BIO 368

ANALISIS INSTRUMENTAL

Métodos radioisotópicos
 USO DE RADIOISOTOPOS EN BIOQUIMICA

Ventajas:
- Técnica de alta sensibilidad
- Las mediciones se hacen de manera acumulativa (bajos niveles de
radioactividad pueden medirse con exactitud usando tiempos más
largos de análisis).
- Se complementa con técnicas como cromatografía o electroforesis.
- Pueden usarse como marcadores al investigar o monitorear un proceso.

Desventajas:
- Su uso implica ciertos riesgos (radiaciones), lo que ha llevado a
reemplazarlos en muchos casos por otras técnicas.
 CLASIFICACION DE LAS RADIACIONES

Radiaciones ionizantes:
Son radiaciones de alta energía que al incidir en una molécula
la ionizan (pérdida de un electrón).
Rayos gama, rayos x, partículas alfa y beta, neutrones.
Producidas por materiales radioactivos y ciertos aparatos
(ciclotrones, reactores nucleares, etc.)

Radiaciones no ionizantes:
Son radiaciones de menor energía, capaces de excitar una
molécula, pero sin la energía suficiente para que pierda un electrón.
Ondas electromagnéticas de mayor longitud de onda.
Producidas por lasers, microondas, radios, TV, etc.
 ALGUNOS CONCEPTOS BASICOS

Atomos: constituídos por un núcleo (protones y neutrones)

y una nube de electrones.

Número atómico: número de protones o electrones de un átomo.

Peso atómico: número de protones + número de neutrones.

Isótopos: átomos con igual carga pero distinta masa (se diferencian
en el número de neutrones).
Ej: 12C6 ; 13C6 ; 14C6
 LOS ISOTOPOS RADIOACTIVOS
Los isótopos se diferencian en su estabilidad. Algunos sufren
espontáneamente transformaciones nucleares de masa y/o carga para
alcanzar un estado más estable. Estos son los "radioisótopos".
Hay varios mecanismos por los cuales los isótopos inestables
alcanzan estabilidad. Ellos pueden implicar la liberación de
partículas específicas:

Ejemplo: 12C6 y 13C6 son estables; 14C6 es un isótopo radioactivo que

emite radiaciones beta (electrones).
En la gran mayoría de las aplicaciones bioquímicas de
radioactividad se utilizan isótopos que emiten radiaciones beta o gama.
DESINTEGRACION RADIOACTIVA POR EMISION DE
PARTICULAS BETA (β-)
Las partículas beta (o negatrones) están cargadas negativamente y
tienen masa despreciable (partículas similares a los electrones).

Neutrón protón + negatrón (β-) + antineutrino

La masa atómica permanece constante pero el número atómico sube 1.

Ejemplo:

La energía liberada es compartida al azar entre la partícula beta y el

antineutrino, por lo que esta partícula es emitida en un rango
(o espectro) de energías.

Las partículas beta son fácilmente detectables. Las diferencias de

energías son importantes en la detección de radioisótopos (en especial
en los experimentos de "doble marca").
Un electron-volt (eV) es la energía cinética que un electrón adquiere cuando
es acelerado por una diferencia de potencial de exactamente un volt.
Es igual a 1 volt (1 volt = 1 joule por coulomb) multiplicado por la carga
(sin signo) de un electrón. 1 eV = 1,602 ×10-19 J
DESINTEGRACION RADIOACTIVA POR EMISION DE
POSITRONES (β+)

Protón neutrón + positrón (β+)

Ejemplo:

Como resultado, disminuye en uno el número atómico y se mantiene

el peso atómico.

Los positrones son muy inestables; son aniquilados al chocar con

electrones y como resultado se emiten dos rayos gama.

