TEMAS DE

REUMATOLOGIA CLNICA

Curso Bsico Atualizado de Imunologia para o Reumatologista

Inflamao, citocinas, protenas de fase aguda e implicaes teraputicas

Angelina M. B. Bilate
Doutora em Imunologia pelo Instituto de Cincias Biomdicas (ICB) da USP. Ps-doutoranda do Laboratrio de Imunologia do InCor. Tema da tese: Patognese da cardiomiopatia chagsica crnica. Seu projeto atual: Anlise protemica para identificao de novos marcadores moleculares envolvidos na progresso da cardiomiopatia chagsica crnica.

INFLAMAO

Infeces e injria tecidual induzem uma cascata complexa de eventos fisiolgicos conhecida como resposta inflamatria, que promove proteo aos tecidos, restringindo os danos no local da infeco ou injria, mas podendo ter efeitos deletrios quando de forma exacerbada. Em geral, uma resposta inflamatria aguda de curta durao e, alm de uma reao local, ocorre tambm uma reao sistmica, chamada de resposta de fase aguda (ver a seguir). A resposta local se inicia quando o dano tecidual e endotelial desencadeia vasodilatao e aumento da permeabilidade vascular. Com o aumento da permeabilidade vascular ocorre extravasamento de leuccitos para os stios inflamados. Em estgios iniciais da inflamao o tipo celular predominante o neutrfilo, em fases mais tardias moncitos e linfcitos tambm migram para o local, amplificando o processo inflamatrio. Vrios mediadores participam ativamente da resposta inflamatria: 1) quimiocinas realizam quimiotaxia de leucctios; 2) enzimas plasmticas, como bradicinina e fibrinopeptdeos, aumentam a permeabilidade vascular; 3) plasminina degrada cogulos em produtos quimiotticos e ativa protenas do sistema complemento e seus derivados, como anafilotoxinas que induzem degranulao de mastcitos e conseqente liberao de histamina, e opsoninas que induzem a opsonizao de microrganismos, facilitando a fagocitose; 4) mediadores lipdicos como tromboxanos, prostaglandinas e leucotrienos participam do processo de vasodilatao e aumento da permeabilidade vascular; 5) citocinas (IL-1, IL-6 e TNF-) induzem efeitos locais, tais como induo da expresso de molculas de adeso e de quimiocinas, facilitando a migrao de leuccitos, e efeitos sistmicos como a induo de protenas de fase aguda, levando a febre. Em alguns casos o processo inflamatrio agudo no completamente resolvido, levando a inflamao crnica, como o caso de doenas auto-imunes ou infeces causadas por microrganismos que conseguem evadir a
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resposta imune. Esse tipo de inflamao acontece quando macrfagos e clulas T so constantemente ativados, levando ao seu acmulo nos stios de leso e significativo dano tecidual. As citocinas liberadas pelos macrfagos cronicamente ativados estimulam a proliferao de fibroblastos, levando ao aumento da produo de colgeno que culmina na fibrose, caracterstica das inflamaes crnicas.
PROTENAS DE FASE AGUDA

A reao inflamatria acompanhada por uma resposta sistmica conhecida por resposta de fase aguda. Esta resposta caracterizada por febre, produo de diversos hormnios, leucocitose e produo de protenas de fase aguda pelo fgado. Citocinas, como IL-1, IL-6, TNF-, LIF (leukemia inhibitory factor) e oncostatina M (OSM) so produzidas no local de inflamao e desempenham papel crucial na resposta de fase aguda, induzindo a produo de protenas de fase aguda pelos hepatcitos. O pico de produo das protenas de fase aguda geralmente ocorre entre 12 e 24 horas aps o incio da resposta inflamatria aguda. Entre as protenas de fase aguda, destaca-se a protena C-reativa (PCR), uma vez que seu nvel srico aumentado aproximadamente 1.000 vezes durante a inflamao aguda. Esta protena se liga a uma variedade de patgenos, ativa as protenas do sistema complemento que resulta na deposio de C3b na superfcie do microrganismo. Este processo termina por facilitar a fagocitose dos patgenos mediada por fagcitos que expressam receptor para C3b.
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CITOCINAS

