Alfa talasemia: testare genetic Informaii generale Alfa-talasemiile reprezint un grup de afeciuni cu transmitere genetic autozomal-recesiv caracterizate printr-o

o rat sczut de sintez a lanurilor ale globinei. Clusterul genelor este localizat n apropierea telomerului cromozomului 16, se ntinde pe o lungime de 28 kb i conine n urmtoarea ordine: o gen zeta (), o pseudogen (), o pseudogen () i dou gene , care codific 2-globina i 1-globina, denumite HBA2 i respectiv HBA11. Fiecare gen prezint 3 secvene care codific proteine (exoni) i 2 regiuni care aparent nu au nici un rol n sinteza proteinelor (introni = intervening sequences), flancate de secvene 5 i 3, care de asemenea nu intervin n procesul de translaie. La captul 5 al fiecrei gene se gsete promotorul, o secven necesar pentru iniierea transcripiei. Promotorul genei include 2 secvene: TATA box i CCATT box. Att exonii ct i intronii sufer fenomenul de transcripie a ADN-ului n ARN mesager; acest proces este controlat de factori de transcripie care se leag de promotori i de elementele de control situate n amonte - intensificatori (enhancers) care cresc foarte mult viteza de transcripie. Astfel, genele -globinei se afl sub influena unui element intensificator major, denumit HS-40 (vezi figura)1;3.
Genele globinei pe cromozomul 16

1
Hemoglobina

Ft

Adult

Adaptare dupa J. Clin. Invest. 117(4): 850-858 (2007)

Adaptare dup J. Clin. Invest 117(4): 850-858 (2007) Fenomenul de transcripie include urmtoarele etape: - transcripia propriu-zis: rezult o copie ARN a genei, ce include secvenele complementare att pentru exoni ct i pentru introni;

- ncapsularea i poliadenilarea (capping + polyadenilation): ataarea unor nucleotide speciale la capetele 5 i 3 ale ARN-ului; - nndirea (splicing): ndeprtarea intronilor din ARNm; secvenele ARN corespunztoare exonilor sunt apoi nndite mpreun3. Alfa-talasemiile se produc atunci cnd una sau mai multe gene care codific lanurile ale globinei lipsesc sau sunt afectate. Severitatea defectului este variabil; una din extreme este condiia complet asimptomatic ce rezult din deleia sau disfuncia uneia din cele 4 gene ; la polul opus este situat sindromul Hemoglobinei Bart, produs prin deleia celor 4 gene , caracterizat prin hidrops fetal, de obicei incompatibil cu viaa (edeme generalizate, efuziuni pleurale i pericardice, hepatosplenomegalie, anemie hipocrom sever n absena unei incompatibiliti de grup sangvin i Rh). Unele din manifestrile clinico-patologice ale sindroamelor alfa-talasemice rezult ca urmare a absenei lanului , n timp ce altele se produc prin afectarea precursorilor eritropoietici de ctre lanurile non- aflate n exces. Astfel, lanurile i sintetizate n exces formeaz tetrameri, rezultnd hemoglobinele H (4) i Bart (4). Atunci cnd ambele gene de pe un singur cromozom sufer o deleie sau o inactivare complet a transcripiei condiia rezultat este denumit 0 talasemie (alfa-zero talasemie); atunci cnd se menine o funcie rezidual a genei i o anume producie a lanului , de exemplu n cazul deleiei unei singure gene de pe un cromozom, se utilizeaz termenul de + talasemie (alfa-plus talasemie). Deleia sau disfuncia a trei gene genereaz boala HbH. Din punct de vedere al defectului genetic subiacent alfa-talasemiile sunt mprite n talasemii deleionale i non-deleionale. Talasemiile deleionale vor genera 0 talasemie sau + talasemie, n funcie de natura i lungimea deleiei. Talasemiile nedeleionale conduc de obicei la + talasemie i rezult prin: - mutaii ale codonului de iniiere; - mutaii care afecteaz clivajul, nndirea, poliadenilarea sau stabilitatea ARN-ului; - producia unui lan structural anormal, care este fie sintetizat la o rat redus, fie este instabil1. Testarea genetic Testarea prin tehnici de biologie molecular a demonstrat c HBA1 i HBA2 prezint deleii (ca urmare a unor evenimente de recombinare aberant) n 90% din cazuri i mutaii punctiforme la aproximativ 10% dintre indivizii afectai. Metodele bazate pe reacia de polimerizare n lan (PCR) ce utilizeaz primeri specifici care flancheaz punctele de ruptur (breakpoints), detecteaz deleia unei singure gene de -globin (+-talasemie) sau deleia ambelor gene, 1 i 2, de pe un singur cromozom (0-talasemie). Prin tehnica MLPA (multiple ligation-dependent probe amplification) se pot detecta deleii mai puin ntlnite. Cele mai obinuite deleii care afecteaz o singur gen sunt cele denumite -3.7 i 4.2; n plus fa de acestea au mai fost raportate 3 deleii mai rare6. (-4.2 ) este o deleie de 4.2 kb la nivelul genei 2; (-3.7) desemneaz un grup de 3 deleii uor diferite cu lungimea de 3.7 kb produse la captul 3 al genei 2 i la captul 3 al genei 1 cu formarea unei gene de fuziune 21. Ambele deleii au ca rezultat reducerea cu 50% a sintezei lanului de pe cromozomul afectat1. n ceea ce privete 0 talasemia, sunt cunoscute mai mult de 20 de deleii diferite, de la 6 kb la 300 kb, ce conduc la nlturarea ambelor gene de -globin (uneori i la deleia genei zeta). Cele mai cunoscute sunt - -SEA , - -FIL, - -THAI, - -MED, - -20.5 care n cazul homozigoiei provoac sindromul hemoglobinei Bart5. Atunci cnd oricare dintre aceste alele apare n combinaie cu o alt alel

