neste grupo 21 pacientes que pree£ cheram 3 ou mais dos seguintes critérios: a) b) ausência de sinais típicos de nanismo hipofisãrio. laboratorial. MAN. c) dosagem sêrica normal de SmC. FFH e JCES). radiolõgica e hormonal. ritmo de crescimento normal. caracterizado como em pelo altura Inferior a 46 cm e peso abaixo de 2.

RTS. SRC. caracterizado por retardo mental estigmas somáticos: 1 paciente (FCS). não foi encontrada explicação para o déficit de crescimento. JCES e A S ) . 7 pacientes per(FFH. IDADE E SEXO Foram estudados 15 meninos e 6 meninas. e f) baixa estatura familiar. CAC.89 b) retardo puberal. e) nanismo primordial. caracterizada por baixa proteica e proteínas séricas totais entre 5 . 1. AVALIAÇÃO CLÍNICA (TABELAS II E I I I ) 1. MTT. FFK.6 pacientes (FCS. Em 7 pacientes (JAM. SCN.5 anos. com Idade entre 2. SCN. AVC. PMR. A/M. caracterizada pela média da altura dos pais inferior a 158 cm (correspondente ao centil 10 da população brasileira): RTS. AVC e JCES). ADO. caracterizado por inicio da puberdade apôs os 13 anos em meninuj e apôs os 14 em meninos: 5 pa cientes (SRC. . MSP e JABÁ).1. JHS. EZ e MBH). ingestão g/dl: 7 d) doença crônica prévia (tuberculose pulmonar e ülcera duo denal estenosante): 2 pacientes (JCES e AS).9 e 17. AHM. c) desnutrição discreta.

FFH. Vários pacientes tinham sido previamente tratados com v i t a m i n a s ou anabolizantes não hormonais. apresentação cefálica. MAN. RTS. sem resultados satisfatórios . que nasceu prematuro ses) com peso de 1. em a p r o v e i t a m e n t o ^scolar em 2 (FFH e R T S ) . AVC e JCES) e as de afeto domiciliar apenas 1 ( J C E S ) . Foram observados retardo do desenvolvimento neuropsico-motor em 4 pacientes (FCS. Duas crianças (FCS e JCES) apresentaram cianose na hora do parto do e 5 (FCS. SRC. R T S .2. Os pacientes JCES e AS tinham sido previamente sub metidos a cirurgias de úlcera duodenal estenosapte e pneu- . HISTÓRIA DO DÉFICIT ESTATURAL O início do retardo de crescimento foi observado des de o nascimento até 3 anos antes da avaliação inicial no HCFMUSP. enquanto que 6 mães foram submetidas a cesárea.90 1. apenas um domi ciliar. ANTECEDENTES INDIVIDUAIS Todos os pacientes nasceram após gestações normais a t e r m o .800 g e altera de 37 cm. SCN e JCES) nasceram com peso menor que 2. SCN e JCES) e baixo de (FCS. AAM.3. As c o n d i z e s n u t r i ç ã o foram consideradas inadequadas em 7 c r i a n ç a s FFH. exceto o paciente SCN. 1. Quinze (7 mepartos foram por via vaginal.500 g e altura abaixo de 45 cm.

91

m e c t o m i a direita por tuberculose pulmonar,

respectivamente.

A m a i o r i a referia verminose anterior t r a t a d a . Doze pacientes relataram início do d e s e n v o l v i m e n t o puberal entre 9 e 17 anos, sendo este c o n s i d e r a d o em 4 (SCN, A V C , JCES e A S ) . em M B M aos 12 a n o s . retardado

A menarca tinha o c o r r i d o apenas

1.4.

ANTECEDENTES

HEREDITÁRIOS

A média da altura dos pais foi m e n o r do q u e 1 5 8 cm em 7 pacientes (FFH, RTS, S C N , PMR, CAC, EZ e M B M ) , não sendo possível d e t e r m i n a r a idade em oue teve início a paterna ou m a t e r n a . p'jberdade

Apenas os pais de F C S eram consangüíneos

(primos em lfi g r a u ) , enquanto que só JHS tinha um irmão com n a n i s m o (hipofisário). N ã o foram detectadas outras patologias

f a m i l i a r e s que pudessem ajxiliar no d i a g n ó s t i c o da causa da baixa estatura.

1.5.

INTERROGATÓRIO

COMPLEMENTAR

Não foram observados sintomas importantes referentes aos sistemas neurológico, cárdio-respiratório, gastro-i£ testinal, ósteo-articular ou endócrino em nenhum dos pacientes estudados.

f.V '.

' r " f '•',

92

1.6.

EXAME

FÍSICO entre

A altura variou entre 1,3 e 4,2 DP e o peso 0,7 e 3,4 DP abaixo da média para sexo e idade.

0 exame clínico de FCS revelou retardo do desenvol vimento neuro-psico-motor associado a hipotonia global e estigmas somáticos comopálato ogival, retrognatia, filtro sal curto e esboço de sinofris. na-

No paciente MAN, foram dee EZ, não

tectados pectus escavatum e prega simiesca e, em JABÁ nevos em tronco e pálato ogival. Os demais pacientes

apresentavam estigmas ou anormalidades importantes. Oito meninos e 1 menina não mostravam nenhum sinal de puberdade ao exame físico, sendo classificados como Grupo IA (Tabela I ) . Nos outros 12 pacientes, incluídos no Grupo ras

IB (Tabela I I ) , foi detectada pubarca em todos, telarca

5 meninas e testículos com dimensões maiores do que 2,5 cin nos 7 meninos.

2.

AVALIAÇÃO LABORATORIAL E RADIOLÓ6ICA GERAL III)

(TABELAS II E

As proteínas séricas totais estavam

discretamente

diminuídas em 4 pacientes (FCS, FFH, SRC e AVC), sendo deteve tada hipoalbuminemia em apenas um {FCS). Foi constatada an^ e

mia hipocrômica microcitica em 4 pacientes (FCS, A^M, AVC

93

TABELA II - Dados clínicos e laboratoriais em pacientes pré-púberes sem déficit de GH (Grupo IA)
Noie Sexo Idade cr on. (anos) (kg) (-DP) Peso Altura Idade Idade óssea (anos) Ritio cresc. (c«/ano) (g/dl) Heiog. Prot. tot. (g/dl) (g/dl) Alb.

(1)

(c.)

( •DP) -

1)

estat. (anos)

FCS KAN FFH RTS JM A

H M M
H

2,9 9,0 91 ,
11,0 11,0 12,1 13,0 14,5

10,2 22,0 19,0 18,7 31,1 26,8 25,2 24.3 IS.5

2, 6 1.1 1,7
1. 8

85, 0
122, 0 114, 3 120, 0 131. 138,

3,1 1,9 3,3 3,0 1,8 1.3 3,1 5.5 2, e

1,7 7,0 5,7
6,5

1,5

0

10,2 13,9 13,5 12.4 12,6 12,3 12,6 13,3 11,2 12-16

5,3

3,2

7 6
10

5,6 6,3 5,3 3,3 2,1 4.2 5.1 5,1

7,4 5,8
6.1

4,3
3,9 i.,0

H K K
H

0,7 1.2 1.8 8 2.,
, 1,4

7 3

3,5
10,0

8
10

7.0 7,4 6,5 5,6 69 ,
6-8

4,0
4,3

;o o
AAM
SRC AHH
Nonal

130, 0 123,

8,2 7.2 5,2

8
10
t,

3,8
4,3 4,0 3,5-5,0

, 3

F

7,9

112, , 1

(1)

Desvio-padrão ei relação à aédia para sexo e idade segundo as tabelas de Karques e col. (45).

