Analisa DNA sequencing merupakan salah satutools yang sangat penting dalam mengungkap rahasia genetik di balik kehidupan.

Banyak sekali penelitian life science yang melibatkan analisa ini. Pencapaian terbesar teknologi DNA sequencingsaat ini adalah terungkapnya urutan basa nukleotida yang menyusun genom manusia. Para peneliti yang menggunakan tools ini seringkali menghadapi masalah dalam melakukan analisa, output yang dihasilkan seringkali tidak memuaskan. DNA sequencing menggunakan elektrophoresis kapiler merupakan teknologi kunci pada laboratorium-laboratorium life science. Berikut ini adalah beberapa hal yang penting untuk diketahui yang menjadi faktor penentu keberhasilan analisa DNA Sequencing.

Ekstraksi DNA untuk DNA sequencing

Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis sample memiliki tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan/tissue (termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari sumbernya, dan bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak. Metode untuk isolasi asam nukleat sering dikerjakan menggunakan penghancuran mekanik atau metode kimiawi, yang kadang-kadang juga terotomatisasi. Baik metode ekstraksi manual maupun otomatis yang digunakan, kita harus berhati-hati untuk meminimalisir degradasi DNA, dengan menghindari ekspos terhadap panas, cahaya, freeze-thaw yang berulang-ulang dan vortex. Selanjutnya, laboratorium harus diatur sedemikian rupa untuk meminimalisir kemungkinan kontaminasi silang diantara sample.

Desain Primer dan Amplifikasi

Urutan kerja DNA sequencing secara umum mengharuskan kita mengamplifikasi hasil ekstraksi DNA sample sebelum disekuen. Untuk mengamplifikasi DNA sample, kita membutuhkan DNA polymerase, nukleotida (dNTP), buffer reaksi, primer dan sebuah thermal cycler.

Sequencing Chemistries
Cycle sequencing merupakan metode sederhana yang mana terdiri atas proses denaturasi, annealing dan ekstensi yang berulang-ulang dalam sebuah mesin thermal cycler, menghasilkan amplifikasi linear produkproduk ekstensi. Produk ini kemudian diinjeksikan ke dalam sebuah kapiler. Untuk Applied Biosystems, ada 2 kategori pendekatan sequencing chemistry: Dye Primer Chemistry dan Dye Terminator chemistry.

Sequencing menggunakan Dye Primers

Ketika menggunakan sequencing chemistry berbasis dye primer, dilakukan empat reaksi terpisah. Setiap reaksi dilabel pada ujung 5-nya dengan menggunakan dye fluorescent yang berbeda. Masing-masing keempat reaksi ini akan mengandung apakah primer yang dilabel warna biru, hijau, kuning atau merah. Warna setiap reaksi berkorespondensi dengan A, C, G atau T. Dideoksiribonukleotida (ddNTP) terdapat dalam setiap campuran reaksi, dan menterminasi sintesis DNA secara acak, menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan panjang yang bervariasi. Karena digunakan primer yang dilabel fluorescent untuk ekstensi, seluruh fragmen yang diterminasi terlabel fluorescent. Setelah beberapa siklus yang cukup untuk terbentuknya produk ekstensi yang optimal, keempat reaksi tersebut digabungkan dan dielektroforesis menggunakan satu kapiler pada mesin Genetic Analyzer (gambar 2).

Gambar 2: Satu siklus dye primer cycle sequencing

Sequencing menggunakan Dye Terminators

DNA sequencing fluorescent dapat juga dilakukan menggunakan suatu bahan kimia dimana pewarna (dye) terikat pada ddNTP, sehingga membutuhkan hanya satu tabung reaksi per sample, bukan empat. Karena hanya membutuhkan satu tabung reaksi untuk reaksi dye terminator, bahan kimia ini lebih simple untuk digunakan dibanding dye primer chemistry. Template DNA, primer tak dilabel, buffer, empat jenis dNTP, empat jenis ddNTP

yang terlabel fluorescent, dan DNA polymerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Fragmen-fragmen yang berfluorescent terbentuk karena inkorporasi ddNTP yang terlabel pewarna. Masing-masing ddNTP yang berbeda (ddATP, ddCTP, ddGTP, atau ddTTP) akan membawa sebuah warna dye yang berbeda. Dengan demikian semua fragmen yang diterminasi (yang berujung sebuah ddNTP), mengandung sebuah dye pada ujung 3-nya (gambar 3).

