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Apostila de Bioquímica

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FACULDADE ESTÁCIO DE SÁ DE CAMPO GRANDE-MS

BIOQUÍMICA – PRÁTICA

PROFESSOR Dr. JOAQUIM CORSINO APOIO TÉCNICO – Rafael e Euler

Campo Grande – MS 2008 INTRODUÇÃO A – Objetivos Gerais das Aulas Práticas de Bioquímica As aulas práticas de Bioquímica tem como objetivo criar condições para que os estudantes sejam capazes, ao final do curso, de: 1. Manipular os equipamentos freqüentemente utilizados em laboratório de bioquímica. 2. Conhecer por meio de reações efetuadas no laboratório, as propriedades químicas das substâncias que compõem os organismos vivos. 3. Interpretar resultados experimentais. B – Normas do Laboratório de Bioquímica 1. Espectrofotômetro, centrifuga, banho-maria ou quaisquer outros aparelhos, somente deverão ser manuseados pelos alunos após instruções, a fim de se evitar danos irreparáveis. 2. Em dias e hora pré-determinados, os alunos terão à sua disposição professores e técnicos encarregados de orienta-los na execução e interpretação dos referidos trabalhos. 3. Após o uso de um bico de gás, ou de água, não deixa-los aberto, tomando o cuidado de fechar as torneiras completamente. 4. Não lançar nas pias quaisquer materiais, com exceção de água, para evitar a corrosão dos encanamentos. C – Prevenção de Acidentes 1. Trabalhar sempre protegido por avental. 2. Não fumar dentro do laboratório. 3. Ao acender o bico de gás, ter o cuidado de não abrir a torneira de gás, antes que tenha a mão o palito de fósforo acesso. 4. Não operar com substâncias inflamáveis (álcool, éter) nas proximidades de uma chama. Usar banho de água ou areia. 5. Os reagentes tóxicos ou corrosivos, álcali ou ácidos fortes (quando concentrados), não deverão ser pipetados com a boca.

TRABALHO PRÁTICO

IDENTIFICAÇÃO DE AMINOÁCIDOS OBJETIVOS ESPECÍFICOS No final desse trabalho prático, o estudante deverá saber: 1. Executar testes qualitativos em tubos de ensaio para reconhecimento de aminoácidos. 2. O significado de seguintes reações particulares. • Reação xantoprotéica • Reação de Sakaguchi • Reação de aminoácidos que contém enxofre. 1. Reações Gerais dos Aminoácidos a.Formação de sais com ácidos e bases devido à natureza de íon dipolar dos aminoácidos O conhecimento das propriedades ácido-básicas dos aminoácidos, é extremamente importante para o entendimento de muitas propriedades das proteínas. Além disso, separar, identificar e quantificar os diferentes aminoácidos, que são passos necessários para a determinação da composição e seqüência aminoácidos das proteínas, é baseada no comportamento característicos de cada um destes monômeros. Os aminoácidos são cristalizados a partir de soluções aquosas neutras em sua forma totalmente ionizada como íons dipolares ou zwitterions. Embora tais íons dipolares sejam eletricamente neutros e não se movam em um campo elétrico, eles possuem cargas opostas nos seus dois pólos. Quando um aminoácido neutro é dissolvido em água, ele pode se comportar como um ácido (doador de prótons) ou como uma base (aceptor de prótons). OHR-CH(+NH3)-COOH H
+

OHR-CH(+NH3) COOH
+

R-CH(NH2)-COO-

[ A-] Sabendo-se que: pH = pK1 + log -------[ HA]

onde HA é um ácido qualquer

Podemos, por uma curva de titulação, calcular os diferentes pK, s de um determinado aminoácido bem como o seu ponto isoelétrico, a partir da relação:

PK, 1 + pK,2 pI = ---------------------2 Dessa maneira, podemos, a partir dos valores de pK e pI identificar qualquer dos 20 aminoácidos protéicos.

Procedimento experimental

5 – rosa.11. gota a gota. A ninhidrina oxida o aminoácido. pK2 = 9.roxo pK. reduzindo. pK3 = 10. e um derivado aldeídico com um átomo de carbono a menos e.0 . conseqüentemente. os mesmos resultados seriam observados? Por que? b. pH acima de 7. que é amarelo.07 Responda: • • Qual é o pI da tirosina? Se em lugar da tirosina tivesse sido empregada a glicina. + NH3 H HO CH2 C COO - TIROSINA OBSERVAÇÃO: O vermelho de cresol apresenta os seguintes pontos de viragem: pH 0. NH3 .5 – 6.0 – 2. produzindo CO2 . após reagir com aminas. NaOH 2N e acompanhar a dissolução da tirosina precipitada. usando a estrutura da tirosina e explicar cada etapa do processo. pH 2. Reação com Ninhidrina A ninhidrina (hidrato de triceto-hidrindeno) é um composto heterocíclico que forma um derivado corado. Posteriormente. esta reação é freqüentemente utilizada para determinação quantitativa de aminoácidos em solução. Adicionar. observar que a tirosina não se dissolve.5 – amarelo. gota a gota.• • • • • Suspender uma pitada de tirosina em 1 mL de água Acrescentar uma gota de indicador de cor (vermelho cresol). . Prosseguir a adição de HCl até dissolução da tirosina. a ninhidrina oxidada e reduzida reage com a amônia liberada formando um complexo violeta ou púrpura. As reações podem ser equacionadas da seguinte maneira: H O OH OH O + H R C COOH NH2 CO2 + R C O O OH H NH3 O HO Ninidrina reduzida O Ninidrina oxidada O + H + 3 H2O + HO O N O O - O Complexo colorido Como a intensidade da coloração do complexo formado é proporcional à concentração de aminoácidos ou peptídeos pequenos. HCl 10% e notar a formação de precipitado. Adicionar. Exceto o derivado da prolina.20. com os amingrupos dos aminoácidos livres ou de terminações de proteínas e peptídeos. Escrever as reações envolvidas nos diversos passos da experiência. s da tirosina: pK1 = 2.

