Carcinoma Ductal Infiltrante de Mama - 2002 2

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Ciruga
VALOR PRONSTICO DE LOS FACTORES CLNICOS E INMUNOHISTOQUMICOS EN LA RECIDIVA PRECOZ DEL CARCINOMA DUCTAL INFILTRANTE DE MAMA
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR
ngel Martn Louredo Mndez
Bajo la direccin de los doctores lvaro Larraz Jimnez Jess Mara Andrs de LLano
Madrid, 2002
ISBN: 84-669-2066-8
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE CIRUGA
TESIS DOCTORAL
VALOR PRONSTICO DE LOS FACTORES CLNICOS E INMUNOHISTOQUMICOS EN LA RECIDIVA PRECOZ DEL CARCINOMA DUCTAL INFILTRANTE DE MAMA
ANGEL MARTN LOUREDO MENDEZ

MADRID, SEPTIEMBRE DE 2000
INDICE GENERAL
INTRODUCCIN
........................................................................... .......................
ESTADO ACTUAL DE LOS MARCADORES TUMORALES MOLECULARES

Receptor de estrgeno Receptor de progesterona pS2
...............................................
3 3 21 32 37 42 52 65 72 79 91 97 103
....................................................................... ...................................................................
.....................................................................................................
Hsp27 ................................................................................ EGFR ...................................................................................
C-erbB-2 ..................................................................................................... Ki-67 PCNA p53 ..................................................................................................... ..................................................................................................... .......................................................................................................... ............................................................................................ ....................................................................................... ..................................................
Catepsina D Glicoprotena P
JUSTIFICACIN DEL TRABAJO HIPTESIS DE TRABAJO OBJETIVO
...........................................................
104
............................................................................................
105
MATERIAL Y MTODOS
DISEO POBLACIN
.................................................................
106 106 106 107
.................................................................................................. ............................................................................................. ..........................................................................
RECOGIDA DE DATOS
VARIABLES DEL ESTUDIO
..................................................................... .............................................. ................................
107 108 111 111 111 112 113 114 115 115 116 117 118 118 119 120 120 121
PARMETROS CLNICO-PATOLGICOS
MARCADORES TUMORALES MOLECULARES Determinacin inmunohistoqumica
.............................................. ...........................
Mtodo de la peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) Mtodo de la avidina-biotina (ABC)
.............................................. ...................... ...................... ................. ............. .................. ............. .................. .................. .................. ....
1. Determinacin inmunohistoqumica del RE 2. Determinacin inmunohistoqumica del RPg 3. Determinacin inmunohistoqumica de la pS2 4. Determinacin inmunohistoqumica de la Hsp27 5. Determinacin inmunohistoqumica del EGFR
6. Determinacin inmunohistoqumica del C-erbB-2 7. Determinacin inmunohistoqumica del Ki-67 8. Determinacin inmunohistoqumica del PCNA 9. Determinacin inmunohistoqumica de la p53
10. Determinacin inmunohistoqumica de la catepsina D
11. Determinacin inmunohistoqumica de la glicoprotena P. .... ANLISIS ESTADSTICO DE DATOS ....................................................