La emisión de positrones se detecta por el mismo tipo de equipos

utilizados en la detección de rayos gama. Muy usados en medicina
en "scanners" de cerebro para detectar tumores (tomografía de
emisión de positrones).
DEGRADACION ISOTOPICA POR CAPTURA DE ELECTRONES

Un protón captura un electrón de la capa orbital más interna (K)

Protón + electrón neutrón + rayo X

Ejemplo:

Como resultado, se mantiene el peso atómico pero disminuye en 1 el

número atómico.
DEGRADACION ISOTOPICA POR EMISION DE RAYOS GAMA
Implica la emisión de radiación electromagnética, con rayos de
longitud de onda menor (y mayor energía) que los rayos X.

Los rayos gama se liberan como resultado de la transformación de

un núcleo atómico por degradación en varias etapas y va acompañado
de la emisión de partículas alfa o beta.

La emisión de rayos gama por si misma no conlleva cambios en el

peso atómico ni en el número atómico. Estos cambios dependen de
la partícula que es liberada en el proceso.

Ejemplo:

En la degradación que libera rayos gama se produce más de un rayo gama

y cada uno posee una cantidad discreta de energía. Son en general más
fáciles de detectar que las partículas beta o alfa que se liberan en el
mismo proceso.
 CINETICA DE LA DEGRADACION RADIOACTIVA
Todas las transformaciones nucleares proceden espontáneamente
y a velocidades que no son afectadas por los procesos físicos y
químicos ordinarios.

La degradación radioactiva obedece cinética de orden 1, o sea,

es proporcional al número de átomos (N) presentes:
λ: constante de desintegración, característica de cada isótopo.
Al t = 0 hay N0 átomos; a otro t cualquiera, habrá N átomos.
Integrando la ecuación entre t = 0 y t:

A menudo se expresa la ecuación en términos de la “vida media”, t :1/2

Tiempo requerido para que decaiga la mitad de los átomos radioactivos.

 NATURALEZA EXPONENCIAL DEL DECAIMIENTO
RADIOACTIVO

La constante de desintegración o “tasa específica de decaimiento” (λ) es

igual a la pendiente multiplicada por –1.
 UNIDADES DE DESINTEGRACION RADIOACTIVA

La radioactividad se mide “contando” el número de desintegraciones que

ocurren en un plazo de tiempo, las que son detectadas por instrumentos
apropiados.
La desintegración radioactiva es un proceso aleatorio; la desintegración
de una partícula individual en el tiempo es al azar.
Para definir estadísticamente la velocidad de conteo radioactivo hay que
detectar un número grande de desintegraciones.
En general, las muestras radioactivas deben contarse hasta un valor límite
de error de ± 5 % (error límite en manipulaciones bioquímicas, p. ej,
pipeteo).
Unidad básica de radioactividad: 1 curie (Ci) (cantidad de material
radioactivo que emite partículas a la misma velocidad que un gramo de
Radium: 3,7 x 1010 desintegraciones por segundo).
Se usa mucho el término “radioactividad específica”: curies/mol (o g).
Subunidades son el milicurie y el microcurie.
.
 OTRAS UNIDADES PARA MEDIR DESINTEGRACION
RADIOACTIVA

Poco usado es el Becquerel (Bq): 1 desintegración/segundo

Desintegraciones por minuto (dpm): número de átomos que se

desintegran por minuto. 1 μCi = 2,2 x 106 dpm

Cuentas por minuto (cpm): número de desintegraciones detectadas por

un equipo de detección determinado por minuto.
dpm x efiiciencia = cpm
 ESTADISTICA DE MEDICIONES RADIOACTIVAS

- No es posible prever cuando se desintegrará un átomo dado. Sólo

sabemos que el 50 % de ellos se desintegrará al cabo de una vida media.
- El número de desintegraciones que ocurren en un tiempo finito es
relativamente pequeño en relación al número total de átomos de la
muestra radioactiva (a menos que la vida media sea muy corta).
- La frecuencia con que ocurren acontecimientos raros es descrita
estadísticamente por la llamada “Distribución de Poisson”.
- La “desviación standard” nos da una idea del error.
- En una distribución de Poisson, la desviación standard es:

σ = √N N = número total de desintegraciones

Hay 95 % de probabilidades que el valor verdadero esté en N ± 2 σ .

