INSTITUI-O

DE

PESQUISAS

ENERGÉTICAS

E

NUCLEARES

AUTARQUIA ASSOCIADA Â UNIVERSIDADE DE SÂO PAULO

COMPARAÇÃO DO TESTE DA CLONIDINA COM 0 TESTE DE TOLERÂNCIA k INSULINA NA AVALIAÇÃO DE PACIENTES COM BAIXA ESTATURA

MARCELO CIDADE BATISTA

Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de Doutor em Tecnologia Nuclear.

Orientador: Prof. Dr. tflilan Nicolau

SAO PAULO 1986

AOS HEUS

PAIS

JOÃO E DILZA

A LENA

cujo carinho e apoio se encontram escritos trabalho. em cada página deste

tOM!5SíO MAClONAL DE tr.e I. P. £. ,.

•••r:.3AR/SP

AGRADECIMENTOS

Esta tese resultou da colaboração t influência de várias pessoas, is quais expresso minha gratidão: Ao Prof. Dr. Wilian Nicolau, orientador e sobretudo amigo, cujo estimulo e participação pessoal foram de fun damentai importância para o meu desenvolvimento na área de Endocrinologia e Radioimunoensaio, culminando, agora, com a realização deste trabalho. Ao Dr. Júlio Kieffer (in memorian), ex-orientador e responsável por minha formação em Medicina Nuclear, por me Incentivar a ingressar no curso de pôs-graduação. Ã Dra. Constância Pagano Gonçalves da Silva, ex-orientadora, pelo apoio dado durante a realização dos cursos e seminários de area. Ao Dr. Walter Bloise, Dra. Berenice Bilharinho de Mendonça e Dr. Ivo Jorge Prado Arnhold, responsáveis por minha formação clinica na área de Endocrinologia. Suas valiosas sugestões contribuíram multo para a elaboração deste tra balho. Ao Dr. Francisco Homero D'Abronzo, que me auxiliou e orientou no desenvolvimento da parte metodológica d e s t e trabalho.

''-Wll-l DE Vr~

• • • - "A" SP

mino. A todos os méoic:. pela participação na dosagem do: hormônios pepndicos e soBatonedina C.A Maria Angel» Henrfques Zanella Fortes. pela colaboração têc»!cõ indispensável no mento do radioimunoensaio ás SH. em especial i Dra. ~\r „ k " " • . pela na análise estatística dos Cherem. i I . Ã FAPESP . Ao Dr. Sandra Ma>*a Villares. Isabel Cristina de Hello Guazzelii e Antonio CSneíido Pinheiro Palodesenvolvi- Ã Dra. Maria Beatriz da Fonte Kohec. 5niornar Madurcira estimulo. e Norma no e ano Dra.s estagiários e residentes trabalharam na Unidade d* òo>adas e Intersexo 1985-86. pela participação rt dpsagem dos hormônios peptfdicos colaboração Ao Dr.Fuhdeçao de Amparo i Pesquisa do Estado de SSo Paulo. Paulo Lu<z k^iirrt Costa. Débora Gonçalves de Carvalho e esterôides. A Valeria S*"iuel Undo. que de Edna Regina Nakandakare. • • ••) ire.. pelo afilio na realização dos testes de T3nid Cecilio Silva. pelo apoio financeiro concedido durante a realização deste trabalho. pelo forneci^ mento de preparações hormonais de referenda. Rui Montei 10 de Barros Maciel. : . • • • ^ «J r .

. SP . . r\ E. r-íL DE ENERGIA U\CLEAR. ij.Este trabalho foi realizado na Divisão de CHnica Médica I do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina da Universidade de Sio Paulo.

'. li. .ÍNDICE I II III IV V V VII VIII IX -RESUMO -ABSTRACT -INTRODUÇÃO -OBJETIVOS -CASUÍSTICA .REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 140 ••'•" -'•' • • • ~~ C F : E R G : A • • .EAR/ .MATERIAL E MÉTODOS -RESULTADOS -DISCUSSÃO -CONCLUSÕES 1 5 9 19 21 23 87 125 138 X .. " . Z.""^.

I - RESUMO J ! .

. 90 e 120 minutos.1 U/kg de peso por via endovenosa.7 e 4.2Y e a interensaio de de 19. a variação 1ntraensa1o 5.4. (2) teste da cionidina (TCLO): cionidina 0.2 ng/ml. 30.3 e 25.COMPARAÇÃO DO TESTE DA CLONIDINA COM O TESTE DE TOLERÂNCIA A INSULINA NA AVALIAÇÃO DE PACIENTES COM BAIXA ESTATURA MARCELO CIDADE BATISTA RESUMO Foram estudados 31 pacientes.6.5 anos e altura entre 1.5 desvios-padrões da média para sexo e idade. 0. • •. 45.1 ± 0. A sensibilidade do método foi de 1. com coletas de sangue nos tempos de -30. 60 e 90 minutos. 15.7 e 12.6% para amostras-controie de 6H contendo 1. A especificidade foi considerada adequada com . 8. 60. Todos foram submetidos a 2 testes de liberação de GH: (1) teste de tolerância ã insulina (ITT): insulina simples 0. 0 6H foi dosado em soro por método de radioimunoensaio desenvo^ vido em nosso laboratório e padronizado por comparação com preparaçio de referência fornecida pelo "National Institutes of Health". com idade entre 2.?:Cíí'. _*.9.08 ng / ml (média + erro padrío da média). 8..0375 mg/m* de superfície corpórea por via oral. 30.9 abaixo e 17. respectivamente. 4. O. com coletas de sangue nos tempos de -30.P/3P1 :.3 e 8. .

que apresentavam sinais típicos de nanismo hipofisário e/ou ritmo de crescimento diminuído.19 p* (pico < 7.3 + 1. os picos de liberação de GH foram de 10. Foi estabelecida deficiência de GH em 8 crianças (Grupo ZA) e 2 adolescentes (Grupo 2B).8 ng/ml _ * _ no ITT e de 14.3X par* o TCLO. dosagem sérica normal de somatomedina C (SmC) e pico de libe raçSo de GH maior do que 7. respecti_ _ vamente.3 + 2. os únicos efeitos colaterais observados foram Mpotensão e sonolência discretas.2 + 3. mal-estar geral e sonoièri cia. SmC baixa e pico de GH menor do que 5. .6 e 9.0 ng/ml em pelo menos um teste de estimulo (ITT ou TCLO). Nos Grupos IA e 16.base ea estudos de Imunorreatividade cruzada e dos efeitos não específicos do meio de Incubaçâo. ao passo que todos os pacientes apresentaram hípogíicemia (< 45 mg/dl) no ITT. No . erro padrSo da média) e 15. Estes valores nío foram considerados estatisticamente diferentes (p > 0. A Incidência de resultados faiso-negativos 28. Fora» considerados normais quanto à secreção de 6H 9 crianças (Grupo IA) e 12 adolescentes (Grupo IB) que preen^ chiam 3 ou mais dos seguintes critérios: ausência de sinais típicos de nanismo hipofisário.4 e 12.05) quando comparados pelo teste "IP de Mann-Whitney.8 • 2. acompanhada por sudorese.0 ng/ml) nos Grupos IA e IB foi de rs o ITT * de 11.1 e 58.7 (média . No TCLO. ritmo de crescimento normal. n&useas.5 ng/ml no TCLO.0 ng/ml nos 2 testes provocativos (ITT e TCLO). respectivamente.

8 ng/ml no TCLO. no entanto. além efeitos colaterais menos graves.7 e 4. os picos de GH observados no ITT e TCLü foram de 0. respectivamente.3 ng/ml em nenhum teste. que engloba a maioria dos pacientes com déficit de crescimento. ser considerado o teste de eleição para excluir o diagnóstico de nanismo hipofisário na idade prê-puberal. Não foi calculada a média dos picos no Grupo 2B.89 + 0. •' •• . respectivamente.-: • r '} -. o diagnóstico de nanismo pode ser estabelecido com segurança próxima a 100%. o TCLO foi menos eficiente do que o ITT para excluir deficiência de GH. sendo signj^ _ ficantemente menores (p < 0.05) do que os do Grupo IA e não ultrapassando 2.Grupo 2A.08 e 1. Conclui-se que o TCLO apresenta maior eficiência de causar de liberação de GH do que o ITT em crianças. Deve. cujos valores máximos foram de 0. .1 • 0. portanto. sugerindo que esta deva ser a conduta preferida naqueles com clinica desta patologia. Et» adolescentes. devendo ser utilizado apenas teste complementar. Quando ambos cs testes são como realizados hipofisSrio em um mesmo paciente. suspeita .5 ng/ml no ITT e 1.08 ng/ml. já que este era constituído por apenas ? pacientes.9 e 3.

II - ABSTRACT .

9 to 17.0375 mg/m* surface area. _ and 4.3 and 25. The sensitivity of the method was 1.7 Interassay precision of 19.6. with samples drawn -30.08 ng/mi (mean + standard error of the mean).5 years. 15. 60.3 to 8. 8.2* and an 12.COMPARISON OF THt CLONIDINE TEST WITH THE INSULIN TOLERANCE TEST IN THE EVALUATION OF PATIENTS WITH SHORT STATURE MARCELO CIDADE BATISTA ABSTRACT He studied 31 patients aged 2.2 ng/ml. 45. An adequate specificity was demonstrated by cros$-react1v1ty studies and by assays designed to test non-specific effects . (2) clonidine test (CLOT): oral at clonidine 0.9. 30. 4. 60 and 90 minutes. 8.4. Serum GH was measured by a rad1o1mmunoassay method developed in our own laboratory and calibrated against a reference preparation provided by the National Institutes of Health. 90 and 120 minutes.1 + 0. respectively.1 U/kg body weight» with samples drawn at -30. 0. 0.61 for quality with an Intraassay precision of 5.7 and control samples of 1. with heights from 1.5 standard deviations below the mean (1) for age and sex. 30. All underwent 2 6H provocative tests: Insulin tolerance test (ITT): Intravenous regular Insulin 0.

Eight children (Group 2A) and 2 adolescents (Group 2B) were diagnosed as GH deficient by the presence of typical signs of pituitary dwarfism and/or reduced growth rate.08 ng/ml. respectively.of the medium used for Incubation.1 and 58.4 and 12. malaise and drowsiness.or of the mean) and 15. False-negative results (peak i 7. These values were . associated with nausea.08 and 1.3 + 1. normal growth rate.89 * 0.5 ng/ml for CLOT.2 + 3. A normal GH secretory reserve was established In 9 children (Group 1A) and 12 adolescents (Group IB). Slight hypotension and drowsiness were the side-effects observed during CLOT. peak GH responses were 10.3X for CLOT.0 ng/mi In at least one provocative test (ITT or CLOT). only had sweating.7 (mean + standard tr.0 ng/mi GH response to 2 provocative tests (ITT and CLOT).U for ITT and 11.6 and 9. with no response greater than 2. low serum SmC and a less than 5. respectively. normal serum somatomedin C (SmC) measurement and peak GH responses greater than 7.8 ng/rol for ITT and 14. In Groups 1A and IB. peak 6H responses for ITT and CLOT were 0.05) when compared by the "U" -Whitney. who had 3 or more of the following features: absence of typical signs of pituitary dwarf 1 sin.3 ng/ml.1 • 0. In Group 2A. respectively.3 £ 2.8 • 2. These values were not statistically test of Mannfor different (p > 0. whereas all patients hypoglycemia (< 45 mg/dl) in ITT.0 ng/ml) Groups 1A and IB were 28.

respectively. Their peak GH responses were 0. W . besides being associated dangerous side effects.5 ng/ml ITT and 1. provocative test It should be considered the diagnosis of with less the best pituitary most to exclude dwarfism in the prepubertal age. '<•'.05) than the ones Group 1A.8 ng/ml for CLOT. Nevertheless.8 significantly lower (p < 0.7 and 4. E . pituitary dwarfisn is very rarely nisdiagnosed. which encompasses patients with growth retardation.0375 mg/m* is more effective than ITT in promoting GH release in children. since only 2 patients were included in group. the clonidine test is less effective than ITT to exclude GH deficiency in adolescents and should be used only as a complementary In pubertai patients. observed in It was not possible to calculate mean peak levels this for for Group 2B.9 and 3. approach when COMISSÃO KMiQML OE EKERGiA NUCLEAR/SP !. We conclude that the clonidine test with a low-oral dose of 0. suggesting that this should be the preferred this disorder Is clinically suspected. When both tests are performed in test a single patient.

Ill - INTRODUÇÃO .

ponente fisiológico predominante consiste em uma cadeia polj^ peptfdica única. fósforo e nagnésio. 0 papel primordial do 6H consiste no controle do crescimento somático pós-natal. Acredita-se que esta açio seja mediada principalmente pela geraçlo das somatomedinas (57). embora alguns estudos . estando presente em quantidades de 5 a 10 mg em cada glândula. cálcio. potássio. associado a balanços positivos de nitrogênio. correspondentes a 35 a 45* da pituitária e localizadas predominantemente nas suas asas laterais.10 A somatotrofina (GH) é o hormônio «ais abundante da hipófise humana. identificados por seu tamanho ou carga (42). Quando administrado a criaji ças com hipopituitarismo. 0 GH presente em extratos hipofisários e no plasma corresponde a uma mistura heterogênea de pelo menos 6 pe£ 0 com tideos. Seu ritmo de secreção diário é de 1 a 2 mg. desaparecendo do pias ma com uma meia vida de 20 a 25 minutos (12).000 daitons. contendo 191 aminoácidos e com peso molecular de 22. Ele é sintetizado e armazenado nas células somatotrõficas. ele estimula o crescimento proporcionado do esqueleto e tecidos moles.

A secreçio de GH ê regulada pelo hi potalamo através de 2 peptideos sintetizados ao nível dos núcleos ventromediai e arqueado: a somatocrinina (6RH) e a somatostatina (SS). aumentando ou reduzindo a liberação de 6RH e SS. As somatomedinas corresponde* a una família de pe£ tideos cujos 2 principais componentes. concentrações séricas de 6H e somatomedinas atuam diretjs mente sobre o hipotfilamo. cuja secr£ ção é diretamente controlada pelo GK. têm peso mole cuiar de 7.000 daltons). Esta característica per_ mite que os níveis séricos de somatomedina C (SmC). •gentes estimilador e inibidor da secreçio h1pof1sir1a de GH.11 "1n vitro" tenhas demonstrado UM possível efeito estimuiatõrio direto do 6H sobre r crescimento longitudinal dos ossos (34). As somatomedinas também agem ao nível da h1p6- . Através de mecanismo de "feedback" negativo. dencainados "insulin-like growth factors" I (somatomedina C) e II. Circulam no sangue ligadas a proteínas carregadoras de alto peso molecular (145. respectivamente.500 daitons (57). São sintetizadas principalmente no ffgado e sua ação sobre o crescimento somático consiste em promove** a mitogenese e estimular a síntese de colãgeno e proteoglican. formando complexos proteicos que as protegem contra a proteõlise e as conferem mela vida maior e flutuação sangüínea menor do que •s dos demais hormônios peptidicos. possam ser utilizados como índice de secreçio da somatotrofina (75)'.

A secreção de 6H é episódica. ciminuindo a resposta das células somatotrõficas ao 6RH (44). C O M 1 a 2 picos moderados ocorrendo 2 a 4 horas apôs as refeições. o seu d1agnÓ£ tico ê multo Importante. Mecanismos de controle neural exerce» importante ação sobre o hipotâlamo. por as con centrações sêricas deste hormônio situam-se em nível Inferior • 3. provocada por tumor produtor de 6H. já que se dispSe. sendo responsá- vel por menos de IX destes casos. Por outro lado. de .0 ng/ml. decorrente da defj_ ciência deste hormônio. conseqüentemente. 0 nanismo hipofisário corresponde a uma causa rara de retardo de crescimento em crianças. participando também d? regulação da secreção de GH.\2 fise. ou a acromegalia. atualmente. Distúrbios da secreção de 6H podem resultar em patologias tais como o nanismo hipofisário. Entretanto. de 6H (44) ao passo que o bloquei o dos receptores colinérgicos inibe esta resposta (13). A ativação dos receptores «-adrenérgicos e serotoninèrgicos centrais promove a liberação de 6RH e. Os valores máximos são detectados aproxi nadamente 1 hora após início do sono profundo (estádio III ou IV). a es timulação dos receptores e-adrenérgicos centrais provoca 1n^ biçSo da secreção de 6H (44). com picos Menores ocorrendo posteriormente durante as fases mais tardias do sono (9. Na maior part* do dia. caracterizada pulsos de duração limitada.12).

Estes também são necessários em crianças abaixo de 5 anos de Idade. o que pode ser ocasionado por outras doenças como desnutrição e hipotireoidismo. quando os níveis encontram-se diminuídos. testes provocativos de liberação de GH foram desenvolvidos.13 terapêutica adequada para esta doença. inferior a 3 desvios-padrões em relação de i média para sexo e idade (11). A dosagem sérica basal de GH não permite.na maioria das vezes. com o Intuito de se poder avaliar a reserva nenhum hipofisiria deste hormônio. Nio existe. como o GK extraído de hipófises humanas ou produzido por engenharia genética (12). teste que consistentemente promova uma resposta hormonal ade quada em todo paciente sem déficit de GH. o diagnóstico de déficit de GH precisa ser confirmado por estudos da secreção deste hormônio. praticamente excluindo a presença de nanismo hipofi sirio quando normal (75). Em crianças acima de 5 anos idade» a dosagem sérica de SmC corresponde a um bom teste de triagem. diferenciar entre crianças com e sem deficiência deste hormônio. Entretanto. Isto ocorre por- que os diversos estímulos agem ao nível do hipotllamo através . j£ que sua secreção ê episódica e mantêm co£ centrações séricas baixas durante a maior parte do dia (28). nas quais não ê possível uma boa discriminação entre valores normais e baixos de SmC (75). A possibilidade de déficit de GH deve ser considerada em todas as crianças que se apresentarem con baixa esta tura proporcionada. no entanto. Por este motivo.

14 de Mecanismos neurals monoaainérgicos. de baixo custo e se» efeitos colaterais. f - M . o efeito não é. o diagnóstico de nanismo hipofisário deve se basear na demonstração de resposta subnormal do 6H a pelo menos 2 testes provocativos (32). porisso. Modificando a secreçâo de SRH e/ou somatostatina. portanto. direto Por estas ra sobre as células somatotróficas hipofisárias. Os testes de estimulo pode* ser divididos em 2 gran des grupos (17): 1t) TESTES DE TRIAGEM Estes testes consiste» na dosage» do GH em una única amostra de sangue coletada 20 a 40 minutos apôs o inicio do exercido fisico ou 1 hora após o inicio do sono. 21) TE8TES DEFINITIVOS Estes testes Implicam na dosagem de 6H em amostras seriadas de sangue coletadas antes e após administração de -. só são utilizados a nível ambuiatoriai para excluir o diagnóstico de nanismo hipofisSrio em pacientes com baixa suspeita clinica desta patologia. zões. Ape sar de seren fisiológicos. apresentam u*a incidência relativamente alta (ao redor de 30X) de resultados falso-negativos (Indivíduos sem deficiência derte hormônio mas com resposta subnormal ao teste) e. convenientes.

35.0 ou 10 ng/ml). dependendo do nível de GH •cima do qual a resposta foi considerada normal (5.36. Em todos. Recentemente. Nos vários estudos prévios sobre o ITT (18.64. Apesar de apresentarem uma menor incidência de resultados falso-negativos (variável de 10 a 30%). já que o bloqueio destes receptores por drogas como a fentolamina inj^ be esta liberação (44).0. parece ser o mais eficiente no que refere i liberação de 6H.55. Acredita-se que a hipoglicemia promova a secreção de 6H por estimulação de receptores o-adrenérgicos centrais. nSo foi observada liberação de 6H nenhum paciente com deficiência deste hormônio. Entre os testes definitivos. São indica dos em pacientes com características clinicas de nanismo hipofisârio e/ou resposta subnormal triagem. embora associado ás conseqüências perigose a um teste de sas da hipoglicemia. foi Introduxida como novo agente capaz de estimular a secreçio . a clonidina.15 mi estimulo farmacolõgico como a insulina. a incidência de resultados falso-negativos variou de 8 a 265.72. por vezes severos e perigosos. todos estão associados a efeitos colaterais desagradáveis.59.69). sendo considerado por muitos autores o teste padrão C O R O qual os demais devem ser comparados (48). o teste de tolerância â insulina (ITT).77). 1-dnpa. argi nina ou glucagon.56. 7.20. um agonista o-adrenérem gico central utilizado como snt1-h1pertens1vo (37.

