INSTITUI-O

DE

PESQUISAS

ENERGÉTICAS

E

NUCLEARES

AUTARQUIA ASSOCIADA Â UNIVERSIDADE DE SÂO PAULO

COMPARAÇÃO DO TESTE DA CLONIDINA COM 0 TESTE DE TOLERÂNCIA k INSULINA NA AVALIAÇÃO DE PACIENTES COM BAIXA ESTATURA

MARCELO CIDADE BATISTA

Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de Doutor em Tecnologia Nuclear.

Orientador: Prof. Dr. tflilan Nicolau

SAO PAULO 1986

AOS HEUS

PAIS

JOÃO E DILZA

A LENA

cujo carinho e apoio se encontram escritos trabalho. em cada página deste

tOM!5SíO MAClONAL DE tr.e I. P. £. ,.

•••r:.3AR/SP

AGRADECIMENTOS

Esta tese resultou da colaboração t influência de várias pessoas, is quais expresso minha gratidão: Ao Prof. Dr. Wilian Nicolau, orientador e sobretudo amigo, cujo estimulo e participação pessoal foram de fun damentai importância para o meu desenvolvimento na área de Endocrinologia e Radioimunoensaio, culminando, agora, com a realização deste trabalho. Ao Dr. Júlio Kieffer (in memorian), ex-orientador e responsável por minha formação em Medicina Nuclear, por me Incentivar a ingressar no curso de pôs-graduação. Ã Dra. Constância Pagano Gonçalves da Silva, ex-orientadora, pelo apoio dado durante a realização dos cursos e seminários de area. Ao Dr. Walter Bloise, Dra. Berenice Bilharinho de Mendonça e Dr. Ivo Jorge Prado Arnhold, responsáveis por minha formação clinica na área de Endocrinologia. Suas valiosas sugestões contribuíram multo para a elaboração deste tra balho. Ao Dr. Francisco Homero D'Abronzo, que me auxiliou e orientou no desenvolvimento da parte metodológica d e s t e trabalho.

''-Wll-l DE Vr~

• • • - "A" SP

: . Isabel Cristina de Hello Guazzelii e Antonio CSneíido Pinheiro Palodesenvolvi- Ã Dra. que de Edna Regina Nakandakare. • • ••) ire.. em especial i Dra. ~\r „ k " " • .Fuhdeçao de Amparo i Pesquisa do Estado de SSo Paulo. pelo apoio financeiro concedido durante a realização deste trabalho. 5niornar Madurcira estimulo.A Maria Angel» Henrfques Zanella Fortes. pelo afilio na realização dos testes de T3nid Cecilio Silva. Sandra Ma>*a Villares.s estagiários e residentes trabalharam na Unidade d* òo>adas e Intersexo 1985-86. pelo forneci^ mento de preparações hormonais de referenda. • • • ^ «J r . Ao Dr. A Valeria S*"iuel Undo. e Norma no e ano Dra. A todos os méoic:. Ã FAPESP . i I . mino. pela participação na dosagem do: hormônios pepndicos e soBatonedina C. Rui Montei 10 de Barros Maciel. pela colaboração têc»!cõ indispensável no mento do radioimunoensaio ás SH. Maria Beatriz da Fonte Kohec. Débora Gonçalves de Carvalho e esterôides. Paulo Lu<z k^iirrt Costa. pela participação rt dpsagem dos hormônios peptfdicos colaboração Ao Dr. pela na análise estatística dos Cherem.

r-íL DE ENERGIA U\CLEAR.Este trabalho foi realizado na Divisão de CHnica Médica I do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina da Universidade de Sio Paulo. ij. . . r\ E. SP .

.EAR/ .""^. Z. .REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 140 ••'•" -'•' • • • ~~ C F : E R G : A • • . " . '.MATERIAL E MÉTODOS -RESULTADOS -DISCUSSÃO -CONCLUSÕES 1 5 9 19 21 23 87 125 138 X .ÍNDICE I II III IV V V VII VIII IX -RESUMO -ABSTRACT -INTRODUÇÃO -OBJETIVOS -CASUÍSTICA . li.

I - RESUMO J ! .

O.1 U/kg de peso por via endovenosa. _*. 8. A especificidade foi considerada adequada com . 0.P/3P1 :. 90 e 120 minutos. respectivamente. 60 e 90 minutos. 15.08 ng / ml (média + erro padrío da média).3 e 25.1 ± 0. com coletas de sangue nos tempos de -30.7 e 4. a variação 1ntraensa1o 5.COMPARAÇÃO DO TESTE DA CLONIDINA COM O TESTE DE TOLERÂNCIA A INSULINA NA AVALIAÇÃO DE PACIENTES COM BAIXA ESTATURA MARCELO CIDADE BATISTA RESUMO Foram estudados 31 pacientes. Todos foram submetidos a 2 testes de liberação de GH: (1) teste de tolerância ã insulina (ITT): insulina simples 0. 30.5 anos e altura entre 1.6. 45. . 0 6H foi dosado em soro por método de radioimunoensaio desenvo^ vido em nosso laboratório e padronizado por comparação com preparaçio de referência fornecida pelo "National Institutes of Health".2Y e a interensaio de de 19. 30.9 abaixo e 17.5 desvios-padrões da média para sexo e idade. com idade entre 2.4. . (2) teste da cionidina (TCLO): cionidina 0.0375 mg/m* de superfície corpórea por via oral. 60.9.7 e 12.2 ng/ml.?:Cíí'. 8. com coletas de sangue nos tempos de -30. 4. A sensibilidade do método foi de 1..6% para amostras-controie de 6H contendo 1.3 e 8. • •.

1 e 58. Foi estabelecida deficiência de GH em 8 crianças (Grupo ZA) e 2 adolescentes (Grupo 2B). os únicos efeitos colaterais observados foram Mpotensão e sonolência discretas. ritmo de crescimento normal. dosagem sérica normal de somatomedina C (SmC) e pico de libe raçSo de GH maior do que 7. que apresentavam sinais típicos de nanismo hipofisário e/ou ritmo de crescimento diminuído. A Incidência de resultados faiso-negativos 28. Estes valores nío foram considerados estatisticamente diferentes (p > 0. No .4 e 12.3 + 2.base ea estudos de Imunorreatividade cruzada e dos efeitos não específicos do meio de Incubaçâo.2 + 3.3X par* o TCLO.0 ng/ml) nos Grupos IA e IB foi de rs o ITT * de 11. . erro padrSo da média) e 15.19 p* (pico < 7. No TCLO.5 ng/ml no TCLO.6 e 9. respectivamente.8 ng/ml _ * _ no ITT e de 14. n&useas.8 • 2.0 ng/ml em pelo menos um teste de estimulo (ITT ou TCLO).3 + 1.7 (média . Nos Grupos IA e 16.0 ng/ml nos 2 testes provocativos (ITT e TCLO). acompanhada por sudorese. os picos de liberação de GH foram de 10. Fora» considerados normais quanto à secreção de 6H 9 crianças (Grupo IA) e 12 adolescentes (Grupo IB) que preen^ chiam 3 ou mais dos seguintes critérios: ausência de sinais típicos de nanismo hipofisário. SmC baixa e pico de GH menor do que 5. ao passo que todos os pacientes apresentaram hípogíicemia (< 45 mg/dl) no ITT. mal-estar geral e sonoièri cia.05) quando comparados pelo teste "IP de Mann-Whitney. respecti_ _ vamente.

portanto. Conclui-se que o TCLO apresenta maior eficiência de causar de liberação de GH do que o ITT em crianças. •' •• .Grupo 2A.08 e 1. no entanto. já que este era constituído por apenas ? pacientes. o TCLO foi menos eficiente do que o ITT para excluir deficiência de GH. o diagnóstico de nanismo pode ser estabelecido com segurança próxima a 100%. sendo signj^ _ ficantemente menores (p < 0. cujos valores máximos foram de 0.05) do que os do Grupo IA e não ultrapassando 2. Deve.5 ng/ml no ITT e 1.9 e 3.89 + 0.-: • r '} -. .7 e 4. Não foi calculada a média dos picos no Grupo 2B. respectivamente.08 ng/ml. além efeitos colaterais menos graves. os picos de GH observados no ITT e TCLü foram de 0. Quando ambos cs testes são como realizados hipofisSrio em um mesmo paciente. devendo ser utilizado apenas teste complementar. que engloba a maioria dos pacientes com déficit de crescimento. ser considerado o teste de eleição para excluir o diagnóstico de nanismo hipofisário na idade prê-puberal.8 ng/ml no TCLO. suspeita . Et» adolescentes. respectivamente. sugerindo que esta deva ser a conduta preferida naqueles com clinica desta patologia.1 • 0.3 ng/ml em nenhum teste.

II - ABSTRACT .

respectively. The sensitivity of the method was 1. 60. 4. All underwent 2 6H provocative tests: Insulin tolerance test (ITT): Intravenous regular Insulin 0. 8. 8.7 and control samples of 1.2* and an 12.1 + 0.9 to 17. Serum GH was measured by a rad1o1mmunoassay method developed in our own laboratory and calibrated against a reference preparation provided by the National Institutes of Health. 60 and 90 minutes. 45.5 standard deviations below the mean (1) for age and sex.4.08 ng/mi (mean + standard error of the mean).0375 mg/m* surface area.7 Interassay precision of 19. with heights from 1.2 ng/ml.9. 30. with samples drawn -30.COMPARISON OF THt CLONIDINE TEST WITH THE INSULIN TOLERANCE TEST IN THE EVALUATION OF PATIENTS WITH SHORT STATURE MARCELO CIDADE BATISTA ABSTRACT He studied 31 patients aged 2. 90 and 120 minutes. 0. An adequate specificity was demonstrated by cros$-react1v1ty studies and by assays designed to test non-specific effects . 15. 30.6.3 to 8.5 years.1 U/kg body weight» with samples drawn at -30.61 for quality with an Intraassay precision of 5.3 and 25. 0. (2) clonidine test (CLOT): oral at clonidine 0. _ and 4.

malaise and drowsiness.0 ng/ml) Groups 1A and IB were 28. These values were not statistically test of Mannfor different (p > 0. normal growth rate.89 * 0.3X for CLOT. False-negative results (peak i 7.5 ng/ml for CLOT.08 and 1. associated with nausea.or of the mean) and 15. These values were .08 ng/ml. normal serum somatomedin C (SmC) measurement and peak GH responses greater than 7. In Group 2A. peak GH responses were 10. respectively.1 and 58. low serum SmC and a less than 5. Eight children (Group 2A) and 2 adolescents (Group 2B) were diagnosed as GH deficient by the presence of typical signs of pituitary dwarfism and/or reduced growth rate.05) when compared by the "U" -Whitney.3 ng/ml.0 ng/mi In at least one provocative test (ITT or CLOT). only had sweating.2 + 3. In Groups 1A and IB. respectively.4 and 12.U for ITT and 11.1 • 0. respectively. with no response greater than 2. peak 6H responses for ITT and CLOT were 0.3 + 1.8 ng/rol for ITT and 14. Slight hypotension and drowsiness were the side-effects observed during CLOT.0 ng/mi GH response to 2 provocative tests (ITT and CLOT).6 and 9.7 (mean + standard tr. whereas all patients hypoglycemia (< 45 mg/dl) in ITT.of the medium used for Incubation.3 £ 2. A normal GH secretory reserve was established In 9 children (Group 1A) and 12 adolescents (Group IB). who had 3 or more of the following features: absence of typical signs of pituitary dwarf 1 sin.8 • 2.

the clonidine test is less effective than ITT to exclude GH deficiency in adolescents and should be used only as a complementary In pubertai patients. since only 2 patients were included in group.9 and 3. Their peak GH responses were 0.5 ng/ml ITT and 1. observed in It was not possible to calculate mean peak levels this for for Group 2B. Nevertheless. '<•'. W . provocative test It should be considered the diagnosis of with less the best pituitary most to exclude dwarfism in the prepubertal age. which encompasses patients with growth retardation. respectively. We conclude that the clonidine test with a low-oral dose of 0. besides being associated dangerous side effects.8 ng/ml for CLOT. pituitary dwarfisn is very rarely nisdiagnosed. approach when COMISSÃO KMiQML OE EKERGiA NUCLEAR/SP !. When both tests are performed in test a single patient.0375 mg/m* is more effective than ITT in promoting GH release in children.7 and 4. E .8 significantly lower (p < 0. suggesting that this should be the preferred this disorder Is clinically suspected.05) than the ones Group 1A.

Ill - INTRODUÇÃO .

Quando administrado a criaji ças com hipopituitarismo. Ele é sintetizado e armazenado nas células somatotrõficas.10 A somatotrofina (GH) é o hormônio «ais abundante da hipófise humana.000 daitons. cálcio. ele estimula o crescimento proporcionado do esqueleto e tecidos moles. desaparecendo do pias ma com uma meia vida de 20 a 25 minutos (12). contendo 191 aminoácidos e com peso molecular de 22. fósforo e nagnésio. potássio. 0 papel primordial do 6H consiste no controle do crescimento somático pós-natal. ponente fisiológico predominante consiste em uma cadeia polj^ peptfdica única. estando presente em quantidades de 5 a 10 mg em cada glândula. identificados por seu tamanho ou carga (42). 0 GH presente em extratos hipofisários e no plasma corresponde a uma mistura heterogênea de pelo menos 6 pe£ 0 com tideos. Acredita-se que esta açio seja mediada principalmente pela geraçlo das somatomedinas (57). associado a balanços positivos de nitrogênio. embora alguns estudos . correspondentes a 35 a 45* da pituitária e localizadas predominantemente nas suas asas laterais. Seu ritmo de secreção diário é de 1 a 2 mg.

formando complexos proteicos que as protegem contra a proteõlise e as conferem mela vida maior e flutuação sangüínea menor do que •s dos demais hormônios peptidicos. Através de mecanismo de "feedback" negativo. Esta característica per_ mite que os níveis séricos de somatomedina C (SmC). respectivamente. cuja secr£ ção é diretamente controlada pelo GK. Circulam no sangue ligadas a proteínas carregadoras de alto peso molecular (145. As somatomedinas também agem ao nível da h1p6- .000 daltons). têm peso mole cuiar de 7. dencainados "insulin-like growth factors" I (somatomedina C) e II.11 "1n vitro" tenhas demonstrado UM possível efeito estimuiatõrio direto do 6H sobre r crescimento longitudinal dos ossos (34). São sintetizadas principalmente no ffgado e sua ação sobre o crescimento somático consiste em promove** a mitogenese e estimular a síntese de colãgeno e proteoglican.500 daitons (57). As somatomedinas corresponde* a una família de pe£ tideos cujos 2 principais componentes. aumentando ou reduzindo a liberação de 6RH e SS. A secreçio de GH ê regulada pelo hi potalamo através de 2 peptideos sintetizados ao nível dos núcleos ventromediai e arqueado: a somatocrinina (6RH) e a somatostatina (SS). •gentes estimilador e inibidor da secreçio h1pof1sir1a de GH. possam ser utilizados como índice de secreçio da somatotrofina (75)'. concentrações séricas de 6H e somatomedinas atuam diretjs mente sobre o hipotfilamo.

já que se dispSe. Os valores máximos são detectados aproxi nadamente 1 hora após início do sono profundo (estádio III ou IV). Mecanismos de controle neural exerce» importante ação sobre o hipotâlamo. de 6H (44) ao passo que o bloquei o dos receptores colinérgicos inibe esta resposta (13). participando também d? regulação da secreção de GH. a es timulação dos receptores e-adrenérgicos centrais provoca 1n^ biçSo da secreção de 6H (44). de . A secreção de 6H é episódica.12). A ativação dos receptores «-adrenérgicos e serotoninèrgicos centrais promove a liberação de 6RH e.\2 fise. o seu d1agnÓ£ tico ê multo Importante. caracterizada pulsos de duração limitada. por as con centrações sêricas deste hormônio situam-se em nível Inferior • 3.0 ng/ml. Entretanto. atualmente. Na maior part* do dia. com picos Menores ocorrendo posteriormente durante as fases mais tardias do sono (9. provocada por tumor produtor de 6H. Distúrbios da secreção de 6H podem resultar em patologias tais como o nanismo hipofisário. 0 nanismo hipofisário corresponde a uma causa rara de retardo de crescimento em crianças. ciminuindo a resposta das células somatotrõficas ao 6RH (44). sendo responsá- vel por menos de IX destes casos. C O M 1 a 2 picos moderados ocorrendo 2 a 4 horas apôs as refeições. Por outro lado. conseqüentemente. decorrente da defj_ ciência deste hormônio. ou a acromegalia.

Em crianças acima de 5 anos idade» a dosagem sérica de SmC corresponde a um bom teste de triagem. Estes também são necessários em crianças abaixo de 5 anos de Idade. diferenciar entre crianças com e sem deficiência deste hormônio.na maioria das vezes. nas quais não ê possível uma boa discriminação entre valores normais e baixos de SmC (75). no entanto. Entretanto. inferior a 3 desvios-padrões em relação de i média para sexo e idade (11). testes provocativos de liberação de GH foram desenvolvidos. com o Intuito de se poder avaliar a reserva nenhum hipofisiria deste hormônio. teste que consistentemente promova uma resposta hormonal ade quada em todo paciente sem déficit de GH. Nio existe. o diagnóstico de déficit de GH precisa ser confirmado por estudos da secreção deste hormônio. como o GK extraído de hipófises humanas ou produzido por engenharia genética (12). Por este motivo. praticamente excluindo a presença de nanismo hipofi sirio quando normal (75). j£ que sua secreção ê episódica e mantêm co£ centrações séricas baixas durante a maior parte do dia (28). Isto ocorre por- que os diversos estímulos agem ao nível do hipotllamo através . o que pode ser ocasionado por outras doenças como desnutrição e hipotireoidismo. A possibilidade de déficit de GH deve ser considerada em todas as crianças que se apresentarem con baixa esta tura proporcionada.13 terapêutica adequada para esta doença. A dosagem sérica basal de GH não permite. quando os níveis encontram-se diminuídos.

convenientes. zões. Os testes de estimulo pode* ser divididos em 2 gran des grupos (17): 1t) TESTES DE TRIAGEM Estes testes consiste» na dosage» do GH em una única amostra de sangue coletada 20 a 40 minutos apôs o inicio do exercido fisico ou 1 hora após o inicio do sono. apresentam u*a incidência relativamente alta (ao redor de 30X) de resultados falso-negativos (Indivíduos sem deficiência derte hormônio mas com resposta subnormal ao teste) e. 21) TE8TES DEFINITIVOS Estes testes Implicam na dosagem de 6H em amostras seriadas de sangue coletadas antes e após administração de -. portanto. f - M .14 de Mecanismos neurals monoaainérgicos. o efeito não é. de baixo custo e se» efeitos colaterais. direto Por estas ra sobre as células somatotróficas hipofisárias. só são utilizados a nível ambuiatoriai para excluir o diagnóstico de nanismo hipofisSrio em pacientes com baixa suspeita clinica desta patologia. porisso. Modificando a secreçâo de SRH e/ou somatostatina. Ape sar de seren fisiológicos. o diagnóstico de nanismo hipofisário deve se basear na demonstração de resposta subnormal do 6H a pelo menos 2 testes provocativos (32).

um agonista o-adrenérem gico central utilizado como snt1-h1pertens1vo (37. a clonidina. todos estão associados a efeitos colaterais desagradáveis. foi Introduxida como novo agente capaz de estimular a secreçio .59. parece ser o mais eficiente no que refere i liberação de 6H. embora associado ás conseqüências perigose a um teste de sas da hipoglicemia.15 mi estimulo farmacolõgico como a insulina. Acredita-se que a hipoglicemia promova a secreção de 6H por estimulação de receptores o-adrenérgicos centrais.0. a incidência de resultados falso-negativos variou de 8 a 265.0 ou 10 ng/ml).35. Entre os testes definitivos. dependendo do nível de GH •cima do qual a resposta foi considerada normal (5.56. Em todos.69). por vezes severos e perigosos.55. o teste de tolerância â insulina (ITT). argi nina ou glucagon. São indica dos em pacientes com características clinicas de nanismo hipofisârio e/ou resposta subnormal triagem.72.36. 7. Apesar de apresentarem uma menor incidência de resultados falso-negativos (variável de 10 a 30%).77).20.64. 1-dnpa. nSo foi observada liberação de 6H nenhum paciente com deficiência deste hormônio. Nos vários estudos prévios sobre o ITT (18. Recentemente. sendo considerado por muitos autores o teste padrão C O R O qual os demais devem ser comparados (48). já que o bloqueio destes receptores por drogas como a fentolamina inj^ be esta liberação (44).