RESULTADOS
..................................................................................... 122 ........................................... 122
I-A. DESCRIPCIN GENERAL DE LA SERIE
I-B. ANLISIS DE LA ASOCIACIN ENTRE LOS MARCADORES TUMORALES CLNICOPATOLGICOS ..................................................................................... 127 MOLECULARES Y LOS PARMETROS
1-a) Anlisis de la asociacin entre el receptor de estrgeno y los parmetros clnico-patolgicos. ...................................... 127
1-b) Anlisis de la asociacin entre el receptor de estrgeno y los marcadores tumorales moleculares. 2-a) Anlisis de la asociacin entre el receptor de progesterona y los parmetros clnico-patolgicos. 2-b) Anlisis de la asociacin entre el receptor de progesterona y los marcadores tumorales moleculares. 3-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la protena pS2 y los parmetros clnico-patolgicos. ................................... 133 ........... 130 ............... 130 ............................. 127
3-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la protena pS2 y los marcadores tumorales moleculares. ......................... 133
4-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la protena Hsp27 y los parmetros clnico-patolgicos. .............................. 136
4-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la protena Hsp27 y los marcadores tumorales moleculares. .................... 136
5-a) Anlisis de la asociacin entre el receptor del factor de crecimiento epidrmico y los parmetros clnicopatolgicos. .................................................................................. 138
5-b) Anlisis de la asociacin entre el receptor del factor de crecimiento epidrmico y los marcadores tumorales moleculares. ................................................................................. 138
6-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin del oncogen C-erbB-2 (p185C-erbB-2) y los parmetros clnicopatolgicos. ................................................................................. 140
6-b). Anlsis de la asociacin entre la expresin del oncogen C-erbB-2 (p185C-erbB-2) y los marcadores tumorales moleculares. ................................................................................. 140
7-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin del antgeno nuclear de proliferacin celular Ki-67 y los parmetros clnico-patolgicos. ...................................................................... 141
7-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin del antgeno nuclear de proliferacin celular Ki-67 y los marcadores tumorales moleculares. ............................................................. 142
8-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin del antgeno nuclear de proliferacin celular PCNA y los parmetros clnico-patolgicos. ................................................................... 143
8-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin del antgeno nuclear de proliferacin celular PCNA y los marcadores tumorales moleculares. ............................................................... 144
9-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin del oncogen supresor p53 y los parmetros clnico-patolgicos. ............... 145
9-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin del oncogen supresor p53 y los marcadores tumorales moleculares. 10-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin de catepsina D y los parmetros clnico-patolgicos. ................................... 147 ........... 146
10-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la catepsina D y los marcadores tumorales moleculares. 11-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la glicoprotena P y los parmetros clnico-patolgicos. 11-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la glicoprotena P y los marcadores tumorales moleculares. ....... 149 ............ 149 ........... 148
I-C. ANLISIS DE LOS TUMORES QUE DESARROLLARON METASTASIS DURANTE LOS 36 MESES DE SEGUIMIENTO .............. 1-a) Anlisis de la asociacin entre los parmetros clnicopatolgicos y las recidivas precoces. ..................................... 153 153
1-b) Anlisis de la asociacin entre los marcadores tumorales moleculares y las recidivas precoces. ...................................... 155
2-a) Anlisis de la asociacin entre los parmetros clnicopatolgicos y las recidivas precoces en pacientes con ganglios axilares positivos. ....................................................... 157
2-b) Anlisis de la asociacin entre los marcadores tumorales moleculares y las recidivas precoces en pacientes con ganglios axilares positivos. ..................................................... 158
3-a) Anlisis de la asociacin entre los parmetros clnicopatolgicos y las recidivas precoces en pacientes con ganglios axilares negativos. .................................................... 160
3-b) Anlisis de la asociacin entre los marcadores tumorales moleculares y las recidivas precoces en pacientes con ganglios axilares negativos. .................................................... 161
II. ANLISIS DEL INTERVALO LIBRE DE ENFERMEDAD A 36 MESES CON RELACION A LOS PARMETROS CLINICOPATOLOGICOS Y LOS MARCADORES TUMORALES
MOLECULARES. METODO DE KAPLAN-MEIER Y ANLISIS UNIVARIANTE. ................................................................................... 162
1) Anlisis del intervalo libre de enfermedad a 36 meses con relacin a los parmetros clnico-patolgicos. ....................... 162
2) Anlisis del intervalo libre de enfermedad a 36 meses con
relacin a los marcadores tumorales moleculares.
.............
163
III. ANALISIS MULTIVARIANTE DE LOS PARMETROS CLINICOPATOLOGICOS Y DE LOS MARCADORES TUMORALES MOLECULARES. .............................................................................. 173
DISCUSIN
........................................................................................ .....................................
179 179
I-A. DESCRIPCIN GENERAL DE LA SERIE
I-B. ANALISIS DE LA ASOCIACIN ENTRE LOS MARCADORES TUMORALES MOLECULARES Y LOS PARMETROS CLINICO-PATOLOGICOS .................................................................. 182
1-a) Anlisis de la asociacin entre el receptor de estrgeno y los parmetros clnico-patolgicos. .......................................... 182
1-b) Anlisis de la asociacin entre el receptor de estrgeno y los marcadores tumorales moleculares. ................................. 183
2-a) Anlisis de la asociacin entre el receptor de progesterona y los parmetros clnico-patolgicos. 2-b) Anlisis de la asociacin entre el receptor de progesterona y los marcadores tumorales moleculares. 3-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la protena pS2 y los parmetros clnico-patolgicos. ................................... 189 ...... 187 ............... 186
3-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la protena pS2 y los marcadores tumorales moleculares. .......................... 190
4-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la protena Hsp27 y los parmetros clnico-patolgicos. ............................... 192
4-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la protena
Hsp27 y los marcadores tumorales moleculares.