Outra evidência por da da ação a-adrenérgica central da clonidina foi relatada Ganong e col. Chambers e Brown comprovaram que a clonidina atua ao nível de receptores o-adrenêrgicos centrais. G1l-Ad e col. Gold e col.-adrenérgicos centrais. õpós transsecção •edula espinhal. com exceçSo de . os autores e oral demonstra- ram uma elevação significante da concentração de GH em todos os pacientes sem déficit deste hormônio. bloqueia o aumento da secreção de GH induzido pela clonidina. eu provavelmente se deve à estimulação de receptores a. (38) em 1975. Nos 7 pacientes com hipopUuitarismo. (22). nestes Mesmos animais. inicialmente demonstrada adultos normais por Lal e col. que a administração de piperoxane.5 ng/mi). que observaram que. não houve aumento estatisticamente signify i cante dos níveis de 6H (máximo de 2. um a-antagonista. em 1979. o uso da clonidina como agente liberador de GH para excluir o diagnóstico de nanismo hipofisário em crianças adolescentes com baixa estatura. Utilizando uma dose de 0. n3o tendo qualquer efeito sobre receptores dopaminérgicos ou serotoninérgicos. (26) demonstraram. Estudos mais recentes em animais indicaram a clonidina promove a liberação de GH por estimular neurônios hipotalãmicos secretores de GRH (44). a resposta do GH a esta droga permanecia que Inalterada. Em 1978. (23) foram os primeiros a descrever.15 mg/m* de superfície corpôrea. Esta ação da clonidina.16 de 6H. Em estudos realizados em macacos Rhesus (5 ).

associada a choque. que res a pondeu ã expansão de volume. os resultados obtidos no ITT foram equivalentes aos do teste da clonidina no que diz respeito i efi— ciência de liberação de GH.025 mg (41).23.39. alguns autores tentaram realizar o teste da clonidina com d£ ses menores e fixas tais como 0. Em todos estes estti dos.035 mg/m* (11). houve redução dos níveis pressôricos que variou de 15 a 25 mmHg para a sistól^ ca e de 10 a 15 mmHg para a diastólica.05 ou 0. havendo decréscimo de 5 a 15 wwHg . Com o objetivo de minimizar os efeitos colaterais.63.71) e arginina (71). Em todos os estudos realizados com esta dose (16. 0.30.15 mg/m* foi comparado com o ITT (16.15 «g/m*.15 mg/»* seja um excelente estimulador da secreção de GH. Embora a clonidina na dose de 0. levando os autores a chamar atenção para esta possível complicação do teste.n relato (47).5 ng/ml). sendo em todos obser vado um maior pico de liberação de 6H e uma menor incidência de resultados falso-negativos no primeiro teste.71).62. ela provoca sonolêrt cia e hipotensão moderadas. 1-dopa (62. o teste da clonidina rea Uzado com a dose de 0.1 mg (40) ou com a dose de 0. C O M provivel deficiência GH. foii observada hipotensão severa Em u. 39.17 1 (pico de 5. fora» observadas sonolência e hipotensio Multo mais d1s_ cretas do que com 0.66).66. Em apenas um trabalho (30). parcial de EM estudos Mais recentes.

na época da puberdade. Estas diferenças talvez possam ser explica das pelo fato de que. estes valores foram de 30. no primeiro trabalho (40). Sabe-se que. .6 + 1. Isto não foi ainda. Utilizando 0. (40) obtiveram picos de GH de 11. (41) com a dose 0.8 ng/ml _ e de 8. a um consenso geral sobre qual a dose de clonidina a ser utilizada nos testes provocativos. estudou-se um grupo misto constituído por crianças e adolescentes.6 + 8. _ enquanto que. devido ao aumento da do secreção de testosterona e estradiol (19). demonstrado para o teste da clonidina. a dose mínima que promova uma estimuiaçao eficiente da secreçSo de 6H associada a uma baixa Incidência de efeitos colaterais.18 na pressão sistôlica e de 2 a 7 mmHg na diastólica. ou seja. os resultados no que diz respeito ã eficiência de liberação de GH foram muito discrepantes e não relacionados magnitude da dose. à Lanes e coi. t mister.6 ng/ml {média _ + erro padrão da média) e resultados falso-negativos de 361. que outros estudos sejam realizados para esclarecer esta dúvida. ao passo que. apenas pacientes pré-púberes foram avaliados.050 ng de clonidina. portanto. NSo se chegou. Entre- tanto.3X. no e£ tanto. jã que ele nujn ca foi avaliado em grupo constituído apenas por pacientes p£ beres. ainda. no segundo (41).025 mg. respectivamente. a r e s posta do GH aos estímulos provocativos clássicos é maior que a observada na infância. no estudo de Laron e col.

IV - OBJETIVOS .

20 Comparar o teste da clonidina realizado com a admi nistração oral de uma dose de 0. Incidência de efeitos colaterais indesejáveis. .0375 mg/m* de superfície cor pórea com o teste de tolerância â insulina em grupos de entes pré-púberes e púberes no que diz respeito 2: Is) 28) Eficiência de liberação de GH.

n? EKERCA Í:I. ..V - CASUÍSTICA ••: MAC-:: . N./S? : : .\ E.CLEA?..

statada uma estatura abaixo da média para sexo e idade.5 desvios-padrões (DP). sendo 22 do sexo majs culino e 9 do sexo feminino. com Idade entre 2.5 anos. compietando-se a investigação diagnostica em um período máximo de 4 meses. . laboni torial e radiolõgica realizada neste período. Em todos.3 e 8. foi ccr. que procuraram o Serviço de Éndocrinologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC-FMUSP) com queixa de déficit de crescimento. Dezenove pacientes que se apresentaram com forte suspeita clinica de déficit de GH foram Internados por aproximadamente 5 dias na enfermaria da Divisão de Clinica Médica I do HC-FMU3P.9 e 17.Foram estudados 31 pacientes. Os outros 12 pacientes foram estudados a nível ambulatorial. sendo toda a avaliação clinica. variando entre 1.

VI - MATERIAL E MÉTODOS .

peso. sonolència e intolerância ao frio. Os graus de pubarca e teiarca foram clas- sificados de acordo com os parâmetros de Tanner (46). as te.2. convulsões.relação púbis-vértex/púbis-chão. tosse. distúrbios neurológicos. potássio. dosagens séricas de sódio. uréia. desenvolvimento mamãrio. cianose. alterações visuais. hematúria. f) exame ffsico: altura (média de 3 medidas feitas por UM único médico era estadiôraetro construído de acordo con as recomendações de Underwood e Van Hyk (74)). 1. . giicemia de jejum. presença de estigmas somáticos. de hipotireoidismo. as quais avaliados foram e utilizadas para o calculo dos respectivos desvios-padrões idade estatura!. anormalidades cardio- -respiratórias e gastrointestinais. edema. poliúria. dores ôsteo-articulares. cllcio. nictúria. dispnéia. diarréia. de Cushing ou de déficit de 6H. creatinina. (45). tamanho de pènis e testículos. A estatura e o peso dos pacientes foram segundo as tabelas de Marques e coi. albumina. AVALIAÇÃO LABORATORIAL E RADIOLÕGICA GERAL Os exames laboratoriais gerais Incluíram hemograma completo. polidipsia. presença de pelos axilares e pu bianos. verminose. proteínas totais. disúria. desmaios. fraqueza Muscular.25 sença de cefalêia. sinais de raquitismo. caimbras.iia.

U a paciente foi submetida a m tomografia computadorizada de crinio. AVALIAÇÃO HORMONAL BASAL Dosagens séricas basais de somatomedina C (SmC). For»» também realizados Rx e de tõrax.4.) em meninas foram realizadas em todos os pacientes. deixado em repouso por 3 horas a . TESTES FARMACOLÓGICOS DE ESTÍMULO Todos os testes Mveram início is 8:00 horas da »£ nhi. parasitolõgico de fezes e eventualmente cariôtipo. 1. com o paciente repousando em decúbito dorsal por pelo menos 1 hora e em jejum por um período mínimo de 8 horas. Rx de crânio para visualização da sela türcica Rx de *5os e punhos para avaliação da idade õssea conforme o Atlas de Greulich & Pyie (29). Amostras seriadas de sangue foram coletadas através de veia canuiada com "butterfly"» mantida com solução fisiológica 0. 0 sangue para dosagen5 hormonais foi colocado •m tubo de vidro simples. tiroxina (T.91. te£ tosterona (T) em meninos e estradiol (E.26 fósforo. 1. fosfatase alcalina. triiodotironina (T ) .3. sendo a punçlo realizada pelo menos 60 minutos antes da primeira coleta. urin» tipo 1 . Niveis sêricos basais de hormônio luteinizante (LH) e hormônio foiiculo-estimulante (FSH) foram determinados apenas nas meninas púberes.). tireotrofina (TSH).

MG) na dose de 0. glicernia e cortisol (este último determinado apenas em pacientes com sus peita clinica de panhipopituitarismo) foram coletadas nos tem pos de .temperatura ambiente para que houvesse retração do coágulo e. 45. . A coleta de glicemia durante o teste de tolerância i insulina foi realizada em tubos contendo fluoreto de sódio.30. 0.1 U/kg de peso.. Montes Claros.A. a seguir. 15. Foram ntonitorizados sintomas e sinais de hipoglicemia durante todo o teste. sendo realizada. 0 soro foi então separado. os quais foram encaminhados ao laboratório Imediatamente após o término do teste. 60 e 90 minutos. no tempo zero. a administração endovenosa em bolo de insulina simples (U-40 Biobrãs . a) TESTE DE . centrifugado a 1000 rpm por 10 minutos. 30.OLERÂNCIA À INSULINA (ITT) Amostras de sangue para dosagem de GH. tendo-se sempre 3 disposição solução de glicose h1 per tônica a 50X (20 m U a qual era sistematicamente Injetada por via endovenosa no final do teste ou durante este se ocorresse perda de consciên cia.Bioquímica do Brasil S. aliquotado em volumes de 1 a 2 ml e congelado a -20°C até a hora do ensaio.

1 mg (Atensina 0. Seguiu-se lavagem da seringa com ãgua por 2 vezes para remoçio de possíveis resíduos da droga retidos nas paredes de plástico. 60. c) TE8TE DO HORMÔNIO LZBERADOR DO TSH (TRH) ASSOCIADO AO TESTE DO HORMÔNIO LIBERADOR DAS GONADOTROFINAS (LHRH) Amostras de sangue para dosagem de LH. Medidas do pulso e pressão arterial foram realizadas em cada tempo do teste. 90 e 120 minutos.1 mg. a adminis— . na dose de 0. no tempo zero. De Angeli. sendo a igua aspirada e administrada ao paciente da mesma maneira que a solução de clonidina. TSH e proiactina (PRL) foram coletadas nos tempos de -30. 30. 0. solicitando-se ao paciente que succionasse e engolisse todo o liquido durante o pro cedimento. sendo a clonidina administrada por via oral. 15. 45 e 60 minutos. sendo também observados quaisquer outros efeitos colaterais. 0 volume correspondente è dose calcula da para cada paciente foi então aspirado em seringa de plástico e injetado diretamente na boca.01 mg/rol. 0. Itapecerica da Serra. 30.0375 mg/m* de superfície corpõrea.28 b) TESTE DA CLONIDINA Amostras de sangue para dosages de 6H foram coleta das nos tempos de -30. FSH. no tempo zero. sendo realizada. O comprimido de 0. SP) foi esmagado e dissolvido em 10 ml de ãgua resultando eu solução de 0.

2. SP). ao passo que o teste de do TRH associado ao LHRH só foi realizado naqueles com suspeita clinica de panhipopituitarisao. SP) associado na mesma seringa a 100 | g i de LHRH (Ayerst.ERC A r • ^ f ^ / s • : . um ensaio adequado is CC.5. de Todos os aspectos da técnica foram cuidadosamente analisados e coji troiados de modo a se obter.. prestou-se particular atenção ao ritmo de crescimento e início ou evolução do desenvolvimento puberal. Nestas consul^ tas.. Todos os pacientes fora» submetidos aos testes tolerância i insulina e clonidina.. . São Paulo. no final..1.V. METODOLOGIA LABORATORIAL 2.-:«'. DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS SÉRICOS DE 6H Todas as dosagens de 6H foram realizadas em triply cata por método de radioimunoensaio (RIE) desenvolvido a pajr tir de reagentes Inteiramente preparados no Laboratório Pesquisas da Divisão de Clinica Médica I do HC-FMUSP. SEGUINENTO AHBULATORIAL Todos os pacientes foram avaliados em ambulatório a cada 3 meses por um período mínimo de 6 meses.• . ü E Ef. 1. São Paulo.tração endovenosa em bolo de ZOO ug de TRH (Escola Paulista de Medicina.

7 com HC1 concentrado (Fig. cujo pH foi ajustado a 8.5 (ajustado com NaOH) e submetido aos mesmos processos das etapas anteriores. filtrados em li de vidro e o pH re duzido a 6.. rehomogeneizado com 60 «1 de tam pão Tris-fosfato pH 9. Os sobrenadantes das frações foram combinados. realizada a 4*C assim como todas as demais etapas. (6) com pequenas modificações (53). gota a gota. foram conservadas a -20°C. foi segui da de homogenização em liqüidificador durante 3 minutos com 200 ml de tampão Tr1s-fosfato (50 mM Tris.000 g por 1 hora. 0 precipitado foi retomado. baseado no método de Chapman e col.30 finalidades deste projeto. Extração e purificação do GH-HC 0 6K utilizado na preparação de padrões p£ ra radiolodação e curva de deslocamento (a seguir designado GH-HC) foi extrafdo a partir de um lote de 100 hipófises con geladas. São Paulo. ]). coletadas durante autópsias de rotina pelo Serviço de Anatomia Patológica da FHUSP. 1 mH feniimetanossulfonilfluoreto).3 pela adiçlo de 4cIdo acético • 50X. 2. 0 homogeneizado foi colocado em agitador magnético (Fanem Ltda. 10 mM Na 2 HPO 4> 5 mM EDTA. SP) por 2 horas e depois centrifugado a 10. com agitação constante. envoltas individualmente em papel alumínio até o seu processamento. As hipófises.1. previamente obtidas de cadáveres humanos. A dissecção das glândulas. A suspensão foi então centrifugada .1.

5.31 HIPÓFISES DISSECADAS I HOMOGENEIZADOS EM TAMPÃO TRIS-HCL 5 0 mM pH 8.»*.S E PRL I PRECIPITADO p RETIRADO RESÍDUO DE ETANOL COM TAMPÃO TRIS-ACETATO 50mM pH 4 . 0 COM AC.. « „ « . 1 . «. lOmM No 2 HPO4 .« „ SOBRENADANTE E 1 l SOBRENADANTE RESÍDUO INSOLUVEL FILTRAÇÃO EM SEPHADEX G-IOO PROTEÍNAS DE ALTO PESO MOLECULAR P|CO ' h e H PIC0 DEh 6 H CROMATOGRAFIA EM DEAE CELULOSE GH ELUÍDO EM TAMPÃO ACETATO DE AMÕNJA 2 0 0 mM pH 8 . PRECIPITAÇÃO ISOELETRICA EM pH 4 . ACÉTICO A 5 0 % . 9 PRECIPITADO E DISSOLVIDO EM TAMPÃO TRIS-ACETATO 50mM pH 8. 3 I CONGELAÇÃO DO GH A .1 9 8 » C FIG. 9 REALIZADA EM ETANOL ( 1 = 7 ) u PRECIPITADO C COLETA .7 (CONTENDO 1. .0 mM FENILME TILSULFONILFLUORETO.5mM EDTA) SOBRENADANTE A r RESÍDUO A REEXTRAIDO SOBRENAOANTE B RESÍDUO B i n I COMBINAÇÃO SOBRENADANTE A + B PRECIPITAÇÃO EM pH 6 . FILTRADO E CONCENTRADO EM MILLIPORE SOBRENADANTE D COLETAM-SE AS 6 30PR0TEÍNAS ..ESQUEMA RESUMIDO DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO DO GH-HC .

gota a go ta. seguida de decantaçio do sobrenadante e ressuspensão do precipitado com 50 ai de tampão Tris-fos fato cujo pH foi ajustado a 6. TSH e lipotrofinas. A solução resultante repousou então por 12 horas antes de ser centrifugada a 15.. A eluição foi realizada com este Mesmo tampão (fluxo 75 ml/min) e o efluente da coluna monitorizado com . A fração sobrenadante foi aplicada a uma coluna (5 x 100 cm) de Sephadex 6.000 g por 1 hora.000 g por 1 hora e o precipitado dissolvido em 500 ml de tampão Tris-acetato 50 mN pH 8.32 por 18 horas a 8.9 pela adição seqüencial. üpsalla. Suécia). cujo pH foi ajustado a 4.9 com HC1 concentrado contendo etanol 12. A fração sobrenadante foi decantada e separada para eventual extração de LH. previamente equi. A solução resultante foi filtrada e concentrada utilizando-se Membrana de Millipore 10 K a um volume de 90 ml.5%.000 g. A suspensão foi então centrifugada a 15.000 g por 1 hor?.000 g por 1 hora.100 (PharMacia Fine Chemicals.021. Esta fração homogeneizada foi adicionada ao sobrenadante anterior e centrifugada a 8. o qual foi centrifugado a 15. FSH. 0 pH do sobrenadante foi reduzido a 4. que continha o 6H. coa agitação constante.5. foi lava do C O M 50 ml de tampão Tris-fosfato. de icido acêtico a 50X e etanol absoluto (volume 1:7). librada com tampão Tris-acetato 50 mM pH 8.3 con HC1 concentrado. 0 precipitado.5 contendo ciortw tanol 0. sendo o precipitado separado para eventual extração da prolactina.

mantendo-se o mesmo volume e monitorizando-se o efluente com absorbãncia a 280 nm (Fig. NJ.15 mg/ml.46 mg/ml. obtendo-se em média um de 1. 0 conteúdo de uma destas alíquotas foi sub metido a testes de controle de qualidade que consistiram em: a) determinação da concentração de proteínas pelo método de Schacterie & Pollack (68).5 (fluxo 80 ml/hora) em um gradiente crescente de concentração até 200 mM.200. a coluna foi lavada com 350 ml de tampão acetato de amônio 50 mM pH 8.000 em tampão de ensaio) como amostras desconhecidas e obtendo-se em média um valor de 1. c) estimativa da atividade biológica do GH-HC por método de . a em sua fração central (8 ml) foi coletada em frasco imerso gelo seco. CA. aliquotada em volumes de 0.000 até valor 1/3. preequilibra da com tampão acetato de amorno 0.33 absorb&ncia a 280 nm (Fig. b) quantificação do GH-HC por "kit" comercial de RIE (Diagnostic Products Corporation.05 M pH 8. EUA). 2A).1 ml e congelada em ni trogênio líquido (-198°C). utilizando-se 6 diluições progressivas (1/200. 2B).3. Quando o GH nonõnero começou a ser eluido.c 52 (Whatman. EUA). Quando o pico principal do GH começou a ser eluido. Apôs receber o 6H. o efluente da coluna de Sephadex foi conectado diretamente a outra coluna (2 x 60 cm) de dietilaminoetil ce lulose DEAE . Clifton. Los Angeles.

200 2000 VOLUME (ml) VOLUME (ml) FIG. 2 .IOO(A) E EM D E A E .34 ABSORBANCIA ABSORBANCIA Inn) 100 • 90 60 70 60 50 : 40 30 20 10 (nm) t \ \ / \ MONO MERO 100 »0 80 FRAÇÃO CENTRAL COLETADA r~i í\ 1\ / \A 70 60 50 • 40 30 20 • 10 IDÍMERoA U 7\ 1000 (A) ^ V y J / ^V 100 (B) \ x.CR0MAT06RAFIA DO GH-HCEM SEPHADEX G. .c 52 ( B).

EUA): TSH < 3 uUI/ral. St Louis. cujo re sultado foi de 2. FSH * 82 mUI/mg e LH = 641 mUI/mg. a qual demonstrou ter o GH-HC padrão de isohormônios com predominância forma fl semelhante ao do GH-NIH. MD.1% (a seguir designa do tamplo de ensaio).35 radiorreceptor em fígado de mulher grávida (10). PRL = 3 ng/mg.5 com albumina séHca bovina (BSA. EUA (GH-NIH) por ele troforese em gel de poliacrilamida (8). Neste perfodo. Estes foram no mes. e) determinação da contaminação por outros hormônios hipofi sérios através de "kits" comerciais de RIE (Clinical Assays. d) comparação do GH-HC com padrão fornecido pelo National Institutes of Health. EUA) e azida sôdica 0. uma alíquota foi descongelada e utilizada para: a) preparação de padrões para radioiodação contendo 5 ug de GH em 50 ul de tampão fosfato (TF) 0. b) preparação de padrões para curva de deslocamento contendo 1 ug de GH em da 1 ml de tampão borato (TB) 0. MA.1 U/ml. Cambridge. . MD.1 M pH 8. Sygma Chemical Company. mo dia utilizados para marcação e a seguir desprezados. Estes foram aliquotados em volumes de 0. Bethesda.5 ml e congelados a -20*C por 30 dias.4 preparado com fosfato de potássio monobásico. 0 GH-HC foi conservado em nitrogênio liqui do por um período de 9 meses. A cada 45 dias aproximadamente.2 M pH 7.

Inglaterra). em tubo de vidro 12 x 60 mm.4.2 ml de solução de lodeto de sódio (10 mg/ml em TF 0.2 M pH 7. Rio de Janeiro. 2. 20 e 40 ng/ml de GH "frio" em tampão de en saio.. Procedeu-se então a nova agitação suave por 10 segundos antes da adição de 0.5. A eficiência de radioiodação foi determine da de maneira grosseira pelo denominado teste do carvão.0.A.36 uma alíquota foi descongelada na hora de cada ensaio utilizada para a preparação de soluções contendo e 1.2 M pH 7. 2.4 ml de tampão e . no qual 1 ul do material radioiodado.diluído em 2. Radioiodação do GH-HC A radioiodação do GH-HC foi realizada de acordo com o método clássico de Greenwood e Hunter (27) com apenas algumas modificações (51).0 mg/ml em TF 0. 50 ul do padrão para radioiodação (preparado no mesmo dia) 125 contendo 5 ug de GH-HC. 10.4) homogenização final da mistura. Buckinghamshire. Após homogenização. RJ) contendo 1.4 mg/ml em TF 0.e 1 mC1 de I sob a forma de lodeto de sódio livre de carreador (Amersham International plc. com no mínimo 100 mC1/ml. foram pipetados 20 ul de solução de cloramina T (Merck S.4.2 M pH 7. sendo todas desprezadas apôs o término do RIE. Em cada processo de marca ção.2.1. seguidos de agitação suave por 10 segundos e adi^ ção de 20 pi de solução de metabissulfito de sódio (Merck) contendo 2.25. 5. adidonaram-se seqüencialmente.

75 zada em coluna de vidro (1 x 55 cm) contendo Sephadex (Pharmacia) deareada e previamente equilibrada com TB 0. Todo o conteúdo do tubo de radioiodação foi colocado no topo da coluna e.foi adicionado em duplicata a 0.05 M pH8. CA. foram adicionados 0. LKB.5 ml/minuto.05 H pH 6..1%. Suécia) em 80 tubos de vidro (15 x 100 mm) contendo 0. Apôs horaogenização em "Vôrtex" e centrifugação por 15 minutos a 1000 rpm.1 N pH 8. sendo os primeiros 6 ml do eluTdo desprezados. com fluxo de 0. Irvine.1 ml de solução de .1% e azida sódica 0.5 ml de suspensão de carvão (carvão Merck a 100 mg/ml em TB 0.5).1%. Beckman Instruments Inc. 0 restante foi coletado em alíquotas de 1 ml a cada 2 minutos (2070 Ultrorac II. a eluição foi iniciada com TB 0. o teste do carvão de permitiu também escolher o material com maior eficiência marcação.6 com BSA 0.37 de ensaio. 2 alíquotas do mesmo padrão de GH-HC foram si multaneamente submetidas a radioiodação.6 com BSA 0. EUA). em cada processo. o sobrenadante foi separado do precipitado por decantação e a radioatividade de ambos determinada em contador de cintilação de poço (Gamma 4000. A cromatografia do GH-HC - I foi realiG. o qual foi em seguida submetido a purificação. Considerou-se uma boa eficiência de marca ção quando 60X ou mais da radioatividade total encontrava-se no precipitado (correspondente ao GH-HC 1 25 I). logo após sua penetração no Sephadex.1* e azida sõdica 0. Como.3 ml de solução de lodeto de sódio (10 mg/ml). Bromma. A seguir.

