Espectrofotometra

Principios, Componentes, Cuidados, Control de Calidad y Mantenimiento

Espectrofotometra
Trmino que se refiere al uso de la Radicacin Electromagntica (REM) para medir las concentraciones de una sustancia.

Un poco de historia
Antes de 1940 la mayora de las determinaciones en qumica clnica eran del tipo volumtricas y gravimtricas. Por lo que la mayor parte de los resultados fueron semicuantitativos. En la dcada de 1950 se comienza a utilizar el espectrofotmetro (EE.UU.). ste elimin el comparador de color, logrando as que los anlisis fuesen ms cuantitativos, confiables, reproducibles e incrementando la precisin y la exactitud.

El espectrofotmetro es un instrumento til, por las ventajas tales como rapidez, sencillez, especificidad y sensibilidad.
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Antecedentes tericos
Todo tomo y molcula es capaz de absorber energa (bajo ciertas limitaciones). La energa puede proporcionarse en forma de REM, luz. El tipo y la cantidad de REM absorbida por una molcula esta relacionada con su estructura.

As mismo la cantidad de REM absorbida est relacionada con el nmero de molculas que interaccionan con ella.
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Antecedentes tericos
De la REM slo se trabaja para la espectrofotometra en qumica clnica con la ultravioleta y la visible.

Antecedentes tericos
mxima absorcin (nm) 400-450 450-480 440-470 470-500 500-560 560-575 575-590 590-625 625-750 Color absorbido Violeta Azul Verde-azul Azul-verde Verde Amarillo-verde Amarillo Naranja Rojo Color observado Amarillo-verde Amarillo Naranja Rojo Prpura Violeta Azul Verde-azul Azul-verde
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Antecedentes tericos
La radicacin electromagntica tiene un comportamiento dual, es decir, como onda y como partcula. Como onda se sabe que presenta la propiedades de reflexin, refraccin y difraccin, esta ltima explica la descomposicin de la luz en los diferentes colores.
Radiacin electromagntica, de luz polarizada en un plano y que se propaga a lo largo del eje de las x

Espectro de luz visible

Antecedentes tericos
La REM se desplaza describiendo una onda, mientras ms pequea es la longitud de onda () mayor energa posee y viceversa. La longitud de onda () es la distancia lineal desde cualquier punto de una onda hasta el punto correspondiente de la onda adyacente y se mide comnmente en nm . La frecuencia () es el nmero de ondas que pasan por un punto dado en una unidad de tiempo, es decir, en s-1 = hertz Longitud de (Hz). onda grande
Baja Frecuencia

Alta frecuencia Longitud de onda pequea

Antecedentes tericos
c La ecuacin describe esa relacin.
La velocidad de la luz (c) una constante universal de valor = 2,997 924 58 X 108 m/s. La potencia (P) de un haz de radiacin es la energa del haz que llega a un rea dada por segundo. La intensidad (I) es la potencia por ngulo slido unitaria.

Antecedentes tericos
Como partcula (fotn) permite explicar el proceso energtico de la REM. E = h donde E = energa y h = constante de Planck (= 6,626 0755 X 10-34 Js). c Sustituyendo de , en E = h . hc o E hc , 1 que recibe el Nos queda que E nombre de nmero de onda.

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Antecedentes tericos
a) b) c) d) Todas las molculas poseen energa la cual es debida a: La translacin. La vibracin de sus constituyentes (tomos). Rotacin y. Su configuracin electrnica. Dando como resultado que la energa total sea igual a la suma de cada una de las anteriores. Por lo que la mecnica cuntica nos ndica que la molcula slo puede adoptar ciertos valores de energa y que sta se encuentra cuantizada y es diferente para cada compuesto.
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Antecedentes tericos
La absorcin de la REM por alguna especie M se considera en dos etapas y como un proceso irreversible. M + h M*, donde M* es la partcula en estado excitado, debido a la absorcin de un fotn la vida de M* es del orden de 10-8 - 10-9 s. La molcula regresa a su estado basal mediante la liberacin de la energa antes adsorbida, es decir, M* M + calor.

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Fundamento
Cuando una muestra absorbe fotones, la potencia del haz disminuye (P P0) donde P0 es la que sale del monocromador. La ley que explica la relacin entre la absorcin y la concentracin de una sustancia es conocida comnmente como ley de Beer o Lambert-Beer. Si T es la transmitancia, es decir la radiacin que pasa altraves del cuerpo entonces T=P/P0 por lo que T solo puede tener valores que van desde cero hasta uno.
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Fundamento
Como normalmente se trabaja con %T entonces tenemos que %T P 100 lo que nos da como resultado P0 100 la ecuacin ms conocida para la relacin de la absorbancia, esta es:

A 2 log%T

Cuando no se absorbe luz P=P0 A = 0.