Citocinas so protenas de baixo peso molecular produzidas por diferentes tipos celulares do sistema imune. A produo de citocinas desencadeada quando as clulas so ativadas por diferentes estmulos, como agentes infecciosos, tumores ou estresse. As citocinas atuam na comunicao entre as clulas, promovendo a induo ou regulao da resposta imune. As principais caractersticas das citocinas so: 1. Uma mesma citocina pode ser produzida por mais de um tipo celular; 2. Uma mesma citocina pode ter diferentes efeitos, dependendo das condies do microambiente pleiotropismo; 3. Diferentes citocinas podem exercer a mesma funo redundncia; 4. As citocinas podem potencializar ou inibir o efeito de outras citocinas sinergismo ou antagonismo, respectivamente; 5. A maioria das citocinas exerce efeitos parcrinos (ao sobre clulas presentes nas proximidades das clulas produtoras da citocina) ou efeitos autcrinos (ao sobre o tipo celular que a produz). Alm disso, algumas citocinas exercem efeitos endcrinos, agindo sobre clulas presentes em outros locais que no os da clula produtora daquela citocina. Atualmente, j foram descritas mais de 200 diferentes citocinas, pertencentes s famlias de hematopoietinas, interferons, quimiocinas e TNF. Originalmente, as citocinas e quimiocinas eram nomeadas de acordo com a sua funo (como fator de crescimento de clulas T, agora chamada interleucina-2 (IL-2); protena quimioatraente de macrfagos MCP-1, macrophage chemoacttract protein-1, agora chamada de CCL2), mas devido s suas aes pleiotrpicas, a nomenclatura mudou para nmeros para facilitar o entendimento. O efeito das citocinas se d aps a ligao ao seu receptor especfico expresso na superfcie da clula-alvo, desencadeando a transduo de sinais no interior da clula. As famlias de receptores so: 1. Superfamlia das imunoglobulinas (Ig); 2. Receptores classe I (tambm conhecidos como famlia de receptores das hematopoietinas); 3. Receptores classe II (tambm conhecidos como famlia de receptores de interferons); 4. Membros da famlia de receptores de TNF; 5. Receptores de quimiocinas. A maioria dos receptores de citocinas composta por subunidades distintas: uma cadeia envolvida na ligao a citocina e na transduo de sinais e outra cadeia envolvida na cascata de sinalizao. A cadeia
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associada a uma famlia de protenas tirosinas quinases chamada famlia Janus quinase (JAK, Janus kinase), mas a atividade enzimtica ocorre somente na presena da citocina. A ligao da citocina induz a associao (dimerizao) das cadeias e e a ativao das JAKs. A ativao das JAKs leva a fosforiliao de resduos de tirosina que gera stios para a ligao dos fatores de transcrio STAT (signal transducers and activators of transcription). Atualmente j foram descritas seis diferentes STATs envolvidas em vias de sinalizao de diversas citocinas. Aps a fosforiliao mediada por JAK de um resduo especfico de tirosina, STAT dissociado das subunidades do receptor e ento translocado da membrana para o ncleo onde induz a transcrio de genes especficos. Por exemplo, STAT1 ativa a transcrio do RNAm de IFN- enquanto a STAT6 ativa IL-4. O tipo de estmulo determina o tipo de STAT a ser ativado e, conseqentemente, a citocina a ser produzida. Como exemplo, antgenos de helmintos e alrgenos ativam STAT6 e a produo de IL4 e antgenos de patgenos intracelulares geralmente ativam STAT4 e STAT1 que induzem a produo de IL12 e IFN-, respectivamente. Embora diversos tipos celulares possam secretar citocinas, clulas T, macrfagos e clulas dendrticas so as principais fontes produtoras de citocinas. Entre as atividades fisiolgicas das citocinas, se destacam a ativao da resposta imune celular e humoral, regulao da hematopoiese e controle da proliferao e diferenciao celular (Na Tabela 1 esto descritas as funes das principais citocinas). Durante a resposta imune celular adaptativa ocorre intensa produo de citocinas, porm vale ressaltar que a produo de citocinas no depende do antgeno, ou seja, no antgeno-especfica, portanto, as citocinas agem sobre qualquer tipo celular que tenha o receptor apropriado. As citocinas desempenham papel fundamental na diferenciao de clulas T e na ativao dos diferentes subtipos de linfcitos T. A ativao de subpopulaes de clulas T resulta na secreo de diversas citocinas que iro determinar o perfil da resposta imune. A diferenciao de clulas T CD4+ em linfcitos T helper tipo 1 (Th1) ocorre na presena de IL-12 e IFN- que iro determinar um perfil inflamatrio. A diferenciao em linfcitos T helper tipo 2 (Th2) ocorre na presena de IL-4 e determina um perfil antiinflamatrio. Atualmente, outras subpopulaes de linfcitos T foram descritas de acordo com a sua atividade e padro de produo de citocinas: linfcitos Th3, caracterizados pela produo de TGF-, associados a um perfil regulador da resposta imune; linfcitos T CD4+ CD25+ produtores de TGF- e IL-10, tambm chamados de clulas T reguladoras (Treg), devido a sua capacidade de supresso da resposta imune; e
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Tabela 1 - Principais citocinas, suas funes e implicaes teraputicas Citocina TNF- Clulas produtoras Macrfagos, clulas dendrticas, clulas endoteliais Moncitos, macrfagos, clulas endoteliais e epiteliais Macrfagos, clulas dendrticas Macrfagos, clulas endoteliais, fibroblastos Alvos e efeitos Vasculatura (inflamao); fgado (induo de protenas de fase aguda); caquexia; morte celular; ativao de neutrfilos Vasculatura (inflamao); hipotlamo (febre); fgado (induo de protenas de fase aguda) Ativa clulas NK, promove a diferenciao de clulas Th1 Fgado (induz protenas de fase aguda), promove proliferao de clulas B e secreo de anticorpos, inibe diferenciao de clulas Treg Induz resposta antiviral, aumenta a expresso de MHC classe I e ativa clulas NK Promove a diferenciao de clulas Th17 Implicao teraputica Anti-TNF- (Infliximab) e sTNFR:Fc (Etanercept), doenas auto-imunes (em uso) IL1Ra, choque sptico (modelos experimentais); artrite reumatide (ensaio clnico) IL-12, linfomas; anti-IL-12, doena de Crohn (ensaios clnicos) IL-6, cncer (ensaio clnico)