05 M) pH 8.125 I p u j rificado consistiu em: *) DETERMINAÇÃO DO GRAU DE CONTAMINAÇÃO POR TESTE DO CARVÃO 1 25 I LIVRE PELO Este teste foi realizado da mesma maneira que antes da cromatografia. 3 ml de GH-HC . Os conteúdos dos tubos que acusaram as 3 maiores ati vidcdes no primeiro pico foram misturados de modo a se obter.1X. só que agora adicionando-se 10 ul de GH-HC . 3 ) .1 ml e congelado a -20°C por um período de 30 dias. a seguir. no final. 2 picos foram constatados: pondendo ao 6H-HC o primeiro corres I livre.6 con azida sódica 0. A radioatividade dos 80 tubos foi determinada por contagem de 10 | l do conteúdo de cada tubo em dete£ i tor de cintilação gama. Este foi. I integro e o segundo ao Praticamente não foi observado pico de agregados do hormônio Marcado.1 2 5 I integro. 0 controle de qualidade do GH-HC . Apôs construção do gráfico expressando a distribuição da radioatividade ao longo do volume eluído (Fig. a porcentagem de radioatividade total 125 presente no sobrenadante (correspondente ao I livre) deve ria s1tuar-se abaixo de 20X (51). .Í 2 5 I diluídos em 2.4 ml de tampão de ensaio ã suspensão de carvão.38 BSA 21 em TB 0. Para que o hormônio marcado fosse conside_ rado de boa qualidade. aliquotado em volumes de 0.

I 2 5 I EM SEPHADEX G.39 CP» .I 2 5 I ÍNTEGRO 60 60 VOLUME (ml ) FIG.H C . .H C .75. 3-CROMATOGRAFIA DO G H . (XIO3) G H .

o foi grau de ligação máxima do hormônio mar ado ao anticorpo determinado pela razão (radioatividade do precipitado/radio^ tividade total x 100).0 ml de solução de polietilenoglicol a 17X (PEG S000. 0 método de separação do complexo antfgeno -anticorpo do antfgeno livre.consistiu na adição de 1.49. pre parada em tampão de ensaio sem BSA e conservada a 4°C. (1) (2) anti-soro 72 (100 ul de solu (3) GH-KC 1Z5 ção 1/1000 em tampão de ensaio). em triplicata. em triplicata.40 b) AVALIAÇÃO DA IMUNORREATIVIOADE MAXIMA DO GH-HC PELA ADIÇÃO DE EXCESSO DE ANTICORPO 125 I Os seguintes reagentes foram incubados. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) concentrações crescentes de hormônio marcado (100 ul de solu_ çôes 1/100. 1/75. Após contagem do precipitado. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: tampão de ensaio (100 pi).05) 125 I PELO Os seguintes reagentes foram Incubados. I (100 pi de solução 1/200 em tampão de ensaio). devendo situar-se acima de 80% que o GH-HC 125 I fosse considerado de boa qualidade.utilizado neste co«o em todos os demais ensaios deste projeto. 1/50 e 1/25 em tampão de ensaio. Se- guiu-se a centrifugação a 3000 rpm por 30 minutos a 4*C e de cantação do sobrenadante. cujas &ti_ . Sygma). para C) ESTIMATIVA DA ATIVIDADE ESPECÍFICA DO GH-HC MÉTODO DO AUTODESLOCAMENTO (25.

41 vidades foram previamente determinadas. tubo amostra Bi (ou Bn) . (2) anti-soro 72 (100 pi de solução 1/90. 20 e 40 ng/ml em tampão de ensaio). Todos os tubos foram contados antes e apôs precipitação com PEG para determinação da radioatividade total e do precipitado.000 em (3) GH-HC 125 tampão de ensaio).5. NSB * radioatividade do precipitado correspondente ao NSB. foi calculada para cada padrão de GH "frio" e amostra desconhecida pela equação: B T onde: Bi (ou Bn) * radioatividade do precipitado correspondente ao padrão 1 ng/ml de GH "frio" (Bi) ou & desconhecida n (Bn). T * radioatividade total.25.NSB T x 100 . I (100 | l de solução 1/200 i apenas para em tampão de ensaio). Em 3 tubos (N5B). a seguir denominadas amostras desconhecidas) e de hormônio "frio" (100 pi de solu ções contendo 0. 10. respectivamente. 1. 4. A seguir. 2. a razão ra dioatividade ligada/radioatividade total (B/T). incubou-se tampão de ensaio (200 pi) e hormônio marcado (100 pi) determinação da ligação inespecffica. utilizada p^ ra construção da curva dose-resposta da Fig. 5.0.

CAlCULO DA MASSA DE GH-HC J 2 5 I PRESENTE EM UMA AMOSTRA DESCONHECIDA PELA TÉCNICA DO AUTO-DESLOCAMENTO.I 2 5 I PRESENTE NA AMOSTRA DESCONHECIDA 1.25 2.CONCENTRAÇÃO DEGH-HC.0 10 20 40 LOG [ 6 H ] (ng/ml) FIG. . 4 .5 5.

dessa Maneira.foi entio determinada por interpolação de suas respectivas razões B/T a partir da curva dose-resposta. sua «assa. Apôs separação com PEG e contagem do precj^ pitado. presente nas diferentes amostras desconhecidas.1 2 5 ! 4°C E A -20»C CONSERVADO A Os seguintes reagentes foram incubados. correspondente ao tubo Bo) ou tampão de ensaio (100 pi.43 A concentração do hormônio Marcado e. 5. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) tampão de ensaio (100 ul). inespe cffica (XHSB) e especifica (XBo especifica) foram calculadas pelas equações: . d) DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE DO GH-HC. correspondente ao tubo NSB). conseqüentemente.000. (2) anti-soro 72 (100 ul de s o U ção 1/90. em triplicate. Foi possível. (3) GH-HC-125I (100 ul de solução 1/200). a partir do qual a atividade especifica foi calculada pela reciproca da inclinação da reta obtida por regressão linear simples. as porcentagens de ligação total (XBo total). correlacionar a massa e atividade do traçador presente em cada amostra e construir o grafico da Fig.

985 • / 6. 5 -RELAÇÃO ENTRE A ATIVIDADE DE UMA AMOSTRA DE G H .0 2.0 y^ r ATIVIDADE ESPECÍFICA» — • i i i V 1 ».0 10 ATIVIDADE DO TRAÇADOR (jiCi. 2.0 8.H C . .0 r« 0.0 4#0 6.MASSA DO TRAÇADOR 8.I 2 5 I E SUA RESPECTIVA MASSA DETERMINADA PELA TÉCNICA DO AUTODESLOCAMENTO.0 4.10'2) FIG.

por esta razão.IB o total . (3) GH-HC.000). «) COMPARAÇÃO DO GH-HC - 12 *I COM GH-NIH - 125 I (PREPARAÇÃO PARA RADIOIODAÇAO FORNECIDA PELO NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH E MARCADA NO HC-FMUSP) 0s seguintes reagentes foram Incubados» em triplicate.XNSB Medidas seriadas ao longo de 30 dias após radiolodação (Fig. sendo esta redu Ção U M pouco «ais acentuada a 4*C do que a -20"C. 6) revelara» uma redução lenta e discreta dos 3 parâmetros ao longo de todo o período. Estes dados demonstrara* uaa aaior perda de Imunorreatividade do h o m ô nio «arcado a 4*C e. as alíquotas de 6H-HCI conservadas a -20*C passara* a ser descongeladas e diluídas apenas na hora do ensaio.125 I . (2) anti-soro 72 (100 ui de solução 1/90. sendo desprezadas após o término deste. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) padrões de GH "frio" (100 pi de soluções contendo desde 0 até 40 ng/»l>.4$ radioatividade do precipitado do tubo Bo XBo total « radioatividade total x 100 radioatividade do precipitado do tubo RSB MSB = x 100 radioatividade total « o específica .

80 46 60 4O 20 10 15 20 25 30 DIAS PO'S RADIOIODAÇAO DO GH-H( (A) %DE LI6.LI6. 6 .2 0 * C ( B ). éo 60 40 20 5 10 15 (B) 20 25 30 DIAS POS RADIOIODAÇAO DO GH-HC FIG. INESPECÍFICA ( • ) E ESPECÍFICA ( â ) AO LONGO DE 3 0 DIAS APÔS RADIOIODAÇAO DO GH-HC COM ESTE CONSERVADO A 4 * C ( A ) OU A .VARIAÇÃO DA PORCENTAGEM DE LIGAÇÃO TOTAL ( • ) . .

GH-HC 125 I Não houve deterioração significante de n<e nhum destes parâmetros ao longo dos 9 meses. 7 ) . Produção de anti-soro anti-GH A técnica de Imunização empregada para a produção de anti-soro anti-GH baseou-se primariamente no método de Va1tukat1s e coi. o grau de contaminação com 125 I entre 4 e 15%. (76). Em dois. as curvas dose-resposta para cada hormônio marcado fo ram elaboradas e comparadas entre si (Fig. .3. a eficiência de marcação situou-se entre 64 e 71%. um a cada 45 dias aproximada mente. Em 3 tubos (NSBX incubou-se apenas tampão de ensaio (200 pi) e hormônio sarca do (100 |il). demonstrando a boa qualidade do para fins de RIE. a imunorreativj^ dade máxima entre 82 e 94% e a atividade específica entre 124 e 157 uCi/ug. 2. Nos outros 6 pro cessos. a eficiência de marcação determinada pelo teste do carvão foi inferior a 501 e. Apôs separação com PEG e contagem do preci pitado. 0 paralelismo observado entre elas confirmou o comportamento do GH-HC 1Z5 idêntico I em relação ao GH-HIH .1 2 5 I . Oito processos de radioiodação foram reali zados em um período de 9 meses. Indicando ser o nitrogênio liquido eficiente meio de conservação para o GH-HC.47 OU GH-NIH - I (100 pi de solução 1/200). o material rja dioiodado não foi submetido a purificação.1. porisso.

7 .25 2.48 L06IT0 B/Bo (%) 80 50 20 1. .0 10 20 40 LOG [GH] (ng/ml) FIG.RESPOSTA PREPARADAS COM GH -HC -'25l ( • .5 5.* J E GH-NIN-125! (A-*).COMPARAÇÃO ENTRE CURVAS DOSE .

emulsão contendo 3 mg de GH (Kabi Diagnostica. correspondendo a 0. Apôs a quarta imunização de um dos animais. cujas excelen- tes características foram demonstradas pelos testes de c o n trole de qualidade. 3 coelhos da Nova Zelândia (idade média de 3 meses) foram imunizados. seguida de homogenizaçao em Vórtex e repouso por 24 horas a 4°C para confirmar a não separação das partes.1 ml da emu1 são em diferentes pontos do dorso. cada animal recebendo 30 aplicações intradérmicas de 0. sõ que com emu Isão preparada com adjuvante incompleto Freund.49 Preparou-se.6 mg de 6H. Procedeu-se entco 3 titulação do anti- -soro para se determinar a necessidade ou nãu de novas 1munj[ zações. Após raspagem dos pelos do dorso.inicialmente. Suécia). Estes consistiram em: a) DETERMINAÇÃO DO TÍTULO. 0 sangue coletado foi deixado em repouso a 4°C por 48 a 72 horas para que houvesse retração do coágulo. Estocolmo. A cada 3 semanas. 9 ml de so lução salina e 6 ml de adjuvante completo de Freund. foi realizada nova imunização nas mesmas condições que a primeira. O QUAL FOI DEFINIDO COMO A DILUI . seguido de separação do soro e diluição do mesmo com tampão de ensaio na proporção de 1:1. foi finalmente obtido um anti-soro (anti-soro 72). Amostras de sangue foram colhidas através de da punçSo da veia central da orelha 10 dias após cada Imunização.

ou 1/640. Em 3 tubos (NSB). Incubou-se apenas tampão de ensaio (200 pi) e hormônio marcado (100 ul). 8.000) (2) anti-soro 72 (100 ul de so 125 e (3) GH-HC I (100 ul de soluçlo 1/200). Apôs separação com PEG e contagem do precj^ pitado. Em 3 tubos. 0 titulo do anti-soro 72 foi então determinado pela diluição final correspondente a 501 de ligação especifica. (1) (2) diluições progressivas do anti-soro 72 (100 pi de solução 1/30.50 ÇÃO FINAL DO ANTI-SORO CAPAZ DE LIGAR BOX DO (54) HORMÔNIO MARCADO EM CONDIÇÕES PRÉ-ESTABELECIDAS Os seguintes reagentes foram incubados. seja. incubou-se apenas tampão de ensaio (200 ul) hormônio marcado (100 pi). luçío 1/90.000. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: tampão de ensaio (100 ul). (3) GH-HC I (100 ul de solução 1/200). por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) concentrações crescentes de GH "frio" (100 pi de soluções cojt tendo desde 0 até 40 ng/mi).920. os valores da %Bo especifica para cada diluição do e anti-soro foram calculados e expressos no gráfico da Fig.000 em 125 tampão de ensaio). em triplicate. b) CÁLCULO DA CONSTANTE DE AFINIDADE (K) PELO MÉTODO DE SCATCHARD (67) Os seguintes reagentes foram Incubados. .000 até 1/1. em triplicata.

8-CURVA DE TITULAÇÃO DO ANTI-SORO 72. .51 % DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA 70 30 20 10 TITULO DO ANTI-SORO O o o 6 C D — o o _O d fO o o o o o o d ~d C M — O O O -d CD o o o -d C O oi DILUIÇÃO FINAL DO ANTI-SORO (LOG) FIG.

Fig. 9 ) . IO 1 0 l/mole) foi determinado pela inclinação da obtida por regressão linear simples. respectivamente. T ' radioatividade total. NSB = radioatividade do precipitado correspondente ao tubo NSB.1 . • A partir do grafico relacionando estes parâmetros (grafico de Scatchard.NSB) IT . de 2 K reta .(Bi-NSB)] (Bi-NSB) b » concentração de GH "frio" x onde: Bi * radioatividade do precipitado correspondente â concentração 1 ng/ml de GH "frio".52 Todos os tubos fora» contados antes e após precipitação com PEG para determinação da radioatividade total e do precipitado. Os parâmetros radioatividade ligada/radioatividade livre (B/F) e concentração de hormônio ligado ao anticorpo (b) forem calculados para ca da padrão de 6H "frio" pelas equações: B F (Bi . o valor (2.

0 0.0 1.IO* 12 ) FIG.5 25 50 75 100 b(Mol/I. .985 1. 9 .DETERMINAÇÃO DA CONSTANTE DE AFINIDADE ( K ) PELO GRA'FICO DE SCATCHARD.5 r= 0.S3 B/F 2.

NSB « radioatividade do precipitado correspondente ao tubo NSB.1 2 5 I (100 ul de solução 1/200) e hormônio (100 ul). HPL (até 10.000 ng/ml cada um).i) «arcado 6H-HC . e» triplicate. FSH. PRL E HORMÔNIO LACTOGÊNICO PLACEN TÂRIO (HPL) FORNECIDOS PELO NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH (PREPARAÇÕES PARA RADIOIODAÇÃO) Os seguintes reagentes foram incubados. TSH.54 c) DETERMINAÇÃO DA IMUNORREATIVIOADE CRUZADA COM PADRÕES PUROS DE LH. (2) anti-soro 72 (100 ul de solução 1/90. TSH (até 2500 ng/ml). por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) concentrações crescentes de hormônio "frio" em tampão de ensaio (100 ui) tais como 6H (0 até 40 ng/mi). Após separação com PEG e contagem do preci^ pitado. Bo * radioatividade do precipitado correspondente i concentração zero. FSH e PRL (até 2.000 ng/ml) e LH.000) e '. . o grau de inibição da ligação maxima (B/Bo) foi d e terminado para cada hormônio pela equação: B — « (Bi-NSB) r x 100 Be (Bo-NSB) onde: BI • radioatividade do precipitado correspondente i concentração 1 ng/ml de hormônio "frio".

10).0.6*. permitindo que ele fosse utilizado em todos os ensaios deste projeto.1 ml foram liofilizadas e pos teriormente conservadas a -20°C.3X. uma foi re constituída e diluída 1/10 em tampão de ensaio. descrita em 1971 por Desbuquois e Aurbach (14). FSH < 0. resultando em diminuição da solubilidade e precipitação .4. conservadas a 4°C e utilizadas nos ensaios durante este período. 2. Método de separação do complexo antígeno-anticorpo do antigeno livre A separação do complexo antígeno-anticorpo do antigeno livre foi realizada pela técnica do polietilenoglicol. B/Bo * 50X (Fig. A partir destas últimas alíquotas. Os seguintes valores foram encontrados: LH < 0. As características do anti-soro 72. comparáveis âs descritas na literatura para anticorpos anti-GH de comprovada eficácia (50). Este agente provoca a redução da quantidade de Sgua livre do sistema. Alíquotas de 0. soluções 1/90. HPL < 0. realiquotada eu volumes de 0.1.000 em tampão de ensaio foram preparadas a cada 30 dias. A cada 6 meses. ou seja.U. confirmaram a sua excelente qualidade.3t. PRL .55 A porcentagem de imunorreatividade cruzada do anti-soro 72 para cada hormônio foi então determinada pela razão entre a concentração de 6H "frio" e a do hormônio estu dado necessárias para provocar 50% de inibicão ( 2 ) .3X.1 ml e recongelada a -20°C. TSH < 0.

. CRUZADA Ill4ng/ml X 100 .0 10 20 40 250 500 1000 2000 LOG [ H ] (ng/m.imunuirnc Ml IVIUAUt .0.5 5.25 2.DETERMINAÇÃO DO 6RAU OE IMUNORREATIVIDADI CRUZADA DO ANTI-S0R0 72 COM A PRL.6 % LOG 1 TO B/Bo(%) PRL 20 1. 1 0 .) FIG.

(3) GH-HC . Inespecífica e especifica foram determinadas para cada concentração de PEG e expressas . citado como a prin^ cipai desvantagem deste método. correspondente tubo NS6).0 ml do mesmo imediatamente apôs adição soro humano (100 ul). o PEG foi escolhido como método de separação. 0 grau re lativamente alto de ligação inespecífica. Uma vez contados os precipitados. Por estas razões. Suas principais vantagens consistem em ser um método simples e de baixo custo no caso do GH. dos seguintes reagentes: (1) tampão de ensaio (100 ul). promover a separação instantânea e e.57 do complexo antfgeno-anticorpo ( 7 ). quais exigem maior custo e complexicidade. como é o caso do RIE de senvolvido neste projeto.000. (2) anti-soro 72 (100 ul de solução 1/90. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente. as porcentagens de ligação total. ao invés de técnicas mais so fisticadas tais como precipitação com segundo anticorpo. eficiente do complexo antigeno-anticorpo do antígeno livre. A concentração de PEG a ser adicionada ao as ensaio foi determinada por experimento que consistiu na incu bação em triplicata. não parece comprometer signi ficantemente a precisão de ensaios em que a capacidade de li gação total é maior do que 50X ( 7 ). de p1petando-se 1. precipitação foi realizada com diferentes concentrações nais de PEG (2 a 20%) diluído em tampão de ensaio sem ao A fiBSA. correspondente ao tubo Bo) ou tampão de ensaio (100 ul.1 2 5 I (100 ul de solução 1/200).

% DE LIGAÇÃO 60 50 40 30 20 10 4 8 12 16 20 CONCENTRAÇÃO FINAL DE PEG (%) FIG. II-VARIAÇÃO DA PORCENTAGEM DE LIGAÇÃO TOTAL ( • ) . INESPECÍFICA(o) E ESPECÍFICA ( â ) EM FUNÇÃO DA CONCENTRAÇÃO FINAL DE PEG. .

sifilis e Chagas) foi acrescentado ã mistura de incubação em volumes crescen— tes variando de 0 até 200 pi. de monstrando não haver vantagem alguma em se utilizar concen- trações muito maiores do que 10X. as porcentagens de ligação total. _.It).IX.. A Influência da concentração proteica do valor •elo sobre o grau de precipitação do complexo antigeno-anticorpo provocado pelo PEG foi estudada em ensaio no qual realizou-se incubação idêntica ã do experimento anterior. Na ausência de soro. _J.59 no gráfico da Fig. Estes dados demonstraram claramente a necessidade de uma concentra _. . imunologicamente negativo para hepatite B. ao i i passo que a XBo especifica permaneceu praticamente constante. Soro humano ("pool" com concentração proteica total = 7. sendo este utilizado em todos os ensaios deste projeto. o incremento da concentração de PEG acima de 10X resultou em aumentos muito pequenos da XBo espe cífica associados a elevações mais significativas da XNSB. Após contagem do precipitado.. inespecffica e especifica foram calculadas para cada volume de soro adicionado an tes do PEG e expressas no grafico da Fig. seguido da adição de 1.0 g/dl. Por esta razão.j. 12. 11.L- . Incrementos a partir deste volume resulta ram em aumentos progressivos da XBo total e XNSB. aumentando substancialmente após adição de 25 pi de soro.^ I ••! •• "I- • -*^ "• •*• "' ' I l— I .0 ml de PEG (concentração final 12. a concentração final de PEG foi fixada em 12. r . a precipitação do complexo antigeno-anticorpo com PEG foi multo pequena.

. E ESPECÍFICA ( â ) EM FUNÇÃO DO VOLUME DE SORO ADICIONADO IMEDIATAMENTE ANTES DO PEG (CONCENTRAÇÃO FINAL 12.30 20 10 50 100 150 200 VOLUME DE SORO ( j i l ) FIG. 12 .1%).VARIAÇÃO DA PORCENTAGEM DE LIGAÇÃO TOTAL ( • ) . INESPECÍFICA ( © ) .

des crito na Tabela I.2 «g/ml) para que a preci pitação do complexo antigeno-anticorpo pelo PEG fosse comple ta. sendo pipetados 100 ul de tampão de ensaio nos tubos correspondentes aos controles e amostras desconhecidas. antes do PEG.0 e 8. soro diluído em tampão de modo a completar volume de soro presente em cada tubo a 100 ul. seria adicionado.0 g/dl) nos tubos correspondentes â curva-padrão (diluída em tampão de ensaio). antes da precipitação com PEG. CONTROLES E AMOSTRAS Um padrão de GH contendo 1 ug/ml (preparado no dia da radioiodação) foi descongelado na hora do RIE e diluído progressivamente em tampão de ensaio até obtenção de . Com a finalidade de se igualar a concentra ção de proteínas séricas em todos os tubos de um determinado ensaio. o 2. Nos casos em que houvesse necessidade de diluir estas amostras com tampão de ensaio antes de sua dosagem. foi estc*>e1ecido que.61 çSo mini«a de proteínas séricas (1. envolveu o estudo de diversos fatores: • ) PREPARAÇÃO DOS PADRÕES DE 6H " F R I O " . Protocolo do RIE de GH A elaboração do protocolo do RIE de GH.5. seriam acrescentados 100 ul de soro humano ("pool" com c o n centração proteica total variando entre 6.1.