purttoare a deleiei unei singure gene (ca de exemplu, -3.7) rezult boala Hb H, caracterizat prin prezena tetramerului Hb Bart la natere, nlocuit ulterior de tetramerul Hb H2. Deleia elementului reglator major care include intensificatorul HS-40 induce scderea marcat sau anularea expresiei ambelor gene cu structur normal (0 talasemie)1. Tehnica de secveniere este aplicat n cazurile n care nu a fost depistat nici o deleie a lanurilor -globinei n prezena suspiciunii clinice de alfa-talasemie. Pot fi detectate astfel mutaiile punctiforme:6 Mutaiile codonului de terminalizare interfer cu fenomenul de translaie a ARN-ului prin producerea unui lan instabil alungit. Cele mai cunoscute exemple sunt hemoglobina Constant Spring (ntlnit n sudul Chinei, Tailanda, Cambodgia, Vietnam, Laos, bazinul mediteranean) i hemoglobina Koya Dora (India). Mutaii care afecteaz clivajul, splicing-ul i poliadenilarea ARN-ului. De exemplu IVSI117(GA) la nivelul genei 1 este o mutaie a jonciunii de splicing ntlnit n India care conduce la o gen nefuncional. TSaudi, ntlnit n mod obinuit n regiunea mediteranean, este o mutaie a semnalului de poliadenilare care conduce la o reducere marcat a sintezei lanului 1. Mutaii care determin instabilitatea posttranslaional a unui lan anormal, de exemplu hemoglobina Quong Sze (125LeuPro sau QS), ntlnit la evreii kurzi i n Asia de Sud-Est, i hemoglobina Agrinio (29LeuPro sau Agr), ntlnit n regiunea mediteranean i Asia de sudEst1. n zona mediteranean + talasemia (cauzat de deleia -3.7 ) este obinuit, cu frecvena cea mai mare n Sardinia i cea mai sczut n Spania. Pe de alt parte, 0 talasemia este foarte rar, ceea ce explic i incidena extrem de sczut a hidropsului fetal. O caracteristic important a talasemiei n populaia mediteranean este heterogenicitatea mutaiilor, n special a celor nedeleionale6. Recomandri pentru testarea genetic - confirmarea diagnosticului la persoanele cu suspiciune clinic; - depistarea statusului de purttor asimptomatic; - diagnosticul prenatal6. Specimen recoltat - snge venos4. Recipient de recoltare - vacutainer ce conine EDTA ca anticoagulant4. Cantitate recoltat - ct permite vacuumul4 Cauze de respingere a probei - folosirea heparinei ca anticoagulant; probe coagulate sau hemolizate4. Stabilitate prob 7 zile la 2-8C; 1 an la -20 C4. Metod secveniere complet HbA1 i HbA2; analiza duplicaiilor/deleiilor prin metoda MLPA4. Interpretarea rezultatelor Alfa plus-talasemia Tara de + talasemie este cea mai frecvent afeciune monogenic din lume. Mutaiile cele mai obinuite sunt sunt -3.7 i -4.2. Aproximativ un sfert din persoanele de origine african sunt heterozigote pentru + talasemie (avnd genotipul -3.7/), n timp ce 1-2% sunt homozigoi (genotip -3.7/-3.7). Alte grupuri etnice care pot asocia + talasemie deleional sunt grecii, ciprioii, turcii, sarzii, libanezii, saudiii, indienii, tailandezii, filipinezii, indonezienii, melanezienii i polinezienii. Mai puin frecvent, + talasemia rezult ca urmare a unei mutaii punctiforme a genei 2, denumit T (ntlnit n Orientul Mijlociu, dar i n Cipru i Sardinia). Alfa-plus talasemiile non-deleionale care afecteaz gena 1, denumite T, sunt forme mai uoare n comparaie cu T, fiind de regul intermediare ca severitate ntre -/ i - -/. Anumite variante de lan pot da natere fenotipului de + talasemie. Acestea includ: Hb Constant Spring, Hb Q, Hb Icaria, Hb

