INSTITUI-O

DE

PESQUISAS

ENERGÉTICAS

E

NUCLEARES

AUTARQUIA ASSOCIADA Â UNIVERSIDADE DE SÂO PAULO

COMPARAÇÃO DO TESTE DA CLONIDINA COM 0 TESTE DE TOLERÂNCIA k INSULINA NA AVALIAÇÃO DE PACIENTES COM BAIXA ESTATURA

MARCELO CIDADE BATISTA

Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de Doutor em Tecnologia Nuclear.

Orientador: Prof. Dr. tflilan Nicolau

SAO PAULO 1986

AOS HEUS

PAIS

JOÃO E DILZA

A LENA

cujo carinho e apoio se encontram escritos trabalho. em cada página deste

tOM!5SíO MAClONAL DE tr.e I. P. £. ,.

•••r:.3AR/SP

AGRADECIMENTOS

Esta tese resultou da colaboração t influência de várias pessoas, is quais expresso minha gratidão: Ao Prof. Dr. Wilian Nicolau, orientador e sobretudo amigo, cujo estimulo e participação pessoal foram de fun damentai importância para o meu desenvolvimento na área de Endocrinologia e Radioimunoensaio, culminando, agora, com a realização deste trabalho. Ao Dr. Júlio Kieffer (in memorian), ex-orientador e responsável por minha formação em Medicina Nuclear, por me Incentivar a ingressar no curso de pôs-graduação. Ã Dra. Constância Pagano Gonçalves da Silva, ex-orientadora, pelo apoio dado durante a realização dos cursos e seminários de area. Ao Dr. Walter Bloise, Dra. Berenice Bilharinho de Mendonça e Dr. Ivo Jorge Prado Arnhold, responsáveis por minha formação clinica na área de Endocrinologia. Suas valiosas sugestões contribuíram multo para a elaboração deste tra balho. Ao Dr. Francisco Homero D'Abronzo, que me auxiliou e orientou no desenvolvimento da parte metodológica d e s t e trabalho.

''-Wll-l DE Vr~

• • • - "A" SP

pela na análise estatística dos Cherem. A Valeria S*"iuel Undo. Isabel Cristina de Hello Guazzelii e Antonio CSneíido Pinheiro Palodesenvolvi- Ã Dra.A Maria Angel» Henrfques Zanella Fortes. pela participação rt dpsagem dos hormônios peptfdicos colaboração Ao Dr. mino. Ao Dr.. pelo forneci^ mento de preparações hormonais de referenda.Fuhdeçao de Amparo i Pesquisa do Estado de SSo Paulo. Sandra Ma>*a Villares. • • ••) ire. A todos os méoic:. e Norma no e ano Dra. ~\r „ k " " • . pela colaboração têc»!cõ indispensável no mento do radioimunoensaio ás SH.s estagiários e residentes trabalharam na Unidade d* òo>adas e Intersexo 1985-86. em especial i Dra. Rui Montei 10 de Barros Maciel. Maria Beatriz da Fonte Kohec. • • • ^ «J r . 5niornar Madurcira estimulo. pelo afilio na realização dos testes de T3nid Cecilio Silva. que de Edna Regina Nakandakare. Débora Gonçalves de Carvalho e esterôides. pela participação na dosagem do: hormônios pepndicos e soBatonedina C. i I . Paulo Lu<z k^iirrt Costa. Ã FAPESP . pelo apoio financeiro concedido durante a realização deste trabalho. : .

. r\ E.Este trabalho foi realizado na Divisão de CHnica Médica I do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina da Universidade de Sio Paulo. SP . . ij. r-íL DE ENERGIA U\CLEAR.

EAR/ .MATERIAL E MÉTODOS -RESULTADOS -DISCUSSÃO -CONCLUSÕES 1 5 9 19 21 23 87 125 138 X . " . .ÍNDICE I II III IV V V VII VIII IX -RESUMO -ABSTRACT -INTRODUÇÃO -OBJETIVOS -CASUÍSTICA .""^. '. Z. li..REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 140 ••'•" -'•' • • • ~~ C F : E R G : A • • .

I - RESUMO J ! .

.9.P/3P1 :. a variação 1ntraensa1o 5.4.0375 mg/m* de superfície corpórea por via oral. com idade entre 2. 8. 15. .2Y e a interensaio de de 19. • •. 8. 90 e 120 minutos.2 ng/ml.1 U/kg de peso por via endovenosa.7 e 12. 60. com coletas de sangue nos tempos de -30. 60 e 90 minutos.3 e 25. respectivamente. A sensibilidade do método foi de 1. 0.?:Cíí'.5 anos e altura entre 1. com coletas de sangue nos tempos de -30.6% para amostras-controie de 6H contendo 1.9 abaixo e 17. O. (2) teste da cionidina (TCLO): cionidina 0.3 e 8.1 ± 0.. 4.5 desvios-padrões da média para sexo e idade. 45.6. _*. 30.COMPARAÇÃO DO TESTE DA CLONIDINA COM O TESTE DE TOLERÂNCIA A INSULINA NA AVALIAÇÃO DE PACIENTES COM BAIXA ESTATURA MARCELO CIDADE BATISTA RESUMO Foram estudados 31 pacientes.08 ng / ml (média + erro padrío da média). Todos foram submetidos a 2 testes de liberação de GH: (1) teste de tolerância ã insulina (ITT): insulina simples 0. A especificidade foi considerada adequada com . 30.7 e 4. 0 6H foi dosado em soro por método de radioimunoensaio desenvo^ vido em nosso laboratório e padronizado por comparação com preparaçio de referência fornecida pelo "National Institutes of Health".

19 p* (pico < 7. os únicos efeitos colaterais observados foram Mpotensão e sonolência discretas.base ea estudos de Imunorreatividade cruzada e dos efeitos não específicos do meio de Incubaçâo. Foi estabelecida deficiência de GH em 8 crianças (Grupo ZA) e 2 adolescentes (Grupo 2B).6 e 9.0 ng/ml em pelo menos um teste de estimulo (ITT ou TCLO).7 (média .1 e 58. SmC baixa e pico de GH menor do que 5.2 + 3. ritmo de crescimento normal.8 • 2. mal-estar geral e sonoièri cia. ao passo que todos os pacientes apresentaram hípogíicemia (< 45 mg/dl) no ITT.5 ng/ml no TCLO. erro padrSo da média) e 15. A Incidência de resultados faiso-negativos 28.4 e 12. No . dosagem sérica normal de somatomedina C (SmC) e pico de libe raçSo de GH maior do que 7. respectivamente. Fora» considerados normais quanto à secreção de 6H 9 crianças (Grupo IA) e 12 adolescentes (Grupo IB) que preen^ chiam 3 ou mais dos seguintes critérios: ausência de sinais típicos de nanismo hipofisário.3X par* o TCLO. Estes valores nío foram considerados estatisticamente diferentes (p > 0. respecti_ _ vamente. Nos Grupos IA e 16.0 ng/ml nos 2 testes provocativos (ITT e TCLO).0 ng/ml) nos Grupos IA e IB foi de rs o ITT * de 11. os picos de liberação de GH foram de 10. acompanhada por sudorese. que apresentavam sinais típicos de nanismo hipofisário e/ou ritmo de crescimento diminuído. .05) quando comparados pelo teste "IP de Mann-Whitney.3 + 2. n&useas.3 + 1.8 ng/ml _ * _ no ITT e de 14. No TCLO.

os picos de GH observados no ITT e TCLü foram de 0.Grupo 2A. no entanto. .7 e 4. suspeita . sugerindo que esta deva ser a conduta preferida naqueles com clinica desta patologia.08 ng/ml. já que este era constituído por apenas ? pacientes. Não foi calculada a média dos picos no Grupo 2B. cujos valores máximos foram de 0. portanto. Et» adolescentes.3 ng/ml em nenhum teste.9 e 3. Deve. respectivamente.8 ng/ml no TCLO.1 • 0.5 ng/ml no ITT e 1.-: • r '} -. Conclui-se que o TCLO apresenta maior eficiência de causar de liberação de GH do que o ITT em crianças. Quando ambos cs testes são como realizados hipofisSrio em um mesmo paciente. ser considerado o teste de eleição para excluir o diagnóstico de nanismo hipofisário na idade prê-puberal. sendo signj^ _ ficantemente menores (p < 0. que engloba a maioria dos pacientes com déficit de crescimento.89 + 0.05) do que os do Grupo IA e não ultrapassando 2.08 e 1. •' •• . respectivamente. além efeitos colaterais menos graves. o diagnóstico de nanismo pode ser estabelecido com segurança próxima a 100%. devendo ser utilizado apenas teste complementar. o TCLO foi menos eficiente do que o ITT para excluir deficiência de GH.

II - ABSTRACT .

3 to 8. 60 and 90 minutes.0375 mg/m* surface area. 4.6. 30. (2) clonidine test (CLOT): oral at clonidine 0.08 ng/mi (mean + standard error of the mean).5 years. An adequate specificity was demonstrated by cros$-react1v1ty studies and by assays designed to test non-specific effects .2* and an 12.4. 0.5 standard deviations below the mean (1) for age and sex.9. with samples drawn -30. respectively. 45. 15.61 for quality with an Intraassay precision of 5. Serum GH was measured by a rad1o1mmunoassay method developed in our own laboratory and calibrated against a reference preparation provided by the National Institutes of Health. 8. The sensitivity of the method was 1. with heights from 1.3 and 25. 60. 30.9 to 17.1 U/kg body weight» with samples drawn at -30.COMPARISON OF THt CLONIDINE TEST WITH THE INSULIN TOLERANCE TEST IN THE EVALUATION OF PATIENTS WITH SHORT STATURE MARCELO CIDADE BATISTA ABSTRACT He studied 31 patients aged 2.7 Interassay precision of 19.1 + 0. All underwent 2 6H provocative tests: Insulin tolerance test (ITT): Intravenous regular Insulin 0. 8.7 and control samples of 1. 90 and 120 minutes.2 ng/ml. _ and 4. 0.

These values were .3 £ 2.8 ng/rol for ITT and 14.89 * 0.1 • 0. Slight hypotension and drowsiness were the side-effects observed during CLOT. associated with nausea. normal serum somatomedin C (SmC) measurement and peak GH responses greater than 7.3 ng/ml.8 • 2.7 (mean + standard tr.or of the mean) and 15. In Group 2A.5 ng/ml for CLOT.0 ng/ml) Groups 1A and IB were 28. These values were not statistically test of Mannfor different (p > 0. who had 3 or more of the following features: absence of typical signs of pituitary dwarf 1 sin.3 + 1. respectively. only had sweating.0 ng/mi GH response to 2 provocative tests (ITT and CLOT). False-negative results (peak i 7.05) when compared by the "U" -Whitney.of the medium used for Incubation. respectively.1 and 58.0 ng/mi In at least one provocative test (ITT or CLOT). low serum SmC and a less than 5. respectively.08 and 1.08 ng/ml. normal growth rate. with no response greater than 2. peak 6H responses for ITT and CLOT were 0.2 + 3. Eight children (Group 2A) and 2 adolescents (Group 2B) were diagnosed as GH deficient by the presence of typical signs of pituitary dwarfism and/or reduced growth rate. In Groups 1A and IB. malaise and drowsiness.4 and 12.U for ITT and 11. peak GH responses were 10. whereas all patients hypoglycemia (< 45 mg/dl) in ITT.3X for CLOT. A normal GH secretory reserve was established In 9 children (Group 1A) and 12 adolescents (Group IB).6 and 9.

7 and 4.5 ng/ml ITT and 1. Their peak GH responses were 0. besides being associated dangerous side effects.9 and 3. When both tests are performed in test a single patient. since only 2 patients were included in group. pituitary dwarfisn is very rarely nisdiagnosed. W . provocative test It should be considered the diagnosis of with less the best pituitary most to exclude dwarfism in the prepubertal age.05) than the ones Group 1A. suggesting that this should be the preferred this disorder Is clinically suspected.8 ng/ml for CLOT. the clonidine test is less effective than ITT to exclude GH deficiency in adolescents and should be used only as a complementary In pubertai patients. Nevertheless. E . observed in It was not possible to calculate mean peak levels this for for Group 2B. approach when COMISSÃO KMiQML OE EKERGiA NUCLEAR/SP !. We conclude that the clonidine test with a low-oral dose of 0. which encompasses patients with growth retardation.8 significantly lower (p < 0. '<•'. respectively.0375 mg/m* is more effective than ITT in promoting GH release in children.

Ill - INTRODUÇÃO .

Seu ritmo de secreção diário é de 1 a 2 mg. embora alguns estudos . cálcio. desaparecendo do pias ma com uma meia vida de 20 a 25 minutos (12). ponente fisiológico predominante consiste em uma cadeia polj^ peptfdica única. Acredita-se que esta açio seja mediada principalmente pela geraçlo das somatomedinas (57). potássio. ele estimula o crescimento proporcionado do esqueleto e tecidos moles. 0 papel primordial do 6H consiste no controle do crescimento somático pós-natal. Ele é sintetizado e armazenado nas células somatotrõficas. 0 GH presente em extratos hipofisários e no plasma corresponde a uma mistura heterogênea de pelo menos 6 pe£ 0 com tideos.10 A somatotrofina (GH) é o hormônio «ais abundante da hipófise humana.000 daitons. identificados por seu tamanho ou carga (42). fósforo e nagnésio. estando presente em quantidades de 5 a 10 mg em cada glândula. associado a balanços positivos de nitrogênio. correspondentes a 35 a 45* da pituitária e localizadas predominantemente nas suas asas laterais. Quando administrado a criaji ças com hipopituitarismo. contendo 191 aminoácidos e com peso molecular de 22.

Circulam no sangue ligadas a proteínas carregadoras de alto peso molecular (145. As somatomedinas também agem ao nível da h1p6- . dencainados "insulin-like growth factors" I (somatomedina C) e II.000 daltons). aumentando ou reduzindo a liberação de 6RH e SS. A secreçio de GH ê regulada pelo hi potalamo através de 2 peptideos sintetizados ao nível dos núcleos ventromediai e arqueado: a somatocrinina (6RH) e a somatostatina (SS). respectivamente. As somatomedinas corresponde* a una família de pe£ tideos cujos 2 principais componentes.11 "1n vitro" tenhas demonstrado UM possível efeito estimuiatõrio direto do 6H sobre r crescimento longitudinal dos ossos (34). possam ser utilizados como índice de secreçio da somatotrofina (75)'. têm peso mole cuiar de 7. concentrações séricas de 6H e somatomedinas atuam diretjs mente sobre o hipotfilamo. formando complexos proteicos que as protegem contra a proteõlise e as conferem mela vida maior e flutuação sangüínea menor do que •s dos demais hormônios peptidicos. Esta característica per_ mite que os níveis séricos de somatomedina C (SmC). São sintetizadas principalmente no ffgado e sua ação sobre o crescimento somático consiste em promove** a mitogenese e estimular a síntese de colãgeno e proteoglican. •gentes estimilador e inibidor da secreçio h1pof1sir1a de GH. cuja secr£ ção é diretamente controlada pelo GK.500 daitons (57). Através de mecanismo de "feedback" negativo.

provocada por tumor produtor de 6H. Por outro lado. por as con centrações sêricas deste hormônio situam-se em nível Inferior • 3. ciminuindo a resposta das células somatotrõficas ao 6RH (44). conseqüentemente.0 ng/ml. decorrente da defj_ ciência deste hormônio. de . participando também d? regulação da secreção de GH.12). Distúrbios da secreção de 6H podem resultar em patologias tais como o nanismo hipofisário. de 6H (44) ao passo que o bloquei o dos receptores colinérgicos inibe esta resposta (13).\2 fise. Mecanismos de controle neural exerce» importante ação sobre o hipotâlamo. o seu d1agnÓ£ tico ê multo Importante. com picos Menores ocorrendo posteriormente durante as fases mais tardias do sono (9. A secreção de 6H é episódica. A ativação dos receptores «-adrenérgicos e serotoninèrgicos centrais promove a liberação de 6RH e. caracterizada pulsos de duração limitada. Os valores máximos são detectados aproxi nadamente 1 hora após início do sono profundo (estádio III ou IV). Na maior part* do dia. 0 nanismo hipofisário corresponde a uma causa rara de retardo de crescimento em crianças. ou a acromegalia. já que se dispSe. atualmente. a es timulação dos receptores e-adrenérgicos centrais provoca 1n^ biçSo da secreção de 6H (44). C O M 1 a 2 picos moderados ocorrendo 2 a 4 horas apôs as refeições. sendo responsá- vel por menos de IX destes casos. Entretanto.

Estes também são necessários em crianças abaixo de 5 anos de Idade. A possibilidade de déficit de GH deve ser considerada em todas as crianças que se apresentarem con baixa esta tura proporcionada. o que pode ser ocasionado por outras doenças como desnutrição e hipotireoidismo. quando os níveis encontram-se diminuídos.na maioria das vezes. praticamente excluindo a presença de nanismo hipofi sirio quando normal (75). no entanto. j£ que sua secreção ê episódica e mantêm co£ centrações séricas baixas durante a maior parte do dia (28). Isto ocorre por- que os diversos estímulos agem ao nível do hipotllamo através . com o Intuito de se poder avaliar a reserva nenhum hipofisiria deste hormônio. como o GK extraído de hipófises humanas ou produzido por engenharia genética (12). nas quais não ê possível uma boa discriminação entre valores normais e baixos de SmC (75). A dosagem sérica basal de GH não permite.13 terapêutica adequada para esta doença. o diagnóstico de déficit de GH precisa ser confirmado por estudos da secreção deste hormônio. inferior a 3 desvios-padrões em relação de i média para sexo e idade (11). Nio existe. testes provocativos de liberação de GH foram desenvolvidos. Em crianças acima de 5 anos idade» a dosagem sérica de SmC corresponde a um bom teste de triagem. diferenciar entre crianças com e sem deficiência deste hormônio. Por este motivo. teste que consistentemente promova uma resposta hormonal ade quada em todo paciente sem déficit de GH. Entretanto.

Os testes de estimulo pode* ser divididos em 2 gran des grupos (17): 1t) TESTES DE TRIAGEM Estes testes consiste» na dosage» do GH em una única amostra de sangue coletada 20 a 40 minutos apôs o inicio do exercido fisico ou 1 hora após o inicio do sono.14 de Mecanismos neurals monoaainérgicos. zões. o efeito não é. só são utilizados a nível ambuiatoriai para excluir o diagnóstico de nanismo hipofisSrio em pacientes com baixa suspeita clinica desta patologia. portanto. de baixo custo e se» efeitos colaterais. convenientes. o diagnóstico de nanismo hipofisário deve se basear na demonstração de resposta subnormal do 6H a pelo menos 2 testes provocativos (32). Ape sar de seren fisiológicos. Modificando a secreçâo de SRH e/ou somatostatina. 21) TE8TES DEFINITIVOS Estes testes Implicam na dosagem de 6H em amostras seriadas de sangue coletadas antes e após administração de -. f - M . direto Por estas ra sobre as células somatotróficas hipofisárias. porisso. apresentam u*a incidência relativamente alta (ao redor de 30X) de resultados falso-negativos (Indivíduos sem deficiência derte hormônio mas com resposta subnormal ao teste) e.

a clonidina. Acredita-se que a hipoglicemia promova a secreção de 6H por estimulação de receptores o-adrenérgicos centrais. nSo foi observada liberação de 6H nenhum paciente com deficiência deste hormônio.77).59.64. sendo considerado por muitos autores o teste padrão C O R O qual os demais devem ser comparados (48). um agonista o-adrenérem gico central utilizado como snt1-h1pertens1vo (37. embora associado ás conseqüências perigose a um teste de sas da hipoglicemia. o teste de tolerância â insulina (ITT). Recentemente. São indica dos em pacientes com características clinicas de nanismo hipofisârio e/ou resposta subnormal triagem.35.55.20. Apesar de apresentarem uma menor incidência de resultados falso-negativos (variável de 10 a 30%).36. 7.15 mi estimulo farmacolõgico como a insulina. parece ser o mais eficiente no que refere i liberação de 6H. por vezes severos e perigosos. Nos vários estudos prévios sobre o ITT (18. Entre os testes definitivos. todos estão associados a efeitos colaterais desagradáveis. 1-dnpa.72.0. foi Introduxida como novo agente capaz de estimular a secreçio .0 ou 10 ng/ml). já que o bloqueio destes receptores por drogas como a fentolamina inj^ be esta liberação (44).69). dependendo do nível de GH •cima do qual a resposta foi considerada normal (5. a incidência de resultados falso-negativos variou de 8 a 265. argi nina ou glucagon.56. Em todos.

