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A

H1 H2 H3 H4 H5 MM C- t1 t2

t3

240306

Extracciones de ADN realizadas mediante protocolo a base de Cloruro de Litio. Carriles A-J, ADN de muestras de piel, Sara. Carriles H1-H5, ADN de muestras de piel, Hctor. MM- marcador de peso molecular 1000 bp. t1-t3 Productos PCR, 800 bp.

Protocolo de extraccin de ADN utilizando cloruro de litio (LiCl) (Modificado de Axayacatl Rocha por Julia Azanza)

1. Cortar ~50 mg de tejido con una navaja tan finamente como sea posible. Si se usa sangre en buffer de lisis, tomar 200 ul de sangre. Si la sangre est congelada es mas sencillo tomar este volumen raspando el material congelado y transferirlo a un tubo vaco para medir el volumen aproximado contra las marcas al lado del tubo. 2. Colocar el tejido en un tubo Eppendorf de 1.5 ml y agregar 350 l de buffer de extraccin (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1% SDS, %0 mM EDTA, pH 8.0). Asegurarse de que no queda nada de tejido adherido alrededor de la boca del tubo. Si es sangre, aforar a 400 ul con buffer de extraccin (o sea, aadir 200 ul del buffer) 3. Agregar 20 l de proteinasa K (20 mg/ ml) y agitar brevemente.

4. Colocar en bao mara o en rotador en incubadora a 55 C toda la noche o hasta que el tejido est suficientemente digerido. 5. Agregar 300 l de LiCl 5M y agitar a temperatura ambiental por un minuto. 6. Agregar 600 l de cloroformo: alcohol isoamlico (24:1) y agitar brevemente. 7. Mezclar en el rotador a temperatura ambiente durante 30 minutos aproximadamente. 8. Centrifugar a 13,000 X g por 15 minutos. 9. Extraer con pipeta 500 l de la capa acuosa (parte superior) y transferir a un nuevo tubo eppendorf de 1.5 ml. Tener cuidado de no extraer material de la interfase (capa media). En caso de extraer parte de esta, regresar la muestra al tubo y centrifugar por 5 minutos para despus repetir este paso. 10. Agregar 50 l de acetato de sodio 3 M pH 5.2 y 1000 l de etanol al 100% fro.

11.Invertir el tubo varias veces y colocarlo en el congelador a -20 C por lo menos una hora (o 30 minutos a -80C). Tambin puede dejarse toda la noche 12. Centrifugar a mxima velocidad por 20 minutos. Para obtener mayor cantidad de ADN

puede ponerse una centrifuga pequea en el refrigerador (4 C). 13. 14. 15. 16. Remover el lquido del tubo teniendo cuidado de no perder el pellet de ADN. Agregar 750 l de etanol al 70% y mezclar por 15 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar a mxima velocidad por 5 minutos. Remover el etanol con sumo cuidado.

17. Secar el pellet en centrifuga de vaco por 10 minutos o hasta que est seco. 18.Agregar 50 l de TE 1x pH 8.0 para resuspender el pellet. Si se nota que hay mucho DNA se debe aumentar la cantidad de TE. 19. Permitir que el pellet se resuspenda a 4 C durante la noche o 30 minutos a temperatura

ambiente.

20. 21.

Mezclar la muestra para asegurar que el pellet est totalmente disuelto. Para estimar la calidad y cantidad de ADN, correr un minigel de agarosa 1% (3 l de

ADN y 2 l de loading buffer) de 20 a 40 minutos a 85 volts. No es necesario usar escalera.

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