Seal Rock i Hb Koya Dora. Cea mai obinuit form de -talasemie nedeleional este hemoglobina Constant Spring, cu o frecven de 1-8% n Tailanda. Aceast variant este datorat unei mutaii a codonului de terminalizare al genei 2, n urma creia se adaug la lanul o secven de 31 aminoacizi; ARN-ul mesager este foarte instabil, iar rata sintezei lanului este redus la aproximativ 1%. Alfa plus-talasemia este n majoritatea cazurilor nesemnificativ clinic, persoanele afectate fiind asimptomatice. Condiia prezint ns semnificaie genetic deoarece heterozigoia compus pentru + talasemia deleional i 0 talasemie genereaz boala HbH. Homozigoii pentru formele mai severe de + talasemie nedeleional (T / T) pot prezenta de asemenea caracteristicile clinice ale bolii HbH. Homozigoia pentru hemoglobina Constant Spring conduce la o anomalie mai sever comparativ cu cea ntlnit n statusul homozigot pentru + talasemie; pacienii prezint de regul anemie, iar n unele cazuri pot s apar icter moderat i hepatosplenomegalie. Heterozigoii pentru + talasemie (-/) pot prezenta fie un tablou hematologic normal, fie o anemie discret, cu reducerea uoar a VEM i HEM. n medie, valoarea Hb este cu 1g/dL mai mic dect la persoanele cu cele 4 gene intacte. Electroforeza Hb este normal, la fel ca i separarea fraciunilor prin cromatografie lichid sub nalt presiune (HPLC). Homozigoii pentru + talasemie (-/-) prezint de obicei un tablou hematologic similar cu cel ntlnit n beta-talasemia minor. Heterozigoii pentru Hb Constant Spring prezint un grad mai mare de anemie dect cel ntlnit n tara de + talasemie, ns VEM nu este redus n mod proporional; punctaiile bazofile sunt de regul proeminente. Homozigoii pentru aceast variant sunt anemici, cu o reducere marcat a HEM; VEM este mai puin sczut datorit hidratrii celulare excesive (consecutiv afectrii membranei eritrocitare de ctre lanurile i CS oxidate). Diagnosticul tarei de alfa-talasemie este suspectat n condiiile unei microcitoze persistente care nu este explicat prin deficitul de fier sau prin existena tarei de sau talasemie. Numai testarea genetic poate stabili diagnosticul de certitudine. Alfa 0-talasemia Aceast condiie rezult de obicei prin deleia ambelor gene ; rareori se produce numai prin deleia genei 1 i a secvenelor n amonte cu inactivarea genei 2 restante. Este relativ comun n sud-estul Chinei, precum i n Tailanda, Vietnam, Laos, Cambodgia, Malaezia i Filipine. Este ntlnit cu o frecven mai mic n zona mediteranean (Grecia, Cipru, Turcia, Israel, Sardinia). Trei tipuri de deleie sunt mai frecvente n sud-estul Asiei: - -SEA , - -FIL, - -THAI (ultimele dou constituie deleii mari care includ i gena ). n regiunea mediteranean cea mai cunoscut deleie este - -MED, care nu include i gena . n statusul heterozigot nu exist diferene ale tabloului clinic sau hematologic ntre diferitele deleii care genereaz 0 talasemia. Tara de 0 talasemie conduce la o anemie foarte uoar nsoit de un numr crescut de eritrocite i de reducerea indicilor VEM i HEM. Diagnosticul este suspectat n prezena acestor modificri aprute la persoane cu origine etnic sugestiv i avnd o electroforez a Hb normal. Confirmarea se efectueaz prin testare genetic. Boala hemoglobinei H Este un sindrom clinic rezultat dintr-o varietate mare de anomalii genetice. Cauza cea mai obinuit este heterozigoia compus pentru + talasemie i 0 talasemie, cum ar fi - -SEA/-4.2 n sud-estul Asiei sau 20.5/-3.7 ori - -MED /-3.7 n regiunea mediteranean. Un mecanism alternativ l constituie heterozigoia compus pentru 0 talasemie i o -talasemie nedeleional, cum ar fi hemoglobina Constant Spring sau tipul Saudi (- -SEA/CS sau - -MED/ TSaudi); mai este posibil i homozigoia pentru -talasemia nedeleional, n principal TSaudi/ TSaudi. Boala HbH este caracterizat printr-o reducere semnificativ a ratei de sintez a lanurilor , avnd drept rezultat o anemie microcitar hipocrom moderat-sever (Hb 7-10 g/dL, VEM 50-65 fL, HEM