Esta ação da clonidina. um a-antagonista. que a administração de piperoxane. n3o tendo qualquer efeito sobre receptores dopaminérgicos ou serotoninérgicos.16 de 6H. Estudos mais recentes em animais indicaram a clonidina promove a liberação de GH por estimular neurônios hipotalãmicos secretores de GRH (44). Outra evidência por da da ação a-adrenérgica central da clonidina foi relatada Ganong e col. (38) em 1975. nestes Mesmos animais. bloqueia o aumento da secreção de GH induzido pela clonidina. (22). os autores e oral demonstra- ram uma elevação significante da concentração de GH em todos os pacientes sem déficit deste hormônio. a resposta do GH a esta droga permanecia que Inalterada. não houve aumento estatisticamente signify i cante dos níveis de 6H (máximo de 2. Gold e col. Nos 7 pacientes com hipopUuitarismo. com exceçSo de .5 ng/mi). Em estudos realizados em macacos Rhesus (5 ). G1l-Ad e col. eu provavelmente se deve à estimulação de receptores a. Utilizando uma dose de 0.-adrenérgicos centrais. (26) demonstraram. Em 1978.15 mg/m* de superfície corpôrea. em 1979. (23) foram os primeiros a descrever. õpós transsecção •edula espinhal. Chambers e Brown comprovaram que a clonidina atua ao nível de receptores o-adrenêrgicos centrais. o uso da clonidina como agente liberador de GH para excluir o diagnóstico de nanismo hipofisário em crianças adolescentes com baixa estatura. inicialmente demonstrada adultos normais por Lal e col. que observaram que.

Em apenas um trabalho (30).17 1 (pico de 5. fora» observadas sonolência e hipotensio Multo mais d1s_ cretas do que com 0.23.15 mg/»* seja um excelente estimulador da secreção de GH. houve redução dos níveis pressôricos que variou de 15 a 25 mmHg para a sistól^ ca e de 10 a 15 mmHg para a diastólica. C O M provivel deficiência GH.39.62. sendo em todos obser vado um maior pico de liberação de 6H e uma menor incidência de resultados falso-negativos no primeiro teste.1 mg (40) ou com a dose de 0. 0.66. 1-dopa (62. Com o objetivo de minimizar os efeitos colaterais. parcial de EM estudos Mais recentes. que res a pondeu ã expansão de volume.71).05 ou 0.025 mg (41). 39. associada a choque. Embora a clonidina na dose de 0.15 mg/m* foi comparado com o ITT (16.63. o teste da clonidina rea Uzado com a dose de 0.n relato (47). alguns autores tentaram realizar o teste da clonidina com d£ ses menores e fixas tais como 0.71) e arginina (71).035 mg/m* (11). Em todos os estudos realizados com esta dose (16. havendo decréscimo de 5 a 15 wwHg .15 «g/m*. ela provoca sonolêrt cia e hipotensão moderadas. levando os autores a chamar atenção para esta possível complicação do teste. foii observada hipotensão severa Em u.5 ng/ml). os resultados obtidos no ITT foram equivalentes aos do teste da clonidina no que diz respeito i efi— ciência de liberação de GH. Em todos estes estti dos.30.66).

Entre- tanto. no primeiro trabalho (40).6 ng/ml {média _ + erro padrão da média) e resultados falso-negativos de 361. a dose mínima que promova uma estimuiaçao eficiente da secreçSo de 6H associada a uma baixa Incidência de efeitos colaterais. Sabe-se que.8 ng/ml _ e de 8. no estudo de Laron e col. estudou-se um grupo misto constituído por crianças e adolescentes.6 + 1. no segundo (41). (40) obtiveram picos de GH de 11. . ou seja. portanto. demonstrado para o teste da clonidina. na época da puberdade. a um consenso geral sobre qual a dose de clonidina a ser utilizada nos testes provocativos. ainda. apenas pacientes pré-púberes foram avaliados. estes valores foram de 30. a r e s posta do GH aos estímulos provocativos clássicos é maior que a observada na infância. _ enquanto que.3X. os resultados no que diz respeito ã eficiência de liberação de GH foram muito discrepantes e não relacionados magnitude da dose. t mister. (41) com a dose 0. ao passo que.6 + 8.025 mg. à Lanes e coi. jã que ele nujn ca foi avaliado em grupo constituído apenas por pacientes p£ beres. NSo se chegou.050 ng de clonidina. no e£ tanto. respectivamente. devido ao aumento da do secreção de testosterona e estradiol (19). Estas diferenças talvez possam ser explica das pelo fato de que.18 na pressão sistôlica e de 2 a 7 mmHg na diastólica. que outros estudos sejam realizados para esclarecer esta dúvida. Utilizando 0. Isto não foi ainda.

IV - OBJETIVOS .

20 Comparar o teste da clonidina realizado com a admi nistração oral de uma dose de 0. . Incidência de efeitos colaterais indesejáveis.0375 mg/m* de superfície cor pórea com o teste de tolerância â insulina em grupos de entes pré-púberes e púberes no que diz respeito 2: Is) 28) Eficiência de liberação de GH.

V - CASUÍSTICA ••: MAC-:: ..CLEA?.\ E. n? EKERCA Í:I./S? : : .. . N.

statada uma estatura abaixo da média para sexo e idade. com Idade entre 2. sendo toda a avaliação clinica. laboni torial e radiolõgica realizada neste período. que procuraram o Serviço de Éndocrinologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC-FMUSP) com queixa de déficit de crescimento.Foram estudados 31 pacientes. Em todos. variando entre 1. Dezenove pacientes que se apresentaram com forte suspeita clinica de déficit de GH foram Internados por aproximadamente 5 dias na enfermaria da Divisão de Clinica Médica I do HC-FMU3P.5 anos. compietando-se a investigação diagnostica em um período máximo de 4 meses.3 e 8.5 desvios-padrões (DP). sendo 22 do sexo majs culino e 9 do sexo feminino. Os outros 12 pacientes foram estudados a nível ambulatorial. foi ccr.9 e 17. .

VI - MATERIAL E MÉTODOS .

creatinina. tamanho de pènis e testículos. 1. uréia. proteínas totais. anormalidades cardio- -respiratórias e gastrointestinais. tosse. cianose. convulsões. poliúria. desenvolvimento mamãrio.iia. diarréia. (45). distúrbios neurológicos. fraqueza Muscular. . f) exame ffsico: altura (média de 3 medidas feitas por UM único médico era estadiôraetro construído de acordo con as recomendações de Underwood e Van Hyk (74)). dores ôsteo-articulares. dosagens séricas de sódio. alterações visuais. desmaios. dispnéia. presença de estigmas somáticos. AVALIAÇÃO LABORATORIAL E RADIOLÕGICA GERAL Os exames laboratoriais gerais Incluíram hemograma completo. edema. de Cushing ou de déficit de 6H. as te. sonolència e intolerância ao frio. hematúria. caimbras.relação púbis-vértex/púbis-chão. de hipotireoidismo. verminose. nictúria. cllcio. albumina. peso. sinais de raquitismo. giicemia de jejum. disúria. potássio. as quais avaliados foram e utilizadas para o calculo dos respectivos desvios-padrões idade estatura!.2. Os graus de pubarca e teiarca foram clas- sificados de acordo com os parâmetros de Tanner (46). A estatura e o peso dos pacientes foram segundo as tabelas de Marques e coi. polidipsia. presença de pelos axilares e pu bianos.25 sença de cefalêia.

triiodotironina (T ) .26 fósforo.) em meninas foram realizadas em todos os pacientes. deixado em repouso por 3 horas a . Amostras seriadas de sangue foram coletadas através de veia canuiada com "butterfly"» mantida com solução fisiológica 0. tireotrofina (TSH). com o paciente repousando em decúbito dorsal por pelo menos 1 hora e em jejum por um período mínimo de 8 horas.4. 1. For»» também realizados Rx e de tõrax. AVALIAÇÃO HORMONAL BASAL Dosagens séricas basais de somatomedina C (SmC). 1. 0 sangue para dosagen5 hormonais foi colocado •m tubo de vidro simples.). fosfatase alcalina. tiroxina (T.91. TESTES FARMACOLÓGICOS DE ESTÍMULO Todos os testes Mveram início is 8:00 horas da »£ nhi. Rx de crânio para visualização da sela türcica Rx de *5os e punhos para avaliação da idade õssea conforme o Atlas de Greulich & Pyie (29).3. urin» tipo 1 . Niveis sêricos basais de hormônio luteinizante (LH) e hormônio foiiculo-estimulante (FSH) foram determinados apenas nas meninas púberes. U a paciente foi submetida a m tomografia computadorizada de crinio. te£ tosterona (T) em meninos e estradiol (E. parasitolõgico de fezes e eventualmente cariôtipo. sendo a punçlo realizada pelo menos 60 minutos antes da primeira coleta.

. MG) na dose de 0.30. . Foram ntonitorizados sintomas e sinais de hipoglicemia durante todo o teste.temperatura ambiente para que houvesse retração do coágulo e. 15.OLERÂNCIA À INSULINA (ITT) Amostras de sangue para dosagem de GH. os quais foram encaminhados ao laboratório Imediatamente após o término do teste.Bioquímica do Brasil S. a) TESTE DE . no tempo zero. tendo-se sempre 3 disposição solução de glicose h1 per tônica a 50X (20 m U a qual era sistematicamente Injetada por via endovenosa no final do teste ou durante este se ocorresse perda de consciên cia.A.1 U/kg de peso. aliquotado em volumes de 1 a 2 ml e congelado a -20°C até a hora do ensaio. Montes Claros. 60 e 90 minutos. 0. glicernia e cortisol (este último determinado apenas em pacientes com sus peita clinica de panhipopituitarismo) foram coletadas nos tem pos de . 0 soro foi então separado. centrifugado a 1000 rpm por 10 minutos. a seguir. A coleta de glicemia durante o teste de tolerância i insulina foi realizada em tubos contendo fluoreto de sódio. 30. a administração endovenosa em bolo de insulina simples (U-40 Biobrãs . sendo realizada. 45.

0 volume correspondente è dose calcula da para cada paciente foi então aspirado em seringa de plástico e injetado diretamente na boca. 30. O comprimido de 0. Medidas do pulso e pressão arterial foram realizadas em cada tempo do teste. solicitando-se ao paciente que succionasse e engolisse todo o liquido durante o pro cedimento. 30. 90 e 120 minutos. 45 e 60 minutos. SP) foi esmagado e dissolvido em 10 ml de ãgua resultando eu solução de 0. FSH. 60.28 b) TESTE DA CLONIDINA Amostras de sangue para dosages de 6H foram coleta das nos tempos de -30. sendo realizada. Seguiu-se lavagem da seringa com ãgua por 2 vezes para remoçio de possíveis resíduos da droga retidos nas paredes de plástico. TSH e proiactina (PRL) foram coletadas nos tempos de -30. no tempo zero.1 mg (Atensina 0. De Angeli. Itapecerica da Serra.0375 mg/m* de superfície corpõrea. no tempo zero. sendo também observados quaisquer outros efeitos colaterais. 0. na dose de 0. 0. 15. a adminis— .1 mg.01 mg/rol. c) TE8TE DO HORMÔNIO LZBERADOR DO TSH (TRH) ASSOCIADO AO TESTE DO HORMÔNIO LIBERADOR DAS GONADOTROFINAS (LHRH) Amostras de sangue para dosagem de LH. sendo a igua aspirada e administrada ao paciente da mesma maneira que a solução de clonidina. sendo a clonidina administrada por via oral.

. São Paulo. de Todos os aspectos da técnica foram cuidadosamente analisados e coji troiados de modo a se obter. SP). São Paulo. ao passo que o teste de do TRH associado ao LHRH só foi realizado naqueles com suspeita clinica de panhipopituitarisao.• . SP) associado na mesma seringa a 100 | g i de LHRH (Ayerst..ERC A r • ^ f ^ / s • : . METODOLOGIA LABORATORIAL 2. prestou-se particular atenção ao ritmo de crescimento e início ou evolução do desenvolvimento puberal. SEGUINENTO AHBULATORIAL Todos os pacientes foram avaliados em ambulatório a cada 3 meses por um período mínimo de 6 meses..tração endovenosa em bolo de ZOO ug de TRH (Escola Paulista de Medicina.V. 2. . ü E Ef. DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS SÉRICOS DE 6H Todas as dosagens de 6H foram realizadas em triply cata por método de radioimunoensaio (RIE) desenvolvido a pajr tir de reagentes Inteiramente preparados no Laboratório Pesquisas da Divisão de Clinica Médica I do HC-FMUSP. no final. 1.-:«'. Todos os pacientes fora» submetidos aos testes tolerância i insulina e clonidina. Nestas consul^ tas.1.5.. um ensaio adequado is CC.

7 com HC1 concentrado (Fig.30 finalidades deste projeto. envoltas individualmente em papel alumínio até o seu processamento. 1 mH feniimetanossulfonilfluoreto). gota a gota. realizada a 4*C assim como todas as demais etapas. Extração e purificação do GH-HC 0 6K utilizado na preparação de padrões p£ ra radiolodação e curva de deslocamento (a seguir designado GH-HC) foi extrafdo a partir de um lote de 100 hipófises con geladas. rehomogeneizado com 60 «1 de tam pão Tris-fosfato pH 9. previamente obtidas de cadáveres humanos. 0 precipitado foi retomado. ]).000 g por 1 hora. As hipófises.1. A suspensão foi então centrifugada . cujo pH foi ajustado a 8. São Paulo. coletadas durante autópsias de rotina pelo Serviço de Anatomia Patológica da FHUSP. Os sobrenadantes das frações foram combinados. baseado no método de Chapman e col. (6) com pequenas modificações (53).3 pela adiçlo de 4cIdo acético • 50X. com agitação constante.1. SP) por 2 horas e depois centrifugado a 10. A dissecção das glândulas.5 (ajustado com NaOH) e submetido aos mesmos processos das etapas anteriores.. filtrados em li de vidro e o pH re duzido a 6. foram conservadas a -20°C. 2. 10 mM Na 2 HPO 4> 5 mM EDTA. foi segui da de homogenização em liqüidificador durante 3 minutos com 200 ml de tampão Tr1s-fosfato (50 mM Tris. 0 homogeneizado foi colocado em agitador magnético (Fanem Ltda.

0 mM FENILME TILSULFONILFLUORETO. 9 PRECIPITADO E DISSOLVIDO EM TAMPÃO TRIS-ACETATO 50mM pH 8. lOmM No 2 HPO4 .31 HIPÓFISES DISSECADAS I HOMOGENEIZADOS EM TAMPÃO TRIS-HCL 5 0 mM pH 8.»*..S E PRL I PRECIPITADO p RETIRADO RESÍDUO DE ETANOL COM TAMPÃO TRIS-ACETATO 50mM pH 4 .« „ SOBRENADANTE E 1 l SOBRENADANTE RESÍDUO INSOLUVEL FILTRAÇÃO EM SEPHADEX G-IOO PROTEÍNAS DE ALTO PESO MOLECULAR P|CO ' h e H PIC0 DEh 6 H CROMATOGRAFIA EM DEAE CELULOSE GH ELUÍDO EM TAMPÃO ACETATO DE AMÕNJA 2 0 0 mM pH 8 .7 (CONTENDO 1. 9 REALIZADA EM ETANOL ( 1 = 7 ) u PRECIPITADO C COLETA . PRECIPITAÇÃO ISOELETRICA EM pH 4 .ESQUEMA RESUMIDO DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO DO GH-HC .5. « „ « .5mM EDTA) SOBRENADANTE A r RESÍDUO A REEXTRAIDO SOBRENAOANTE B RESÍDUO B i n I COMBINAÇÃO SOBRENADANTE A + B PRECIPITAÇÃO EM pH 6 . «. 3 I CONGELAÇÃO DO GH A . 0 COM AC. 1 . . ACÉTICO A 5 0 % . FILTRADO E CONCENTRADO EM MILLIPORE SOBRENADANTE D COLETAM-SE AS 6 30PR0TEÍNAS .1 9 8 » C FIG..

5. üpsalla.000 g por 1 hor?.5 contendo ciortw tanol 0. librada com tampão Tris-acetato 50 mM pH 8. seguida de decantaçio do sobrenadante e ressuspensão do precipitado com 50 ai de tampão Tris-fos fato cujo pH foi ajustado a 6.32 por 18 horas a 8. coa agitação constante.000 g por 1 hora. de icido acêtico a 50X e etanol absoluto (volume 1:7). A fração sobrenadante foi aplicada a uma coluna (5 x 100 cm) de Sephadex 6. gota a go ta. que continha o 6H. cujo pH foi ajustado a 4.000 g. A solução resultante repousou então por 12 horas antes de ser centrifugada a 15..000 g por 1 hora. o qual foi centrifugado a 15. A suspensão foi então centrifugada a 15. foi lava do C O M 50 ml de tampão Tris-fosfato. Esta fração homogeneizada foi adicionada ao sobrenadante anterior e centrifugada a 8. TSH e lipotrofinas.021.000 g por 1 hora e o precipitado dissolvido em 500 ml de tampão Tris-acetato 50 mN pH 8.100 (PharMacia Fine Chemicals. previamente equi.9 pela adição seqüencial. A solução resultante foi filtrada e concentrada utilizando-se Membrana de Millipore 10 K a um volume de 90 ml. FSH.5%. A fração sobrenadante foi decantada e separada para eventual extração de LH. A eluição foi realizada com este Mesmo tampão (fluxo 75 ml/min) e o efluente da coluna monitorizado com .9 com HC1 concentrado contendo etanol 12. sendo o precipitado separado para eventual extração da prolactina. 0 precipitado. 0 pH do sobrenadante foi reduzido a 4.3 con HC1 concentrado. Suécia).

3. NJ.c 52 (Whatman. 0 conteúdo de uma destas alíquotas foi sub metido a testes de controle de qualidade que consistiram em: a) determinação da concentração de proteínas pelo método de Schacterie & Pollack (68). obtendo-se em média um de 1. Clifton. c) estimativa da atividade biológica do GH-HC por método de . a coluna foi lavada com 350 ml de tampão acetato de amônio 50 mM pH 8. mantendo-se o mesmo volume e monitorizando-se o efluente com absorbãncia a 280 nm (Fig. CA. Los Angeles.1 ml e congelada em ni trogênio líquido (-198°C). a em sua fração central (8 ml) foi coletada em frasco imerso gelo seco.05 M pH 8.15 mg/ml.46 mg/ml. o efluente da coluna de Sephadex foi conectado diretamente a outra coluna (2 x 60 cm) de dietilaminoetil ce lulose DEAE . utilizando-se 6 diluições progressivas (1/200. b) quantificação do GH-HC por "kit" comercial de RIE (Diagnostic Products Corporation.000 até valor 1/3. 2A).33 absorb&ncia a 280 nm (Fig. EUA). Quando o pico principal do GH começou a ser eluido. Apôs receber o 6H. preequilibra da com tampão acetato de amorno 0. EUA).5 (fluxo 80 ml/hora) em um gradiente crescente de concentração até 200 mM.200. aliquotada em volumes de 0. Quando o GH nonõnero começou a ser eluido. 2B).000 em tampão de ensaio) como amostras desconhecidas e obtendo-se em média um valor de 1.