5 4. 3." 3 3.7 7.4 4.1 12.7 14.1 34. (anos) HTT JHS HSP SCN PHR AVC JCES 1 M M H H N M F F 12.1 31.5 10.6 (c ) 140.0 126.7 4.0 146.1 15.í.8 12.94 TABELA III .1 13.0 10. 5 152. 5 135. 6 142.4 5.5 11.9 12.4 128. J 8.6 95 .1 4.7 30.2 2. 8 .0 15. 4.8 2. (ç/dl) lifil) Aib.3 13. 75 .3 2.0 (l) Desvio-padrSo tu relação a ifdia para seio e idade segundo as tabelas de Marques t col.7 31.Dados clínicos e laboratoriais em pacientes püberes sen déficit de GH (Grupo IB) Noae Sexo Idade cron. Prot. 4 141 .5-5.8 13.3 25.0 11.7 3.2 7.0 30.4 1.1 ll.4 61 .0 12.3 4. 8.0 4 .7 1.0 138. cW11 0. 6-8 4.5 9 9 1 1 12 10 13 13 6.4 28.8 12.5 4.7 • " CAC JA9A 9. 2.5 9 1 1 10 12 1 1 4.P it 5 8.8 14. tot.2 3.0 6.0 6.4 15.0 10. .2 4.2 L.7 11.i . 71 .0 *. 61 .8 142.3 9.8 1. 3.9 10.8 0 l.0 39.4 3.0 15. (c«/ano) (g/dl) Hciog.2 1. (anos) (kg) Peso Altura Idade Idad* óssea (anos) Ritto cresc.7 39. 5 141 .2 16.7 11.2 6.9 13.3 6.8 11. 1 132. 69 .5 17.5 6. 12.5 . 5.0 7.7 8.5 2.8* zi . (45).7 13.2 25.5 12-16 E: KBH AS Nor»al F F F 1.4 3.3 3.2 25.2 3.7 6? . 7 (-DP) (D estat.9 2.6 13.5 34.7 2.

3. quando correlacionada com a idade cro nológica e sexo. Foram detectados níveis cos normais de LH e FSH em todas as meninas púberes. . MSP. AVC e A S ) .enquanto que os de E_ peimaneceram abaixo da sensibilidade do ensaio (10 p g / m l ) . Todos os outros exames laboratoriais g e r a i s . JABÁ e EZ) mostraram-se normais.95 EZ) e verminose em 5 (RTS. do que Já no Grupo IB. e TSH apresenta ram-se dentro dos limites da normalidade em todos os pacientes. bem como o Rx de crânio e o cariótipo (este último realizado ape nas em MAN. sendo compatível com a idade esta tural em 13 casos. a testosterona e o estradiol -se em nível inferior a 27 ng/dl t 10 pg/ml. No Grupo IA. os valores de T foram sempre maiores 60 ng/dl. JHS. assim como a SmC. AVALIAÇÃO HORMONAL BASAL (TABELAS IV E V) As concentrações séricas de T . situaram respectivamente. AHM. T. 0 Rx de mãos e punhos revelou retardo da idade óssea em todos os pacientes.

0 2.7 (0.9 (0.8) 181 10.9 3.0 FFH 6.2 (0.6 25.8) 2.6 2.1 (ng/dl) 13.8-5.0 SRC 181 10.22-2.3 25.5) 152 8.28-3.* (0. .7 *.90-5.96 TABELA IV - Avaliação hormonal basal em pacientes sem d é f i c i t de G (Grupo IA) H SiC pré-púberes Noie T 3 T TSH T l 2 (ü/.0 1.2 (0.0 11.8) 180 9.2 20.6) 181 9.0 3-27 < 10 Valores noraais para sexo e idade cronológica.l) FCS (ng/dl) 180 Wdl) 9.U-4.60 (O.5 0.22-2.0 JAU 2.0 UuiM) 2.D "' HAN 1.08-1.0 AN A 1.5-11.9 (0.7) 2.1 2.0 1.7) 170 11.8 (0.3 20.6 RTS 188 10.0 AM H 0.2>-2.28-3.6 (pg/il) M0 ei 1 (0.8) 189 10.7 < 10 Nonal (1) 80-200 4.2 26.0 AO D 2.9 16.22-2.

8) 6.2 1. .91-3.0 1.1 (0.9 < 10 150 9.1) 3.5) 2.28-3.0 445 JCES 168 9.3 (0.6 (0 .5 (0.5-11.5) I 3 (ng/dl) 160 T 4 (tig/dl) 8.41-4.0 TSH (|iUI/i!) 1.28-3.8) EZ 2.71-4 .91-3.8 (0.99-6 .5 (0.4 3.0 2.0 3.7) 2.0 < 10 AS 160 10.5 < 10 Noraal 80-200 4.1) 6.9) (1 1.20-5 .7 (0.0 1.7 < 10 HBtt 161 8.6 153 «SP 160 468 SCN 185 9.97 TABELA V .1) 190 11.0 (0 .0 > 50 < 82 (l) Valores nonais para sexo e idads cronológica.5 3.0 (ng/dl) 542 JKS 178 9.8 257 PMR 195 11.3 (0.90-5.91-3.99-6.Avaliação hormonal basal em pacientes púberes sem déficit de GH (Grupo IB) fco»e StC (U/.7 (0.5 0.7 1.1) 1.8-5.2 1.l) KTT 1.7 76 CAC 200 8.1] 2.91-3.7) (D 1.8 65 AVC 188 10.7 < 10 JA8A (0.8 .

0 ng/ml em 10 (90.es A tes níveis elevaram-se acima de 7. TESTES FARMACOLÓGICOS DE ESTÍMULO 4. A média dos picos de GH foi de 15.3 + 2.0 ng/ml.4%). Todos os pacientes queixaram-se de mal-es- tar geral.1. média dos picos de GH. náuseas.6 ng/ml. foi obtida hipogl icerniu ou inferior a 45 mg/dl.47) da obtida no Grupo IA. interromper o teste devido a perda de consciência em nenhum deles. VII E VIII) igual para a Em todos os testes.98 4. TESTE DE TOLERÂNCIA Ã INSULINA (TABELAS VI.8 ng/ml. estes níveis ultrapassaram 7. 11 pacientes partiram de concentrações basais de GH inferiores a 3. Após o estímulo hipoglj^ foi de cêmico. 10. no entanto. considerada estímulo efetivo liberação de GH.°%).3 + 1.7 ng/ml. não sendo es_ tatisticamente diferente (p = 0. porisso. Os outros 7 centes ao Grupo IA partiram de concentrações basais de menores do que 3. não sendo necessá rio. Três pacientes (FFH e ADO do Grupo IA e AVC do Gru po IB) apresentaram níveis basais elevados de GH.0 ng/ml em 5 (71. incluindo o doente JAM no qual não hou ve aumento dos níveis hormonais durante o teste. excluídos da comparação com os demais. Após administração áa insulina. sudorese e sonolência. provavelforam pertenGH mente devido a "stress" na hora do teste. _ No Grupo IB. . e.

0 1..2 1. forai (3) Os pacientes FFH.1 p < 1....1 8.0 1.5 0.7 4.9 0 .3 1.3 2.1C B 1. 3 9.5 <1.8 11.1 11.2 7.3 1.3 1.2 1.1 3. . ADO e AVC fora» excluídos do cálculo das iédias no ITT por apresentarei valores basais elevados de GH.3 12.3 1.3 21.0 6. Pacientes púberes (Grupo IB) GH (ng/. 1 <1. 8 11.2 21. 1 8.2 1.7 0.2 6.7 2.9 11.o 1.2 .1 2. 8 3.9 33.5 Noie EZ M8H AS a EPM 1 .l) ITT Clcnidina B MTT JHS MSP SCN PMR AVC JC£S CAC JAdA < 1. 4 13.2 15.6 16.2 10.3 1.3 13.. as concentrações de GH que caírai abaixo ia sensibilidade consideradas iguais ao valor da sensibilidade do respectivo ensaio.2 <i.1 1.3 26. 2*.7 1.5 2.9 5. 9 1.30 10.3 3 22.4 9. 1.2 2. 6 12.4 1.6 30.1 21.5 0.6 1.1 15.9 < 1.8 10.Níveis de GH em condições basais (B) e de pico (P) em pacientes sem déficit de GH Pacientes pré-púheres (Grupo IA]) GH (ng/.6 1. 5 23.3 2.16 14.3 11.6 1.3 < 1. (2) Para o cálculo da «édia.2'J P 7.4 38.6 6.1 16.5 I.5 18.tO 9. .1 <1.9 3.6 12.6 15.4 < 1..99 TABELA VI .1 1. 0 .5 11.8 2 (1) Média das concentrações de GH nos teipos de -30 e 0 »inutos.2 3.4 1.2 12.l) Clonidina Noae ITT ) P P B FCS MAN FFH RTS JAN ADO AAN SRC AHM 3.6 3. 6 4.4 3.8 <1.3 <1.8 1.