0 1.0 1. seguida de hoaojenização ea Vártex. iocubaçio por 20 a 24 horas a teaperatura aabitnte.0 1.0 1.Protocolo do RIE de GH Tubo Taapio/Padrio/Aaostra Anti-soro 72 (1/90.c-mi (1/200) (pi) Taspio/Sora (Ml) PEG (in) (HD Total W) (•D 1. aspiraçio do sobrenadante.0 1.000) «u. eentagea do precipitado por 1 ainute ea detector de cintilaçlo gata.0 ng/»l) (padrio 10 ng/al) (padrio 20 ng/al) (padrio 40 ng/al) (a«ostra) (aaostra) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 1OO 100 100 100 (soro) (soro) (saro) (soro) Uor«) (soro) (soro) (soro) (taapio) (ta»pl>. ia triplicata. anti-soro 72 e GH-HC. adiçio seqüencial de taapio/soro e PEG. seguida de hoaogeninçâo ea Yírtei.0 1. de taapio d* ensaio/padrio/aaostra. centrifugasio a 3000 rpa por 30 ainutos a 4»C.0 1.25 ng/al) (padrão 2.0 1.0 1.5 ng/al) (padrio 5. a) adiçio seqüencial.0 •SB Bo A B C D E F Controla Aaostra 200 100 100 100 100 100 100 100 100 100 (taaplo) (taapio) (padrio 1. anílise dos dados obtidos atravfs do prograaa de coaputador RIA CALC.I .62 Tabela I . b) c) ú\ a) f) g) .

0. As amostras de soro a serem dosadas.25. estas so luções foram todas desprezadas. um volure de 100 ul. sendo ambas desprezadas apôs o término do ensaio. . 10.07 ng e a uma atividade aproximada de 15. Após o término do ensaio. Alíquotas de 0.63 todos os pontos da curva (padrões "frios" contendo 1. sendo desprezadas a seguir. b) CONCENTRAÇÃO DO QH-HC - 125 I Uma solução 1/200 em tampão de ensaio foi preparada na hora do RIE a partir de uma alíquota de 100 ul de GH-HC I conservada a -20°C desde o dia da radioloda- ção. foram preparados a partir de 3 "pools" obtidos pela mistura de soros previamente dosados. foi pipetjj do em cada tubo do ensaio. incluí^ dos no início e no final de cada ensaio.5.com concentrações de GH variando entre 20 a 25. foram descongeladas no início do ensaio e recongeladas apôs o término deste. Os controles (alto. médio e baixo). 5.5 ml de cada controle foram conservadas a -20°C até sua utilização no ensaio. permitindo assim a repetição da dosagem caso esta fosse necessária. Desta solução. respectivamente.000 cpm. mantidas a -20°C desde a sua coleta. resultando em uma concentração f^ nal de 0. correspondendo * uma massa de 0. 20 e 40 ng/ml). 2.23 ng de traçado»* por ml da mistura de Incubação. 7 a 10 e 1 a 3 ng/ml.

13A) foram comparadas pelos seus respectivos perfis de precisão (Fig. também foi melhor com a 1/90.3 ng/ml). cujas respectivas <Bo especifica correspondiam a 65 e 62X.000 e 1/27O. resultando em diluições finais do anticorpo de 1/180.000. . a diluição do anticorpo a ser utilizada em um determinado ensaio deve resultar em ligação específica ao redor de 651. porisso. Baseado nesta premissa.000 e 1/90. 13B).000 (1.7 ng/ml. dados permitiram concluir que a solução 1/90. as soluções 1/60.000 foi nitidamente superior â obtida com a solução 1/60.000 solução Estes resuitava foi em melhores características do ensaie e.64 C) DILUIÇÃO DO ANTI-SORO ANTI-GH De acordo com Hunter (33). As carac terfsticas das curvas dose-resposta assim obtidas (Fig. elaborados segundo os critérios de Rodbard (60). respectivamente. fo ram incubadas com antígeno "frio" e marcado de acordo com o protocolo da Tabela I. ela escolhida e utilizada em todos os RIEs de GH realizados neste projeto.000 do anti-soro 72. A sensibilidade.OOO. A precisão intraensaio obtida com a diluição 1/90.000 (0.8 ng/ml) do que com 1/60. situan do-se em nível igual ou inferior a 10% para concentrações de GK "frio" acima de 1. definida como a dose mínima detectável.

* ) E 1/90.4 (B) 10.2 LOG [ G H ] ( n 9 / m l ) FIG. 13 .000 ( • — ) DO ANTI-SORO 72.6 43.CURVAS DOSE-RESPOSTA ( A) E PERFIS DE PRECISÃO (B) PARA RIEs DE GH REALIZADOS COM DILUIÇÕES 1/60.2 LOG [GH] (ng/ml) 1.000 ( * .65 L06IT0 B/Bo(%) 80 50 20 5.4 (A) 10.8 21.7 5.8 21.6 43. .35 2.

correspondente ao tubo NSB).9 ng/ml.000.7 e 0. Apôs diferentes períodos de Incubação (0 a 48 horas). definido como a incubação do antigeno "frio" com anticorpo sem a adição do traçador. seguida de contagem do precipitado. 14A1. comparadas com 0.I (100 pi de solução 1/200). foi efetuada a separação com PEG. (3) GH-HC . 0 cálculo da porcentagem de ligação . temperatura ambiente e a 37°C: de ensaio (100 ul). os RIEs de GH deste projeto passaram a ser realizados sem perÍ£ do de pré-incubação.6 ng/mi. associada a urna piora Importante da precisão intraensaio para concentrações de GH "frio" acima de 10 ng/nl. Neste experimento. foram comparadas pelos seus respec tivos perfis de precisão (Fig. Apôs adição do hormônio marcado.66 d) TEMPO DE INCU3AÇÃO As características das curvas dose-resposta elaboradas com e sem período de pré-incubação (Fig. obtida sem período de pré-incubação). 14B).em tr1p!1cata. os seguintes reagentes foram incubados. realizada a temperatura ambiente ou a 37"C. o tempo de incubação necessário para que a reação atingisse o equílí^ brio foi determinado em diferentes condições de temperatura. levou a uma redução muito discreta da dose mínima detectável (0. (2) anti-soro 72 (100 ul (1) tampão de solução 1/90. A introdução de prê-i£ cubaçâo por 1 hora. correspondente ao tubo Bo) ou tampão de ensaio 125 (100 ul.a 4°C. Por esta razão. respectivamente.

5 5.• ) .CURVAS DOSE-RESPOSTA ( A ) E PERFIS DE PRECISÃO ( B) PARA RIEt DE GH REALIZADOS SEM PERÍODO DE PRÉ.) E COM PERÍODO DE PRÉ-INCUBAÇÃO POR 1 HORA A TEMPERATURA AMBIENTE (à-k) OU A 37° C ( • .0 (A) 10 20 40 LOG [GH] (ng/ml) 50 40 30 20 10 1.25 2..b/ao(%j 67 80 50 20 CV 1.5 5.INCUBAÇÃO ( — .25 2. . 14 .0 (B) 10 20 40 LOG [GH] (ng/ml) FIG.

(61). Gianeila (comunicação pessoal) em 1982. segundo os critérios pr£ postos por Rodbard e col. (2) a XBo especifica observada no equilíbrio durante incubaçSo a temperatura ambiente (47X) foi maior do que a 4* e 37°C (43 e 41X. Este programa ba seia-se na transformação Iog1to-log.51). já que. Em todos os ensaios (exceto os correspon- dentes ao cálculo da atividade especifica e da constante de afinidade). respectivamente). formulado por D. e a e) PROCESSAMENTO E ANÁLISE DOS DADOS OBTIDOS Os cálculos da curva dose-resposta e da con centração das amostras desconhecidas foram efetuados por um programa de computação denominado RIA CALC.68 total. a XBo especifica era maior XNSB permanecia em níveis aceitáveis. A partir destes dados. 15) permitiu concluir que (1) a reação atingiu o equilíbrio mais rapidamente a 37*C (12 horas) do que a 4°C ou a temperatura ambiente (16 horas para ambos). inespecifica e especifica para cada tempo e temperatu ra de Incubaçâo (Fig. nestas condições. ficou estabelecido que a incubaçâo dos RIEs de 6H seria realizada a temperatura ambiente por 20 a 24 horas. (3) a XNSB durante incubaçâo a 4°C e a temperatura ambiente foi semelhante (ao redor de 16X). mas inferior ã observada a 37°C (ao redor de 17. a curva dose-resposta foi ajustada a uma reta por regressão linear não ponderada a partir das equações: .

.69 4#C TEMPERATURA AMBIENTE 37 # C 10 20 30 40 50 10 20 30 40 50 10 20 3 0 40 51 HORA! FI6. E ESPECÍFICA ( A ) . INESPECÍFICA ( o ) .INFLUÊNCIA DO TEMPO t TEMPERATURA DE INCUBAÇÃO SOBRE AS PORCENTAGENS DE LIGAÇÃO T O T A L Í O . 1 5 .

logi B —% Bo Bi-NSB = Bo-NSB x 100 onde: BI = radioatividade do precipitado correspondente à concen— tração 1 ng/ml do padrão de GH "frio".1. as curvas dose-resposta para cada hormônio foram compara ' •••• ! .6. 2.70 Logito (B/Bo X) « a • b. concentrações crescentes de GH-NIH (preparação de referência fornecida pelo National Institutes of Health) e GH-HC "frios" foram Incuba125 das com anti-soro 72 e GH-HC I. Bo ou NSB = radioatividade do precipitado correspondente aos tubos Bo e NSB. obedecendo ao protocolo da Tabela I. As concentrações das amostras desconhecivalores das foram determinadas pelo cálculo dos respectivos logito (B/Bo %) e interpolação a partir da curva dose-respos ta. Caracterização do RIE de GH a) COMPARAÇÃO COM PADRÃO INTERNACIONAL PARA DETERMINAÇÃO DE PARALELISMO E POTÊNCIA Em 3 ensaios diferentes. Após separação com PEG e contagem do precipita do. respectivamente.

71

das entre si para determinação de paralelismo (confirmada por inclinações idênticas das curvas) e potência. Esta última

foi calculada pela razão entre as concentrações de GH-HC e 6H-NIH necessárias para provocar 50% de inibição da ligação máxima, ou seja, B/Bo = 50% (21). A Fig. 16 mostra claramente o paralelismo entre as 2 curvas, confirmando o comportamento idêntico dos 2 hormônios. O cálculo da potência revelou ser o GH-HC, em média, 7% mais potente do que o GH-NIH, permitindo dessa maneira a calibração correta dos padrões "frios" de GH-HC.

b)

SENSIBILIDADE

A sensibilidade, definida como a dose mfnj^ ma detectávei (DHD), f o i determinada pela concentração de G H que resultou em valor B/Bo estatisticamente Assim, diferente do

obtido para a dose zero ( 1 5 ) .

'(Bo-NSB) - 2 DP
D D * concentração de G correspondente ao logito N H

(Bo-NSB) onde: Bo - média das contagens do precipitado em 9 replicatas tubo Bo; DP • desvio-padrão de B~õ; NSB « contagens do precipitado do tubo NSB. do

LOGITO B/Bo(%)

80

50

20

1,25

2,5

5,0

10

20

40 LOG [GH] (ng/ml)

FIG. 16-COMPARAÇÃO DAS CURVAS DOSE-RESPOSTA PREPARADAS COM PADRÕES DE GH - HC (•—•) E GH- NIH ( * ~ á ) "FRIOS*.

73

A sensibilidade, calculada e» 12 ensaios, foi de 1,1 + 0,08 ng/ml (média • erro padrão da média), do considerada adequada para o estudo dos testes de ção de 6H. sen

libera-

c)

PRECISÃO

A variação intraensaio intraamostra foi de terminada pelo perfil de precisão (Figs. 13B e 14B), elabora do de acordo com os critérios propostos por Rodbard (60). e col.

0 coeficiente de variação (CV) para uma determinada de hormônio "frio" foi calculado pela equação:

concentração

«y CVx = dy/dx onde: íy = desvio-padrão da resposta B/Bo correspondente à concentração x (determinada em triplicata); dy/dx • inclinação da curva dose-resposta no ponto correspo^ dente i concentração x> x 100

Em todos os RIEs de 6H, a variação ensaio situou-se em nível igual ao Inferior a 10X para centrações de GH acima de 1,5 - 2,0 ng/ml e permaneceu redor de 5% para valores entre 10 a 30 ng/ml,

intraconao

Intervalo que

A variação interensaio intraamostra calculada por dosagens repetidas dos controles baixo. 8.4. 8.3 e 25. seqüenfoi de •êdio (8.9. d) ESPECIFICIDADE A especificidade. Não houve alteração signi- ficativa destes valores quando 4 replicatas foram determinadas no inicio e 4 no final do ensaio.2%. o que poderia Invalidar a comparação da . o coeficiente de variação 5. foi médio e alto em 12 ensaios sucessivos.74 compreende a maioria dos picos de 6H obtidos nos testes liberação.6.3 ng/ml) fora» dosadas cialmente em um único RIE. demonstrando a estabilidade do RIE.6* para concentrações de 1. definida como o grau interferência provocado por substâncias estranhas sobre de a reação antigeno-anticorpo.respectivamente. 4.7 e 4. de Quando 9 replicatas do controle baixo (2. foi estabelecida de acordo com os critérios propostos por Yalow & Berson (78): d ) Estudo dos efeitos não específicos do meio de incubação Uma possível dúvida surgida na elaboração do RIE de 6H consistiu na diferença existente entre a composição do melo de Incubação dos pontos da curva-padrSo (apenas tampão de ensaio) e das amostras desconhecidas (tampão de ensaio mais soro). respectivamente.0 ng/ml) e alto (22.7 e 12.2 ng/ml. resultando em valores de 19.3 no/ml).

obedecendo ao pro tocolo da Tabela I. determinada pela Incubação de tampão de ensaio (200 pi) e GH-HC . com anti-soro 72 (50 pi de solução 1/45. A Fig. foram comparadas curvas dose-resposta preparadas com padrões GH-HC "frio" diluídos em tampão de ensaio e em r de stripper" (soro com concentração de GH < 1. não foi significantemente diferente da calculada pela incubação de soro. excluindo dessa maneira a presença de efeitos não específicos do soro sobre a reação antígeno-anticorpo e validando o protocolo do RIE de GH. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente.2 ng/ml). exibindo valores de 14.1 2 5 I (100 pi) por 20 a 24 horas a temperatura ambiente. d ) Recuperação quantitativa Neste experimento. tampão de ensaio e hormônio marcado (100 ul de cada). Neste mesmo experimento. 17 revela a identidade entre estas 2 curvas. padrões de GH "frio" (100 ul de soluções contendo desde 1.25 até 40 ng/ml em tampão de ensaio) foram Incubados em trip!icata.9 e 14. Estes dados demonstraram a validade de se utilizar o mesmo NSB para o calculo da curva-padrão e das amostras desconhecidas. Para se avaliar esta possibilidade.3%.000 em tampão de ensaio) e GH-HC 25 I (50 ul . a porcentagem de ligação Inespecífica.75 razão B/Bo das amostras desconhecidas como as da curva-padrão. respectivamente.

0 10 20 40 LOG [GH ] ( n g / m l ) FIG.COMPARAÇÃO ENTRE CURVAS DOSE RESPOSTA PREPARADAS COM PADRÕES DE GH "FRIO" DILUÍDOS EM TAMPÃO DE ENSAIO ( • .25 2. .• ) OU EM "STRIPPER" ( * .5 5. 17.76 LOGITO B/Bo (%) 60 50 20 1.* ) .

e utilizados para construção de curvas dose-resposta. 19.X entre as concentrações esptí radas e observadas (Fig.1 ng/mi de GH fo125 ran Incubados com anti-soro 72 e GH-HC I. 18) confirmou a identidade entre e s _ tes 2 parâmetros e excluiu novamente a presença de efeitos não específicos do soro sobre a reação antigeno-anticorpo.3 ng/ntl) e volumes idênticos de anticorpo e hormônio marcado. os mesmos padrões de 6H "frio" foram incubados com quantidade fixa e conhecida de GH (100 ul de soro contendo 5.77 de solução 1/100 em tampão de ensaio). do) Construção de curva dose-resposta com diluições progres sivas de soro de paciente acrompgálico Neste experimento. demonstra da na F1g. obedecendo ao protocolo da Tabela I. excluiu a presença de substâncias estranhas que pudessem Interferir com a reação antigeno-anticorpo nestas condições. Apôs separação com PEG e contigem do precj^ pitado. Simultaneamente. A identidade entre estas 2 curvas. A existência de uma relação linear tipo Y . as concentrações de GH presentes nestas amostras foram determinadas por interpolação a partir da curva dose-res posta e comparadas cem os valores esperados. padrões de GH "frio" e diluições progressivas (1/2 até 1/32 em tampão de ensaio) de soro de paciente acromegãiico contendo 43. sendo tra tados como se fossem amostras desconhecidas. completando-se o volu me final a 300 ul com tampão de ensaio. .

78 CONCENTRAÇÃO OBSERVADA ( ng/ml) 50 40 r * 0.2. 10 10 20 30 40 50 CONCENTRAÇÃO ESPERADA ( n g / m l ) FIG. 18-RELAÇÃO ENTRE AS CONCENTRAÇÕES ESPERADAS E OBSERVADAS DE GH EM ENSAIO DENOMINADO RECUPERAÇÃO QUANTITATIVA.994 30 20 . .

LOGITO B/Bo (%) 60 50 20 1.COMPARAÇÃO ENTRE CURVAS DOSE . .0 10 20 40 LOG [ G H ] ( n g / m l ) FIG.5 5. 19.25 2.RESPOSTA PREPARADAS COM PADRÕES DE GH "FRIO" (•—•) OU COM DILUIÇÕES PROGRESSIVAS DE SORO DE PACIENTE ACROMEGAllCO í A—*).

"kit": "Sm-C Radioimmunoassay Kit" (Nichols comer- Institute Diagnostics.2S para concentrações de 0. . com exceção da testoste rona. CA.2.33.sensibilidade: 9 ng/dl: .4 e 9.características: dosagem sem extração prévia.2. .Genentech Diagnostics. a) SmC .sensibilidade: 0. respectivamente.9. 9. separa- TU .50 U/ml.3 e 3. 1. EUA).70 e 1.0 e 5. foram dosados em duplicata no soro por "kits" ciais de RIE. MA.variaçío Intrasnsaio: 7. .1» para concentrações de 89.características: fase sólida (anticorpo ligado 3 parede do tubo).6 e 3. San Juan Capistrano. .0% para concentrações de 0.80 2. respectivamente. no! . ção por segundo anticorpo. . Tr Cambridge. . 3."kit" "GAMMACOAT (" ^ X1 T Radioimmunoassay Kit" (Clinical Assays.2 U/ml. 169 e 449 ng/dl. . EUA). respectivamente.1 U/ml.variação intra e interensaio: 5. DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS SÉRICOS DOS DEMAIS HORHÕ NIOS Todos os outros hormônios.variação interensaio: 11.

. respectivamente.3. respectivamente. .2 e 4.34 iiUI/ml.8.6. respectivamente. .8 pUI/ml.variação Intraensaio: 4.2X para concen- .1.6 e 14. trações de 2. 7.0 ug/dl.5 ug/dl. 4."kit": "GAMMADAB HS V N Ij hTSH Radioimmunoassay Kit' (Clinical Assays).1 e 12. d) TSH .6 e 5.características: separação por segundo anticorpo.0. 5. 3.8. 5. e) PRL . 5. .2 pUI/ml.2% para concen- trações de 2.variação Interensaio: 7.6. . .características: fase sólida (anticorpo ligado à parede do tubo). 7.2 ug/dl."kit": "GAMMADAB R P ij Prolactin Radioimmunoassay Kit" (Clinical Assays).variação intraensaio: 7.7 e 13.sensibilidade: 0.1 e 5.3 e 5. . .3.sensibilidade: 0.3* para concentrações de 3.8 e 3.características: separação por segundo anticorpo. respectivamente. .variação interensaio: 7.05 para concen- 13. trações de 2.81 - "kit": "GAMMACOAT l""'1J » ' Free/Total T 4 Radioimmuno — assay Kit" (Clinical Assays).

4.0 e 118 ng/ml.4 e 116 ng/ml.variação intraensaio: 6.7 e 172 mUI/ml. respectivamente. . .características: separação por segundo anticorpo.7.valores normais: calibrados pelo padrão da WHO 2 n d IRP-HMG.sensibilidade: 1. f) LH . respectivamente.variação interensaio: 5.35 para concen- trações de 16.8% para concen- trações de 16.sensibilidade: 0. 2. .3X para concen— trações de 16. 41.9.sensibilidade: 1. .6 e 150 mUI/ml.características: separação por segundo anticorpo. .0. . g) FSH _ "kit": "GAMMADAB N I' ij FSH Radioimmunoassay Kit' (Clinical Assays). 38. .valores normais: calibrados pelo padrão da WHO 1st IRP 75/504.4 e 8. . .variação intraensaio: 5.7.4 e 9. respectivamente. 8. respectivamente. 41.1.2% para concen- trações de 11.0.6. .8..variação interens2io: 7.9 e 5.6 ng/ml. .2 e 7. 40.6 mUI/ml.5 mUI/ml."kit": "GAMMADAB R ['"ij LH Radioimmunoassay Kit" (Clinical Assays). 5.