CR0MAT06RAFIA DO GH-HCEM SEPHADEX G.c 52 ( B). 200 2000 VOLUME (ml) VOLUME (ml) FIG.IOO(A) E EM D E A E . 2 . .34 ABSORBANCIA ABSORBANCIA Inn) 100 • 90 60 70 60 50 : 40 30 20 10 (nm) t \ \ / \ MONO MERO 100 »0 80 FRAÇÃO CENTRAL COLETADA r~i í\ 1\ / \A 70 60 50 • 40 30 20 • 10 IDÍMERoA U 7\ 1000 (A) ^ V y J / ^V 100 (B) \ x.

e) determinação da contaminação por outros hormônios hipofi sérios através de "kits" comerciais de RIE (Clinical Assays. Estes foram aliquotados em volumes de 0. MD. EUA (GH-NIH) por ele troforese em gel de poliacrilamida (8). . a qual demonstrou ter o GH-HC padrão de isohormônios com predominância forma fl semelhante ao do GH-NIH. MD. St Louis. FSH * 82 mUI/mg e LH = 641 mUI/mg.1 M pH 8.5 ml e congelados a -20*C por 30 dias. mo dia utilizados para marcação e a seguir desprezados. Bethesda. 0 GH-HC foi conservado em nitrogênio liqui do por um período de 9 meses. uma alíquota foi descongelada e utilizada para: a) preparação de padrões para radioiodação contendo 5 ug de GH em 50 ul de tampão fosfato (TF) 0. d) comparação do GH-HC com padrão fornecido pelo National Institutes of Health.5 com albumina séHca bovina (BSA.1% (a seguir designa do tamplo de ensaio). Neste perfodo. Sygma Chemical Company.2 M pH 7.1 U/ml.4 preparado com fosfato de potássio monobásico. Estes foram no mes. b) preparação de padrões para curva de deslocamento contendo 1 ug de GH em da 1 ml de tampão borato (TB) 0.35 radiorreceptor em fígado de mulher grávida (10). cujo re sultado foi de 2. EUA): TSH < 3 uUI/ral. MA. Cambridge. PRL = 3 ng/mg. EUA) e azida sôdica 0. A cada 45 dias aproximadamente.

A eficiência de radioiodação foi determine da de maneira grosseira pelo denominado teste do carvão.4) homogenização final da mistura.0 mg/ml em TF 0. Buckinghamshire.. 2.36 uma alíquota foi descongelada na hora de cada ensaio utilizada para a preparação de soluções contendo e 1. Inglaterra). Em cada processo de marca ção.0.4 ml de tampão e .2 M pH 7. Procedeu-se então a nova agitação suave por 10 segundos antes da adição de 0.e 1 mC1 de I sob a forma de lodeto de sódio livre de carreador (Amersham International plc. adidonaram-se seqüencialmente. Após homogenização. no qual 1 ul do material radioiodado. em tubo de vidro 12 x 60 mm.A.25. 10. 20 e 40 ng/ml de GH "frio" em tampão de en saio.2 M pH 7. seguidos de agitação suave por 10 segundos e adi^ ção de 20 pi de solução de metabissulfito de sódio (Merck) contendo 2.1. foram pipetados 20 ul de solução de cloramina T (Merck S. 2.2 M pH 7.diluído em 2.4 mg/ml em TF 0. sendo todas desprezadas apôs o término do RIE. RJ) contendo 1. Rio de Janeiro. 50 ul do padrão para radioiodação (preparado no mesmo dia) 125 contendo 5 ug de GH-HC.5. Radioiodação do GH-HC A radioiodação do GH-HC foi realizada de acordo com o método clássico de Greenwood e Hunter (27) com apenas algumas modificações (51).4.4.2. 5. com no mínimo 100 mC1/ml.2 ml de solução de lodeto de sódio (10 mg/ml em TF 0.

1% e azida sódica 0.5 ml/minuto. 2 alíquotas do mesmo padrão de GH-HC foram si multaneamente submetidas a radioiodação. Todo o conteúdo do tubo de radioiodação foi colocado no topo da coluna e.6 com BSA 0.37 de ensaio.75 zada em coluna de vidro (1 x 55 cm) contendo Sephadex (Pharmacia) deareada e previamente equilibrada com TB 0. LKB. com fluxo de 0. logo após sua penetração no Sephadex. foram adicionados 0.1 N pH 8. o sobrenadante foi separado do precipitado por decantação e a radioatividade de ambos determinada em contador de cintilação de poço (Gamma 4000. CA.1%.. Apôs horaogenização em "Vôrtex" e centrifugação por 15 minutos a 1000 rpm.05 M pH8. o qual foi em seguida submetido a purificação. Irvine. Considerou-se uma boa eficiência de marca ção quando 60X ou mais da radioatividade total encontrava-se no precipitado (correspondente ao GH-HC 1 25 I). sendo os primeiros 6 ml do eluTdo desprezados.3 ml de solução de lodeto de sódio (10 mg/ml). A seguir.5). Como.1 ml de solução de . A cromatografia do GH-HC - I foi realiG. Beckman Instruments Inc. EUA).6 com BSA 0. em cada processo. a eluição foi iniciada com TB 0. Suécia) em 80 tubos de vidro (15 x 100 mm) contendo 0. Bromma. o teste do carvão de permitiu também escolher o material com maior eficiência marcação. 0 restante foi coletado em alíquotas de 1 ml a cada 2 minutos (2070 Ultrorac II.foi adicionado em duplicata a 0.5 ml de suspensão de carvão (carvão Merck a 100 mg/ml em TB 0.1* e azida sõdica 0.1%.05 H pH 6.

. I integro e o segundo ao Praticamente não foi observado pico de agregados do hormônio Marcado.38 BSA 21 em TB 0.Í 2 5 I diluídos em 2. Este foi. no final.1X. aliquotado em volumes de 0. 0 controle de qualidade do GH-HC . Os conteúdos dos tubos que acusaram as 3 maiores ati vidcdes no primeiro pico foram misturados de modo a se obter. Apôs construção do gráfico expressando a distribuição da radioatividade ao longo do volume eluído (Fig.6 con azida sódica 0. Para que o hormônio marcado fosse conside_ rado de boa qualidade. 3 ml de GH-HC .4 ml de tampão de ensaio ã suspensão de carvão.125 I p u j rificado consistiu em: *) DETERMINAÇÃO DO GRAU DE CONTAMINAÇÃO POR TESTE DO CARVÃO 1 25 I LIVRE PELO Este teste foi realizado da mesma maneira que antes da cromatografia. 3 ) . 2 picos foram constatados: pondendo ao 6H-HC o primeiro corres I livre. A radioatividade dos 80 tubos foi determinada por contagem de 10 | l do conteúdo de cada tubo em dete£ i tor de cintilação gama. só que agora adicionando-se 10 ul de GH-HC . a porcentagem de radioatividade total 125 presente no sobrenadante (correspondente ao I livre) deve ria s1tuar-se abaixo de 20X (51).1 ml e congelado a -20°C por um período de 30 dias.05 M) pH 8.1 2 5 I integro. a seguir.

H C . 3-CROMATOGRAFIA DO G H .H C .75. .39 CP» .I 2 5 I EM SEPHADEX G. (XIO3) G H .I 2 5 I ÍNTEGRO 60 60 VOLUME (ml ) FIG.

pre parada em tampão de ensaio sem BSA e conservada a 4°C. 1/50 e 1/25 em tampão de ensaio.0 ml de solução de polietilenoglicol a 17X (PEG S000.consistiu na adição de 1. Se- guiu-se a centrifugação a 3000 rpm por 30 minutos a 4*C e de cantação do sobrenadante. o foi grau de ligação máxima do hormônio mar ado ao anticorpo determinado pela razão (radioatividade do precipitado/radio^ tividade total x 100). (1) (2) anti-soro 72 (100 ul de solu (3) GH-KC 1Z5 ção 1/1000 em tampão de ensaio). cujas &ti_ . Após contagem do precipitado.49.05) 125 I PELO Os seguintes reagentes foram Incubados. I (100 pi de solução 1/200 em tampão de ensaio). por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) concentrações crescentes de hormônio marcado (100 ul de solu_ çôes 1/100. em triplicata. Sygma). para C) ESTIMATIVA DA ATIVIDADE ESPECÍFICA DO GH-HC MÉTODO DO AUTODESLOCAMENTO (25. 1/75.utilizado neste co«o em todos os demais ensaios deste projeto. 0 método de separação do complexo antfgeno -anticorpo do antfgeno livre. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: tampão de ensaio (100 pi). devendo situar-se acima de 80% que o GH-HC 125 I fosse considerado de boa qualidade. em triplicata.40 b) AVALIAÇÃO DA IMUNORREATIVIOADE MAXIMA DO GH-HC PELA ADIÇÃO DE EXCESSO DE ANTICORPO 125 I Os seguintes reagentes foram incubados.

A seguir. a razão ra dioatividade ligada/radioatividade total (B/T). Em 3 tubos (N5B). I (100 | l de solução 1/200 i apenas para em tampão de ensaio). utilizada p^ ra construção da curva dose-resposta da Fig.25. respectivamente. 1.NSB T x 100 . (2) anti-soro 72 (100 pi de solução 1/90.0.41 vidades foram previamente determinadas. 4. incubou-se tampão de ensaio (200 pi) e hormônio marcado (100 pi) determinação da ligação inespecffica. foi calculada para cada padrão de GH "frio" e amostra desconhecida pela equação: B T onde: Bi (ou Bn) * radioatividade do precipitado correspondente ao padrão 1 ng/ml de GH "frio" (Bi) ou & desconhecida n (Bn). a seguir denominadas amostras desconhecidas) e de hormônio "frio" (100 pi de solu ções contendo 0. 10. Todos os tubos foram contados antes e apôs precipitação com PEG para determinação da radioatividade total e do precipitado.5. 20 e 40 ng/ml em tampão de ensaio). tubo amostra Bi (ou Bn) . 5. 2. NSB * radioatividade do precipitado correspondente ao NSB.000 em (3) GH-HC 125 tampão de ensaio). T * radioatividade total.

25 2.0 10 20 40 LOG [ 6 H ] (ng/ml) FIG.CONCENTRAÇÃO DEGH-HC. 4 .5 5.CAlCULO DA MASSA DE GH-HC J 2 5 I PRESENTE EM UMA AMOSTRA DESCONHECIDA PELA TÉCNICA DO AUTO-DESLOCAMENTO.I 2 5 I PRESENTE NA AMOSTRA DESCONHECIDA 1. .

presente nas diferentes amostras desconhecidas.43 A concentração do hormônio Marcado e. a partir do qual a atividade especifica foi calculada pela reciproca da inclinação da reta obtida por regressão linear simples. sua «assa. Apôs separação com PEG e contagem do precj^ pitado. correspondente ao tubo NSB).1 2 5 ! 4°C E A -20»C CONSERVADO A Os seguintes reagentes foram incubados. conseqüentemente. em triplicate. (2) anti-soro 72 (100 ul de s o U ção 1/90.foi entio determinada por interpolação de suas respectivas razões B/T a partir da curva dose-resposta. correspondente ao tubo Bo) ou tampão de ensaio (100 pi. d) DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE DO GH-HC. correlacionar a massa e atividade do traçador presente em cada amostra e construir o grafico da Fig. inespe cffica (XHSB) e especifica (XBo especifica) foram calculadas pelas equações: . (3) GH-HC-125I (100 ul de solução 1/200). 5. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) tampão de ensaio (100 ul).000. Foi possível. dessa Maneira. as porcentagens de ligação total (XBo total).

0 r« 0.0 2.985 • / 6. .0 y^ r ATIVIDADE ESPECÍFICA» — • i i i V 1 ».MASSA DO TRAÇADOR 8.0 10 ATIVIDADE DO TRAÇADOR (jiCi.0 8. 5 -RELAÇÃO ENTRE A ATIVIDADE DE UMA AMOSTRA DE G H .10'2) FIG.0 4.I 2 5 I E SUA RESPECTIVA MASSA DETERMINADA PELA TÉCNICA DO AUTODESLOCAMENTO.0 4#0 6.H C . 2.

IB o total .XNSB Medidas seriadas ao longo de 30 dias após radiolodação (Fig. sendo desprezadas após o término deste.000). (3) GH-HC. (2) anti-soro 72 (100 ui de solução 1/90.125 I . sendo esta redu Ção U M pouco «ais acentuada a 4*C do que a -20"C.4$ radioatividade do precipitado do tubo Bo XBo total « radioatividade total x 100 radioatividade do precipitado do tubo RSB MSB = x 100 radioatividade total « o específica . «) COMPARAÇÃO DO GH-HC - 12 *I COM GH-NIH - 125 I (PREPARAÇÃO PARA RADIOIODAÇAO FORNECIDA PELO NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH E MARCADA NO HC-FMUSP) 0s seguintes reagentes foram Incubados» em triplicate. Estes dados demonstrara* uaa aaior perda de Imunorreatividade do h o m ô nio «arcado a 4*C e. 6) revelara» uma redução lenta e discreta dos 3 parâmetros ao longo de todo o período. as alíquotas de 6H-HCI conservadas a -20*C passara* a ser descongeladas e diluídas apenas na hora do ensaio. por esta razão. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) padrões de GH "frio" (100 pi de soluções contendo desde 0 até 40 ng/»l>.

éo 60 40 20 5 10 15 (B) 20 25 30 DIAS POS RADIOIODAÇAO DO GH-HC FIG.LI6.2 0 * C ( B ).VARIAÇÃO DA PORCENTAGEM DE LIGAÇÃO TOTAL ( • ) . 6 . INESPECÍFICA ( • ) E ESPECÍFICA ( â ) AO LONGO DE 3 0 DIAS APÔS RADIOIODAÇAO DO GH-HC COM ESTE CONSERVADO A 4 * C ( A ) OU A . 80 46 60 4O 20 10 15 20 25 30 DIAS PO'S RADIOIODAÇAO DO GH-H( (A) %DE LI6. .

Oito processos de radioiodação foram reali zados em um período de 9 meses.1 2 5 I . as curvas dose-resposta para cada hormônio marcado fo ram elaboradas e comparadas entre si (Fig.47 OU GH-NIH - I (100 pi de solução 1/200). a eficiência de marcação situou-se entre 64 e 71%. Em dois.1. Indicando ser o nitrogênio liquido eficiente meio de conservação para o GH-HC. Em 3 tubos (NSBX incubou-se apenas tampão de ensaio (200 pi) e hormônio sarca do (100 |il).3. Apôs separação com PEG e contagem do preci pitado. o grau de contaminação com 125 I entre 4 e 15%. 7 ) . Nos outros 6 pro cessos. 2. porisso. 0 paralelismo observado entre elas confirmou o comportamento do GH-HC 1Z5 idêntico I em relação ao GH-HIH . GH-HC 125 I Não houve deterioração significante de n<e nhum destes parâmetros ao longo dos 9 meses. a eficiência de marcação determinada pelo teste do carvão foi inferior a 501 e. demonstrando a boa qualidade do para fins de RIE. Produção de anti-soro anti-GH A técnica de Imunização empregada para a produção de anti-soro anti-GH baseou-se primariamente no método de Va1tukat1s e coi. (76). . a imunorreativj^ dade máxima entre 82 e 94% e a atividade específica entre 124 e 157 uCi/ug. um a cada 45 dias aproximada mente. o material rja dioiodado não foi submetido a purificação.

48 L06IT0 B/Bo (%) 80 50 20 1.* J E GH-NIN-125! (A-*).5 5. 7 .COMPARAÇÃO ENTRE CURVAS DOSE .RESPOSTA PREPARADAS COM GH -HC -'25l ( • .25 2.0 10 20 40 LOG [GH] (ng/ml) FIG. .

49 Preparou-se.6 mg de 6H. A cada 3 semanas. seguida de homogenizaçao em Vórtex e repouso por 24 horas a 4°C para confirmar a não separação das partes. sõ que com emu Isão preparada com adjuvante incompleto Freund. 0 sangue coletado foi deixado em repouso a 4°C por 48 a 72 horas para que houvesse retração do coágulo. Apôs a quarta imunização de um dos animais. Estes consistiram em: a) DETERMINAÇÃO DO TÍTULO. foi realizada nova imunização nas mesmas condições que a primeira.inicialmente.1 ml da emu1 são em diferentes pontos do dorso. O QUAL FOI DEFINIDO COMO A DILUI . 3 coelhos da Nova Zelândia (idade média de 3 meses) foram imunizados. foi finalmente obtido um anti-soro (anti-soro 72). Estocolmo. Após raspagem dos pelos do dorso. Procedeu-se entco 3 titulação do anti- -soro para se determinar a necessidade ou nãu de novas 1munj[ zações. Amostras de sangue foram colhidas através de da punçSo da veia central da orelha 10 dias após cada Imunização. correspondendo a 0. 9 ml de so lução salina e 6 ml de adjuvante completo de Freund. Suécia). cujas excelen- tes características foram demonstradas pelos testes de c o n trole de qualidade. cada animal recebendo 30 aplicações intradérmicas de 0.emulsão contendo 3 mg de GH (Kabi Diagnostica. seguido de separação do soro e diluição do mesmo com tampão de ensaio na proporção de 1:1.

000 até 1/1.50 ÇÃO FINAL DO ANTI-SORO CAPAZ DE LIGAR BOX DO (54) HORMÔNIO MARCADO EM CONDIÇÕES PRÉ-ESTABELECIDAS Os seguintes reagentes foram incubados. incubou-se apenas tampão de ensaio (200 ul) hormônio marcado (100 pi). por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: tampão de ensaio (100 ul). Em 3 tubos (NSB). os valores da %Bo especifica para cada diluição do e anti-soro foram calculados e expressos no gráfico da Fig. 8. luçío 1/90. Incubou-se apenas tampão de ensaio (200 pi) e hormônio marcado (100 ul). Apôs separação com PEG e contagem do precj^ pitado. (1) (2) diluições progressivas do anti-soro 72 (100 pi de solução 1/30. seja. . em triplicate.920. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) concentrações crescentes de GH "frio" (100 pi de soluções cojt tendo desde 0 até 40 ng/mi). (3) GH-HC I (100 ul de solução 1/200). b) CÁLCULO DA CONSTANTE DE AFINIDADE (K) PELO MÉTODO DE SCATCHARD (67) Os seguintes reagentes foram Incubados.000 em 125 tampão de ensaio). 0 titulo do anti-soro 72 foi então determinado pela diluição final correspondente a 501 de ligação especifica. Em 3 tubos.000. ou 1/640.000) (2) anti-soro 72 (100 ul de so 125 e (3) GH-HC I (100 ul de soluçlo 1/200). em triplicata.

.51 % DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA 70 30 20 10 TITULO DO ANTI-SORO O o o 6 C D — o o _O d fO o o o o o o d ~d C M — O O O -d CD o o o -d C O oi DILUIÇÃO FINAL DO ANTI-SORO (LOG) FIG. 8-CURVA DE TITULAÇÃO DO ANTI-SORO 72.

o valor (2.1 . • A partir do grafico relacionando estes parâmetros (grafico de Scatchard. de 2 K reta . Os parâmetros radioatividade ligada/radioatividade livre (B/F) e concentração de hormônio ligado ao anticorpo (b) forem calculados para ca da padrão de 6H "frio" pelas equações: B F (Bi . 9 ) .(Bi-NSB)] (Bi-NSB) b » concentração de GH "frio" x onde: Bi * radioatividade do precipitado correspondente â concentração 1 ng/ml de GH "frio". respectivamente. T ' radioatividade total.52 Todos os tubos fora» contados antes e após precipitação com PEG para determinação da radioatividade total e do precipitado.NSB) IT . Fig. NSB = radioatividade do precipitado correspondente ao tubo NSB. IO 1 0 l/mole) foi determinado pela inclinação da obtida por regressão linear simples.

985 1.DETERMINAÇÃO DA CONSTANTE DE AFINIDADE ( K ) PELO GRA'FICO DE SCATCHARD.5 r= 0.IO* 12 ) FIG.0 0.5 25 50 75 100 b(Mol/I.S3 B/F 2.0 1. . 9 .