Gambar 3: Satu Siklus Dye Terminator Cycle Sequencing

BigDye Cycle Sequencing Chemistries

BigDye primers dan terminators mengutilisasi molekul-molekul transfer energi tunggal, yang mencakup sebuah pewarna (dye) donor dan akseptor energi yang terhubung oleh sebuah penghubung (linker) transfer energi yang sangat efisien. Dalam struktur molekul BigDye, akseptornya adalah sebuah dyedichlororhodamine. Dye dichlororhodamine (dRhodamine) merupakan suatu penyempurnaan atas dyerhodamine konvensional. dRhodamine terpisah lebih baik secara spektral terdapat overlap spektral yang jauh lebih sedikit pada panjang gelombang eksitasi maksimumnya, dan produk sequencing yang dihasilkan memperlihatkan background noise yang jauh berkurang. Sehingga menghasilkan signal yang lebih bersih dan akurasi base calling yang lebih besar pada pembacaan yang lebih panjang. Suatu linkertransfer energi mengcouple fluorescein donor dan dye dRhodamine akseptor untuk transfer energi yang efisien dalam satu molekul tunggal. Dye yang lebih terang dan bersih ini menghasilkan sebuahsequencing chemistry yang sesuai untuk kebanyakan aplikasi.

Pemurnian sample
Setelah reaksi sequencing, sangat penting untuk membuang dye terminators yang tidak menempel dan garamgaram yang dapat berkompetisi saat injeksi elektrophoresis kapiler. Terminator yang tidak menempel dapat turut bermigrasi bersama template sequencing, mengakibatkan basecalling errors dan kelebihan garam mengakibatkan rasio signal-to-noise menjadi buruk.

Elektroforesis
Pada proses elektroforesis kapiler, produk-produk reaksi cycle sequencing diinjeksikan secara elektrokinetik ke dalam kapiler yang diisi dengan polimer. Dengan diberikannya tegangan listrik tinggi maka fragmen DNA yang bermuatan negatif akan bergerak melalui polimer di dalam kapiler menuju elektroda positif. Dengan diberikannya tegangan listrik tinggi maka fragmen DNA yang bermuatan negatif akan bergerak melalui polimer di dalam kapiler menuju elektroda positif (gambar 4). Elektroforesis kapiler dapat memisahkan molekul DNA yang memiliki perbedaan bobot molekul hanya satu nukleotida.

Gambar 4: Fragmen DNA yang dilabel fluorescent bergerak melalui sebuah kapiler

Gambar 5: Fragmen DNA melewati sebuah sinar laser dan detektor optis.

Beberapa saat sebelum mencapai elektroda positif, fragmen DNA terlabel fluorescent yang terpisah berdasarkan ukuran, bergerak melalui lintasan sinar laser. Sinar laser menyebabkan dye pada fragmen berpendar. Sebuah alat pendeteksi optis pada mesin DNA analyzer mendeteksi fluorescent (gambar 5).Software Data Collection mengkonversi signal fluorescent menjadi data digital, kemudian merekam datanya dalam sebuah file *.ab1. Karena masing-masing dye mengemisikan cahaya pada panjang gelombang yang berbeda ketika tereksitasi oleh laser, sehingga keempat warna yang mewakili keempat basa dapat dideteksi dan dibedakan dalam satu injeksi kapiler.

Analisa Data
Setelah elektroforesis, software Data Collection membuat sebuah file sample dari data mentah. Dengan menggunakan aplikasi software, analisa data selanjutnya diperlukan untuk menterjemahkan image data warna yang diperoleh menjadi basa-basa nukleotida yang berhubungan.