.8.9.variação Intraensaío: 6.variação intraensaio: 7. ."kit": "GAMMACOAT Cortisol Radioimmunoassay Kit" (Clinical Assays)."kit": "Coat . 1) Estradioi .0 38.45 para concen- 39.6 e 5. h) Cortisol TM |125 I l l\ .variação Intraensaio: 11. 4.4. respectivamente. Los Angeles. fase sólida (anticorpo ligado ã parede do tubo). respectivamente.6X para concen- 24.4 e 49.7 e 2.4.sensibilidade: 0.1. . 11.variação interensaio: 8.6 »UI/ml. .Count Estradiol" (Diagnostic Products Corporation.valores normais: calibrados pelo padrão da WHO 2nd IRP-HHG.83 . .4 e 51.5 e 9. 6.4.9 mUI/ml. 5.1 f/g/dl.1 e 5. te. ções de 8. .2* para concen- . trações de 3. trações de 8.8. 11.7.características: fase sólida (anticorpo ligado à parede do tubo). respectivamente.variação interensaio: 9.2 e 4.24 pg/dl.6 e 3.sensibilidade: 10 pg/mi. CA.8% para concen- .4% para concentra 23.A .características: dosagem sem extração prévia. trações de 3. .4 e ug/dl.6. EUA). respectivamen- 5. .

j) Testosterona Os níveis séricos de testosterona foram determina dos por RIE segundo o método de Abraham ( 1 ).6 a 6.5 ng/dl. Antes de ser utilizado. sen do a sua especificidade considerada adequada. Os padrões "frios" foram obtidos da Sygma e o hormônio trici ado da A.51 para concentrações de 81. Carson. A sensibilidade variou de 5. 7.4.7% e a interensaio de 12 a 15%.31): a) hemograma completo: a contagem global foi realizada em contador automatizado e a específica em lâmina após colo ração com mistura de Romanowsky (Leishman). sódio e potássio séricos: espectrofotometria de chamai . o anti-soro (Radioassay Systems Laboratories.nersham. . a variação intraensaio de 5. respectivamente. 2. b) c) gileemia piasmática: método enzimático automatizado. 125 e 300 pg/ml. respectivamente..3. Inc. EUA) foi testado.7. 111 e 295 pg/ml. após extração do soro com acetato de etila: hexana (3:2) e sem cromatogra fia prévia. OUTRAS DETERMINAÇÕES LABORATORIAIS Todos os outros exames laboratoriais foram incluídos na rotina do Laboratório Central do HC-FMUSP e determina dos por técnicas consagradas na literatura (3.variação interensaio: 13. CA.5 a 6.84 trações de 37.0 e 5.

70). As diferenças foram consideradas significativas ao nível de 5% (p < 0. h) cálcio sérico: espectrofotometria de absorção atômica. com poder de de 95% (43.85 d) uréia sêrica: método enzimãtico da urease. i) fósforo sérico: método de Fiske-Subbarow. m) exame parasitoiogico de fezes: método de Faust e Hoffmann[ f n) cariótipo: analise em cultura de linfócitos. com número relativamente pequeno de amostras. . j) fosfatase alcalina: método enzimãtico e cinêtico. f) g) proteínas séricas totais: método do biureto. cuja distribuição não era p r e — viamente conhecida. o equivalente nSo pararnétrico do "t" de Student. albumina sérica: método do verde bromocresol. e) creatinina sérica: método colorimétrico.05). eficiência de Este teste foi escolhido por se tratar comparaçío entre variáveis Independentes. 1) urina tipo I: microscopia óptica. l 3. MÉTODOS ESTATÍSTICOS Os níveis de GH observados nos testes de tolerân- cia á insulina e clonidina foram comparados e estatisticameni te analisados pelo teste H ü" de Mann-Whitney.

.86 Todos os valores foram expressos como média + _ 1 à erro padrão da média (EPM). inclusive os dados referentes literatura.

VII - RESULTADOS .

0 ng/ml menos uit teste de estímulo (ITT ou clonidina).500 g ao nascimento para gestações a termo: 4 pacientes (FCS. c) dosagem sêrica normal de SmC. GRUPO 1: PACIENTES SEM DÉFICIT DE 6H Foram incluídos neste grupo 21 pacientes que pree£ cheram 3 ou mais dos seguintes critérios: a) b) ausência de sinais típicos de nanismo hipofisãrio. laboratorial. de acordo C O M os dados obtidos na avaliação clínica. caracterizado como em pelo altura Inferior a 46 cm e peso abaixo de 2. radiolõgica e hormonal. ritmo de crescimento normal. . d) pico de liberação de GH maior do que 7. MAN. FFH e JCES). Os principais fatores que contribuíram para a baixa estatura destes pacientes foram: a) déficit de crescimento Intrauterino.88 Os pacientes foram divididos em 2 grupos.

AHM. não foi encontrada explicação para o déficit de crescimento. JCES e A S ) . ingestão g/dl: 7 d) doença crônica prévia (tuberculose pulmonar e ülcera duo denal estenosante): 2 pacientes (JCES e AS). FFK. e f) baixa estatura familiar. MTT. e) nanismo primordial. caracterizada pela média da altura dos pais inferior a 158 cm (correspondente ao centil 10 da população brasileira): RTS. Em 7 pacientes (JAM. MSP e JABÁ).89 b) retardo puberal. SCN. ADO.9 e 17. A/M. caracterizada por baixa proteica e proteínas séricas totais entre 5 . 1. caracterizado por retardo mental estigmas somáticos: 1 paciente (FCS). IDADE E SEXO Foram estudados 15 meninos e 6 meninas. c) desnutrição discreta. 7 pacientes per(FFH. com Idade entre 2. EZ e MBH). AVC e JCES). SRC. CAC. AVC.5 anos. caracterizado por inicio da puberdade apôs os 13 anos em meninuj e apôs os 14 em meninos: 5 pa cientes (SRC. JHS. AVALIAÇÃO CLÍNICA (TABELAS II E I I I ) 1. SCN.6 pacientes (FCS. .1. RTS. PMR.

3. SCN e JCES) e baixo de (FCS. apresentação cefálica. apenas um domi ciliar. Foram observados retardo do desenvolvimento neuropsico-motor em 4 pacientes (FCS. MAN.90 1. ANTECEDENTES INDIVIDUAIS Todos os pacientes nasceram após gestações normais a t e r m o . RTS. Duas crianças (FCS e JCES) apresentaram cianose na hora do parto do e 5 (FCS. SCN e JCES) nasceram com peso menor que 2. R T S . SRC.500 g e altura abaixo de 45 cm. FFH. HISTÓRIA DO DÉFICIT ESTATURAL O início do retardo de crescimento foi observado des de o nascimento até 3 anos antes da avaliação inicial no HCFMUSP. sem resultados satisfatórios . AVC e JCES) e as de afeto domiciliar apenas 1 ( J C E S ) . Os pacientes JCES e AS tinham sido previamente sub metidos a cirurgias de úlcera duodenal estenosapte e pneu- .800 g e altera de 37 cm. que nasceu prematuro ses) com peso de 1.2. em a p r o v e i t a m e n t o ^scolar em 2 (FFH e R T S ) . Vários pacientes tinham sido previamente tratados com v i t a m i n a s ou anabolizantes não hormonais. 1. As c o n d i z e s n u t r i ç ã o foram consideradas inadequadas em 7 c r i a n ç a s FFH. enquanto que 6 mães foram submetidas a cesárea. exceto o paciente SCN. Quinze (7 mepartos foram por via vaginal. AAM.

91

m e c t o m i a direita por tuberculose pulmonar,

respectivamente.

A m a i o r i a referia verminose anterior t r a t a d a . Doze pacientes relataram início do d e s e n v o l v i m e n t o puberal entre 9 e 17 anos, sendo este c o n s i d e r a d o em 4 (SCN, A V C , JCES e A S ) . em M B M aos 12 a n o s . retardado

A menarca tinha o c o r r i d o apenas

1.4.

ANTECEDENTES

HEREDITÁRIOS

A média da altura dos pais foi m e n o r do q u e 1 5 8 cm em 7 pacientes (FFH, RTS, S C N , PMR, CAC, EZ e M B M ) , não sendo possível d e t e r m i n a r a idade em oue teve início a paterna ou m a t e r n a . p'jberdade

Apenas os pais de F C S eram consangüíneos

(primos em lfi g r a u ) , enquanto que só JHS tinha um irmão com n a n i s m o (hipofisário). N ã o foram detectadas outras patologias

f a m i l i a r e s que pudessem ajxiliar no d i a g n ó s t i c o da causa da baixa estatura.

1.5.

INTERROGATÓRIO

COMPLEMENTAR

Não foram observados sintomas importantes referentes aos sistemas neurológico, cárdio-respiratório, gastro-i£ testinal, ósteo-articular ou endócrino em nenhum dos pacientes estudados.

f.V '.

' r " f '•',

92

1.6.

EXAME

FÍSICO entre

A altura variou entre 1,3 e 4,2 DP e o peso 0,7 e 3,4 DP abaixo da média para sexo e idade.

0 exame clínico de FCS revelou retardo do desenvol vimento neuro-psico-motor associado a hipotonia global e estigmas somáticos comopálato ogival, retrognatia, filtro sal curto e esboço de sinofris. na-

No paciente MAN, foram dee EZ, não

tectados pectus escavatum e prega simiesca e, em JABÁ nevos em tronco e pálato ogival. Os demais pacientes

apresentavam estigmas ou anormalidades importantes. Oito meninos e 1 menina não mostravam nenhum sinal de puberdade ao exame físico, sendo classificados como Grupo IA (Tabela I ) . Nos outros 12 pacientes, incluídos no Grupo ras

IB (Tabela I I ) , foi detectada pubarca em todos, telarca

5 meninas e testículos com dimensões maiores do que 2,5 cin nos 7 meninos.

2.

AVALIAÇÃO LABORATORIAL E RADIOLÓ6ICA GERAL III)

(TABELAS II E

As proteínas séricas totais estavam

discretamente

diminuídas em 4 pacientes (FCS, FFH, SRC e AVC), sendo deteve tada hipoalbuminemia em apenas um {FCS). Foi constatada an^ e

mia hipocrômica microcitica em 4 pacientes (FCS, A^M, AVC

93

TABELA II - Dados clínicos e laboratoriais em pacientes pré-púberes sem déficit de GH (Grupo IA)
Noie Sexo Idade cr on. (anos) (kg) (-DP) Peso Altura Idade Idade óssea (anos) Ritio cresc. (c«/ano) (g/dl) Heiog. Prot. tot. (g/dl) (g/dl) Alb.

(1)

(c.)

( •DP) -

1)

estat. (anos)

FCS KAN FFH RTS JM A

H M M
H

2,9 9,0 91 ,
11,0 11,0 12,1 13,0 14,5

10,2 22,0 19,0 18,7 31,1 26,8 25,2 24.3 IS.5

2, 6 1.1 1,7
1. 8

85, 0
122, 0 114, 3 120, 0 131. 138,

3,1 1,9 3,3 3,0 1,8 1.3 3,1 5.5 2, e

1,7 7,0 5,7
6,5

1,5

0

10,2 13,9 13,5 12.4 12,6 12,3 12,6 13,3 11,2 12-16

5,3

3,2

7 6
10

5,6 6,3 5,3 3,3 2,1 4.2 5.1 5,1

7,4 5,8
6.1

4,3
3,9 i.,0

H K K
H

0,7 1.2 1.8 8 2.,
, 1,4

7 3

3,5
10,0

8
10

7.0 7,4 6,5 5,6 69 ,
6-8

4,0
4,3

;o o
AAM
SRC AHH
Nonal

130, 0 123,

8,2 7.2 5,2

8
10
t,

3,8
4,3 4,0 3,5-5,0

, 3

F

7,9

112, , 1

(1)

Desvio-padrão ei relação à aédia para sexo e idade segundo as tabelas de Karques e col. (45).

9 2. (c«/ano) (g/dl) Hciog. 4 141 .5 11.9 12.7 8. tot.5-5.2 3.4 28.1 31.2 4.8 14.5 9 9 1 1 12 10 13 13 6.3 2.7 6? . 12.4 4." 3 3.2 3.0 10.3 6.4 3.7 2.3 13.9 10.7 31.2 2.8 142.7 11. 8. 69 .5 12-16 E: KBH AS Nor»al F F F 1.3 9.5 9 1 1 10 12 1 1 4.4 128. 5 135.7 11. 3. (ç/dl) lifil) Aib.8 13.0 15.8 1.3 3.5 .5 6.5 17.P it 5 8. 7 (-DP) (D estat.8 0 l.0 *.3 4. 75 . 2.í.7 7. 1 132.0 6.0 39.94 TABELA III .0 30.3 25.1 15.4 1. (anos) (kg) Peso Altura Idade Idad* óssea (anos) Ritto cresc. (anos) HTT JHS HSP SCN PHR AVC JCES 1 M M H H N M F F 12. 6 142.8 11.4 5.1 4.7 13.5 4. . 5 141 .7 14.0 (l) Desvio-padrSo tu relação a ifdia para seio e idade segundo as tabelas de Marques t col.2 1.2 25.4 61 . 3.0 146.7 4.6 13.5 2.8* zi . cW11 0. J 8.1 12.0 12.2 L.2 25.5 10. Prot.2 7. 6-8 4.8 12.9 13.0 11.0 10.1 ll. 8 .4 3.i .8 12.0 6. (45).1 34.6 95 .6 (c ) 140.Dados clínicos e laboratoriais em pacientes püberes sen déficit de GH (Grupo IB) Noae Sexo Idade cron.0 7.0 138.5 34.1 13. 4.7 30. 5.8 2.2 16. 61 . 71 .7 1.5 4.7 • " CAC JA9A 9.7 39.0 4 .7 3.2 6.0 126. 5 152.4 15.0 15.

JHS. os valores de T foram sempre maiores 60 ng/dl.95 EZ) e verminose em 5 (RTS. AVALIAÇÃO HORMONAL BASAL (TABELAS IV E V) As concentrações séricas de T . AHM. bem como o Rx de crânio e o cariótipo (este último realizado ape nas em MAN. No Grupo IA. MSP. JABÁ e EZ) mostraram-se normais. assim como a SmC. AVC e A S ) .enquanto que os de E_ peimaneceram abaixo da sensibilidade do ensaio (10 p g / m l ) . a testosterona e o estradiol -se em nível inferior a 27 ng/dl t 10 pg/ml. sendo compatível com a idade esta tural em 13 casos. quando correlacionada com a idade cro nológica e sexo. Todos os outros exames laboratoriais g e r a i s . do que Já no Grupo IB. situaram respectivamente. e TSH apresenta ram-se dentro dos limites da normalidade em todos os pacientes. Foram detectados níveis cos normais de LH e FSH em todas as meninas púberes. 0 Rx de mãos e punhos revelou retardo da idade óssea em todos os pacientes. . 3. T.

5 0.2 (0.22-2.0 AO D 2.96 TABELA IV - Avaliação hormonal basal em pacientes sem d é f i c i t de G (Grupo IA) H SiC pré-púberes Noie T 3 T TSH T l 2 (ü/.8) 189 10.5) 152 8.6) 181 9.08-1.* (0.1 (ng/dl) 13.9 16.8) 181 10.2>-2.60 (O.0 UuiM) 2.5-11.2 (0.6 RTS 188 10.7) 170 11.9 3.22-2.0 1.22-2.0 AN A 1.0 FFH 6.U-4.1 2.90-5.7) 2.0 1.6 (pg/il) M0 ei 1 (0.0 SRC 181 10.8 (0.9 (0.6 25.8) 180 9.l) FCS (ng/dl) 180 Wdl) 9.3 25.7 (0.8-5.2 26. .0 JAU 2.D "' HAN 1.3 20.0 3-27 < 10 Valores noraais para sexo e idade cronológica.28-3.7 < 10 Nonal (1) 80-200 4.0 AM H 0.9 (0.0 11.28-3.8) 2.2 20.0 2.7 *.6 2.

7 < 10 JA8A (0.0 > 50 < 82 (l) Valores nonais para sexo e idads cronológica.0 1.8) 6.7 < 10 HBtt 161 8.0 (0 .91-3.1] 2.5 < 10 Noraal 80-200 4.7) 2.3 (0.8 65 AVC 188 10.91-3.0 2.0 TSH (|iUI/i!) 1.1) 1.0 1.3 (0.0 3.9 < 10 150 9.90-5.7) (D 1.5) 2.0 < 10 AS 160 10.9) (1 1.8 (0.5 (0.l) KTT 1.71-4 .0 445 JCES 168 9.91-3.1) 3.28-3.1) 190 11.41-4.5-11.7 (0.7 76 CAC 200 8.6 153 «SP 160 468 SCN 185 9.5 0.2 1.7 (0.1 (0.1) 6.0 (ng/dl) 542 JKS 178 9.8 .99-6.20-5 .6 (0 .5 (0.99-6 .Avaliação hormonal basal em pacientes púberes sem déficit de GH (Grupo IB) fco»e StC (U/.28-3.8-5.4 3.5) I 3 (ng/dl) 160 T 4 (tig/dl) 8.5 3.97 TABELA V .8) EZ 2. .7 1.2 1.8 257 PMR 195 11.91-3.

8 ng/ml. excluídos da comparação com os demais. Todos os pacientes queixaram-se de mal-es- tar geral. não sendo es_ tatisticamente diferente (p = 0. incluindo o doente JAM no qual não hou ve aumento dos níveis hormonais durante o teste. 11 pacientes partiram de concentrações basais de GH inferiores a 3. provavelforam pertenGH mente devido a "stress" na hora do teste.1. Os outros 7 centes ao Grupo IA partiram de concentrações basais de menores do que 3.47) da obtida no Grupo IA. no entanto.6 ng/ml. não sendo necessá rio. interromper o teste devido a perda de consciência em nenhum deles. VII E VIII) igual para a Em todos os testes. Após administração áa insulina.es A tes níveis elevaram-se acima de 7.4%). média dos picos de GH. A média dos picos de GH foi de 15. _ No Grupo IB. Após o estímulo hipoglj^ foi de cêmico. foi obtida hipogl icerniu ou inferior a 45 mg/dl. náuseas. considerada estímulo efetivo liberação de GH. estes níveis ultrapassaram 7.3 + 1.98 4. TESTE DE TOLERÂNCIA Ã INSULINA (TABELAS VI. Três pacientes (FFH e ADO do Grupo IA e AVC do Gru po IB) apresentaram níveis basais elevados de GH.3 + 2.0 ng/ml. porisso. 10. . sudorese e sonolência.7 ng/ml.°%). e.0 ng/ml em 5 (71.0 ng/ml em 10 (90. TESTES FARMACOLÓGICOS DE ESTÍMULO 4.

6 1.1 p < 1.2 21.0 1.1 3.9 < 1.3 1.7 4.2 3. 1 8.5 2.8 11.3 1.2 2. 0 .2 10. .7 1.16 14.30 10.3 1. 3 9.2 1.l) ITT Clcnidina B MTT JHS MSP SCN PMR AVC JC£S CAC JAdA < 1.Níveis de GH em condições basais (B) e de pico (P) em pacientes sem déficit de GH Pacientes pré-púheres (Grupo IA]) GH (ng/.5 Noie EZ M8H AS a EPM 1 .1 1.3 2.5 I.3 1.2 15.4 1. (2) Para o cálculo da «édia.8 10.6 6.l) Clonidina Noae ITT ) P P B FCS MAN FFH RTS JAN ADO AAN SRC AHM 3.6 30.9 3.7 2.6 16.2 6.1 21. Pacientes púberes (Grupo IB) GH (ng/.3 <1.2 1.o 1.3 21. 1 <1.. 9 1.8 1..4 38.1 <1.0 6.5 11. .3 12.5 0.3 3 22.2 1. ADO e AVC fora» excluídos do cálculo das iédias no ITT por apresentarei valores basais elevados de GH. forai (3) Os pacientes FFH.6 12. as concentrações de GH que caírai abaixo ia sensibilidade consideradas iguais ao valor da sensibilidade do respectivo ensaio.8 <1.1 15. 5 23. 4 13. 8 3.4 < 1.2 .3 13. 8 11.3 2.1 11.9 5.3 < 1.3 26.4 1..2 12.4 9.2'J P 7.6 15.5 0.6 3.2 <i. 6 12.7 0..1 16.8 2 (1) Média das concentrações de GH nos teipos de -30 e 0 »inutos.5 <1.1 2.9 0 . 0 1.5 18. 6 4.99 TABELA VI .1C B 1..9 11.4 3.3 11.1 1.6 1.tO 9. 1.2 7.9 33. 2*.6 1..3 1.1 8.

EPM (1) GH (ng/«l).2 47 2.3 88 1.1 U/kg) 45 30 10. (3) Para o cálculo das •(dias.9 88 11.I 85 9.7 7.3 1.. ' .5 87 2.5 79 GH G GH G I.3 40 5.2 1.5 24.4 0.: 6.1 23.0 <' 1.2 <1.8 54 12. 1.0 60 9.5 85 ITT 15 2.2 5.2 <1.6 0.2 2.25 6.7 51 8.6 10.2 <1.6 92 16.7 43 12.5 22 (0.4 1.ia (ig/dl).6 <1.0 ^.3 79 2.11 1.Níveis séricos de GH nos testes de tolerância ã insulina e clonidina em pacientes pré-púberes sem déficit de GH (Grupo IA) Note Dosagei -30 3.0 t.2 30 <1.8 2.6 74 36 1.3 1. .1 71 1.7 15.4 •gV) 90 5.7 55 8.8 73 9.4 12.7 54 8.6 3.' FCS HAN FFH R1S JAM ADO AAH SRC AHH Média (3) 1.8 23 14.2 9.1 30 6.2 8.9 13.21 e.0 4.4 2.7 53 4.5 54 17.. U. L.6 49 2.2 1.3 6.2 <1.8 2. 77 8.9 <1.2 69 3.9 67 11.8 37 1.9 2.2 41 7.3 81 1.2 Clonití ina (0 .7 14 4.5 5.2 3.7 74 6.3 2.3 69 11.9 53 60 8.8 C <1.0375 0 30 60 1.2 1. as concentrações de GH que cairai abaixo da sensibilidade forai considir*das iguais ao vaior da sensibilidade do respectivo ensaio.7 r 27 1. 1.3 71 1. 1.2 53 2.1 <1.6 81 3. 2.3 93 0 2.4 21 73 3.1 0.5 0.1 8! I.7 53 10.1 <1.2 87 2.6 77 90 5.37 90 1.5 11.2 45 1.1 1.5 : - G GH G GH G GH G GH G GH G GH 78 2.1 88 7.2 53 9.100 TABELA VII .6 58 9.2 1.1 <1.2 1.5 1.4 (2) Glice.0 £.26 1.0 72 6.1 27 3.7 59 5.6 1.7 0.9 -30 3.4 38 21.3 38 5.» 92 55 1.0 77 2.1 1.4 <1.8 45 <1.1 11.5 7 <1.