0 72 6.8 2.3 69 11.2 53 2.: 6.» 92 55 1.4 0.9 <1.7 51 8.2 3.8 C <1.9 -30 3.2 <1.0 4.4 •gV) 90 5.3 81 1.2 1.6 10.0 ^.2 9.7 55 8.1 8! I.1 30 6.7 54 8. 1.3 71 1..7 14 4.1 27 3.6 74 36 1.7 59 5.2 41 7.5 0.7 53 4.3 93 0 2.2 <1.1 71 1.2 30 <1.1 <1.0 60 9. 1.9 67 11.26 1.5 24.2 87 2.9 88 11.2 1.7 43 12.6 <1.5 54 17.0 <' 1.5 1. (3) Para o cálculo das •(dias.6 81 3.21 e.4 38 21.2 1.5 : - G GH G GH G GH G GH G GH G GH 78 2.' FCS HAN FFH R1S JAM ADO AAH SRC AHH Média (3) 1.5 79 GH G GH G I.3 40 5.5 11.6 49 2. .2 5.9 53 60 8. L.4 (2) Glice.2 Clonití ina (0 .3 1.2 <1.1 <1.7 0.2 1.8 37 1.7 74 6.1 <1.25 6.1 1.0375 0 30 60 1.5 85 ITT 15 2. 2.37 90 1.2 2.6 58 9. 77 8.2 53 9.6 1.7 r 27 1.1 0.3 88 1. U.7 53 10.3 2.1 1.4 1.3 79 2.3 38 5.2 45 1.5 22 (0..5 5.6 3.4 <1.Níveis séricos de GH nos testes de tolerância ã insulina e clonidina em pacientes pré-púberes sem déficit de GH (Grupo IA) Note Dosagei -30 3.8 54 12.9 2.4 12. EPM (1) GH (ng/«l).I 85 9.3 1.1 U/kg) 45 30 10.11 1.9 13.7 7.8 73 9.2 69 3. as concentrações de GH que cairai abaixo da sensibilidade forai considir*das iguais ao vaior da sensibilidade do respectivo ensaio.5 7 <1.1 88 7.0 t.6 77 90 5.8 45 <1.ia (ig/dl).5 87 2.6 92 16.0 £.2 8.6 0.100 TABELA VII .2 47 2.3 6.7 15. ' .4 2.1 23.8 2.4 21 73 3.0 77 2.1 11. 1.8 23 14.2 1.2 <1.

6 90 4.8 2.2 10.3 0.7 10.4 14.3 81 77 34 39 36 35 44 15.5 3.6 60 %?.1 66 5.0 6.6 1.2 49 9.2 <1.2 <1.1 85 19 2.101 TABELA VIII .0 <l.2 GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH <1.7 2.2 95 3.6 <l.3 2.4 27 7.3 '1.4 1.4 3.6 1.4 80 2.2 69 5.0 16. .8 1.7 30.0375 iq/i') j | j ' Noie Dosagea -30 GH 0 <lt2 15 <1>2 30 lf2 45 7 9 60 ? 2 90 6>1 I3Õ l>3 Õ <I>2 30 <1>2 60 ' 90 <! 2 ÍTíT G JHS (2' ' <1>2 ' ' <lt2 ' 80 1.5 38 2.4 83 82 2.3 <1.2 34 51 1.6 74 1.3 <1.2 64 52 <l.0 63 10.2 40 2.3 <1.1 2.9 91 1.4 <1.6 62 i 1.4 *.1 SC " 18.1 45 9.1 84 1. as concentrações de GH que caírai abaixo d? sensibilidade fora§ consideradas iguais ao valor da sensibilidade do respectivo ensaio.5 1.5 2.4 <1.3 <1.0 5.C PBR <1.08 0.9 1.0 1.0 17.3 72 9.0 <I.3 1.1 0.9 1.7 *VC \ 1.3 <1.1 2.2 17.2 <1.1 26.3 0.2 14.1 19.9 2.5 96 1.5 1.2 38.3 4.1 39 42 3.2 10.3 11.5 2.2 74 75 3.3 24.3 AS G GH Hftíia^ EPH 12.0 9.3 <!.14 0.6 54 1.7 18.1 38 3.3 8.2 JABA 11 <1.3 19.2 2.22 0.l).8 1.1 13.5 84 6.4 78 4.6 (1) GH (ng/.1 57 45 2.4 ! JCE$ 21.7 84 1.0 73 9.4 1.9 15.2 1.6 40 5.2 77 5.2 93 1.0 6.7 89 2.7 1.0 12.7 2. (2) Gliceaia («g/dl).3 87 84 44 <1.4 24.6 3.4 44 1.63 3.4 51 11.6 79 2.6 45 2.2 43 28 6.4 1.0 36 39 47 60 1.7 40 6.1 U/kg) Clonidina (0.6 2.0 26.4 94 1.8 27 7.1 2.8 87 6.1 60 7.8 *. 77 1.0 59 1.8 26.6 2.3 74 30 40 56 61 1.Níveis séricos de GH nos testes de tolerância ã insulina e clonidina em pacientes púberes sem déficit de GH (Grupo IB) ITT (0.1 83 1.8 1.1 6.5 " BM 21.2 <1.6 1.4 10.1 84 1.5 15.2 33.9 2.1 45 2.3 2.6 3.3 68 73 <1.2 1.£ CAC <!.5 9.0 1.6 16.5 1. (3) Para o cálculo das aédias.6 73 1.2 <1.0 46 <1.45 2.5 66 8.6 12.22 0.

Todos os pacientes partiram de níveis b a s a i s de GH inferiores a 2.26) da obtida no ITT.2 + 3.0 ng/ml em 5 (41. a clonidina diferente promoveu apenas Incremento na concentração de GH acima de 7.1 mmHg para a diastólica.0 ng/ml. a media dos picos de GH de 14. os níveis de GH observados nos dife .102 Em ambos os c upos. com resposta inferior a 7. o c o r r e n d o entre 60 e 120 minutos após administração da c l o n i ó i n a . No.4 ng/ml. mostrando uma resposta normal ao estímulo h i p o g l i c ê m i c o (Tabela X V I ) . No Grupo IA (9 p a c i e n t e s ) .Grupo IB (12 p a c i e n t e s ) . mais fre q u e n t e m e n t e no tempo 60 (7 p a c i e n t e s ) . incluindo os 7 p a c i e n t e s ng/ml. 0 cortisol só foi dosado no paciente F C S .28) nem da observada no ITT no G r u p o (p = 0 .8 mmHg para a pressão sistõlica 5. A média dos pico de GH. houve discreta r e d u ç ã o níveis pressóricos associada a leve sonolência.9 +_ 1.5 n g / m l .7%). não sendo estatisticamente (p = 0. da foi de 10. IB Entretanto. siderando todos os 9 pacientes. 4. 9 X ) .9 + 1.2. 1 5 ) .0 ng/ml em 8 ( 8 8 .8 + 2. VII E V I I I ) dos Na maioria dos testes.5 não sendo estatisticamente diferente da obtida no m e s m o teste no Grupo IA (p = 0. a c o n c e n t r a ç ã o máxima de GH ocor reu entre 30 e 90 minutos após injeção da insulina. TESTE DA CLONIDINA (TABELA VI. a r e s p o ^ Coji foi e A que de ta à clonidina foi maior do que 7. foi de 12.

103

rentes tempos do teste da clonidina foram discretamente infe riores aos do ITT (Fig. 2 0 ) . Em ambos os grupos, a concentração máxima de GH ocor reu entre 60 e 120 minutos após administração da clonidina, mais freqüentemente no tempo 60 (9 pacientes).

4.3.

TESTE DO TRH ASSOCIADO

AO LHRH

Este teste sõ foi realizado no paciente FCS, revelando respostas hipofisárias normais de LH, FSH, TSH e PRL. a

Os níveis basais elevados de PRL deveram-se provavelmente "stress" na hora do teste (Tabela X V I ) .

5.

SEGUIMENTO

(FI6S. 21 E 22)

Todos os pacientes apresentaram ritmo de crescimen to adequado, com exceção de FCS e ADO. Durante a evolução,

foi observada pubarca em ADO aos 12,5 anos e início da pube£ dade em SRC aos 14,8 anos, permanecendo pré-púberes os demais componentes do Grupo IA. Já no Grupo IB, houve progressão

discreta dos sinais puberais em todos os pacientes.

104

30

60

90 120 TEMPO (MINUTOS)

FIG. 2 0 - NÍVEIS SERICOS DE 6H ( MEDI A ± ERRO PADRÃO
DA MÉDIA) NOS TESTES DE TOLERÂNCIA À INSULINA { • — • ) E CLONIDINA ( * — * ) EM PACIENTES PÚBERF.S SEM DÉFICIT DE GH.

105

M-TURA cm

90
80 70 60 150 140 30 120

110
00 90
• i i i i i i i i

5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 20
IDADE EM ANOS IG. 21 - RITMO DE CRESCIMENTO DE 21 PACIENTES DO SEXO MASCULINO COMPARADO COM O GRA'FICO DE MARQUES E C 0 L . ( 2 8 ) . ( • ) INÍCIO DO TRATAMENTO COM GH. ( t ) INÍCIO DA PUBERDADE.