...................... 194
5-a) Anlisis de la asociacin entre el receptor del factor de crecimiento epidrmico y los parmetros clnicopatolgicos. ................................................................................... 194
5-b) Anlisis de la asociacin entre el receptor del factor de crecimiento epidrmico y los marcadores tumorales moleculares. ................................................................................... 195
6-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin del oncogen C-erbB-2 (p185C-erbB-2) y los parmetros clnicopatolgicos. .............................................................................. 197
6-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin del oncogen C-erbB-2 (p185C-erbB-2) y los marcadores tumorales moleculares. .............................................................................. 198
7-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin del antgeno nuclear de proliferacin celular Ki-67 y los parmetros clnico-patolgicos. ..................................................................... 201
7-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin del antgeno nuclear de proliferacin celular Ki-67 y los marcadores tumorales moleculares. .......................................................... 202
8-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin del antgeno nuclear de proliferacin celular PCNA y los parmetros clnico-patolgicos. .................................................................... 203
8-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin del antgeno nuclear de proliferacin celular PCNA y los marcadores tumorales moleculares. ........................................................... 204
9-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin del oncogen supresor p53 y los parmetros clnico-patolgicos. ............ 205
9-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin del oncogen supresor p53 y los marcadores tumorales moleculares. 10-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin de catepsina D y los parmetros clnico-patolgicos. ............................. 208 .... 206
10-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la catepsina D y los marcadores tumorales moleculares. 11-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la glicoprotena P y los parmetros clnico-patolgicos. 11-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la glicoprotena P y los marcadores tumorales moleculares. ........ I-C. ANALISIS DE LOS TUMORES QUE DESARROLLARON METASTASIS DURANTE LOS 36 MESES DE SEGUIMIENTO 1-a) Anlisis de la asociacin entre los parmetros clnicopatolgicos y las recidivas precoces. ..................................... 212 ......... 212 212 ........ 211 ....... 210
1-b) Anlisis de la asociacin entre los marcadores tumorales moleculares y las recidivas precoces. .................................. 215
2-a) Anlisis de la asociacin entre los parmetros clnicopatolgicos y las recidivas precoces en pacientes con ganglios axilares positivos. ....................................................... 221
2-b) Anlisis de la asociacin entre los marcadores tumorales moleculares y las recidivas precoces en pacientes con ganglios axilares positivos. ....................................................... 221
3-a) Anlisis de la asociacin entre los parmetros clnicopatolgicos y las recidivas precoces en pacientes con ganglios axilares negativos. ....................................................... 222
3-b) Anlisis de la asociacin entre los marcadores tumorales moleculares y las recidivas precoces en pacientes con
ganglios axilares negativos.
.......................................................
223
II. ANLISIS DEL INTERVALO LIBRE DE ENFERMEDAD A 36 MESES CON RELACION A LOS PARMETROS CLINICOPATOLOGICOS Y LOS MARCADORES TUMORALES
MOLECULARES. METODO DE KAPLAN-MEIER Y ANLISIS UNIVARIANTE. .............................................................................. 224
1) Anlisis del intervalo libre de enfermedad a 36 meses con relacin a los parmetros clnico-patolgicos. ..................... 224
2) Anlisis del intervalo libre de enfermedad a 36 meses con relacin a los marcadores tumorales moleculares. ............... 229
III. ANALISIS MULTIVARIANTE DE LOS PARMETROS CLINICOPATOLOGICOS Y DE LOS MARCADORES TUMORALES MOLECULARES. .............................................................................. 239
CONCLUSIONES
..............................................................................
245
BIBLIOGRAFA
...................................................................................