(2) anti-soro 72 (100 ul de solução 1/90. HPL (até 10. Após separação com PEG e contagem do preci^ pitado. TSH. FSH. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) concentrações crescentes de hormônio "frio" em tampão de ensaio (100 ui) tais como 6H (0 até 40 ng/mi). e» triplicate.i) «arcado 6H-HC .000 ng/ml cada um). FSH e PRL (até 2. TSH (até 2500 ng/ml). NSB « radioatividade do precipitado correspondente ao tubo NSB.54 c) DETERMINAÇÃO DA IMUNORREATIVIOADE CRUZADA COM PADRÕES PUROS DE LH. Bo * radioatividade do precipitado correspondente i concentração zero. . PRL E HORMÔNIO LACTOGÊNICO PLACEN TÂRIO (HPL) FORNECIDOS PELO NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH (PREPARAÇÕES PARA RADIOIODAÇÃO) Os seguintes reagentes foram incubados. o grau de inibição da ligação maxima (B/Bo) foi d e terminado para cada hormônio pela equação: B — « (Bi-NSB) r x 100 Be (Bo-NSB) onde: BI • radioatividade do precipitado correspondente i concentração 1 ng/ml de hormônio "frio".000 ng/ml) e LH.1 2 5 I (100 ul de solução 1/200) e hormônio (100 ul).000) e '.

HPL < 0. 10).0.1. conservadas a 4°C e utilizadas nos ensaios durante este período.1 ml foram liofilizadas e pos teriormente conservadas a -20°C. A cada 6 meses.55 A porcentagem de imunorreatividade cruzada do anti-soro 72 para cada hormônio foi então determinada pela razão entre a concentração de 6H "frio" e a do hormônio estu dado necessárias para provocar 50% de inibicão ( 2 ) . PRL . A partir destas últimas alíquotas. uma foi re constituída e diluída 1/10 em tampão de ensaio.U. TSH < 0. Método de separação do complexo antígeno-anticorpo do antigeno livre A separação do complexo antígeno-anticorpo do antigeno livre foi realizada pela técnica do polietilenoglicol. descrita em 1971 por Desbuquois e Aurbach (14). As características do anti-soro 72. B/Bo * 50X (Fig.3X.000 em tampão de ensaio foram preparadas a cada 30 dias.6*. Este agente provoca a redução da quantidade de Sgua livre do sistema. Os seguintes valores foram encontrados: LH < 0.1 ml e recongelada a -20°C. Alíquotas de 0. comparáveis âs descritas na literatura para anticorpos anti-GH de comprovada eficácia (50). ou seja.3X.3t. FSH < 0. confirmaram a sua excelente qualidade.4. permitindo que ele fosse utilizado em todos os ensaios deste projeto. soluções 1/90. realiquotada eu volumes de 0. resultando em diminuição da solubilidade e precipitação . 2.

CRUZADA Ill4ng/ml X 100 .0.6 % LOG 1 TO B/Bo(%) PRL 20 1.5 5.) FIG.DETERMINAÇÃO DO 6RAU OE IMUNORREATIVIDADI CRUZADA DO ANTI-S0R0 72 COM A PRL.0 10 20 40 250 500 1000 2000 LOG [ H ] (ng/m. .25 2.imunuirnc Ml IVIUAUt . 1 0 .

citado como a prin^ cipai desvantagem deste método. quais exigem maior custo e complexicidade. Suas principais vantagens consistem em ser um método simples e de baixo custo no caso do GH. dos seguintes reagentes: (1) tampão de ensaio (100 ul). precipitação foi realizada com diferentes concentrações nais de PEG (2 a 20%) diluído em tampão de ensaio sem ao A fiBSA. correspondente tubo NS6).57 do complexo antfgeno-anticorpo ( 7 ). promover a separação instantânea e e.0 ml do mesmo imediatamente apôs adição soro humano (100 ul). por 20 a 24 horas a temperatura ambiente. (3) GH-HC . o PEG foi escolhido como método de separação.000. as porcentagens de ligação total. como é o caso do RIE de senvolvido neste projeto. (2) anti-soro 72 (100 ul de solução 1/90. 0 grau re lativamente alto de ligação inespecífica. eficiente do complexo antigeno-anticorpo do antígeno livre. de p1petando-se 1. A concentração de PEG a ser adicionada ao as ensaio foi determinada por experimento que consistiu na incu bação em triplicata. ao invés de técnicas mais so fisticadas tais como precipitação com segundo anticorpo. Uma vez contados os precipitados.1 2 5 I (100 ul de solução 1/200). Inespecífica e especifica foram determinadas para cada concentração de PEG e expressas . correspondente ao tubo Bo) ou tampão de ensaio (100 ul. não parece comprometer signi ficantemente a precisão de ensaios em que a capacidade de li gação total é maior do que 50X ( 7 ). Por estas razões.

II-VARIAÇÃO DA PORCENTAGEM DE LIGAÇÃO TOTAL ( • ) .% DE LIGAÇÃO 60 50 40 30 20 10 4 8 12 16 20 CONCENTRAÇÃO FINAL DE PEG (%) FIG. INESPECÍFICA(o) E ESPECÍFICA ( â ) EM FUNÇÃO DA CONCENTRAÇÃO FINAL DE PEG. .

r . as porcentagens de ligação total.. o incremento da concentração de PEG acima de 10X resultou em aumentos muito pequenos da XBo espe cífica associados a elevações mais significativas da XNSB.It). Na ausência de soro. Por esta razão. a concentração final de PEG foi fixada em 12.0 g/dl. inespecffica e especifica foram calculadas para cada volume de soro adicionado an tes do PEG e expressas no grafico da Fig.59 no gráfico da Fig.0 ml de PEG (concentração final 12.^ I ••! •• "I- • -*^ "• •*• "' ' I l— I . imunologicamente negativo para hepatite B. Após contagem do precipitado. Incrementos a partir deste volume resulta ram em aumentos progressivos da XBo total e XNSB. _. 11. Soro humano ("pool" com concentração proteica total = 7. A Influência da concentração proteica do valor •elo sobre o grau de precipitação do complexo antigeno-anticorpo provocado pelo PEG foi estudada em ensaio no qual realizou-se incubação idêntica ã do experimento anterior.L- . _J. seguido da adição de 1. aumentando substancialmente após adição de 25 pi de soro. . Estes dados demonstraram claramente a necessidade de uma concentra _.IX. ao i i passo que a XBo especifica permaneceu praticamente constante..j. de monstrando não haver vantagem alguma em se utilizar concen- trações muito maiores do que 10X. sifilis e Chagas) foi acrescentado ã mistura de incubação em volumes crescen— tes variando de 0 até 200 pi. sendo este utilizado em todos os ensaios deste projeto. 12. a precipitação do complexo antigeno-anticorpo com PEG foi multo pequena.

30 20 10 50 100 150 200 VOLUME DE SORO ( j i l ) FIG. INESPECÍFICA ( © ) . . E ESPECÍFICA ( â ) EM FUNÇÃO DO VOLUME DE SORO ADICIONADO IMEDIATAMENTE ANTES DO PEG (CONCENTRAÇÃO FINAL 12. 12 .VARIAÇÃO DA PORCENTAGEM DE LIGAÇÃO TOTAL ( • ) .1%).

envolveu o estudo de diversos fatores: • ) PREPARAÇÃO DOS PADRÕES DE 6H " F R I O " . o 2. CONTROLES E AMOSTRAS Um padrão de GH contendo 1 ug/ml (preparado no dia da radioiodação) foi descongelado na hora do RIE e diluído progressivamente em tampão de ensaio até obtenção de .61 çSo mini«a de proteínas séricas (1. seria adicionado. soro diluído em tampão de modo a completar volume de soro presente em cada tubo a 100 ul.0 e 8. antes do PEG. Protocolo do RIE de GH A elaboração do protocolo do RIE de GH.5.0 g/dl) nos tubos correspondentes â curva-padrão (diluída em tampão de ensaio). des crito na Tabela I. Nos casos em que houvesse necessidade de diluir estas amostras com tampão de ensaio antes de sua dosagem. sendo pipetados 100 ul de tampão de ensaio nos tubos correspondentes aos controles e amostras desconhecidas.1. antes da precipitação com PEG. seriam acrescentados 100 ul de soro humano ("pool" com c o n centração proteica total variando entre 6.2 «g/ml) para que a preci pitação do complexo antigeno-anticorpo pelo PEG fosse comple ta. Com a finalidade de se igualar a concentra ção de proteínas séricas em todos os tubos de um determinado ensaio. foi estc*>e1ecido que.

eentagea do precipitado por 1 ainute ea detector de cintilaçlo gata.c-mi (1/200) (pi) Taspio/Sora (Ml) PEG (in) (HD Total W) (•D 1. de taapio d* ensaio/padrio/aaostra. aspiraçio do sobrenadante. anílise dos dados obtidos atravfs do prograaa de coaputador RIA CALC.Protocolo do RIE de GH Tubo Taapio/Padrio/Aaostra Anti-soro 72 (1/90. seguida de hoaogeninçâo ea Yírtei.25 ng/al) (padrão 2.I . a) adiçio seqüencial.0 ng/»l) (padrio 10 ng/al) (padrio 20 ng/al) (padrio 40 ng/al) (a«ostra) (aaostra) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 1OO 100 100 100 (soro) (soro) (saro) (soro) Uor«) (soro) (soro) (soro) (taapio) (ta»pl>.62 Tabela I .5 ng/al) (padrio 5.0 1. anti-soro 72 e GH-HC.0 1.0 1. adiçio seqüencial de taapio/soro e PEG.0 1.0 •SB Bo A B C D E F Controla Aaostra 200 100 100 100 100 100 100 100 100 100 (taaplo) (taapio) (padrio 1. ia triplicata.0 1. iocubaçio por 20 a 24 horas a teaperatura aabitnte. b) c) ú\ a) f) g) .0 1.0 1.000) «u.0 1. seguida de hoaojenização ea Vártex. centrifugasio a 3000 rpa por 30 ainutos a 4»C.0 1.

estas so luções foram todas desprezadas. sendo ambas desprezadas apôs o término do ensaio. foram preparados a partir de 3 "pools" obtidos pela mistura de soros previamente dosados. Os controles (alto. 7 a 10 e 1 a 3 ng/ml. resultando em uma concentração f^ nal de 0. Alíquotas de 0.000 cpm. um volure de 100 ul. . mantidas a -20°C desde a sua coleta. incluí^ dos no início e no final de cada ensaio. 20 e 40 ng/ml).com concentrações de GH variando entre 20 a 25. 10.5 ml de cada controle foram conservadas a -20°C até sua utilização no ensaio.5.23 ng de traçado»* por ml da mistura de Incubação. Desta solução. foi pipetjj do em cada tubo do ensaio.07 ng e a uma atividade aproximada de 15. correspondendo * uma massa de 0. sendo desprezadas a seguir.0. foram descongeladas no início do ensaio e recongeladas apôs o término deste. 5.63 todos os pontos da curva (padrões "frios" contendo 1. Após o término do ensaio. 2. As amostras de soro a serem dosadas. respectivamente. b) CONCENTRAÇÃO DO QH-HC - 125 I Uma solução 1/200 em tampão de ensaio foi preparada na hora do RIE a partir de uma alíquota de 100 ul de GH-HC I conservada a -20°C desde o dia da radioloda- ção. médio e baixo).25. permitindo assim a repetição da dosagem caso esta fosse necessária.

fo ram incubadas com antígeno "frio" e marcado de acordo com o protocolo da Tabela I.000. a diluição do anticorpo a ser utilizada em um determinado ensaio deve resultar em ligação específica ao redor de 651. A precisão intraensaio obtida com a diluição 1/90. resultando em diluições finais do anticorpo de 1/180. As carac terfsticas das curvas dose-resposta assim obtidas (Fig. Baseado nesta premissa. A sensibilidade. 13B).000 e 1/90. elaborados segundo os critérios de Rodbard (60). porisso.000 e 1/27O. as soluções 1/60. . respectivamente. situan do-se em nível igual ou inferior a 10% para concentrações de GK "frio" acima de 1.000 (1.64 C) DILUIÇÃO DO ANTI-SORO ANTI-GH De acordo com Hunter (33). também foi melhor com a 1/90.7 ng/ml.000 (0.000 solução Estes resuitava foi em melhores características do ensaie e.OOO. definida como a dose mínima detectável. 13A) foram comparadas pelos seus respectivos perfis de precisão (Fig. cujas respectivas <Bo especifica correspondiam a 65 e 62X.000 foi nitidamente superior â obtida com a solução 1/60.000 do anti-soro 72.3 ng/ml). dados permitiram concluir que a solução 1/90. ela escolhida e utilizada em todos os RIEs de GH realizados neste projeto.8 ng/ml) do que com 1/60.

2 LOG [GH] (ng/ml) 1.8 21.65 L06IT0 B/Bo(%) 80 50 20 5.6 43.2 LOG [ G H ] ( n 9 / m l ) FIG.CURVAS DOSE-RESPOSTA ( A) E PERFIS DE PRECISÃO (B) PARA RIEs DE GH REALIZADOS COM DILUIÇÕES 1/60.4 (A) 10.8 21. 13 .000 ( • — ) DO ANTI-SORO 72.35 2.* ) E 1/90.000 ( * .4 (B) 10. .7 5.6 43.

foram comparadas pelos seus respec tivos perfis de precisão (Fig.66 d) TEMPO DE INCU3AÇÃO As características das curvas dose-resposta elaboradas com e sem período de pré-incubação (Fig. Apôs adição do hormônio marcado. correspondente ao tubo Bo) ou tampão de ensaio 125 (100 ul. levou a uma redução muito discreta da dose mínima detectável (0. associada a urna piora Importante da precisão intraensaio para concentrações de GH "frio" acima de 10 ng/nl. 0 cálculo da porcentagem de ligação . 14A1. obtida sem período de pré-incubação). (3) GH-HC . os RIEs de GH deste projeto passaram a ser realizados sem perÍ£ do de pré-incubação. respectivamente. 14B).000. correspondente ao tubo NSB). definido como a incubação do antigeno "frio" com anticorpo sem a adição do traçador. realizada a temperatura ambiente ou a 37"C.I (100 pi de solução 1/200). A introdução de prê-i£ cubaçâo por 1 hora. Por esta razão.em tr1p!1cata. Neste experimento. os seguintes reagentes foram incubados. temperatura ambiente e a 37°C: de ensaio (100 ul). foi efetuada a separação com PEG.a 4°C.9 ng/ml. comparadas com 0. seguida de contagem do precipitado.6 ng/mi. Apôs diferentes períodos de Incubação (0 a 48 horas).7 e 0. o tempo de incubação necessário para que a reação atingisse o equílí^ brio foi determinado em diferentes condições de temperatura. (2) anti-soro 72 (100 ul (1) tampão de solução 1/90.

• ) ..0 (A) 10 20 40 LOG [GH] (ng/ml) 50 40 30 20 10 1.) E COM PERÍODO DE PRÉ-INCUBAÇÃO POR 1 HORA A TEMPERATURA AMBIENTE (à-k) OU A 37° C ( • .CURVAS DOSE-RESPOSTA ( A ) E PERFIS DE PRECISÃO ( B) PARA RIEt DE GH REALIZADOS SEM PERÍODO DE PRÉ.0 (B) 10 20 40 LOG [GH] (ng/ml) FIG.25 2. 14 .5 5. .b/ao(%j 67 80 50 20 CV 1.25 2.INCUBAÇÃO ( — .5 5.

(2) a XBo especifica observada no equilíbrio durante incubaçSo a temperatura ambiente (47X) foi maior do que a 4* e 37°C (43 e 41X. A partir destes dados. segundo os critérios pr£ postos por Rodbard e col. a curva dose-resposta foi ajustada a uma reta por regressão linear não ponderada a partir das equações: . Este programa ba seia-se na transformação Iog1to-log.68 total. Gianeila (comunicação pessoal) em 1982.51). 15) permitiu concluir que (1) a reação atingiu o equilíbrio mais rapidamente a 37*C (12 horas) do que a 4°C ou a temperatura ambiente (16 horas para ambos). inespecifica e especifica para cada tempo e temperatu ra de Incubaçâo (Fig. (3) a XNSB durante incubaçâo a 4°C e a temperatura ambiente foi semelhante (ao redor de 16X). ficou estabelecido que a incubaçâo dos RIEs de 6H seria realizada a temperatura ambiente por 20 a 24 horas. mas inferior ã observada a 37°C (ao redor de 17. formulado por D. (61). nestas condições. a XBo especifica era maior XNSB permanecia em níveis aceitáveis. respectivamente). já que. e a e) PROCESSAMENTO E ANÁLISE DOS DADOS OBTIDOS Os cálculos da curva dose-resposta e da con centração das amostras desconhecidas foram efetuados por um programa de computação denominado RIA CALC. Em todos os ensaios (exceto os correspon- dentes ao cálculo da atividade especifica e da constante de afinidade).

INFLUÊNCIA DO TEMPO t TEMPERATURA DE INCUBAÇÃO SOBRE AS PORCENTAGENS DE LIGAÇÃO T O T A L Í O . . E ESPECÍFICA ( A ) . INESPECÍFICA ( o ) . 1 5 .69 4#C TEMPERATURA AMBIENTE 37 # C 10 20 30 40 50 10 20 30 40 50 10 20 3 0 40 51 HORA! FI6.

6.logi B —% Bo Bi-NSB = Bo-NSB x 100 onde: BI = radioatividade do precipitado correspondente à concen— tração 1 ng/ml do padrão de GH "frio". as curvas dose-resposta para cada hormônio foram compara ' •••• ! . obedecendo ao protocolo da Tabela I.70 Logito (B/Bo X) « a • b. respectivamente.1. Caracterização do RIE de GH a) COMPARAÇÃO COM PADRÃO INTERNACIONAL PARA DETERMINAÇÃO DE PARALELISMO E POTÊNCIA Em 3 ensaios diferentes. Bo ou NSB = radioatividade do precipitado correspondente aos tubos Bo e NSB. 2. Após separação com PEG e contagem do precipita do. As concentrações das amostras desconhecivalores das foram determinadas pelo cálculo dos respectivos logito (B/Bo %) e interpolação a partir da curva dose-respos ta. concentrações crescentes de GH-NIH (preparação de referência fornecida pelo National Institutes of Health) e GH-HC "frios" foram Incuba125 das com anti-soro 72 e GH-HC I.

71

das entre si para determinação de paralelismo (confirmada por inclinações idênticas das curvas) e potência. Esta última

foi calculada pela razão entre as concentrações de GH-HC e 6H-NIH necessárias para provocar 50% de inibição da ligação máxima, ou seja, B/Bo = 50% (21). A Fig. 16 mostra claramente o paralelismo entre as 2 curvas, confirmando o comportamento idêntico dos 2 hormônios. O cálculo da potência revelou ser o GH-HC, em média, 7% mais potente do que o GH-NIH, permitindo dessa maneira a calibração correta dos padrões "frios" de GH-HC.

b)

SENSIBILIDADE

A sensibilidade, definida como a dose mfnj^ ma detectávei (DHD), f o i determinada pela concentração de G H que resultou em valor B/Bo estatisticamente Assim, diferente do

obtido para a dose zero ( 1 5 ) .

'(Bo-NSB) - 2 DP
D D * concentração de G correspondente ao logito N H

(Bo-NSB) onde: Bo - média das contagens do precipitado em 9 replicatas tubo Bo; DP • desvio-padrão de B~õ; NSB « contagens do precipitado do tubo NSB. do

LOGITO B/Bo(%)

80

50

20

1,25

2,5

5,0

10

20

40 LOG [GH] (ng/ml)

FIG. 16-COMPARAÇÃO DAS CURVAS DOSE-RESPOSTA PREPARADAS COM PADRÕES DE GH - HC (•—•) E GH- NIH ( * ~ á ) "FRIOS*.

73

A sensibilidade, calculada e» 12 ensaios, foi de 1,1 + 0,08 ng/ml (média • erro padrão da média), do considerada adequada para o estudo dos testes de ção de 6H. sen

libera-

c)

PRECISÃO

A variação intraensaio intraamostra foi de terminada pelo perfil de precisão (Figs. 13B e 14B), elabora do de acordo com os critérios propostos por Rodbard (60). e col.