Si se absorbe el 90% de la luz, 10% es lo que se transmite, es decir, P=1/P0 dando un valor de A = 1.
Al absorberse el 99% de la luz, es decir, se transite el 1% A = 2.
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Fundamento
La importancia de la absorbancia [A] (Densidad ptica [D.O.] Densidad [D] o Extincin [E]) estiba en que es directamente proporcional a la concentracin de la especie absorbente en la muestra, y la expresin matemtica que la representa es. A = bc que es la ley de Lambert-Beer Donde A es la absorbancia de la muestra, (a) es el coeficiente de extincin molar, b es la longitud de la trayectoria ptica y c la concentracin de la solucin problema. La relacin lineal entre A y b a una concentracin fija de sustancia absorbente es una generalizacin para la que no se conoce excepcin.
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Limitaciones a la ley de Lambert-Beer

La relacin directa entre A y c si presenta desviaciones a la linealidad medidas a una misma longitud de trayectoria del haz. Por lo que la ley slo se cumple con disoluciones verdaderas y a concentraciones 0.01M o F. Puesto que en toda solucin concentrada las molculas del soluto interaccionan entre s por su proximidad: Lo cual hace probablemente que cambien las propiedades elctricas de las molculas, causando tambin una modificacin en las propiedades pticas de stas.

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Limitaciones a la ley de Lambert-Beer (continuacin)

Desviaciones qumicas. Debidas a la asociacin, disociacin o reaccin de las sustancia problema con el disolvente. V. g. soluciones mal amortiguadas, lo cual cambia la concentracin y la desviacin es ms aparente que real, por modificacin de los equilibrios qumicos.

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Instrumento, sus partes

Rendija Rendija

Escala de lectura
T= % transmitancia A = -log (T/100)

en una cubeta

Muestra

Monocromador

Seleccin de una longitud de onda de luz: 500 nm

Lmpara

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Sus partes
a. Lmpara: La tungsteno es una magnifica fuente de radiacin en el intervalo de los 380 - 780 nm y opera a T de 2 870 K. Las ms empleadas en qumica clnica son las de yoduro de tungsteno que tiene una vida til de 2 a 3 000 h. por debajo de los 360 nm es conveniente utilizar una lmpara de arco de deuterio la cual emite una radiacin en el intervalo de 180 - 400 nm. Menos frecuentes son las lmparas de hidrogeno con intervalos de 150 350 siendo parecidos a los de deuterio. Las de mercurio presentan el inconveniente de proporcionar slo espectros discontinuos de 313, 365, 405, 436 y 546 nm.

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Sus partes
b, c y d son los componentes del monocromador. b. La rendija de entrada reduce al mximo la luz difusa y evita que la luz dispersa penetre al dispersor, ste solo lo puede hacer con un mnimo de luz directa. c. Dispersor de luz (selector de longitud de onda, o monocromador propiamente dicho). Pueden ser prismas o rejillas de difraccin.
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c Prismas y rejillas de difraccin

En caso de los prismas. Para la luz visible un prisma de vidrio es bueno, sin embargo, este material no es conveniente para las mediciones en la regin del ultravioleta, pues el vidrio absorbe la radicacin a estas . La dispersin producida por un prisma ni es lineal, y se hace mucho menor cuando >550 nm.
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Prismas y rejillas de difraccin (continuacin)

Las rejillas de difraccin, estas se preparan a partir de una rejilla patrn la en la cual se graban surcos las que se emplean para las regiones visible-uv poseen 2 325 surcos por cm2- sobre una superficie metlica. La dispersin de la luz en las rejillas de difraccin es lineal. Como los surcos estn muy prximos entre s cuando la luz es reflejada por la rejilla, cada estra se comporta como una fuente de radiacin. Si los rayos de luz adyacentes estn en fase, se refuerzan unos a otros. Cuando no lo estn, se cancelan parcial o totalmente.

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d Ranura o rendija de salida

sta determina el ancho del espectro de dispersin que sale del sistema monocromador. Puede enfocarse una lnea particular sobre dicha ranura haciendo girar la rejilla. Si las ranuras de entrada y salida son del mismo tamao, la imagen de rendija de entrada tericamente encajar exactamente en la abertura de la ranura de salida cuando al montaje del monocromador corresponde a la longitud de onda de la radicacin. Moviendo el montaje del monocromador en una u otra direccin produce una continua disminucin de la intensidad emitida, llegado a cero cuando la imagen de la ranura de entrada ha sido desplazada en todo su ancho.

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Ancho de banda
Como la luz obtenida que sale del sistema monocromador no es verdaderamente de una sola , sino que comprende un intervalo de . El grado de monocromaticidad se define como el Ancho de Banda. Es el intervalo de que pasan a travs de la rendija de salida.