nestes Mesmos animais. Chambers e Brown comprovaram que a clonidina atua ao nível de receptores o-adrenêrgicos centrais. inicialmente demonstrada adultos normais por Lal e col. bloqueia o aumento da secreção de GH induzido pela clonidina. õpós transsecção •edula espinhal. Estudos mais recentes em animais indicaram a clonidina promove a liberação de GH por estimular neurônios hipotalãmicos secretores de GRH (44).16 de 6H. a resposta do GH a esta droga permanecia que Inalterada. Utilizando uma dose de 0. Gold e col. Em estudos realizados em macacos Rhesus (5 ). G1l-Ad e col. Outra evidência por da da ação a-adrenérgica central da clonidina foi relatada Ganong e col. n3o tendo qualquer efeito sobre receptores dopaminérgicos ou serotoninérgicos. em 1979. eu provavelmente se deve à estimulação de receptores a. os autores e oral demonstra- ram uma elevação significante da concentração de GH em todos os pacientes sem déficit deste hormônio. (38) em 1975. não houve aumento estatisticamente signify i cante dos níveis de 6H (máximo de 2. Nos 7 pacientes com hipopUuitarismo.15 mg/m* de superfície corpôrea. o uso da clonidina como agente liberador de GH para excluir o diagnóstico de nanismo hipofisário em crianças adolescentes com baixa estatura. (22).-adrenérgicos centrais. Esta ação da clonidina. Em 1978. (26) demonstraram. que a administração de piperoxane. com exceçSo de .5 ng/mi). que observaram que. (23) foram os primeiros a descrever. um a-antagonista.

que res a pondeu ã expansão de volume. ela provoca sonolêrt cia e hipotensão moderadas.63.71). parcial de EM estudos Mais recentes. houve redução dos níveis pressôricos que variou de 15 a 25 mmHg para a sistól^ ca e de 10 a 15 mmHg para a diastólica.15 mg/»* seja um excelente estimulador da secreção de GH.62. 39. fora» observadas sonolência e hipotensio Multo mais d1s_ cretas do que com 0.n relato (47).17 1 (pico de 5.15 «g/m*.15 mg/m* foi comparado com o ITT (16. 1-dopa (62. 0. C O M provivel deficiência GH.035 mg/m* (11). alguns autores tentaram realizar o teste da clonidina com d£ ses menores e fixas tais como 0. Em apenas um trabalho (30). sendo em todos obser vado um maior pico de liberação de 6H e uma menor incidência de resultados falso-negativos no primeiro teste.66.30. havendo decréscimo de 5 a 15 wwHg .025 mg (41). Em todos os estudos realizados com esta dose (16.05 ou 0.23. o teste da clonidina rea Uzado com a dose de 0. associada a choque.39. Em todos estes estti dos. Com o objetivo de minimizar os efeitos colaterais.71) e arginina (71). foii observada hipotensão severa Em u. os resultados obtidos no ITT foram equivalentes aos do teste da clonidina no que diz respeito i efi— ciência de liberação de GH. Embora a clonidina na dose de 0.66).5 ng/ml).1 mg (40) ou com a dose de 0. levando os autores a chamar atenção para esta possível complicação do teste.

6 + 1. Utilizando 0. ao passo que.18 na pressão sistôlica e de 2 a 7 mmHg na diastólica. estes valores foram de 30. Entre- tanto. apenas pacientes pré-púberes foram avaliados. a um consenso geral sobre qual a dose de clonidina a ser utilizada nos testes provocativos.6 ng/ml {média _ + erro padrão da média) e resultados falso-negativos de 361. . demonstrado para o teste da clonidina. na época da puberdade. a r e s posta do GH aos estímulos provocativos clássicos é maior que a observada na infância. que outros estudos sejam realizados para esclarecer esta dúvida. devido ao aumento da do secreção de testosterona e estradiol (19). à Lanes e coi. portanto. estudou-se um grupo misto constituído por crianças e adolescentes. (41) com a dose 0. no primeiro trabalho (40). Isto não foi ainda. no estudo de Laron e col. os resultados no que diz respeito ã eficiência de liberação de GH foram muito discrepantes e não relacionados magnitude da dose. NSo se chegou. t mister. Estas diferenças talvez possam ser explica das pelo fato de que. ainda.6 + 8. ou seja. no segundo (41). a dose mínima que promova uma estimuiaçao eficiente da secreçSo de 6H associada a uma baixa Incidência de efeitos colaterais.025 mg.3X. (40) obtiveram picos de GH de 11. Sabe-se que. respectivamente. jã que ele nujn ca foi avaliado em grupo constituído apenas por pacientes p£ beres.8 ng/ml _ e de 8. no e£ tanto. _ enquanto que.050 ng de clonidina.

IV - OBJETIVOS .

20 Comparar o teste da clonidina realizado com a admi nistração oral de uma dose de 0.0375 mg/m* de superfície cor pórea com o teste de tolerância â insulina em grupos de entes pré-púberes e púberes no que diz respeito 2: Is) 28) Eficiência de liberação de GH. Incidência de efeitos colaterais indesejáveis. .

N. ../S? : : ..V - CASUÍSTICA ••: MAC-:: .\ E. n? EKERCA Í:I.CLEA?.

5 anos.3 e 8. variando entre 1. laboni torial e radiolõgica realizada neste período. compietando-se a investigação diagnostica em um período máximo de 4 meses. sendo 22 do sexo majs culino e 9 do sexo feminino.statada uma estatura abaixo da média para sexo e idade. .Foram estudados 31 pacientes. com Idade entre 2. Os outros 12 pacientes foram estudados a nível ambulatorial. Em todos.5 desvios-padrões (DP). que procuraram o Serviço de Éndocrinologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC-FMUSP) com queixa de déficit de crescimento. Dezenove pacientes que se apresentaram com forte suspeita clinica de déficit de GH foram Internados por aproximadamente 5 dias na enfermaria da Divisão de Clinica Médica I do HC-FMU3P. foi ccr.9 e 17. sendo toda a avaliação clinica.

VI - MATERIAL E MÉTODOS .

peso. convulsões. dosagens séricas de sódio. . albumina.iia. desenvolvimento mamãrio. poliúria. as quais avaliados foram e utilizadas para o calculo dos respectivos desvios-padrões idade estatura!. dores ôsteo-articulares. giicemia de jejum. alterações visuais. distúrbios neurológicos. fraqueza Muscular. verminose. (45). hematúria.25 sença de cefalêia. AVALIAÇÃO LABORATORIAL E RADIOLÕGICA GERAL Os exames laboratoriais gerais Incluíram hemograma completo. caimbras. Os graus de pubarca e teiarca foram clas- sificados de acordo com os parâmetros de Tanner (46). desmaios. edema. presença de pelos axilares e pu bianos. de hipotireoidismo. as te. f) exame ffsico: altura (média de 3 medidas feitas por UM único médico era estadiôraetro construído de acordo con as recomendações de Underwood e Van Hyk (74)). creatinina.relação púbis-vértex/púbis-chão. polidipsia. disúria. de Cushing ou de déficit de 6H. sinais de raquitismo. nictúria. cianose. sonolència e intolerância ao frio. 1. tosse. presença de estigmas somáticos. potássio. proteínas totais. dispnéia.2. uréia. A estatura e o peso dos pacientes foram segundo as tabelas de Marques e coi. diarréia. anormalidades cardio- -respiratórias e gastrointestinais. tamanho de pènis e testículos. cllcio.

Niveis sêricos basais de hormônio luteinizante (LH) e hormônio foiiculo-estimulante (FSH) foram determinados apenas nas meninas púberes. For»» também realizados Rx e de tõrax. parasitolõgico de fezes e eventualmente cariôtipo. deixado em repouso por 3 horas a . fosfatase alcalina. com o paciente repousando em decúbito dorsal por pelo menos 1 hora e em jejum por um período mínimo de 8 horas.4. sendo a punçlo realizada pelo menos 60 minutos antes da primeira coleta. Rx de crânio para visualização da sela türcica Rx de *5os e punhos para avaliação da idade õssea conforme o Atlas de Greulich & Pyie (29).) em meninas foram realizadas em todos os pacientes. Amostras seriadas de sangue foram coletadas através de veia canuiada com "butterfly"» mantida com solução fisiológica 0. tiroxina (T. U a paciente foi submetida a m tomografia computadorizada de crinio. AVALIAÇÃO HORMONAL BASAL Dosagens séricas basais de somatomedina C (SmC). 1.3.). urin» tipo 1 . 1. TESTES FARMACOLÓGICOS DE ESTÍMULO Todos os testes Mveram início is 8:00 horas da »£ nhi.91. triiodotironina (T ) . 0 sangue para dosagen5 hormonais foi colocado •m tubo de vidro simples.26 fósforo. tireotrofina (TSH). te£ tosterona (T) em meninos e estradiol (E.

A. Foram ntonitorizados sintomas e sinais de hipoglicemia durante todo o teste. 15. a) TESTE DE . sendo realizada.. 60 e 90 minutos. Montes Claros. tendo-se sempre 3 disposição solução de glicose h1 per tônica a 50X (20 m U a qual era sistematicamente Injetada por via endovenosa no final do teste ou durante este se ocorresse perda de consciên cia. A coleta de glicemia durante o teste de tolerância i insulina foi realizada em tubos contendo fluoreto de sódio. a administração endovenosa em bolo de insulina simples (U-40 Biobrãs . glicernia e cortisol (este último determinado apenas em pacientes com sus peita clinica de panhipopituitarismo) foram coletadas nos tem pos de . 0. centrifugado a 1000 rpm por 10 minutos. . 45.OLERÂNCIA À INSULINA (ITT) Amostras de sangue para dosagem de GH. 0 soro foi então separado. 30.1 U/kg de peso. no tempo zero. a seguir.temperatura ambiente para que houvesse retração do coágulo e.Bioquímica do Brasil S.30. aliquotado em volumes de 1 a 2 ml e congelado a -20°C até a hora do ensaio. MG) na dose de 0. os quais foram encaminhados ao laboratório Imediatamente após o término do teste.

no tempo zero. Medidas do pulso e pressão arterial foram realizadas em cada tempo do teste. O comprimido de 0.0375 mg/m* de superfície corpõrea. TSH e proiactina (PRL) foram coletadas nos tempos de -30. sendo a clonidina administrada por via oral. solicitando-se ao paciente que succionasse e engolisse todo o liquido durante o pro cedimento.1 mg. a adminis— . 90 e 120 minutos. no tempo zero. sendo também observados quaisquer outros efeitos colaterais. sendo realizada. FSH.01 mg/rol. 30. 0.28 b) TESTE DA CLONIDINA Amostras de sangue para dosages de 6H foram coleta das nos tempos de -30. De Angeli. 0 volume correspondente è dose calcula da para cada paciente foi então aspirado em seringa de plástico e injetado diretamente na boca. Itapecerica da Serra.1 mg (Atensina 0. 15. Seguiu-se lavagem da seringa com ãgua por 2 vezes para remoçio de possíveis resíduos da droga retidos nas paredes de plástico. 30. na dose de 0. 60. SP) foi esmagado e dissolvido em 10 ml de ãgua resultando eu solução de 0. 0. 45 e 60 minutos. c) TE8TE DO HORMÔNIO LZBERADOR DO TSH (TRH) ASSOCIADO AO TESTE DO HORMÔNIO LIBERADOR DAS GONADOTROFINAS (LHRH) Amostras de sangue para dosagem de LH. sendo a igua aspirada e administrada ao paciente da mesma maneira que a solução de clonidina.

DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS SÉRICOS DE 6H Todas as dosagens de 6H foram realizadas em triply cata por método de radioimunoensaio (RIE) desenvolvido a pajr tir de reagentes Inteiramente preparados no Laboratório Pesquisas da Divisão de Clinica Médica I do HC-FMUSP. ü E Ef. prestou-se particular atenção ao ritmo de crescimento e início ou evolução do desenvolvimento puberal. São Paulo.. Todos os pacientes fora» submetidos aos testes tolerância i insulina e clonidina.5.ERC A r • ^ f ^ / s • : .• . SEGUINENTO AHBULATORIAL Todos os pacientes foram avaliados em ambulatório a cada 3 meses por um período mínimo de 6 meses. ao passo que o teste de do TRH associado ao LHRH só foi realizado naqueles com suspeita clinica de panhipopituitarisao.-:«'.1. METODOLOGIA LABORATORIAL 2...V.. de Todos os aspectos da técnica foram cuidadosamente analisados e coji troiados de modo a se obter. SP) associado na mesma seringa a 100 | g i de LHRH (Ayerst. .tração endovenosa em bolo de ZOO ug de TRH (Escola Paulista de Medicina. um ensaio adequado is CC. São Paulo. SP). no final. 2. Nestas consul^ tas. 1.

As hipófises. 0 precipitado foi retomado.7 com HC1 concentrado (Fig.5 (ajustado com NaOH) e submetido aos mesmos processos das etapas anteriores. 0 homogeneizado foi colocado em agitador magnético (Fanem Ltda. foram conservadas a -20°C. realizada a 4*C assim como todas as demais etapas.3 pela adiçlo de 4cIdo acético • 50X. coletadas durante autópsias de rotina pelo Serviço de Anatomia Patológica da FHUSP. rehomogeneizado com 60 «1 de tam pão Tris-fosfato pH 9. previamente obtidas de cadáveres humanos. envoltas individualmente em papel alumínio até o seu processamento. baseado no método de Chapman e col.. 1 mH feniimetanossulfonilfluoreto). A suspensão foi então centrifugada . SP) por 2 horas e depois centrifugado a 10. ]).000 g por 1 hora.1. com agitação constante. (6) com pequenas modificações (53). Os sobrenadantes das frações foram combinados. cujo pH foi ajustado a 8. 10 mM Na 2 HPO 4> 5 mM EDTA. 2. Extração e purificação do GH-HC 0 6K utilizado na preparação de padrões p£ ra radiolodação e curva de deslocamento (a seguir designado GH-HC) foi extrafdo a partir de um lote de 100 hipófises con geladas. São Paulo. foi segui da de homogenização em liqüidificador durante 3 minutos com 200 ml de tampão Tr1s-fosfato (50 mM Tris.30 finalidades deste projeto.1. filtrados em li de vidro e o pH re duzido a 6. A dissecção das glândulas. gota a gota.

7 (CONTENDO 1. 9 PRECIPITADO E DISSOLVIDO EM TAMPÃO TRIS-ACETATO 50mM pH 8. . FILTRADO E CONCENTRADO EM MILLIPORE SOBRENADANTE D COLETAM-SE AS 6 30PR0TEÍNAS . 9 REALIZADA EM ETANOL ( 1 = 7 ) u PRECIPITADO C COLETA .1 9 8 » C FIG. « „ « .S E PRL I PRECIPITADO p RETIRADO RESÍDUO DE ETANOL COM TAMPÃO TRIS-ACETATO 50mM pH 4 . lOmM No 2 HPO4 .« „ SOBRENADANTE E 1 l SOBRENADANTE RESÍDUO INSOLUVEL FILTRAÇÃO EM SEPHADEX G-IOO PROTEÍNAS DE ALTO PESO MOLECULAR P|CO ' h e H PIC0 DEh 6 H CROMATOGRAFIA EM DEAE CELULOSE GH ELUÍDO EM TAMPÃO ACETATO DE AMÕNJA 2 0 0 mM pH 8 . ACÉTICO A 5 0 % .»*. PRECIPITAÇÃO ISOELETRICA EM pH 4 .31 HIPÓFISES DISSECADAS I HOMOGENEIZADOS EM TAMPÃO TRIS-HCL 5 0 mM pH 8.0 mM FENILME TILSULFONILFLUORETO.5.ESQUEMA RESUMIDO DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO DO GH-HC .. 0 COM AC. 1 . 3 I CONGELAÇÃO DO GH A .. «.5mM EDTA) SOBRENADANTE A r RESÍDUO A REEXTRAIDO SOBRENAOANTE B RESÍDUO B i n I COMBINAÇÃO SOBRENADANTE A + B PRECIPITAÇÃO EM pH 6 .

A suspensão foi então centrifugada a 15. librada com tampão Tris-acetato 50 mM pH 8. cujo pH foi ajustado a 4. Esta fração homogeneizada foi adicionada ao sobrenadante anterior e centrifugada a 8.000 g por 1 hora.100 (PharMacia Fine Chemicals.9 com HC1 concentrado contendo etanol 12. previamente equi.. o qual foi centrifugado a 15.9 pela adição seqüencial. gota a go ta. A eluição foi realizada com este Mesmo tampão (fluxo 75 ml/min) e o efluente da coluna monitorizado com . 0 pH do sobrenadante foi reduzido a 4. sendo o precipitado separado para eventual extração da prolactina.5%.32 por 18 horas a 8. A fração sobrenadante foi decantada e separada para eventual extração de LH.5.000 g por 1 hora e o precipitado dissolvido em 500 ml de tampão Tris-acetato 50 mN pH 8. 0 precipitado.000 g por 1 hora.5 contendo ciortw tanol 0. de icido acêtico a 50X e etanol absoluto (volume 1:7). A fração sobrenadante foi aplicada a uma coluna (5 x 100 cm) de Sephadex 6. TSH e lipotrofinas. A solução resultante repousou então por 12 horas antes de ser centrifugada a 15.3 con HC1 concentrado. Suécia). seguida de decantaçio do sobrenadante e ressuspensão do precipitado com 50 ai de tampão Tris-fos fato cujo pH foi ajustado a 6. FSH. que continha o 6H.000 g.021. üpsalla. A solução resultante foi filtrada e concentrada utilizando-se Membrana de Millipore 10 K a um volume de 90 ml. coa agitação constante.000 g por 1 hor?. foi lava do C O M 50 ml de tampão Tris-fosfato.

preequilibra da com tampão acetato de amorno 0. EUA). aliquotada em volumes de 0. utilizando-se 6 diluições progressivas (1/200.3. a em sua fração central (8 ml) foi coletada em frasco imerso gelo seco.200. Quando o pico principal do GH começou a ser eluido. obtendo-se em média um de 1.46 mg/ml. b) quantificação do GH-HC por "kit" comercial de RIE (Diagnostic Products Corporation.05 M pH 8. o efluente da coluna de Sephadex foi conectado diretamente a outra coluna (2 x 60 cm) de dietilaminoetil ce lulose DEAE .5 (fluxo 80 ml/hora) em um gradiente crescente de concentração até 200 mM.000 até valor 1/3. mantendo-se o mesmo volume e monitorizando-se o efluente com absorbãncia a 280 nm (Fig. Quando o GH nonõnero começou a ser eluido.15 mg/ml. 0 conteúdo de uma destas alíquotas foi sub metido a testes de controle de qualidade que consistiram em: a) determinação da concentração de proteínas pelo método de Schacterie & Pollack (68). 2A).33 absorb&ncia a 280 nm (Fig. a coluna foi lavada com 350 ml de tampão acetato de amônio 50 mM pH 8. Apôs receber o 6H.c 52 (Whatman. 2B). c) estimativa da atividade biológica do GH-HC por método de . Los Angeles. CA. Clifton.000 em tampão de ensaio) como amostras desconhecidas e obtendo-se em média um valor de 1.1 ml e congelada em ni trogênio líquido (-198°C). NJ. EUA).

34 ABSORBANCIA ABSORBANCIA Inn) 100 • 90 60 70 60 50 : 40 30 20 10 (nm) t \ \ / \ MONO MERO 100 »0 80 FRAÇÃO CENTRAL COLETADA r~i í\ 1\ / \A 70 60 50 • 40 30 20 • 10 IDÍMERoA U 7\ 1000 (A) ^ V y J / ^V 100 (B) \ x.c 52 ( B). 2 .CR0MAT06RAFIA DO GH-HCEM SEPHADEX G. 200 2000 VOLUME (ml) VOLUME (ml) FIG. .IOO(A) E EM D E A E .