) INÍCIO DA PUBERDADE. .R I T M O DE CRESCIMENTO DE 9 PACIENTES DO SEXO FEMININO COMPARADO COM O GRAFICO DE MARQUES E COL. ( 2 8 ) .106 AS CAN i—i—I—I—i—i—i—I—I—I—i—i—i i i • • i . i i 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 20 IDADE EM ANOS FIG. 22 . ( * ) INÍCIO DO TRATAMENTO COM GH.

na qual foi diagnosticado craniofaringioma. . suspeitou-se de doença hipofisária familiar em 4 (ARC. WL.0 ng/ml err 2 t e s tes de estímulo (ITT e c l o n i d i n a ) .1. AMAS. CC e JAS) foram classificados como déficit isolado de GH. com idade entre 5. PCS.107 GRUPO 2: PACIENTES COM DÉFICIT DE GH Foram incluídos neste grupo 10 pacientes que preer cheram 3 ou mais dos seguintes critérios: a) b) c) d) presença de sinais típicos de nanismo hipofisârio. Entretanto. foi feito o dia£ nõstico de deficiência hipotaiâmica-hipofisária múltipla pelos níveis séricos basais reduzidos de T e T. CAN e FSGS). ritmo de crescimento redu2ido. P C S . AVALIAÇÃO CLÍNICA 1. TRH e LHRH. FK. pico de liberação de GH menor do que 5.0 e 16.1 anos. dosagem sérica diminuída de SmC. IDADE E SEXO Foram estudados 7 meninos e 3 meninas. Os outros 6 pacientes (ARC. e/ou respostas subnormals dos demais hormônios hipofisários aos estímulos de hipoglicf? mia. CC e JAS) devido à presença de consangüinidade entre os pais. A etiologia do distúrbio hormonal foi considerada idiopática em todos os pacientes com exceção de FSGS. Em 4 pacientes (RJSC. 1.

asma brõnquica em RJCS e verminoses prévias. do os demais pré-púberes. Com exceção de vitaminas. com duração de 9 meses. respectivamente. Foi observado retar- do do desenvolvimento neuro-psico-motor no paciente PCS e um baixo aproveitamento escolar em RJCS e PCS.2. HISTÓRIA DO DÉFICIT ESTATURAL O retardo de crescimento foi notado pelos familiares nos primeiros 6 anos de vida. nutrição foram consideradas inadequadas em 4 crianças WL. Os 10 partos foram por via vaginal. a não ser criptorquidia tratada com Pregnyl en AMAS.3. As condições de (PCS. antes de nenhum paciente tinha recebido qualquer tratamento procurar o HC-FHUSP. 1. Não foram relatadas outras patologias importantes em nenhum dos doentes. ANTECEDENTES INDIVIDUAIS Todas as gestações evoluíram sem intercorrências. I Í . CC. sendo 3 pélvicos e associados a cianose do recém-nascido. CAN) e as de afeto domiciliar em apenas 1 (ARC). Dois pacientes (JAS e FS6S) referiram início do d£ senvolvimento puberal aos 14 e 15 anos.108 1. Apenas 1 criança nasceu corn peso inferior a 2.500 g e nenhuma com altura abaixo de 48 cm.

nictúria e hemianopsia bitemporal não associada a cefaléia. EXAME FÍSICO Sete pacientes (ARC.109 1. A paciente FSGS apresentava polidipsia.6. FK. ANTECEDENTES HEREDITÁRIOS A média da altura dos pais foi menor do que 158 cm em apenas 1 paciente (FSGS). associados a pele ressecada e reflexo aquileu lentificado em 2 (RJSC e P C S ) . Não foram a detectadas outras anormalidades em nenhum dos pacientes. hipotireoidismo ou de hipocortisolismo. Seis meninos e 2 meninas foram considerados pré-p£ beres ao exame físico. PCS. CC. constituído por apenas 2 . não ser presença de fronte olímpica e esclera a2ulada em CC. não sen do referidas outras patologias lias.5. sendo observada consangüinidade entre os pais de 4 (ARC. CC e JAS). No Grupo 2B (púberes). Foi relatado nanis mo acentuado (não investigado) só em 1 irmão de ARC. sendo classificados como Grupo 2A (Tabela I X ) . Nenhum dos outros doentes referia sintomas neurológicos. RJSC. CAN e JAS) apresentavam sinais típicos de nanismo hipofisãrio como nariz em sela e adiposidade abdominal. PCS. de 1 .4. relewntes nas demais famí' | 1. INTERROGATÓRIO COMPLEMENTAR poliúria.

CC e FSGS) e graus variáveis anemia normocítica normocrômica ou microcítica hipocrômica em t o d o s . 2 . o estudo radiolôgico não mostrou nível da sela türcica. desdobramento do assoalho. não sendo compatível com a idade estatural em apenas (AMAS e W L ) . WL. com exceção de FK. 2. enquanto que JAS tinha testí culos com 3.2 cm de diâmetro.nc elementos (Tabela X) a paciente FSGS apresentava pubarca e telarca (estádio II de T a n n e r ) . 0 Rx de crânio de FSGS revelou sela túrcica con cii mensões a u m e n t a d a s . sendo detectada hipo_ albuminemia discreta em apenas 1 (CAN). anormalidades ao A idade óssea estava retardada em todos os pacient e s . CC e C A N ) . Os demais exames laboratoriais e ^ tavam dentro dos limites da normalidade. e calcificaçã> suprasselar. Foi constatada verde minose em 3 pacientes (WL. AVALIAÇÃO L A B O R A T O R I A L E RADIOLÓGICA GERAL E X) (TABELAS IX As proteínas séricas totais encontravam-se diminuí das em 4 pacientes (PCS. sendo confirmado o diagnóstico de tumor cístico com extensão intra e suprasselar pela tomografia computadori zada. Nos demais pacientes.

. 7 2.7 25.4 5.4 K M H F F 5. 2. 4 0.5 3.5-5.3 3. p »* - 5.6 3.7 i AC R RJSC F K PCS AHAS »L.9 15.7 4.2 5. (anos) (s/ál) 11.0 5. tot.3 3.2 10.0 3.1 3.7 4 7 85 2.9 1.2 15 .3 29.4 5 ii *í 11.9 4. C C CAN Noraa! K M H 9.7 6 10 12 21. 8 5. 5.5 3 5 7 4. 133. i.ill TABELA IX .0 2. -DP) ( ( D tstat.1 8. I 5.0 15.2 9.4 11.0 12.4 3. 2 113. (c»/ano) Heioç.0 12. (45. 0 12*.6 87 4 84 7 2 1.0 í.7 6.8 2. 1 3.5 2.4 6. 6 114.0 26.2 *.4 11.2 10.0 13.5 2 5.0 2..0 9.9 0.5 6. 6 119.5 H.9 (g/dl) (s/<^ 4.0 1.2 2.2 2.5 7. Prot.3 10. Alb.9 J :! . 1 ii ( D (c) 98.5 6.0 12-15 6-B i (l) Oesvio-padrão e» relação a «édia para sexo t idade segunda as tabelas it Karques e col.7 10.8 5. (anos) (kg) Peso (-DP) Altura Idade Idade óssea (anos) fcit»o cresc.0 10.5 3.6 3.4 3.0 5.Dados clínicos e laboratoriais em pacientes prê-púberes com déficit de GH (Grupo 2A) Noae Sexo Idade cron.

tot.) 120. 62 . 8. (anos) 67 .9 128.1 21.6 4. .2 2.7 3. éssea (anos) 9 9 Ritio tresc.9 12-16 Alb. 4 Altura (c.8 (fl/dl) 11. Prot.p a d r ã o em r e l a ç ã o a « é d i » para seno e idade segundo as t a b e l a s de Par-ques e c o l .7 10.5-5.8 Idad.5 16. (ct/ano) 3.0 4. 1 3. 6-8 (<ó).5 25.4 3.0 O e s v i o .2 < jj Note Peso Sexo Hade cron.112 TABELA X - Dados c l í n i c o s e laboratoriais em pacientes púberes com d é f i c i t de G H (Grupo 2B) Idad: estat. 8 (-DP) (1) 5.al (l) 4. ig/dl) (g/dl) 63 . JS A FSGS Nor. (1) (anos) (kg) (-DP) X F 14.