Lo que se observa en una rendija de salida cuando se explora con el monocromador son longitudes de onda que van desde 1 hasta 2 + 24

e Celdas o portamuestras
Existen de todos tamaos y formas. Las ms comunes para medir espectros visibles y de ultravioleta son de cuarzo, tienen un espesor de 1,00 cm (o trayectoria ptica). Las ms fciles de conseguir son las redondas (tipo tubo de ensayo) las mejores son las cbicas.

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Detectores, fotomultiplicadores y fototubos

Poseen la capacidad de producir una seal elctrica cuando son bombardeados por fotones. Se basan en el efecto fotoelctrico. El ms sensible es el fotomultiplicador. En ste los electrones emitidos por una superficie fotosensible inciden en una segunda superficie, llamada dnodo, la cual se mantiene (+) respecto al emisor fotosensible.

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Fotomultipicadores

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g Registrador
De aguja o digital. Incorporado a un sistema de impresin. Conectado a una computadora.

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Errores en espectrofotometra
Para el anlisis cuantitativo se debe tomar en cuenta: 1. La absorbancia no debe ser demasiado grande. 2. La absorbancia debe medirse en un pico o en una meseta donde dA/d sea pequea. 3. El ancho de banda del monocromador debe ser lo ms grande posible, mas pequea comparada con la banda que va a medirse. Los errores instrumentales Las mediciones ms exactas suelen hacerse cuando la absorbancia se encuentra entre 0,4 y 0,9. Para mayor precisin, las muestras deben estar libres de polvo, las celdas de huellas digitales, o cualquier otra contaminacin o dao fsico que modifique o altere la ptica en general.
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Control de calidad
Es necesario realizar peridicamente pruebas para verificar que el instrumento esta trabajando adecuadamente: exactitud de longitud de onda, linealidad de la respuesta del detector, radiacin errtica, y exactitud fotomtrica.

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Disco de Newton
800 400

620

Rojo

Violeta

430

Naranja

Azul

580

Verde

490

560
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Colores complementarios para leer en el espectrofotmetro

Intervalo de longitud de onda (nm) 400 435 435 480 480 490 490 500 500 560 560 580 580 595 595 650 650 750 Color de la luz absorbida Violeta Azul Azul verdoso Verde azulado Verde Amarillo verdoso Amarillo Anaranjado Rojo Color complementario trasmitido Amarillo verdoso Amarillo Anaranjado Rojo Prpura Violeta Azul Azul verdoso Verde azulado

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Exactitud de longitud de onda

Se han sugerido varios estndares para verificarla en las regiones visible y uv. Las lmparas de mercurio producen como ya se ha mencionado lneas de emisin. Las lneas de emisin del hidrgeno (o deuterio) con lneas de emisin tiles a 486 y 656 nm. El espectro de absorcin del xido de holmio como vidrio o en solucin posee fuertes lneas de absorcin a aproximadamente 241, 279, 287, 333, 361, 418, 453, 536 y 636 nm. El didimio tiene bandas de absorcin mucho ms amplias 573, 586, 685, 741 y 803. Espectro de absorcin del benceno. Solucin alcalina de cromato de potasio. Puntos isosbsticos.
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Puntos isosbsticos
Cuando una sustancia presenta varias formas (como los colorantes cido-base), stas pueden presentar un mismo punto donde se cruzan los espectros de absorbancia, stos son fijos por lo que permiten verificar la exactitud de la longitud de onda. La limitacin que este procedimiento tiene es que se debe hacer el barrido espectrofotomtrico para cada una de las formas de dicha sustancia (v. g. rojo de metilo) y realizar la grfica tal como lo muestra la figura siguiente.

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Linealidad
Un espectrofotmetro que trabaje adecuadamente debe mostrar una relacin lineal entre la cantidad de energa radiante absorbida y la lectura del indicador. sta es un requisito para la exactitud tanto instrumental como analtica. Filtros de vidrio pueden emplearse. El empleo de soluciones a distintas concentraciones de un compuesto que siga la ley de Lambert-Beer por ejemplo: La oxihemoglobina a 415 nm. p-nitrofenol a 405 nm. Sulfato de amonio y cobalto a 512 nm. Sulfato de cobre a 650 nm.

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Mantenimiento
Preventivo. ste se realiza tomando en cuenta los datos vertidos en la bitcora. Registrar el tiempo que permanece encendida la lmpara Verificar el la vida til de la lmpara y solicitar a compras un repuesto con tiempo suficiente para su cambio. Anotar fecha, hora, y personal que realiz el cambio de lmpara. Anotar fecha, hora y operador que hizo la verificacin de linealidad, y exactitud de . Anotar hora y da que se realiz la limpieza, engrasado y revisin de partes del instrumento. Anotar el ltimo mantenimiento correctivo que se le realiz al instrumento.
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