0 coeficiente de variação (CV) para uma determinada de hormônio "frio" foi calculado pela equação:

concentração

«y CVx = dy/dx onde: íy = desvio-padrão da resposta B/Bo correspondente à concentração x (determinada em triplicata); dy/dx • inclinação da curva dose-resposta no ponto correspo^ dente i concentração x> x 100

Em todos os RIEs de 6H, a variação ensaio situou-se em nível igual ao Inferior a 10X para centrações de GH acima de 1,5 - 2,0 ng/ml e permaneceu redor de 5% para valores entre 10 a 30 ng/ml,

intraconao

Intervalo que

2%. 8. respectivamente.6* para concentrações de 1. 4. demonstrando a estabilidade do RIE. o coeficiente de variação 5. foi médio e alto em 12 ensaios sucessivos.4. resultando em valores de 19.2 ng/ml.3 e 25.7 e 12.3 ng/ml) fora» dosadas cialmente em um único RIE.9.7 e 4. seqüenfoi de •êdio (8. o que poderia Invalidar a comparação da . Não houve alteração signi- ficativa destes valores quando 4 replicatas foram determinadas no inicio e 4 no final do ensaio.3 no/ml). definida como o grau interferência provocado por substâncias estranhas sobre de a reação antigeno-anticorpo. A variação interensaio intraamostra calculada por dosagens repetidas dos controles baixo. de Quando 9 replicatas do controle baixo (2. foi estabelecida de acordo com os critérios propostos por Yalow & Berson (78): d ) Estudo dos efeitos não específicos do meio de incubação Uma possível dúvida surgida na elaboração do RIE de 6H consistiu na diferença existente entre a composição do melo de Incubação dos pontos da curva-padrSo (apenas tampão de ensaio) e das amostras desconhecidas (tampão de ensaio mais soro).respectivamente.74 compreende a maioria dos picos de 6H obtidos nos testes liberação. d) ESPECIFICIDADE A especificidade. 8.0 ng/ml) e alto (22.6.

por 20 a 24 horas a temperatura ambiente. padrões de GH "frio" (100 ul de soluções contendo desde 1. respectivamente. Estes dados demonstraram a validade de se utilizar o mesmo NSB para o calculo da curva-padrão e das amostras desconhecidas. determinada pela Incubação de tampão de ensaio (200 pi) e GH-HC .9 e 14. excluindo dessa maneira a presença de efeitos não específicos do soro sobre a reação antígeno-anticorpo e validando o protocolo do RIE de GH.1 2 5 I (100 pi) por 20 a 24 horas a temperatura ambiente. foram comparadas curvas dose-resposta preparadas com padrões GH-HC "frio" diluídos em tampão de ensaio e em r de stripper" (soro com concentração de GH < 1. com anti-soro 72 (50 pi de solução 1/45. obedecendo ao pro tocolo da Tabela I. a porcentagem de ligação Inespecífica. A Fig. exibindo valores de 14. Para se avaliar esta possibilidade. não foi significantemente diferente da calculada pela incubação de soro.2 ng/ml). Neste mesmo experimento. tampão de ensaio e hormônio marcado (100 ul de cada).000 em tampão de ensaio) e GH-HC 25 I (50 ul .25 até 40 ng/ml em tampão de ensaio) foram Incubados em trip!icata. d ) Recuperação quantitativa Neste experimento.3%. 17 revela a identidade entre estas 2 curvas.75 razão B/Bo das amostras desconhecidas como as da curva-padrão.

76 LOGITO B/Bo (%) 60 50 20 1.COMPARAÇÃO ENTRE CURVAS DOSE RESPOSTA PREPARADAS COM PADRÕES DE GH "FRIO" DILUÍDOS EM TAMPÃO DE ENSAIO ( • .25 2. 17.• ) OU EM "STRIPPER" ( * . .5 5.* ) .0 10 20 40 LOG [GH ] ( n g / m l ) FIG.

obedecendo ao protocolo da Tabela I.1 ng/mi de GH fo125 ran Incubados com anti-soro 72 e GH-HC I. e utilizados para construção de curvas dose-resposta. Apôs separação com PEG e contigem do precj^ pitado. as concentrações de GH presentes nestas amostras foram determinadas por interpolação a partir da curva dose-res posta e comparadas cem os valores esperados. padrões de GH "frio" e diluições progressivas (1/2 até 1/32 em tampão de ensaio) de soro de paciente acromegãiico contendo 43.X entre as concentrações esptí radas e observadas (Fig.77 de solução 1/100 em tampão de ensaio). sendo tra tados como se fossem amostras desconhecidas. completando-se o volu me final a 300 ul com tampão de ensaio. 18) confirmou a identidade entre e s _ tes 2 parâmetros e excluiu novamente a presença de efeitos não específicos do soro sobre a reação antigeno-anticorpo. os mesmos padrões de 6H "frio" foram incubados com quantidade fixa e conhecida de GH (100 ul de soro contendo 5.3 ng/ntl) e volumes idênticos de anticorpo e hormônio marcado. Simultaneamente. A existência de uma relação linear tipo Y . demonstra da na F1g. A identidade entre estas 2 curvas. 19. . do) Construção de curva dose-resposta com diluições progres sivas de soro de paciente acrompgálico Neste experimento. excluiu a presença de substâncias estranhas que pudessem Interferir com a reação antigeno-anticorpo nestas condições.

18-RELAÇÃO ENTRE AS CONCENTRAÇÕES ESPERADAS E OBSERVADAS DE GH EM ENSAIO DENOMINADO RECUPERAÇÃO QUANTITATIVA. 10 10 20 30 40 50 CONCENTRAÇÃO ESPERADA ( n g / m l ) FIG.78 CONCENTRAÇÃO OBSERVADA ( ng/ml) 50 40 r * 0.2. .994 30 20 .

19. .RESPOSTA PREPARADAS COM PADRÕES DE GH "FRIO" (•—•) OU COM DILUIÇÕES PROGRESSIVAS DE SORO DE PACIENTE ACROMEGAllCO í A—*).0 10 20 40 LOG [ G H ] ( n g / m l ) FIG.25 2.5 5.LOGITO B/Bo (%) 60 50 20 1.COMPARAÇÃO ENTRE CURVAS DOSE .

2 U/ml.variação interensaio: 11. .9."kit": "Sm-C Radioimmunoassay Kit" (Nichols comer- Institute Diagnostics. 9.4 e 9.variação intra e interensaio: 5.1 U/ml. CA. . Tr Cambridge. 3. San Juan Capistrano. MA. a) SmC .2S para concentrações de 0.características: dosagem sem extração prévia.3 e 3. respectivamente. 1.50 U/ml.1» para concentrações de 89. no! .80 2.sensibilidade: 0.Genentech Diagnostics. .variaçío Intrasnsaio: 7. 169 e 449 ng/dl. EUA).características: fase sólida (anticorpo ligado 3 parede do tubo). . EUA).6 e 3. separa- TU .0% para concentrações de 0. com exceção da testoste rona. ."kit" "GAMMACOAT (" ^ X1 T Radioimmunoassay Kit" (Clinical Assays.2.33. ção por segundo anticorpo. . . foram dosados em duplicata no soro por "kits" ciais de RIE.0 e 5.70 e 1. respectivamente.2.sensibilidade: 9 ng/dl: . DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS SÉRICOS DOS DEMAIS HORHÕ NIOS Todos os outros hormônios. respectivamente.

2 e 4.1 e 5. .3* para concentrações de 3.2% para concen- trações de 2.2 pUI/ml. . respectivamente. 4.8 e 3.variação Interensaio: 7. d) TSH . e) PRL .6. .8.81 - "kit": "GAMMACOAT l""'1J » ' Free/Total T 4 Radioimmuno — assay Kit" (Clinical Assays). respectivamente.5 ug/dl.6.sensibilidade: 0.8 pUI/ml.3. respectivamente.3 e 5. respectivamente.0 ug/dl. trações de 2.1. . 7. 7."kit": "GAMMADAB HS V N Ij hTSH Radioimmunoassay Kit' (Clinical Assays).características: separação por segundo anticorpo.8.3."kit": "GAMMADAB R P ij Prolactin Radioimmunoassay Kit" (Clinical Assays). . 3.7 e 13.características: separação por segundo anticorpo.características: fase sólida (anticorpo ligado à parede do tubo). . .variação intraensaio: 7.1 e 12.2 ug/dl.variação Intraensaio: 4.05 para concen- 13. .0. 5. trações de 2. 5.34 iiUI/ml.2X para concen- . .variação interensaio: 7.sensibilidade: 0.6 e 5. 5.6 e 14.

41. g) FSH _ "kit": "GAMMADAB N I' ij FSH Radioimmunoassay Kit' (Clinical Assays).características: separação por segundo anticorpo. respectivamente. .5 mUI/ml.8% para concen- trações de 16.sensibilidade: 1.9.valores normais: calibrados pelo padrão da WHO 2 n d IRP-HMG.variação intraensaio: 6. 38. . 5. 41.2% para concen- trações de 11.características: separação por segundo anticorpo.6 ng/ml.6 mUI/ml. .4 e 9.7. 4.4 e 8.6 e 150 mUI/ml.valores normais: calibrados pelo padrão da WHO 1st IRP 75/504. 2. ..sensibilidade: 0.0.0 e 118 ng/ml. .variação intraensaio: 5.1.variação interensaio: 5. f) LH .7 e 172 mUI/ml.variação interens2io: 7. 40.4 e 116 ng/ml. respectivamente.35 para concen- trações de 16.9 e 5. .3X para concen— trações de 16. ."kit": "GAMMADAB R ['"ij LH Radioimmunoassay Kit" (Clinical Assays).8. respectivamente.6. respectivamente.sensibilidade: 1.0. 8. .2 e 7.7. . . .

variação interensaio: 8.características: fase sólida (anticorpo ligado à parede do tubo). 11. .6 e 3.9 mUI/ml.83 . trações de 3. .9.7 e 2. .45 para concen- 39. .sensibilidade: 10 pg/mi.8% para concen- .4.variação Intraensaio: 11.4. respectivamente.1."kit": "GAMMACOAT Cortisol Radioimmunoassay Kit" (Clinical Assays).características: dosagem sem extração prévia.1 f/g/dl. trações de 8.Count Estradiol" (Diagnostic Products Corporation. respectivamente. fase sólida (anticorpo ligado ã parede do tubo).6 »UI/ml. .4 e 49.6X para concen- 24. CA. 11.2* para concen- . 4.4 e ug/dl.24 pg/dl.2 e 4.6 e 5.6.8. 6. .valores normais: calibrados pelo padrão da WHO 2nd IRP-HHG.4.A .7.8. respectivamente. 5.0 38.variação intraensaio: 7."kit": "Coat . .sensibilidade: 0. trações de 3. Los Angeles.variação Intraensaío: 6. te. EUA).4% para concentra 23.1 e 5.variação interensaio: 9.5 e 9. . 1) Estradioi .4 e 51. h) Cortisol TM |125 I l l\ . ções de 8. respectivamen- 5.

Inc. respectivamente.variação interensaio: 13. Carson.7% e a interensaio de 12 a 15%.3. CA. 2. .31): a) hemograma completo: a contagem global foi realizada em contador automatizado e a específica em lâmina após colo ração com mistura de Romanowsky (Leishman). A sensibilidade variou de 5.5 a 6. OUTRAS DETERMINAÇÕES LABORATORIAIS Todos os outros exames laboratoriais foram incluídos na rotina do Laboratório Central do HC-FMUSP e determina dos por técnicas consagradas na literatura (3.84 trações de 37.nersham.51 para concentrações de 81. j) Testosterona Os níveis séricos de testosterona foram determina dos por RIE segundo o método de Abraham ( 1 ). o anti-soro (Radioassay Systems Laboratories. 7. sódio e potássio séricos: espectrofotometria de chamai .7.4. 125 e 300 pg/ml. Antes de ser utilizado.5 ng/dl. EUA) foi testado. a variação intraensaio de 5. respectivamente. após extração do soro com acetato de etila: hexana (3:2) e sem cromatogra fia prévia. sen do a sua especificidade considerada adequada.. Os padrões "frios" foram obtidos da Sygma e o hormônio trici ado da A.0 e 5. 111 e 295 pg/ml.6 a 6. b) c) gileemia piasmática: método enzimático automatizado.

eficiência de Este teste foi escolhido por se tratar comparaçío entre variáveis Independentes. 1) urina tipo I: microscopia óptica. com número relativamente pequeno de amostras. albumina sérica: método do verde bromocresol.70).05). As diferenças foram consideradas significativas ao nível de 5% (p < 0. e) creatinina sérica: método colorimétrico.85 d) uréia sêrica: método enzimãtico da urease. com poder de de 95% (43. f) g) proteínas séricas totais: método do biureto. h) cálcio sérico: espectrofotometria de absorção atômica. m) exame parasitoiogico de fezes: método de Faust e Hoffmann[ f n) cariótipo: analise em cultura de linfócitos. i) fósforo sérico: método de Fiske-Subbarow. l 3. j) fosfatase alcalina: método enzimãtico e cinêtico. cuja distribuição não era p r e — viamente conhecida. o equivalente nSo pararnétrico do "t" de Student. . MÉTODOS ESTATÍSTICOS Os níveis de GH observados nos testes de tolerân- cia á insulina e clonidina foram comparados e estatisticameni te analisados pelo teste H ü" de Mann-Whitney.

. inclusive os dados referentes literatura.86 Todos os valores foram expressos como média + _ 1 à erro padrão da média (EPM).

VII - RESULTADOS .

0 ng/ml menos uit teste de estímulo (ITT ou clonidina). radiolõgica e hormonal. c) dosagem sêrica normal de SmC. GRUPO 1: PACIENTES SEM DÉFICIT DE 6H Foram incluídos neste grupo 21 pacientes que pree£ cheram 3 ou mais dos seguintes critérios: a) b) ausência de sinais típicos de nanismo hipofisãrio. caracterizado como em pelo altura Inferior a 46 cm e peso abaixo de 2. de acordo C O M os dados obtidos na avaliação clínica. d) pico de liberação de GH maior do que 7.500 g ao nascimento para gestações a termo: 4 pacientes (FCS. ritmo de crescimento normal. laboratorial. Os principais fatores que contribuíram para a baixa estatura destes pacientes foram: a) déficit de crescimento Intrauterino.88 Os pacientes foram divididos em 2 grupos. MAN. FFH e JCES). .

e) nanismo primordial. PMR. FFK. AHM. MSP e JABÁ). SRC. SCN. com Idade entre 2. IDADE E SEXO Foram estudados 15 meninos e 6 meninas. não foi encontrada explicação para o déficit de crescimento.1. caracterizado por retardo mental estigmas somáticos: 1 paciente (FCS). .9 e 17. CAC. RTS. e f) baixa estatura familiar. ingestão g/dl: 7 d) doença crônica prévia (tuberculose pulmonar e ülcera duo denal estenosante): 2 pacientes (JCES e AS).6 pacientes (FCS. JCES e A S ) . AVALIAÇÃO CLÍNICA (TABELAS II E I I I ) 1. AVC e JCES).89 b) retardo puberal. c) desnutrição discreta. 7 pacientes per(FFH. SCN. caracterizada pela média da altura dos pais inferior a 158 cm (correspondente ao centil 10 da população brasileira): RTS. AVC. caracterizado por inicio da puberdade apôs os 13 anos em meninuj e apôs os 14 em meninos: 5 pa cientes (SRC. EZ e MBH). caracterizada por baixa proteica e proteínas séricas totais entre 5 . 1.5 anos. JHS. MTT. ADO. A/M. Em 7 pacientes (JAM.

Quinze (7 mepartos foram por via vaginal. Os pacientes JCES e AS tinham sido previamente sub metidos a cirurgias de úlcera duodenal estenosapte e pneu- . SRC.500 g e altura abaixo de 45 cm. apenas um domi ciliar. apresentação cefálica.90 1. em a p r o v e i t a m e n t o ^scolar em 2 (FFH e R T S ) . SCN e JCES) e baixo de (FCS. ANTECEDENTES INDIVIDUAIS Todos os pacientes nasceram após gestações normais a t e r m o . SCN e JCES) nasceram com peso menor que 2. R T S . FFH. Foram observados retardo do desenvolvimento neuropsico-motor em 4 pacientes (FCS. 1. Duas crianças (FCS e JCES) apresentaram cianose na hora do parto do e 5 (FCS. MAN.2. HISTÓRIA DO DÉFICIT ESTATURAL O início do retardo de crescimento foi observado des de o nascimento até 3 anos antes da avaliação inicial no HCFMUSP.3.800 g e altera de 37 cm. As c o n d i z e s n u t r i ç ã o foram consideradas inadequadas em 7 c r i a n ç a s FFH. que nasceu prematuro ses) com peso de 1. AVC e JCES) e as de afeto domiciliar apenas 1 ( J C E S ) . Vários pacientes tinham sido previamente tratados com v i t a m i n a s ou anabolizantes não hormonais. sem resultados satisfatórios . AAM. enquanto que 6 mães foram submetidas a cesárea. exceto o paciente SCN. RTS.

91

m e c t o m i a direita por tuberculose pulmonar,

respectivamente.

A m a i o r i a referia verminose anterior t r a t a d a . Doze pacientes relataram início do d e s e n v o l v i m e n t o puberal entre 9 e 17 anos, sendo este c o n s i d e r a d o em 4 (SCN, A V C , JCES e A S ) . em M B M aos 12 a n o s . retardado

A menarca tinha o c o r r i d o apenas

1.4.

ANTECEDENTES

HEREDITÁRIOS

A média da altura dos pais foi m e n o r do q u e 1 5 8 cm em 7 pacientes (FFH, RTS, S C N , PMR, CAC, EZ e M B M ) , não sendo possível d e t e r m i n a r a idade em oue teve início a paterna ou m a t e r n a . p'jberdade

Apenas os pais de F C S eram consangüíneos

(primos em lfi g r a u ) , enquanto que só JHS tinha um irmão com n a n i s m o (hipofisário). N ã o foram detectadas outras patologias

f a m i l i a r e s que pudessem ajxiliar no d i a g n ó s t i c o da causa da baixa estatura.

1.5.

INTERROGATÓRIO

COMPLEMENTAR

Não foram observados sintomas importantes referentes aos sistemas neurológico, cárdio-respiratório, gastro-i£ testinal, ósteo-articular ou endócrino em nenhum dos pacientes estudados.

f.V '.

' r " f '•',

92

1.6.

EXAME

FÍSICO entre

A altura variou entre 1,3 e 4,2 DP e o peso 0,7 e 3,4 DP abaixo da média para sexo e idade.

0 exame clínico de FCS revelou retardo do desenvol vimento neuro-psico-motor associado a hipotonia global e estigmas somáticos comopálato ogival, retrognatia, filtro sal curto e esboço de sinofris. na-

No paciente MAN, foram dee EZ, não

tectados pectus escavatum e prega simiesca e, em JABÁ nevos em tronco e pálato ogival. Os demais pacientes

apresentavam estigmas ou anormalidades importantes. Oito meninos e 1 menina não mostravam nenhum sinal de puberdade ao exame físico, sendo classificados como Grupo IA (Tabela I ) . Nos outros 12 pacientes, incluídos no Grupo ras

IB (Tabela I I ) , foi detectada pubarca em todos, telarca

5 meninas e testículos com dimensões maiores do que 2,5 cin nos 7 meninos.

2.

AVALIAÇÃO LABORATORIAL E RADIOLÓ6ICA GERAL III)

(TABELAS II E

As proteínas séricas totais estavam

discretamente

diminuídas em 4 pacientes (FCS, FFH, SRC e AVC), sendo deteve tada hipoalbuminemia em apenas um {FCS). Foi constatada an^ e

mia hipocrômica microcitica em 4 pacientes (FCS, A^M, AVC

93

TABELA II - Dados clínicos e laboratoriais em pacientes pré-púberes sem déficit de GH (Grupo IA)
Noie Sexo Idade cr on. (anos) (kg) (-DP) Peso Altura Idade Idade óssea (anos) Ritio cresc. (c«/ano) (g/dl) Heiog. Prot. tot. (g/dl) (g/dl) Alb.

(1)

(c.)