1. Citocinas relacionadas resposta imune inata

IL-1

IL-12 IL-6*

IFN-

Macrfagos

IFNrec, hepatite e cncer (em uso)

IL-23

Macrfagos

Anti-IL-23, encefalomielite auto-imune (modelo experimental) Anti-IL2R (anti-TAC), rejeio de transplantes (modelos experimentais) Actimmune, doena granulomatos a crnica, osteopetrose (em uso) Anti-IL-5, sndrome hipereosinoflica (ensaio clnico) IL-4, leucemia (ensaio clnico)

2. Citocinas relacionadas resposta imune adaptativa IL-2 Clulas T Induz proliferao de clulas T e B, ativao de clulas NK e pode promover morte induzida por ativao Ativa macrfagos, induz a expresso de MHC classe I e classe II, aumenta apresentao de antgenos Promove diferenciao e ativao de eosinfilos Promove a diferenciao de clulas Th2 e mudana de classe de anticorpos para IgE Promove inflamao induzindo a produo de citocinas inflamatrias como IL-6, IL-1 e TNF- em clulas endoteliais Inibe proliferao de clulas Th1 Inibe proliferao de clulas T e B, inibe ativao de macrfagos, promove mudana de classe de anticorpos para IgE e diferenciao de clulas Treg Produo de eritrcitos Produo de plaquetas Produo de granulcitos e macrfagos, maturao e ativao de clulas dendrticas Produo de neutrfilos

IFN-

Clulas Th1, clulas T CD8+, clulas NK Clulas Th2 Clulas Th2, mastcitos

IL-5* IL-4

IL-17

Clulas Th17, neutrfilos

Anti-IL-17, doenas auto-imunes (modelos experimentais) IL-10, psorase e hepatite C (ensaio clnico) TGF-, cncer (ensaio clnico); anti-TGF-, leishmaniose (modelo experimental)

IL-10 TGF-

Macrfagos, clulas dendrticas, linfcitos Treg Clulas T, macrfagos, fibroblastos

3. Citocinas relacionadas hematopoiese (hematopoietinas) Eritropoetina IL-11 GM-CSF Hepatcitos Macrfagos, clulas endoteliais, fibroblastos Clulas Th1 e Th2, macrfagos e mastcitos Macrfagos, clulas endoteliais, fibroblastos Epogen, estimula produo de eritrcitos (em uso) Neumega, estimula produo de plaquetas (em uso) Leukine, estimula a produo de clulas mielides aps transplante de medula ssea (em uso) Neupogen, reduz o risco de infeco em pacientes com cncer submetidos quimioterapia (em uso)

G-CSF

IL, interleukin; IFN, interferon; TNF, tumor necrosis factor; TGF, transforming growth factor; G-CSF, granolocyte colony stimulating factor; GM-CSF, granolocyte and macrophage colony stimulating factor; IL2R, receptor de IL-2; sTNFR:Fc, receptor solvel de TNF conjugado a poro Fc de IgG; Th1, clulas T helper tipo 1; Th2, clulas T helper tipo 2, Th17, clulas T helper produtoras de IL-17, Treg, clulas T reguladoras; IFNrec, interferon recombinante; IL1Ra, antagonista do receptor de IL-1. *IL-6 e IL-5 tambm so consideradas citocinas hematopoiticas. Adaptada de Goldsby et al., 2000. Immunology W.H. Freeman and Company, New York, USA, 2000. 4 ed. 670p.