0 Ninhidrina 0. aquecê-los em banho-maria a 100º C por 3 minutos.1% (gotas) 5 5 5 5 5 5 * Aspartame (L-aspartil-fenilalanina metil éste ).0 1.5% o mL N gotas gotas mL 1 Água 1.0 3 3 1 3 Glicina 0. Identifique o (s) aminoácidos (s) contendo o grupo guanidina.0 3 3 1 4 Triptofano 0. Aminoácidos com grupos guanidina: Reação de Sakaguchi H2N C NH R NH2 OH Os aminoácidos com grupo guanidina [ Um complexo verde com o α – naftol ( ] desenvolvem em meio alcalino ) que.0.0 3 3 1 Misturar e observar a cor. Procedimento experimental Amostra/Concentraçã Volume NaOH 2.mL 1. que desaparece após alguns minutos.0 1.5 mM Prolina 0.5 mM Aspartame 0.5 mM 1.0 3 3 1 2 Arginina 0. Após a adição da ninhidrina.Procedimento experimental Tubo 1 2 3 4 5 6 Amostra/Concentração Água Glicina 0.19%* Solução protéica Volume .0 1.5 mM 1.5 mM 1. 2. adoçante 200 vezes mais potente do que o açúcar. usando o tubo 1 como controle. Reações específicas de identificação de aminoácidos a.0 3 3 1 5 Solução Protéica 1. Tubos . Compare os resultados com o branco (tubo 1). em presença de hipoclorito de sódio (NaClO) passa a avermelhado.5 mM Leucina 0.5 α – Naftol NaClO . Anote os resultados e explique-os.0 1. Anote os resultados e explique-os.0 1. Dissolver o conteúdo de um envelope em 20 mL de água destilada.

com suas respectivas fórmulas estruturais. que escurece a reação: H H R S R C NH2 COOH + NaOH Na2S + R C NH2 Aminoácido com enxofre COOH Sulfeto de sódio Aminoácido sem enxofre PbS CH3COONa Acetado de sódio Na2S Sulfeto de sódio + (CH2COO)2Pb Acetado de chumbo + Sufeto de chumbo Cite os aminoácidos que contém enxofre.5 0. Procedimento experimental *** OBSERVAÇÃO: Para que se garanta a segurança.mL 2 2 2 2 2 HNO3 . em meio alcalino e. Procedimento experimental Tubos 1 2 3 4 Amostras Água Cisteína Glicina Solução Protéica Volume . Relacione os aminoácidos aromáticos e suas respectivas estruturas.mL 1 1 1 1 1 Anote os resultados e explique-os. c.b.5 0. O precipitado branco que se forma é devido à ação do HNO3 (ácido mineral forte). Tubos 1 2 3 4 5 Amostra/Concentração Água Glicina 0.5 mM Triptofano 0. à quente. formando o PbS.mL 2 2 2 2 NaOH 2 N 100º C mL 1 1 1 1 (CH3COO)2Pb mL 0. Reação para aminoácidos contendo enxofre Aminoácidos que contém enxofre. . os experimentos a seguir deverão ser efetuados na capela. Reação xantoprotéica Específica para aminoácidos que apresentam anel aromático.5 Anote os resultados obtidos e explique-os. e o desenvolvimento da cor amarela ocorre por formação de nitrocompostos (anel aromático + NO 2 ).5 0.5 mM Solução Protéica Volume .5 mM Tirosina 0. liberam o enxofre que aparece na forma de sulfeto de sódio (Na2S). Este reage com acetato de chumbo (CH3COO)2 Pb.

constante dielétrica do solvente e temperatura. Estas moléculas. que são macromoléculas de peso molecular definido. Nestes casos. em meio alcalino. de cor púrpura) . De ambos os lados do pH isoelétrico todas as moléculas terão carga efetiva positiva ou negativa. Neste pH as proteínas não apresentam carga efetiva (as cargas positivas são iguais às negativas) e portanto não atuam como forças eletrostáticas entre as outras moléculas presentes no meio. essa reação é positiva para todas as proteínas e peptídeos graças às suas ligações peptídicas. bem como as técnicas e reações de identificação das mesmas.(complexo de coordenação entre peptídeos e cobre II. dão coloração púrpura característica. depende pH. HN R CH O C HN Cu NH HC NH R C O Biureto . A natureza química dos radicais R (cadeias laterais) dos aminoácidos que compõe a estrutura primária das proteínas determina a sua estrutura secundária e/ou terciária. haverá menor tendência para agregação e precipitação. O comportamento físico-químico das proteínas está relacionado a vários fatores. força iônica do meio. III – REAÇÃO DO BIURETO 3.1 – Fundamento NH C O A reação do biureto ocorre com substâncias que contenham grupos e grupos nitrogenados. Sendo assim.CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS I – INTRODUÇÃO As proteínas. II – OBJETIVOS ESPECÍFICOS No final deste trabalho prático o aluno estará familiarizado com as propriedades físicoquímicas das proteínas. Em geral as proteínas são menos solúveis no ponto isoelétrico. quando tratadas com uma solução diluída de sulfato de cobre. devido à formação do complexo de coordenação entre o átomo de cobre e 4 átomos de nitrogênio.pelo fato das moléculas de proteínas se repelirem. A solubilidade por exemplo. são eletrólitos cujo comportamento se ajusta aos mesmos princípios físicos de eletrólitos de massa molecular menor.