PRL = 3 ng/mg. cujo re sultado foi de 2.5 ml e congelados a -20*C por 30 dias. EUA (GH-NIH) por ele troforese em gel de poliacrilamida (8). d) comparação do GH-HC com padrão fornecido pelo National Institutes of Health. Estes foram aliquotados em volumes de 0. MD. EUA): TSH < 3 uUI/ral. uma alíquota foi descongelada e utilizada para: a) preparação de padrões para radioiodação contendo 5 ug de GH em 50 ul de tampão fosfato (TF) 0.1% (a seguir designa do tamplo de ensaio). Neste perfodo.4 preparado com fosfato de potássio monobásico. 0 GH-HC foi conservado em nitrogênio liqui do por um período de 9 meses.1 M pH 8. A cada 45 dias aproximadamente. Sygma Chemical Company. .35 radiorreceptor em fígado de mulher grávida (10). St Louis. b) preparação de padrões para curva de deslocamento contendo 1 ug de GH em da 1 ml de tampão borato (TB) 0. MA.5 com albumina séHca bovina (BSA. a qual demonstrou ter o GH-HC padrão de isohormônios com predominância forma fl semelhante ao do GH-NIH.1 U/ml. mo dia utilizados para marcação e a seguir desprezados. Estes foram no mes. Bethesda. e) determinação da contaminação por outros hormônios hipofi sérios através de "kits" comerciais de RIE (Clinical Assays.2 M pH 7. MD. EUA) e azida sôdica 0. Cambridge. FSH * 82 mUI/mg e LH = 641 mUI/mg.

4 ml de tampão e . sendo todas desprezadas apôs o término do RIE.2 M pH 7. no qual 1 ul do material radioiodado. 20 e 40 ng/ml de GH "frio" em tampão de en saio..diluído em 2.4. 2. adidonaram-se seqüencialmente.2 M pH 7. Buckinghamshire.1.2 ml de solução de lodeto de sódio (10 mg/ml em TF 0.4. 50 ul do padrão para radioiodação (preparado no mesmo dia) 125 contendo 5 ug de GH-HC. Radioiodação do GH-HC A radioiodação do GH-HC foi realizada de acordo com o método clássico de Greenwood e Hunter (27) com apenas algumas modificações (51).25. A eficiência de radioiodação foi determine da de maneira grosseira pelo denominado teste do carvão.0 mg/ml em TF 0.4 mg/ml em TF 0. 2. Rio de Janeiro. Procedeu-se então a nova agitação suave por 10 segundos antes da adição de 0. com no mínimo 100 mC1/ml. Inglaterra).2 M pH 7.36 uma alíquota foi descongelada na hora de cada ensaio utilizada para a preparação de soluções contendo e 1. RJ) contendo 1. Após homogenização. em tubo de vidro 12 x 60 mm. foram pipetados 20 ul de solução de cloramina T (Merck S.e 1 mC1 de I sob a forma de lodeto de sódio livre de carreador (Amersham International plc.4) homogenização final da mistura. 10. seguidos de agitação suave por 10 segundos e adi^ ção de 20 pi de solução de metabissulfito de sódio (Merck) contendo 2.2. 5.A.5. Em cada processo de marca ção.0.

0 restante foi coletado em alíquotas de 1 ml a cada 2 minutos (2070 Ultrorac II.05 M pH8.1% e azida sódica 0. em cada processo. Irvine. Considerou-se uma boa eficiência de marca ção quando 60X ou mais da radioatividade total encontrava-se no precipitado (correspondente ao GH-HC 1 25 I). A seguir. A cromatografia do GH-HC - I foi realiG. CA. a eluição foi iniciada com TB 0. EUA).6 com BSA 0.5 ml/minuto.5 ml de suspensão de carvão (carvão Merck a 100 mg/ml em TB 0. Todo o conteúdo do tubo de radioiodação foi colocado no topo da coluna e. Suécia) em 80 tubos de vidro (15 x 100 mm) contendo 0. LKB.1%. com fluxo de 0.foi adicionado em duplicata a 0. sendo os primeiros 6 ml do eluTdo desprezados. o qual foi em seguida submetido a purificação.1* e azida sõdica 0.1 ml de solução de . Como.1%.5). o sobrenadante foi separado do precipitado por decantação e a radioatividade de ambos determinada em contador de cintilação de poço (Gamma 4000.05 H pH 6.1 N pH 8. Beckman Instruments Inc. Bromma.6 com BSA 0.3 ml de solução de lodeto de sódio (10 mg/ml).37 de ensaio.75 zada em coluna de vidro (1 x 55 cm) contendo Sephadex (Pharmacia) deareada e previamente equilibrada com TB 0. foram adicionados 0.. logo após sua penetração no Sephadex. 2 alíquotas do mesmo padrão de GH-HC foram si multaneamente submetidas a radioiodação. Apôs horaogenização em "Vôrtex" e centrifugação por 15 minutos a 1000 rpm. o teste do carvão de permitiu também escolher o material com maior eficiência marcação.

125 I p u j rificado consistiu em: *) DETERMINAÇÃO DO GRAU DE CONTAMINAÇÃO POR TESTE DO CARVÃO 1 25 I LIVRE PELO Este teste foi realizado da mesma maneira que antes da cromatografia. Apôs construção do gráfico expressando a distribuição da radioatividade ao longo do volume eluído (Fig.1X.1 ml e congelado a -20°C por um período de 30 dias.1 2 5 I integro.6 con azida sódica 0. 2 picos foram constatados: pondendo ao 6H-HC o primeiro corres I livre. 3 ) .38 BSA 21 em TB 0. Os conteúdos dos tubos que acusaram as 3 maiores ati vidcdes no primeiro pico foram misturados de modo a se obter. aliquotado em volumes de 0. no final. .Í 2 5 I diluídos em 2. a seguir. 0 controle de qualidade do GH-HC . I integro e o segundo ao Praticamente não foi observado pico de agregados do hormônio Marcado. Para que o hormônio marcado fosse conside_ rado de boa qualidade. a porcentagem de radioatividade total 125 presente no sobrenadante (correspondente ao I livre) deve ria s1tuar-se abaixo de 20X (51).05 M) pH 8. Este foi. A radioatividade dos 80 tubos foi determinada por contagem de 10 | l do conteúdo de cada tubo em dete£ i tor de cintilação gama. 3 ml de GH-HC . só que agora adicionando-se 10 ul de GH-HC .4 ml de tampão de ensaio ã suspensão de carvão.

39 CP» . (XIO3) G H .75.H C .I 2 5 I EM SEPHADEX G.I 2 5 I ÍNTEGRO 60 60 VOLUME (ml ) FIG.H C . 3-CROMATOGRAFIA DO G H . .

Sygma). cujas &ti_ .utilizado neste co«o em todos os demais ensaios deste projeto. I (100 pi de solução 1/200 em tampão de ensaio). em triplicata. para C) ESTIMATIVA DA ATIVIDADE ESPECÍFICA DO GH-HC MÉTODO DO AUTODESLOCAMENTO (25. devendo situar-se acima de 80% que o GH-HC 125 I fosse considerado de boa qualidade. Se- guiu-se a centrifugação a 3000 rpm por 30 minutos a 4*C e de cantação do sobrenadante.40 b) AVALIAÇÃO DA IMUNORREATIVIOADE MAXIMA DO GH-HC PELA ADIÇÃO DE EXCESSO DE ANTICORPO 125 I Os seguintes reagentes foram incubados.0 ml de solução de polietilenoglicol a 17X (PEG S000.consistiu na adição de 1. 0 método de separação do complexo antfgeno -anticorpo do antfgeno livre. 1/75. (1) (2) anti-soro 72 (100 ul de solu (3) GH-KC 1Z5 ção 1/1000 em tampão de ensaio).05) 125 I PELO Os seguintes reagentes foram Incubados. 1/50 e 1/25 em tampão de ensaio. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: tampão de ensaio (100 pi). em triplicata. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) concentrações crescentes de hormônio marcado (100 ul de solu_ çôes 1/100. pre parada em tampão de ensaio sem BSA e conservada a 4°C.49. Após contagem do precipitado. o foi grau de ligação máxima do hormônio mar ado ao anticorpo determinado pela razão (radioatividade do precipitado/radio^ tividade total x 100).

I (100 | l de solução 1/200 i apenas para em tampão de ensaio). 4. A seguir. NSB * radioatividade do precipitado correspondente ao NSB.25. T * radioatividade total.NSB T x 100 . utilizada p^ ra construção da curva dose-resposta da Fig.000 em (3) GH-HC 125 tampão de ensaio). tubo amostra Bi (ou Bn) . incubou-se tampão de ensaio (200 pi) e hormônio marcado (100 pi) determinação da ligação inespecffica. 1. a razão ra dioatividade ligada/radioatividade total (B/T).5.0. 10. (2) anti-soro 72 (100 pi de solução 1/90. foi calculada para cada padrão de GH "frio" e amostra desconhecida pela equação: B T onde: Bi (ou Bn) * radioatividade do precipitado correspondente ao padrão 1 ng/ml de GH "frio" (Bi) ou & desconhecida n (Bn). Todos os tubos foram contados antes e apôs precipitação com PEG para determinação da radioatividade total e do precipitado. a seguir denominadas amostras desconhecidas) e de hormônio "frio" (100 pi de solu ções contendo 0.41 vidades foram previamente determinadas. Em 3 tubos (N5B). 2. respectivamente. 20 e 40 ng/ml em tampão de ensaio). 5.

0 10 20 40 LOG [ 6 H ] (ng/ml) FIG.5 5.CONCENTRAÇÃO DEGH-HC. .CAlCULO DA MASSA DE GH-HC J 2 5 I PRESENTE EM UMA AMOSTRA DESCONHECIDA PELA TÉCNICA DO AUTO-DESLOCAMENTO.25 2. 4 .I 2 5 I PRESENTE NA AMOSTRA DESCONHECIDA 1.

(2) anti-soro 72 (100 ul de s o U ção 1/90. inespe cffica (XHSB) e especifica (XBo especifica) foram calculadas pelas equações: . correlacionar a massa e atividade do traçador presente em cada amostra e construir o grafico da Fig. a partir do qual a atividade especifica foi calculada pela reciproca da inclinação da reta obtida por regressão linear simples. conseqüentemente. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) tampão de ensaio (100 ul). Foi possível. (3) GH-HC-125I (100 ul de solução 1/200). presente nas diferentes amostras desconhecidas.43 A concentração do hormônio Marcado e. em triplicate. as porcentagens de ligação total (XBo total). d) DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE DO GH-HC. correspondente ao tubo NSB).foi entio determinada por interpolação de suas respectivas razões B/T a partir da curva dose-resposta. sua «assa.1 2 5 ! 4°C E A -20»C CONSERVADO A Os seguintes reagentes foram incubados. dessa Maneira.000. Apôs separação com PEG e contagem do precj^ pitado. correspondente ao tubo Bo) ou tampão de ensaio (100 pi. 5.

I 2 5 I E SUA RESPECTIVA MASSA DETERMINADA PELA TÉCNICA DO AUTODESLOCAMENTO.0 r« 0.0 10 ATIVIDADE DO TRAÇADOR (jiCi.0 8.H C .0 4#0 6. 2. .0 2. 5 -RELAÇÃO ENTRE A ATIVIDADE DE UMA AMOSTRA DE G H .985 • / 6.MASSA DO TRAÇADOR 8.0 4.10'2) FIG.0 y^ r ATIVIDADE ESPECÍFICA» — • i i i V 1 ».

XNSB Medidas seriadas ao longo de 30 dias após radiolodação (Fig. sendo desprezadas após o término deste. 6) revelara» uma redução lenta e discreta dos 3 parâmetros ao longo de todo o período. (3) GH-HC.IB o total . por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) padrões de GH "frio" (100 pi de soluções contendo desde 0 até 40 ng/»l>. Estes dados demonstrara* uaa aaior perda de Imunorreatividade do h o m ô nio «arcado a 4*C e. por esta razão. as alíquotas de 6H-HCI conservadas a -20*C passara* a ser descongeladas e diluídas apenas na hora do ensaio.4$ radioatividade do precipitado do tubo Bo XBo total « radioatividade total x 100 radioatividade do precipitado do tubo RSB MSB = x 100 radioatividade total « o específica . (2) anti-soro 72 (100 ui de solução 1/90. sendo esta redu Ção U M pouco «ais acentuada a 4*C do que a -20"C. «) COMPARAÇÃO DO GH-HC - 12 *I COM GH-NIH - 125 I (PREPARAÇÃO PARA RADIOIODAÇAO FORNECIDA PELO NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH E MARCADA NO HC-FMUSP) 0s seguintes reagentes foram Incubados» em triplicate.000).125 I .

LI6. . 80 46 60 4O 20 10 15 20 25 30 DIAS PO'S RADIOIODAÇAO DO GH-H( (A) %DE LI6.VARIAÇÃO DA PORCENTAGEM DE LIGAÇÃO TOTAL ( • ) . 6 . éo 60 40 20 5 10 15 (B) 20 25 30 DIAS POS RADIOIODAÇAO DO GH-HC FIG.2 0 * C ( B ). INESPECÍFICA ( • ) E ESPECÍFICA ( â ) AO LONGO DE 3 0 DIAS APÔS RADIOIODAÇAO DO GH-HC COM ESTE CONSERVADO A 4 * C ( A ) OU A .

1. porisso. .1 2 5 I . a imunorreativj^ dade máxima entre 82 e 94% e a atividade específica entre 124 e 157 uCi/ug. Produção de anti-soro anti-GH A técnica de Imunização empregada para a produção de anti-soro anti-GH baseou-se primariamente no método de Va1tukat1s e coi. demonstrando a boa qualidade do para fins de RIE. 0 paralelismo observado entre elas confirmou o comportamento do GH-HC 1Z5 idêntico I em relação ao GH-HIH . Oito processos de radioiodação foram reali zados em um período de 9 meses. Nos outros 6 pro cessos. Indicando ser o nitrogênio liquido eficiente meio de conservação para o GH-HC. as curvas dose-resposta para cada hormônio marcado fo ram elaboradas e comparadas entre si (Fig. Em 3 tubos (NSBX incubou-se apenas tampão de ensaio (200 pi) e hormônio sarca do (100 |il).47 OU GH-NIH - I (100 pi de solução 1/200). (76). Apôs separação com PEG e contagem do preci pitado. o material rja dioiodado não foi submetido a purificação. o grau de contaminação com 125 I entre 4 e 15%. GH-HC 125 I Não houve deterioração significante de n<e nhum destes parâmetros ao longo dos 9 meses. a eficiência de marcação situou-se entre 64 e 71%. um a cada 45 dias aproximada mente.3. Em dois. a eficiência de marcação determinada pelo teste do carvão foi inferior a 501 e. 2. 7 ) .

48 L06IT0 B/Bo (%) 80 50 20 1.25 2.* J E GH-NIN-125! (A-*).COMPARAÇÃO ENTRE CURVAS DOSE . .RESPOSTA PREPARADAS COM GH -HC -'25l ( • .0 10 20 40 LOG [GH] (ng/ml) FIG.5 5. 7 .

Suécia). cujas excelen- tes características foram demonstradas pelos testes de c o n trole de qualidade. 9 ml de so lução salina e 6 ml de adjuvante completo de Freund. O QUAL FOI DEFINIDO COMO A DILUI .emulsão contendo 3 mg de GH (Kabi Diagnostica. Procedeu-se entco 3 titulação do anti- -soro para se determinar a necessidade ou nãu de novas 1munj[ zações. A cada 3 semanas. 3 coelhos da Nova Zelândia (idade média de 3 meses) foram imunizados. seguido de separação do soro e diluição do mesmo com tampão de ensaio na proporção de 1:1. 0 sangue coletado foi deixado em repouso a 4°C por 48 a 72 horas para que houvesse retração do coágulo. Estocolmo.49 Preparou-se. Após raspagem dos pelos do dorso. cada animal recebendo 30 aplicações intradérmicas de 0.inicialmente.6 mg de 6H. correspondendo a 0. foi realizada nova imunização nas mesmas condições que a primeira. Amostras de sangue foram colhidas através de da punçSo da veia central da orelha 10 dias após cada Imunização. Apôs a quarta imunização de um dos animais. seguida de homogenizaçao em Vórtex e repouso por 24 horas a 4°C para confirmar a não separação das partes. Estes consistiram em: a) DETERMINAÇÃO DO TÍTULO. foi finalmente obtido um anti-soro (anti-soro 72). sõ que com emu Isão preparada com adjuvante incompleto Freund.1 ml da emu1 são em diferentes pontos do dorso.

(3) GH-HC I (100 ul de solução 1/200). em triplicata. os valores da %Bo especifica para cada diluição do e anti-soro foram calculados e expressos no gráfico da Fig. ou 1/640. 8. Em 3 tubos (NSB). luçío 1/90. Incubou-se apenas tampão de ensaio (200 pi) e hormônio marcado (100 ul). . por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) concentrações crescentes de GH "frio" (100 pi de soluções cojt tendo desde 0 até 40 ng/mi). 0 titulo do anti-soro 72 foi então determinado pela diluição final correspondente a 501 de ligação especifica. em triplicate. Em 3 tubos.000) (2) anti-soro 72 (100 ul de so 125 e (3) GH-HC I (100 ul de soluçlo 1/200).000 em 125 tampão de ensaio).50 ÇÃO FINAL DO ANTI-SORO CAPAZ DE LIGAR BOX DO (54) HORMÔNIO MARCADO EM CONDIÇÕES PRÉ-ESTABELECIDAS Os seguintes reagentes foram incubados. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: tampão de ensaio (100 ul). seja. (1) (2) diluições progressivas do anti-soro 72 (100 pi de solução 1/30.000 até 1/1. Apôs separação com PEG e contagem do precj^ pitado. incubou-se apenas tampão de ensaio (200 ul) hormônio marcado (100 pi). b) CÁLCULO DA CONSTANTE DE AFINIDADE (K) PELO MÉTODO DE SCATCHARD (67) Os seguintes reagentes foram Incubados.000.920.

.51 % DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA 70 30 20 10 TITULO DO ANTI-SORO O o o 6 C D — o o _O d fO o o o o o o d ~d C M — O O O -d CD o o o -d C O oi DILUIÇÃO FINAL DO ANTI-SORO (LOG) FIG. 8-CURVA DE TITULAÇÃO DO ANTI-SORO 72.

• A partir do grafico relacionando estes parâmetros (grafico de Scatchard.1 . Os parâmetros radioatividade ligada/radioatividade livre (B/F) e concentração de hormônio ligado ao anticorpo (b) forem calculados para ca da padrão de 6H "frio" pelas equações: B F (Bi .NSB) IT . NSB = radioatividade do precipitado correspondente ao tubo NSB. o valor (2. de 2 K reta .(Bi-NSB)] (Bi-NSB) b » concentração de GH "frio" x onde: Bi * radioatividade do precipitado correspondente â concentração 1 ng/ml de GH "frio".52 Todos os tubos fora» contados antes e após precipitação com PEG para determinação da radioatividade total e do precipitado. IO 1 0 l/mole) foi determinado pela inclinação da obtida por regressão linear simples. Fig. T ' radioatividade total. respectivamente. 9 ) .

DETERMINAÇÃO DA CONSTANTE DE AFINIDADE ( K ) PELO GRA'FICO DE SCATCHARD.0 0.5 25 50 75 100 b(Mol/I.0 1.985 1. .S3 B/F 2.IO* 12 ) FIG. 9 .5 r= 0.