( •DP) -

1)

estat. (anos)

FCS KAN FFH RTS JM A

H M M
H

2,9 9,0 91 ,
11,0 11,0 12,1 13,0 14,5

10,2 22,0 19,0 18,7 31,1 26,8 25,2 24.3 IS.5

2, 6 1.1 1,7
1. 8

85, 0
122, 0 114, 3 120, 0 131. 138,

3,1 1,9 3,3 3,0 1,8 1.3 3,1 5.5 2, e

1,7 7,0 5,7
6,5

1,5

0

10,2 13,9 13,5 12.4 12,6 12,3 12,6 13,3 11,2 12-16

5,3

3,2

7 6
10

5,6 6,3 5,3 3,3 2,1 4.2 5.1 5,1

7,4 5,8
6.1

4,3
3,9 i.,0

H K K
H

0,7 1.2 1.8 8 2.,
, 1,4

7 3

3,5
10,0

8
10

7.0 7,4 6,5 5,6 69 ,
6-8

4,0
4,3

;o o
AAM
SRC AHH
Nonal

130, 0 123,

8,2 7.2 5,2

8
10
t,

3,8
4,3 4,0 3,5-5,0

, 3

F

7,9

112, , 1

(1)

Desvio-padrão ei relação à aédia para sexo e idade segundo as tabelas de Karques e col. (45).

4 28.3 3.1 13. 4 141 . 6 142.7 11.5 . 75 .3 2. Prot.4 4.2 L.8 0 l.5 2. .5 6.7 13.7 14. 2.0 146. 61 .8 14.0 6.2 3.5 4.0 15.0 12. tot.3 25.5 9 1 1 10 12 1 1 4. J 8.5 10.8 142.0 138. 12.i .5 17. 71 .9 12.8 11.Dados clínicos e laboratoriais em pacientes püberes sen déficit de GH (Grupo IB) Noae Sexo Idade cron.4 128. (ç/dl) lifil) Aib.0 4 . 8 .2 6.7 8.7 31.8 12.3 6.9 10.8 13. 5 152.6 95 .7 • " CAC JA9A 9.4 1.3 4.1 34. cW11 0. 1 132.4 61 .5 4.4 3. 4.94 TABELA III .7 7.P it 5 8. 69 .2 25.0 *.7 30.2 1.9 13. 5.í.7 4.2 4.2 2.8 1.0 11. 5 141 .0 10.6 (c ) 140.0 126.5-5.5 9 9 1 1 12 10 13 13 6.3 9.7 3. 5 135.1 31. 8.9 2. 6-8 4.6 13.0 10.5 11.3 13. (c«/ano) (g/dl) Hciog.7 11.0 30.0 15.8 12.8 2. 3.0 39. 3.2 7.5 34.7 2.4 15.7 6? ." 3 3.2 3.8* zi .1 4.4 3.0 7.4 5. (45).1 ll.0 6.1 15.2 16.7 39.2 25.7 1. 7 (-DP) (D estat. (anos) HTT JHS HSP SCN PHR AVC JCES 1 M M H H N M F F 12.0 (l) Desvio-padrSo tu relação a ifdia para seio e idade segundo as tabelas de Marques t col. (anos) (kg) Peso Altura Idade Idad* óssea (anos) Ritto cresc.1 12.5 12-16 E: KBH AS Nor»al F F F 1.

0 Rx de mãos e punhos revelou retardo da idade óssea em todos os pacientes.95 EZ) e verminose em 5 (RTS. T. . AHM. e TSH apresenta ram-se dentro dos limites da normalidade em todos os pacientes.enquanto que os de E_ peimaneceram abaixo da sensibilidade do ensaio (10 p g / m l ) . quando correlacionada com a idade cro nológica e sexo. Foram detectados níveis cos normais de LH e FSH em todas as meninas púberes. do que Já no Grupo IB. JHS. 3. Todos os outros exames laboratoriais g e r a i s . AVC e A S ) . MSP. JABÁ e EZ) mostraram-se normais. No Grupo IA. bem como o Rx de crânio e o cariótipo (este último realizado ape nas em MAN. sendo compatível com a idade esta tural em 13 casos. AVALIAÇÃO HORMONAL BASAL (TABELAS IV E V) As concentrações séricas de T . os valores de T foram sempre maiores 60 ng/dl. a testosterona e o estradiol -se em nível inferior a 27 ng/dl t 10 pg/ml. assim como a SmC. situaram respectivamente.

9 3.9 16. .7 (0.22-2.7 *.6 (pg/il) M0 ei 1 (0.96 TABELA IV - Avaliação hormonal basal em pacientes sem d é f i c i t de G (Grupo IA) H SiC pré-púberes Noie T 3 T TSH T l 2 (ü/.0 2.2 (0.7) 2.0 AN A 1.0 AM H 0.22-2.U-4.0 JAU 2.90-5.08-1.0 UuiM) 2.0 AO D 2.3 25.8) 2.0 11.6 2.9 (0.6 25.9 (0.8) 180 9.60 (O.6 RTS 188 10.5) 152 8.2 26.8) 189 10.2 (0.22-2.7) 170 11.l) FCS (ng/dl) 180 Wdl) 9.* (0.7 < 10 Nonal (1) 80-200 4.0 FFH 6.8) 181 10.5 0.1 (ng/dl) 13.5-11.D "' HAN 1.0 3-27 < 10 Valores noraais para sexo e idade cronológica.8 (0.0 SRC 181 10.6) 181 9.3 20.8-5.0 1.1 2.28-3.28-3.2>-2.2 20.0 1.

.91-3.3 (0.8 65 AVC 188 10.90-5.7 (0.8) 6.91-3.91-3.7 76 CAC 200 8.8-5.5) 2.5 (0.7 < 10 JA8A (0.1) 190 11.5 0.99-6 .0 (0 .1 (0.8 .7 (0.0 1.2 1.28-3.0 445 JCES 168 9.0 TSH (|iUI/i!) 1.l) KTT 1.41-4.1) 1.5) I 3 (ng/dl) 160 T 4 (tig/dl) 8.1) 6.20-5 .0 3.99-6.5 (0.97 TABELA V .2 1.5 < 10 Noraal 80-200 4.6 153 «SP 160 468 SCN 185 9.9 < 10 150 9.7 < 10 HBtt 161 8.4 3.8) EZ 2.8 257 PMR 195 11.0 > 50 < 82 (l) Valores nonais para sexo e idads cronológica.7 1.1) 3.7) (D 1.Avaliação hormonal basal em pacientes púberes sem déficit de GH (Grupo IB) fco»e StC (U/.1] 2.28-3.71-4 .8 (0.9) (1 1.0 (ng/dl) 542 JKS 178 9.0 1.0 2.5 3.3 (0.91-3.7) 2.5-11.6 (0 .0 < 10 AS 160 10.

0 ng/ml em 10 (90. interromper o teste devido a perda de consciência em nenhum deles.0 ng/ml em 5 (71.1.6 ng/ml.0 ng/ml. excluídos da comparação com os demais. TESTES FARMACOLÓGICOS DE ESTÍMULO 4. Todos os pacientes queixaram-se de mal-es- tar geral. Três pacientes (FFH e ADO do Grupo IA e AVC do Gru po IB) apresentaram níveis basais elevados de GH.4%). não sendo necessá rio. VII E VIII) igual para a Em todos os testes. náuseas. média dos picos de GH. no entanto. considerada estímulo efetivo liberação de GH.°%). não sendo es_ tatisticamente diferente (p = 0. Após o estímulo hipoglj^ foi de cêmico. porisso.8 ng/ml. e. Após administração áa insulina. foi obtida hipogl icerniu ou inferior a 45 mg/dl. 10. A média dos picos de GH foi de 15.es A tes níveis elevaram-se acima de 7.98 4. _ No Grupo IB. . provavelforam pertenGH mente devido a "stress" na hora do teste. sudorese e sonolência.3 + 1. estes níveis ultrapassaram 7. 11 pacientes partiram de concentrações basais de GH inferiores a 3. incluindo o doente JAM no qual não hou ve aumento dos níveis hormonais durante o teste.7 ng/ml. TESTE DE TOLERÂNCIA Ã INSULINA (TABELAS VI.47) da obtida no Grupo IA. Os outros 7 centes ao Grupo IA partiram de concentrações basais de menores do que 3.3 + 2.

4 9.16 14.3 2. ADO e AVC fora» excluídos do cálculo das iédias no ITT por apresentarei valores basais elevados de GH.3 12. 2*.1 11.5 0. 4 13.3 21.2 1.4 3.3 1.6 30.5 2. 1 8.2 6.2 12.0 1..30 10.1 8.3 1.1 1.9 3.2 15. 6 4.6 12.6 1. 6 12.3 1.7 4..2 . 5 23.9 33. Pacientes púberes (Grupo IB) GH (ng/.1C B 1.3 11.Níveis de GH em condições basais (B) e de pico (P) em pacientes sem déficit de GH Pacientes pré-púheres (Grupo IA]) GH (ng/.5 <1.2 1.3 <1.3 1.8 2 (1) Média das concentrações de GH nos teipos de -30 e 0 »inutos. 9 1.1 21..l) Clonidina Noae ITT ) P P B FCS MAN FFH RTS JAN ADO AAN SRC AHM 3.9 5. as concentrações de GH que caírai abaixo ia sensibilidade consideradas iguais ao valor da sensibilidade do respectivo ensaio..5 11.7 0.1 16.2 3.8 1.6 16.6 1.7 2.0 6..3 1.2 7.1 3.1 1.2 1. (2) Para o cálculo da «édia.4 < 1.5 I.3 < 1. .3 26.o 1.2 2.8 10.1 p < 1.7 1.8 11. 8 3. 8 11.5 Noie EZ M8H AS a EPM 1 .99 TABELA VI .8 <1.9 < 1.1 15.l) ITT Clcnidina B MTT JHS MSP SCN PMR AVC JC£S CAC JAdA < 1.6 6.6 3.tO 9. forai (3) Os pacientes FFH. .2 10.1 <1.4 38.6 1.4 1.9 0 .4 1.6 15. 0 .1 2.3 3 22.3 2.3 13.2 21..2 <i.9 11. 1.5 18. 0 1. 3 9.5 0. 1 <1.2'J P 7.

5 5.3 79 2.8 54 12.26 1.4 0.7 7.0 60 9.5 79 GH G GH G I.3 1.8 2.2 1.4 <1.3 1.3 69 11.0 t.8 45 <1.3 2.6 81 3.5 87 2.6 3.7 55 8.2 <1.0 4.2 87 2.2 53 2.5 54 17.8 2.0 77 2. 2.37 90 1.6 1.7 74 6.8 23 14.9 -30 3.2 5.0 72 6.6 58 9.2 69 3.1 8! I.8 73 9.2 1.4 2.5 7 <1.3 38 5.4 •gV) 90 5.2 30 <1.0375 0 30 60 1.7 43 12.5 11.1 <1.11 1.21 e.4 38 21.3 40 5. L.2 2.3 93 0 2. 1.2 8. 1.1 23.1 0.1 11.Níveis séricos de GH nos testes de tolerância ã insulina e clonidina em pacientes pré-púberes sem déficit de GH (Grupo IA) Note Dosagei -30 3.6 10.2 <1.2 45 1. U.9 <1.9 13.9 2.1 27 3.4 12.7 54 8.7 53 10.4 21 73 3.1 88 7.4 1.6 92 16.7 r 27 1.9 53 60 8.100 TABELA VII .8 C <1.' FCS HAN FFH R1S JAM ADO AAH SRC AHH Média (3) 1.1 U/kg) 45 30 10.7 0.2 47 2.3 81 1.2 1.1 <1.2 3.2 41 7.2 1.9 88 11.4 (2) Glice.2 <1.1 <1. ' .ia (ig/dl).2 Clonití ina (0 .. as concentrações de GH que cairai abaixo da sensibilidade forai considir*das iguais ao vaior da sensibilidade do respectivo ensaio.2 9.1 1.0 <' 1.5 : - G GH G GH G GH G GH G GH G GH 78 2.6 74 36 1. 1.3 71 1.2 1.1 71 1.7 53 4.0 £.2 <1.7 51 8.7 14 4.» 92 55 1.1 30 6. EPM (1) GH (ng/«l).7 59 5.7 15. (3) Para o cálculo das •(dias. 77 8.0 ^.5 0.: 6.6 0.1 1.8 37 1.5 22 (0.3 88 1.6 77 90 5. .25 6.3 6.9 67 11.5 24.5 85 ITT 15 2..5 1.I 85 9.6 <1.6 49 2.2 53 9.

0 46 <1.2 <1.1 19.101 TABELA VIII .0 26.5 2.0 16.4 14.5 2.3 4.3 <1.5 66 8.2 2.3 2.0 1.3 0.7 10.3 <1.0 9.2 10.1 6.3 8.2 <1.7 30.6 3.3 87 84 44 <1.9 2.4 <1.4 1.4 44 1.7 84 1.3 <!.1 0.5 1.7 1.3 '1.7 *VC \ 1.1 2.0 <l.3 <1.3 74 30 40 56 61 1.1 2.6 1.2 43 28 6.1 U/kg) Clonidina (0.6 (1) GH (ng/.4 1.6 74 1.5 3.0 36 39 47 60 1.1 26. as concentrações de GH que caírai abaixo d? sensibilidade fora§ consideradas iguais ao valor da sensibilidade do respectivo ensaio. 77 1.6 40 5.4 <1.1 2.6 1.1 85 19 2.2 93 1.2 10.1 83 1.8 1.4 1.C PBR <1.3 2.5 9.5 84 6.5 " BM 21.6 3.2 17.2 69 5.0 73 9.4 3.2 49 9.4 94 1.0 59 1.0 6.0 17.1 39 42 3.8 87 6.£ CAC <!.14 0.1 13.4 80 2.6 73 1.4 ! JCE$ 21.0375 iq/i') j | j ' Noie Dosagea -30 GH 0 <lt2 15 <1>2 30 lf2 45 7 9 60 ? 2 90 6>1 I3Õ l>3 Õ <I>2 30 <1>2 60 ' 90 <! 2 ÍTíT G JHS (2' ' <1>2 ' ' <lt2 ' 80 1.2 JABA 11 <1.9 1.0 6.8 *.4 51 11.3 0.45 2.4 *.1 66 5.6 <l.8 27 7.6 54 1.6 45 2.9 1.2 38.08 0.0 63 10.2 40 2.2 34 51 1.2 <1.3 81 77 34 39 36 35 44 15.2 74 75 3.6 1.2 GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH <1.7 2.22 0.5 1.1 45 2.2 64 52 <l.0 5.6 2.4 78 4. (3) Para o cálculo das aédias.2 <1.3 AS G GH Hftíia^ EPH 12.2 95 3.5 38 2.1 84 1.1 38 3.2 1.2 77 5.1 60 7.2 14.1 84 1.8 1.2 1.2 33.4 27 7.8 2.1 57 45 2.9 2.7 89 2.63 3. .3 72 9.8 26.4 24.0 12. (2) Gliceaia («g/dl).5 1.0 <I.6 16.8 1.3 <1.6 2.0 1.3 19.l).4 10.9 15.6 62 i 1.6 79 2.1 SC " 18.3 11.4 83 82 2.5 15.6 12.22 0.2 <1.9 91 1.3 1.Níveis séricos de GH nos testes de tolerância ã insulina e clonidina em pacientes púberes sem déficit de GH (Grupo IB) ITT (0.7 40 6.1 45 9.6 60 %?.6 90 4.3 68 73 <1.5 96 1.3 <1.7 18.7 2.3 24.

9 +_ 1.7%). mostrando uma resposta normal ao estímulo h i p o g l i c ê m i c o (Tabela X V I ) . IB Entretanto.5 não sendo estatisticamente diferente da obtida no m e s m o teste no Grupo IA (p = 0. a clonidina diferente promoveu apenas Incremento na concentração de GH acima de 7. a c o n c e n t r a ç ã o máxima de GH ocor reu entre 30 e 90 minutos após injeção da insulina.1 mmHg para a diastólica. o c o r r e n d o entre 60 e 120 minutos após administração da c l o n i ó i n a . No. houve discreta r e d u ç ã o níveis pressóricos associada a leve sonolência. a media dos picos de GH de 14. 0 cortisol só foi dosado no paciente F C S . TESTE DA CLONIDINA (TABELA VI. 9 X ) .26) da obtida no ITT. incluindo os 7 p a c i e n t e s ng/ml.4 ng/ml. foi de 12.2 + 3. No Grupo IA (9 p a c i e n t e s ) . os níveis de GH observados nos dife . da foi de 10.0 ng/ml em 5 (41.5 n g / m l .9 + 1.Grupo IB (12 p a c i e n t e s ) . 4.0 ng/ml em 8 ( 8 8 .0 ng/ml.102 Em ambos os c upos. com resposta inferior a 7. a r e s p o ^ Coji foi e A que de ta à clonidina foi maior do que 7. Todos os pacientes partiram de níveis b a s a i s de GH inferiores a 2.2. siderando todos os 9 pacientes. mais fre q u e n t e m e n t e no tempo 60 (7 p a c i e n t e s ) . não sendo estatisticamente (p = 0.8 + 2. A média dos pico de GH.8 mmHg para a pressão sistõlica 5. 1 5 ) .28) nem da observada no ITT no G r u p o (p = 0 . VII E V I I I ) dos Na maioria dos testes.

103

rentes tempos do teste da clonidina foram discretamente infe riores aos do ITT (Fig. 2 0 ) . Em ambos os grupos, a concentração máxima de GH ocor reu entre 60 e 120 minutos após administração da clonidina, mais freqüentemente no tempo 60 (9 pacientes).

4.3.

TESTE DO TRH ASSOCIADO

AO LHRH

Este teste sõ foi realizado no paciente FCS, revelando respostas hipofisárias normais de LH, FSH, TSH e PRL. a

Os níveis basais elevados de PRL deveram-se provavelmente "stress" na hora do teste (Tabela X V I ) .

5.

SEGUIMENTO

(FI6S. 21 E 22)

Todos os pacientes apresentaram ritmo de crescimen to adequado, com exceção de FCS e ADO. Durante a evolução,

foi observada pubarca em ADO aos 12,5 anos e início da pube£ dade em SRC aos 14,8 anos, permanecendo pré-púberes os demais componentes do Grupo IA. Já no Grupo IB, houve progressão

discreta dos sinais puberais em todos os pacientes.

104

30

60

90 120 TEMPO (MINUTOS)

FIG. 2 0 - NÍVEIS SERICOS DE 6H ( MEDI A ± ERRO PADRÃO
DA MÉDIA) NOS TESTES DE TOLERÂNCIA À INSULINA { • — • ) E CLONIDINA ( * — * ) EM PACIENTES PÚBERF.S SEM DÉFICIT DE GH.

105

M-TURA cm

90
80 70 60 150 140 30 120

110
00 90
• i i i i i i i i

5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 20
IDADE EM ANOS IG. 21 - RITMO DE CRESCIMENTO DE 21 PACIENTES DO SEXO MASCULINO COMPARADO COM O GRA'FICO DE MARQUES E C 0 L . ( 2 8 ) . ( • ) INÍCIO DO TRATAMENTO COM GH. ( t ) INÍCIO DA PUBERDADE.

R I T M O DE CRESCIMENTO DE 9 PACIENTES DO SEXO FEMININO COMPARADO COM O GRAFICO DE MARQUES E COL. ( * ) INÍCIO DO TRATAMENTO COM GH. ( 2 8 ) . 22 .106 AS CAN i—i—I—I—i—i—i—I—I—I—i—i—i i i • • i . i i 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 20 IDADE EM ANOS FIG. . ) INÍCIO DA PUBERDADE.

e/ou respostas subnormals dos demais hormônios hipofisários aos estímulos de hipoglicf? mia.107 GRUPO 2: PACIENTES COM DÉFICIT DE GH Foram incluídos neste grupo 10 pacientes que preer cheram 3 ou mais dos seguintes critérios: a) b) c) d) presença de sinais típicos de nanismo hipofisârio. P C S . Em 4 pacientes (RJSC. suspeitou-se de doença hipofisária familiar em 4 (ARC. IDADE E SEXO Foram estudados 7 meninos e 3 meninas. foi feito o dia£ nõstico de deficiência hipotaiâmica-hipofisária múltipla pelos níveis séricos basais reduzidos de T e T. com idade entre 5. CC e JAS) devido à presença de consangüinidade entre os pais. AVALIAÇÃO CLÍNICA 1. 1. na qual foi diagnosticado craniofaringioma. pico de liberação de GH menor do que 5.1 anos. Os outros 6 pacientes (ARC. AMAS.1. Entretanto.0 e 16. A etiologia do distúrbio hormonal foi considerada idiopática em todos os pacientes com exceção de FSGS. PCS. CAN e FSGS). CC e JAS) foram classificados como déficit isolado de GH.0 ng/ml err 2 t e s tes de estímulo (ITT e c l o n i d i n a ) . TRH e LHRH. ritmo de crescimento redu2ido. FK. . WL. dosagem sérica diminuída de SmC.