5 0.3. • c) homogeneização de 50 g (5 colheres médias) de leite em pó com 100 mL de água.5 0. • d) homogeneização de 10 g de farinha de soja de semente de soja em 100 mL de água destilada.5 5 Extrato de Soja(d).5 (b) 3 Gema de ovo .5 2 Clara de ovo(a). 4.1. . e observar a coagulação. 2 mL 0.2 – Coagulação com ácidos minerais – Reação de Heller Fundamento Os ácidos minerais fortes desnaturam as proteínas.1.2 – Procedimento Montar uma bateria com: Tubos Amostra CuSO4 a 0. 2 mL 0. enquanto que no tubo contendo apenas água e os reagentes verificar-se-á uma cor azul escura característica do cobre em meio alcalino (formação de Cu (OH)2 e de óxidos de Cu). 2 mL 0.1 – Termocoagulação – Coagulação pelo calor As proteínas são termolábeis.5 • Soluções preparadas por: a) homogeneização de 1 clara de ovo com 50 mL de água.1 – Reações de Precipitação de Proteínas com Desnaturação 4. Procedimento • Colocar em tubos de ensaio soluções contendo proteínas (ovo. característica de reação positiva. de maneira demonstrativa.5 0. • Aquecer. IV – REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS 4.5 0. Esta reação é sensível a concentração da ordem 1:30. A reação de Heller (reação de proteínas com HNO3 concentrado) é freqüentemente utilizada para a pesquisa de albumina na urina e permite a dosagem semi-quantitativa. quando submetidas à ação do calor desnaturam irreversivelmente. 2 mL 0. insolúveis. pelo professor. transformando-as em metaproteínas. etc). Observar que em alguns tubos haverá formação de uma coloração violeta. soro. • b) homogeneização de 1 gema de ovo com 50 mL de água. Procedimento Experimental ***OBSERVAÇÃO: Para que se garanta a segurança.5% mL NaOH a 10% mL 1 Água.5 0. o experimento a seguir deverá ser efetuado na capela. 2 mL 0.000.5 (c) 4 Leite .

• Tubo Então Juntar: • 0. Uréia. 4. Observar no limite de separação das duas camadas um anel branco (proteína e meta-proteína). pelas paredes do tubo.3 – Precipitação com Sais de Metais Pesados Alguns sais de metais pesados precipitam as proteínas. Interprete os resultados observados.1.1.5 mL de H2SO4 10%. • 1 mL de etanol. • 1 mL de solução de Na2WO4 10% • Agitar. (CH2COO)2Pb (acetato de chumbo). Creatinina.4 – Precipitação com Solventes Orgânicos Colocar em tubo de ensaio: • 2 mL de solução protéica. etc.5 – Precipitação por reagentes alcalóides . 4. até observar a formação de precipitado. Por exemplo: Na2WO4 (tungstato de sódio). Notar que não ocorre precipitação. Esta reação é utilizada em análises clínicas para desproteinização de sangue (método de Follin – Wu). 2 mL de HNO3 concentrado. AgNO3 CuSO4. Notar a formação de um anel branco na separação das camadas. assim o exigem. sem misturar. Procedimento B Colocar em um tubo de ensaio: • 2 mL de solução protéica. por exemplo: HgCl 2. FeCl3. Procedimento A Solução Protéica CuSO4 0.5% FeCl3 1% (CH2COO)2 Pb mL 1% 1 2 2 2 *gotas 3 2 *gotas 4 2 *gotas * Adicionar gotas das soluções de metais pesados à solução protéica. Forma-se imediatamente um precipitado. 4. quando os métodos de dosagens de Glicose.Colocar um tubo de ensaio: • 2 mL de solução protéica • Juntar cuidadosamente e vagarosamente. Outros somente precipitam proteínas em meio ácidos.1.

Forma-se um precipitado amarelo.0g em 100 mL de H2O). portanto. agem pelo seu âniom e reagem com as proteínas formando sais (proteinados) insolúveis.. Explicar. cítrico. • Juntar: • 1 mL de NaOH 10%.). Esta reação só é possível se a proteína apresentar carga positiva. no lado ácido do seu pI.Os reagentes alcalóides (ácido pícrico.0g / ácido cítrico – 2. Observar a dissolução do precipitado. re-dissolve o precipitado formado. Reação de Esbach Procedimento Experimental Colocar em tubo de ensaio: • 2 mL de solução protéica. Quando adicionamos base.. • 1 mL do reativo de esbach (ácido pícrico – 1. tânico. etc. .

que se intensifica. fígado e rins.0 Água . em meio alcalino. a. Identificar experimentalmente as propriedades de termolabilidade e especificidade. Procedimento Experimental 1. Manipular reações catalisadas por enzimas com a finalidade de determinar semiquantitativamente a influência da concentração de enzima.mL 5. Atividade da Catalase Enzima presente em quase todas as células animais. oxidando assim a fenolftaleína. Em um tubo de ensaio colocar: • 10 gotas de sangue • 5 mL de água destilada – homogeneizar • 1 mL de H2O2 3% (10 volumes) – agitar b. hemácias. Procure uma explicação para o fato. que é convertido em H2O. Esquematize a reação ocorrida. 2. OBS. que oxida diidroxifenóis na presença de H2O2. nem pelo oxigênio molecular (O2). Note a formação de espuma abundante. AH2 + H2O2 Fenolftaleína reduzida → 2H2O + A+ Fenolftaleína oxidada .0 H2O2 3% gotas 3 3 b. Colocar em dois tubos de ensaio: Tubos 1 2 Reativo Kastle-Meyer 1. que transfere dois átomos de hidrogênio do substrato (AH 2) para H2O2.ENZIMAS I Objetivos Específicos • • • Ao final deste trabalho prático o estudante deverá saber: Manipular experimentalmente soluções de enzimas. Não sendo oxidada pelo peróxido de hidrogênio (H2O2). temperatura e do pH na atividade enzimática. formando a quinona correspondente. Atividade da Peroxidase A peroxidase é uma enzima encontrada em todas as plantas superiores. lentamente. sendo rara em tecidos animais. no tubo que contém sangue. O sangue contém peroxidase. As exceções são leucócitos.0 Sangue diluído mL 5.: O reativo de Kastle-Meuer é uma solução alcalina de fenolftaleína reduza (AH 2). Note o aparecimento imediato de cor rosa.0 1. que adquire coloração rósea. a.