247
INDICE DE ABREVIATURAS
AgNOR: regiones organizadoras nucleolares teidas con plata. Am: anticuerpo monoclonal. AP-1: protena nuclear activadora de la transcripcin tipo 1. CAF: ciclofosfamida, adriamicina, fluorouracilo. Catep. D: catepsina D. CDKN: cinasas de las ciclinas D. C-erbB-2: protena receptor producto de expresin del oncogen de la familia ERBB. CMF: ciclofosfamida, metrotexate, fluorouracilo. DMBA: 7,12 dimetilbenzeno antraceno. DNA: cido desoxiribonucleico. EGFR: factor de crecimiento epidrmico. EIA: enzimoinmunoanlisis. ELISA: ensayo por absorcin ligado a enzima. EREs: elemento de respuesta estrognico especfico. FEC: fluorouracilo, epirrubicina, ciclofosfamida. FGF: factor de crecimiento de los fibroblastos. FISH: hibridacin in situ con fluorescencia. GH: grado histolgico. Glicopot. P: glicoprotena P. GN: grado nuclear. HIV: virus de inmunodeficiencia humana. Ho: hiptesis nula. H-R: razn de riesgos HRG: heregulina. HSF-1: factor de transcripcin de choque trmico tipo 1. HSP: protena cinasa de choque trmico. I.C.: intervalo de confianza. IGF-1: factor de crecimiento insulnico tipo 1. IHQ: inmunohistoqumica. IL-1: interleucina tipo 1. ILE: intervalo libre de enfermedad. IRMA: anlisis inmunorradiomtrico.
JAK: cinasas asociadas al receptor de interfern. kDa: kilodaltones. Ki-67: antgeno nuclear de proliferacin celular. LBA: ensayo de unin al ligando. MAPK: cinasas asociadas a la cascada de seales. MDR: resistencia a mltiples drogas. NDF: factor de diferenciacin neuronal. NMBCs: protenas de la matriz nuclear del cncer de mama. p29/Hsp27: protena de choque trmico de 29 - 27 Kilodaltones. p53: protena supresora 53. PAF: mostaza l-fenilalanina, adriamicina y fluorouracilo. PBP: protena de unin al receptor proliferador-peroxisoma. PCNA: antgeno nuclear de proliferacin celular. PF: mostaza l-fenilalanina, fluorouracilo PKC: protena cinasa C. pS2/TFF1: protena S2 o protena en forma de trbol 1. RE: receptor de estrgeno. RNAm: cido ribonucleico mensajero. RNAr: cido ribonucleico ribosomal. RPg: receptor de progesterona. RR: riesgo relativo. RT-PCR: transcripcin inversa-reaccin en cadena de la polimerasa. SG: supervivencia global SH: regiones homlogas Src SIE: secuencias especficas de unin inducibles. SIF: factor de transcripcin especficos inducibles. SRC: coactivadores de receptores esteroideos. SRU: unidad de respuesta esteroidea. SSCP: anlisis de polimorfismos de la conformacin unicatenaria del DNA. Stat: transductores de seales y activadores de la transcripcin. SV40: virus de sarcoma. TAF: funcin de activacin de la transcripcin. TGF alfa: factor de crecimiento transformante alfa. TNF: factor de necrosis tumoral. uAP: activador del plasmingeno.
AGRADECIMIENTOS
Expreso mi profunda gratitud a los Dres. Alvaro Larrad Jimnez y Jess Mara Andrs de Llano por su constante estmulo y orientacin cientfica, haciendo posible la culminacin de este trabajo.
Quiero agradecer muy sinceramente la colaboracin de los Dres. Luis Carretero Albiana y Emilio Alvarez Fernndez del Departamento de Anatoma Patolgica del Hospital General Universitario Gregorio Maran.
Asimismo, quiero agradecer al Dr. Alberto Muoz-Calero, Jefe de Departamento de Ciruga, al Dr. Modesto Trinchet Hernndez, Jefe del Servicio de Ciruga I y a todas aquellas personas que con su incesante apoyo han contribuido al buen fin de este trabajo.