000 ng/ml cada um).1 2 5 I (100 ul de solução 1/200) e hormônio (100 ul).000 ng/ml) e LH.000) e '. (2) anti-soro 72 (100 ul de solução 1/90. e» triplicate. . PRL E HORMÔNIO LACTOGÊNICO PLACEN TÂRIO (HPL) FORNECIDOS PELO NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH (PREPARAÇÕES PARA RADIOIODAÇÃO) Os seguintes reagentes foram incubados. HPL (até 10. FSH e PRL (até 2. FSH.54 c) DETERMINAÇÃO DA IMUNORREATIVIOADE CRUZADA COM PADRÕES PUROS DE LH. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente: (1) concentrações crescentes de hormônio "frio" em tampão de ensaio (100 ui) tais como 6H (0 até 40 ng/mi). o grau de inibição da ligação maxima (B/Bo) foi d e terminado para cada hormônio pela equação: B — « (Bi-NSB) r x 100 Be (Bo-NSB) onde: BI • radioatividade do precipitado correspondente i concentração 1 ng/ml de hormônio "frio". Bo * radioatividade do precipitado correspondente i concentração zero.i) «arcado 6H-HC . TSH. Após separação com PEG e contagem do preci^ pitado. TSH (até 2500 ng/ml). NSB « radioatividade do precipitado correspondente ao tubo NSB.

2.1 ml foram liofilizadas e pos teriormente conservadas a -20°C.3t. ou seja. B/Bo * 50X (Fig. realiquotada eu volumes de 0. uma foi re constituída e diluída 1/10 em tampão de ensaio. conservadas a 4°C e utilizadas nos ensaios durante este período. As características do anti-soro 72.0. Este agente provoca a redução da quantidade de Sgua livre do sistema. Método de separação do complexo antígeno-anticorpo do antigeno livre A separação do complexo antígeno-anticorpo do antigeno livre foi realizada pela técnica do polietilenoglicol. resultando em diminuição da solubilidade e precipitação .6*. confirmaram a sua excelente qualidade. TSH < 0. soluções 1/90.55 A porcentagem de imunorreatividade cruzada do anti-soro 72 para cada hormônio foi então determinada pela razão entre a concentração de 6H "frio" e a do hormônio estu dado necessárias para provocar 50% de inibicão ( 2 ) .3X. comparáveis âs descritas na literatura para anticorpos anti-GH de comprovada eficácia (50).U. Os seguintes valores foram encontrados: LH < 0. PRL . 10). A partir destas últimas alíquotas. permitindo que ele fosse utilizado em todos os ensaios deste projeto.3X. HPL < 0. descrita em 1971 por Desbuquois e Aurbach (14).1.4. FSH < 0.000 em tampão de ensaio foram preparadas a cada 30 dias.1 ml e recongelada a -20°C. A cada 6 meses. Alíquotas de 0.

1 0 .25 2. CRUZADA Ill4ng/ml X 100 .6 % LOG 1 TO B/Bo(%) PRL 20 1.imunuirnc Ml IVIUAUt .5 5.) FIG.0.DETERMINAÇÃO DO 6RAU OE IMUNORREATIVIDADI CRUZADA DO ANTI-S0R0 72 COM A PRL. .0 10 20 40 250 500 1000 2000 LOG [ H ] (ng/m.

ao invés de técnicas mais so fisticadas tais como precipitação com segundo anticorpo. dos seguintes reagentes: (1) tampão de ensaio (100 ul). as porcentagens de ligação total. precipitação foi realizada com diferentes concentrações nais de PEG (2 a 20%) diluído em tampão de ensaio sem ao A fiBSA. promover a separação instantânea e e. citado como a prin^ cipai desvantagem deste método. 0 grau re lativamente alto de ligação inespecífica. correspondente tubo NS6). o PEG foi escolhido como método de separação. (2) anti-soro 72 (100 ul de solução 1/90. Por estas razões.1 2 5 I (100 ul de solução 1/200).57 do complexo antfgeno-anticorpo ( 7 ). Uma vez contados os precipitados. Inespecífica e especifica foram determinadas para cada concentração de PEG e expressas . (3) GH-HC . Suas principais vantagens consistem em ser um método simples e de baixo custo no caso do GH. correspondente ao tubo Bo) ou tampão de ensaio (100 ul.0 ml do mesmo imediatamente apôs adição soro humano (100 ul). quais exigem maior custo e complexicidade. de p1petando-se 1. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente. como é o caso do RIE de senvolvido neste projeto. eficiente do complexo antigeno-anticorpo do antígeno livre. não parece comprometer signi ficantemente a precisão de ensaios em que a capacidade de li gação total é maior do que 50X ( 7 ).000. A concentração de PEG a ser adicionada ao as ensaio foi determinada por experimento que consistiu na incu bação em triplicata.

II-VARIAÇÃO DA PORCENTAGEM DE LIGAÇÃO TOTAL ( • ) . . INESPECÍFICA(o) E ESPECÍFICA ( â ) EM FUNÇÃO DA CONCENTRAÇÃO FINAL DE PEG.% DE LIGAÇÃO 60 50 40 30 20 10 4 8 12 16 20 CONCENTRAÇÃO FINAL DE PEG (%) FIG.

Na ausência de soro. seguido da adição de 1.0 g/dl.. Estes dados demonstraram claramente a necessidade de uma concentra _. inespecffica e especifica foram calculadas para cada volume de soro adicionado an tes do PEG e expressas no grafico da Fig. Após contagem do precipitado. sifilis e Chagas) foi acrescentado ã mistura de incubação em volumes crescen— tes variando de 0 até 200 pi.59 no gráfico da Fig. Por esta razão.0 ml de PEG (concentração final 12. o incremento da concentração de PEG acima de 10X resultou em aumentos muito pequenos da XBo espe cífica associados a elevações mais significativas da XNSB.IX.. de monstrando não haver vantagem alguma em se utilizar concen- trações muito maiores do que 10X. 11. _J. Incrementos a partir deste volume resulta ram em aumentos progressivos da XBo total e XNSB. . A Influência da concentração proteica do valor •elo sobre o grau de precipitação do complexo antigeno-anticorpo provocado pelo PEG foi estudada em ensaio no qual realizou-se incubação idêntica ã do experimento anterior.j. aumentando substancialmente após adição de 25 pi de soro.It). as porcentagens de ligação total.^ I ••! •• "I- • -*^ "• •*• "' ' I l— I . sendo este utilizado em todos os ensaios deste projeto. 12. a concentração final de PEG foi fixada em 12. r . ao i i passo que a XBo especifica permaneceu praticamente constante. Soro humano ("pool" com concentração proteica total = 7. imunologicamente negativo para hepatite B. a precipitação do complexo antigeno-anticorpo com PEG foi multo pequena. _.L- .

.30 20 10 50 100 150 200 VOLUME DE SORO ( j i l ) FIG.VARIAÇÃO DA PORCENTAGEM DE LIGAÇÃO TOTAL ( • ) . 12 .1%). INESPECÍFICA ( © ) . E ESPECÍFICA ( â ) EM FUNÇÃO DO VOLUME DE SORO ADICIONADO IMEDIATAMENTE ANTES DO PEG (CONCENTRAÇÃO FINAL 12.

antes da precipitação com PEG. Protocolo do RIE de GH A elaboração do protocolo do RIE de GH.5.0 g/dl) nos tubos correspondentes â curva-padrão (diluída em tampão de ensaio).61 çSo mini«a de proteínas séricas (1. antes do PEG. des crito na Tabela I. seria adicionado.0 e 8. CONTROLES E AMOSTRAS Um padrão de GH contendo 1 ug/ml (preparado no dia da radioiodação) foi descongelado na hora do RIE e diluído progressivamente em tampão de ensaio até obtenção de . Com a finalidade de se igualar a concentra ção de proteínas séricas em todos os tubos de um determinado ensaio. envolveu o estudo de diversos fatores: • ) PREPARAÇÃO DOS PADRÕES DE 6H " F R I O " .2 «g/ml) para que a preci pitação do complexo antigeno-anticorpo pelo PEG fosse comple ta.1. foi estc*>e1ecido que. seriam acrescentados 100 ul de soro humano ("pool" com c o n centração proteica total variando entre 6. soro diluído em tampão de modo a completar volume de soro presente em cada tubo a 100 ul. Nos casos em que houvesse necessidade de diluir estas amostras com tampão de ensaio antes de sua dosagem. sendo pipetados 100 ul de tampão de ensaio nos tubos correspondentes aos controles e amostras desconhecidas. o 2.

0 1. anti-soro 72 e GH-HC.0 1. a) adiçio seqüencial. adiçio seqüencial de taapio/soro e PEG.c-mi (1/200) (pi) Taspio/Sora (Ml) PEG (in) (HD Total W) (•D 1. b) c) ú\ a) f) g) . aspiraçio do sobrenadante.0 •SB Bo A B C D E F Controla Aaostra 200 100 100 100 100 100 100 100 100 100 (taaplo) (taapio) (padrio 1.0 1. seguida de hoaojenização ea Vártex.0 1.0 1.0 ng/»l) (padrio 10 ng/al) (padrio 20 ng/al) (padrio 40 ng/al) (a«ostra) (aaostra) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 1OO 100 100 100 (soro) (soro) (saro) (soro) Uor«) (soro) (soro) (soro) (taapio) (ta»pl>. anílise dos dados obtidos atravfs do prograaa de coaputador RIA CALC. ia triplicata.Protocolo do RIE de GH Tubo Taapio/Padrio/Aaostra Anti-soro 72 (1/90.I .5 ng/al) (padrio 5. seguida de hoaogeninçâo ea Yírtei.25 ng/al) (padrão 2.0 1. iocubaçio por 20 a 24 horas a teaperatura aabitnte. centrifugasio a 3000 rpa por 30 ainutos a 4»C.0 1. de taapio d* ensaio/padrio/aaostra. eentagea do precipitado por 1 ainute ea detector de cintilaçlo gata.0 1.000) «u.62 Tabela I .0 1.

23 ng de traçado»* por ml da mistura de Incubação.0.25.07 ng e a uma atividade aproximada de 15.5 ml de cada controle foram conservadas a -20°C até sua utilização no ensaio.com concentrações de GH variando entre 20 a 25. foram preparados a partir de 3 "pools" obtidos pela mistura de soros previamente dosados. mantidas a -20°C desde a sua coleta. sendo desprezadas a seguir. 2. resultando em uma concentração f^ nal de 0. correspondendo * uma massa de 0. 5. incluí^ dos no início e no final de cada ensaio. Desta solução. 10.000 cpm. 7 a 10 e 1 a 3 ng/ml. Após o término do ensaio. respectivamente. Alíquotas de 0. As amostras de soro a serem dosadas. foi pipetjj do em cada tubo do ensaio. . 20 e 40 ng/ml). um volure de 100 ul. sendo ambas desprezadas apôs o término do ensaio. Os controles (alto. foram descongeladas no início do ensaio e recongeladas apôs o término deste. permitindo assim a repetição da dosagem caso esta fosse necessária. b) CONCENTRAÇÃO DO QH-HC - 125 I Uma solução 1/200 em tampão de ensaio foi preparada na hora do RIE a partir de uma alíquota de 100 ul de GH-HC I conservada a -20°C desde o dia da radioloda- ção.63 todos os pontos da curva (padrões "frios" contendo 1. estas so luções foram todas desprezadas. médio e baixo).5.

13B). ela escolhida e utilizada em todos os RIEs de GH realizados neste projeto. respectivamente. situan do-se em nível igual ou inferior a 10% para concentrações de GK "frio" acima de 1.000 e 1/27O. fo ram incubadas com antígeno "frio" e marcado de acordo com o protocolo da Tabela I.000 foi nitidamente superior â obtida com a solução 1/60. A precisão intraensaio obtida com a diluição 1/90.000 (0. elaborados segundo os critérios de Rodbard (60).000. A sensibilidade. definida como a dose mínima detectável. também foi melhor com a 1/90.000 e 1/90.8 ng/ml) do que com 1/60. 13A) foram comparadas pelos seus respectivos perfis de precisão (Fig.000 (1. . cujas respectivas <Bo especifica correspondiam a 65 e 62X.000 do anti-soro 72. as soluções 1/60.OOO. dados permitiram concluir que a solução 1/90.64 C) DILUIÇÃO DO ANTI-SORO ANTI-GH De acordo com Hunter (33).3 ng/ml). resultando em diluições finais do anticorpo de 1/180.000 solução Estes resuitava foi em melhores características do ensaie e.7 ng/ml. a diluição do anticorpo a ser utilizada em um determinado ensaio deve resultar em ligação específica ao redor de 651. porisso. Baseado nesta premissa. As carac terfsticas das curvas dose-resposta assim obtidas (Fig.

2 LOG [ G H ] ( n 9 / m l ) FIG.4 (A) 10.7 5.* ) E 1/90.65 L06IT0 B/Bo(%) 80 50 20 5.6 43.CURVAS DOSE-RESPOSTA ( A) E PERFIS DE PRECISÃO (B) PARA RIEs DE GH REALIZADOS COM DILUIÇÕES 1/60.6 43.000 ( * . .35 2.8 21.4 (B) 10.8 21.2 LOG [GH] (ng/ml) 1.000 ( • — ) DO ANTI-SORO 72. 13 .

9 ng/ml. 14A1. foi efetuada a separação com PEG. os RIEs de GH deste projeto passaram a ser realizados sem perÍ£ do de pré-incubação.6 ng/mi. associada a urna piora Importante da precisão intraensaio para concentrações de GH "frio" acima de 10 ng/nl.000. correspondente ao tubo NSB). (2) anti-soro 72 (100 ul (1) tampão de solução 1/90. Neste experimento. 14B). levou a uma redução muito discreta da dose mínima detectável (0.em tr1p!1cata. obtida sem período de pré-incubação). temperatura ambiente e a 37°C: de ensaio (100 ul). (3) GH-HC . realizada a temperatura ambiente ou a 37"C.I (100 pi de solução 1/200). A introdução de prê-i£ cubaçâo por 1 hora. os seguintes reagentes foram incubados. o tempo de incubação necessário para que a reação atingisse o equílí^ brio foi determinado em diferentes condições de temperatura. foram comparadas pelos seus respec tivos perfis de precisão (Fig. Por esta razão.a 4°C. Apôs adição do hormônio marcado. respectivamente. 0 cálculo da porcentagem de ligação . definido como a incubação do antigeno "frio" com anticorpo sem a adição do traçador. seguida de contagem do precipitado.66 d) TEMPO DE INCU3AÇÃO As características das curvas dose-resposta elaboradas com e sem período de pré-incubação (Fig.7 e 0. Apôs diferentes períodos de Incubação (0 a 48 horas). comparadas com 0. correspondente ao tubo Bo) ou tampão de ensaio 125 (100 ul.

25 2.0 (B) 10 20 40 LOG [GH] (ng/ml) FIG.0 (A) 10 20 40 LOG [GH] (ng/ml) 50 40 30 20 10 1..5 5.) E COM PERÍODO DE PRÉ-INCUBAÇÃO POR 1 HORA A TEMPERATURA AMBIENTE (à-k) OU A 37° C ( • .b/ao(%j 67 80 50 20 CV 1.25 2.CURVAS DOSE-RESPOSTA ( A ) E PERFIS DE PRECISÃO ( B) PARA RIEt DE GH REALIZADOS SEM PERÍODO DE PRÉ.• ) . 14 .5 5.INCUBAÇÃO ( — . .

segundo os critérios pr£ postos por Rodbard e col. formulado por D. Gianeila (comunicação pessoal) em 1982. a curva dose-resposta foi ajustada a uma reta por regressão linear não ponderada a partir das equações: . Em todos os ensaios (exceto os correspon- dentes ao cálculo da atividade especifica e da constante de afinidade).51). a XBo especifica era maior XNSB permanecia em níveis aceitáveis.68 total. nestas condições. respectivamente). inespecifica e especifica para cada tempo e temperatu ra de Incubaçâo (Fig. (2) a XBo especifica observada no equilíbrio durante incubaçSo a temperatura ambiente (47X) foi maior do que a 4* e 37°C (43 e 41X. (3) a XNSB durante incubaçâo a 4°C e a temperatura ambiente foi semelhante (ao redor de 16X). e a e) PROCESSAMENTO E ANÁLISE DOS DADOS OBTIDOS Os cálculos da curva dose-resposta e da con centração das amostras desconhecidas foram efetuados por um programa de computação denominado RIA CALC. (61). A partir destes dados. já que. mas inferior ã observada a 37°C (ao redor de 17. Este programa ba seia-se na transformação Iog1to-log. ficou estabelecido que a incubaçâo dos RIEs de 6H seria realizada a temperatura ambiente por 20 a 24 horas. 15) permitiu concluir que (1) a reação atingiu o equilíbrio mais rapidamente a 37*C (12 horas) do que a 4°C ou a temperatura ambiente (16 horas para ambos).

69 4#C TEMPERATURA AMBIENTE 37 # C 10 20 30 40 50 10 20 30 40 50 10 20 3 0 40 51 HORA! FI6.INFLUÊNCIA DO TEMPO t TEMPERATURA DE INCUBAÇÃO SOBRE AS PORCENTAGENS DE LIGAÇÃO T O T A L Í O . 1 5 . E ESPECÍFICA ( A ) . . INESPECÍFICA ( o ) .

6.logi B —% Bo Bi-NSB = Bo-NSB x 100 onde: BI = radioatividade do precipitado correspondente à concen— tração 1 ng/ml do padrão de GH "frio". Caracterização do RIE de GH a) COMPARAÇÃO COM PADRÃO INTERNACIONAL PARA DETERMINAÇÃO DE PARALELISMO E POTÊNCIA Em 3 ensaios diferentes. Bo ou NSB = radioatividade do precipitado correspondente aos tubos Bo e NSB. concentrações crescentes de GH-NIH (preparação de referência fornecida pelo National Institutes of Health) e GH-HC "frios" foram Incuba125 das com anti-soro 72 e GH-HC I. obedecendo ao protocolo da Tabela I. 2.1. As concentrações das amostras desconhecivalores das foram determinadas pelo cálculo dos respectivos logito (B/Bo %) e interpolação a partir da curva dose-respos ta.70 Logito (B/Bo X) « a • b. Após separação com PEG e contagem do precipita do. as curvas dose-resposta para cada hormônio foram compara ' •••• ! . respectivamente.

71

das entre si para determinação de paralelismo (confirmada por inclinações idênticas das curvas) e potência. Esta última

foi calculada pela razão entre as concentrações de GH-HC e 6H-NIH necessárias para provocar 50% de inibição da ligação máxima, ou seja, B/Bo = 50% (21). A Fig. 16 mostra claramente o paralelismo entre as 2 curvas, confirmando o comportamento idêntico dos 2 hormônios. O cálculo da potência revelou ser o GH-HC, em média, 7% mais potente do que o GH-NIH, permitindo dessa maneira a calibração correta dos padrões "frios" de GH-HC.

b)

SENSIBILIDADE

A sensibilidade, definida como a dose mfnj^ ma detectávei (DHD), f o i determinada pela concentração de G H que resultou em valor B/Bo estatisticamente Assim, diferente do

obtido para a dose zero ( 1 5 ) .

'(Bo-NSB) - 2 DP
D D * concentração de G correspondente ao logito N H

(Bo-NSB) onde: Bo - média das contagens do precipitado em 9 replicatas tubo Bo; DP • desvio-padrão de B~õ; NSB « contagens do precipitado do tubo NSB. do

LOGITO B/Bo(%)

80

50

20

1,25

2,5

5,0

10

20

40 LOG [GH] (ng/ml)

FIG. 16-COMPARAÇÃO DAS CURVAS DOSE-RESPOSTA PREPARADAS COM PADRÕES DE GH - HC (•—•) E GH- NIH ( * ~ á ) "FRIOS*.

73

A sensibilidade, calculada e» 12 ensaios, foi de 1,1 + 0,08 ng/ml (média • erro padrão da média), do considerada adequada para o estudo dos testes de ção de 6H. sen

libera-

c)

PRECISÃO

A variação intraensaio intraamostra foi de terminada pelo perfil de precisão (Figs. 13B e 14B), elabora do de acordo com os critérios propostos por Rodbard (60). e col.