2 10.2 93 1.2 <1.4 1.6 3.6 1.6 54 1.0 6.4 78 4.2 74 75 3.3 <!.6 40 5.7 40 6.3 1.4 14.£ CAC <!.l).3 <1.4 27 7.4 10.1 0.0 59 1.0 36 39 47 60 1.7 18.3 2.3 4.4 ! JCE$ 21.3 <1.2 <1.0 63 10.4 3.1 84 1.3 0.22 0.0 6.3 81 77 34 39 36 35 44 15.0 73 9.5 66 8.2 34 51 1.1 60 7.Níveis séricos de GH nos testes de tolerância ã insulina e clonidina em pacientes púberes sem déficit de GH (Grupo IB) ITT (0.5 " BM 21.2 64 52 <l.4 94 1.9 2.9 2.0 17.4 83 82 2.2 69 5.8 87 6.101 TABELA VIII . (3) Para o cálculo das aédias.5 3.3 74 30 40 56 61 1.7 89 2.2 <1.8 26.6 1.2 1.0 26.5 2.1 38 3.45 2.2 1.1 2.4 44 1.08 0. as concentrações de GH que caírai abaixo d? sensibilidade fora§ consideradas iguais ao valor da sensibilidade do respectivo ensaio.7 84 1.2 40 2.5 2.9 15.3 <1.2 <1.6 90 4.1 SC " 18.6 1.3 8.14 0.C PBR <1.8 *.3 11.4 <1.7 1.5 1.4 1.2 14.5 38 2.8 1.7 10.3 72 9.4 80 2.2 17.5 84 6.9 1.6 2.1 6.0 46 <1.2 49 9. (2) Gliceaia («g/dl).2 95 3.3 19.6 45 2.6 12.4 <1.1 45 9.6 74 1. 77 1.3 87 84 44 <1.6 79 2.8 1.1 2.1 83 1.3 '1. .8 27 7.0 16.2 33.3 2.3 AS G GH Hftíia^ EPH 12.1 57 45 2.3 0.63 3.5 1.7 2.1 13.1 2.2 <1.5 1.0375 iq/i') j | j ' Noie Dosagea -30 GH 0 <lt2 15 <1>2 30 lf2 45 7 9 60 ? 2 90 6>1 I3Õ l>3 Õ <I>2 30 <1>2 60 ' 90 <! 2 ÍTíT G JHS (2' ' <1>2 ' ' <lt2 ' 80 1.7 2.7 *VC \ 1.6 16.6 <l.0 9.1 19.0 1.3 <1.6 2.3 <1.4 *.2 GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH <1.6 62 i 1.2 38.3 24.3 68 73 <1.2 10.1 26.4 51 11.7 30.9 91 1.0 <l.0 5.0 1.6 3.6 73 1.2 JABA 11 <1.8 2.1 U/kg) Clonidina (0.0 <I.5 96 1.1 85 19 2.8 1.1 66 5.6 60 %?.4 1.2 2.5 15.4 24.9 1.2 77 5.2 43 28 6.5 9.0 12.1 45 2.22 0.1 39 42 3.6 (1) GH (ng/.1 84 1.

com resposta inferior a 7.Grupo IB (12 p a c i e n t e s ) .4 ng/ml. a clonidina diferente promoveu apenas Incremento na concentração de GH acima de 7. VII E V I I I ) dos Na maioria dos testes. a c o n c e n t r a ç ã o máxima de GH ocor reu entre 30 e 90 minutos após injeção da insulina. A média dos pico de GH.2 + 3.28) nem da observada no ITT no G r u p o (p = 0 . No. 9 X ) . incluindo os 7 p a c i e n t e s ng/ml. não sendo estatisticamente (p = 0.9 + 1. mais fre q u e n t e m e n t e no tempo 60 (7 p a c i e n t e s ) . a media dos picos de GH de 14. IB Entretanto.9 +_ 1. da foi de 10.102 Em ambos os c upos. os níveis de GH observados nos dife .1 mmHg para a diastólica.2. 1 5 ) . 4.8 + 2.5 não sendo estatisticamente diferente da obtida no m e s m o teste no Grupo IA (p = 0.7%).0 ng/ml em 8 ( 8 8 . a r e s p o ^ Coji foi e A que de ta à clonidina foi maior do que 7. houve discreta r e d u ç ã o níveis pressóricos associada a leve sonolência. siderando todos os 9 pacientes. o c o r r e n d o entre 60 e 120 minutos após administração da c l o n i ó i n a . mostrando uma resposta normal ao estímulo h i p o g l i c ê m i c o (Tabela X V I ) . 0 cortisol só foi dosado no paciente F C S .26) da obtida no ITT.8 mmHg para a pressão sistõlica 5. No Grupo IA (9 p a c i e n t e s ) . TESTE DA CLONIDINA (TABELA VI. Todos os pacientes partiram de níveis b a s a i s de GH inferiores a 2. foi de 12.0 ng/ml em 5 (41.0 ng/ml.5 n g / m l .

103

rentes tempos do teste da clonidina foram discretamente infe riores aos do ITT (Fig. 2 0 ) . Em ambos os grupos, a concentração máxima de GH ocor reu entre 60 e 120 minutos após administração da clonidina, mais freqüentemente no tempo 60 (9 pacientes).

4.3.

TESTE DO TRH ASSOCIADO

AO LHRH

Este teste sõ foi realizado no paciente FCS, revelando respostas hipofisárias normais de LH, FSH, TSH e PRL. a

Os níveis basais elevados de PRL deveram-se provavelmente "stress" na hora do teste (Tabela X V I ) .

5.

SEGUIMENTO

(FI6S. 21 E 22)

Todos os pacientes apresentaram ritmo de crescimen to adequado, com exceção de FCS e ADO. Durante a evolução,

foi observada pubarca em ADO aos 12,5 anos e início da pube£ dade em SRC aos 14,8 anos, permanecendo pré-púberes os demais componentes do Grupo IA. Já no Grupo IB, houve progressão

discreta dos sinais puberais em todos os pacientes.

104

30

60

90 120 TEMPO (MINUTOS)

FIG. 2 0 - NÍVEIS SERICOS DE 6H ( MEDI A ± ERRO PADRÃO
DA MÉDIA) NOS TESTES DE TOLERÂNCIA À INSULINA { • — • ) E CLONIDINA ( * — * ) EM PACIENTES PÚBERF.S SEM DÉFICIT DE GH.

105

M-TURA cm

90
80 70 60 150 140 30 120

110
00 90
• i i i i i i i i

5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 20
IDADE EM ANOS IG. 21 - RITMO DE CRESCIMENTO DE 21 PACIENTES DO SEXO MASCULINO COMPARADO COM O GRA'FICO DE MARQUES E C 0 L . ( 2 8 ) . ( • ) INÍCIO DO TRATAMENTO COM GH. ( t ) INÍCIO DA PUBERDADE.

) INÍCIO DA PUBERDADE. ( * ) INÍCIO DO TRATAMENTO COM GH.106 AS CAN i—i—I—I—i—i—i—I—I—I—i—i—i i i • • i . ( 2 8 ) .R I T M O DE CRESCIMENTO DE 9 PACIENTES DO SEXO FEMININO COMPARADO COM O GRAFICO DE MARQUES E COL. . i i 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 20 IDADE EM ANOS FIG. 22 .

TRH e LHRH. CC e JAS) foram classificados como déficit isolado de GH. suspeitou-se de doença hipofisária familiar em 4 (ARC. AVALIAÇÃO CLÍNICA 1. CC e JAS) devido à presença de consangüinidade entre os pais.0 ng/ml err 2 t e s tes de estímulo (ITT e c l o n i d i n a ) . P C S . FK. IDADE E SEXO Foram estudados 7 meninos e 3 meninas.0 e 16. pico de liberação de GH menor do que 5. com idade entre 5. dosagem sérica diminuída de SmC. PCS. Em 4 pacientes (RJSC. na qual foi diagnosticado craniofaringioma. Entretanto. . foi feito o dia£ nõstico de deficiência hipotaiâmica-hipofisária múltipla pelos níveis séricos basais reduzidos de T e T.107 GRUPO 2: PACIENTES COM DÉFICIT DE GH Foram incluídos neste grupo 10 pacientes que preer cheram 3 ou mais dos seguintes critérios: a) b) c) d) presença de sinais típicos de nanismo hipofisârio. AMAS. WL. 1. A etiologia do distúrbio hormonal foi considerada idiopática em todos os pacientes com exceção de FSGS. Os outros 6 pacientes (ARC. e/ou respostas subnormals dos demais hormônios hipofisários aos estímulos de hipoglicf? mia.1 anos. CAN e FSGS).1. ritmo de crescimento redu2ido.

Foi observado retar- do do desenvolvimento neuro-psico-motor no paciente PCS e um baixo aproveitamento escolar em RJCS e PCS.2. Não foram relatadas outras patologias importantes em nenhum dos doentes. As condições de (PCS. CC. nutrição foram consideradas inadequadas em 4 crianças WL. a não ser criptorquidia tratada com Pregnyl en AMAS. ANTECEDENTES INDIVIDUAIS Todas as gestações evoluíram sem intercorrências. asma brõnquica em RJCS e verminoses prévias. I Í . Com exceção de vitaminas. Apenas 1 criança nasceu corn peso inferior a 2. Dois pacientes (JAS e FS6S) referiram início do d£ senvolvimento puberal aos 14 e 15 anos.108 1.3. antes de nenhum paciente tinha recebido qualquer tratamento procurar o HC-FHUSP. 1. com duração de 9 meses. sendo 3 pélvicos e associados a cianose do recém-nascido. Os 10 partos foram por via vaginal. do os demais pré-púberes.500 g e nenhuma com altura abaixo de 48 cm. HISTÓRIA DO DÉFICIT ESTATURAL O retardo de crescimento foi notado pelos familiares nos primeiros 6 anos de vida. CAN) e as de afeto domiciliar em apenas 1 (ARC). respectivamente.

de 1 . A paciente FSGS apresentava polidipsia. não ser presença de fronte olímpica e esclera a2ulada em CC. Seis meninos e 2 meninas foram considerados pré-p£ beres ao exame físico. Foi relatado nanis mo acentuado (não investigado) só em 1 irmão de ARC.6. não sen do referidas outras patologias lias. constituído por apenas 2 . associados a pele ressecada e reflexo aquileu lentificado em 2 (RJSC e P C S ) . nictúria e hemianopsia bitemporal não associada a cefaléia.4. sendo observada consangüinidade entre os pais de 4 (ARC. No Grupo 2B (púberes). Nenhum dos outros doentes referia sintomas neurológicos. PCS. RJSC. sendo classificados como Grupo 2A (Tabela I X ) . CAN e JAS) apresentavam sinais típicos de nanismo hipofisãrio como nariz em sela e adiposidade abdominal. ANTECEDENTES HEREDITÁRIOS A média da altura dos pais foi menor do que 158 cm em apenas 1 paciente (FSGS). relewntes nas demais famí' | 1. PCS. CC. Não foram a detectadas outras anormalidades em nenhum dos pacientes. INTERROGATÓRIO COMPLEMENTAR poliúria.109 1. FK. hipotireoidismo ou de hipocortisolismo. CC e JAS).5. EXAME FÍSICO Sete pacientes (ARC.

e calcificaçã> suprasselar.nc elementos (Tabela X) a paciente FSGS apresentava pubarca e telarca (estádio II de T a n n e r ) . Os demais exames laboratoriais e ^ tavam dentro dos limites da normalidade. CC e FSGS) e graus variáveis anemia normocítica normocrômica ou microcítica hipocrômica em t o d o s . 0 Rx de crânio de FSGS revelou sela túrcica con cii mensões a u m e n t a d a s . CC e C A N ) . sendo detectada hipo_ albuminemia discreta em apenas 1 (CAN). Foi constatada verde minose em 3 pacientes (WL. com exceção de FK. Nos demais pacientes. AVALIAÇÃO L A B O R A T O R I A L E RADIOLÓGICA GERAL E X) (TABELAS IX As proteínas séricas totais encontravam-se diminuí das em 4 pacientes (PCS. anormalidades ao A idade óssea estava retardada em todos os pacient e s . sendo confirmado o diagnóstico de tumor cístico com extensão intra e suprasselar pela tomografia computadori zada. 2. enquanto que JAS tinha testí culos com 3. o estudo radiolôgico não mostrou nível da sela türcica.2 cm de diâmetro. 2 . não sendo compatível com a idade estatural em apenas (AMAS e W L ) . WL. desdobramento do assoalho.

9 4. tot. C C CAN Noraa! K M H 9.0 5.0 12.9 1. 6 114.5 2.2 5. (anos) (kg) Peso (-DP) Altura Idade Idade óssea (anos) fcit»o cresc.Dados clínicos e laboratoriais em pacientes prê-púberes com déficit de GH (Grupo 2A) Noae Sexo Idade cron.0 26.6 3.3 3. I 5.5 3 5 7 4. 1 3.6 3.0 9. 5. 133.2 10. 8 5.0 13.0 2. 1 ii ( D (c) 98.5 H.7 4.0 10.0 12-15 6-B i (l) Oesvio-padrão e» relação a «édia para sexo t idade segunda as tabelas it Karques e col.9 0. 6 119.5 6.7 10.4 5 ii *í 11. (45.0 5.3 29.2 *.4 K M H F F 5.2 10.0 3. 2 113.9 J :! .3 10.4 3.0 12. -DP) ( ( D tstat.4 6. i. (anos) (s/ál) 11.7 4 7 85 2. Prot.9 15.4 3. Alb.8 2.6 87 4 84 7 2 1.4 11.4 11.2 15 .2 2.9 (g/dl) (s/<^ 4.7 6 10 12 21. 7 2.5-5.1 8.5 2 5.4 5.5 3.5 7..7 25.0 í.5 6.2 2. . p »* - 5.0 2. (c»/ano) Heioç.7 6. 4 0.8 5.0 1.3 3.2 9.ill TABELA IX .0 15.1 3.7 i AC R RJSC F K PCS AHAS »L.5 3. 2. 0 12*.

(anos) 67 . 6-8 (<ó). (1) (anos) (kg) (-DP) X F 14.5 25. ig/dl) (g/dl) 63 .0 O e s v i o .1 21. 8. JS A FSGS Nor.) 120. tot. éssea (anos) 9 9 Ritio tresc.112 TABELA X - Dados c l í n i c o s e laboratoriais em pacientes púberes com d é f i c i t de G H (Grupo 2B) Idad: estat.9 128.al (l) 4.7 10.6 4. . 1 3.4 3.2 2.8 Idad. 8 (-DP) (1) 5. (ct/ano) 3.5-5.7 3.8 (fl/dl) 11.9 12-16 Alb. 62 .p a d r ã o em r e l a ç ã o a « é d i » para seno e idade segundo as t a b e l a s de Par-ques e c o l .5 16. 4 Altura (c. Prot.2 < jj Note Peso Sexo Hade cron.0 4.

PCS e FSGS). . não foi necessário i n t e r — romper o teste devido a perda de consciência em nenhum. Com exceção de JAS.1 ng/dl. não . níveis sêricos reduzidos de T 3 e/ou T . no Grupo 2B. TESTES FARMACOLÓGICOS DE ESTÍMULO 4. Níveis de glicemia inferiores a 40 mg/dl ocorreram entre 15 e 30 minutos após administração da insulina em todos os testes. JAS mostrou um valor de 50. quando correlacionada com a idade cronológi ca e sexo. foram observados em 3 (RJSC. • . confirmando a presença de hipotireoidismo secundário. Já o estradiol i sérico caiu abaixo da sensibilidade do ensaio (10 pg/ml ) em todos os pacientes de ambos os grupos. enquanto que. TESTE DE TOLERÂNCIA XIV E XV) Ã INSULINA (TABELAS XIII.113 3. mostrou-se diminuída em todos os pacientes.0 ng/ml . associados a valores normais de TSH. Apesar dos sintomas desagradáveis de hipoglicemia observados em todos os pacientes. 4.1. todos os pacientes partiram de níveis basais de GH iguais ou menores do que 1. A testosterona sérica situou-se em nível inferior a 2? ng/dl em todos os meninos do Grupo 2A. AVALIAÇÃO HORMONAL BASAL (TABELAS XI E XII) A SmC.

22-2.22-2.7) 0.5 0.5 1.10 (0.D ARC (0.0 (1) Valores noriais para sexo e idade cronológica.5-11.2 13.0 25.0 AMAS ML CC 156 11.10 (0.9 8.2 147 7.10 (0.90-5.13 (0.0 CAN 97 8.14 (0.0 E 2 (w/dl) 7.0 135 8C .41-4.3 < IO 3-27 < 10 Norial 80-200 4.6) < 0.91-3.1) < 0.22-2.4) < 0.7 6.5) 3 (ng/dl) 100 T \ TSH (\iUlfil) 4.8)' RJSC < 0.8) PCS 0.18-2. .4 75 4.10 (0.114 TABELA XI - Avaliação hormonal basal em pacientes prê-púberes com d é f i c i t de G H (Grupo 2A) Noae SiC (u/.2 T (ng/dl) 16.10 (0.7 2.28-3. < :c 2.0 2.0 93 7.8) < 0.4 42 23.7 (pgM) ° >1! (1) 122 3.8-5.5 3.

1) FSGS 37 3.9 2.10 (0.7 TSH (jiUl/dl) 2.71-4.2 T E (ng/dl) ( p 9 M ) 50.0 > 5C < 82 (l) Valores noraais para sexo e idade cronoláçica.5 0.90-5.5-11.l) T (ng/dl) 97 T dig/dl) 10. .7 < 10 Norial 80-200 «.10 (0.6)' 0.8-5.1 JAS 0.115 TABELA XII - Avaliação hormonal ba:al e pacientes püberes com m d é f i c i t de G H (Grupo 2B) Nose S»C (U/.

2 3 ) .5 ny/ml no tempo 3 0 . do hormônio liber^ valores máximos foram observados . Com relação ao cortisol (Tabela X V I ) . a média dos picos d e t e c t a d o s apôs injeção de insulina foi de 0.89 +_ 0.08 n g / m l . a resposta foi c o n s i d e r a d a subnormal em apenas 3 (RJSC. PCS e F S G S ) .116 havendo incrementos acima de 1. No pacientes JAS.01) do que a obtida no Grupo IA. Após estímulo h i p o g l i c ê m i c o . ccn os apresentavam secreções nitidamente d i f e r e n t e s de GH. os entre 30 e 90 m i n u t o s . já que este era constituído por apenas 2 pacientes q u e . confirmando a deficiência do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) ou dor do ACTH (CRF). além de tudo.4 ng/ml apôs o estímulo hiooglicêmico em nenhum. No G r u p o 2A. a concentração de GH elevou-se de um basal de 1.s e normais em todos os pacientes.9 ng/ml para um máximo de 3. estatisticamente menor (p < 0. Nos pacientes em que houve discreto aumento dos níveis de GH durante o teste. Não foi calculada a média dos picos nem realizada a comparação estatística do Grupo 2B com os d e m a i s . Houve uma dis criminação completa entre os níveis de GH o b s e r v a d o s nos diferentes tempos do ITT no Grupo 2A quando comparados do Grupo IA (Fig. os níveis sj? ricos basais m o s t r a r a m .

8 <: 0.05 0.0 1.08 EPH (1) Média dos níveis de GH nos teipo.9 1.8 JAS n PCS AKAS XL CC CAN Hidia 0.7 0.89 0.5 1.3 0.9 3.8 0.1 0.08 o.2 lfk J.9 0.9 0.ei 0.70 0.6 0.7 < 0.3 1.9 0.6 1.7 0.6 < 0. as concentrações de GH que caíra* abaixo da sensibilidade forai consideradas iguais ao valor da sensibilidade do respectivo ensaio.9 1.0 0.2 2.0 0.18 FSGS 1.0 0.9 1. .Níveis de GH em condições basais (B) e de pico (P) em pacientes com déficit de GH Pacientes púberes ÍG^upo 2B) «fvtis d» GH ( n q M ) No«* ITT Clonidina Pacientes pré-púberes (Grupo 2A) Híveis de GH (nq/il] ffoae ITT Clonídina B ARC RJSC 0.6 < 0.8 M 0.6 0.6 0.3 0.TABELA XIII .6 < 0.5 B 1. de -30 e 0 linutos.7 0.9 < 0.7 U.0 1. (2) Para o cálculo da aídia.6 0.7 1.

7 86 <0.-: 0.6 58 0.6 28 0.6 1.90 0.6 61 0.9 0.0 0.83 0.3 67 0.12 1.6 86 <0.5 C.6 50 0. (3) Para o cálculo das iíd.« <C. (2) Gliceiia (*g/dl).6 1.20 0.8 " 0.7 11 0.68 0.9 -3C <0.9 0.6 38 1.0 43 0.6 76 <0. (2) G GH G GH G PCS GH G ANAS GH 6 "L GH G GH G GH G GH 0.6 120 1.9 <0.7 0.2 0.0 1.Níveis séricos de GH nos testes de tolerância ã insulina e clonidina em pacientes pré-púberes com déficit de GH {Grupo 2) Nose Dosage» -30 GH.9 39 0.5 <C.19 (1) GH (ng/il).0 1.6 48 0.6 30 1.5 <0.77 0.9 <0.11 1.09 C.0 35 0.06 0 <0.06 (0.05 0.7 36 0.9 1.8 77 <0.3 25 <0.3 0.9 <0.9 1.9 40 0.9 0.C5 0.6 - <0.8 32 <0.8 39 <0.6 0.77 0.6 32 0.6 17 0.6 2.7 0.8 49 0.6 27 0.08 <0.9 1.7 39 0.8 56 <0.7 72 0.7 51 0.6 72 <0.10 ITT 15 <0.80 0.6 39 1.3 1.5 <C.7 32 0.1 1.9 73 0.1 U/kg) 30 45 0.S 22 0.9 0.07 90 0.0 0.9 0. .8 43 1.4 40 <0.9 26 1.6 78 <O.0 ARC 0.6 34 <C.118 TABELA XIV .6 CC nu Hídia^ EPH <0.6 104 <0.6 81 <0.0 40 <0.2 33 <0.9 <0.6 <0.6 56 0.6 <0.78 0.71 0.73 0.5 0.04 Clonidina (C.6 44 42 «"0.85 0.1 75 0.2 0.0375 i g V ) 0 30 60 90 <0.9 82 0.9 0.2 0.9 60 <0.: :.6 <O.6 2.9 <O.9 89 1. .6 30 0.9 80 0.as.3 1.9 <0.6 34 <0.8 36 <0. as concentrações de GH que caírai abaixo da sensibilidade forat consideradas iguai* ao valor da sensibilidade do respectivo ensaio.73 0.5 0.