Analisa Primer
Tool-tool ini mengkonversi gambar yang diperoleh selama Data Collection menjadi empat warna, yang merepresentasikan keempat basa nukleotida yang berhubungan (gambar 1). Sebagai contoh, Software Sequence Analysis adalah perangkat analisa primer yang harus digunakan setelah pengumpulan data selesai. Aplikasi software Sequence Analysis memungkinkan pengguna untuk melakukan basecall danbasecall ulang, memotong ujung data, menampilkan, menyunting dan mencetak file-file sample. Softwareanalisa primer memproses data mentah pada file *.ab1 menggunakan algoritma dan menerapkan pengaturan analisa berikut kepada hasil:

Basecalling
Basecaller yang dipilih memproses signal-signal fluorescent, kemudian menetapkan suatu basa kepada setiap peak (A, C, G, T, atau N). Jika digunakan KB basecaller, software ini juga menyediakan prediksi nilai kualitas per basa, basecalling campuran tambahan dan identifikasi otomatis sample-sample yang gagal.

Gambar 6: Hasil Software Analisa Primer menampilkan masing-masing dari keempat basa sebagai warna yang berbeda-beda.

Koreksi Pergeseran Mobility

File Mobility mengkompensasi perubahan dalam mobilitas fragmen DNA yang disebabkan oleh molekuldye yang terikat pada fragmen DNA dan mengubah penetapan warna basa-basa bergantung pada jenischemistry yang digunakan untuk melabel DNA.

Quality Value (QV)

Jika menggunakan KB basecaller untuk analisa, software memberikan suatu QV untuk setiap basa. QV memprediksi probabilitas suatu galat basecall. Contohnya, suatu QV 20 memprediksi tingkat galat 1%. Algoritma pemrediksi kualitas dikalibrasi untuk memperoleh QV yang memenuhi hubungan standar-industri yang ditetapkan oleh software Phred. Jika alur kerja kita mencakup analisa menggunakansoftware Phred untuk memberikan QV setelah data di-basecall, kita dapat menyederhanakan workflow dan menggunakan KB Basecaller saja. KB Basecaller dapat melakukan basecalling dan memberikan QV. Kemudian, kita dapat membuat file *.phd.1 atau *.scf menggunakan KB Basecaller untuk diintegrasikan dengan workflow kita.

Analisa Sekunder
Tool-tool ini memungkinkan kita untuk lebih menyempurnakan hasil. Algoritma dalam produkproduksoftware analisa sekunder melakukan sejumlah aplikasi pendukung fungsi-fungsi seperti deteksi mutasi dan genotyping, dan menghasilkan output-output grafis. Diterjemahkan dengan modifikasi dari situs www.appliedbiosystems.com

Other articles you may like:

Tanya Jawab Seputar Analisa DNA Sequencing Mengenal Teknik DNA Sequencing Interpretasi Electropherogram DNA Sequencing Troubleshooting Guide. Keanehan-keanehan pada Electropherogram PeakTrace; Meningkatkan Kualitas Electropherogram 9 Tips untuk Real-Time PCR Yuk Mendesain Primer dengan Primer3Plus

Istilah pencarian terpopuler untuk artikel ini:

analisis DNA (135) | Ekstraksi DNA (112) | Analisa DNA (71) | elektroforesis kapiler (22) | aplikasi elektroforesis kapiler (21) |ekstrasi DNA (10) | teknik analisa dna (7) | pembuatan analisis DNA (6) | analisi dna (4) | langkah isolasi dna (4) | faktor yang mempengaruhi keberhasilan isolasi dna genom (4) | faktor keberhasilan isolasi dna (3) | ekstraksi DNA adalah (3) | faktor yang mempengaruhi elektroforesis (3) | isolasi pipet kapiler (3) | jurnal aplikasi elektroforesis kapiler (3) | teknik ekstraksi DNA (3) |aplikasi metoda elektroforesis kapiler dalam ekstrak (3) | alat analisis DNA (3) | sequencing adalah (3) |