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clulas Th17, caracterizadas pela produo de IL-17 e associadas a um perfil inflamatrio. Para a diferenciao das subpopulaes de clulas T, as citocinas utilizam diferentes mecanismos moleculares que iro regular o processo de diferenciao. As citocinas produzidas pelos linfcitos Th1 inibem a produo das citocinas Th2 e vice-versa, por um mecanismo chamado regulao cruzada. Essa regulao cruzada explica a relao inversa freqentemente observada entre produo de anticorpos, estimulada pelos linfcitos Th2, e imunidade celular, desencadeada pelos linfcitos Th1. Recentemente, diversos mecanismos de regulao cruzada foram elucidados: 1) a produo de IL-4 faz com que as clulas Th2 se tornem menos responsivas a sinalizao por IFN- e vice-versa; 2) modificaes epigenticas a ativao do gene de IL-4 induz modificaes no DNA da clula Th2 que a impede de ativar o gene do IFN-, e ao mesmo tempo, a estimula a produzir mais IL-4. IFN- atua da mesma maneira; 3) modificaes transcricionais a expresso do fator de transcrio T-bet induz a diferenciao das clulas T em Th1 e suprime a diferenciao em Th2, enquanto a expresso do fator de transcrio GATA-3 induz a diferenciao das clulas Th2 e suprime a diferenciao das Th1. J foi mostrado que na presena de IFN-, as clulas aumentam a expresso de T-bet e diminuem a expresso de GATA-3, e na presena de IL-4, ocorre o inverso. J a citocina TGF- inibe a expresso de T-bet e GATA-3 e induz a expresso de FoxP3, um outro fator de transcrio envolvido na diferenciao de clulas T reguladoras (Treg). Com isso, inibe a diferenciao de Th1 e Th2, favorecendo a diferenciao de Tregs. Com os avanos da microscopia com clulas vivas possvel visualizar dinamicamente a secreo de citocinas durante a sinapse imunolgica, processo caracterizado por modificaes moleculares e estruturais no stio de contato entre linfcitos T e clulas apresentadoras de antgenos (APC, antigen presenting cell). Linfcitos T helper ativados produzem vrias citocinas e algumas, como IL-2 e IFN-, so secretadas diretamente na sinapse imunolgica, em direo a APC, enquanto outras, como TNF- e CCL3, so secretadas de maneira multidirecional. Esses variados padres de secreo de citocinas tm implicao direta no curso de uma resposta inflamatria. A secreo restrita a regio da sinapse vai atuar diretamente na comunicao clulaclula, podendo estar relacionada especificidade da resposta imune adaptativa. J a secreo multidirecional pode estar relacionada ao recrutamento de outras clulas inflamatrias, permitindo a manuteno do processo inflamatrio. Portanto, o tipo de resposta imune no depende apenas do tipo de citocina produzida, mas
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tambm de como ela secretada no microambiente. Como dito anteriormente, as citocinas podem ser induzidas por uma gama de estmulos. Entre eles, esto os agentes infecciosos. Protenas, lipdeos e acares presentes na superfcie de diversos microrganismos induzem a secreo de vrias citocinas, que iro desencadear uma resposta inflamatria ou alrgica. Entretanto, geralmente a produo de citocinas durante as infeces exacerbada e acaba por desencadear efeitos deletrios ao hospedeiro. Como exemplo, o choque sptico resultado da produo descontrolada de TNF- e IL-1 induzida por endotoxinas ou superantgenos presentes na parede de bactrias gram-negativas ou gram-positivas, respectivamente. Por outro lado, doenas inflamatrias crnicas so desencadeadas devido persistncia do estmulo inflamatrio, como o caso das doenas auto-imunes, em que a presena de um autoantgeno constantemente reconhecido por linfcitos T dispara a produo contnua de citocinas como TNF- e IFN-. Essa produo contnua acaba por perpetuar o processo inflamatrio que contribui para o agravamento das leses auto-imunes. Um outro exemplo de inflamao crnica a infeco por micobactria que induz a formao de granuloma, uma massa celular de macrfagos e linfcitos cronicamente ativados.
QUIMIOCINAS