Reação de Molich Os carboidratos e algumas substâncias. para aldoses. cetoses. que se transformam em furfural ou seus derivados na presença de H2SO4.1 M Frutose 0.1 M Volume mL 1. formando compostos de condensação. o estudante deverá saber: • • Executar testes qualitativos para reconhecimento de carboidratos Significado dos seguintes testes: Molisch.0 Alfa-naftol 5% em etanol gotas 3 3 3 3 . há reações gerais e outras para estruturas mais específicas.IDENTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATOS Introdução Os carboidratos podem ser identificados por meio de várias reações. mono e dissacarídeos redutores. Abaixo estão representadas as reações de formação de furfural e de hidroximetilfurfural.0 1. Barfoed. Assim.0 1. respectivamente a partir de uma pentose e de uma hexose. como aquelas. de cor violeta. etc. O O C5H10O5 + C H H2SO4 α-naftol O furfural HOH2C C6H12O6 + Composto violeta O C H H2SO4 α-naftol Composto violeta hidroximetilfurfural Procedimento experimental Preparar os seguintes 8 tubos de reação: Tubos 1 2 3 4 Amostra Água Glicose 0. Seliwanoff e Benedict. e de estrutura incerta. 1.0 1.1 M Sacarose 0. Objetivos Específicos No final deste trabalho prático. Algumas dessas reações envolvem a formação de complexos corados. e a especificidade da identificação depende da estrutura dos carboidratos. reagem com alta naftol.

2. usando o tubo 1 (branco.1% Maltose 0.1 M Volume mL 1 1 Seliwanoff (Resorcinol 0. porque na presença de HCl.(aq) + carboidrato oxidado 3.0 3 3 3 3 Pela parede do tubo inclinado. reagem com os fenóis (timol. portanto. O teste de Molisch serve para identificar carboidratos.5 1. A reação que ocorre é a seguinte: Aquecimento Cetose + HCl O C O H resorcinol Composto violeta furfural Procedimento experimental Preparar 5 tubos de ensaio: Tubos 1 2 Amostra Água Frutose 0. Anotar os resultados. pela ação desidratante do ácido sulfúrico. Oreativo de Barfoed oxida os monossacarídeos ( a mono-ácidos ) mais rapidamente que os dissacarídeos permitindo. sem agitar.3 – bezenodiol). nas condições do teste. transformam-se em furfural no caso de pentoses. formam derivados de furfural que se condensam com o reagente de Seliwanoff.(aq) + carboidrato → Cu2O (prec. as cetoses. Reação de Barfoed Através desta reação se distingue um mono de um dissacarídeo. mais rapidamente do que as aldoses. dando origem a um composto de cor roxa. deve ser desprezada. 2 mL de h2SO4 concentrado (CUIDADO CORROSIVO!!!). A reação exige aquecimento em banho fervente. a partir da reação entre acetato cúprico e o carboidrato.1% Aspartame 0.0 1. que contém resorcinol (1.5 6 7 8 Amido 0. ocorre a sua transformação em frutose. natol).) + CH3COO. Reação de Seliwanoff Na presença de HCl. Cu+2 (aq) + CH3COO. Para o bom êxito desta reação é necessário que o tubo esteja seco.2%” (*) Ciclamato/sacarina 1. é hidrolisada em glicose e frutose. ( *) Aspartame = L – aspartil-L –fenilalanina – metil – éster. pela velocidade com que se forma Cu2O. ou hidroximetilfurfural no caso de hexose. Mesmo a glicose pode dar reação positiva.05 % em HCl 2 N) 1. e que haja a menor agitação possível. e é positiva também para sacarose que.0 1.0 1. Estes. Estes. A concentração do HCl na reação não deve ultrapassar 12 % (aproximadamente 4 N). a diferenciação entre ambos ( mon e dissacarídeos ). se o aquecimento for prolongado. adicionar lentamente. produzindo compostos avermelhados. A coloração verde que às vezes se forma. controle) como referência.5 . por sua vez.

o teste de substâncias redutoras. Anotar os resultados obtidos. o Cu (OH)2 é reduzido a Cu2O. Os testes de carboidratos redutores são positivos para compostos com grupamento – OH glicosídico livre. sob aquecimento. Até alguns anos atrás. colocar em banho de água fervente. Este complexo se dissocia em grau suficiente para que haja. mercúrio. lembrando-se sempre de usar o tubo 1 (controle) como referência. e acompanhar o desenvolvimento da cor a cada 2 ou 3 minutos.1 M Sacarose 0. cobre. ferro. Mas se compostos redutores forem acrescentados à suspensão. Colocando-se hidróxido de cobre II. agitando o tubo. íons metálicos disponíveis para se reduzirem. a não ser após a sua hidrólise. emprega-se CuSO4 à 2%. Reação de Benedict Utilizada para identificação de carboidratos redutores. reage com os íons metálicos. são reduzidos por grupos aldeídos ou cetônicos livres de vários carboidratos. que se precipita e cuja cor se situa entre o amarelo e o vermelho. Atualmente. no caso de reagente de Benedict (qualitativo).5 1. prata. forma-se uma suspensão que. etc. nomeio da reação. Ausência de composto redutor: Meio alcalino Cu(OH)2 (azul) Aquecimento CuO + (preto) H2O Presença de composto redutor: Meio Alcalino Cu (OH)2 (azul) Aquecimento Cu2O + (amarelo/vermelho) H2O Como não é prático utilizar uma suspensão de Cu2+. de cor azul. ou suspeito de sê-lo. Íons de metais como. dissolvidos em Na2CO3 2 M. em meio alcalino e a quente. No caso do reagente de Felihling. Assim. em meio alcalino adequado. de modo rotineiro. e a reação é tanto mais positiva quanto maior a extensão da hidrólise.1 M 1 1 1 1. se precipita como óxido de cobre II. e também para evitar que o CuO (preto) mascare o resultado da reação. retirar o tubo do banho. dissolvido em NaOH 2 M. Cu (OH)2. baseadas em ensaio .1 M Pentose 0. mas negativos para polímeros de cadeias longas.5 Após misturar o conteúdo dos tubos. As reações abaixo mostram o que ocorre o Cu (OH)2 na presença e na ausência de agentes redutores. era empregado no diagnóstico de pacientes diabéticos. amido não dá reação positiva. Para dissolver o precipitado eventualmente formado. CuO de cor preta. 4. sobretudo na urina. formando um complexo iônico solúvel. acrescente algumas gotas de etanol absoluto. há testes mais sensíveis para dosagem rápida de glicose. em meio alcalino. Quando notar o aparecimento da cor vermelha acompanhada ou não de precipitado de cor marrom avermelhado. até no máximo 15 minutos. solubilizado por tartarato de Na + e de K+ 10%. emprega-se CuSO 4 2% solubilizado por citrato de Na+ 20%. acrescenta-se ao meio da reação um composto orgânico solubilizador que.5 1.3 4 5 Glicose 0.