1 ng/dl. não foi necessário i n t e r — romper o teste devido a perda de consciência em nenhum. todos os pacientes partiram de níveis basais de GH iguais ou menores do que 1. Níveis de glicemia inferiores a 40 mg/dl ocorreram entre 15 e 30 minutos após administração da insulina em todos os testes. A testosterona sérica situou-se em nível inferior a 2? ng/dl em todos os meninos do Grupo 2A. Com exceção de JAS. níveis sêricos reduzidos de T 3 e/ou T . enquanto que. Apesar dos sintomas desagradáveis de hipoglicemia observados em todos os pacientes. foram observados em 3 (RJSC.1. TESTES FARMACOLÓGICOS DE ESTÍMULO 4. • . no Grupo 2B. . quando correlacionada com a idade cronológi ca e sexo. mostrou-se diminuída em todos os pacientes. 4.0 ng/ml . PCS e FSGS). AVALIAÇÃO HORMONAL BASAL (TABELAS XI E XII) A SmC. Já o estradiol i sérico caiu abaixo da sensibilidade do ensaio (10 pg/ml ) em todos os pacientes de ambos os grupos. TESTE DE TOLERÂNCIA XIV E XV) Ã INSULINA (TABELAS XIII. JAS mostrou um valor de 50. confirmando a presença de hipotireoidismo secundário. associados a valores normais de TSH. não .113 3.

9 8.7 6.2 13.10 (0.8)' RJSC < 0.5-11.10 (0.22-2.7) 0.8-5.5 0.4) < 0.91-3.0 25.0 2.8) < 0.0 AMAS ML CC 156 11.6) < 0.5 3.0 93 7.5 1.5) 3 (ng/dl) 100 T \ TSH (\iUlfil) 4.3 < IO 3-27 < 10 Norial 80-200 4.0 135 8C .13 (0.114 TABELA XI - Avaliação hormonal basal em pacientes prê-púberes com d é f i c i t de G H (Grupo 2A) Noae SiC (u/. < :c 2.10 (0.1) < 0.D ARC (0.2 T (ng/dl) 16.14 (0.7 2.0 (1) Valores noriais para sexo e idade cronológica.8) PCS 0.10 (0.22-2.90-5.18-2.28-3.22-2.4 75 4.4 42 23.2 147 7. .0 CAN 97 8.0 E 2 (w/dl) 7.41-4.7 (pgM) ° >1! (1) 122 3.10 (0.

10 (0.l) T (ng/dl) 97 T dig/dl) 10.1) FSGS 37 3.0 > 5C < 82 (l) Valores noraais para sexo e idade cronoláçica.8-5.5-11.5 0.1 JAS 0.90-5.9 2.71-4.2 T E (ng/dl) ( p 9 M ) 50.7 < 10 Norial 80-200 «.7 TSH (jiUl/dl) 2.10 (0.6)' 0.115 TABELA XII - Avaliação hormonal ba:al e pacientes püberes com m d é f i c i t de G H (Grupo 2B) Nose S»C (U/. .

do hormônio liber^ valores máximos foram observados .4 ng/ml apôs o estímulo hiooglicêmico em nenhum.9 ng/ml para um máximo de 3. a concentração de GH elevou-se de um basal de 1. os entre 30 e 90 m i n u t o s . confirmando a deficiência do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) ou dor do ACTH (CRF). Nos pacientes em que houve discreto aumento dos níveis de GH durante o teste.08 n g / m l .89 +_ 0. os níveis sj? ricos basais m o s t r a r a m . No G r u p o 2A. a média dos picos d e t e c t a d o s apôs injeção de insulina foi de 0. Houve uma dis criminação completa entre os níveis de GH o b s e r v a d o s nos diferentes tempos do ITT no Grupo 2A quando comparados do Grupo IA (Fig. a resposta foi c o n s i d e r a d a subnormal em apenas 3 (RJSC.01) do que a obtida no Grupo IA. já que este era constituído por apenas 2 pacientes q u e . 2 3 ) . ccn os apresentavam secreções nitidamente d i f e r e n t e s de GH. Após estímulo h i p o g l i c ê m i c o . Com relação ao cortisol (Tabela X V I ) . No pacientes JAS. Não foi calculada a média dos picos nem realizada a comparação estatística do Grupo 2B com os d e m a i s .s e normais em todos os pacientes. além de tudo.116 havendo incrementos acima de 1. PCS e F S G S ) . estatisticamente menor (p < 0.5 ny/ml no tempo 3 0 .

6 1.ei 0.8 0.7 U.9 1.8 JAS n PCS AKAS XL CC CAN Hidia 0.3 0.6 0.5 1. .0 1.9 1.08 EPH (1) Média dos níveis de GH nos teipo.0 0.6 0.1 0.5 B 1.7 0.9 < 0.3 1.9 0.7 0.89 0. (2) Para o cálculo da aídia.2 lfk J.6 < 0.8 <: 0.6 0.7 1.70 0.6 0.6 < 0.2 2.05 0.7 < 0.9 0. de -30 e 0 linutos.9 3.08 o.0 0.18 FSGS 1.9 1.7 0.6 < 0.0 1.Níveis de GH em condições basais (B) e de pico (P) em pacientes com déficit de GH Pacientes púberes ÍG^upo 2B) «fvtis d» GH ( n q M ) No«* ITT Clonidina Pacientes pré-púberes (Grupo 2A) Híveis de GH (nq/il] ffoae ITT Clonídina B ARC RJSC 0.TABELA XIII .9 0. as concentrações de GH que caíra* abaixo da sensibilidade forai consideradas iguais ao valor da sensibilidade do respectivo ensaio.0 0.8 M 0.3 0.

6 76 <0.9 <O.19 (1) GH (ng/il).73 0.5 C.68 0.6 1.2 0.7 86 <0.6 28 0.1 1.8 32 <0.Níveis séricos de GH nos testes de tolerância ã insulina e clonidina em pacientes pré-púberes com déficit de GH {Grupo 2) Nose Dosage» -30 GH.8 39 <0.0 1.0 0.80 0.9 <0.6 78 <O.6 30 0.9 <0.8 43 1.6 50 0.04 Clonidina (C.6 34 <0.6 17 0.09 C.6 120 1.6 <O.5 0.6 56 0.8 " 0.0 35 0.10 ITT 15 <0.5 <C.0375 i g V ) 0 30 60 90 <0.-: 0.9 0.9 <0. .6 104 <0.1 U/kg) 30 45 0.6 30 1.9 73 0.9 <0.2 0.118 TABELA XIV .2 33 <0.6 81 <0.6 2.6 32 0.77 0.6 48 0.7 0.9 0.6 72 <0.C5 0.06 0 <0.6 <0.83 0.9 82 0.20 0.6 2.3 1.9 1. (2) G GH G GH G PCS GH G ANAS GH 6 "L GH G GH G GH G GH 0.0 ARC 0.9 39 0.06 (0.9 1.5 <0. as concentrações de GH que caírai abaixo da sensibilidade forat consideradas iguai* ao valor da sensibilidade do respectivo ensaio.9 80 0. .9 89 1.71 0.5 <C.9 0.7 0.0 43 0.6 0.3 67 0.S 22 0.6 <0.as. (2) Gliceiia (*g/dl).6 58 0.7 51 0.9 -3C <0.7 39 0.73 0.6 39 1.4 40 <0.8 49 0.9 60 <0.07 90 0.3 0.8 77 <0.90 0.1 75 0.0 0. (3) Para o cálculo das iíd.78 0.« <C.6 38 1.: :.9 0.7 72 0.9 <0.7 36 0.05 0.6 27 0.77 0.3 1.8 36 <0.6 61 0.6 - <0.2 0.6 34 <C.9 0.08 <0.7 32 0.6 CC nu Hídia^ EPH <0.5 0.12 1.9 40 0.6 86 <0.9 1.8 56 <0.6 1.6 44 42 «"0.9 26 1.11 1.85 0.9 0.0 1.0 40 <0.3 25 <0.7 11 0.

1 82 ITT (0.8 3.2 78 1.9 37 2.3 1.8 1.9 26 2.1 U/kg) 15 30 45 <0.0375 »g/»') 0 30 60 90 1.5 60 <0.0 "' S (1) GH (ng/il).1.1 1.2 FSGS 1.6 4.4 53 Clonidina (0. .1 46 90 <0.119 TABELA XV . 120 1.9 33 2. (2) Gliceiia («g/dl).7 1.9 74 2.8 62 -30 1.9 24 3.1 1.9 36 2.5 26 <0.Níveis séricos de GH nos testes de tolerância ã insulina e clonidina em pacientes púberes com déficit de GH (Grupo 23) No» Dosage» -30 GH G GH G 1.7 88 0 <0.7 2.9 35 <0.