Si N = 1000, σ = 32 (3,2 %). Representado por 2 σ, el error es 6,4 %
TECNICAS COMUNMENTE USADAS PARA DETECTAR
Y MEDIR RADIOACTIVIDAD

Los métodos están basados en la capacidad de la radiación para:

- ionizar gases
- excitar sólidos o soluciones
- exponer emulsiones fotográficas
 EL “BACKGROUND” EN UN CONTEO RADIOACTIVO

Es el conjunto de cuentas detectadas por un instrumento y que no

provienen de la muestra en estudio.
0.4% fallout
0.4% air travel

0.2%
occupational
12% internal 10%
<0.1% such as food cosmic rays
nuclear waste etc.

Origen del
“background” 12% medical,
X rays etc.
14% gamma rays
from the ground

50% radioactive gases in the home

(Diagram: resourcefulphysics.org)
 METODOS BASADOS EN LA IONIZACION DE GASES

Al pasar una partícula cargada por un gas, su campo electrostático

suelta electrones de los átomos más cercanos del gas provocando
ionización.
La capacidad de ionizar sigue el siguiente orden:
α>β>γ (10 000 : 100 : 1)
por lo que son útiles para detectar partículas alfa y beta.
Si la ionización ocurre entre un par de electrodos en una cámara

Esquema de un
contador Geiger

adecuada, fluye un pulso de corriente que es detectado.

Usado en contadores manuales. Poco sensibles.
 CONTADORES BASADOS EN EXCITACION

Se los denomina “cintiladores”. Se utilizan para detectar radiaciones

beta y gama. Muy sensibles y automáticos de manejo.
Los isótopos radioactivos interactúan excitando un compuesto (el
fluoróforo). Cuando sus electrones vuelven al estado basal se
emiten fotones de luz (flurescencia), la que es detectada por un
fotomultiplicador y cuantificada.
En el fotomultiplicador la energía luminosa es convertida en un pulso
eléctrico amplificado que es directamente proporcional a la energía del
evento radioactivo original. Esto permite detectar dos o más isótopos
diferentes en una misma muestra.
Se usan fluoróforos líquidos o sólidos. Los sólidos son utilizados
para radiaciones gama y los líquidos para beta.
Nos permiten obtener dos tipos de información:
Cuantitativa: cantidad de radiación (número de cuentas)
Cualitativa: tipo de radiación (intensidad de la señal).
CONTADORES DE CENTELLEO LIQUIDOS Y SOLIDOS

Sólido Líquido

Cristales de yoduro de sodio Fluoróforos líquidos

 EL FOTOMULTIPLICADOR

Dínodo: electrodo usado para emisión

secundaria de electrones.

Fotomultiplicador
asociado a un
contador de centelleo

El fotomultiplicador recibe luz del proceso fluorescente. La luz libera

electrones del cátodo fotosensible, y cada electrón choca con un
electrodo secundario que emite múltiples electrones. Estos pasan a su
vez a otro electrodo que también emite múltiples electrones. El proceso
continúa por hasta 9 electrodos, magnificándose la señal 1 millón de veces.
 CONTEO DE PARTICULAS BETA EN UN CINTILADOR
LIQUIDO
Se coloca la muestra en un “cocktail” de cintilación que contiene un
solvente excitable y uno o más fluoróforos. Las partículas ß al chocar
con el solvente le transfieren parte de su energía:

La energía residual (ß- - E) puede excitar muchas más moléculas de

solvente hasta agotarse. El número de moléculas de solvente excitado
depende de la energía inicial de la partícula ß.
Las moléculas excitadas de solvente transfieren su E a otras moléculas
de solvente y a un fluoróforo primario (F*1) que emite fotones:

Un fluoróforo muy usado es el PPO (2,5 difenil oxasol). Algunos

“cocktails” utilizan fluróforos secundarios.
Todos los eventos provocados por la emisión de un ß- son registrados
como un pulso único, cuya energía es proporcional a los fotones
generados por la partícula ß-. Cada pulso es registrado como una cuenta.
 ESTRUCTURA DE UN EQUIPO DE CINTILACION

La energía total de los fotones por cada emisión ß- es muy pequeña, por
lo que el fotomultiplicador debe ser muy sensible. Esta sensibilidad lo
lleva a captar “ruido” (cuentas no relacionadas a emisiónes ß-). Esto se
reduce utilizando un “circuito de coincidencia”: dos fotomultiplicadores,
que deben detectar simultáneamente la cuenta.

Se emplean también “discriminadores”, útiles en experimentos con dos

o más emisores ß-. Ellos tienen “compuertas” que limitan el perfil de
energía de cada canal.

Utilizando muestras “standard” (p. ej. de 14C de radioactividad conocida)

se puede determinar el porcentaje que es detectado por cada canal.
 Ganancia óptima

Ganancia muy alta

El voltaje de “ganancia” aplicado a los fotomultiplicadores es

importante en la discriminación de los canales. Define el grado de
amplificación de los pulsos de voltaje de los fototubos.
 APAGAMIENTO (QUENCHING)

La medición de radioactividad puede ser también afectada por

diversos componenetes del “cocktail” de cintilación. Estos componentes
pueden causar apagamiento, o sea, disminuir la la eficiencia del proceso
de cintilación: el número de “cuentas por minuto” (cpm) es menor que el
“número de desintegraciones por minuto” (dpm).
En la práctica, todas las muestras de conteo están sujetas a cierto grado
de apagamiento. Para determinar la eficiencia de conteo, se cuenta una
muestra estándar que contiene un número conocido de dpm.
Hay 3 tipos de apagamiento:
- Apagamiento por color: el color de la muestra absorbe los fotones
emitidos por el fluoróforo antes que lleguen al detector.
- Apagamiento puntual: la muestra no se disuelve bien y las
partículas beta se absorben antes de excitar al solvente.
- Apagamiento químico: componentes de la mezcla de conteo
interactúan con el solvente o el fluoróforo, disipando la energía. Difícil de
eliminar. Menor en los emisores ß- de alta energía.
CONTEO DE EMISIONES ß- POR CINTILADORES SOLIDOS

Permite evitar algunos de los problemas de la cintilación líquida.

Las muestras líquidas con el material radioactivo se colocan en

pequeños frascos cubiertos en el fondo con una matriz sólida que
contiene itrio, que actúa como fluoróforo. Se seca la muestra y
se cuenta en los mismos instrumentos para centelleo líquido.

El volumen de muestra utilizable es limitado (~ 200 μl) para evitar

apagamiento puntual.
 CONTEO DE RADIACIONES GAMA POR UN CINTILADOR
SOLIDO

Los cintiladores son los métodos más eficientes para la detección de

radiaciones gama.

Los rayos gama son fotones de alta energía que carecen de carga y masa.
Son altamente penetrantes pero requieren materiales densos para ser
absorbidos eficientemente lo que no ocurre con los cintiladores líquidos.
Se usan por lo tanto celdas de cintilación con cristales de NaI.

Los rayos gama son emitidos con valores energéticos únicos, lo que
facilita el análisis de experimentos con doble o triple marca usando
isótopos que emitan rayos gama.
 CONTEO CERENKOV

Las partículas beta de alta energía (> 0,5 MeV) atraviesan medios
acuosos a una velocidad superior a la de la luz en agua, lo que las
lleva a emitir luz (efecto Cerenkov). La luz emitida puede ser
detectada por los instrumentos de cintilación líquida. Muy utilizado
para medir degradación de P32 (eficiencia del 40 %; ¿por qué?).