INTRODUCCIN
El cncer de mama es una de las principales causas de muerte por neoplasias malignas de la poblacin femenina en los pases desarrollados. En Espaa constituye el tumor maligno ms frecuente en la mujer y su incidencia, segn los registros de poblacin, vara entre 40 y 75 por 100.000 mujeres. El riesgo estimado de padecer un cncer de mama antes de los 75 aos es de un 5% (AETS, 1995). Segn las bases de datos del Instituto Nacional de Estadstica en 1997 fallecieron 164.426 mujeres, 34.269 de las muertes fueron causadas por tumores malignos y de stas 5.766 se debieron al cncer de mama. La media de edad de los fallecimientos es de 64, 38 aos, con una tasa cruda de mortalidad de un 29,43 por 100.000 habitantes, una tasa ajustada por edad con la poblacin europea de 25,02, una tasa ajustada a la poblacin mundial de 17,75 y una tasa truncada (35-64 aos) ajustada con la poblacin europea de 37,01. Estos datos le convierten en la primera causa de muerte por cncer en la poblacin femenina. (Martnez de Aragn y Llcer, 1997; Lpez-Abente et al.,1997; INE, 2000)
Gracias a los programas de prevencin, mediante mamografas de cribado e informacin a la poblacin, se ha incrementado el diagnstico de cnceres menores de un centmetro, de cnceres sin afectacin ganglionar, de carcinomas in situ y de cnceres en pacientes en edad inferior a los 40 aos. Tambin se han obtenido avances importantes en el tratamiento quimioterpico adyuvante y se estn ensayado nuevas estrategias teraputicas en el campo de la inmunologa. Sin embargo, a pesar de estos logros la mortalidad global no ha experimentado el descenso deseado, aunque algunos estudios atribuyen este efecto al incremento observado en la incidencia. Desde 1940 la mortalidad en Espaa ha mostrado una tendencia creciente que es adems evidente en todos los grupos de edad e independiente de los avances obtenidos en el tratamiento. Si se compara con el inicio de los aos 80 el incremento ha sido de un 29 %. No obstante, desde 1992 la mortalidad con pequeas variaciones no ha sufrido cambios significativos, observndose una estabilizacin en todos los grupos de edad (AETS, 1995; INE, 2000).
En la VI Conferencia de Consenso Internacional sobre el tratamiento primario del cncer de mama celebrada en febrero de 1998 en St. Gallen, se definieron categoras de riesgo mnimo, intermedio y elevado en pacientes con ganglios axilares negativos. Los factores de riesgo para la recidiva incluyeron, el tamao tumoral, la afectacin ganglionar, el estado de los receptores de estrgeno y progesterona, el grado histolgico y la edad, especialmente considerada factor de alto riesgo por debajo de los 35 aos. La mayora se han estudiado ampliamente,
Introduccin
considerndose en la actualidad el tamao tumoral y el estado y nmero de los ganglios axilares como las variables pronstico ms importantes. Por ello, la estadificacin del cncer de mama que incorpora ambos parmetros es en la actualidad, sin lugar a dudas, uno de los mejores indicadores del pronstico. Destaca que los receptores hormonales (estrgeno y progesterona) fueron los nicos marcadores tumorales moleculares con valor pronstico y adems su determinacin constituye una base para establecer tratamientos quimioendocrinos y predecir las futuras respuestas. El producto del oncogn C-erbB-2 se cita como un marcador tumoral de investigacin cuyo valor pronstico se encuentra en fase de evaluacin clnica y experimental como futura diana teraputica (Ravdin, 1998; Zujewski y Liu, 1998).
Si bien es cierto que las pacientes con enfermedad limitada a la mama y con ganglios axilares libres de colonizacin tumoral gozan de un pronstico favorable, entre un 20 y un 30% de este grupo registra una recidiva durante los primeros 5 aos de seguimiento. Por desgracia, hasta un 30% o ms de las metstasis aparecen durante los tres primeros aos tras la mastectoma, y en estos casos los factores de pronstico clsicos han demostrado tener limitaciones. Esta realidad explica porqu en los ltimos aos se han doblado los esfuerzos por incorporar nuevos factores pronstico adicionales a los utilizados clsicamente. Los avances en biologa molecular han determinado un mejor conocimiento de la biologa tumoral y a su vez han permitido la incorporacin de nuevas variables con un potencial valor pronstico an por definir. Por tanto, se hace necesario conocer el comportamiento, utilidad y rendimiento en la clnica de ciertos marcadores tumorales, que comprenden el receptor de estrgeno (RE), el receptor de progesterona (RPg), la protena pS2 (TFF1), la protena p29 (Hsp27), el receptor del factor de crecimiento epidrmico (EGFR), la protena 185 C-erbB-2, el antgeno nuclear de proliferacin celular Ki-67, el antgeno nuclear de proliferacin celular (PCNA), la protena p53, la catepsina D y la glicoprotena P.
ESTADO
ACTUAL
DE
LOS
MARCADORES
TUMORALES MOLECULARES.
RECEPTOR DE ESTRGENO (RE-alfa, RE-beta, RE-relacionada al RE-alfa).