2.8 + 2.08 ng/ml. No Grupo 2B. de maneira semelhan te à observada no Grupo 1.3 ng/ml em nenhum. respectivamente. Houve também uma discriminação completa e£ tre os níveis de GH observados nos diferentes tempos do teste da clonidina no Grupo 2A quando comparados com os do Grupo IA (Fig. TESTE DA CLONIDINA {TABELAS XIII. Esta queda ocorreu entre os 60 e 120 minutos do tes te e foi acompanhada por leve sonolência. Após administração da clonidina.81 *_ 0.120 4. No Grupo 2A. não houve incremento acima de 2. Os tempos de pico. ocorreram entre 30 e 90 minutos apôs grupos . foi de A análise estatística mostrou que esmesmo te valor era menor (p < 0. que mostrou um valor máximo 4. 2 3 ) . a média dos picos põs-cionidina de 0.37) do obtido no ITT no Grupo 2A. XIV E XV) Houve redução de 10. nos testes em que houve discreto aumento dos níveis de GH.8 ng/ml no tempo 60. com exceção de JAS.4 ng/ml.6 imiHg nos _ níveis da pressão arterial sistólica e diastõlica.01) do que o observado no teste no Grupo IA. mas não diferente (p = 0.0 + 1.8 e de 5. não foi calculada a média dos picos nem realizada a comparação estatística com os demais pelas razões anteriormente especificadas. Todos os pacientes partiram de concentrações basais de GH iguais ou inferiores a 1.

2 3 .) E CLONIDINA (^--4. * .0—6) EM PACIENTES PRÉ-PÚBERES SEM DÉFICIT ( • .*—«.• .* ) E COM DEFICIÊNCIA (c^-o a—a) DE GH.121 GH ( ng/ml) 30 60 90 120 TEMPO (MINUTOS) F!G. .NÍVEIS SÉRICOS DE GH ( MEDIA± ERRO PADRÃO DA MÉDIA} NOS TESTES DE TOLERÂNCIA À INSULINA (•—.

excluindo uma deficiência hipofisãria total d e £ tes hormônios. nesta fase. indicando uma baixa reserva hipofisãria destes h o r m ô n i o s . sendo mais precoces do que Grupo 1. no 4. Com exceção de CAN (teste não r e a l i z a d o ) . já que. ao passo que. . não foi possível avaliar o grau de r e s p o s t a . nas p r é . com exceção do valor elevado de PRL observado nos pacientes PCS e FSGS. Em RJSC. TESTE DO TRH ASSOCIADO AO LHRH (TABELA XVI) Todas as dosagens basais de TSH.122 administração da c l o n i d i n a . LU e FSH foram normais. r e s p e c t i v a m e n t e .p ú b e r e s . 0 aumento das gonadatrofinas foi considerado crianças normal nos 2 pacientes púberes. PRL. todos os pacientes responderam ao LHRH com elevação dos níveis séricos de LH e FSH. Após estímulo com TRH. os incrementos do TSH e PRL foram considerados subnormals em apenas 1 (CAN) e 2 (FSGS e C A N ) pacientes. a hipófise normal pode não responder ao estimulo agudo com LHRH. a resposta exagerada do TSH sugeriu um distúrbio hipotalãmico. sugestivo de distúrbio h i p o t a l â m i co.3.

Pico de concentração horaonal após estíaulo.6 29.8 7.Iic.6 16 . TRH e LHRH em 11 pacientes com baixa estatura ITT .8 23.6 5.5 20.0 13. TSH.5 2.8 9.7 23.2 2.8 34.9 4.9 32.6 4.0 32. 26. 4-".7 5.2 1.1 2-16 21.0 30.3 3.3 8.6 5.0 5.4 4.: 4.6 2.2 4.0 8.1 55.9 <.9 8..4 8.3 25.4 21.8 7.1 15. Nadir.7 12.7 25 3 13-97 C5i 2.1 98.' 85 .0 19.6 13.9 11.6 4.0 30. PRL.3 29. (0.5 10.6 4.123 TABELM XVI .5 6.0 5.(5 -17 3-17 2-9 Basal .9 10.7 3.6 12.3 26.7 5-17 3.1 13.2 1.3 12.8 3.1 7.8 0. Respostas noriais para pacientes púberes.0 16-42 8 2.? 15-98 11.9 1-6 P 26.0 6.e (ig/dl) TSH (pUl/iI) PRL (pg/.6 12.0 7.1 ü/kg) F (ytg/dl) TRH (200 pgj LriRH LH (IÜI/»'!) (IQQ uq) Ho.1 2.0 20.3 6.8 4.7 10. LH e FSH ao estímulo hipoglicêmico.0 58.8 1.1 31.5 9. 20.lédia dos níveis horaonais no teipos it -30 e 0 cinutos. .4 10.Resposta do corfisol (F). Valores noraais segundo Nery (52).4 5.7 7.9 3.1 6.1 1.0 12.0 21.9 3.3 16.0 21.1 5.0 27.9 2.I) FSM (»ui/ii 8 FCS ARC RJSC F K PCS A!US M L 82 66 86 85 74 77 88 78 5/ 85 76 70-110 P 20.5 2.4 30 30 25 26 36 30 39 32 1 1 26 24 16.0 31.4 c c CN A JAS FSCS Nonal (1) (2) (3) (4) (5) 8.4 2.5 6-30 B 34.8 15.'.

7 anos. houve aceleração da velocidade de crescimento em RJSC. a única medicação administrada foi 1-tiroxina (50 a 100 ug por via oral) aos pacientes com hipotireoidismo firmado laboratorialmente. CC e . a qual foi submetida a cirurgia transfenoidal 3 mesr após a avaliação inicial. Com exceção de ARC e FK. Após iniciado trata(0.124 5. Neste sendo confirmado o diagnóstico de craniofaringioma. 21 E 22) Todos os pacientes foram seguidos por um período mínimo de 6 meses. período. CAN. todos os demais pacientes apresentaram ritmo de crescimento reduzido. sendo que apenas WL entrou em puberdade aos 15. SEGUIMENTO (FIGS. com exceção de FSGS.1 U/kg con- mento com GH extraído de hipófises humanas no HC-FMUSP de peso administrados por via intramuscular 3 vezes por semana).

VIII - ÜI SCUSSAO COM:1- A : '•' • V-.R/SP .

6 ng/ml.0 ng/mi.7 ^1.3%. Sa]_ ti e col. (63) relataram picos de GH de 21. no primeiro teste. Fraser e col.9 +_ 4.24) em 1979. é comprovadamente um potente agente estimuiador da secreção de GH.4 + 4.5 ng/ml ) em _ todos os elementos de um grupo de 18 crianças e adolescentes com baixa estatura sem distúrbio endccrino. Fm escudo sero?1han te. Romero e col.15 mg/m* ) foi comparado com o ITT (0.15 mg/ra*. Isto foi demonstrado pela primeira vez por picos de GH Gil-Ad e acima de col.126 A clonidina.1-0. (16) não encontraram respostas inferiores Já a 7.7% dos paciente1. administrada na dose oral de 0. cuja média dos picos foi de 18. que observaram 10 ng/mi (média + erro padrão da média: 34. sendo menores ou Iguais a 8. (23.15 U/kg ou 4 U/m 2 ) em pacientes com nanismo não hipofisário. (66) relataram picos pós-clonidina de 13.0 ng/ml em 9.. com resultados falso-negativos (resposta menor do que 7. foi observado maior pico de liberação de GH.66) em que o teste da cloni dina (0.ultados falso-negativos. Em três estudos (16.9 ng/ml.0 ng/ml) em 14. Picos muito mais elevados durante .39.5 ng/ml em nenhum teste da clonidina. associado a menor i n c i — dência de rc.8 + 1.