CC.500 g e nenhuma com altura abaixo de 48 cm. CAN) e as de afeto domiciliar em apenas 1 (ARC). As condições de (PCS. asma brõnquica em RJCS e verminoses prévias. HISTÓRIA DO DÉFICIT ESTATURAL O retardo de crescimento foi notado pelos familiares nos primeiros 6 anos de vida. Os 10 partos foram por via vaginal. nutrição foram consideradas inadequadas em 4 crianças WL. antes de nenhum paciente tinha recebido qualquer tratamento procurar o HC-FHUSP. a não ser criptorquidia tratada com Pregnyl en AMAS.108 1. I Í . Não foram relatadas outras patologias importantes em nenhum dos doentes. 1. Com exceção de vitaminas.2. do os demais pré-púberes. ANTECEDENTES INDIVIDUAIS Todas as gestações evoluíram sem intercorrências.3. Foi observado retar- do do desenvolvimento neuro-psico-motor no paciente PCS e um baixo aproveitamento escolar em RJCS e PCS. Apenas 1 criança nasceu corn peso inferior a 2. Dois pacientes (JAS e FS6S) referiram início do d£ senvolvimento puberal aos 14 e 15 anos. sendo 3 pélvicos e associados a cianose do recém-nascido. com duração de 9 meses. respectivamente.

hipotireoidismo ou de hipocortisolismo. CAN e JAS) apresentavam sinais típicos de nanismo hipofisãrio como nariz em sela e adiposidade abdominal.109 1. Não foram a detectadas outras anormalidades em nenhum dos pacientes. ANTECEDENTES HEREDITÁRIOS A média da altura dos pais foi menor do que 158 cm em apenas 1 paciente (FSGS). constituído por apenas 2 . não sen do referidas outras patologias lias. FK. No Grupo 2B (púberes). PCS. sendo observada consangüinidade entre os pais de 4 (ARC. CC e JAS).4. relewntes nas demais famí' | 1.6. A paciente FSGS apresentava polidipsia. EXAME FÍSICO Sete pacientes (ARC. INTERROGATÓRIO COMPLEMENTAR poliúria.5. Seis meninos e 2 meninas foram considerados pré-p£ beres ao exame físico. nictúria e hemianopsia bitemporal não associada a cefaléia. associados a pele ressecada e reflexo aquileu lentificado em 2 (RJSC e P C S ) . RJSC. Nenhum dos outros doentes referia sintomas neurológicos. CC. sendo classificados como Grupo 2A (Tabela I X ) . Foi relatado nanis mo acentuado (não investigado) só em 1 irmão de ARC. não ser presença de fronte olímpica e esclera a2ulada em CC. PCS. de 1 .

anormalidades ao A idade óssea estava retardada em todos os pacient e s . CC e FSGS) e graus variáveis anemia normocítica normocrômica ou microcítica hipocrômica em t o d o s . não sendo compatível com a idade estatural em apenas (AMAS e W L ) . Os demais exames laboratoriais e ^ tavam dentro dos limites da normalidade. com exceção de FK. sendo detectada hipo_ albuminemia discreta em apenas 1 (CAN). desdobramento do assoalho. Foi constatada verde minose em 3 pacientes (WL. Nos demais pacientes.nc elementos (Tabela X) a paciente FSGS apresentava pubarca e telarca (estádio II de T a n n e r ) . o estudo radiolôgico não mostrou nível da sela türcica. AVALIAÇÃO L A B O R A T O R I A L E RADIOLÓGICA GERAL E X) (TABELAS IX As proteínas séricas totais encontravam-se diminuí das em 4 pacientes (PCS. 2. enquanto que JAS tinha testí culos com 3.2 cm de diâmetro. sendo confirmado o diagnóstico de tumor cístico com extensão intra e suprasselar pela tomografia computadori zada. CC e C A N ) . WL. 2 . 0 Rx de crânio de FSGS revelou sela túrcica con cii mensões a u m e n t a d a s . e calcificaçã> suprasselar.

4 5.6 3.5 2 5.9 1. 4 0.0 12-15 6-B i (l) Oesvio-padrão e» relação a «édia para sexo t idade segunda as tabelas it Karques e col. (anos) (kg) Peso (-DP) Altura Idade Idade óssea (anos) fcit»o cresc.2 2.0 15.6 87 4 84 7 2 1.8 5. C C CAN Noraa! K M H 9. 7 2. I 5.0 13. Alb. .5 H. 133.2 15 .5 6. -DP) ( ( D tstat.4 3.4 K M H F F 5.0 12. (45. 8 5.0 2.8 2.0 9. (c»/ano) Heioç.5 7.2 *.7 25. 1 3. 2 113.0 10.1 8.0 5.1 3.ill TABELA IX .0 12.4 5 ii *í 11.3 10.0 26. (anos) (s/ál) 11.9 J :! . Prot.4 3.2 9.9 (g/dl) (s/<^ 4.3 3.0 2.Dados clínicos e laboratoriais em pacientes prê-púberes com déficit de GH (Grupo 2A) Noae Sexo Idade cron.0 1.4 11.4 6.5 2. 6 119.2 2. 0 12*.7 6 10 12 21.5 6.7 i AC R RJSC F K PCS AHAS »L.6 3.7 4 7 85 2.3 29..5 3.0 3. 6 114.9 4.5 3 5 7 4. 1 ii ( D (c) 98.7 6.7 10.0 5.2 10. 2.4 11.7 4.5-5.2 5. i.9 15. p »* - 5.5 3.9 0. 5.3 3.0 í.2 10. tot.

ig/dl) (g/dl) 63 .4 3. tot.8 Idad.5 16.112 TABELA X - Dados c l í n i c o s e laboratoriais em pacientes púberes com d é f i c i t de G H (Grupo 2B) Idad: estat. 6-8 (<ó).) 120.7 3. 4 Altura (c. 8. éssea (anos) 9 9 Ritio tresc.8 (fl/dl) 11.6 4.7 10.5-5. 62 .5 25.0 4.1 21.2 < jj Note Peso Sexo Hade cron. (ct/ano) 3. (1) (anos) (kg) (-DP) X F 14. (anos) 67 .9 128.al (l) 4.9 12-16 Alb. 8 (-DP) (1) 5. Prot. 1 3.p a d r ã o em r e l a ç ã o a « é d i » para seno e idade segundo as t a b e l a s de Par-ques e c o l . .0 O e s v i o . JS A FSGS Nor.2 2.

foram observados em 3 (RJSC. confirmando a presença de hipotireoidismo secundário. Já o estradiol i sérico caiu abaixo da sensibilidade do ensaio (10 pg/ml ) em todos os pacientes de ambos os grupos. todos os pacientes partiram de níveis basais de GH iguais ou menores do que 1. . Apesar dos sintomas desagradáveis de hipoglicemia observados em todos os pacientes. enquanto que. associados a valores normais de TSH.113 3. quando correlacionada com a idade cronológi ca e sexo. no Grupo 2B. • . 4. TESTES FARMACOLÓGICOS DE ESTÍMULO 4. Com exceção de JAS.1 ng/dl. JAS mostrou um valor de 50. Níveis de glicemia inferiores a 40 mg/dl ocorreram entre 15 e 30 minutos após administração da insulina em todos os testes. mostrou-se diminuída em todos os pacientes.0 ng/ml . TESTE DE TOLERÂNCIA XIV E XV) Ã INSULINA (TABELAS XIII. não foi necessário i n t e r — romper o teste devido a perda de consciência em nenhum. A testosterona sérica situou-se em nível inferior a 2? ng/dl em todos os meninos do Grupo 2A. AVALIAÇÃO HORMONAL BASAL (TABELAS XI E XII) A SmC.1. níveis sêricos reduzidos de T 3 e/ou T . não . PCS e FSGS).

5 0.18-2.D ARC (0.22-2. < :c 2.3 < IO 3-27 < 10 Norial 80-200 4.114 TABELA XI - Avaliação hormonal basal em pacientes prê-púberes com d é f i c i t de G H (Grupo 2A) Noae SiC (u/.4 75 4.7) 0.0 (1) Valores noriais para sexo e idade cronológica.2 147 7.8)' RJSC < 0.28-3.8-5.22-2.10 (0.10 (0.2 13.41-4.9 8.0 AMAS ML CC 156 11.13 (0.4) < 0.10 (0.6) < 0.0 E 2 (w/dl) 7.8) < 0.22-2.5 3.5) 3 (ng/dl) 100 T \ TSH (\iUlfil) 4.10 (0.0 2.8) PCS 0.90-5.4 42 23.5 1.2 T (ng/dl) 16.0 93 7.1) < 0.0 135 8C .7 6.10 (0.7 2.0 CAN 97 8.0 25.91-3. .7 (pgM) ° >1! (1) 122 3.14 (0.5-11.

1) FSGS 37 3.71-4.0 > 5C < 82 (l) Valores noraais para sexo e idade cronoláçica.7 < 10 Norial 80-200 «. .10 (0.1 JAS 0.9 2.90-5.l) T (ng/dl) 97 T dig/dl) 10.5 0.5-11.10 (0.2 T E (ng/dl) ( p 9 M ) 50.115 TABELA XII - Avaliação hormonal ba:al e pacientes püberes com m d é f i c i t de G H (Grupo 2B) Nose S»C (U/.8-5.6)' 0.7 TSH (jiUl/dl) 2.

9 ng/ml para um máximo de 3. PCS e F S G S ) . do hormônio liber^ valores máximos foram observados .01) do que a obtida no Grupo IA. No G r u p o 2A. confirmando a deficiência do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) ou dor do ACTH (CRF).08 n g / m l . Houve uma dis criminação completa entre os níveis de GH o b s e r v a d o s nos diferentes tempos do ITT no Grupo 2A quando comparados do Grupo IA (Fig. estatisticamente menor (p < 0.5 ny/ml no tempo 3 0 .116 havendo incrementos acima de 1. além de tudo.4 ng/ml apôs o estímulo hiooglicêmico em nenhum. já que este era constituído por apenas 2 pacientes q u e .s e normais em todos os pacientes. a concentração de GH elevou-se de um basal de 1. Nos pacientes em que houve discreto aumento dos níveis de GH durante o teste. ccn os apresentavam secreções nitidamente d i f e r e n t e s de GH. Com relação ao cortisol (Tabela X V I ) . os níveis sj? ricos basais m o s t r a r a m . a resposta foi c o n s i d e r a d a subnormal em apenas 3 (RJSC. No pacientes JAS. Não foi calculada a média dos picos nem realizada a comparação estatística do Grupo 2B com os d e m a i s . Após estímulo h i p o g l i c ê m i c o . 2 3 ) .89 +_ 0. os entre 30 e 90 m i n u t o s . a média dos picos d e t e c t a d o s apôs injeção de insulina foi de 0.

7 0.3 0.9 0.6 0.6 0.8 JAS n PCS AKAS XL CC CAN Hidia 0.7 0. (2) Para o cálculo da aídia.1 0.0 0.TABELA XIII .8 M 0.0 0.9 1.7 1.0 1.08 EPH (1) Média dos níveis de GH nos teipo.7 U.6 1.ei 0.9 < 0.8 <: 0.5 B 1. de -30 e 0 linutos.6 < 0. .2 lfk J.08 o.7 < 0.89 0.Níveis de GH em condições basais (B) e de pico (P) em pacientes com déficit de GH Pacientes púberes ÍG^upo 2B) «fvtis d» GH ( n q M ) No«* ITT Clonidina Pacientes pré-púberes (Grupo 2A) Híveis de GH (nq/il] ffoae ITT Clonídina B ARC RJSC 0.5 1.0 0.3 0. as concentrações de GH que caíra* abaixo da sensibilidade forai consideradas iguais ao valor da sensibilidade do respectivo ensaio.0 1.2 2.7 0.9 3.70 0.9 1.6 0.6 0.8 0.18 FSGS 1.9 1.9 0.6 < 0.6 < 0.3 1.9 0.05 0.

.6 39 1.3 25 <0.10 ITT 15 <0.0 1.7 86 <0.90 0.6 1.0 ARC 0.9 26 1.2 0.6 34 <0.08 <0.6 86 <0.7 0.6 30 0.7 0.9 1.77 0.as.4 40 <0.3 0.9 <O.9 1.12 1.9 39 0.6 76 <0.6 120 1.Níveis séricos de GH nos testes de tolerância ã insulina e clonidina em pacientes pré-púberes com déficit de GH {Grupo 2) Nose Dosage» -30 GH.9 82 0.S 22 0.7 72 0.6 30 1.9 <0.9 <0.6 <0.06 0 <0.6 50 0.7 39 0.7 51 0.6 104 <0.9 0.05 0.80 0.0375 i g V ) 0 30 60 90 <0.1 75 0.6 17 0.8 36 <0.0 43 0.0 0.9 0.8 49 0.3 67 0.77 0.6 72 <0.7 36 0.9 -3C <0.6 27 0. (2) Gliceiia (*g/dl).9 80 0.71 0.9 0.11 1.9 60 <0.6 32 0.8 " 0.7 32 0.9 0.3 1.9 0.0 0.5 C.9 <0.2 33 <0. (3) Para o cálculo das iíd.04 Clonidina (C.8 56 <0.118 TABELA XIV . (2) G GH G GH G PCS GH G ANAS GH 6 "L GH G GH G GH G GH 0.6 - <0.6 1.0 1.8 32 <0.6 81 <0.8 77 <0.5 <C.6 78 <O.6 2.19 (1) GH (ng/il).: :.6 34 <C.73 0.06 (0.6 44 42 «"0.-: 0.8 39 <0.9 <0.9 73 0.7 11 0.68 0.5 0.6 2.07 90 0.85 0.5 <0.2 0.« <C.1 1.6 <0.6 61 0.9 <0.83 0.0 35 0.6 56 0.78 0.9 89 1.8 43 1.6 38 1. .9 1.09 C.6 58 0.6 48 0.5 <C.9 40 0.9 0.0 40 <0.6 0.6 CC nu Hídia^ EPH <0.6 <O.73 0.C5 0. as concentrações de GH que caírai abaixo da sensibilidade forat consideradas iguai* ao valor da sensibilidade do respectivo ensaio.20 0.6 28 0.5 0.2 0.3 1.1 U/kg) 30 45 0.

9 26 2.1.7 88 0 <0.8 1.9 37 2.4 53 Clonidina (0.119 TABELA XV .1 82 ITT (0.1 U/kg) 15 30 45 <0.1 1.2 78 1.5 60 <0.Níveis séricos de GH nos testes de tolerância ã insulina e clonidina em pacientes púberes com déficit de GH (Grupo 23) No» Dosage» -30 GH G GH G 1.1 1.0375 »g/»') 0 30 60 90 1. .6 4.1 46 90 <0.9 36 2.7 2.3 1. (2) Gliceiia («g/dl).8 62 -30 1.9 35 <0. 120 1.8 3.2 FSGS 1.9 24 3.7 1.5 26 <0.9 33 2.9 74 2.0 "' S (1) GH (ng/il).

XIV E XV) Houve redução de 10. com exceção de JAS. de maneira semelhan te à observada no Grupo 1. a média dos picos põs-cionidina de 0.8 e de 5.08 ng/ml. No Grupo 2A.120 4. Houve também uma discriminação completa e£ tre os níveis de GH observados nos diferentes tempos do teste da clonidina no Grupo 2A quando comparados com os do Grupo IA (Fig. não houve incremento acima de 2. foi de A análise estatística mostrou que esmesmo te valor era menor (p < 0.81 *_ 0. Todos os pacientes partiram de concentrações basais de GH iguais ou inferiores a 1.8 + 2.4 ng/ml. Após administração da clonidina.01) do que o observado no teste no Grupo IA.37) do obtido no ITT no Grupo 2A. respectivamente. TESTE DA CLONIDINA {TABELAS XIII. 2 3 ) . mas não diferente (p = 0.6 imiHg nos _ níveis da pressão arterial sistólica e diastõlica. Esta queda ocorreu entre os 60 e 120 minutos do tes te e foi acompanhada por leve sonolência. nos testes em que houve discreto aumento dos níveis de GH. No Grupo 2B. não foi calculada a média dos picos nem realizada a comparação estatística com os demais pelas razões anteriormente especificadas. Os tempos de pico.0 + 1.3 ng/ml em nenhum. ocorreram entre 30 e 90 minutos apôs grupos .2.8 ng/ml no tempo 60. que mostrou um valor máximo 4.

2 3 .0—6) EM PACIENTES PRÉ-PÚBERES SEM DÉFICIT ( • .121 GH ( ng/ml) 30 60 90 120 TEMPO (MINUTOS) F!G.NÍVEIS SÉRICOS DE GH ( MEDIA± ERRO PADRÃO DA MÉDIA} NOS TESTES DE TOLERÂNCIA À INSULINA (•—.* ) E COM DEFICIÊNCIA (c^-o a—a) DE GH. .• .*—«. * .) E CLONIDINA (^--4.

PRL. com exceção do valor elevado de PRL observado nos pacientes PCS e FSGS. r e s p e c t i v a m e n t e . nas p r é . Após estímulo com TRH.122 administração da c l o n i d i n a . LU e FSH foram normais. no 4. a hipófise normal pode não responder ao estimulo agudo com LHRH. sendo mais precoces do que Grupo 1.3. os incrementos do TSH e PRL foram considerados subnormals em apenas 1 (CAN) e 2 (FSGS e C A N ) pacientes. todos os pacientes responderam ao LHRH com elevação dos níveis séricos de LH e FSH. excluindo uma deficiência hipofisãria total d e £ tes hormônios. 0 aumento das gonadatrofinas foi considerado crianças normal nos 2 pacientes púberes.p ú b e r e s . Em RJSC. já que. nesta fase. indicando uma baixa reserva hipofisãria destes h o r m ô n i o s . a resposta exagerada do TSH sugeriu um distúrbio hipotalãmico. . não foi possível avaliar o grau de r e s p o s t a . ao passo que. Com exceção de CAN (teste não r e a l i z a d o ) . TESTE DO TRH ASSOCIADO AO LHRH (TABELA XVI) Todas as dosagens basais de TSH. sugestivo de distúrbio h i p o t a l â m i co.

6 4.7 3.3 16.? 15-98 11.1 6.lédia dos níveis horaonais no teipos it -30 e 0 cinutos.0 12.7 5-17 3.0 30.6 12.8 0.0 19..5 6.123 TABELM XVI .6 5.0 13.2 4.8 1.0 31.4 10.9 4.0 32. 4-".1 15.6 5.8 23.4 8.1 2.6 2. Nadir.0 8.6 13.3 25. TSH.1 13.3 12.1 1.9 2.0 21. 26.0 5.' 85 . TRH e LHRH em 11 pacientes com baixa estatura ITT .9 32.1 7. 20.6 4.5 2.7 12.0 27. Valores noraais segundo Nery (52).1 ü/kg) F (ytg/dl) TRH (200 pgj LriRH LH (IÜI/»'!) (IQQ uq) Ho.0 5.5 20.5 9.3 29.7 23.4 21.1 55.0 30.7 5.8 7. Respostas noriais para pacientes púberes.3 3.0 16-42 8 2.8 34.5 6-30 B 34.6 29.8 15.8 9.2 2.0 7.9 10.9 3.0 20.9 8.e (ig/dl) TSH (pUl/iI) PRL (pg/.1 2-16 21.5 2.Resposta do corfisol (F).3 8.3 26.7 10.4 2.'.7 7.4 5.3 6. PRL.6 12.1 31.5 10.(5 -17 3-17 2-9 Basal .4 c c CN A JAS FSCS Nonal (1) (2) (3) (4) (5) 8.0 21.1 98.0 58.Iic.2 1.9 11.4 4. .8 3.4 30 30 25 26 36 30 39 32 1 1 26 24 16.6 4. LH e FSH ao estímulo hipoglicêmico.I) FSM (»ui/ii 8 FCS ARC RJSC F K PCS A!US M L 82 66 86 85 74 77 88 78 5/ 85 76 70-110 P 20.8 4. Pico de concentração horaonal após estíaulo.9 1-6 P 26.1 5.9 <.6 16 .: 4.9 3.0 6.8 7.2 1.7 25 3 13-97 C5i 2. (0.