0 1.1% 6 Maltose 0.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1. + a ++++). comparando com o tubo 1 (controle).0 1.0 Resultado Aquecer todos os tubos em banho de água fervente .0 1. durante 5 minutos.0 1. Procedimento experimental Identificação de substâncias redutores com reagentes de Benedict (qualitativo) Preparar 9 tubos de ensaio: ´Tubo Amostra 1 Água 2 Glicose 0.1 M 3 Frutose 0.0 Reagente de Benedict 1. por não exigirem a disponibilidade dos reagentes mencionados.0 1. numa escala de 1 a 4 cruzes. Anotar os resultados obtidos (se positivo.1 M 4 Sacarose 0.2% 8 Ciclamato/Sacarina 9 Urina humana Volume mL 1.0 1. .0 1.1 M 7 Aspartame 0.0 1. Explique os resultados.enzimático (glicofita/glicose-oxidase) e que são muitos mais práticos.0 1.0 1.1 M 5 Amido 0.

Espremer a gaze 4. de composição incerta. 3.4) não reage com iodo. 8. Filtrar em gaze. Esse complexo se desfaz sob aquecimento. Descartar. mas é refeito quando é resfriado. cuidadosamente.6). A celulose. 4. B.IDENTIFICAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS Objetivos Específicos No final deste trabalho prático o estudante deverá saber: 1. Preparação da solução de amido 1. enquanto na cadeia ramificada ocorrem ligações α(1. Colocar aproximadamente 25 mL de (amido) completo para 50 mL (água quente) . Extrair grãos de amido de batata Preparar soluções de amido Reconhecer a presença de amido pelo teste de iodo – Lugol Realizar a hidrólise química do amido Determinar a progressão de hidrólise pelos testes de iodo e Benedict Reconhecer os produtos de hidrólise parcial e total de amido Extrair e caracterizar o glicogênio hepático significado das reações e operações realizadas I. filtrando em gaze e recolhendo o filtrado no béquer de 500 mL 5. com uma lâmina de vidro. Extração e identificação do amido O amido não pode ser detectado pelos testes de redução. Na presença de iodo. Deixar o amido se depositar no béquer aproximadamente 20 minutos 6. Procedimento experimental A. 2. A cadeia linear (amilose) é solúvel e a cadeia ramificada (amilopectina). transferindo as raspas para um béquer de 250 mL 2. também um polímero de glicose. Adicionar aproximadamente 50 mL de água destilada e agitar com bastão de vidro 3. o amido forma um complexo de cor azulada. 6.4). à semelhanç do amido. para determinação da atividade redutora. recolhendo o filtrado em um béquer de 500 mL. Também. O amido da batata é constituído por 98% de amilose e 2% de amilopectina. porque dispõe de um número muito reduzido de resíduos de glicose livre. à semelhança do amido. o glicogênio é formado por ligações de tipo α (1. a cadeia linear é constituída por resíduos de glicose ligados entre si por ligações α (1. Na estrutura do amido. perdendo a cor azul. insolúvel. o líquido sobrenadante. mas constituído de ligações β (1. reage formando um complexo de cor avermelhada. Extração do amido 1. Extrair novamente o amido da raspa com 50 mL de água.6). 7. enquanto o glicogênio. 5. Raspar integralmente uma batata.4) e α (1.4) e α(1.

Hidrolise ácida do amido A estrutura polimérica do amido pode ser desfeita por hidrólise das suas ligações glicosídicas. Anotar os resultados. Repetir o processo em intervalos de 5 a 5 minutos.5 mL para outro tubo de ensaio. observar a coloração. Observar novamente.0 Lugol (iodo 5% em KI 10%) gotas 2 2 2 2 2 2 Resultado Aquecer em banho de água fervente. sob constante agitação 4. os tubos que dissolveram cor com Lugol. 1 mL da solução e transferir 0.6 3. à quente. Quimicamente. e no outro adicionar 1 mL do reativo de Benedict e aquecer em banho maria fervente. Adicionar aproximadamente 50 mL de água destilada fria ao deposito de amido. logo que adiciona o HCl. aquecer em banho maria fervente por 30 minutos. D.0 1. fervente 5.0 1.0 1. Procedimento experimental: Transferir 25 mL de amido para um elenmyer e adicionar 1 mL de HCl concentrado. de cadeias de glicose de tamanhos variáveis.1% Celulose Glicose 0. e no final do processo obtém-se uma mistura de glicose e maltose. Adicionar esta última suspensão à água em ebulição. observar a coloração. obtido em A. durante 1 a 2 minutos. Resfriar. Durante a hidrólise do amido são formados compostos intermediários.1 M Sacarose 0. lentamente. usando sempre o tubo 1 (controle) como referência. Fisiologicamente. Continuar o aquecimento até que se forme uma solução opalescente em banho-maria. o amido é hidrolisado enzimaticamente pela amilase salivar e pela amilase pancreática. Observar. Sendo que deve retirar.1 M Quantidades mL 1. Adicionar em um dos tubos 3 gotas de lugol. Utilizar esta solução para as experiências subsequentes C.2. Detecção do amido – reação com Lugol Tubos 1 2 3 4 5 6 Amostras Água Amido obtido em B Maltose 0. Amido amido solúvel + maltose Eritrodextrina + maltose Acrodextrina + maltose . obtém-se resultado semelhante empregando-se HCl concentrado.0 1.0 1.5 mL para um tubo e 0.