La primera alusin a la hormonodependencia en el cncer de mama se le debe al cirujano escocs George Beatson (1896), al sealar que la ablacin ovrica induca la regresin de cnceres de mama inoperables. La disponibilidad de estrgeno tritiado permiti inicialmente demostrar y medir receptores especficos y de alta afinidad para el estradiol (Glascock y Hoekstra, 1959) y ms tarde para el receptor de progesterona (Milgrom et al., 1972). Jensen et al., (1972) indicaron que la presencia del receptor de estrgeno se relacionaba con la respuesta al tratamiento endocrino. McGuire (1975) hizo referencia al valor predictivo y a la importancia de la medicin del receptor de estrgeno en el cncer de mama. Los trabajos posteriores de Bishop et al., (1979), Cooke et al., (1979) Saaman et al., (1981) y Clark y McGuire (1988) confirmaron el valor pronstico de los receptores de estrgeno al demostrar una mayor supervivencia en pacientes con tumores RE+.
Desde 1968 el RE ha sido cuantificado por mtodos bioqumicos empleando homogeneizados de tumores incubados con estrgenos marcados radioactivamente. La cantidad del estrgeno unido al receptor se determinaba despus de la separacin del estrgeno libre con carbn dextrano (DCC). Con este mtodo se ha logrado la identificacin del 60% de los tumores RE+ (Wittliff, 1984; Lluch et al., 1987). Los estudios inmunohistoqumicos y de hibridacin in situ progresivamente han logrado desplazar a los mtodos bioqumicos y, a su vez, han permitido demostrar la localizacin nuclear del RE. Los porcentajes de positividad con la tincin IHQ en algunos casos superan el 70% (Keshegegian et al.,1988; Ramos-Fernndez et al., 1998).
El receptor de estrgeno pertenece a la clase 2 de receptores esteroideos de la superfamilia de receptores nucleares; se une especficamente y con alta afinidad {kd: 1 x 10 (10 M)} al estradiol, su ligando. El RE es una fosfoprotena, un factor de transcripcin nuclear activado por ligando que en su estado inactivo se encuentra en complejos o agregados macromoleculares formados por monmeros del receptor y varias protenas de unin no esteroideas como la Hsp90, Hsp70 y la p59 inmunofilina (Webster et al., 1988; Musgrove y Sutherland, 1994).
Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.
Walter et al., (1985) clonaron el DNA del receptor estrognico en la lnea celular MCF7 y Greene et al., (1986) realizaron la secuenciacin completa del producto de transcripcin del gen. El DNA consta de 1.785 nucletidos que codifican un polipptido de 595 aminocidos con un peso molecular de 66,2 kDa. Cuando se realiz la clonacin y secuenciacin del DNA del RE se demostr que la regin de unin al DNA guardaba una gran similitud con la del oncogn ERBA. Por medio de hibridacin in situ, utilizando una sonda de DNA complementario conteniendo la secuencia de codificacin del RE, Gosden et al., (1986) localizaron el gen del RE en el brazo corto del cromosoma 6 entre las regiones q24 y q27. Menasce et al., (1993) por FISH (hibridacin in situ con fluorescencia) le asignaron al gen la regin 6q25.
Mediante procedimientos bioqumicos y genticos que incluan la clonacin de genes, empleo de vectores con DNA complementarios, alineamiento secuencial y mutaciones por delecin, se logr definir las funciones y estructura molecular del receptor estrognico. El DNA del gen que codifica el RE mide ms de 140 kb de longitud y consta de 8 exones que codifican 6 dominios en la protena, designados por las letras de la A F (Ponglikitmongkol et al., 1988). En el extremo carboxi-terminal se localiza el dominio E que une al ligando. Este dominio de unos 300 aminocidos es codificado por parte de los exones del 4 al 8. (Evans, 1988; Katzenellebogen et al., 1987). La regin del receptor que se une al DNA, o dominio C, est situado en el extremo amino-terminal y es codificada por los exones 2 y 3. (Figura 1). Es una regin de 66 aminocidos altamente conservada con mltiples residuos de cistena y un residuo de histidina en el eje central de la protena. La disposicin de estos residuos produce una estructura en forma de dedo que es estabilizada por un in de zinc. (Figura 2). Existen dos estructuras de dedos de zinc (CI y CII) formada cada una por dos grupos de residuos de cistena coordinados tetradricamente con un tomo de zinc y codificadas cada una por exones independientes. Se supone que esta configuracin permite la interaccin con una media vuelta del DNA y la coordinacin con los elementos de respuesta especficos de estrgeno (EREs) en las regiones promotoras de los genes dependientes del RE. La diferencia en la secuencia de aminocidos en los motivos de unin al DNA determina el elemento de respuesta que cada receptor de la superfamilia es capaz de reconocer (Mader et al., 1989). En el caso del estrgeno corresponden a los aminocidos Glu, Gli, Cis, Lis, Ala/Gli. El dominio D comprende una seal de localizacin nuclear de unos 50 aminocidos que se ha denominado como regin de pinza y es independiente de la unin con el ligando. El dominio AF1 posee la capacidad de activar la transcripcin en ausencia del ligando y est definido por los dominios A y B en el extremo amino-terminal. El dominio AF2, situado en el dominio E, induce la transcripcin de genes al unirse con muy alta afinidad a su ligando. La mayora de los promotores de los genes diana precisan de la interaccin sinrgica entre AF-1 y AF-2 para la completa actividad del RE.