15-20 pg, CHEM 25-30 g/dL) nsoit de reticulocitoz. Electroforeza Hb sau HPLC indic prezena hemoglobinei H cu migrare rapid, ntr-un procent de 2-40% (de regul 8-10%). Procentul de HbA2 este redus, iar cel de HbF poate fi uor crescut (1-3%). Pe frotiul de snge colorat supravital pot fi observate incluziile HbH (precipitatele de lanuri ), ntr-un procent ridicat de eritrocite (35-90%), cu aspect caracteristic de minge de golf. Atunci cnd boala HbH este cauzat de -talasemii nedeleionale, hemoglobina H nu este detectat ntotdeauna pe electroforeza Hb, iar incluziile HbH sunt inconstante; aceasta se datoreaz probabil faptului c lanurile formeaz mpreun cu un lan anormal dimeri tranzitorii i instabili care sunt distrui rapid. Sindromul hemoglobinei Bart Homozigoia pentru 0 talasemie conduce la imposibilitatea sintezei lanurilor , cu absena producerii hemoglobinelor F, A sau A2. Aceast condiie este de obicei incompatibil cu viaa extrauterin. Deleia tuturor celor 4 gene , dar cu una sau ambele gene intacte (- -SEA/- -SEA, - -MED /- -MED, - -SEA/- -THAI sau - -SEA/- -FIL) are drept rezultat hidropsul fetal al hemoglobinei Bart. Majoritatea hemoglobinei prezente este constituit de Hb Bart, ce este alctuit din 4 tetrameri , este instabil i incapabil s furnizeze oxigen esuturilor. Restul hemoglobinei este reprezentat de Hb Portland 2 (22) care, fiind capabil s livreze oxigen esuturilor, reuete s menin ftul n via pn n trimestrul trei de sarcin. Se dezvolt o anemie sever nsoit de hematopoiez extramedular ce conduce la hepatosplenomegalie. Atunci cnd exist o deleie mare ce include genele nu poate fi produs nici o form de hemoglobin funcional. Singurele Hb sintetizate sunt Hb Bart i un tetramer 4. Moartea ftului se nregistreaz precoce n sarcin, cu avort consecutiv. Acest sindrom poate rezulta ca urmare a homozigoiei pentru - -FIL sau - -THAI. La electroforeza hemoglobinei i HPLC se constat Hb Bart ntr-un procent de 70-100% i, uneori, cantiti mici de Hb Portland 1, Portland 2 i HbH. Cazurile produse ca urmare a homozigoiei pentru - -FIL sau - -THAI nu prezint Hb Portland 1 sau 2. Datorit consecinelor letale asupra ftului, este esenial ca aceast condiie s fie depistat precoce n sarcin prin identificarea tuturor cuplurilor purttoare ale tarei de 0 talasemie. Atunci cnd ambii prini prezint tara de 0 talasemie este necesar analiza ADN-ului fetal. Pentru diagnostic se utilizeaz esut fetal obinut prin prelevarea de viloziti coriale n primul trimestru sau din lichid amniotic n trimestrul doi de sarcin1.
Bibliografie 1. Barbara J. Bain. Haemoglobinopathy Diagnosis. Blackwell Science, 2001, 7-9; 49-73. 2. BridgesK R, Thalassemia Overview [Online]. Available from http://sickle.bwh.harvard.edu/menu_thal.html. Reference Type: Internet Communication. 3. Cornel Mironel Niculae. Transcrierea (transcripia). Bioinformatic. fpce9.fizica.unibuc.ro/bioinfo/transcrierea.htm. Reference Type: Internet Communication. 4. Laborator Synevo. Referinele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog. 5. Orathai Tangvarasittichai1, Chanthonrat Sitthiworanan, Warong Dechgitvigrom, Torpong Sanguansermsri, Rattima Jeenapongsa, Prevalence and Haematological Parameters of Thalassaemia in Lower Northern Thailand, In Haema 2005; 8(2): 241-244. 6. Renzo Galanello, Antonio Cao. Alpha-Thalassemia. Gene Reviews, 2008. www.ncbi.nlm.nih.gov. ReferenceType: Internet Communication.