Etanol 6º.Acetona Agitar vigorosamente e verificar: a) b) c) d) Insolubilidade no 1º e 2º tubos Emulsão estável nº 3 e 4 Solubilidade parcial no tubo nº 5 que se torna total pelo aquecimento Solubilidade total no demais tubos. para um béquer • Lavar o resíduo com 10 mL de álcool por duas vezes • Evaporar o filtrado em banho de areia. com agitação constante até diminuição total do álcool • Observar o resíduo amarelo e oleoso. .Na2CO3 a 2% 4º.NaOH a 10% 5º.M altose Glicose EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LIPÍDEOS I. Extração • Em copo de 100 mL pesar 10 g de soja moída e seca • Adicionar 25 mL de álcool • Agitar por 5 minutos • Filtrar através de papel de filtro.Éter Sulfúrico 7º. Juntar mais 20 gotas de óleo nos tubos contendo: • Éter • Clorofórmio • Benzeno • Acetona Observar a grande solubilidade do óleo nesses solventes. colocar 3 gotas de óleo vegetal em cada um e adicionar 3 mL de: 1º. Extração de lipídeos de semente se soja Procedimento experimental a.Benzeno 9º. Solubilidade Em uma bateria de 9 tubos de ensaio numerados. Esse óleo será utilizado como material para as provas seguintes.Água 2º. b.Clorofórmio 8º. Caracterização 1.HCl a 4% 3º.

durante 10 minutos. urina.000 mL. líquor e outras. Adicionar 1 g de ácido benzóico e diluir com água destilada até completar 1. em 630 nm. por 24 meses. a ortotoluidina é a mais utilizada. No início. Esfriar em água corrente por 2 a 3 minutos e ler as absorvâncias. plasma. Misturar até completa dissolução e guardar em frasco escuro. em geladeira. Destas substâncias. Como exemplo. 1 g de glicose e dissolver em 800 mL de água destilada. em banho fervente. colocar 1 g de tiouréia. Tomar 3 tubos. . estes métodos sofrem interferências de outros agentes redutores. Posteriormente. produzindo uma mistura. os métodos enzimáticos foram surgindo e colocados em prática. REATIVOS A – Reativo cromogênico Num frasco de 2. Naturalmente.5 mL Misturar e colocar os tubos. foram desenvolvidos. A temperatura ambiente. a quente e em presença de ácido acético glacial. em equilíbrio.05 mL Padrão 0. uma glicosilamina e a correspondente base de Schiff. A intensidade da cor é medida. presentes na amostra.05 mL Reativo cromogênico 2. acrescentar 940 mL de ácido acético glacial e 60 mL de ortotoluidina.5 mL 2. é estável por 12 meses e. aonde a glicose reage diretamente com certas substâncias orgânicas. Estável por um ano. quando conservada em geladeira. podemos citar o método de glicose-oxidase e o método da hexoquinase. em meio alcalino. fotometricamente. B – Solução padrão de glicose Pesar. 1 – MÉTODO DA ORTOTOLUIDINA A glicose reage especificamente com a ortotoluidina.000 mL.5 mL 2. várias técnicas neste sentido foram desenvolvidas.05mL Soro 0. Outros métodos. Procedimento a. o que determina a falta de especificidade para a análise em questão. ambos. exatamente. e proceder como a seguir: Branco Amostra Padrão Água destilada 0. AMOSTRA Soro. era utilizado o seu poder redutor. O soro deve ser colhido em jejum e livre de hemólise. Os oxidantes mais empregados foram os íons cobre e os íons ferricianeto.I – DOSAGEM DE GLICOSE Vários métodos foram propostos para a determinação de glicose.

A reação segue a lei de Beer até 1. A lactose e a galactose. manose também. multiplicando o resultado final pelo fator de diluição. diluir a solução final com reativo de cor. em água muita fria. até 1. b. Quando os valores forem maiores que 300 mg/dl.2 g/dl. podem reagir com a ortotoluidina. VALORES DE REFERÊNCIA Soro e plasma – 70 a 110 mg/dL Sangue total – 60 a 100 mg/dL Líquor – 40 a 70 mg/dL Urina – até 30 mg/dL ou até 0. A adição de tiouréia como antioxidante confere ao reativo uma cor ligeiramente amarelada. É importante o uso de ortotoluidina. Somente os métodos do ortotoluidina e da hexoquinase fornecem resultados exatos para a glicose urinária.25 g/24 horas.500 mg/dl.015 e. A absorbância desta solução frente a um branco de ácido acético não deve ser superior a 0. O resfriamento. c. a mais incolor possível. efetuar novamente as leituras e calcular.CÁLCULO Glicose (mg/dL) + Absorvância da amostra / Absorvância do padrão x 100 NOTAS a. A hemoglobina até 350 mg/dl e a bilirrubina até 20 mg/dl não interferem no método sem desproteinização. Quantidades maiores dão erros positivos. É recomendaável não desproteinizar com ácido perclórico. g. f. presentes em casos de gravidez e durante a lactação ou em casos raros de galactosemia infantil. d.500 mg/dl. pode provocar turvação. A urina e o líquor podem seguir a metodologia direta para o soro ou plasma. em concentrações inferiores a 0. .

Tampão fosfato – pH 7. As amostras de sangue não contendo um antiglicolítico. sob ação catalisadora da peroxidase. líquor e líquidos ascíticos. bem vedado. entre 2 – 8 ºC. As reduções podem também ser significativas nos indivíduos submetidos a jejum prolongado ou em obesos tratados com dieta com baixo valor calórico.2 – GLICOSE ENZIMÁTICA Finalidade Sistema enzimático para a determinação de Glicose no sangue. AMOSTRA A amostra de sangue deve ser obtida após jejum de no mínimo 8 horas ou de acordo com recomendação médica. Somente para uso diagnóstico in vitro. devem ser centrifugadas imediatamente após a colheita e o plasma Antipirilquinonimina + 4H2O . para evitar evaporação.4 Padrão – 100 mg/dl – Estável entre 15 – 25 ºC. Realizar a colheita do sangue utilizando um anticoagulante contendo um inibidor da glicólise. Usar plasma ou soro tomando as precauções a seguir. pleural e senovial em método cinético. ocorre significativa redução na glicemia. Princípio A glicose oxidase catalisa a oxidação da Glicose de acordo com a seguinte reação: GOD Glicose + O2 + H2O Ácido Glucônico + H2O2 H2O2 formado reage com 4-aminoantipirina e fenol. Após o manuseio armazenar. através de uma reação oxidativa formando um antipirilquinonimina vermelha cuja intensidade de cor é proporcional à concentração da glicose na amostra. POD 2H2O2 + 4 – Aminoantipirina + fenol REAGENTES Enzimas – conservar entre 2 – 8 ºC Tampão – Conservar entre 2 – 8 ºC. Nas 24 horas que sucedem à ingestão aguda de álcool. INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS Ácido ascórbico em concentrações acima de 100 mg/L interferem na reação diminuindo os resultados.