FIGURA 1. RECEPTOR DE ESTROGENO EXONES 1 2 3 4 5 6 7 8
DNA
RNAm
A B C D E F
NH2
______ AF1_______ _Unin_ DNA _________AF2___________ __Unin al ligando__
COOH
Protena
FIGURA 2. MOTIVO DE UNION AL DNA. DEDOS DE ZINC.
Fuente: Pilar Santisteban. Mecanismos reguladores de la transcripcin. Cascales M, Villanueva JR. Proliferacin celular y cncer. Salamanca. Fundacin cientfica de la Asociacin Espaola contra el Cncer. 1994. Pag. 196.
La unin del RE con el estradiol formando un complejo RE-estradiol induce una serie de cambios alostricos en la protena receptora que le permite su separacin de las protenas de choque trmico (heat shock proteins), la fosforilacin de una serie de sus residuos de serina y tirosina y la dimerizacin. (Figura 3). Weiss et al., (1991) examinaron la funcin de la tirosina 537 en la respuesta transcripcional del RE, que debido a su proximidad al dominio de unin del ligando se cree fundamental en la actividad transcripcional dependiente de hormona. Al sustituir esta regin por 5 aminocidos distintos, observaron que las mutaciones tirosina-537 a alanina y tirosina-537 a serina produjeron una actividad transcripcional constitutiva, es decir, en ausencia del ligando del 20 y 100% respectivamente. La sustitucin de este residuo por cido glutmico y lisina en algunos casos ocasion la activacin constitutiva, aunque en menor intensidad. Estos trabajos experimentales reforzaron el concepto que la regin tirosina537 es muy importante en la regulacin de la actividad transcripcional del receptor de estrgeno inducida por su ligando y la sustitucin por otros aminocidos es capaz de generar un cambio conformacional suficiente para activar al receptor en ausencia del ligando.
Una vez producido el cambio conformacional el receptor se une a una serie de elementos de respuesta estrognicos especficos (EREs) y la interaccin con coactivadores de receptores esteroideos (SRC1, SRC2, SRC3) que le permiten inducir la transcripcin de los genes mediante contactos protena-protena entre los dominios AF1 y AF2 con diversos componentes de la maquinaria transcripcional. Las vas de sealizacin son muy complejas como lo ponen de manifiesto diferentes estudios experimentales induciendo una serie de mutaciones en los dominios de unin al ligando, as, la prdida del AF2 permite an la activacin transcripcional mediante el dominio AF1. En este caso, la actividad transcripcional constitutiva es independiente del dominio AF2, aunque de menor intensidad. Tzukerman et al., (1994) demostraron mediante experimentos de mutaciones en los dominios AF1 y AF2 del RE que la funcin o actividad transcripcional de stos vara segn la regin promotora de los genes diana. As, en ciertos promotores se precisa de ambos dominios, AF1 y AF2, para una completa actividad del RE, mientras que en otros promotores, AF1 y AF2, pueden ejercer sus funciones de modo independiente. Observaron adems, que el tamoxifn activa intrnsecamente la AF-2 (funcin de activacin de la transcripcin, TAF-2), sin embargo, en otros promotores este agente activa eficientemente la trascripcin de genes a travs del RE, es decir, acta como un agonista del receptor, y por tanto, la funcin de AF2 no es necesaria. Sobre la base de estos hallazgos, concluyeron que el dominio AF1 es el principal activador de la transcripcin del RE y el dominio AF2 funciona como un facilitador de la transcripcin. En ciertos promotores donde la funcin de AF2 es independiente del RE, el AF1 puede funcionar independientemente del AF2.
