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TRABALHO PRTICO n 4 Cristalizao da lisozima

Objectivos

1. Compreender o processo de cristalizao de protenas pelo mtodo de difuso de vapor. 2. Obter cristais de lisozima 3. Verificar a influncia das diferentes condies de cristalizao na dimenso e qualidade dos cristais obtidos

Fundamento terico A Vida apresenta um dos enredos qumicos mais complexos na Natureza e neste cenrio as protenas desempenham o papel principal. O estudo estrutural de protenas forneceu a base para comearmos a entender a vida em termos moleculares. Desde a resoluo da primeira estrutura de protena em 1959 at os dias de hoje, quase trinta mil estruturas de macromolculas biolgicas tiveram sua estrutura tridimensional determinada e as coordenadas atmicas esto depositadas no banco de dados de estruturas (Protein Data Bank)( www.rcsb.org/pdb/). Um grande desenvolvimento nos mtodos de resoluo de estruturas tem permitido que o tempo de resoluo de estruturas fosse reduzido de anos para meses e em alguns casos dias e at mesmo horas. A principal tcnica para resoluo da estrutura tridimensional de macromolculas biolgicas como um todo tem sido a cristalografia por difraco de raios X, e at hoje a tcnica principal para investigao da estrutura tridimensional de macromolculas biolgicas (Blundell and Johnson, 1976; Drenth, 1994). Os principais passos na resoluo de estruturas por cristalografia de difraco de raios X esto descritos na figura 1.

Uma das partes mais crticas na resoluo da estrutura de uma macromolcula biolgica a cristalizao da mesma.

Figura 1 Determinao da estrutura tridimensional de uma protena por cristalografia de raiosX. (1) Cristalizao; (2) Recolha de dados de difraco de raios-X (3) Clculo dos mapas de densidade electrnica ; (4) Obteno das coordenadas de todos os tomos da protena e sua representao grfica.

Entre os principais passos da resoluo da estrutura tridimensional das protenas descreveremos a cristalizao. O principal objectivo da cristalizao de uma macromolcula biolgica, tal como protena, cidos nucleicos ou vrus, o estudo estrutural destas macromolculas, por mtodos de difraco de raios X. Tal estudo estrutural fundamental para a compreenso molecular de vrios mecanismos biolgicos.

Os trs passos clssicos da cristalizao so: nucleao, crescimento do cristal, cessao do crescimento. O que faz com que o processo de cristalizao de macromolculas biolgicas seja diferente que o mesmo envolve um nmero de parmetros, muito maior do que aquele envolvido no crescimento de cristais de pequenas molculas, e as propriedades fsico-qumicas peculiares destes compostos. Por exemplo, a estabilidade ptima das macromolculas biolgicas em meio aquoso est restrita a uma faixa estreita de pH. Mas a principal diferena entre crescimento de cristais de pequenas molculas e cristais de macromolculas biolgicas a flexibilidade conformacional e a versatilidade qumica destas macromolculas e, consequentemente, sua maior sensibilidade s condies externas. Para uma seleco racional das condies de cristalizao necessrio o controle dos parmetros fsicos e biolgicos.

Tcnicas de cristalizao
Difuso de vapor

Mtodo da gota suspensa

Mtodo da gota assente

A- Preparao de cristais de lisozima pela tcnica de difuso de vapor em gota suspensa e gota assente. Gota suspensa / difuso de vapor Gota assente / difuso de vapor Microbatch Microdilise Contra-difuso

Hanging drop

Sitting drop

Material: Caixas para cristalizao Folhas de ensaio Pipetas P1000, P200, P2 (pontas) Seringa com silicone Lamelas de vidro Reagentes: Soluo de NaCl a 10% Tampo acetato a 0.1 M a vrios pH: pH =4.0-4.7 Protena: 50mg/ml de lisozima em tampo acetato pH=4.5 Soluo precipitante: prepare as solues precipitantes de acordo com o exemplo da tabela. Escreva a concentrao final de NaCl que vai preparar. Pipete os valores indicados na tabela.

final % NaCl 2% NaCl 4% NaCl 6% NaCl 8% NaCl

10% NaCl 200 l 400 l 600 l 800 l

0.1M Acetato 800 l 600 l 400 l 200 l

Volume final = 1000 l

1. Preparao de cristais de lisozima com recurso tcnica de gota suspensa Identifique a caixa que vai utilizar. Com uma caneta de acetato indelvel escreva, na caixa, o nmero do ensaio, o nome e a concentrao da protena bem como a data em que realiza as cristalizaes. Pode ainda escrever qualquer informao que lha parea relevante. Preencha a folha de ensaio que companha as suas experincias, nessa folha ir registar a evoluo da sua experincia ao logo do tempo.

1- Com a ajuda duma seringa coloque silicone em redor dos poos que vai utilizar.

2-Pipete 1000 l de soluo precipitante para o reservatrio do poo.

3-Pipete 2 l de lisozima para uma lamela de vidro, retire do reservatrio do poo 2 l de soluo precipitante e misture com a protena na lamela. Ateno, tenha cuidado para no 4-Inverta a lamela e coloque-a sobre o poo. Faa alguma presso de modo a selar o poo (Cuidado, se fizer muita presso a lamela poder partir-se). introduzir bolhas de ar na gota.

Identifique a caixa que vai utlilizar e preencha a folha de ensaio onde ir registar os resultados desta nova experincia.

Nota- Nas figuras, a soluo de cor vermelha apenas por uma questo de melhor visualizao

detector

Incident beam

Diffracted beam

Resoluo mxima: Lei de Bragg n =2 d sin => dmin= /(2 sinmax) ( Cu K = 1.5418 dmin = 0.77 )