0 coeficiente de variação (CV) para uma determinada de hormônio "frio" foi calculado pela equação:

concentração

«y CVx = dy/dx onde: íy = desvio-padrão da resposta B/Bo correspondente à concentração x (determinada em triplicata); dy/dx • inclinação da curva dose-resposta no ponto correspo^ dente i concentração x> x 100

Em todos os RIEs de 6H, a variação ensaio situou-se em nível igual ao Inferior a 10X para centrações de GH acima de 1,5 - 2,0 ng/ml e permaneceu redor de 5% para valores entre 10 a 30 ng/ml,

intraconao

Intervalo que

resultando em valores de 19.respectivamente. d) ESPECIFICIDADE A especificidade.4.6* para concentrações de 1. seqüenfoi de •êdio (8. 4. respectivamente. 8.3 ng/ml) fora» dosadas cialmente em um único RIE.2%. demonstrando a estabilidade do RIE.7 e 12. o coeficiente de variação 5.9. 8. de Quando 9 replicatas do controle baixo (2. foi estabelecida de acordo com os critérios propostos por Yalow & Berson (78): d ) Estudo dos efeitos não específicos do meio de incubação Uma possível dúvida surgida na elaboração do RIE de 6H consistiu na diferença existente entre a composição do melo de Incubação dos pontos da curva-padrSo (apenas tampão de ensaio) e das amostras desconhecidas (tampão de ensaio mais soro).7 e 4. definida como o grau interferência provocado por substâncias estranhas sobre de a reação antigeno-anticorpo.6.3 no/ml). foi médio e alto em 12 ensaios sucessivos. Não houve alteração signi- ficativa destes valores quando 4 replicatas foram determinadas no inicio e 4 no final do ensaio.74 compreende a maioria dos picos de 6H obtidos nos testes liberação.2 ng/ml. o que poderia Invalidar a comparação da .0 ng/ml) e alto (22. A variação interensaio intraamostra calculada por dosagens repetidas dos controles baixo.3 e 25.

9 e 14. por 20 a 24 horas a temperatura ambiente. 17 revela a identidade entre estas 2 curvas. Neste mesmo experimento. exibindo valores de 14.2 ng/ml). foram comparadas curvas dose-resposta preparadas com padrões GH-HC "frio" diluídos em tampão de ensaio e em r de stripper" (soro com concentração de GH < 1.000 em tampão de ensaio) e GH-HC 25 I (50 ul . tampão de ensaio e hormônio marcado (100 ul de cada). respectivamente. com anti-soro 72 (50 pi de solução 1/45. excluindo dessa maneira a presença de efeitos não específicos do soro sobre a reação antígeno-anticorpo e validando o protocolo do RIE de GH. obedecendo ao pro tocolo da Tabela I. a porcentagem de ligação Inespecífica. determinada pela Incubação de tampão de ensaio (200 pi) e GH-HC .75 razão B/Bo das amostras desconhecidas como as da curva-padrão.3%. Estes dados demonstraram a validade de se utilizar o mesmo NSB para o calculo da curva-padrão e das amostras desconhecidas. não foi significantemente diferente da calculada pela incubação de soro. A Fig. d ) Recuperação quantitativa Neste experimento.25 até 40 ng/ml em tampão de ensaio) foram Incubados em trip!icata. padrões de GH "frio" (100 ul de soluções contendo desde 1. Para se avaliar esta possibilidade.1 2 5 I (100 pi) por 20 a 24 horas a temperatura ambiente.

• ) OU EM "STRIPPER" ( * .0 10 20 40 LOG [GH ] ( n g / m l ) FIG. .76 LOGITO B/Bo (%) 60 50 20 1.5 5.COMPARAÇÃO ENTRE CURVAS DOSE RESPOSTA PREPARADAS COM PADRÕES DE GH "FRIO" DILUÍDOS EM TAMPÃO DE ENSAIO ( • . 17.25 2.* ) .

3 ng/ntl) e volumes idênticos de anticorpo e hormônio marcado. excluiu a presença de substâncias estranhas que pudessem Interferir com a reação antigeno-anticorpo nestas condições. 18) confirmou a identidade entre e s _ tes 2 parâmetros e excluiu novamente a presença de efeitos não específicos do soro sobre a reação antigeno-anticorpo. e utilizados para construção de curvas dose-resposta.1 ng/mi de GH fo125 ran Incubados com anti-soro 72 e GH-HC I. Simultaneamente. A identidade entre estas 2 curvas. sendo tra tados como se fossem amostras desconhecidas. A existência de uma relação linear tipo Y . as concentrações de GH presentes nestas amostras foram determinadas por interpolação a partir da curva dose-res posta e comparadas cem os valores esperados. obedecendo ao protocolo da Tabela I. 19. Apôs separação com PEG e contigem do precj^ pitado.77 de solução 1/100 em tampão de ensaio).X entre as concentrações esptí radas e observadas (Fig. completando-se o volu me final a 300 ul com tampão de ensaio. . padrões de GH "frio" e diluições progressivas (1/2 até 1/32 em tampão de ensaio) de soro de paciente acromegãiico contendo 43. do) Construção de curva dose-resposta com diluições progres sivas de soro de paciente acrompgálico Neste experimento. os mesmos padrões de 6H "frio" foram incubados com quantidade fixa e conhecida de GH (100 ul de soro contendo 5. demonstra da na F1g.

78 CONCENTRAÇÃO OBSERVADA ( ng/ml) 50 40 r * 0. .994 30 20 . 18-RELAÇÃO ENTRE AS CONCENTRAÇÕES ESPERADAS E OBSERVADAS DE GH EM ENSAIO DENOMINADO RECUPERAÇÃO QUANTITATIVA.2. 10 10 20 30 40 50 CONCENTRAÇÃO ESPERADA ( n g / m l ) FIG.

RESPOSTA PREPARADAS COM PADRÕES DE GH "FRIO" (•—•) OU COM DILUIÇÕES PROGRESSIVAS DE SORO DE PACIENTE ACROMEGAllCO í A—*). . 19.25 2.COMPARAÇÃO ENTRE CURVAS DOSE .LOGITO B/Bo (%) 60 50 20 1.5 5.0 10 20 40 LOG [ G H ] ( n g / m l ) FIG.

variação interensaio: 11. 169 e 449 ng/dl.9.1» para concentrações de 89. . foram dosados em duplicata no soro por "kits" ciais de RIE. ção por segundo anticorpo.características: fase sólida (anticorpo ligado 3 parede do tubo).2S para concentrações de 0.características: dosagem sem extração prévia. no! . DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS SÉRICOS DOS DEMAIS HORHÕ NIOS Todos os outros hormônios. . Tr Cambridge. a) SmC . 1.2.Genentech Diagnostics. MA. EUA).6 e 3. respectivamente."kit": "Sm-C Radioimmunoassay Kit" (Nichols comer- Institute Diagnostics.sensibilidade: 9 ng/dl: .4 e 9.80 2. CA.0% para concentrações de 0. 9.variaçío Intrasnsaio: 7. respectivamente."kit" "GAMMACOAT (" ^ X1 T Radioimmunoassay Kit" (Clinical Assays.sensibilidade: 0.50 U/ml. .70 e 1. 3. EUA). separa- TU .2 U/ml. respectivamente. . .3 e 3. San Juan Capistrano. .33.variação intra e interensaio: 5. com exceção da testoste rona.2.0 e 5.1 U/ml. .

7 e 13.1 e 5.2 e 4.variação Interensaio: 7. respectivamente. 5. 5.0. 5. . . . . .1.características: separação por segundo anticorpo. respectivamente. trações de 2.8.6. . 3.2% para concen- trações de 2.5 ug/dl. e) PRL .8 pUI/ml.3* para concentrações de 3.2X para concen- .sensibilidade: 0."kit": "GAMMADAB R P ij Prolactin Radioimmunoassay Kit" (Clinical Assays).1 e 12.3.2 pUI/ml.sensibilidade: 0. 7.81 - "kit": "GAMMACOAT l""'1J » ' Free/Total T 4 Radioimmuno — assay Kit" (Clinical Assays).variação interensaio: 7. 7. 4. d) TSH .8 e 3.características: separação por segundo anticorpo.variação Intraensaio: 4."kit": "GAMMADAB HS V N Ij hTSH Radioimmunoassay Kit' (Clinical Assays).3 e 5.variação intraensaio: 7.0 ug/dl. respectivamente.características: fase sólida (anticorpo ligado à parede do tubo).8.05 para concen- 13. respectivamente.6.6 e 14.2 ug/dl. . . trações de 2. .6 e 5.3.34 iiUI/ml.

.9.2% para concen- trações de 11.valores normais: calibrados pelo padrão da WHO 2 n d IRP-HMG.variação intraensaio: 5.8.5 mUI/ml.4 e 8. .6.variação interens2io: 7. 41. .7 e 172 mUI/ml.6 ng/ml. 8. respectivamente. respectivamente.6 mUI/ml. 38. . ."kit": "GAMMADAB R ['"ij LH Radioimmunoassay Kit" (Clinical Assays).características: separação por segundo anticorpo.características: separação por segundo anticorpo.0. g) FSH _ "kit": "GAMMADAB N I' ij FSH Radioimmunoassay Kit' (Clinical Assays). . 41.4 e 116 ng/ml.0 e 118 ng/ml. 2.sensibilidade: 1.sensibilidade: 1. .2 e 7.7.0.8% para concen- trações de 16.7.sensibilidade: 0. 5. 4. respectivamente.3X para concen— trações de 16. . f) LH . . 40. . .35 para concen- trações de 16.6 e 150 mUI/ml.variação interensaio: 5.9 e 5.variação intraensaio: 6.valores normais: calibrados pelo padrão da WHO 1st IRP 75/504. .4 e 9. respectivamente.1.

valores normais: calibrados pelo padrão da WHO 2nd IRP-HHG. .24 pg/dl. .sensibilidade: 0.6 e 5. CA.6 e 3. h) Cortisol TM |125 I l l\ . .45 para concen- 39.4 e 51. trações de 3. te."kit": "Coat . respectivamente.1 e 5.8% para concen- . .4.1 f/g/dl.83 . fase sólida (anticorpo ligado ã parede do tubo).6 »UI/ml.4. Los Angeles.2* para concen- .4% para concentra 23.2 e 4. 1) Estradioi .variação Intraensaío: 6.variação interensaio: 9.7. 6. ções de 8. 5. 11.variação interensaio: 8.4 e 49. respectivamente.variação Intraensaio: 11.características: dosagem sem extração prévia. .8. . EUA). .4 e ug/dl. respectivamente.4.Count Estradiol" (Diagnostic Products Corporation. trações de 8.9. 4.0 38.9 mUI/ml.A . trações de 3.6X para concen- 24.variação intraensaio: 7.1.6.8. 11."kit": "GAMMACOAT Cortisol Radioimmunoassay Kit" (Clinical Assays).características: fase sólida (anticorpo ligado à parede do tubo). .sensibilidade: 10 pg/mi.5 e 9. respectivamen- 5.7 e 2.

respectivamente. CA. Carson.3.nersham. o anti-soro (Radioassay Systems Laboratories. b) c) gileemia piasmática: método enzimático automatizado. A sensibilidade variou de 5. sen do a sua especificidade considerada adequada.0 e 5.4. Antes de ser utilizado. após extração do soro com acetato de etila: hexana (3:2) e sem cromatogra fia prévia. 111 e 295 pg/ml. Inc.7% e a interensaio de 12 a 15%. 2.5 ng/dl.84 trações de 37. sódio e potássio séricos: espectrofotometria de chamai . . OUTRAS DETERMINAÇÕES LABORATORIAIS Todos os outros exames laboratoriais foram incluídos na rotina do Laboratório Central do HC-FMUSP e determina dos por técnicas consagradas na literatura (3. a variação intraensaio de 5. 125 e 300 pg/ml.31): a) hemograma completo: a contagem global foi realizada em contador automatizado e a específica em lâmina após colo ração com mistura de Romanowsky (Leishman). Os padrões "frios" foram obtidos da Sygma e o hormônio trici ado da A.. j) Testosterona Os níveis séricos de testosterona foram determina dos por RIE segundo o método de Abraham ( 1 ).7. EUA) foi testado.variação interensaio: 13.5 a 6.6 a 6. 7.51 para concentrações de 81. respectivamente.

m) exame parasitoiogico de fezes: método de Faust e Hoffmann[ f n) cariótipo: analise em cultura de linfócitos. l 3. o equivalente nSo pararnétrico do "t" de Student. eficiência de Este teste foi escolhido por se tratar comparaçío entre variáveis Independentes. cuja distribuição não era p r e — viamente conhecida. com número relativamente pequeno de amostras. com poder de de 95% (43.85 d) uréia sêrica: método enzimãtico da urease. h) cálcio sérico: espectrofotometria de absorção atômica. j) fosfatase alcalina: método enzimãtico e cinêtico. 1) urina tipo I: microscopia óptica. e) creatinina sérica: método colorimétrico. As diferenças foram consideradas significativas ao nível de 5% (p < 0.05). albumina sérica: método do verde bromocresol. MÉTODOS ESTATÍSTICOS Os níveis de GH observados nos testes de tolerân- cia á insulina e clonidina foram comparados e estatisticameni te analisados pelo teste H ü" de Mann-Whitney.70). i) fósforo sérico: método de Fiske-Subbarow. f) g) proteínas séricas totais: método do biureto. .

inclusive os dados referentes literatura.86 Todos os valores foram expressos como média + _ 1 à erro padrão da média (EPM). .

VII - RESULTADOS .

laboratorial. caracterizado como em pelo altura Inferior a 46 cm e peso abaixo de 2. GRUPO 1: PACIENTES SEM DÉFICIT DE 6H Foram incluídos neste grupo 21 pacientes que pree£ cheram 3 ou mais dos seguintes critérios: a) b) ausência de sinais típicos de nanismo hipofisãrio.500 g ao nascimento para gestações a termo: 4 pacientes (FCS. FFH e JCES).0 ng/ml menos uit teste de estímulo (ITT ou clonidina). radiolõgica e hormonal. MAN. c) dosagem sêrica normal de SmC. de acordo C O M os dados obtidos na avaliação clínica. ritmo de crescimento normal. Os principais fatores que contribuíram para a baixa estatura destes pacientes foram: a) déficit de crescimento Intrauterino.88 Os pacientes foram divididos em 2 grupos. d) pico de liberação de GH maior do que 7. .

AVALIAÇÃO CLÍNICA (TABELAS II E I I I ) 1. JCES e A S ) . AVC e JCES). e) nanismo primordial. MTT. SRC. RTS. ADO. caracterizada pela média da altura dos pais inferior a 158 cm (correspondente ao centil 10 da população brasileira): RTS. Em 7 pacientes (JAM. JHS.9 e 17. SCN. caracterizado por inicio da puberdade apôs os 13 anos em meninuj e apôs os 14 em meninos: 5 pa cientes (SRC.6 pacientes (FCS.5 anos. CAC. AVC. EZ e MBH). não foi encontrada explicação para o déficit de crescimento. 7 pacientes per(FFH. . PMR.89 b) retardo puberal. SCN. A/M. MSP e JABÁ). ingestão g/dl: 7 d) doença crônica prévia (tuberculose pulmonar e ülcera duo denal estenosante): 2 pacientes (JCES e AS). e f) baixa estatura familiar. 1. FFK. caracterizado por retardo mental estigmas somáticos: 1 paciente (FCS). caracterizada por baixa proteica e proteínas séricas totais entre 5 . c) desnutrição discreta. IDADE E SEXO Foram estudados 15 meninos e 6 meninas. AHM. com Idade entre 2.1.

AAM. SRC. FFH. As c o n d i z e s n u t r i ç ã o foram consideradas inadequadas em 7 c r i a n ç a s FFH. ANTECEDENTES INDIVIDUAIS Todos os pacientes nasceram após gestações normais a t e r m o . AVC e JCES) e as de afeto domiciliar apenas 1 ( J C E S ) . MAN. 1.2. em a p r o v e i t a m e n t o ^scolar em 2 (FFH e R T S ) . Duas crianças (FCS e JCES) apresentaram cianose na hora do parto do e 5 (FCS. que nasceu prematuro ses) com peso de 1.500 g e altura abaixo de 45 cm. enquanto que 6 mães foram submetidas a cesárea. SCN e JCES) nasceram com peso menor que 2. apresentação cefálica. sem resultados satisfatórios . exceto o paciente SCN.800 g e altera de 37 cm. Foram observados retardo do desenvolvimento neuropsico-motor em 4 pacientes (FCS. Os pacientes JCES e AS tinham sido previamente sub metidos a cirurgias de úlcera duodenal estenosapte e pneu- . HISTÓRIA DO DÉFICIT ESTATURAL O início do retardo de crescimento foi observado des de o nascimento até 3 anos antes da avaliação inicial no HCFMUSP. Quinze (7 mepartos foram por via vaginal. RTS. apenas um domi ciliar. Vários pacientes tinham sido previamente tratados com v i t a m i n a s ou anabolizantes não hormonais. SCN e JCES) e baixo de (FCS.90 1. R T S .3.

91

m e c t o m i a direita por tuberculose pulmonar,

respectivamente.

A m a i o r i a referia verminose anterior t r a t a d a . Doze pacientes relataram início do d e s e n v o l v i m e n t o puberal entre 9 e 17 anos, sendo este c o n s i d e r a d o em 4 (SCN, A V C , JCES e A S ) . em M B M aos 12 a n o s . retardado

A menarca tinha o c o r r i d o apenas

1.4.

ANTECEDENTES

HEREDITÁRIOS

A média da altura dos pais foi m e n o r do q u e 1 5 8 cm em 7 pacientes (FFH, RTS, S C N , PMR, CAC, EZ e M B M ) , não sendo possível d e t e r m i n a r a idade em oue teve início a paterna ou m a t e r n a . p'jberdade

Apenas os pais de F C S eram consangüíneos

(primos em lfi g r a u ) , enquanto que só JHS tinha um irmão com n a n i s m o (hipofisário). N ã o foram detectadas outras patologias

f a m i l i a r e s que pudessem ajxiliar no d i a g n ó s t i c o da causa da baixa estatura.

1.5.

INTERROGATÓRIO

COMPLEMENTAR

Não foram observados sintomas importantes referentes aos sistemas neurológico, cárdio-respiratório, gastro-i£ testinal, ósteo-articular ou endócrino em nenhum dos pacientes estudados.

f.V '.

' r " f '•',

92

1.6.

EXAME

FÍSICO entre

A altura variou entre 1,3 e 4,2 DP e o peso 0,7 e 3,4 DP abaixo da média para sexo e idade.

0 exame clínico de FCS revelou retardo do desenvol vimento neuro-psico-motor associado a hipotonia global e estigmas somáticos comopálato ogival, retrognatia, filtro sal curto e esboço de sinofris. na-

No paciente MAN, foram dee EZ, não

tectados pectus escavatum e prega simiesca e, em JABÁ nevos em tronco e pálato ogival. Os demais pacientes

apresentavam estigmas ou anormalidades importantes. Oito meninos e 1 menina não mostravam nenhum sinal de puberdade ao exame físico, sendo classificados como Grupo IA (Tabela I ) . Nos outros 12 pacientes, incluídos no Grupo ras

IB (Tabela I I ) , foi detectada pubarca em todos, telarca

5 meninas e testículos com dimensões maiores do que 2,5 cin nos 7 meninos.

2.

AVALIAÇÃO LABORATORIAL E RADIOLÓ6ICA GERAL III)

(TABELAS II E

As proteínas séricas totais estavam

discretamente

diminuídas em 4 pacientes (FCS, FFH, SRC e AVC), sendo deteve tada hipoalbuminemia em apenas um {FCS). Foi constatada an^ e

mia hipocrômica microcitica em 4 pacientes (FCS, A^M, AVC

93

TABELA II - Dados clínicos e laboratoriais em pacientes pré-púberes sem déficit de GH (Grupo IA)
Noie Sexo Idade cr on. (anos) (kg) (-DP) Peso Altura Idade Idade óssea (anos) Ritio cresc. (c«/ano) (g/dl) Heiog. Prot. tot. (g/dl) (g/dl) Alb.

(1)

(c.)