El conteo Cerenkov no requiere solventes o fluoróforos especiales

por lo que no está sujeto a apagamiento químico, y por eso resulta un
método muy conveniente para detectar radioactividad.
 AUTORRADIOGRAFIA
En investigación bioquímica a menudo es de interés determinar la
ubicación de uno o más compuestos radioactivos después de una
separación cromatográfica o electroforética. Por ejemplo, separación
de sustratos de productos radioactivos después de una reacción
enzimática; separación de oligonucleótidos radioactivos en la
secuenciación de DNA, etc

La forma más usada de autorradiografía es exponer la cromatografía

o electroforesis a una placa fotográfica, como la utilizada para detectar
rayos X. Después de un tiempo de exposición, se revela la placa como
en una fotografía tradicional.

El uso más común es para análisis cualitativo, pero también cuantitativo

utilizando densitómetro. ¿Limitaciones?

La eficiencia depende de la energía de los rayos emitidos.

Uso de tres tipos de isótopos en secuenciación de DNA
 PROBLEMAS DE SEGURIDAD EN EL MANEJO DE
RADIOISOTOPOS

El uso de radioisótopos implica riesgos para los investigadores y para

el medio ambiente (uso y descarte de los residuos). Pero estos riesgos
no son mayores que el manejo p. ej. de acrilamida o bromuro de etidio.

Los riesgos están asociados a la capacidd de la radiación de ionizar

moléculas y formar radicales libres. Esto puede llevar a hidrólisis de
proteínas, quemaduras, mutaciones y cáncer.

La toxicidad depende de la masa y energía absorbida y los órganos que

absorben la radiación. La DOSIS recibida es importante para determinar
la toxicidad de la radiación.

La radiación puede ser absorbida por la piel y membranas, inhalación e

ingestión.
 COMO EXPRESAR LA DOSIS DE RADIACION

La unidad usada más comunmente es el Rad (dosis de radiación

absorbida).
Un Rad es igual a 0,01 Joules de radiación absorbida por Kg de peso.
Otra unidad es el Gray (Gy). 1 Gray = 100 Rad.
Como los distintos tipos de radiación difieren en su capacidad de dañar
los tejidos, es necesario aplicar un factor de corrección W.
La unidad corregida es el Sievert (Sv) o “dosis equivalente”:
Sv = Gy x W
W para rayos X y ß- es 1. Para rayos alfa es 20.
Velocidad de dosis (dose rate): Sv/hora

La dosis absorbida está relacionada inversamente al cuadrado de la

distancia entre la fuente radioactiva y el sujeto. Para reducir al máximo
la radiación recibida se recurre a distintos tipos de protección.
¿CUALES SON LOS LIMITES ACEPTABLES DE RADIACION?

Actualmente se acepta como límite recibir 15 mSv por año para el

cuerpo entero, valor raramente alcanzado por un biólogo.

Para órganos individuales: Manos 500 mSv/año

Cristalino del ojo: 150 mSv/ año

Recomendaciones básicas para el manejo de isótopos son:

- Maximizar la distancia entre el sujeto y la fuente
- Minimizar el tiempo de exposición
- Utilizar protectores siempre mientras dure la exposición

El principio ALARA (As Low As Reasonably Achievable): debe ser

el
guía en todo trabajo que utilice radioactividad.
 RADIOINMUNOENSAYO (RIA)
Método analítico muy sensible, utilizado en especial para la
cuantificación de hormonas.

Requiere de anticuerpos contra la molécula (hormona que se desea

detectar) y de la hormona marcada radioactivamente.

Se incuban cantidades fijas de anticuerpo con cantidades conocidas

de la hormona radioactiva, que se une al anticuerpo.

Se agrega hormona no radioactiva (que se desea cuantificar), la que

compite con la hormona radioactiva por su unión al anticuerpo. Se cuenta
la radioactividad remanente en el complejo.

Se construye una curva standard con cantidades conocidas de

hormona no radioactiva y se cuenta la radioactidad unida. Se interpola el
valor de radioactiviad de la muestra con hormona a cuantificar.
RADIOINMUNOENSAYO