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Microscopia de contraste de fase

Microscopia de contraste de fase




Contraste: diferena de iluminao entre amostras e os arredores ou o plano de fundo.


Transmisso = luz + fluorescncia (absoro + refrao
+ reflexo)

fluorescncia

refrao absoro

LUZ

reflexo

Microscopia de contraste de fase




Tipos de contraste de fase

Positivo: 1) Positivo: amostra mais escura do que o plano de fundo; 2) Negativo: amostra mais clara do que o plano de fundo. Negativo: 

Equao
Contraste = (If - Ia) x 100 If

I = intensidade de luz do campo (f) ou da amostra (a).

Microscopia de contraste de fase




Tipos de amostra

Amplitude: 1) Amplitude: alteram a intensidade da luz transmitida. Amostras transparentes coradas causam o mesmo efeito. 2) Fase: no absorvem luz, mas causam mudana de fase Fase: nos comprimentos de onda que a atravessam.
Amostra transparente Amostra tipo amplitude Amostra tipo fase

Amostra tipo misto (maioria)

Microscopia de contraste de fase




Contraste em amostra com baixo retardo de fase Plano da


imagem

ocular

- Os raios no desviados so retardados cerca de de l em relao aos raios no desviados; Lente do tubo - a diferena de intensidade de luz no percebida pelo olho humano objetiva (no d contraste).
Raios desviados Raios no desviados Distncia focal amostra condensador

Microscopia de contraste de fase




O que o contraste de fase faz?

1) Contraste de fase positivo - Acelera os raios no desviados em de P elevando a diferena de fase total para de P; - a amostra fica escura, circundada por halo claro, sobre um fundo mais claro (menos claro que o halo). D contraste. 2) Contraste de fase negativo - Retarda os raios no desviados em de P elevando a diferena de fase total para de P; - a amostra fica clara, circundada por halo escuro, sobre um fundo mais escuro (menos escuro que o halo). D contraste.

Microscopia de contraste de fase




Configurao
no desviados + 90 No desviados objetiva amostra

Raios desviados 180 fora de fase Anel de fase Raios desviados 90 fora de fase

TrabalhaTrabalha-se nos planos da imagem conoscpica

condensador

Anel de fase

Microscopia de contraste de fase




Configurao
Parte central do anel mais fina que a periferia Contraste positivo

Parte central do anel mais fina que a periferia

Contraste negativo

Microscopia de contraste de fase


 1)

Dados tcnicos Acessrios obrigatrios: anel de fase para obrigatrios:


condensador e objetivas com anis de fase;

extra: 2) Acessrio extra: filtro verde. Isto porque os o sistema projetado para funcionar melhor no centro do espectro visvel (cor verde).

Microscopia de contraste de fase




Tcnicas e contraste
Amostra Transparente Corada Transparente Transparente Transparente Transparente Tcnica Campo claro Campo claro Contraste de fase Contraste diferencial de interferncia Campo escuro Fluorescncia Contraste 2-5% 25% 15-20% 15-20% 60-75% 60-75%

Microscopia de contraste de fase



-

Alinhamento dos anis de fase


Usar telescpio de fase (o mesmo usado para ver a imagem conoscpica) para ver os anis pela ocular; Alinhar os anel do condensador movimentando os parafuso de ajuste no condensador prprio para a tcnica; Sem alinhamento a tcnica no funciona.

Anis no alinhados

Anis alinhados

Microscopia de contraste de fase




Indicaes

- Amostras vivas ou fixadas no coradas; - Melhorar contraste para visualizao de detalhes em amostras coradas (ex.: estriaes transversais de msculos)

Microscopia de contraste de fase



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Limitaes

os halos podem obscurecer os detalhes que circundam a amostra; os anis de fase reduzem a resoluo da objetiva; no adequada para amostras espessas.

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Imagens

- Clulas de ovrio de hamster

Contraste de fase positivo

Contraste de fase negativo

Osso de dinossauro fossilizado com quartzo no canal de Havers Preparo por desgaste

Contraste de fase Osso compacto humano Preparo por desgaste

Contraste de fase + colorao Aterosclerose (placa de colesterol na parede da artria)

Contraste de fase + colorao Pneumonia brnquica

Contraste de fase + HE Lngua humana

Contraste de fase + HE Cartilagem hialina

Contraste de fase Plen de plantasc

Contraste de fase + HE Neurnio multipolar