Em dois estudos (62. a secreção deste ho mõnio em pacientes com não hipofisário após administração de 0.15 mg/m 2 ) também mostrou-se superior ao do 1-dopa (120-250 mg ou 300 :ng/n>*) e ao da argi nina (0. 0 teste da clonidina (0.5 + 9.05.5 g/kg). a clonidina foi testada em quantidades menores com o intuito de se reduzir a incidé£ cia de efeitos colaterais e. nanismo em 1982. (39) no único estudo em que apenas crianças pré-púberes foram avaliadas. En- tretanto.10 e 0.76 ng/ml) e nenor _ índice de resposta inferior a 7. que consistiu na investigação de 64 pacientes coro baixa estatura em diversos centros da Grã-Bretanha.15 mg/m 7 . Romer e col.9 ng/ml) foram observados por _ Lanes e col. (62) estudaram.95 e 13. algumas objeções foram feitas quanto à validade dos resultados deste último estudo.8% de respostas inferiores a 10 ng/. foi observado de liberação de GH (16.0 ng/ml (6 e 0%.3 + 0. respectiva — mente) no teste da clonidina. já que as dosagens de GK foram realizadas en. manter eficiência adequada de liberação de GH.-ni A eficiência de liberação de GH provocada pela clonidina foi considerada equivalente e não superior à do ITT em apenas um trabalho (30). ao mesmo tempo.71) realizados em pacj^ maior pico entes com nanismo não hipofisário. 0. Devido à ocorrência de hipotensão por vezes severa (47) associada â dose de 0.15 mg/m* . com 5. diferentes laboratórios e os pacientes nem sempre estavam em jejum no dia do teste da clonidina (16).127 este teste (36.1 + 1.

123

de clonidina, não observando diferenças estatisticamente sig nificantes nas respostas obtidas com estas 3 doses. Neste

mesmo ano, Laron e col. (41) propuseram a realização Jo teste da clonidina com a dose fixa de 0,025 mg e compararam-no com o ITT (0,1 U/kg). Em 12 pacientes com baixa estatura consti

tucional, sem menção ao estágio puberal, os autores r e l a t a — ram picos de GH e resultados faiso-negativos (resposta menor do que 10 ng/ml ) de 21,8 + 4,9 ng/ml e 16,7% para o ITT, _ e

de 30,6 + 8,8 ng/ml e 8,3% para a clonidina, sendo este ülti _ mo associado a reduções da pressão sistõlica de 5 a 10 mmHg. Concluíram, portanto, que a clonidina, mesmo na pequena dose de 0,025 mg, era um agente liberador de GH mais potente que o estímulo hipoglicêmico. Entretanto, dois estudos subseqüentes (11,40), reji lizados em grupos de crianças pré-púberes com nanismo não hj^ pofisário, demonstraram que o teste da clonidina coro dose in ferior a 0,15 mg/m 2 , embora adequado para avaliar a reserva do

hipofisária de GH, não era tão eficiente quanto inicialmente proposto por Laron e col. (41). No trabalho realizado por

Dammacco e col. (11) em 1983, o teste da clonidina (0,035 mg/m2) foi comparado com o da arginina (0,5 g/kg). Os resultados

revelaram picos de liberação de GH semelhantes (16,7 + 2,44 ng/ml para a clonidina e 15,69 + 2,56 ng/ml para a arginina), _ mas

menor incidência de resultados falso-negativos (pico£7,0 ng/ml) no teste da clonidina (16,7*) do que na arginina (25S). Houve

129

r e d u ç ã o dos níveis pressóricos pós-clonidina de

11,5 i 0,8 mmHg

para a sistõlica e de 7,5 +_ 0,7 mmHg para a diastólica. Jã no e s t u d o de L a n e s e col . ( 4 0 ) , publicado em 1985, a foi t e s t a d a nas doses fixas de 0,100 e 0,050 mg clonidina (corresponem Os

d e n t e s , e m m é d i a , a 0 , 1 1 9 e 0,0619 m g / m 2 , respectivamente) 10 (Grupo A ) e 14 (Grupo B) crianças, respectivamente.

picos de GH foram de 14,5 +_ 2,0 e 11,6 +_ 1,6 ng/ml nos Grupos A e B, r e s p e c t i v a m e n t e , com índice de respostas (menores do que 10 ng/ml) de 10 e 3 6 % . subnormais

Houve decréscimo se14 a

m e l h a n t e da p r e s s ã o arterial nos 2 g r u p o s , variando de

15,3 mmHg para a sistólica e de 2,3 a 4,0 mmHg para a diastó lica. Neste m e s m o trabalho, 9 crianças com baixa estatura de

i d i o p á t i c a foram estudadas com uma dose de 0,100 ug/m 2

c l o n i d i n a e uma única coleta de sangue aos 60 minutos, sendo o b s e r v a d o s picos maiores ou iguais a 10 ng/ml em todas. 0 t e s t e da clonidina com a dose de 0,0375 mg/m 2 foi, neste p r o j e t o , avaliado no que diz respeito â eficiência

de liberação de GH e ã incidência de efeitos colaterais indj; s e j á v e i s , p a r t i c u l a r m e n t e hipotensão e sonolência. to, ele foi c o m p a r a d o com o ITT (0,1 U / k g ) , Para taji

considerado por hipoem

m u i t o s autores o teste padrão de avaliação da reserva f i s á r i a de GH ( 3 2 , 4 8 , 5 8 ) . Os 2 testes foram

realizados

g r u p o s d i s t i n t o s de crianças e a d o l e s c e n t e s , para se estudar também a possível influência da puberdade sobre a do GH à c l o n i d i n a . resposta

130

A avaliação clinica, laboratorial e radiolôgica ge ral obe-deceu às recomendações propostas por Underwood & Van crianças hormônios

Wyk no que se refere ã investigação diagnostica de com baixa estatura ( 7 4 ) . As dosagens basais dos

tireoidianos, gonadotrofinas e SmC contribuíram para descartar a presença de hipotireoidismo, disgenesia gonadal em neninas púberes e nanismo hipofisârio, respectivamente. 0 ITT foi padronizado segundo critérios previamente estabelecidos na literatura (18,20,35,36,56,59,64,72,77), com coletas de sangue até os 90 minutos após administração da insulina, já que, neste teste, o pico de GH geralmente ocorre entre os 30 e 90 minutos. A coleta não foi continuada até os 120 minutos para não perpetuar em demasia os efeitos cola terais desagradáveis associados ã em todos os pacientes. 0 teste da clonidina 0,0375 mg/m*, escolhida por foi realizado corresponder a corc a dose de exatamente um hipoglicemia, observados

quarto do valor inicialmente preconizado na literatura (0,15 mq/rn*) e ser próxima da dose de 0,035 mg/m z , já previamente testada e associada a boa eficiência de liberação de GH e baixa inci^ dência de efeitos colaterais ( 1 2 ) . Foi ponderado também que, embora criasse problemas na hora de sua preparação, a deveria ser corrigida para a superfície corpórea, que todas as crianças recebessem,proporcionalmente, quantidade da droga. de a dose modo mesma

0 ng/ml.30.a Influência da variação ínterensaio. já que. 0 fato de que os tempos de coleta não foram idênticos neste teste e no ITT não invalida a comparação entre eles. caracterizado adequado às necessidades deste projeto.1 mg. As amostras de sangue após administração da clonidina foram coletadas a cada 30 minutos durante 2 horas.63. já que o menor comprimido comercializado contém 0.40. embora ambos com provável ação ao nível de receptores a-adre nérgicos centrais. individualizadas para cada paciente. evitand£ -se. correspondente â maior parte dos picos de liberj^ . Em todos os testes.62.(38.o GH foi determinado por método próprio de RIE completamente desenvolvido.0 0 ao a 30. Embora não se conseguisse uma solução comple tamente homogênea de clonidina em água. este procedimento fa cilitou também a administração da droga a crianças que se re cusassem a engolir o comprimido.23.44 ) .39. em todos os estudos prévios (11. Todos os soros e de um mesmo paciente foram dosados em um único ensaio.dessa maneira.41. o pico de GH ocorreu entre 60 e 120 minutos. método foi ajustado de modo a apresentar sensibilidade redor de 1.16.131 A transformação da clonidina em pó e posterior diluição em água foi a única maneira simples encontrada de se preparar diferentes micro-doses da droga. já que corres pondem a estímulos provocativos diferentes da secreção de GH.0 ng/ml e precisão máxima no intervalo de 5. 7 1 ) . 66.