síndrome auto-imune (formação espontânea de anticorpos para receptores da insulina). A redução da concentração de glicose nos líquidos corporais encontra-se relacionada a processos inflamatórios ou infecciosos. Causas mais comuns de hipoglicemia do jejum: hiperinsulinismo. Hemoglobina até 160 mg/dL e Triglicérides até 750 mg/dL não produzem interferências significativas.0 mL Misturar vigorosamente e colocar em banho-maria a 37 ºC durante 15 minutos. Nas amostras com antiglicolítico. O mesmo procedimento deve ser realizado na colheita de líquor e líquidos ascítico. insuficiência supra-renal e/ou hipofisária. doença hepática grave e alcoolismo.0 mL Teste 0. INTERFERÊNCIAS Bilirrubina até 16 mg/dL. Quando a ocorrência de sintomas de hipoglicemia é relacionada à alimentação. A hipoglicemia pós-prandial é classificada em hipoglicemia alimentar.ou soro. No plasma. Diluir a amostra com NaCl mol/L (0. A concentração de glicose no líquor representa um dos parâmetros para a distinção entre meningite bacteriana e virótica.85%). PROCEDIMENTO Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir: Amostra Padrão Reagente de cor Branco 2. etc). quando não ocorre contaminação bacteriana. duas formas de hipoglicemia podem ser definidas: hipoglicemia do jejum e pós-prandial. pleural e senovial. tumores extrapancreáticos. SIGNIFICADO CLÍNICO Valores elevados ocorrem nos vários tipos de diabetes primárias.0 mL Padrão 0. Determinar as absorvâncias do teste e padrão em 505 nm. nos estados de intolerância à glicose e nas diabetes secundárias a várias doenças (hipertiroidismo. a concentração da glicose permanece estável por até 24 horas. hiperpituitarismo. CÁLCULOS Glicose (mg/dL) = Absorvância do teste x 100 / Absorvância do padrão LINEARIDADE A reação é linear até 400 mg/dl. separados das células ou coágulo. soro e outros líquidos separados das células. hipoglicemia do diabético tipo II e do paciente com intolerância à glicose. .02 mL 2. a glicose permanece estável por 3 dias entre 2 – 8 ºC.02 mL 2. dosar novamente e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição. hipoadrenocorticismo. VALORES DE REFERÊNCIA Plasma: 70 a 110 mg/dL Líquor: 2/3 da glicemia – em amostras colhidas simultaneamente. Valores diminuídos ocorrem nas hipoglicemias que podem ser devidas a várias causas. A cor é estável por 60 minutos.

esterase colesterol livres mais ácidos graxos colesterona + H2O2 3.antipirilquinonimina + 4 H2O Amostra Soro ou plasma isentos de hemólise (anticoagulante . COLESTEROL Principio O colesterol no soro é quantificado através das seguintes reações enzimáticas: 1.O uso de anticoagulantes como: citrato.heparina).0 mL 2. Jejum de 12 a 16 h.x 200 absorvancia do padrao . provocam resultados ligeiramente diminuídos. Amostra quando refrigerada de 2 a 8ºC se conserva por 7 dias. Procedimento Identificar três tubos com B (branco). 2 H2O2 + 4 aminoantipirina + p-hidroxibenzoato peroxidase 4 . em ambos os sexos. esterase col. ésteres de colesterol 2. se mantida a 10ºC conserva-se por 3 meses. os níveis de colesterol situam-se na faixa de 150 – 240 mg/dL. na população brasileira.0 mL Solução padrão Amostra 20 µL P 2. que interferem nos métodos utilizando a reação GOD-POD levando a resultados falsamente diminuídos. absorvancia do teste ---------------------------. EDTA e Oxalato. retirar do banho Maria e efetuar as leituras das absorvancias de P e T em espectrofotômetro em 510 nm zerando o aparelho com o branco. principalmente o ácido úrico. T (teste) e P (padrao) B T Reagente de cor 2. colesterol livre + O2 col.OBSERVAÇÕES • • • A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados corretos A água utilizada na limpeza do material deve ser de boa qualidade A urina contém numerosas substâncias.0 mL 20 µL - Misturar por agitação e incubar por 10 minutos em banho Maria a 37ºC. Calculo Colesterol (mg/dL) = Valores de referencia Em termos estatísticos.

O nível da água do banho deve ser superior ao nível dos reagentes nos tubos de ensaio.fosfato + ADP Glicerol + ATP Glicerol . O analito e estável por 2 .01 mL 1. levando a obtenção de resultados falsamente elevados.8ºC.0 mL 1. O armazenamento prolongado da amostra não e recomendado porque varias substancias podem ser hidrolisadas liberando glicerol.x 200 absorvancia do padrao Valores de referencia Desejável Limiar alto Triglicérides < 200 200 – 400 .01 mL Padrão Reagente de cor 1.fosfato + O2 glicerol-3-fosfato dihidroxiacetona + H2O2 oxidase 2 H2O2 + 4 aminoantipirina + ESPAS peroxidase quinoneimina + 4 H2O Amostra A amostra deve ser obtida após jejum de 12 a 14 h.0 mL Padrão 0. Soro. Efetuar as leituras das absorvancias do padrão e do teste em espectrofotômetro em 540 nm.Desejável Risco moderado Alto risco (DCI) Colesterol (mg/dL) < 200 200 – 239 > 240 TRIGLICERIDES Principio Os triglicérides são determinados de acordo com as seguintes reações: Triglicéride lípase da lipoproteína glicerolquinase Mg+2 glicerol + acido graxo glicerol .3 .3 . Calculo Triglicérides (mg/dL) = absorvancia do teste ---------------------------.0 mL Misturar e incubar por 10 minutos em banho Maria a 37ºC. Procedimento Tomar três tubos de ensaio e proceder como a seguir Branco Teste Amostra 0.

