METODOS DE ANLISIS EN QUIMICA CLINICA

ANLISIS DE SANGRE 1. Anlisis en suero 1.1. Evaluacin de la funcin renal. Es el producto resultante del metabolismo de las nucleoprotenas. La insuficiencia renal crnica avanzada produce un incremento progresivo del nivel de cido rico en el plasma. Se deposita en los tejidos en forma de uratos dando lugar a la enfermedad conocida como gota. Intervalos de referencia: 36-77 mg/L en Hombres 25-68 mg/L en Mujeres Mtodos de anlisis: Mtodo espectrofotomtrico: el cido rico acta como un agente reductor del cido fonsfotungstico. Previamente hay que eliminar las protenas por precipitacin. cido rico + H3PW12O40 + O2 Alantona + CO2 + AZUL DE TUNGSTENO ( = 700 nm) Mtodo enzimtico:
URICASA

ACIDO URICO:

cido rico + O2

Alantona + H2O2 + CO2 Se acopla a una reaccin indicadora

Mtodo polarogrfico: Se emplea un sensor polarogrfico de O2. En la reaccin anterior, se mide el consumo de O2 siendo proporcional a la concentracin de cido rico. HPLC Se usa fase inversa y deteccin espectrofotomtrica a = 280 235 nm nm Tambin se puede usar intercambio inico y deteccin electroqumica (amperomtrica: se mide la intensidad de corriente a un potencial constante). 1.2. Evaluacin de existencia de hiperlipidemia y de riesgo de enfermedades cardiovasculares.
COLESTEROL:

Se encuentra presente en todas las lipoprotenas plasmticas. Cuando un exceso de lpidos no se elimina o utiliza, se deposita en tejidos y paredes arteriales, obstruyendo el flujo de sangre a rganos vitales. Se obstruye la circulacin dando lugar, por ejemplo, al infarto de miocardio. Intervalos de referencia: 1.20-2.20 g/L Colesterol HDL: 0.40-1.10 g/L Hombres 0.50-1.20 g/L Mujeres Mtodos de anlisis: La determinacin de colesterol total incluye las formas libre y esterificada del mismo. Los mtodos de anlisis se dividen en:

 Mtodos en 1 etapa: son ensayos directos, sin preparacin previa de la muestra de suero. Suelen ser medidas espectrofotomtricas o fluorimtricas. Exhiben a menudo errores debido a interferencias y a diferencias del color desarrollado por el colesterol libre y el esterificado. Mtodos en 2 etapas: se introduce una etapa previa de extraccin orgnica eliminando muchas interferencias. Sin embargo, no se elimina el efecto de la respuesta de color diferencial entre el colesterol libre y esterificado. Pero se acepta para el trabajo clnico de rutina usando factores de correccin. Mtodos en 3 etapas: adems de la extraccin del colesterol, incluye una etapa de saponificacin que hidroliza la porcin acido graso de los esteres del colesterol. Se determina el colesterol libre total
EXTRACCIN 1 SAPONIFICACIN 2 COLESTEROL LIBRE TOTAL CUANTIFICACIN 3 DESARROLLO COLOR

Colesterol LIBRE + Colesterol ESTERIFICADO

Mtodos en 4 etapas: adems de la extraccin, saponificacin y desarrollo del color, incluye una cuarta etapa en la cual se precipita el colesterol libre con digitonina (saponina que esterifica el grupo hidroxilo)
Colesterol LIBRE
EXTRACCIN 1 DIGITONINA 2 COLESTEROL ESTERIFICADO SAPONIFICACIN 3 COLESTEROL LIBRE

Se cuantifica
4 CUANTIFICACIN DESARROLLO COLOR

Colesterol LIBRE + Colesterol ESTERIFICADO

La cuantificacin final del colesterol se hace por la medida del color desarrollado y no se distingue entre colesterol libre y esterificado. El reactivo reacciona con el colesterol que encuentran y ya sabemos que el desarrollo del color es distinto para el colesterol libre y para el esterificado. Esta cuantificacin final puede hacerse: Reaccin con una sal de Fe3+ : se emplea cido actico + cido sulfrico y se aade una sal de Fe3+ Como producto de reaccin se obtiene el catin tetraenlico que se mide a = 563 nm. Reaccin con el cido p-toluensulfnico:
Anhdrido actico

Colesterol + cido p-toluensulfnico

ac. Actico glacial ac. Sulfrico

cromforo ( = 550 nm)

Reacciones enzimticas: incluyen la etapa de saponificacin mediante el uso de una enzima:

Colesterol esterasa

Esteres del colesterol + H2O

Colesterol oxidasa

Colesterol + cidos grasos libres colest-4-eno-3-ona + H2O2

Colesterol + O2

Se sigue el consumo de O2 con un electrodo de oxgeno o bien se acopla el H2O2 a una reaccin indicadora, por ejemplo:
Peroxidasa

2 H2O2 + Fenol + 4-aminofenazona

quinonimina + 4 H2O

Se determina la quinonimina formada a = 500 nm

COLESTEROL UNIDO A LIPOPROTENAS DE ALTA DENSIDAD-

HDL : High Density Lipoproteins LDL: Low Density Lipoproteins VLDL: Very Low Density Lipoprotein. La HDL desempean un papel importante para transportar el colesterol lejos de los tejidos y proporciona proteccin contra las enfermedades de la arteria coronaria. Estn compuestas por un 50% de protenas y un 50% de lpidos. De estos ltimos, el 28% son fosfolpidos, el 18% colesterol (libre y esterificado, ms cantidad del segundo) y el 4% restante son triglicridos. Los pasos a seguir para determinar el colesterol unido a las HDL sera: Aislar las HDL Cuantificar el colesterol (ya visto) Para aislar las HDL se puede seguir cualquiera de los siguientes mtodos: Ultracentrifugacin: el suero se ajusta a una densidad de 1.063 g/ml por adicin de KBr (415 mg/5 mL). Se centrfuga: la disolucin sobrenadante contiene VLDL y LDL y la inferior HDL Cromatografa en columna por intercambio inico o exclusin molecular. Electroforesis Precipitacin: precipitacin selectiva de lipoprotenas con diversas soluciones polianinicas. Las HDL quedan en el sobrenadante, no precipitan.

1.3. Evaluacin de la funcin heptica Para evaluar la funcin heptica se determinan las siguientes enzimas: Alanina aminotransferasa (ALT) Fosfatasa alcalina (ALP) Aspartato aminotransferasa (AST) Gamma glutamiltransferasa (GGT) Como ejemplo, veremos la determinacin de la ALT:
ALANINA AMINOTRANSFERASA (ALT):

Diagnostica enfermedades hepticas agudas y crnicas, la presencia de hepatitis aumenta su concentracin en suero. Intervalo de referencia: 0-55 U/L

Mtodos de anlisis: Esta enzima cataliza la transferencia del grupo amino segn la reaccin:
CO2H H - C NH2 CH3 + CO2H C=O CH2 CH2 CO2H L-Alanina -Cetoglutarato PIRUVATO CO2H C=O CH3 + CO2H H- C = NH2 CH2 CH2 CO2H L-Glutamato

ALT

El suero a analizar (donde se encuentra la ALT) se incuba en L-alanina + -cetoglutarato de manera que el PIRUVATO formado se evala de una de las dos maneras siguientes: a) Se sigue la candidad de Dinitrofenilhidrazona del piruvato formada a = 505 nm:

CO2H C=O CH3 PIRUVATO +

Dinitrofenilhidrazina (DNPH)

CO2H N=C CH3 Dinitrofenilhidrazona del PIRUVATO (azul)

b) Se sigue espectrofotomtricamente a = 340 nm la desaparicin del NADH (Nicotinamidaadenin-dinucleotido reducido):

CO2H H - C OH + CH3 Lactato NAD+

PIRUVATO

+ NADH + H+

LD (lactato deshidrogenada)

2. Medidas de la coagulacin sangunea Los cogulos de sangre se forman por la interaccin de aproximadamente una docena de protenas llamadas factores de coagulacin, los cuales funcionan simultneamente para convertir la protena PROTROMBINA en un enzima proteoltico llamado TROMBINA La TROMBINA a su vez acta sobre una protena circulante denominada FIBRINOGENO, convirtiendo dicho fibringeno en FIBRINA. Los monmeros de fibrina se polimerizan para formar unas macromolculas denominadas REDES DE FIBRINA.