( •DP) -

1)

estat. (anos)

FCS KAN FFH RTS JM A

H M M
H

2,9 9,0 91 ,
11,0 11,0 12,1 13,0 14,5

10,2 22,0 19,0 18,7 31,1 26,8 25,2 24.3 IS.5

2, 6 1.1 1,7
1. 8

85, 0
122, 0 114, 3 120, 0 131. 138,

3,1 1,9 3,3 3,0 1,8 1.3 3,1 5.5 2, e

1,7 7,0 5,7
6,5

1,5

0

10,2 13,9 13,5 12.4 12,6 12,3 12,6 13,3 11,2 12-16

5,3

3,2

7 6
10

5,6 6,3 5,3 3,3 2,1 4.2 5.1 5,1

7,4 5,8
6.1

4,3
3,9 i.,0

H K K
H

0,7 1.2 1.8 8 2.,
, 1,4

7 3

3,5
10,0

8
10

7.0 7,4 6,5 5,6 69 ,
6-8

4,0
4,3

;o o
AAM
SRC AHH
Nonal

130, 0 123,

8,2 7.2 5,2

8
10
t,

3,8
4,3 4,0 3,5-5,0

, 3

F

7,9

112, , 1

(1)

Desvio-padrão ei relação à aédia para sexo e idade segundo as tabelas de Karques e col. (45).

9 13. J 8. cW11 0.5 4. (45).4 61 .5 9 1 1 10 12 1 1 4.0 138.8 12.Dados clínicos e laboratoriais em pacientes püberes sen déficit de GH (Grupo IB) Noae Sexo Idade cron. 4 141 .7 39.3 2.7 14. 1 132.7 31.5 6. 7 (-DP) (D estat.5 .5 34.3 6.8 14. .8 1.9 2. 61 . 6 142. (anos) (kg) Peso Altura Idade Idad* óssea (anos) Ritto cresc. 75 .8* zi .1 13.7 30.i .8 13.0 (l) Desvio-padrSo tu relação a ifdia para seio e idade segundo as tabelas de Marques t col.7 2.2 2.0 6. 3.3 4.2 4.7 13. (c«/ano) (g/dl) Hciog.4 128.3 25.6 (c ) 140. 5 152. 4.2 25.3 13.0 4 . 6-8 4.7 4.4 28.7 3. tot.5 17. 71 ." 3 3.5 4.9 12.2 7.1 15.0 7. 2.0 15.1 4.2 3.5 11.1 34.0 30.8 12.8 0 l.7 7.2 L.í. (anos) HTT JHS HSP SCN PHR AVC JCES 1 M M H H N M F F 12.2 25.2 6.2 16.9 10. 3.0 12. (ç/dl) lifil) Aib.0 146.5 2.0 6.0 11.3 3.7 8.4 15.7 • " CAC JA9A 9.0 126.4 3.0 10.0 *. 5.8 11.P it 5 8.7 1. 5 141 .1 31.2 3.5 12-16 E: KBH AS Nor»al F F F 1.5-5.7 6? .0 10.8 142. 8 .0 39.94 TABELA III .1 12.8 2.6 95 . 12. Prot.7 11.6 13.3 9.7 11. 8.4 5.4 1.4 4.1 ll.2 1.5 9 9 1 1 12 10 13 13 6.5 10.4 3. 5 135.0 15. 69 .

do que Já no Grupo IB. sendo compatível com a idade esta tural em 13 casos. a testosterona e o estradiol -se em nível inferior a 27 ng/dl t 10 pg/ml. Foram detectados níveis cos normais de LH e FSH em todas as meninas púberes. JHS. 0 Rx de mãos e punhos revelou retardo da idade óssea em todos os pacientes. MSP.95 EZ) e verminose em 5 (RTS. quando correlacionada com a idade cro nológica e sexo. 3. Todos os outros exames laboratoriais g e r a i s . situaram respectivamente. assim como a SmC. AVALIAÇÃO HORMONAL BASAL (TABELAS IV E V) As concentrações séricas de T . No Grupo IA. os valores de T foram sempre maiores 60 ng/dl. . bem como o Rx de crânio e o cariótipo (este último realizado ape nas em MAN.enquanto que os de E_ peimaneceram abaixo da sensibilidade do ensaio (10 p g / m l ) . JABÁ e EZ) mostraram-se normais. AHM. AVC e A S ) . e TSH apresenta ram-se dentro dos limites da normalidade em todos os pacientes. T.

22-2.7 (0.08-1.2>-2.9 3.9 (0.28-3.8-5.1 (ng/dl) 13.2 26.0 AM H 0.0 AO D 2.1 2.0 UuiM) 2.9 (0.0 FFH 6.0 3-27 < 10 Valores noraais para sexo e idade cronológica.* (0.8) 2.6 (pg/il) M0 ei 1 (0.6 2.2 (0.U-4.6) 181 9.90-5.0 1.5 0.22-2.0 JAU 2.8) 181 10.9 16.8) 189 10.0 AN A 1.8 (0.7 *.7) 2.6 25.7 < 10 Nonal (1) 80-200 4.5-11.D "' HAN 1.96 TABELA IV - Avaliação hormonal basal em pacientes sem d é f i c i t de G (Grupo IA) H SiC pré-púberes Noie T 3 T TSH T l 2 (ü/.28-3.3 25.0 11.0 SRC 181 10.8) 180 9.2 20.2 (0.6 RTS 188 10.7) 170 11.22-2.3 20.0 1.0 2.5) 152 8.l) FCS (ng/dl) 180 Wdl) 9.60 (O. .

0 3.5-11.7) 2.1) 3.0 < 10 AS 160 10.41-4.1) 1.20-5 .1] 2.2 1.8 (0.1 (0.91-3.0 2.91-3.5) I 3 (ng/dl) 160 T 4 (tig/dl) 8.71-4 .28-3.7 < 10 HBtt 161 8.0 445 JCES 168 9.5 (0.4 3.7 < 10 JA8A (0.5) 2.7 76 CAC 200 8.0 > 50 < 82 (l) Valores nonais para sexo e idads cronológica.0 (ng/dl) 542 JKS 178 9.90-5.8 65 AVC 188 10.Avaliação hormonal basal em pacientes púberes sem déficit de GH (Grupo IB) fco»e StC (U/.8) EZ 2.0 TSH (|iUI/i!) 1.97 TABELA V .1) 190 11.99-6.7 (0.91-3.5 < 10 Noraal 80-200 4.91-3.0 1.6 (0 .8) 6.0 (0 .8-5.8 257 PMR 195 11.5 3.8 .0 1.5 (0.9 < 10 150 9.l) KTT 1.2 1.28-3.7 (0.3 (0.3 (0.5 0. .9) (1 1.99-6 .1) 6.7 1.6 153 «SP 160 468 SCN 185 9.7) (D 1.

0 ng/ml. Três pacientes (FFH e ADO do Grupo IA e AVC do Gru po IB) apresentaram níveis basais elevados de GH. estes níveis ultrapassaram 7. Após o estímulo hipoglj^ foi de cêmico.1.3 + 2. sudorese e sonolência. no entanto.8 ng/ml. Todos os pacientes queixaram-se de mal-es- tar geral. não sendo es_ tatisticamente diferente (p = 0. não sendo necessá rio.°%). foi obtida hipogl icerniu ou inferior a 45 mg/dl. Após administração áa insulina.4%).0 ng/ml em 10 (90. A média dos picos de GH foi de 15.98 4. VII E VIII) igual para a Em todos os testes.6 ng/ml. TESTES FARMACOLÓGICOS DE ESTÍMULO 4.3 + 1. 10. . TESTE DE TOLERÂNCIA Ã INSULINA (TABELAS VI. provavelforam pertenGH mente devido a "stress" na hora do teste. náuseas. 11 pacientes partiram de concentrações basais de GH inferiores a 3. interromper o teste devido a perda de consciência em nenhum deles. considerada estímulo efetivo liberação de GH.7 ng/ml.0 ng/ml em 5 (71. incluindo o doente JAM no qual não hou ve aumento dos níveis hormonais durante o teste. e. _ No Grupo IB. média dos picos de GH.47) da obtida no Grupo IA. excluídos da comparação com os demais.es A tes níveis elevaram-se acima de 7. Os outros 7 centes ao Grupo IA partiram de concentrações basais de menores do que 3. porisso.

5 I.3 13. .0 6.6 1.3 1.4 9.2 12.8 1.4 < 1.6 16.3 2.6 12.8 2 (1) Média das concentrações de GH nos teipos de -30 e 0 »inutos. 2*. 0 1.3 1.99 TABELA VI .2 1.1 1. 9 1.6 3.5 11.tO 9.6 1.3 1.2 21.1 <1.1 2.8 10.5 <1.1 21.2 7.5 18.2 <i.3 < 1. 1 8.3 21. .3 2..l) ITT Clcnidina B MTT JHS MSP SCN PMR AVC JC£S CAC JAdA < 1.1C B 1. 3 9. 5 23.1 3.1 1.8 11.9 3. 0 .2 2.30 10.3 1.2 . 1 <1.1 11.8 <1.7 4.16 14.4 1.9 33. ADO e AVC fora» excluídos do cálculo das iédias no ITT por apresentarei valores basais elevados de GH..4 38.3 3 22.2 10. Pacientes púberes (Grupo IB) GH (ng/.3 26.7 2. 4 13.6 6.9 5. (2) Para o cálculo da «édia.2'J P 7.5 Noie EZ M8H AS a EPM 1 .9 11.2 1.7 0.3 11.1 15.6 1.5 0.2 3.2 1.3 1.3 12.5 0.2 6.o 1..9 0 . 6 4.0 1. 8 11.3 <1. 6 12. 1.9 < 1.6 15..1 8. as concentrações de GH que caírai abaixo ia sensibilidade consideradas iguais ao valor da sensibilidade do respectivo ensaio. forai (3) Os pacientes FFH..Níveis de GH em condições basais (B) e de pico (P) em pacientes sem déficit de GH Pacientes pré-púheres (Grupo IA]) GH (ng/.6 30..l) Clonidina Noae ITT ) P P B FCS MAN FFH RTS JAN ADO AAN SRC AHM 3. 8 3.1 p < 1.5 2.1 16.2 15.7 1.4 3.4 1.

5 85 ITT 15 2.8 73 9.2 Clonití ina (0 .4 0.Níveis séricos de GH nos testes de tolerância ã insulina e clonidina em pacientes pré-púberes sem déficit de GH (Grupo IA) Note Dosagei -30 3.4 (2) Glice.8 54 12. U.2 1.3 2. 77 8..6 49 2.1 30 6.8 37 1.21 e.1 <1.6 58 9.2 1.2 30 <1.5 11.2 <1.3 79 2.7 43 12.4 38 21.5 0.7 0.6 3.2 <1. 1.1 71 1.8 C <1.1 <1.0 60 9.1 11.0 t.8 45 <1.2 87 2.7 53 10.0 £.5 1.0 72 6.ia (ig/dl).5 54 17.6 74 36 1.1 U/kg) 45 30 10.7 54 8.9 -30 3.26 1.11 1.. (3) Para o cálculo das •(dias.5 7 <1.4 21 73 3.2 <1.7 59 5.6 1. EPM (1) GH (ng/«l).6 77 90 5.9 2.2 9.2 41 7. 2.100 TABELA VII .4 <1.0 <' 1. 1.9 <1.1 <1. as concentrações de GH que cairai abaixo da sensibilidade forai considir*das iguais ao vaior da sensibilidade do respectivo ensaio.0 ^.7 15.1 8! I.9 53 60 8.3 71 1.5 5. .8 23 14.: 6. L.9 88 11.7 55 8.9 67 11.8 2.3 69 11.1 23.I 85 9.2 <1.1 0.6 0.2 5.7 53 4.2 3.2 53 2.25 6.9 13.5 : - G GH G GH G GH G GH G GH G GH 78 2.7 74 6.0 4.3 81 1.3 93 0 2.2 1.4 •gV) 90 5.1 1.3 88 1.3 40 5.1 88 7.2 45 1.2 1.7 r 27 1.» 92 55 1. 1.4 12.3 1.2 8.3 38 5.6 81 3.5 79 GH G GH G I.6 10.2 47 2.37 90 1.7 7.2 69 3.3 6.7 14 4.5 22 (0.0 77 2.2 1.2 53 9.6 92 16.4 2.5 87 2.7 51 8.6 <1.5 24.0375 0 30 60 1.4 1.' FCS HAN FFH R1S JAM ADO AAH SRC AHH Média (3) 1. ' .2 2.1 27 3.3 1.8 2.1 1.

2 GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH G GH <1.4 44 1.1 SC " 18. (3) Para o cálculo das aédias.5 1.5 84 6.C PBR <1.3 68 73 <1.3 72 9. 77 1.2 <1.2 38.8 87 6.0 1.2 95 3.8 2.7 40 6.2 JABA 11 <1.4 1.3 24.5 1.2 10.2 10.4 27 7.5 38 2.0 6.7 10.1 66 5.1 83 1.5 66 8.6 54 1.1 84 1.0 59 1.2 <1.0 17.0 12.4 14.2 34 51 1.2 74 75 3.3 0.3 2.0 <I. (2) Gliceaia («g/dl).4 78 4.2 2.1 19.5 " BM 21.0 6.4 51 11.5 96 1.0 26.3 AS G GH Hftíia^ EPH 12.2 <1.6 90 4.8 27 7.9 91 1.0 36 39 47 60 1.3 <!.1 45 2.101 TABELA VIII .3 81 77 34 39 36 35 44 15.5 1.3 <1.2 69 5.7 84 1.4 1.6 73 1.7 2.2 14.4 80 2.6 3.8 *.Níveis séricos de GH nos testes de tolerância ã insulina e clonidina em pacientes púberes sem déficit de GH (Grupo IB) ITT (0.2 <1.0375 iq/i') j | j ' Noie Dosagea -30 GH 0 <lt2 15 <1>2 30 lf2 45 7 9 60 ? 2 90 6>1 I3Õ l>3 Õ <I>2 30 <1>2 60 ' 90 <! 2 ÍTíT G JHS (2' ' <1>2 ' ' <lt2 ' 80 1.3 <1.8 26.7 2.2 1.1 U/kg) Clonidina (0.6 12.3 2.5 2.2 49 9.0 1.0 63 10. as concentrações de GH que caírai abaixo d? sensibilidade fora§ consideradas iguais ao valor da sensibilidade do respectivo ensaio.3 '1.1 84 1.08 0.3 74 30 40 56 61 1.22 0.4 24.1 85 19 2.5 3.45 2.2 64 52 <l.3 <1.5 2.4 ! JCE$ 21.3 11.7 30.1 26.1 2.4 <1.4 <1.4 83 82 2.2 1.1 45 9.9 2.2 <1.1 2.0 16.14 0.6 <l.0 46 <1.3 0.6 60 %?.9 1.6 1.2 40 2.3 87 84 44 <1.1 0.0 9.4 *. .6 3.6 62 i 1.6 1.6 40 5.9 1.3 19.0 <l.6 (1) GH (ng/.1 38 3.7 18.7 1.2 17.1 60 7.4 3.6 2.6 1.1 39 42 3.2 33.63 3.1 13.8 1.8 1.9 15.4 10.6 16.6 74 1.0 5.4 1.6 2.3 4.3 1.l).1 2.0 73 9.4 94 1.2 43 28 6.2 77 5.7 *VC \ 1.£ CAC <!.3 <1.7 89 2.8 1.6 79 2.5 15.3 8.1 6.3 <1.9 2.2 93 1.1 57 45 2.22 0.5 9.6 45 2.

TESTE DA CLONIDINA (TABELA VI.1 mmHg para a diastólica. com resposta inferior a 7. da foi de 10. IB Entretanto. a media dos picos de GH de 14. os níveis de GH observados nos dife .8 + 2. 9 X ) .26) da obtida no ITT.5 n g / m l .9 + 1. não sendo estatisticamente (p = 0. 4. houve discreta r e d u ç ã o níveis pressóricos associada a leve sonolência. a c o n c e n t r a ç ã o máxima de GH ocor reu entre 30 e 90 minutos após injeção da insulina.2. VII E V I I I ) dos Na maioria dos testes. Todos os pacientes partiram de níveis b a s a i s de GH inferiores a 2. No Grupo IA (9 p a c i e n t e s ) . 1 5 ) . o c o r r e n d o entre 60 e 120 minutos após administração da c l o n i ó i n a . siderando todos os 9 pacientes.7%). 0 cortisol só foi dosado no paciente F C S .4 ng/ml.28) nem da observada no ITT no G r u p o (p = 0 .0 ng/ml. a clonidina diferente promoveu apenas Incremento na concentração de GH acima de 7. mais fre q u e n t e m e n t e no tempo 60 (7 p a c i e n t e s ) . a r e s p o ^ Coji foi e A que de ta à clonidina foi maior do que 7.5 não sendo estatisticamente diferente da obtida no m e s m o teste no Grupo IA (p = 0. No.Grupo IB (12 p a c i e n t e s ) .102 Em ambos os c upos.9 +_ 1.0 ng/ml em 8 ( 8 8 .0 ng/ml em 5 (41.2 + 3. mostrando uma resposta normal ao estímulo h i p o g l i c ê m i c o (Tabela X V I ) . foi de 12.8 mmHg para a pressão sistõlica 5. A média dos pico de GH. incluindo os 7 p a c i e n t e s ng/ml.

103

rentes tempos do teste da clonidina foram discretamente infe riores aos do ITT (Fig. 2 0 ) . Em ambos os grupos, a concentração máxima de GH ocor reu entre 60 e 120 minutos após administração da clonidina, mais freqüentemente no tempo 60 (9 pacientes).

4.3.

TESTE DO TRH ASSOCIADO

AO LHRH

Este teste sõ foi realizado no paciente FCS, revelando respostas hipofisárias normais de LH, FSH, TSH e PRL. a

Os níveis basais elevados de PRL deveram-se provavelmente "stress" na hora do teste (Tabela X V I ) .

5.

SEGUIMENTO

(FI6S. 21 E 22)

Todos os pacientes apresentaram ritmo de crescimen to adequado, com exceção de FCS e ADO. Durante a evolução,

foi observada pubarca em ADO aos 12,5 anos e início da pube£ dade em SRC aos 14,8 anos, permanecendo pré-púberes os demais componentes do Grupo IA. Já no Grupo IB, houve progressão

discreta dos sinais puberais em todos os pacientes.

104

30

60

90 120 TEMPO (MINUTOS)

FIG. 2 0 - NÍVEIS SERICOS DE 6H ( MEDI A ± ERRO PADRÃO
DA MÉDIA) NOS TESTES DE TOLERÂNCIA À INSULINA { • — • ) E CLONIDINA ( * — * ) EM PACIENTES PÚBERF.S SEM DÉFICIT DE GH.

105

M-TURA cm

90
80 70 60 150 140 30 120

110
00 90
• i i i i i i i i

5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 20
IDADE EM ANOS IG. 21 - RITMO DE CRESCIMENTO DE 21 PACIENTES DO SEXO MASCULINO COMPARADO COM O GRA'FICO DE MARQUES E C 0 L . ( 2 8 ) . ( • ) INÍCIO DO TRATAMENTO COM GH. ( t ) INÍCIO DA PUBERDADE.

( * ) INÍCIO DO TRATAMENTO COM GH.106 AS CAN i—i—I—I—i—i—i—I—I—I—i—i—i i i • • i . i i 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 20 IDADE EM ANOS FIG. ) INÍCIO DA PUBERDADE. 22 .R I T M O DE CRESCIMENTO DE 9 PACIENTES DO SEXO FEMININO COMPARADO COM O GRAFICO DE MARQUES E COL. ( 2 8 ) . .

0 e 16. Em 4 pacientes (RJSC. CC e JAS) devido à presença de consangüinidade entre os pais. 1.107 GRUPO 2: PACIENTES COM DÉFICIT DE GH Foram incluídos neste grupo 10 pacientes que preer cheram 3 ou mais dos seguintes critérios: a) b) c) d) presença de sinais típicos de nanismo hipofisârio. A etiologia do distúrbio hormonal foi considerada idiopática em todos os pacientes com exceção de FSGS. ritmo de crescimento redu2ido. CAN e FSGS). CC e JAS) foram classificados como déficit isolado de GH.1. IDADE E SEXO Foram estudados 7 meninos e 3 meninas. AVALIAÇÃO CLÍNICA 1. FK. Entretanto. pico de liberação de GH menor do que 5. . com idade entre 5.0 ng/ml err 2 t e s tes de estímulo (ITT e c l o n i d i n a ) . PCS. AMAS. Os outros 6 pacientes (ARC. P C S . e/ou respostas subnormals dos demais hormônios hipofisários aos estímulos de hipoglicf? mia. na qual foi diagnosticado craniofaringioma. WL. TRH e LHRH. dosagem sérica diminuída de SmC. suspeitou-se de doença hipofisária familiar em 4 (ARC.1 anos. foi feito o dia£ nõstico de deficiência hipotaiâmica-hipofisária múltipla pelos níveis séricos basais reduzidos de T e T.