58. 0 ritmo de crescimento. já que estudos prévios (35) demons^ traram que a resposta do GH aos testes provocativos não é dj_ ferente nestas doenças quando comparadas entre si ou com indivíduos normais. dosagem basal de SmC e resposta aos testes provocativos.132 çâo de GH observados nos testes provocativos. Foi possível a inclusão de pacientes com patolo- gias diversas no Grupo 1. o na- nismo hipofisãrio foi fortemente suspeitado na avaliação clí^ nica pela severidade do déficit estatural e/ou presença de sinais típicos.74. considerado um dos parâmetros mais importantes na decisão de se submeter ou não um p^ ciente com baixa estatura a investigação laboratorial extensa (74). confirmando a importância do exame clínico. basea da nas características clínicas. obede- ceu a critérios previamente estabelecidos na literatura (32. A especificidade do ensaio foi demonstrada pelo baixo grau de imunorreatividade cruzada do anti-soro anti-GH com os demais hormônios hipofisãrios e pela ausência de efeitos não específicos do meio de incubação sobre a reação antígeno-anticorpo. Em todos os pacientes incluídos no Grupo 2.75). Não se procu- rou obter maior sensibilidade porque não era a finalidade des te projeto estudar valores basais de GH. permitiu uma boa discriminação entre os pacientes . ritmo de crescimento. A c 1 assificação dos 31 pacientes em portadores (Grupo 1) e não portadores (Grupo 2) de déficit de GH.

apontada como um dos melhores índices do estado nutricional adequado de um indivíduo (74). mostrou-se normal em todos os pacientes incluídos no Grupo 1 e diminuída nos do Grupo 2.133 com e sem deficit de GH. a presença de SmC diminuída praticamente excluiu esta hipótese. faixa etária em que se enquadravam ^o dos com exceção de 1 paciente estudado neste projeto. acompanha ram a curva normal de crescimento. valode GH Por outro lado. A dosagem sérica de SmC. valores baixos estão freqüentemente associados a outras patologias. principalmente em quando . Em crianças aci ma de 5 anos de idade. embora situando-se abaixo do percentil 1 0 . e não permitem estabelecer o diagnóstico de nanismo hipofisário ( 7 5 ) . como hi potireoidi smo e desnjj trição. Embo ra eles pudessem apresentar alguma forma de GH biologicamente ativo mas imuncligicamente não ensaiãvei ( 7 4 ) . Não foi encontrada explicação adequada para a velocida de de crescimento normal nestes dois últimos pacientes. foi também utilizada para des^ cartar a presença de graus mais severos de desnutrição qualquer um dos pacientes do Grupo 1. Aliás. a dosagem sêrica normal de SmC. res normais de SmC praticamente excluem deficiência (75). freqüentemente como teste de tr'agem para excluir o diagnóstico de utilizada nanismo hipofisário (74. p o s s i b i l i — tando uma completa diferenciação entre el&s.75). enquanto que isto ocorreu em apenas 2 crianças do Grupo 2 durante o período de observa ção. Todos com exceção de 2 pacientes do Grupo 1.

0 ng/ml em pelo menos um teste p r o v o c a t i v o .3 ng/ml. (40) com a dose fixa de 0. ( 4 8 ) . Segundo os critérios pro- postos por Milner e col. a maioria dos auto res considera um pico de GH acima de 7. Entretanto. foram dose Os n i t i d a m e n t e Inferiores aos de Laron e c o l .0 ng/ml. Estes d£ de dos reforçam a idéia inicial de que os maiores valores pico. (11) com a dose de 0.134 associada a c o n c e n t r a ç õ e s basais baixas de GH. o qual estava também associado a menor incidência de respostas faiso-negativas. (39) com a dose i n i cialmente preconizada na literatura de 0. 48 Este valor está de acordo com os resultados obtidos nes te e s t u d o . Por outro lado. A c o m p a r a ç ã o entre o teste da clonidina e o ITT no grupo de crianças pré-púberes demonstrou que a média dos picos de liberação de GH foi maior (embora não estatisticamente s i g n i f i c a n t e ) no primeiro teste. apenas um pacien- te púbere do Grupo 2 mostrou resposta maior do que 2. já que todos os pacientes incluídos no Grupo 1 apresentaram picos de GH maiores do que 7. este paciente poderia ser cias sificado como déficit parcial de GH.15 m g / m 2 .obtidos por Laron e col (41) com a menor dose de cloni- COV' .1 mg. resultados obtidos foram mais compatíveis com os relatados por Dammacco e c o l . sendo ainda inferior a 5.0 ng/ml como resposta normal a qualquer teste de liberação deste hormônio (32 74).035 mg/m' e por Lanes e col. Embora um assunto controvertido. (41) com a fixa de 0.025 mg e aos de Lanes e col.

o mesmo estudo comparativo revelou que a média dos picos de liberação de GH foi menor (embora não estatisticamente significante) no teste da clonidina. Es ta posb'bi idade implicaria talvez em uma menor sensibilidade dos receptores o 2 -adrenérg1cos centrais ã clonidina na época da puberdade. A média dos pi- cos pós-clonidina neste grupo foi também inferior ã observada nas crianças pré-púberes. terem que provocativos No grupo de pacientes púberes. A obesidade. não estava presente em nenhum paciente. os quais necessitariam de quant^ dades da droga proporcionalmente maiores do que crianças. jã na puberdade.135 dina jâ testada. as respostas do GH aos estímulos clássicos são maiores do que na infância (19). talvez se devam ao fato dos autores incluído crianças e adolescentes em um mesmo grupo. o qual apresentou também incidência muito maior de resultados faiso-negativos do que o ITT. embora corrigida a maior superfície corpórea apresentada pelos adolescentes. contrariamente ao que ocorre com os de- . Não houve correlação entre a presença de resposta inadequada e a superfície corpõrea ou sexo do paciente. A única hipótese proposta para explicar estes para resultados ê que a dose de clonidina. tenha sido insuficiente para provocar uma eficiente liberação de GH nestes pacientes. fato curioso levando-se em consideração que a puberdade geralmente está associada a respostas mais exacerbadas de GH (19). freqüentemente associada a respostas subnormals de GH (73).

0 teste da clonidina (0. perda de consci ência em nenhum. que correspondem â maior parte dos pacientes que procuram o endo crinologista por baixa estatura. Nesta dose.39. A redução dos níveis pressóricos foi.0375 mg/m 2 em crianças pré-púberes. na dose de 0.0375 mg/m*) deve. que o teste da clonidina deve ser preferencialmente realizado com a dos? de 0.15 my/m 2 (23. Nos pacientes púberes. ser considerado o teste provocativo de eleição para excluir o diag — nóstico de nanismo hipofisário em crianças pré-púberes.0375 m g / m 2 . ao passo que os efeitos colaterais são muito mais discretos e menos perigosos do que os observados ou no teste realizado com 0.135 mais estímulos provocativos da secreção de GH. a sonolência e hipotensão observadas no teste da clonidina foram semelhan- tes ãs relatadas nos trabalhos em que a droga foi administra da nas doses de 0. Esta dose. a clonidina. no entanto.15 mg/m 2 ou no ITT. portanto. é um agente liberador de GH muito menos potente do que o estímulo hipoglicêmico. inferior ã observada com a dose de 0. não havendo. Com relação aos efeitos colaterais.66).62. Conclui-se. deve ser utilizada apenas em teste complementar para excluir .035 mg/m z (12) ou 0. portanto.025 mg ( 4 1 ) . a eficiência de liberação de GH ainda é maior do que a do ITT. no entanto. o em ITT resultou em sintomas desagradáveis de hipoglicemia todos os pacientes. pois. Por outro lado.

F i n a l m e n t e . quando os r e s u l t a d o s do teste da cloni dina (0.137 d e f i c i ê n c i a de GH neste grupo ou. em . deve ser s u b s t i t u í d a pela dose de 0. p r e f e r e n c i a l m e n t e .0375 m g / m 2 ) são associados aos do ITT. o d i a g n ó s t i c o de n a n i s m o hipofisãrio pode ser e s t a b e l e c i d o com segurança próxima a 1 0 0 % .15 m g / m 2 . sugerindo que ambos devam ser r e a l i z a d o s p a c i e n t e s com suspeita clínica desta p a t o l o g i a .

IX - CONCLUSÕES .

portanto.0375 mg/m2) apresenta incidência muito maior de resultados falso-ne gativos do que o ITT (0. excluir 3S) Quando os resultados do teste da clonidina (0. por tanto.139 le) O teste da clonidina (0. devendo. o diagnóstico de nanismo hipofisário pode ser estabelecido com segurança próxima a 100%.1 U / k g ) . ser considerado o teste provocativo de eleição em para excluir o diagnóstico de nanismo hipofisário crianças pré-púberes.0375 m g / m 2 ) apresenta naior efi ciência de liberação de GH e menor incidência de efeitos colaterais graves do que o ITT {0. sugerindo que ambos devam ser realiza- dos em pacientes com suspeita clínica desta patologia.0375 mg/n 2 ) são associados aos do ITT (0. ser utilizado apenas como teste complementar para deficiência de GH. . 29) Nos pacientes púberes.1 U / k g ) . o teste da clonidina (ú. devendo.1 U / k g ) .

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