Las redes de fibrina en conjuncin con las plaquetas agregadas y los glbulos rojos de la sangre forman un cogulo que generalmente puede prevenir la prdida excesiva de sangre. Los ANALIZADORES DE COAGULACIN son instrumentos que se utilizan para estudiar el estado funcional del sistema de coagulacin. Evalan la capacidad del sistema de coagulacin, midiendo la cantidad de tiempo necesario para que ocurra la formacin de redes de fibrina bajo condiciones cuidadosamente controladas. Los medidores del tiempo de coagulacin ms utilizados son: 1. Medidores pticos del tiempo de coagulacin (ver fotocopia correspondiente) Los ensayos que se realizan ms comnmente son los del tiempo de protrombina y tiempo de tromboplastina parcial activada. En ambos casos, los reactivos apropiados se mezclan con la muestra y cuando se aade el ltimo reactivo se pone en marcha el cronmetro. Cuando el instrumento detecta la formacin de redes de fibrina se para el cronmetro. Los medidores pticos se basan en la turbidimetra y en l las redes de fibrina formadas son los suficientemente grandes para dispersar o bloquear la transmisin de energa radiante. Cuando se va a medir el tiempo de coagulacin, la muestra de plasma se mezcla con todos los reactivos excepto uno. Al aadir el ltimo reactivo, es cuando se pone en marcha el cronmetro. Cuando el detector capta una disminucin brusca de la luz transmitida, el cronmetro se para automticamente. Las medidas de coagulacin son dependientes de la temperatura, la mayora de los instrumentos estn preparados para mantener la muestra problema a 37 0.5C 2. Medidores conductimtricos del tiempo de coagulacin (ver fotocopia correspondiente) Se determina la conductividad elctrica sumergiendo dos electrodos en la mezcla de reaccin. Cuando se aade el ltimo reactivo a la cubeta de ensayo se pone en marcha el cronmetro y uno de los electrodos se mueve rpidamente a travs de la solucin. Con su movimiento se acerca al electrodo fijo sin llegar a tocarlo, volviendo despus a la posicin original. Este ciclo se repite aproximadamente cada medio segundo, manteniendo la disolucin bien mezclada. Cuando comienzan a formarse las redes de fibrina, se conectan los dos electrodos entre s, causando un cambio en la conductividad elctrica que provoca la parada del cronmetro. 3. Contadores de clulas sanguneas Los ms sencillos pueden identificar y contar eritrocitos, leucocitos y plaquetas. Entre los ms complejos estn los citmetros de flujo que pueden identificar y contar distintos subtipos de leucocitos. En los laboratorios no orientados a la investigacin, se pueden encontrar dos mtodos de identificacin y recuento de clulas: uno basado en la medida de la resistencia elctrica y otro basado en una medida ptica. 1. Contadores de clulas basados en la medida de la resistencia elctrica: (ver fotocopia) Se diluye la sangre con un disolvente de alta conductividad (baja resistencia) y se la hace pasar por una cmara de flujo que presenta un pequeo orificio o abertura que provoca que la mayora de la clulas pasen alineadas. Posee unos electrodos de platino que permiten medir la resistencia elctrica durante el perodo en que un volumen conocido de sangre pasa a travs de la abertura.

Cuando una clula sangunea pasa a travs del orificio, se incrementa la resistencia elctrica en dicho orificio ( las resistencia de las clulas es mucho mayor que las del electrolito que las desplaza). La resistencia medida es la suma de la resistencia de la clula sangunea y del disolvente no desplazado. Una vez que la clula ha pasado a travs de la abertura, sta se llena con disolvente altamente conductor y la resistencia vuelve a su valor inicial. Se cuenta cada impulso de resistencia que tiene lugar cuando la sangre diluida pasa a travs de la abertura. El recuento real viene dado por un contador electrnico. El recuento celular, expresado en n de clulas / L se calcula a partir del volumen de sangre diluida medida, el n de impulsos registrados y el factor de dilucin empleado en la preparacin de la muestra. Para optimizar los resultados, hay que tener en cuenta que, a veces, pasan dos o ms clulas a travs del orificio simultneamente. La frecuencia con la que esto ocurre est relacionada con el n de clulas presentes y el tamao del orificio. El factor de correccin es predecible y calculable a partir de consideraciones estadsticas. En estos equipos, se pueden distinguir clulas de diferentes tamaos; ya que al tener volmenes celulares diferentes generan distintos cambios en la resistencia elctrica: clulas pequeas como las plaquetas generan pequeos cambios en la resistencia, mientras que clulas ms grandes como los glbulos blancos producen un incremento de resistencia ms grande. Se emplean circuitos electrnicos discriminatorios que clasifican los impulsos por tamaos y los integra para responder slo a clulas de un determinado tipo. 2. Contadores celulares basados en medidas pticas. (ver fotocopias) Se basan en la capacidad de dispersin de la radiacin electromagntica: la energa radiante sufre una dispersin de bajo ngulo considerable al chocar con las clulas; lo que se utiliza para realizar recuentos celulares. Se necesita un fotmetro de dispersin de bajo ngulo y una vasija de flujo que obligue a las clulas sanguneas a pasar a travs de un rayo de luz, una por una. Es necesario conocer el volumen de sangre analizada con el fin de expresar los resultados en n de clulas / L sangre. La intensidad y duracin de la seal de salida del fotomultiplicador es caracterstica de la clula que pasa a travs del volumen activo. Es posible hacer un recuento de clulas y, en algunos casos, identificarlas. Es tambin posible estimar el volumen medio de la clula.