1 1.9 26 2.7 1.Níveis séricos de GH nos testes de tolerância ã insulina e clonidina em pacientes púberes com déficit de GH (Grupo 23) No» Dosage» -30 GH G GH G 1.4 53 Clonidina (0.9 33 2.6 4.8 62 -30 1.7 2.2 78 1.8 1.5 26 <0.119 TABELA XV .1 82 ITT (0. (2) Gliceiia («g/dl).0375 »g/»') 0 30 60 90 1.7 88 0 <0. .9 24 3.1 1.3 1.9 35 <0.1.0 "' S (1) GH (ng/il).5 60 <0.8 3.9 36 2.1 46 90 <0.9 37 2.2 FSGS 1. 120 1.1 U/kg) 15 30 45 <0.9 74 2.

de maneira semelhan te à observada no Grupo 1. mas não diferente (p = 0. foi de A análise estatística mostrou que esmesmo te valor era menor (p < 0. XIV E XV) Houve redução de 10. não houve incremento acima de 2. Esta queda ocorreu entre os 60 e 120 minutos do tes te e foi acompanhada por leve sonolência. Houve também uma discriminação completa e£ tre os níveis de GH observados nos diferentes tempos do teste da clonidina no Grupo 2A quando comparados com os do Grupo IA (Fig.08 ng/ml.6 imiHg nos _ níveis da pressão arterial sistólica e diastõlica. não foi calculada a média dos picos nem realizada a comparação estatística com os demais pelas razões anteriormente especificadas. No Grupo 2B. nos testes em que houve discreto aumento dos níveis de GH.01) do que o observado no teste no Grupo IA. 2 3 ) .3 ng/ml em nenhum. ocorreram entre 30 e 90 minutos apôs grupos .37) do obtido no ITT no Grupo 2A. Todos os pacientes partiram de concentrações basais de GH iguais ou inferiores a 1.8 e de 5.120 4.8 + 2. Após administração da clonidina.81 *_ 0. Os tempos de pico. com exceção de JAS.0 + 1.2. a média dos picos põs-cionidina de 0. respectivamente. No Grupo 2A. TESTE DA CLONIDINA {TABELAS XIII.4 ng/ml.8 ng/ml no tempo 60. que mostrou um valor máximo 4.

) E CLONIDINA (^--4. * .*—«. 2 3 . .0—6) EM PACIENTES PRÉ-PÚBERES SEM DÉFICIT ( • .* ) E COM DEFICIÊNCIA (c^-o a—a) DE GH.NÍVEIS SÉRICOS DE GH ( MEDIA± ERRO PADRÃO DA MÉDIA} NOS TESTES DE TOLERÂNCIA À INSULINA (•—.121 GH ( ng/ml) 30 60 90 120 TEMPO (MINUTOS) F!G.• .

não foi possível avaliar o grau de r e s p o s t a . nesta fase. já que. a hipófise normal pode não responder ao estimulo agudo com LHRH. Com exceção de CAN (teste não r e a l i z a d o ) . sugestivo de distúrbio h i p o t a l â m i co. ao passo que. PRL. excluindo uma deficiência hipofisãria total d e £ tes hormônios. indicando uma baixa reserva hipofisãria destes h o r m ô n i o s . todos os pacientes responderam ao LHRH com elevação dos níveis séricos de LH e FSH. . Após estímulo com TRH. LU e FSH foram normais. TESTE DO TRH ASSOCIADO AO LHRH (TABELA XVI) Todas as dosagens basais de TSH.3. 0 aumento das gonadatrofinas foi considerado crianças normal nos 2 pacientes púberes. com exceção do valor elevado de PRL observado nos pacientes PCS e FSGS. nas p r é . sendo mais precoces do que Grupo 1. r e s p e c t i v a m e n t e .122 administração da c l o n i d i n a . os incrementos do TSH e PRL foram considerados subnormals em apenas 1 (CAN) e 2 (FSGS e C A N ) pacientes. a resposta exagerada do TSH sugeriu um distúrbio hipotalãmico. Em RJSC. no 4.p ú b e r e s .

20.6 4.5 2.1 7. (0.9 32.4 21.6 12.6 5.0 16-42 8 2.7 10.5 2.0 12.8 34.1 13.0 30.9 8.1 5.2 4.0 30.6 16 .6 4.3 12.8 1.0 19.5 6.3 8.0 21. 26.0 27.lédia dos níveis horaonais no teipos it -30 e 0 cinutos.0 13.1 15.: 4.0 7.1 2-16 21. TSH.8 23.7 7.7 5-17 3.9 11. Nadir.7 23.0 8.8 7.1 6. LH e FSH ao estímulo hipoglicêmico.0 20..Resposta do corfisol (F).6 13. Valores noraais segundo Nery (52).6 12.0 6.3 16.8 0.6 5.1 1.I) FSM (»ui/ii 8 FCS ARC RJSC F K PCS A!US M L 82 66 86 85 74 77 88 78 5/ 85 76 70-110 P 20.2 1.5 9. PRL.4 c c CN A JAS FSCS Nonal (1) (2) (3) (4) (5) 8.1 2.2 1.3 6.0 32.4 4.e (ig/dl) TSH (pUl/iI) PRL (pg/.4 2.0 58.8 7.4 8.' 85 .8 9.8 3.5 20.8 4.3 26. 4-".'.5 10.5 6-30 B 34.9 10.6 29.(5 -17 3-17 2-9 Basal .4 5.6 2.? 15-98 11.3 25.0 31.7 12.0 21.2 2. Respostas noriais para pacientes púberes.6 4.9 3.9 <.7 5.Iic.4 10.1 98.9 3.9 2. . TRH e LHRH em 11 pacientes com baixa estatura ITT .0 5.1 55.3 3. Pico de concentração horaonal após estíaulo.7 25 3 13-97 C5i 2.1 31.8 15.7 3.9 4.0 5.9 1-6 P 26.1 ü/kg) F (ytg/dl) TRH (200 pgj LriRH LH (IÜI/»'!) (IQQ uq) Ho.4 30 30 25 26 36 30 39 32 1 1 26 24 16.123 TABELM XVI .3 29.

houve aceleração da velocidade de crescimento em RJSC. com exceção de FSGS. CAN. a qual foi submetida a cirurgia transfenoidal 3 mesr após a avaliação inicial. SEGUIMENTO (FIGS. Neste sendo confirmado o diagnóstico de craniofaringioma.1 U/kg con- mento com GH extraído de hipófises humanas no HC-FMUSP de peso administrados por via intramuscular 3 vezes por semana). Com exceção de ARC e FK.7 anos. período. Após iniciado trata(0. a única medicação administrada foi 1-tiroxina (50 a 100 ug por via oral) aos pacientes com hipotireoidismo firmado laboratorialmente. sendo que apenas WL entrou em puberdade aos 15.124 5. 21 E 22) Todos os pacientes foram seguidos por um período mínimo de 6 meses. todos os demais pacientes apresentaram ritmo de crescimento reduzido. CC e .

R/SP .VIII - ÜI SCUSSAO COM:1- A : '•' • V-.

no primeiro teste. cuja média dos picos foi de 18. (63) relataram picos de GH de 21.7 ^1. (16) não encontraram respostas inferiores Já a 7.4 + 4.6 ng/ml. Sa]_ ti e col. Fm escudo sero?1han te.9 +_ 4. que observaram 10 ng/mi (média + erro padrão da média: 34.5 ng/ml ) em _ todos os elementos de um grupo de 18 crianças e adolescentes com baixa estatura sem distúrbio endccrino. Isto foi demonstrado pela primeira vez por picos de GH Gil-Ad e acima de col. associado a menor i n c i — dência de rc.8 + 1. Picos muito mais elevados durante .0 ng/ml) em 14. é comprovadamente um potente agente estimuiador da secreção de GH.1-0.15 mg/ra*.126 A clonidina.7% dos paciente1. (66) relataram picos pós-clonidina de 13. Fraser e col.66) em que o teste da cloni dina (0. sendo menores ou Iguais a 8..ultados falso-negativos.39.5 ng/ml em nenhum teste da clonidina.0 ng/ml em 9.3%.9 ng/ml.15 mg/m* ) foi comparado com o ITT (0. Romero e col. (23. foi observado maior pico de liberação de GH. Em três estudos (16.24) em 1979.15 U/kg ou 4 U/m 2 ) em pacientes com nanismo não hipofisário.0 ng/mi. com resultados falso-negativos (resposta menor do que 7. administrada na dose oral de 0.

95 e 13.15 mg/m 7 .3 + 0.05.-ni A eficiência de liberação de GH provocada pela clonidina foi considerada equivalente e não superior à do ITT em apenas um trabalho (30).8% de respostas inferiores a 10 ng/. Devido à ocorrência de hipotensão por vezes severa (47) associada â dose de 0.15 mg/m 2 ) também mostrou-se superior ao do 1-dopa (120-250 mg ou 300 :ng/n>*) e ao da argi nina (0. En- tretanto.5 + 9. Romer e col. a clonidina foi testada em quantidades menores com o intuito de se reduzir a incidé£ cia de efeitos colaterais e.5 g/kg). nanismo em 1982. (62) estudaram. diferentes laboratórios e os pacientes nem sempre estavam em jejum no dia do teste da clonidina (16). manter eficiência adequada de liberação de GH.0 ng/ml (6 e 0%. foi observado de liberação de GH (16.10 e 0. ao mesmo tempo. 0 teste da clonidina (0.71) realizados em pacj^ maior pico entes com nanismo não hipofisário. com 5. (39) no único estudo em que apenas crianças pré-púberes foram avaliadas. algumas objeções foram feitas quanto à validade dos resultados deste último estudo.9 ng/ml) foram observados por _ Lanes e col.127 este teste (36. respectiva — mente) no teste da clonidina. Em dois estudos (62. 0.1 + 1. já que as dosagens de GK foram realizadas en. que consistiu na investigação de 64 pacientes coro baixa estatura em diversos centros da Grã-Bretanha. a secreção deste ho mõnio em pacientes com não hipofisário após administração de 0.15 mg/m* .76 ng/ml) e nenor _ índice de resposta inferior a 7.

123

de clonidina, não observando diferenças estatisticamente sig nificantes nas respostas obtidas com estas 3 doses. Neste

mesmo ano, Laron e col. (41) propuseram a realização Jo teste da clonidina com a dose fixa de 0,025 mg e compararam-no com o ITT (0,1 U/kg). Em 12 pacientes com baixa estatura consti

tucional, sem menção ao estágio puberal, os autores r e l a t a — ram picos de GH e resultados faiso-negativos (resposta menor do que 10 ng/ml ) de 21,8 + 4,9 ng/ml e 16,7% para o ITT, _ e

de 30,6 + 8,8 ng/ml e 8,3% para a clonidina, sendo este ülti _ mo associado a reduções da pressão sistõlica de 5 a 10 mmHg. Concluíram, portanto, que a clonidina, mesmo na pequena dose de 0,025 mg, era um agente liberador de GH mais potente que o estímulo hipoglicêmico. Entretanto, dois estudos subseqüentes (11,40), reji lizados em grupos de crianças pré-púberes com nanismo não hj^ pofisário, demonstraram que o teste da clonidina coro dose in ferior a 0,15 mg/m 2 , embora adequado para avaliar a reserva do

hipofisária de GH, não era tão eficiente quanto inicialmente proposto por Laron e col. (41). No trabalho realizado por

Dammacco e col. (11) em 1983, o teste da clonidina (0,035 mg/m2) foi comparado com o da arginina (0,5 g/kg). Os resultados

revelaram picos de liberação de GH semelhantes (16,7 + 2,44 ng/ml para a clonidina e 15,69 + 2,56 ng/ml para a arginina), _ mas

menor incidência de resultados falso-negativos (pico£7,0 ng/ml) no teste da clonidina (16,7*) do que na arginina (25S). Houve

129

r e d u ç ã o dos níveis pressóricos pós-clonidina de

11,5 i 0,8 mmHg

para a sistõlica e de 7,5 +_ 0,7 mmHg para a diastólica. Jã no e s t u d o de L a n e s e col . ( 4 0 ) , publicado em 1985, a foi t e s t a d a nas doses fixas de 0,100 e 0,050 mg clonidina (corresponem Os

d e n t e s , e m m é d i a , a 0 , 1 1 9 e 0,0619 m g / m 2 , respectivamente) 10 (Grupo A ) e 14 (Grupo B) crianças, respectivamente.

picos de GH foram de 14,5 +_ 2,0 e 11,6 +_ 1,6 ng/ml nos Grupos A e B, r e s p e c t i v a m e n t e , com índice de respostas (menores do que 10 ng/ml) de 10 e 3 6 % . subnormais

Houve decréscimo se14 a

m e l h a n t e da p r e s s ã o arterial nos 2 g r u p o s , variando de

15,3 mmHg para a sistólica e de 2,3 a 4,0 mmHg para a diastó lica. Neste m e s m o trabalho, 9 crianças com baixa estatura de

i d i o p á t i c a foram estudadas com uma dose de 0,100 ug/m 2

c l o n i d i n a e uma única coleta de sangue aos 60 minutos, sendo o b s e r v a d o s picos maiores ou iguais a 10 ng/ml em todas. 0 t e s t e da clonidina com a dose de 0,0375 mg/m 2 foi, neste p r o j e t o , avaliado no que diz respeito â eficiência

de liberação de GH e ã incidência de efeitos colaterais indj; s e j á v e i s , p a r t i c u l a r m e n t e hipotensão e sonolência. to, ele foi c o m p a r a d o com o ITT (0,1 U / k g ) , Para taji

considerado por hipoem

m u i t o s autores o teste padrão de avaliação da reserva f i s á r i a de GH ( 3 2 , 4 8 , 5 8 ) . Os 2 testes foram

realizados

g r u p o s d i s t i n t o s de crianças e a d o l e s c e n t e s , para se estudar também a possível influência da puberdade sobre a do GH à c l o n i d i n a . resposta

130

A avaliação clinica, laboratorial e radiolôgica ge ral obe-deceu às recomendações propostas por Underwood & Van crianças hormônios

Wyk no que se refere ã investigação diagnostica de com baixa estatura ( 7 4 ) . As dosagens basais dos

tireoidianos, gonadotrofinas e SmC contribuíram para descartar a presença de hipotireoidismo, disgenesia gonadal em neninas púberes e nanismo hipofisârio, respectivamente. 0 ITT foi padronizado segundo critérios previamente estabelecidos na literatura (18,20,35,36,56,59,64,72,77), com coletas de sangue até os 90 minutos após administração da insulina, já que, neste teste, o pico de GH geralmente ocorre entre os 30 e 90 minutos. A coleta não foi continuada até os 120 minutos para não perpetuar em demasia os efeitos cola terais desagradáveis associados ã em todos os pacientes. 0 teste da clonidina 0,0375 mg/m*, escolhida por foi realizado corresponder a corc a dose de exatamente um hipoglicemia, observados

quarto do valor inicialmente preconizado na literatura (0,15 mq/rn*) e ser próxima da dose de 0,035 mg/m z , já previamente testada e associada a boa eficiência de liberação de GH e baixa inci^ dência de efeitos colaterais ( 1 2 ) . Foi ponderado também que, embora criasse problemas na hora de sua preparação, a deveria ser corrigida para a superfície corpórea, que todas as crianças recebessem,proporcionalmente, quantidade da droga. de a dose modo mesma

16. Todos os soros e de um mesmo paciente foram dosados em um único ensaio.30.dessa maneira.63.(38. já que. As amostras de sangue após administração da clonidina foram coletadas a cada 30 minutos durante 2 horas. 0 fato de que os tempos de coleta não foram idênticos neste teste e no ITT não invalida a comparação entre eles.44 ) . em todos os estudos prévios (11.23. já que o menor comprimido comercializado contém 0.40.a Influência da variação ínterensaio.0 ng/ml. individualizadas para cada paciente.131 A transformação da clonidina em pó e posterior diluição em água foi a única maneira simples encontrada de se preparar diferentes micro-doses da droga. já que corres pondem a estímulos provocativos diferentes da secreção de GH.62.0 0 ao a 30.1 mg. correspondente â maior parte dos picos de liberj^ .o GH foi determinado por método próprio de RIE completamente desenvolvido. método foi ajustado de modo a apresentar sensibilidade redor de 1. caracterizado adequado às necessidades deste projeto.41. 66. o pico de GH ocorreu entre 60 e 120 minutos. 7 1 ) . este procedimento fa cilitou também a administração da droga a crianças que se re cusassem a engolir o comprimido. embora ambos com provável ação ao nível de receptores a-adre nérgicos centrais.39. Embora não se conseguisse uma solução comple tamente homogênea de clonidina em água. Em todos os testes.0 ng/ml e precisão máxima no intervalo de 5. evitand£ -se.

A especificidade do ensaio foi demonstrada pelo baixo grau de imunorreatividade cruzada do anti-soro anti-GH com os demais hormônios hipofisãrios e pela ausência de efeitos não específicos do meio de incubação sobre a reação antígeno-anticorpo. Não se procu- rou obter maior sensibilidade porque não era a finalidade des te projeto estudar valores basais de GH. basea da nas características clínicas. confirmando a importância do exame clínico. 58. obede- ceu a critérios previamente estabelecidos na literatura (32. dosagem basal de SmC e resposta aos testes provocativos. o na- nismo hipofisãrio foi fortemente suspeitado na avaliação clí^ nica pela severidade do déficit estatural e/ou presença de sinais típicos. já que estudos prévios (35) demons^ traram que a resposta do GH aos testes provocativos não é dj_ ferente nestas doenças quando comparadas entre si ou com indivíduos normais. Em todos os pacientes incluídos no Grupo 2. permitiu uma boa discriminação entre os pacientes . considerado um dos parâmetros mais importantes na decisão de se submeter ou não um p^ ciente com baixa estatura a investigação laboratorial extensa (74). ritmo de crescimento. Foi possível a inclusão de pacientes com patolo- gias diversas no Grupo 1.75).132 çâo de GH observados nos testes provocativos. 0 ritmo de crescimento.74. A c 1 assificação dos 31 pacientes em portadores (Grupo 1) e não portadores (Grupo 2) de déficit de GH.

freqüentemente como teste de tr'agem para excluir o diagnóstico de utilizada nanismo hipofisário (74. Em crianças aci ma de 5 anos de idade.75). como hi potireoidi smo e desnjj trição. embora situando-se abaixo do percentil 1 0 . A dosagem sérica de SmC. Todos com exceção de 2 pacientes do Grupo 1. apontada como um dos melhores índices do estado nutricional adequado de um indivíduo (74). a presença de SmC diminuída praticamente excluiu esta hipótese. Aliás. res normais de SmC praticamente excluem deficiência (75). a dosagem sêrica normal de SmC. mostrou-se normal em todos os pacientes incluídos no Grupo 1 e diminuída nos do Grupo 2.133 com e sem deficit de GH. faixa etária em que se enquadravam ^o dos com exceção de 1 paciente estudado neste projeto. principalmente em quando . e não permitem estabelecer o diagnóstico de nanismo hipofisário ( 7 5 ) . foi também utilizada para des^ cartar a presença de graus mais severos de desnutrição qualquer um dos pacientes do Grupo 1. acompanha ram a curva normal de crescimento. valores baixos estão freqüentemente associados a outras patologias. p o s s i b i l i — tando uma completa diferenciação entre el&s. Embo ra eles pudessem apresentar alguma forma de GH biologicamente ativo mas imuncligicamente não ensaiãvei ( 7 4 ) . Não foi encontrada explicação adequada para a velocida de de crescimento normal nestes dois últimos pacientes. enquanto que isto ocorreu em apenas 2 crianças do Grupo 2 durante o período de observa ção. valode GH Por outro lado.

apenas um pacien- te púbere do Grupo 2 mostrou resposta maior do que 2.0 ng/ml em pelo menos um teste p r o v o c a t i v o . resultados obtidos foram mais compatíveis com os relatados por Dammacco e c o l .obtidos por Laron e col (41) com a menor dose de cloni- COV' . Entretanto. (41) com a fixa de 0.0 ng/ml. Por outro lado. (39) com a dose i n i cialmente preconizada na literatura de 0.134 associada a c o n c e n t r a ç õ e s basais baixas de GH.025 mg e aos de Lanes e col. 48 Este valor está de acordo com os resultados obtidos nes te e s t u d o . já que todos os pacientes incluídos no Grupo 1 apresentaram picos de GH maiores do que 7. Segundo os critérios pro- postos por Milner e col. o qual estava também associado a menor incidência de respostas faiso-negativas.3 ng/ml. a maioria dos auto res considera um pico de GH acima de 7. (11) com a dose de 0.035 mg/m' e por Lanes e col.15 m g / m 2 . sendo ainda inferior a 5. este paciente poderia ser cias sificado como déficit parcial de GH. ( 4 8 ) .1 mg. A c o m p a r a ç ã o entre o teste da clonidina e o ITT no grupo de crianças pré-púberes demonstrou que a média dos picos de liberação de GH foi maior (embora não estatisticamente s i g n i f i c a n t e ) no primeiro teste. foram dose Os n i t i d a m e n t e Inferiores aos de Laron e c o l .0 ng/ml como resposta normal a qualquer teste de liberação deste hormônio (32 74). Embora um assunto controvertido. Estes d£ de dos reforçam a idéia inicial de que os maiores valores pico. (40) com a dose fixa de 0.