3.2. Dois pacientes (JAS e FS6S) referiram início do d£ senvolvimento puberal aos 14 e 15 anos. a não ser criptorquidia tratada com Pregnyl en AMAS. 1. Com exceção de vitaminas. nutrição foram consideradas inadequadas em 4 crianças WL. sendo 3 pélvicos e associados a cianose do recém-nascido. com duração de 9 meses. antes de nenhum paciente tinha recebido qualquer tratamento procurar o HC-FHUSP. As condições de (PCS. CAN) e as de afeto domiciliar em apenas 1 (ARC). HISTÓRIA DO DÉFICIT ESTATURAL O retardo de crescimento foi notado pelos familiares nos primeiros 6 anos de vida. Os 10 partos foram por via vaginal. Apenas 1 criança nasceu corn peso inferior a 2.108 1. asma brõnquica em RJCS e verminoses prévias.500 g e nenhuma com altura abaixo de 48 cm. respectivamente. CC. do os demais pré-púberes. ANTECEDENTES INDIVIDUAIS Todas as gestações evoluíram sem intercorrências. Foi observado retar- do do desenvolvimento neuro-psico-motor no paciente PCS e um baixo aproveitamento escolar em RJCS e PCS. Não foram relatadas outras patologias importantes em nenhum dos doentes. I Í .

INTERROGATÓRIO COMPLEMENTAR poliúria. relewntes nas demais famí' | 1.4. PCS. ANTECEDENTES HEREDITÁRIOS A média da altura dos pais foi menor do que 158 cm em apenas 1 paciente (FSGS). CC e JAS). EXAME FÍSICO Sete pacientes (ARC. Não foram a detectadas outras anormalidades em nenhum dos pacientes. No Grupo 2B (púberes). não ser presença de fronte olímpica e esclera a2ulada em CC. PCS. constituído por apenas 2 . de 1 . Seis meninos e 2 meninas foram considerados pré-p£ beres ao exame físico.109 1. associados a pele ressecada e reflexo aquileu lentificado em 2 (RJSC e P C S ) .6. FK. CC. não sen do referidas outras patologias lias. Foi relatado nanis mo acentuado (não investigado) só em 1 irmão de ARC. A paciente FSGS apresentava polidipsia. nictúria e hemianopsia bitemporal não associada a cefaléia. Nenhum dos outros doentes referia sintomas neurológicos. CAN e JAS) apresentavam sinais típicos de nanismo hipofisãrio como nariz em sela e adiposidade abdominal. hipotireoidismo ou de hipocortisolismo. sendo observada consangüinidade entre os pais de 4 (ARC.5. sendo classificados como Grupo 2A (Tabela I X ) . RJSC.

anormalidades ao A idade óssea estava retardada em todos os pacient e s .2 cm de diâmetro. 2. Nos demais pacientes. 2 . Os demais exames laboratoriais e ^ tavam dentro dos limites da normalidade. WL. sendo confirmado o diagnóstico de tumor cístico com extensão intra e suprasselar pela tomografia computadori zada. desdobramento do assoalho.nc elementos (Tabela X) a paciente FSGS apresentava pubarca e telarca (estádio II de T a n n e r ) . o estudo radiolôgico não mostrou nível da sela türcica. CC e FSGS) e graus variáveis anemia normocítica normocrômica ou microcítica hipocrômica em t o d o s . 0 Rx de crânio de FSGS revelou sela túrcica con cii mensões a u m e n t a d a s . com exceção de FK. e calcificaçã> suprasselar. não sendo compatível com a idade estatural em apenas (AMAS e W L ) . sendo detectada hipo_ albuminemia discreta em apenas 1 (CAN). enquanto que JAS tinha testí culos com 3. CC e C A N ) . AVALIAÇÃO L A B O R A T O R I A L E RADIOLÓGICA GERAL E X) (TABELAS IX As proteínas séricas totais encontravam-se diminuí das em 4 pacientes (PCS. Foi constatada verde minose em 3 pacientes (WL.

9 4.5 2 5. (anos) (s/ál) 11.8 2. 5. C C CAN Noraa! K M H 9.7 10.5-5.9 0.1 8. 4 0.4 11. 133. Alb.2 10.0 5. (45. 2 113. 6 114.0 26.2 10. 2.5 3 5 7 4.4 6. tot. (c»/ano) Heioç.5 2.5 7.0 í. 1 3.7 4.4 5 ii *í 11. 8 5.0 12.0 12-15 6-B i (l) Oesvio-padrão e» relação a «édia para sexo t idade segunda as tabelas it Karques e col.9 J :! .6 3.2 5. (anos) (kg) Peso (-DP) Altura Idade Idade óssea (anos) fcit»o cresc.0 9.0 2.7 25.0 15.9 15. .9 (g/dl) (s/<^ 4.6 87 4 84 7 2 1.0 3. 6 119.2 2.ill TABELA IX .1 3.2 2.2 15 .4 3.4 5.2 *.0 5.4 K M H F F 5. 1 ii ( D (c) 98.Dados clínicos e laboratoriais em pacientes prê-púberes com déficit de GH (Grupo 2A) Noae Sexo Idade cron. -DP) ( ( D tstat.8 5.0 2. 0 12*.3 3.7 4 7 85 2.5 6.7 i AC R RJSC F K PCS AHAS »L. Prot.0 13.5 3.0 12.2 9.4 3. 7 2.5 H.5 3. i.4 11. I 5.7 6 10 12 21. p »* - 5.0 10.0 1..3 3.3 29.5 6.6 3.7 6.3 10.9 1.

(anos) 67 .112 TABELA X - Dados c l í n i c o s e laboratoriais em pacientes púberes com d é f i c i t de G H (Grupo 2B) Idad: estat. 8. ig/dl) (g/dl) 63 . (1) (anos) (kg) (-DP) X F 14.9 12-16 Alb. tot.8 (fl/dl) 11.0 O e s v i o .0 4.7 3. éssea (anos) 9 9 Ritio tresc.7 10. JS A FSGS Nor. (ct/ano) 3.8 Idad.5 25. 4 Altura (c. 1 3.) 120.2 2.9 128.5-5. 6-8 (<ó).al (l) 4. 62 .6 4.1 21. .5 16.p a d r ã o em r e l a ç ã o a « é d i » para seno e idade segundo as t a b e l a s de Par-ques e c o l . 8 (-DP) (1) 5.2 < jj Note Peso Sexo Hade cron. Prot.4 3.

associados a valores normais de TSH. Já o estradiol i sérico caiu abaixo da sensibilidade do ensaio (10 pg/ml ) em todos os pacientes de ambos os grupos. no Grupo 2B. PCS e FSGS). não foi necessário i n t e r — romper o teste devido a perda de consciência em nenhum. Apesar dos sintomas desagradáveis de hipoglicemia observados em todos os pacientes.1.0 ng/ml . JAS mostrou um valor de 50. Com exceção de JAS. não . todos os pacientes partiram de níveis basais de GH iguais ou menores do que 1. TESTE DE TOLERÂNCIA XIV E XV) Ã INSULINA (TABELAS XIII. quando correlacionada com a idade cronológi ca e sexo. 4. confirmando a presença de hipotireoidismo secundário. TESTES FARMACOLÓGICOS DE ESTÍMULO 4. AVALIAÇÃO HORMONAL BASAL (TABELAS XI E XII) A SmC. . mostrou-se diminuída em todos os pacientes. • . enquanto que. Níveis de glicemia inferiores a 40 mg/dl ocorreram entre 15 e 30 minutos após administração da insulina em todos os testes. foram observados em 3 (RJSC. A testosterona sérica situou-se em nível inferior a 2? ng/dl em todos os meninos do Grupo 2A. níveis sêricos reduzidos de T 3 e/ou T .113 3.1 ng/dl.

10 (0.5) 3 (ng/dl) 100 T \ TSH (\iUlfil) 4.7 6.3 < IO 3-27 < 10 Norial 80-200 4.4 75 4.0 2. < :c 2.0 93 7.90-5.18-2.10 (0.0 25.6) < 0.91-3.8-5.7) 0.0 AMAS ML CC 156 11.7 (pgM) ° >1! (1) 122 3.10 (0.22-2.114 TABELA XI - Avaliação hormonal basal em pacientes prê-púberes com d é f i c i t de G H (Grupo 2A) Noae SiC (u/.4 42 23.13 (0.0 E 2 (w/dl) 7.0 CAN 97 8.5 3.9 8.5 0.10 (0.8)' RJSC < 0.22-2.8) < 0.22-2.2 13.4) < 0.14 (0.2 147 7.0 135 8C .7 2.D ARC (0.28-3.41-4.10 (0.2 T (ng/dl) 16.1) < 0.0 (1) Valores noriais para sexo e idade cronológica.8) PCS 0. .5-11.5 1.

5-11.l) T (ng/dl) 97 T dig/dl) 10.9 2.5 0.115 TABELA XII - Avaliação hormonal ba:al e pacientes püberes com m d é f i c i t de G H (Grupo 2B) Nose S»C (U/.2 T E (ng/dl) ( p 9 M ) 50.6)' 0.1 JAS 0.1) FSGS 37 3.10 (0.7 < 10 Norial 80-200 «.10 (0.0 > 5C < 82 (l) Valores noraais para sexo e idade cronoláçica. .71-4.7 TSH (jiUl/dl) 2.90-5.8-5.

além de tudo. Nos pacientes em que houve discreto aumento dos níveis de GH durante o teste. já que este era constituído por apenas 2 pacientes q u e .01) do que a obtida no Grupo IA. a resposta foi c o n s i d e r a d a subnormal em apenas 3 (RJSC. No pacientes JAS.9 ng/ml para um máximo de 3. a concentração de GH elevou-se de um basal de 1.4 ng/ml apôs o estímulo hiooglicêmico em nenhum.08 n g / m l . 2 3 ) . a média dos picos d e t e c t a d o s apôs injeção de insulina foi de 0. No G r u p o 2A. PCS e F S G S ) . Com relação ao cortisol (Tabela X V I ) . os níveis sj? ricos basais m o s t r a r a m .89 +_ 0. Não foi calculada a média dos picos nem realizada a comparação estatística do Grupo 2B com os d e m a i s .s e normais em todos os pacientes. estatisticamente menor (p < 0. Houve uma dis criminação completa entre os níveis de GH o b s e r v a d o s nos diferentes tempos do ITT no Grupo 2A quando comparados do Grupo IA (Fig.5 ny/ml no tempo 3 0 . ccn os apresentavam secreções nitidamente d i f e r e n t e s de GH. do hormônio liber^ valores máximos foram observados . confirmando a deficiência do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) ou dor do ACTH (CRF). os entre 30 e 90 m i n u t o s . Após estímulo h i p o g l i c ê m i c o .116 havendo incrementos acima de 1.

0 0.9 0.6 < 0.0 1.6 < 0.1 0.0 0.8 JAS n PCS AKAS XL CC CAN Hidia 0.70 0.9 0.7 0.6 0.8 M 0.7 1.5 B 1.Níveis de GH em condições basais (B) e de pico (P) em pacientes com déficit de GH Pacientes púberes ÍG^upo 2B) «fvtis d» GH ( n q M ) No«* ITT Clonidina Pacientes pré-púberes (Grupo 2A) Híveis de GH (nq/il] ffoae ITT Clonídina B ARC RJSC 0.89 0.8 0.3 1.5 1.9 < 0.7 < 0.6 0.6 1.9 1.6 0. de -30 e 0 linutos. (2) Para o cálculo da aídia.3 0.9 3.6 0.9 1.08 o.2 2.0 1.ei 0.9 0.08 EPH (1) Média dos níveis de GH nos teipo.3 0.7 U. .0 0.2 lfk J.6 < 0.8 <: 0.7 0.7 0.TABELA XIII .18 FSGS 1.9 1. as concentrações de GH que caíra* abaixo da sensibilidade forai consideradas iguais ao valor da sensibilidade do respectivo ensaio.05 0.

3 0.0 1.9 0.6 44 42 «"0.7 11 0.06 0 <0.2 0.7 0.7 86 <0.6 <0.0 1.6 17 0.6 104 <0.85 0.6 86 <0.9 73 0.6 27 0.0 40 <0.77 0.05 0.9 0.2 0.08 <0.8 43 1.9 <O.6 72 <0.C5 0.07 90 0.6 <O.09 C.9 <0.9 -3C <0.90 0.9 <0.0 0.6 2.8 56 <0.73 0.8 32 <0.7 72 0.19 (1) GH (ng/il).9 80 0.6 2.12 1.6 CC nu Hídia^ EPH <0.3 67 0.3 1.9 <0.6 30 1.6 50 0.« <C.1 1.8 " 0.6 32 0. (3) Para o cálculo das iíd.83 0.6 76 <0.9 1.77 0.8 39 <0.71 0.6 39 1. (2) Gliceiia (*g/dl). as concentrações de GH que caírai abaixo da sensibilidade forat consideradas iguai* ao valor da sensibilidade do respectivo ensaio.S 22 0.7 0.80 0.6 58 0.6 0.5 <C.6 56 0.06 (0.5 0.5 <0.8 36 <0.6 34 <C.6 61 0.Níveis séricos de GH nos testes de tolerância ã insulina e clonidina em pacientes pré-púberes com déficit de GH {Grupo 2) Nose Dosage» -30 GH.9 <0.6 30 0.0 0. .20 0.10 ITT 15 <0.2 33 <0.2 0.4 40 <0.3 1.6 48 0.6 38 1. .9 0.: :.7 51 0.9 40 0.6 - <0.9 26 1.6 1.6 120 1.9 0.6 <0.9 0.7 39 0.8 77 <0.9 89 1.5 <C.9 <0.0375 i g V ) 0 30 60 90 <0.9 82 0.3 25 <0.6 78 <O.04 Clonidina (C.73 0.78 0.5 0.9 0.118 TABELA XIV .9 1.11 1.7 32 0.0 43 0.as.6 34 <0.6 1.1 75 0.1 U/kg) 30 45 0. (2) G GH G GH G PCS GH G ANAS GH 6 "L GH G GH G GH G GH 0.7 36 0.9 60 <0.-: 0.68 0.9 39 0.6 28 0.6 81 <0.0 ARC 0.0 35 0.8 49 0.9 1.5 C.

0 "' S (1) GH (ng/il).1 U/kg) 15 30 45 <0.2 78 1.9 33 2.8 3.9 35 <0.1 1.1 46 90 <0.2 FSGS 1.Níveis séricos de GH nos testes de tolerância ã insulina e clonidina em pacientes púberes com déficit de GH (Grupo 23) No» Dosage» -30 GH G GH G 1.0375 »g/»') 0 30 60 90 1.7 2.9 36 2.119 TABELA XV . (2) Gliceiia («g/dl).9 24 3.9 37 2. 120 1.1 82 ITT (0.7 88 0 <0.8 62 -30 1.4 53 Clonidina (0.1 1.8 1.7 1.3 1.5 60 <0.1. .9 74 2.9 26 2.5 26 <0.6 4.

não houve incremento acima de 2.08 ng/ml. não foi calculada a média dos picos nem realizada a comparação estatística com os demais pelas razões anteriormente especificadas.8 e de 5.01) do que o observado no teste no Grupo IA. Esta queda ocorreu entre os 60 e 120 minutos do tes te e foi acompanhada por leve sonolência.3 ng/ml em nenhum. Após administração da clonidina. No Grupo 2B. XIV E XV) Houve redução de 10. nos testes em que houve discreto aumento dos níveis de GH. Todos os pacientes partiram de concentrações basais de GH iguais ou inferiores a 1. TESTE DA CLONIDINA {TABELAS XIII. Houve também uma discriminação completa e£ tre os níveis de GH observados nos diferentes tempos do teste da clonidina no Grupo 2A quando comparados com os do Grupo IA (Fig. respectivamente.6 imiHg nos _ níveis da pressão arterial sistólica e diastõlica.8 + 2. No Grupo 2A. foi de A análise estatística mostrou que esmesmo te valor era menor (p < 0.120 4. ocorreram entre 30 e 90 minutos apôs grupos .37) do obtido no ITT no Grupo 2A.4 ng/ml. mas não diferente (p = 0.81 *_ 0. a média dos picos põs-cionidina de 0. Os tempos de pico.2. de maneira semelhan te à observada no Grupo 1.0 + 1. 2 3 ) . que mostrou um valor máximo 4.8 ng/ml no tempo 60. com exceção de JAS.

• . 2 3 .) E CLONIDINA (^--4. * .* ) E COM DEFICIÊNCIA (c^-o a—a) DE GH.0—6) EM PACIENTES PRÉ-PÚBERES SEM DÉFICIT ( • .NÍVEIS SÉRICOS DE GH ( MEDIA± ERRO PADRÃO DA MÉDIA} NOS TESTES DE TOLERÂNCIA À INSULINA (•—. .121 GH ( ng/ml) 30 60 90 120 TEMPO (MINUTOS) F!G.*—«.

a hipófise normal pode não responder ao estimulo agudo com LHRH. LU e FSH foram normais. os incrementos do TSH e PRL foram considerados subnormals em apenas 1 (CAN) e 2 (FSGS e C A N ) pacientes. Após estímulo com TRH. nesta fase. todos os pacientes responderam ao LHRH com elevação dos níveis séricos de LH e FSH. PRL. já que. excluindo uma deficiência hipofisãria total d e £ tes hormônios. r e s p e c t i v a m e n t e . sendo mais precoces do que Grupo 1. Com exceção de CAN (teste não r e a l i z a d o ) . Em RJSC. a resposta exagerada do TSH sugeriu um distúrbio hipotalãmico.122 administração da c l o n i d i n a . .p ú b e r e s . sugestivo de distúrbio h i p o t a l â m i co. TESTE DO TRH ASSOCIADO AO LHRH (TABELA XVI) Todas as dosagens basais de TSH. 0 aumento das gonadatrofinas foi considerado crianças normal nos 2 pacientes púberes. não foi possível avaliar o grau de r e s p o s t a . ao passo que.3. nas p r é . no 4. indicando uma baixa reserva hipofisãria destes h o r m ô n i o s . com exceção do valor elevado de PRL observado nos pacientes PCS e FSGS.

4 5.0 19.0 16-42 8 2.9 2.0 21.6 13.5 9. Pico de concentração horaonal após estíaulo.2 1.6 2.3 26.8 4.0 30.123 TABELM XVI . PRL.0 21.0 31.e (ig/dl) TSH (pUl/iI) PRL (pg/.8 34.0 30.1 55.1 2-16 21.5 2.1 15.8 0.3 6.1 31.lédia dos níveis horaonais no teipos it -30 e 0 cinutos.0 5. TSH.0 12.6 12.6 12.3 29.9 11.6 5. Nadir. 26.4 8.6 4.5 20.2 1.9 3.4 21.3 25.: 4.8 7.9 4.7 23.1 7. Respostas noriais para pacientes púberes.5 2.. LH e FSH ao estímulo hipoglicêmico.8 9.Resposta do corfisol (F).0 5. 4-".7 5.8 3.4 4.9 <. TRH e LHRH em 11 pacientes com baixa estatura ITT .1 6.0 32.1 1.4 c c CN A JAS FSCS Nonal (1) (2) (3) (4) (5) 8.4 2.3 12.1 13.7 10.5 6-30 B 34.7 5-17 3.0 7.7 7.5 6.8 7.0 20.' 85 .6 5.9 1-6 P 26.0 6. 20.Iic.8 23.0 27.6 16 .1 ü/kg) F (ytg/dl) TRH (200 pgj LriRH LH (IÜI/»'!) (IQQ uq) Ho.9 10.I) FSM (»ui/ii 8 FCS ARC RJSC F K PCS A!US M L 82 66 86 85 74 77 88 78 5/ 85 76 70-110 P 20.0 8.(5 -17 3-17 2-9 Basal .2 4. .3 8.2 2.9 3.8 1.3 3.1 2.? 15-98 11.1 5.5 10.7 3.8 15.6 4.7 25 3 13-97 C5i 2.4 10.6 4.6 29.0 13. (0.9 32.0 58.4 30 30 25 26 36 30 39 32 1 1 26 24 16.'.7 12.1 98.3 16.9 8. Valores noraais segundo Nery (52).