As quimiocinas so pequenos polipeptdeos (90-130 resduos de aminocidos) que fazem parte de um subgrupo de citocinas. As quimiocinas controlam a adeso, quimiotaxia e ativao de vrios tipos de leuccitos. As quimiocinas desempenham papel fundamental na resposta inflamatria, recrutando clulas inflamatrias para o local da leso por quimiotaxia. As quimiocinas tambm controlam e atuam em diversos processos biolgicos como hematopoiese, angiognese e metstase de tumores. Mais de 50 quimiocinas e pelo menos 15 receptores j foram descritos. As quimiocinas possuem quatro resduos conservados de cistenas e so classificadas de acordo com a posio de dois desses resduos: 1. subgrupo C-C, onde os resduos so contguos; 2. subgrupo C-X-C, onde os resduos so separados por um outro aminocido. A ao das quimiocinas mediada por receptores transmembranais acoplados a protena G. Os receptores de quimiocinas so classificados da mesma maneira que as quimiocinas: 1. receptores CC (CCRs) que reconhecem quimiocinas CC; 2. receptores CXC (CXCRs) que reconhecem quimiocinas CXC. A maioria dos receptores se liga a mais de uma quimiocina e uma mesma quimiocina pode ligar-se a mais de um
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receptor. Aps a ligao da quimiocina em seu receptor, ocorre a ativao de protenas G, iniciando uma cascata de transduo de sinais que gera segundos mensageiros como AMPc (adenosina monofosfato cclico), IP3 (inositol trifosfato) e clcio. As vias de transduo de sinais ativadas pelas quimiocinas promovem a ativao de integrinas nos leuccitos, levando a adeso parede do endotlio, gerao de radicais livres por fagcitos, liberao de histamina dos basfilos, e ativao de proteases de neutrfilos. Assim como as citocinas, as quimiocinas tambm esto envolvidas na diferenciao de linfcitos Th1 e Th2. Clulas Th2 expressam CCR3 e CCR4 que no so expressos em clulas Th1, enquanto que as clulas Th1 expressam CCR1, CCR3 e CCR5, receptores que as clulas Th2 no expressam.
IMPLICAES TERAPUTICAS

uso na clnica enquanto outras esto em fase experimental (Tabela 1) com resultados promissores. Apesar de algumas imunoterapias para o bloqueio de citocinas apresentarem bons resultados no tratamento de doenas inflamatrias crnicas, a aplicao em doenas agudas como sepse, queimaduras e trauma, onde as citocinas inflamatrias so produzidas em nveis elevados e desencadeiam efeitos danosos, os resultados no foram bem sucedidos. Os mecanismos envolvidos na melhora ou piora clnica aps as imunoterapias ainda assunto de intenso debate. Como as citocinas atuam em uma grande variedade de clulas, difcil antecipar todos os efeitos do tratamento com citocinas ou seus bloqueadores. Contudo, o entendimento da imunopatognese das doenas contribui de maneira significativa para o desenvolvimento de novas abordagens de imunoterapia.
LITERATURA RECOMENDADA

Com base no conhecimento do papel patognico das citocinas e quimiocinas em diversas doenas se torna atraente o desenvolvimento de imunoterapias especficas com o objetivo de modular a resposta imune. Com isso, muitas citocinas recombinantes, receptores solveis e anticorpos monoclonais foram desenvolvidos para o tratamento de doenas auto-imunes, rejeio de transplantes e cncer. Algumas imunoterapias j esto em

1. Rossi D, Zlotnik A. The biology of chemokines and their receptors. Annu Rev Immunol. 2000; 18:217-42. 2. Dong C. Diversification of T-helper-cell lineages: finding the family root of IL-17-producing cells. Nat Rev Immunol. 2006; 6:329-33. 3. Leonard WJ, OShea JJ, JAKS and STATS: Biological implications. Ann Rev Immunol 1998; 16:293-322. 4. Ansel KM, Lee DU, Rao A. An epigenetic view of helper T cell differentiation. Nat Immunol. 2003; 4:616-23. 5. Goldsby RA, Kindt TJ, Osborne BA. Kuby Immunology. W.H. Freeman and Company, New York, USA, 2000. 4 ed. 670p.

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