Não houve correlação entre a presença de resposta inadequada e a superfície corpõrea ou sexo do paciente. os quais necessitariam de quant^ dades da droga proporcionalmente maiores do que crianças. fato curioso levando-se em consideração que a puberdade geralmente está associada a respostas mais exacerbadas de GH (19). talvez se devam ao fato dos autores incluído crianças e adolescentes em um mesmo grupo. não estava presente em nenhum paciente. A obesidade. freqüentemente associada a respostas subnormals de GH (73). contrariamente ao que ocorre com os de- . as respostas do GH aos estímulos clássicos são maiores do que na infância (19). o mesmo estudo comparativo revelou que a média dos picos de liberação de GH foi menor (embora não estatisticamente significante) no teste da clonidina. terem que provocativos No grupo de pacientes púberes. jã na puberdade. A média dos pi- cos pós-clonidina neste grupo foi também inferior ã observada nas crianças pré-púberes. o qual apresentou também incidência muito maior de resultados faiso-negativos do que o ITT. Es ta posb'bi idade implicaria talvez em uma menor sensibilidade dos receptores o 2 -adrenérg1cos centrais ã clonidina na época da puberdade. embora corrigida a maior superfície corpórea apresentada pelos adolescentes. A única hipótese proposta para explicar estes para resultados ê que a dose de clonidina.135 dina jâ testada. tenha sido insuficiente para provocar uma eficiente liberação de GH nestes pacientes.

0375 m g / m 2 . na dose de 0. Com relação aos efeitos colaterais. inferior ã observada com a dose de 0. o em ITT resultou em sintomas desagradáveis de hipoglicemia todos os pacientes. Nos pacientes púberes.15 mg/m 2 ou no ITT. A redução dos níveis pressóricos foi. portanto. Esta dose.66).15 my/m 2 (23. ao passo que os efeitos colaterais são muito mais discretos e menos perigosos do que os observados ou no teste realizado com 0. ser considerado o teste provocativo de eleição para excluir o diag — nóstico de nanismo hipofisário em crianças pré-púberes. Nesta dose. não havendo.135 mais estímulos provocativos da secreção de GH. a sonolência e hipotensão observadas no teste da clonidina foram semelhan- tes ãs relatadas nos trabalhos em que a droga foi administra da nas doses de 0. portanto.0375 mg/m*) deve. Conclui-se. pois. que correspondem â maior parte dos pacientes que procuram o endo crinologista por baixa estatura.0375 mg/m 2 em crianças pré-púberes. Por outro lado. no entanto. perda de consci ência em nenhum.025 mg ( 4 1 ) .035 mg/m z (12) ou 0.39. deve ser utilizada apenas em teste complementar para excluir .62. a eficiência de liberação de GH ainda é maior do que a do ITT. 0 teste da clonidina (0. a clonidina. que o teste da clonidina deve ser preferencialmente realizado com a dos? de 0. é um agente liberador de GH muito menos potente do que o estímulo hipoglicêmico. no entanto.

o d i a g n ó s t i c o de n a n i s m o hipofisãrio pode ser e s t a b e l e c i d o com segurança próxima a 1 0 0 % . F i n a l m e n t e . quando os r e s u l t a d o s do teste da cloni dina (0.137 d e f i c i ê n c i a de GH neste grupo ou.0375 m g / m 2 ) são associados aos do ITT. sugerindo que ambos devam ser r e a l i z a d o s p a c i e n t e s com suspeita clínica desta p a t o l o g i a .15 m g / m 2 . p r e f e r e n c i a l m e n t e . deve ser s u b s t i t u í d a pela dose de 0. em .

IX - CONCLUSÕES .

1 U / k g ) . excluir 3S) Quando os resultados do teste da clonidina (0.0375 mg/n 2 ) são associados aos do ITT (0. por tanto. o diagnóstico de nanismo hipofisário pode ser estabelecido com segurança próxima a 100%.0375 mg/m2) apresenta incidência muito maior de resultados falso-ne gativos do que o ITT (0. devendo.0375 m g / m 2 ) apresenta naior efi ciência de liberação de GH e menor incidência de efeitos colaterais graves do que o ITT {0. ser utilizado apenas como teste complementar para deficiência de GH.1 U / k g ) . portanto. . 29) Nos pacientes púberes.139 le) O teste da clonidina (0. devendo.1 U / k g ) . ser considerado o teste provocativo de eleição em para excluir o diagnóstico de nanismo hipofisário crianças pré-púberes. o teste da clonidina (ú. sugerindo que ambos devam ser realiza- dos em pacientes com suspeita clínica desta patologia.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .X .

Isolation of human pituitary hormones from frozen glands.E. 2. G. . 75{Suppl. 29:866-70. 53:1008-13. 4. RENWICK. The J.. 6.. 1934. 1931. ABRAHAM.E. Endocri no!ogy. 1980. materials.. 4ed. 98:420-8. Clin. V. 183):1-42.G. BROWN. Metab. Exame parasitológico de São Paulo. Philadelphia. & BROWN. 1976.. Solid phase radioimmunoassay of oestradiol. A. G.L. Endocrinol. Neurotransmi tter regulation of growth hormone and ACTH in the rhesus monkey: effects of biogenic amines. Endocrinol. CHAPMAN. Hematology: principles and procedures. 3. Clin. G. Radioimmunoassay of steroids in biological Acta Endocrinol. fezes. & CORRÊA.1974.H. J. AMATO NETO. CHAMBERS. 6. ABRAHAM.C.1. 1969. Lea & Febiger. 17B . B.M.A.. Sarvier. 5. J. LIVESEY. J.W. L.

1973. 1977. F. 93:843-57. In: _ TINI.. 1985. . Saunders. .. W. Endocrinology. DAUGHADAY. 8.D. CHARD. J.H. 70:280-90. 1980. ramento.H. DAMMACCO. New York. Characte rization by electrophoresis and isoelectric focusing in polyacrilarpide gel. YADLEY. Ammonium sulfate and polyethylene glycol as antigen-antibody reagents to separate antigen from complexes. eds.H. & DAUGHADAY. A. D. J.243-77.E. CAVALLO. D'ABRONZO. 7ed. 103(3) :501-2. D.. Pediatr. CHRAMBACH. 1983. F. BAFUNDI. RODBARD. Growth hormone. CRYER.. 1985. 11. G. 12. Williams textbook of Hhiladeiphia. p. eds. 10.. Methods Enzimol. p. The anterior pituitary.. USPi. TORELLI. P. R. I. (Tese de Douto- no fígado humano.W.563-613. Receptores do hormônio de crescimento São Paulo. & FOSTER. J.H. Academic. In: WILSON. Low oral dose of clonidine: an effective test of growth hormone reserve (letter).7. T. 9. FREZZA. M. DAMMACCO. W. BENDAVID. Faculdade de Medicina.. T. endocrinology.M.A. Isohormones of human growth hormone. Clinical neuroendocrinology. & BE^SER. C .. E. L. N.

D. D E S B U Q U O I S . R.325-53... N . C h o l i n e r g i c receptor control m e c h a n i s m s for L-dopa. J. Endocrinoi. 732-8. p. 1983. Clonidine is a b e t t e r test for growth hormone d e f i c i e n c y than insulin hypoglycaemia. M A I O L I . P A L E R M O . Child. B. A.P. S . M. 16. 8-12 September 1969. a p o m o r p h i n e and c i o n i d i n e .. T h e o r e t i c a l aspects of s a t u r a t i o n analysis.. 58:355-8. S E T H . CO: \ . P e d i a t r i c s . D E L I T A L A .D. 1974. . held in Viena. E n d o c r . A review of growth h o r m o n e stimuiati on tests in c h i l d r e n . Arch. 53(6 ):929-37. 15. 1983.. V i e n n a . N . M A N N E L L I .13. F R A S I E R . 57:1145-9. 1970. M. EKINS. . Metab. M. 14.... Pis. In vitro In: INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY A G E N C Y . Use of p o l y e t h y l e n e peptide 33: glycol to s e p a r a t e free and a n t i b o d y .. & AURBACH. S. B R I A N D A . J. Clin. G. P A C I F I C O .b o u n d h o r m o n e in ratíioimmunoassay. p r o c e d u r e s of radioisotopes in m e d i c i n e : proceedings of the symposium on. C .i n duced growth h o r m o n e secretion in man. J. G... 17. S. BROWN. F R A S E R . C l i n . 1971.

eds. GAINES DAS. 71:625-38. CORRIE. 1978..L.response curves..E. FROHMAN. SMITH JR.F. WISE. hypo- 20. blood Heuro- . J. R. Studies of growth hormone secretion in children: normal. endocrinoiogy. T.M. REID.D. ACETO JR. R. 21. J. Great Britain. J. SHACKELFORD.T. GANONG. B. 1970.18. J.A. I. Endocrinol. 19. S. BORYCZKA.D.M. Effect of adolescence on the growth hormone response to glycemia. In: HUNTER. 25(2):105-10. C1i n.. J. A.. hypo pituitary and constitutionally delayed. 22. The serum growth hormone response to hypoglycemia in dwarfism. HILBURN.E..H. M. FRASIER. Pediatr.632-9. Pedi atr. A.... Churchill Livingstone... Effect of spinal cord transection of the endocrine and pressure responses to intravenous clonidine. 1967.. p. 1983... Edinburgh. W. L.T. W. FRASIER. & Immupoassays for clinical chemistry. J.. 27:1409-17.C. MACGILLIVRAY. F. 77:465-7. HOLLAND. KAPLAN. Calibration and assessment of standards- -Problems encountered in the comparison of radioimmunoassay dose . S. S. 1967.

T O P P E R . I. . M . 1979. W.. . HUNTER. G O L D . F. g r o w t h h o r m o n e stimulation test ( l e t t e r ) . M .. S . Oral c l o n i d i n e as a Lancet. L A R O N . .. endocrinology. E. G I L .23. GrowthBrit. 28... G O C K E .A D . The p r e p a r a t i o n of 1 3 1 I . and sodium b a l a n c e . L A R O N . & HUNTER. V.. g r o w t h h o r m o n e s t i m u l a t i o n test. REDMOND J R . J. W .J.H. ... GREENWOOD. F. L A R A G H . H. E.i n d u c e d i n c r e a s e in serum growth h o r m o n e : role of epinephrine-mediated s y n a p s e s . J.J. 24. D O N A B E D I A N .A D . G I L . P h y s i o l o g i c a l and pathological v a r i a t i o n of plasma C o r r e l a t i o n with renin activity a n g i o t e n s i n II in man. R. 8 9 : 1 1 4 . HARRIAN. 25. S . 2:1242. G R E E N W O O D .h o r m o n e levels in c h i l d r e n and a d o l e s c e n t s . B i o c h e m . D.C. D . G E R T E N .M. 24/25(Suppl . 1978. Clonidinepossible Psychoneuro- 27. 48. T O P P E R . I. . 3:187-94.C. E . L. M . Ci re .. 2:278-9. Z.K. Oral c l o n i d i n e as a Lancet.. 1969.2 3 . . 1979. -labelled human growth h o r m o n e of high s p e c i f i c r a d i o activity. 1 } : 131- 26. S H E R W O O D . 1 9 6 3 . R e s . Z.

4 . G R E U L I C H . 14(l):l-32. Metab. Harper & Row.G. Clinical chemistry: principles and techniques. Livingstone. New York. GANSE.Churchill p. Optimization of RIA: some simple guidelines.A. THORNER. W . Great Britain. 1985.69-75.. H E N R Y . & CORRIE. JANSSON. S . P i s .. 1 9 6 4 . Comparison of the intravenous insulin and oral clonidine tolerance tests for growth hormone secretion.. 1 9 8 1 . t 5374:25-6. 1983. 5 6 : 8 5 2 .W.. Growth hormone stimulates longitudinal bone growth d i r e c t l y . l. J. Clir. 32.P. ISAKSSON.J. HUNTER.. 29. 34. Radiographic atlas of skeletal development of the hand and wrist. THE HEALTH Services Hunan Growth Hormone Committee. J-0. W. S. . W. 1 9 6 4 . Arch. & PYLE. c r i n o l . K.M. EVANS.O.Y. H. <^. Endo- 33. Edinburg. Ircmunoassays for clinical chemistry.J. Stanford University.T.M e d . Child. HO. T!59. Disorders of prolactin and growth hormone secretion. In: HUNTER.M.M. R. . 31. Stanford. O. 30. eds. W.

1968.L.L. S. BELL.. C. 1965.. 216:1237-8. actions of clonidine. W. prolactin. KOBINGER. J. M. 38. HArtTIH. 2:43-63. BELL. 1982.. J.L.. J.A.B. KAPLAN. 67:956-9. J. MOYER. 35. LAL.A. GUYDA.. 41:827-32.M.. Grune & Stratton.J.M. p.A.. F. Changes in serum level of growth hormone following hypoglycemia in 134 children with growth retardation. Hypertension: mechanisms and management. H. Endocrinol.Science. J.J. ABRAMS. G. eds. K..M. Growth and growth hormone... G. Metab. hormone luteinizing hormone. S. 1973. CONTE. Effect of clonidir.369. Pediet. KAPLAN. M. 1975. C O M E .. . Serum growth hormone response to insulin induced hypoglycemia in disorders of growth.A. J. GRUMBACH. KIM.E.. I. G. Pediatr.. New York. C.. BROWN. Res. F.L. TOLIS. follicle-stimulating and thyroid-stimulating hormone in the serum of normal men. S. GRUMBACH.e on growth hormone. Pharmacologic basis of the cardiovascular In: ONESTI. ABRAMS. Clin... 36. 37.

Z. RECKER. 1947. VANDERLAAN. 41. Amer.. R . 1980. 44. JOSEFS^ BERG.C. 18:50-60.39... R. New York. KAUFMAN. SINGH.. R. Horm. TUTWILER. G. Low oral dose of clonidine: an effective Acta screening test for growth hormone deficiency. H. On a test of whether one of than two random variables is stochastically larger the other. M. Ann.. Z.. Endocrine physiology.R. Pediatr. 40.. U. E. SIGEL.. Math..B.. D. Pis. LANES. Oral clonidine .P. Oxford University. HURTADO. 42. Scand.F.. MANN. I.B. 71:847-8..1985.. J. GIL-AD.An effective growth hormone releasing agent in prepubertal subjects. E. LARON.815-85. 139:87-8. hormone: a complex of proteins.. 100(5):710-4. 36:477-508.. Paediatr. LIFSHITZ.C. LEWIS. H.. 1985.. FORT.F. VANDERLAAN. p.J. R. 1982. Hunan growth Recent Prog. MARTIN. E. 43. N. . R. W. Low-dose oral clonidine. LANES. 1982. hypophysis and thymus. Child. The hypothaiamus. Res. TOPPER. P. B. J. Statist.. & WHITNEY. F. In: MARTIN.

48. . MASSARANO. Specific radioactivity of radioimmunoassay a re-evaluation. T . E . B E R Q U Ó .. R. MARSHALL. I n v e s t i g a t i o n of suspected Arch. 46.45. 50.. R . & CORRIE. C l o n i d i n e and i n s u l i n t e s t s for growth A r c h . C . Pis. E. O . CHAPMAN. B . I n : F A L K N E R .. 1985. {4):399. J . e d s . FATORI. P R A N I . Immunoassays antisera for HUNTER. G . C r e s c i m e n t o e d e s e n v o l v i m e n t o em c r i a n ç a s e a d o l e s c e n t e s b r a s i l e i r o s .d i s p l a c e m e n t : 1976. MILNER. Chim.A. D.G.141-81 . 57: 49. P i s . 7 3 : 2 1 3 . C l i n . p. . eds. A . A. 47. & BURNS.D. E . W. 1978. F. 50 hormone deficiency (letter).6 . R. Y U N E S . t r a c e r s determined by s e l f .M. New York. S . .M. Child. 1982. J . J. . & iANNER. 1982. Human growth. E d i t o r a B r a s i l e i r a de C i ê n c i a s . pubertário I I . e peso. M A R C O N D E S . Child. radioimmunoass?y. .A.C. growth h o r m o n e d e f i c i e n c y . 944-7. W. Puberty. V . MUNRO. M A R Q U E S . . Production of primary In: TEMPLETON.. 2 . M. Altura S ã o P a u l o . MORRIS. Plenum. J. E . A c t a . R.

1978.447-55. . W . Metabol. G . Production of a n t i s e r a f o r p o l y p e p t i d e Biol. ODELL. B.ioassay. . Reprod. VILLARES. NERY. idiopática 1983. Endocrinoi.. BILHARINHO. A. ASSIS. L . P.R. de M e d i c i n a . 1984. steroid 1972. R .3 3 . Extração e purificação congeladas de h o r m ô n i o de h i p ó f i s e s Endocrinol. GROVER. crescimento Arq. 6:427-42. Avaliação da f u n ç ã o pituitária anterior em de pacientes com d e f i c i ê n c i a São P a u l o . anticorpo PIERONI. BLOISE. cie MATTAR. M. 54. M . . humanas (hGH-HC). . E. radioimmu. . para R.. 28(4):83-6. Radioircunoende com d u p l o dosagem de h o r m ô n i o Arq. Faculdade ( T e s e de Doutoramento. crescimento Metabol. . HESCOX.M. 22(1 ) : 2 9 . ABRAHAM. saio PUPO. . NAKASONE.. . . S. humano no s o r o . W . de h o r m ô n i o crescimento. W .K. 51. CARDIA...for clinical chemistry. PALOMINO. Churchill Livingstone. NICOLAU. 1983. A . Bras. . USP). Great Britain. p. M . A . 53.M. SKOWSKY. . Edinburgh. G .. 52. Bras. and D . . A . FISCHER.

M. 1967.M. K. growth hormone deficiency. Catapress (STI55). 1982. C. 60. Clin. SCHWARTZ. W.B.T. nypo- 27:1129-36. The arginine provocative test: an aid in the diagnosis of somatotropism. 56. S..S. 57. M.. RODBARD. PHILLIPS.. J. BREST. R. SWARTZ. Circulation.. A.. A. PARKER. 39:219-28. ENERGY AGENCY. R. D. Hed.E. n ( l ):l-24. DAUGHADAY. G. Pharmacodynamic effects of a new anti- hypertensive drug. Quality control for RIA: Recommendations ATOMIC for a minimal program. In: INTERNATIONAL Radioimmunoassay and related procedures . 59.. BLIZZARD.. 1980. M. 1969. PREECE.L. 1967.M.. Endocrinol.. L. ONESTI. J. Endocrinoi. RAITI. A comparison of arginine Lancet.. 2:1182-3. 302(7):371-80. KIM. Diagnosis and treatment of children with Clin. Somatomedins.A. W. 58. & VASSIPOULOU-SELIN.55.H. Metab. DAVIS. HAMMOND.. New England J. the effects of insulin hypoglycemia and infusion on release of human growth hormone.

J. D. Computer analysis of Acta radioligand assays and radioimmunoassay data... 14(4):254-8.E. 65. W. 1982.. RYMKIEWICZ-KLUCZYNSKA. V. symposium November. A. F.. R. ROULSTON. J..C. B. 39:844-52. Oral clonidine for screening of growth hormone Pan. A.E. Endocrinol.in medicine: proceedings of the international in. Vienna.R. Pediatr. Biochem. ORTEGA.. Z.. J. A. Med.2 p.M. RODBARD.. ROMERO.M.21-36. & LEWALD. Clin. held in Berlin from 31 October to 4 1977. GUERRERO. 61.E. 63. 64(Suppl.. J. GARCIA. |4:231-5. 1970. 1981.L. ROMER.. ROSENFIELD.A. RUIZ-CABAL. 62. Esp.C. F. Validation of the self-displacement technique for estimation of specific radioactivity of rac"ioimmunoassay tracers. The plasma growth hormone response to insulin-induced hypoglycemia in children with retardation of growth. Ann.. .W. Anal. J.. BOGONIOWSKA. deficiency. Pediatrics... T.. PALOMINO. 64. ROOT. 1978. 1967. EBERLEIN..R. "Test" con clo nidina oral como estímulo de la hormona del cresci — miento. J. BONGIOVANNI.E. 147 ):79-103.

SCHMITT. Won parametric statistics for the behavioral p.. McGraw-Hill. FENARD. R. H. S. R. 35:527-31. Biochem.M.. & POLLACK. 51:654-5. SALTI. N. BECHERUCCI. S. LA CAüZA.. sciences. Acta.. R.. S. C. Ann. Sci . RADCLIFFE. S. 68. 67. GALLUZZI. Evidence for of by an alpha-sympathomimetic component in the effects Catapresan on vasomotor centers: antagonism piperoxan. Anal.R. SIEGEL. 14:98-100. I . C . G.. 1 9 7 1 . 1973. J. Acad. 71. 1956. SCHACTERLE. H.. New York.W. 0. A simplified method for the quantitative assay of small amounts of protein in biologic materials. 1949. Oral growth Helv. .131-44. 1981. . 66.. G.. Paediat. 1979. SLOVER. C . SEMINARA.16:26-9. KLINGENSMITH. Eur. . CALZOLARI. SCHMITT. A comparison of clonidine and standard i. SCATCHARD. F..J.H. .. G. 51^:660-72. 69. Y. The attractions of proteins for snail molecules and ions. R. . 70. P. GOTLIH. clonidine: an effective provocative test of hormone release.I. INNOCENTI. Pharmacol.

LARON. NIESCHLAG. UNDERWOOD. Z. with small doses of immunogen. J.. & FOSTER. Clin. textbook of endocri no!ooy. A method for producing specific antisera ROSS. Dis. Hetab. 1984... 16(Supplement):127-30.. D'ERCOLE. B. 1980. Endocr. JOSEFSBEPG. BAUMAN. Z. J. & VAN WYK.E. clonidine as compared to insulin hypoglycemia obese children and adolescents. TOPPER. ROBBINS. 42:232-8..O. Normal and aberrant Williams In: WILSON. VAITUKAITIS. 1984..J. 27:771-82. UNDERWOOD.provocative agents of growth hormone. p. 73. STIMMLER. J. 138^314-7. A. D. Pediatr. E. 72. 75. 1985. L..D. Amer. Child.T. 74. GIL-AD. G.. Pis.. 6. J. 76. Plasma growth hormone response to oral in Res. L.E. 1967. Growth hormone secretion provoked by insulin-induced hypoglycaemia in children of short stature.. J. 33:988- . & BROWN. Somatomedin C and the assessment of growth. Child.155-205. 7ed.. North Amer. Clin.B. Philadelphia.. J. E.. Saunders.W. L. J. growth.A. I. VAN WYK..J. Horn. Arch.

1968. in Vienna.A..455-79.. Growth hormone release during insulin tolerance test in normal children. 1969. p. Scand. 182(Suppl. . YALOW.):39-42. . General aspects of radio — In: INTERNATIONAL ATOMIC In vitro procedures with radioisotopes held in medicine: proceedings of a symposium on. & BERSON. Acta Paeci at.S. 78. S. 0. 77. 8-12 September. immunoassay procedures. 1970.. WESTPHAL. ENERGY AGENCY. 1971. Vienna. R.91 .

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