a bilirrubina interfere nos níveis maiores de 50 mg/L Procedimento Em um tubo de Kahn. Centrifugar 15 minutos a 3000 rpm. no sobrenadante fica o resto de lipoproteínas (HDL e VDL). Após centrifugar. obtém se o colesterol ligado as LDL.Elevado Muito elevado 400 – 1000 > 1000 LDL . o colesterol ligado às mesmas determina-se utilizando o sistema enzimático Colesterol oxidase/peroxidase com colorimetria segundo Trinder (Fenol/4-AF). colocar: B P D Sobrenadante 100 µL Padrão 20 µL Reagente de 2 mL 2 mL 2 mL trabalho Misturar e incubar 5 minutos a 37ºC quando seja utilizado o reagente de trabalho de Colestat enzimático AA/liquida ou 15 minutos a 37ºC quando seja utilizado aquele de Colestat enzimático. pecipitando-as seletivamente pela adição de polímeros de alto peso molecular. Separar rapidamente o sobrenadante. Ler em espectofotometro a 505 nm. Amostra Soro a) Coleta: o paciente deve estar em jejum (de 12 a 16 h) b) Aditivos: não são necessários c) Substâncias interferentes conhecidas: os soros hipertrigliceridemicos (com quilomicrons) produzem sobrenadantes turvos. Em três tubos de fotocolorimetros marcados B (branco). Utilizar o sobrenadante como amostra para o ensaio colorimetrico.COLESTEROL Fundamento As lipoproteínas de baixa densidade (LDL ou β-lipoproteínas) separam do soro. . colocar: Amostra 200 µL Reagente precipitante 100 µL Homogeneizar agitando (sem inverter) durante 20 segundos e deixar 15 minutos no banho Maria a 20-25ºC. P (padrão) e D (desconhecido). Pela diferença obtida entre o colesterol total e o determinado no sobrenadante. Vide limitações do procedimento. Tirar do banho Maria e esfriar.

624 P (*) valor obtido com Colestat enzimático ou Colestat enzimático AA liquida. Valores esperados Risco baixo ou nenhum (pessoas normais): menores de 140 mg/dL Risco moderado (pessoas com probabilidade de contrair ECC): entre 140 e 190 mg/dL Risco elevado (pessoas suspeitas de ter ECC): acima de 190 mg/dL .Calculo do resultado LDL colesterol (g/l) = colesterol total (*) – (D x f) f = 0.

0 mL 2.159 45 .65 35 – 55 Alto risco > 160 < 45 < 35 . o paciente deve estar em jejum obrigatório de 12 h. Procedimento Identificar três tubos com B (branco). LDL(mg/dl) Col. permanece estável por 15 dias se mantido a . são precipitadas seletivamente por polietilenoglicol tamponado. T (teste) e P (padrao) B T Reagente de cor 2. resta apenas a fração de alta densidade HDL. zerando o aparelho com o branco. HDL masc (mg/dl) desejável < 130 > 65 > 55 risco moderado 130 .0 mL Solução padrão Sobrenadante 50 µL P 2. Amostra Soro.HDL COLESTEROL Principio Lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e muita baixa densidade (VLDL).0 mL 50 µL - Misturar por agitação e incubar por 10 minutos em banho Maria a 37ºC. Calculo Absorvancia do teste Colesterol HDL (mg/dL) = ---------------------------. Estável por 4 dias. o sobrenadante.20ºC. O teor de colesterol da fração HDL e determinado pelo sistema enzimático colesterol 250 Dolis/colesterol enzimático liquido Dolis. HDL fem (mg/dl) Col.x 50 x 2 Absorvancia do padrao Valores de referencia Col. retirar do banho Maria e efetuar as leituras das absorvancias de P e T em espectrofotômetro em 510 nm. No sobrenadante. Após a precipitação. sob refrigeração de 2-8ºC.

02 mL 1. úrina e líquidos (aminiotico e sinovial).5 a 7.ÁCIDO ÚRICO Principio O ácido úrico e determinado de acordo com as seguintes reacões: Ácido úrico + O2 + H2O uricase alantoina + CO2 +H2O2 peroxidase antipirilquinonimina + 4 H2O 2 H2O2 + DHBS + 4 – aminoantipirina Amostra Usar soro. O nível da água do banho deve ser superior ao nível dos reagentes nos tubos de ensaio.0 mL 1.x 6 absorvancia do padrao Valores de referencia Soro: homens Soro: mulheres Urina Acido úrico (mg/dl) 2.5 a 6. O analto e estável por 3 dias entre 2 – 8ºC e por 6 meses a –10ºC.0 mL Misturar e incubar por 10 minutos em banho Maria a 37ºC.0 250 a 750 por 24 h . Procedimento Tomar três tubos de ensaio e proceder como a seguir : Branco Teste Amostra 0.0 1.0 mL Padrão 0. Efetuar as leituras das absorvancias de padrão e do teste em espectrofotômetro em 520 nm.02 mL Padrão Reagente de trabalho 1. Calculo Ácido úrico (mg/dL) = absorvancia do teste ---------------------------.

O analito e estável por 8 dias entre 2-8ºC. Amostra Soro ou plasma (heparinizados). onde: Cp = concentração do padrão Ct = concentração do teste Ap = absorbância do padrão At = absorbância do teste Valores de referencia Soro Plasma Proteínas totais 6.0 a 8. cuja absorbância medida em 545 nm e diretamente proporcional a concentração de proteína na amostra.0 g/dL 6. Procedimento Pipetar em tubos de ensaio identificados: Tubos Branco Água destilada 20 µL Amostra Padrão Biureto 1000 µL Teste 20 µL 1000 µL Padrão 20 µL 1000 µL Agitar bem e deixar os tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente.PP Fundamento As ligações peptídicas das proteínas (-HN-CO-) reagem com íons cúpricos em meio alcalino (reagente do biureto). Fc = Cp ------Ap Ct = Fc x At. zerando o aparelho com o branco em 545 nm.PROTEINAS TOTAIS .8 a 8. Calculo O calculo pode ser efetuado através do Fator de Calibração. formando um complexo de coloração violeta. Ler absorbância do padrão e do teste.3 g/dL .

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