Tags: dna dna analysis dna sequence DNA Sequencing sequence Pcrrr Tentu Anda sudah mengenal yang namanya DNA. DNA ini sering disebut-sebut terutama berkaitan dengan kriminalitas, diagnosa penyakit, penentuan keabsahan keturunan, dll. Mungkin Anda bingung bagaimana caranya polisi bisa mengungkap pelaku kejahatan dengan berbekal sehelai rambut pelaku yang tercecer di TKP, atau dari tetesan sperma pemerkosa yang mengering di tubuh korban. Padahal kan sampel yang dianalisa jumlahnya sangat sedikit, ajaib!

Ternyata hal ini gak lepas dari yang namanya PCR alias Polymerase Chain Reaction. Proses yang berlangsung secara in vitro dalam tabung reaksi sebesar 200 l ini mampu menggandakan atau mengkopi DNA hingga miliaran kali jumlah semula. Maka pantes aja dengan berbekal DNA yang terkandung dalam sampel yang cuma secuil itu bisa diperoleh banyak sekali informasi sesuai kebutuhan kita.

Reaksi PCR meniru reaksi penggandaan atau replikasi DNA yang terjadi dalam makhluk hidup. Secara sederhana PCR merupakan reaksi penggandaan daerah tertentu dari DNA cetakan (template) dengan batuan enzim DNA polymerase. PCR terdiri atas beberapa siklus yang berulang-ulang, biasanya 20 sampai 40 siklus. Nah, sekarang bayangkan bahwa pada setiap siklus DNA polymerase akan menggandakan DNA sebanyak 2 kali, dan coba hitung berapa salinan utas ganda DNA yang akan dihasilkan setelah 30 siklus? Yup, 2 pangkat 30 alias 1.073.741.824 kali! Tentu saja nilainya tidak tepat seperti itu, kita masih harus memperhitungkan efisiensi reaksi, tapi tetap saja hasilnya akan sangat banyak.

Sumber: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrcopies.gif

Komponen PCR
Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang dibutuhkan adalah:

Primer
Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.

dNTP (deoxynucleoside triphosphate)

dNTP alias building blocks sebagai batu bata penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.

Buffer
Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase.

Ion Logam

Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja.

Ion logam monovalen, kalsium (K+).

Tahapan Reaksi

Sumber: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrsteps.gif
Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:

Denaturasi
Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik. Pada suhu ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal.

Annealing
Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40-60oC selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer.

Ekstensi/elongasi
Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase, biasanya 70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T, dan C dengan G,

begitu pula sebaliknya). Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.

Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:

Pra-denaturasi
Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu).

Final Elongasi
Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir

PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. Pada awalnya orang menggunakan tiga penangas air (water bath) untuk melakukan denaturasi, annealing dan ekstensi secara manual, berpindah dari satu suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan. Tapi syukurlah sekarang mesin Thermal Cycler sudah terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan.

Aplikasi teknik PCR

Kita harus berterima kasih kepada Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR pada tahun 1984. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:

Isolasi Gen
Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Oh ya, gen itu apaan ya?

Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut junk DNA, DNA sampah yang fungsinya belum diketahui dengan baik.

Kembali ke pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia.

Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin juga

[http://www.littletree.com.au/dna.htm]. Dan ajaib! Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus mengorbankan sapi atau babi.

Nah, untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama probe yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.

DNA Sequencing
Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.

Forensik
Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud.

Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua sesungguhnya dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.

Diagnosa Penyakit
Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat.

PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.

Masih banyak aplikasi PCR lainnya yang sangat bermanfaat. Maka tak salah panitia Nobel menganugrahkan hadiah Nobel bidang kimia yang bergengsi ini kepada Kary B Mullis hanya 9 tahun setelah penemuannya (1993).

Sumber: Wikipedia , Andy Vierstraete dan sumber-sumber lainnya.