7 anos. CC e . Após iniciado trata(0. com exceção de FSGS. 21 E 22) Todos os pacientes foram seguidos por um período mínimo de 6 meses.1 U/kg con- mento com GH extraído de hipófises humanas no HC-FMUSP de peso administrados por via intramuscular 3 vezes por semana). Com exceção de ARC e FK. houve aceleração da velocidade de crescimento em RJSC. período. sendo que apenas WL entrou em puberdade aos 15. CAN. SEGUIMENTO (FIGS. a qual foi submetida a cirurgia transfenoidal 3 mesr após a avaliação inicial.124 5. a única medicação administrada foi 1-tiroxina (50 a 100 ug por via oral) aos pacientes com hipotireoidismo firmado laboratorialmente. Neste sendo confirmado o diagnóstico de craniofaringioma. todos os demais pacientes apresentaram ritmo de crescimento reduzido.

R/SP .VIII - ÜI SCUSSAO COM:1- A : '•' • V-.

no primeiro teste. (23. Fm escudo sero?1han te. associado a menor i n c i — dência de rc.6 ng/ml. (63) relataram picos de GH de 21.0 ng/ml) em 14.24) em 1979.1-0. Picos muito mais elevados durante .7 ^1.9 +_ 4. (66) relataram picos pós-clonidina de 13.9 ng/ml. sendo menores ou Iguais a 8. é comprovadamente um potente agente estimuiador da secreção de GH. foi observado maior pico de liberação de GH. Sa]_ ti e col.5 ng/ml em nenhum teste da clonidina.0 ng/mi.4 + 4.5 ng/ml ) em _ todos os elementos de um grupo de 18 crianças e adolescentes com baixa estatura sem distúrbio endccrino.15 mg/ra*. com resultados falso-negativos (resposta menor do que 7..15 mg/m* ) foi comparado com o ITT (0.66) em que o teste da cloni dina (0.0 ng/ml em 9.3%. (16) não encontraram respostas inferiores Já a 7.126 A clonidina. cuja média dos picos foi de 18.ultados falso-negativos. administrada na dose oral de 0.15 U/kg ou 4 U/m 2 ) em pacientes com nanismo não hipofisário. Isto foi demonstrado pela primeira vez por picos de GH Gil-Ad e acima de col. Em três estudos (16.7% dos paciente1.39. que observaram 10 ng/mi (média + erro padrão da média: 34. Fraser e col. Romero e col.8 + 1.

0 ng/ml (6 e 0%. já que as dosagens de GK foram realizadas en. Romer e col. Devido à ocorrência de hipotensão por vezes severa (47) associada â dose de 0. ao mesmo tempo.10 e 0. a clonidina foi testada em quantidades menores com o intuito de se reduzir a incidé£ cia de efeitos colaterais e. 0.127 este teste (36.8% de respostas inferiores a 10 ng/.15 mg/m* . En- tretanto.1 + 1.-ni A eficiência de liberação de GH provocada pela clonidina foi considerada equivalente e não superior à do ITT em apenas um trabalho (30). a secreção deste ho mõnio em pacientes com não hipofisário após administração de 0. foi observado de liberação de GH (16.9 ng/ml) foram observados por _ Lanes e col.15 mg/m 2 ) também mostrou-se superior ao do 1-dopa (120-250 mg ou 300 :ng/n>*) e ao da argi nina (0. com 5.15 mg/m 7 . (62) estudaram.76 ng/ml) e nenor _ índice de resposta inferior a 7.71) realizados em pacj^ maior pico entes com nanismo não hipofisário. diferentes laboratórios e os pacientes nem sempre estavam em jejum no dia do teste da clonidina (16). que consistiu na investigação de 64 pacientes coro baixa estatura em diversos centros da Grã-Bretanha. manter eficiência adequada de liberação de GH. Em dois estudos (62. algumas objeções foram feitas quanto à validade dos resultados deste último estudo. respectiva — mente) no teste da clonidina.05.5 + 9.95 e 13. 0 teste da clonidina (0. nanismo em 1982.3 + 0. (39) no único estudo em que apenas crianças pré-púberes foram avaliadas.5 g/kg).

123

de clonidina, não observando diferenças estatisticamente sig nificantes nas respostas obtidas com estas 3 doses. Neste

mesmo ano, Laron e col. (41) propuseram a realização Jo teste da clonidina com a dose fixa de 0,025 mg e compararam-no com o ITT (0,1 U/kg). Em 12 pacientes com baixa estatura consti

tucional, sem menção ao estágio puberal, os autores r e l a t a — ram picos de GH e resultados faiso-negativos (resposta menor do que 10 ng/ml ) de 21,8 + 4,9 ng/ml e 16,7% para o ITT, _ e

de 30,6 + 8,8 ng/ml e 8,3% para a clonidina, sendo este ülti _ mo associado a reduções da pressão sistõlica de 5 a 10 mmHg. Concluíram, portanto, que a clonidina, mesmo na pequena dose de 0,025 mg, era um agente liberador de GH mais potente que o estímulo hipoglicêmico. Entretanto, dois estudos subseqüentes (11,40), reji lizados em grupos de crianças pré-púberes com nanismo não hj^ pofisário, demonstraram que o teste da clonidina coro dose in ferior a 0,15 mg/m 2 , embora adequado para avaliar a reserva do

hipofisária de GH, não era tão eficiente quanto inicialmente proposto por Laron e col. (41). No trabalho realizado por

Dammacco e col. (11) em 1983, o teste da clonidina (0,035 mg/m2) foi comparado com o da arginina (0,5 g/kg). Os resultados

revelaram picos de liberação de GH semelhantes (16,7 + 2,44 ng/ml para a clonidina e 15,69 + 2,56 ng/ml para a arginina), _ mas

menor incidência de resultados falso-negativos (pico£7,0 ng/ml) no teste da clonidina (16,7*) do que na arginina (25S). Houve

129

r e d u ç ã o dos níveis pressóricos pós-clonidina de

11,5 i 0,8 mmHg

para a sistõlica e de 7,5 +_ 0,7 mmHg para a diastólica. Jã no e s t u d o de L a n e s e col . ( 4 0 ) , publicado em 1985, a foi t e s t a d a nas doses fixas de 0,100 e 0,050 mg clonidina (corresponem Os

d e n t e s , e m m é d i a , a 0 , 1 1 9 e 0,0619 m g / m 2 , respectivamente) 10 (Grupo A ) e 14 (Grupo B) crianças, respectivamente.

picos de GH foram de 14,5 +_ 2,0 e 11,6 +_ 1,6 ng/ml nos Grupos A e B, r e s p e c t i v a m e n t e , com índice de respostas (menores do que 10 ng/ml) de 10 e 3 6 % . subnormais

Houve decréscimo se14 a

m e l h a n t e da p r e s s ã o arterial nos 2 g r u p o s , variando de

15,3 mmHg para a sistólica e de 2,3 a 4,0 mmHg para a diastó lica. Neste m e s m o trabalho, 9 crianças com baixa estatura de

i d i o p á t i c a foram estudadas com uma dose de 0,100 ug/m 2

c l o n i d i n a e uma única coleta de sangue aos 60 minutos, sendo o b s e r v a d o s picos maiores ou iguais a 10 ng/ml em todas. 0 t e s t e da clonidina com a dose de 0,0375 mg/m 2 foi, neste p r o j e t o , avaliado no que diz respeito â eficiência

de liberação de GH e ã incidência de efeitos colaterais indj; s e j á v e i s , p a r t i c u l a r m e n t e hipotensão e sonolência. to, ele foi c o m p a r a d o com o ITT (0,1 U / k g ) , Para taji

considerado por hipoem

m u i t o s autores o teste padrão de avaliação da reserva f i s á r i a de GH ( 3 2 , 4 8 , 5 8 ) . Os 2 testes foram

realizados

g r u p o s d i s t i n t o s de crianças e a d o l e s c e n t e s , para se estudar também a possível influência da puberdade sobre a do GH à c l o n i d i n a . resposta

130

A avaliação clinica, laboratorial e radiolôgica ge ral obe-deceu às recomendações propostas por Underwood & Van crianças hormônios

Wyk no que se refere ã investigação diagnostica de com baixa estatura ( 7 4 ) . As dosagens basais dos

tireoidianos, gonadotrofinas e SmC contribuíram para descartar a presença de hipotireoidismo, disgenesia gonadal em neninas púberes e nanismo hipofisârio, respectivamente. 0 ITT foi padronizado segundo critérios previamente estabelecidos na literatura (18,20,35,36,56,59,64,72,77), com coletas de sangue até os 90 minutos após administração da insulina, já que, neste teste, o pico de GH geralmente ocorre entre os 30 e 90 minutos. A coleta não foi continuada até os 120 minutos para não perpetuar em demasia os efeitos cola terais desagradáveis associados ã em todos os pacientes. 0 teste da clonidina 0,0375 mg/m*, escolhida por foi realizado corresponder a corc a dose de exatamente um hipoglicemia, observados

quarto do valor inicialmente preconizado na literatura (0,15 mq/rn*) e ser próxima da dose de 0,035 mg/m z , já previamente testada e associada a boa eficiência de liberação de GH e baixa inci^ dência de efeitos colaterais ( 1 2 ) . Foi ponderado também que, embora criasse problemas na hora de sua preparação, a deveria ser corrigida para a superfície corpórea, que todas as crianças recebessem,proporcionalmente, quantidade da droga. de a dose modo mesma

caracterizado adequado às necessidades deste projeto. o pico de GH ocorreu entre 60 e 120 minutos. As amostras de sangue após administração da clonidina foram coletadas a cada 30 minutos durante 2 horas. já que corres pondem a estímulos provocativos diferentes da secreção de GH. Em todos os testes.(38.16. 0 fato de que os tempos de coleta não foram idênticos neste teste e no ITT não invalida a comparação entre eles. Embora não se conseguisse uma solução comple tamente homogênea de clonidina em água.a Influência da variação ínterensaio.30. 66.40.62. método foi ajustado de modo a apresentar sensibilidade redor de 1. 7 1 ) .dessa maneira. este procedimento fa cilitou também a administração da droga a crianças que se re cusassem a engolir o comprimido. embora ambos com provável ação ao nível de receptores a-adre nérgicos centrais.0 ng/ml. Todos os soros e de um mesmo paciente foram dosados em um único ensaio. individualizadas para cada paciente. evitand£ -se. em todos os estudos prévios (11.23.63.1 mg.44 ) . já que o menor comprimido comercializado contém 0. correspondente â maior parte dos picos de liberj^ .41.0 ng/ml e precisão máxima no intervalo de 5.0 0 ao a 30. já que.39.131 A transformação da clonidina em pó e posterior diluição em água foi a única maneira simples encontrada de se preparar diferentes micro-doses da droga.o GH foi determinado por método próprio de RIE completamente desenvolvido.

permitiu uma boa discriminação entre os pacientes .74. 0 ritmo de crescimento. 58.132 çâo de GH observados nos testes provocativos. já que estudos prévios (35) demons^ traram que a resposta do GH aos testes provocativos não é dj_ ferente nestas doenças quando comparadas entre si ou com indivíduos normais. confirmando a importância do exame clínico. basea da nas características clínicas. dosagem basal de SmC e resposta aos testes provocativos. Em todos os pacientes incluídos no Grupo 2. A c 1 assificação dos 31 pacientes em portadores (Grupo 1) e não portadores (Grupo 2) de déficit de GH. obede- ceu a critérios previamente estabelecidos na literatura (32. o na- nismo hipofisãrio foi fortemente suspeitado na avaliação clí^ nica pela severidade do déficit estatural e/ou presença de sinais típicos. Não se procu- rou obter maior sensibilidade porque não era a finalidade des te projeto estudar valores basais de GH. Foi possível a inclusão de pacientes com patolo- gias diversas no Grupo 1. considerado um dos parâmetros mais importantes na decisão de se submeter ou não um p^ ciente com baixa estatura a investigação laboratorial extensa (74).75). ritmo de crescimento. A especificidade do ensaio foi demonstrada pelo baixo grau de imunorreatividade cruzada do anti-soro anti-GH com os demais hormônios hipofisãrios e pela ausência de efeitos não específicos do meio de incubação sobre a reação antígeno-anticorpo.

p o s s i b i l i — tando uma completa diferenciação entre el&s. valores baixos estão freqüentemente associados a outras patologias. foi também utilizada para des^ cartar a presença de graus mais severos de desnutrição qualquer um dos pacientes do Grupo 1.133 com e sem deficit de GH. valode GH Por outro lado. embora situando-se abaixo do percentil 1 0 . res normais de SmC praticamente excluem deficiência (75). acompanha ram a curva normal de crescimento. faixa etária em que se enquadravam ^o dos com exceção de 1 paciente estudado neste projeto. como hi potireoidi smo e desnjj trição. a presença de SmC diminuída praticamente excluiu esta hipótese. Em crianças aci ma de 5 anos de idade. a dosagem sêrica normal de SmC. Não foi encontrada explicação adequada para a velocida de de crescimento normal nestes dois últimos pacientes. Aliás. Todos com exceção de 2 pacientes do Grupo 1. A dosagem sérica de SmC. Embo ra eles pudessem apresentar alguma forma de GH biologicamente ativo mas imuncligicamente não ensaiãvei ( 7 4 ) . mostrou-se normal em todos os pacientes incluídos no Grupo 1 e diminuída nos do Grupo 2. freqüentemente como teste de tr'agem para excluir o diagnóstico de utilizada nanismo hipofisário (74. enquanto que isto ocorreu em apenas 2 crianças do Grupo 2 durante o período de observa ção. e não permitem estabelecer o diagnóstico de nanismo hipofisário ( 7 5 ) . principalmente em quando .75). apontada como um dos melhores índices do estado nutricional adequado de um indivíduo (74).

035 mg/m' e por Lanes e col.134 associada a c o n c e n t r a ç õ e s basais baixas de GH. (41) com a fixa de 0. (40) com a dose fixa de 0. Embora um assunto controvertido.0 ng/ml em pelo menos um teste p r o v o c a t i v o . A c o m p a r a ç ã o entre o teste da clonidina e o ITT no grupo de crianças pré-púberes demonstrou que a média dos picos de liberação de GH foi maior (embora não estatisticamente s i g n i f i c a n t e ) no primeiro teste. ( 4 8 ) . a maioria dos auto res considera um pico de GH acima de 7.025 mg e aos de Lanes e col. (39) com a dose i n i cialmente preconizada na literatura de 0. Entretanto.3 ng/ml. Estes d£ de dos reforçam a idéia inicial de que os maiores valores pico.obtidos por Laron e col (41) com a menor dose de cloni- COV' . o qual estava também associado a menor incidência de respostas faiso-negativas.0 ng/ml. sendo ainda inferior a 5. (11) com a dose de 0. 48 Este valor está de acordo com os resultados obtidos nes te e s t u d o . foram dose Os n i t i d a m e n t e Inferiores aos de Laron e c o l . já que todos os pacientes incluídos no Grupo 1 apresentaram picos de GH maiores do que 7.1 mg.15 m g / m 2 . resultados obtidos foram mais compatíveis com os relatados por Dammacco e c o l . apenas um pacien- te púbere do Grupo 2 mostrou resposta maior do que 2. este paciente poderia ser cias sificado como déficit parcial de GH.0 ng/ml como resposta normal a qualquer teste de liberação deste hormônio (32 74). Segundo os critérios pro- postos por Milner e col. Por outro lado.

não estava presente em nenhum paciente. A média dos pi- cos pós-clonidina neste grupo foi também inferior ã observada nas crianças pré-púberes. A única hipótese proposta para explicar estes para resultados ê que a dose de clonidina. os quais necessitariam de quant^ dades da droga proporcionalmente maiores do que crianças. talvez se devam ao fato dos autores incluído crianças e adolescentes em um mesmo grupo. o mesmo estudo comparativo revelou que a média dos picos de liberação de GH foi menor (embora não estatisticamente significante) no teste da clonidina. freqüentemente associada a respostas subnormals de GH (73). tenha sido insuficiente para provocar uma eficiente liberação de GH nestes pacientes. embora corrigida a maior superfície corpórea apresentada pelos adolescentes. Não houve correlação entre a presença de resposta inadequada e a superfície corpõrea ou sexo do paciente. A obesidade. jã na puberdade.135 dina jâ testada. as respostas do GH aos estímulos clássicos são maiores do que na infância (19). contrariamente ao que ocorre com os de- . Es ta posb'bi idade implicaria talvez em uma menor sensibilidade dos receptores o 2 -adrenérg1cos centrais ã clonidina na época da puberdade. fato curioso levando-se em consideração que a puberdade geralmente está associada a respostas mais exacerbadas de GH (19). o qual apresentou também incidência muito maior de resultados faiso-negativos do que o ITT. terem que provocativos No grupo de pacientes púberes.

portanto.62.66).0375 mg/m*) deve.15 my/m 2 (23. o em ITT resultou em sintomas desagradáveis de hipoglicemia todos os pacientes. a clonidina. é um agente liberador de GH muito menos potente do que o estímulo hipoglicêmico. a sonolência e hipotensão observadas no teste da clonidina foram semelhan- tes ãs relatadas nos trabalhos em que a droga foi administra da nas doses de 0. 0 teste da clonidina (0. que o teste da clonidina deve ser preferencialmente realizado com a dos? de 0. não havendo. perda de consci ência em nenhum. A redução dos níveis pressóricos foi.0375 mg/m 2 em crianças pré-púberes.025 mg ( 4 1 ) . que correspondem â maior parte dos pacientes que procuram o endo crinologista por baixa estatura.135 mais estímulos provocativos da secreção de GH. pois. Conclui-se. deve ser utilizada apenas em teste complementar para excluir . Com relação aos efeitos colaterais.15 mg/m 2 ou no ITT. Nos pacientes púberes. inferior ã observada com a dose de 0. Nesta dose. Por outro lado.39. ao passo que os efeitos colaterais são muito mais discretos e menos perigosos do que os observados ou no teste realizado com 0. Esta dose. a eficiência de liberação de GH ainda é maior do que a do ITT. portanto. no entanto. no entanto.035 mg/m z (12) ou 0. na dose de 0.0375 m g / m 2 . ser considerado o teste provocativo de eleição para excluir o diag — nóstico de nanismo hipofisário em crianças pré-púberes.

137 d e f i c i ê n c i a de GH neste grupo ou. F i n a l m e n t e . quando os r e s u l t a d o s do teste da cloni dina (0. o d i a g n ó s t i c o de n a n i s m o hipofisãrio pode ser e s t a b e l e c i d o com segurança próxima a 1 0 0 % . deve ser s u b s t i t u í d a pela dose de 0.0375 m g / m 2 ) são associados aos do ITT. sugerindo que ambos devam ser r e a l i z a d o s p a c i e n t e s com suspeita clínica desta p a t o l o g i a .15 m g / m 2 . p r e f e r e n c i a l m e n t e . em .

IX - CONCLUSÕES .

139 le) O teste da clonidina (0. sugerindo que ambos devam ser realiza- dos em pacientes com suspeita clínica desta patologia. ser utilizado apenas como teste complementar para deficiência de GH.1 U / k g ) . por tanto.0375 m g / m 2 ) apresenta naior efi ciência de liberação de GH e menor incidência de efeitos colaterais graves do que o ITT {0. devendo.1 U / k g ) . devendo. ser considerado o teste provocativo de eleição em para excluir o diagnóstico de nanismo hipofisário crianças pré-púberes. 29) Nos pacientes púberes. excluir 3S) Quando os resultados do teste da clonidina (0.0375 mg/m2) apresenta incidência muito maior de resultados falso-ne gativos do que o ITT (0. . o diagnóstico de nanismo hipofisário pode ser estabelecido com segurança próxima a 100%.0375 mg/n 2 ) são associados aos do ITT (0.1 U / k g ) . o teste da clonidina (ú. portanto.

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