1 U/kg con- mento com GH extraído de hipófises humanas no HC-FMUSP de peso administrados por via intramuscular 3 vezes por semana). houve aceleração da velocidade de crescimento em RJSC. Neste sendo confirmado o diagnóstico de craniofaringioma. sendo que apenas WL entrou em puberdade aos 15. período. Após iniciado trata(0. 21 E 22) Todos os pacientes foram seguidos por um período mínimo de 6 meses. CC e . CAN. todos os demais pacientes apresentaram ritmo de crescimento reduzido. a qual foi submetida a cirurgia transfenoidal 3 mesr após a avaliação inicial.124 5. Com exceção de ARC e FK. a única medicação administrada foi 1-tiroxina (50 a 100 ug por via oral) aos pacientes com hipotireoidismo firmado laboratorialmente. SEGUIMENTO (FIGS. com exceção de FSGS.7 anos.

R/SP .VIII - ÜI SCUSSAO COM:1- A : '•' • V-.

0 ng/ml) em 14.15 mg/m* ) foi comparado com o ITT (0. (16) não encontraram respostas inferiores Já a 7.126 A clonidina. Fm escudo sero?1han te.5 ng/ml ) em _ todos os elementos de um grupo de 18 crianças e adolescentes com baixa estatura sem distúrbio endccrino.7 ^1.66) em que o teste da cloni dina (0. administrada na dose oral de 0. com resultados falso-negativos (resposta menor do que 7. sendo menores ou Iguais a 8.15 U/kg ou 4 U/m 2 ) em pacientes com nanismo não hipofisário.24) em 1979. que observaram 10 ng/mi (média + erro padrão da média: 34.6 ng/ml.. Isto foi demonstrado pela primeira vez por picos de GH Gil-Ad e acima de col. Fraser e col.39. foi observado maior pico de liberação de GH. (23. (66) relataram picos pós-clonidina de 13.3%.9 ng/ml. associado a menor i n c i — dência de rc.0 ng/ml em 9. Sa]_ ti e col.5 ng/ml em nenhum teste da clonidina. Romero e col. no primeiro teste.7% dos paciente1. cuja média dos picos foi de 18. (63) relataram picos de GH de 21.15 mg/ra*.ultados falso-negativos.1-0.9 +_ 4. Em três estudos (16. é comprovadamente um potente agente estimuiador da secreção de GH. Picos muito mais elevados durante .4 + 4.8 + 1.0 ng/mi.

71) realizados em pacj^ maior pico entes com nanismo não hipofisário.3 + 0. foi observado de liberação de GH (16. Romer e col.10 e 0. nanismo em 1982. 0. ao mesmo tempo. En- tretanto. a secreção deste ho mõnio em pacientes com não hipofisário após administração de 0. algumas objeções foram feitas quanto à validade dos resultados deste último estudo. diferentes laboratórios e os pacientes nem sempre estavam em jejum no dia do teste da clonidina (16).0 ng/ml (6 e 0%.15 mg/m 7 .5 g/kg). com 5.9 ng/ml) foram observados por _ Lanes e col. respectiva — mente) no teste da clonidina.15 mg/m 2 ) também mostrou-se superior ao do 1-dopa (120-250 mg ou 300 :ng/n>*) e ao da argi nina (0.5 + 9.76 ng/ml) e nenor _ índice de resposta inferior a 7. manter eficiência adequada de liberação de GH. (62) estudaram. Devido à ocorrência de hipotensão por vezes severa (47) associada â dose de 0. Em dois estudos (62.1 + 1.05.95 e 13. a clonidina foi testada em quantidades menores com o intuito de se reduzir a incidé£ cia de efeitos colaterais e.15 mg/m* .127 este teste (36. que consistiu na investigação de 64 pacientes coro baixa estatura em diversos centros da Grã-Bretanha. (39) no único estudo em que apenas crianças pré-púberes foram avaliadas.8% de respostas inferiores a 10 ng/.-ni A eficiência de liberação de GH provocada pela clonidina foi considerada equivalente e não superior à do ITT em apenas um trabalho (30). 0 teste da clonidina (0. já que as dosagens de GK foram realizadas en.

123

de clonidina, não observando diferenças estatisticamente sig nificantes nas respostas obtidas com estas 3 doses. Neste

mesmo ano, Laron e col. (41) propuseram a realização Jo teste da clonidina com a dose fixa de 0,025 mg e compararam-no com o ITT (0,1 U/kg). Em 12 pacientes com baixa estatura consti

tucional, sem menção ao estágio puberal, os autores r e l a t a — ram picos de GH e resultados faiso-negativos (resposta menor do que 10 ng/ml ) de 21,8 + 4,9 ng/ml e 16,7% para o ITT, _ e

de 30,6 + 8,8 ng/ml e 8,3% para a clonidina, sendo este ülti _ mo associado a reduções da pressão sistõlica de 5 a 10 mmHg. Concluíram, portanto, que a clonidina, mesmo na pequena dose de 0,025 mg, era um agente liberador de GH mais potente que o estímulo hipoglicêmico. Entretanto, dois estudos subseqüentes (11,40), reji lizados em grupos de crianças pré-púberes com nanismo não hj^ pofisário, demonstraram que o teste da clonidina coro dose in ferior a 0,15 mg/m 2 , embora adequado para avaliar a reserva do

hipofisária de GH, não era tão eficiente quanto inicialmente proposto por Laron e col. (41). No trabalho realizado por

Dammacco e col. (11) em 1983, o teste da clonidina (0,035 mg/m2) foi comparado com o da arginina (0,5 g/kg). Os resultados

revelaram picos de liberação de GH semelhantes (16,7 + 2,44 ng/ml para a clonidina e 15,69 + 2,56 ng/ml para a arginina), _ mas

menor incidência de resultados falso-negativos (pico£7,0 ng/ml) no teste da clonidina (16,7*) do que na arginina (25S). Houve

129

r e d u ç ã o dos níveis pressóricos pós-clonidina de

11,5 i 0,8 mmHg

para a sistõlica e de 7,5 +_ 0,7 mmHg para a diastólica. Jã no e s t u d o de L a n e s e col . ( 4 0 ) , publicado em 1985, a foi t e s t a d a nas doses fixas de 0,100 e 0,050 mg clonidina (corresponem Os

d e n t e s , e m m é d i a , a 0 , 1 1 9 e 0,0619 m g / m 2 , respectivamente) 10 (Grupo A ) e 14 (Grupo B) crianças, respectivamente.

picos de GH foram de 14,5 +_ 2,0 e 11,6 +_ 1,6 ng/ml nos Grupos A e B, r e s p e c t i v a m e n t e , com índice de respostas (menores do que 10 ng/ml) de 10 e 3 6 % . subnormais

Houve decréscimo se14 a

m e l h a n t e da p r e s s ã o arterial nos 2 g r u p o s , variando de

15,3 mmHg para a sistólica e de 2,3 a 4,0 mmHg para a diastó lica. Neste m e s m o trabalho, 9 crianças com baixa estatura de

i d i o p á t i c a foram estudadas com uma dose de 0,100 ug/m 2

c l o n i d i n a e uma única coleta de sangue aos 60 minutos, sendo o b s e r v a d o s picos maiores ou iguais a 10 ng/ml em todas. 0 t e s t e da clonidina com a dose de 0,0375 mg/m 2 foi, neste p r o j e t o , avaliado no que diz respeito â eficiência

de liberação de GH e ã incidência de efeitos colaterais indj; s e j á v e i s , p a r t i c u l a r m e n t e hipotensão e sonolência. to, ele foi c o m p a r a d o com o ITT (0,1 U / k g ) , Para taji

considerado por hipoem

m u i t o s autores o teste padrão de avaliação da reserva f i s á r i a de GH ( 3 2 , 4 8 , 5 8 ) . Os 2 testes foram

realizados

g r u p o s d i s t i n t o s de crianças e a d o l e s c e n t e s , para se estudar também a possível influência da puberdade sobre a do GH à c l o n i d i n a . resposta

130

A avaliação clinica, laboratorial e radiolôgica ge ral obe-deceu às recomendações propostas por Underwood & Van crianças hormônios

Wyk no que se refere ã investigação diagnostica de com baixa estatura ( 7 4 ) . As dosagens basais dos

tireoidianos, gonadotrofinas e SmC contribuíram para descartar a presença de hipotireoidismo, disgenesia gonadal em neninas púberes e nanismo hipofisârio, respectivamente. 0 ITT foi padronizado segundo critérios previamente estabelecidos na literatura (18,20,35,36,56,59,64,72,77), com coletas de sangue até os 90 minutos após administração da insulina, já que, neste teste, o pico de GH geralmente ocorre entre os 30 e 90 minutos. A coleta não foi continuada até os 120 minutos para não perpetuar em demasia os efeitos cola terais desagradáveis associados ã em todos os pacientes. 0 teste da clonidina 0,0375 mg/m*, escolhida por foi realizado corresponder a corc a dose de exatamente um hipoglicemia, observados

quarto do valor inicialmente preconizado na literatura (0,15 mq/rn*) e ser próxima da dose de 0,035 mg/m z , já previamente testada e associada a boa eficiência de liberação de GH e baixa inci^ dência de efeitos colaterais ( 1 2 ) . Foi ponderado também que, embora criasse problemas na hora de sua preparação, a deveria ser corrigida para a superfície corpórea, que todas as crianças recebessem,proporcionalmente, quantidade da droga. de a dose modo mesma

individualizadas para cada paciente.39.44 ) .dessa maneira.131 A transformação da clonidina em pó e posterior diluição em água foi a única maneira simples encontrada de se preparar diferentes micro-doses da droga.0 0 ao a 30. 7 1 ) .1 mg.40. já que. evitand£ -se.62.63. Em todos os testes. este procedimento fa cilitou também a administração da droga a crianças que se re cusassem a engolir o comprimido. Todos os soros e de um mesmo paciente foram dosados em um único ensaio. método foi ajustado de modo a apresentar sensibilidade redor de 1. 0 fato de que os tempos de coleta não foram idênticos neste teste e no ITT não invalida a comparação entre eles.0 ng/ml e precisão máxima no intervalo de 5.0 ng/ml. Embora não se conseguisse uma solução comple tamente homogênea de clonidina em água.o GH foi determinado por método próprio de RIE completamente desenvolvido. já que o menor comprimido comercializado contém 0.16. correspondente â maior parte dos picos de liberj^ . As amostras de sangue após administração da clonidina foram coletadas a cada 30 minutos durante 2 horas.30. 66. em todos os estudos prévios (11.a Influência da variação ínterensaio. já que corres pondem a estímulos provocativos diferentes da secreção de GH.23.(38. embora ambos com provável ação ao nível de receptores a-adre nérgicos centrais. o pico de GH ocorreu entre 60 e 120 minutos. caracterizado adequado às necessidades deste projeto.41.

permitiu uma boa discriminação entre os pacientes . confirmando a importância do exame clínico. considerado um dos parâmetros mais importantes na decisão de se submeter ou não um p^ ciente com baixa estatura a investigação laboratorial extensa (74).132 çâo de GH observados nos testes provocativos. dosagem basal de SmC e resposta aos testes provocativos. A c 1 assificação dos 31 pacientes em portadores (Grupo 1) e não portadores (Grupo 2) de déficit de GH. basea da nas características clínicas.75). já que estudos prévios (35) demons^ traram que a resposta do GH aos testes provocativos não é dj_ ferente nestas doenças quando comparadas entre si ou com indivíduos normais. Foi possível a inclusão de pacientes com patolo- gias diversas no Grupo 1.74. Não se procu- rou obter maior sensibilidade porque não era a finalidade des te projeto estudar valores basais de GH. obede- ceu a critérios previamente estabelecidos na literatura (32. A especificidade do ensaio foi demonstrada pelo baixo grau de imunorreatividade cruzada do anti-soro anti-GH com os demais hormônios hipofisãrios e pela ausência de efeitos não específicos do meio de incubação sobre a reação antígeno-anticorpo. 58. o na- nismo hipofisãrio foi fortemente suspeitado na avaliação clí^ nica pela severidade do déficit estatural e/ou presença de sinais típicos. Em todos os pacientes incluídos no Grupo 2. ritmo de crescimento. 0 ritmo de crescimento.

acompanha ram a curva normal de crescimento. res normais de SmC praticamente excluem deficiência (75). A dosagem sérica de SmC. principalmente em quando . a presença de SmC diminuída praticamente excluiu esta hipótese. Não foi encontrada explicação adequada para a velocida de de crescimento normal nestes dois últimos pacientes. faixa etária em que se enquadravam ^o dos com exceção de 1 paciente estudado neste projeto. foi também utilizada para des^ cartar a presença de graus mais severos de desnutrição qualquer um dos pacientes do Grupo 1. Todos com exceção de 2 pacientes do Grupo 1. a dosagem sêrica normal de SmC. mostrou-se normal em todos os pacientes incluídos no Grupo 1 e diminuída nos do Grupo 2. Embo ra eles pudessem apresentar alguma forma de GH biologicamente ativo mas imuncligicamente não ensaiãvei ( 7 4 ) .75). enquanto que isto ocorreu em apenas 2 crianças do Grupo 2 durante o período de observa ção. apontada como um dos melhores índices do estado nutricional adequado de um indivíduo (74). Aliás.133 com e sem deficit de GH. como hi potireoidi smo e desnjj trição. e não permitem estabelecer o diagnóstico de nanismo hipofisário ( 7 5 ) . embora situando-se abaixo do percentil 1 0 . valores baixos estão freqüentemente associados a outras patologias. p o s s i b i l i — tando uma completa diferenciação entre el&s. valode GH Por outro lado. freqüentemente como teste de tr'agem para excluir o diagnóstico de utilizada nanismo hipofisário (74. Em crianças aci ma de 5 anos de idade.

(40) com a dose fixa de 0.15 m g / m 2 . foram dose Os n i t i d a m e n t e Inferiores aos de Laron e c o l . Embora um assunto controvertido.3 ng/ml. Por outro lado.0 ng/ml. ( 4 8 ) . (11) com a dose de 0.0 ng/ml como resposta normal a qualquer teste de liberação deste hormônio (32 74). A c o m p a r a ç ã o entre o teste da clonidina e o ITT no grupo de crianças pré-púberes demonstrou que a média dos picos de liberação de GH foi maior (embora não estatisticamente s i g n i f i c a n t e ) no primeiro teste. 48 Este valor está de acordo com os resultados obtidos nes te e s t u d o . Entretanto.0 ng/ml em pelo menos um teste p r o v o c a t i v o . este paciente poderia ser cias sificado como déficit parcial de GH.obtidos por Laron e col (41) com a menor dose de cloni- COV' . o qual estava também associado a menor incidência de respostas faiso-negativas. sendo ainda inferior a 5. (41) com a fixa de 0. resultados obtidos foram mais compatíveis com os relatados por Dammacco e c o l . Estes d£ de dos reforçam a idéia inicial de que os maiores valores pico. Segundo os critérios pro- postos por Milner e col.035 mg/m' e por Lanes e col. apenas um pacien- te púbere do Grupo 2 mostrou resposta maior do que 2. (39) com a dose i n i cialmente preconizada na literatura de 0. já que todos os pacientes incluídos no Grupo 1 apresentaram picos de GH maiores do que 7. a maioria dos auto res considera um pico de GH acima de 7.025 mg e aos de Lanes e col.134 associada a c o n c e n t r a ç õ e s basais baixas de GH.1 mg.

A média dos pi- cos pós-clonidina neste grupo foi também inferior ã observada nas crianças pré-púberes. A obesidade. os quais necessitariam de quant^ dades da droga proporcionalmente maiores do que crianças. embora corrigida a maior superfície corpórea apresentada pelos adolescentes. talvez se devam ao fato dos autores incluído crianças e adolescentes em um mesmo grupo. terem que provocativos No grupo de pacientes púberes. fato curioso levando-se em consideração que a puberdade geralmente está associada a respostas mais exacerbadas de GH (19). contrariamente ao que ocorre com os de- . jã na puberdade. as respostas do GH aos estímulos clássicos são maiores do que na infância (19). Não houve correlação entre a presença de resposta inadequada e a superfície corpõrea ou sexo do paciente. não estava presente em nenhum paciente. tenha sido insuficiente para provocar uma eficiente liberação de GH nestes pacientes. A única hipótese proposta para explicar estes para resultados ê que a dose de clonidina. o qual apresentou também incidência muito maior de resultados faiso-negativos do que o ITT.135 dina jâ testada. freqüentemente associada a respostas subnormals de GH (73). Es ta posb'bi idade implicaria talvez em uma menor sensibilidade dos receptores o 2 -adrenérg1cos centrais ã clonidina na época da puberdade. o mesmo estudo comparativo revelou que a média dos picos de liberação de GH foi menor (embora não estatisticamente significante) no teste da clonidina.

que o teste da clonidina deve ser preferencialmente realizado com a dos? de 0. pois. Nos pacientes púberes. ser considerado o teste provocativo de eleição para excluir o diag — nóstico de nanismo hipofisário em crianças pré-púberes. Por outro lado. que correspondem â maior parte dos pacientes que procuram o endo crinologista por baixa estatura. perda de consci ência em nenhum. deve ser utilizada apenas em teste complementar para excluir .135 mais estímulos provocativos da secreção de GH. portanto. não havendo. 0 teste da clonidina (0.025 mg ( 4 1 ) . A redução dos níveis pressóricos foi. a eficiência de liberação de GH ainda é maior do que a do ITT. na dose de 0. inferior ã observada com a dose de 0. o em ITT resultou em sintomas desagradáveis de hipoglicemia todos os pacientes.0375 mg/m*) deve. Com relação aos efeitos colaterais.62. a sonolência e hipotensão observadas no teste da clonidina foram semelhan- tes ãs relatadas nos trabalhos em que a droga foi administra da nas doses de 0. ao passo que os efeitos colaterais são muito mais discretos e menos perigosos do que os observados ou no teste realizado com 0. no entanto. portanto. Nesta dose.66). é um agente liberador de GH muito menos potente do que o estímulo hipoglicêmico.035 mg/m z (12) ou 0.15 mg/m 2 ou no ITT. Conclui-se.39.15 my/m 2 (23.0375 m g / m 2 . no entanto. a clonidina. Esta dose.0375 mg/m 2 em crianças pré-púberes.

F i n a l m e n t e . p r e f e r e n c i a l m e n t e .15 m g / m 2 . sugerindo que ambos devam ser r e a l i z a d o s p a c i e n t e s com suspeita clínica desta p a t o l o g i a . deve ser s u b s t i t u í d a pela dose de 0. em .0375 m g / m 2 ) são associados aos do ITT. quando os r e s u l t a d o s do teste da cloni dina (0. o d i a g n ó s t i c o de n a n i s m o hipofisãrio pode ser e s t a b e l e c i d o com segurança próxima a 1 0 0 % .137 d e f i c i ê n c i a de GH neste grupo ou.

IX - CONCLUSÕES .

0375 mg/n 2 ) são associados aos do ITT (0. ser utilizado apenas como teste complementar para deficiência de GH. excluir 3S) Quando os resultados do teste da clonidina (0. 29) Nos pacientes púberes. o diagnóstico de nanismo hipofisário pode ser estabelecido com segurança próxima a 100%.139 le) O teste da clonidina (0. por tanto. devendo. devendo.1 U / k g ) .1 U / k g ) . o teste da clonidina (ú. ser considerado o teste provocativo de eleição em para excluir o diagnóstico de nanismo hipofisário crianças pré-púberes.1 U / k g ) .0375 mg/m2) apresenta incidência muito maior de resultados falso-ne gativos do que o ITT (0.0375 m g / m 2 ) apresenta naior efi ciência de liberação de GH e menor incidência de efeitos colaterais graves do que o ITT {0. portanto. sugerindo que ambos devam ser realiza- dos em pacientes com suspeita clínica desta patologia. .

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