FIGURA 3. ACCION DE LOS ESTROGENOS SOBRE EL RE
Unin del estradiol al receptor

estradiol estradiol
HSP
DIMERO DE RE
Translocacin al ncleo RE RE Dimerizacin

LIGANDO LIGANDO
Fosforilacin y unin con protenas adaptadoras
Cambio de conformacin y fosforilacin
ERE 1/2 Separacin de las protenas de choque trmico (HSP) del RE
xnt
ERE 1/2
INTERACCIN CON EL APARATO GRAL. DE TRANSCRIPCION
DNA
Modulacin de la RNA polimerasa
En la actualidad se han identificado dos isoformas del RE, el RE-isoforma alfa (RE clsico, RE-alfa) y el RE-isoforma beta (RE-beta), que presentan diferentes patrones de expresin tisular y celular. Se ha identificado un nuevo receptor estrognico relacionado con la isoforma alfa, el RER-alfa, incluido como un subgrupo de la superfamilia de receptores nucleares con una gran homologa al RE-alfa y compartiendo sus mismos genes dianas, aunque es incapaz de activar la transcripcin de genes tras su estimulacin con estradiol. No se conoce an su ligando especfico ni sus funciones exactas y por eso se ha considerado como un receptor hurfano. El RER-alfa fue clonado empleando una genoteca de DNA de clulas renales humanas con una sonda conteniendo el dominio de unin del DNA del RE (Giguere et al., 1988). La clonacin del DNA del RER-alfa del ratn permiti demostrar la elevada expresin de este gen en tejidos como el rin, corazn y tejido adiposo marrn caracterizados por metabolizar cidos grasos. Tambin se comprob que el RER-alfa se une a un elemento de respuesta que contiene la mitad de un solo sitio consenso TNAAGGTCA. Un elemento de respuesta para el RER-alfa se ha encontrado en el extremo 5 de la regin promotora del gen que codifica la enzima acil coenzima A deshidrogenosa de cidos grasos de cadena media (MCAD) implicada en la oxidacin beta mitocondrial de las grasas. El RER-alfa interacciona con el elemento de respuesta nuclear 1 (NRRE-1) de MCAD controlando la expresin del gen de esta enzima. Adems el RER-alfa a travs de la unin con NRRE-1 inhibe la induccin de la sntesis de cido retinoico. Se cree que este receptor puede desempear un rol en la regulacin del balance energtico celular. Mediante FISH, Sladek et al., (1997), localizaron el gen del RER-alfa en locus 11q12-q13. Este mismo autor identific un seudogen RER-alfa en el cromosoma 13q12.1.
El receptor de estrgeno isoforma-beta (RE-beta) fue clonado por Mosselman et al., (1996). Kuiper et al., (1996) tambin identificaron el RE-beta en el tejido prosttico y ovrico de la rata. La comparacin de su secuencia de aminocidos con el receptor de estrgeno (RE-alfa) demostr un grado de conservacin del 96% en el dominio de unin al DNA y un 58% en el dominio de unin al ligando. En cambi, no se encontr homologa con los dominios AB, F y con la regin de pinza. El RE- beta codifica un dominio AF-1 diferente del RE. Moore et al., (1998), sobre la base de las diferencias en las secuencias de aminocidos de la regin carboxiterminal y por los patrones de expresin en distintos tejidos, han identificado 5 isoformas del RE-beta (RE-beta 1, 2, 3, 4, 5). Este receptor es activado por el 17-beta estradiol e inhibido por el antagonista ICI-164384. El timo, bazo, las espermtides en desarrollo en el testculo y las clulas de la granulosa de los ovarios expresan el RE-beta.
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Mosselman et al., (1996) y Tsukamoto et al., (1998) le asignaron al gen RE-beta el locus 14q. Enmark et al., (1997) mediante FISH identificaron el gen en la regin 14q22-q24. El gen consta de 8 exones con una extensin de 40 kb aproximadamente.
El RE-alfa y las variantes de su RNAm producidas por deleciones de los exones 2, 4, 5 y 7 han sido reconocidas en hipfisis normales y en adenomas hipofisiarios. La mayora de los prolactinomas expresan RE-alfa (Shupnik et al. 1998), aunque tambin se han demostrado en tumores que contienen la hormona del crecimiento y gonadotropinas y en tumores de clulas nulas. Chaidarun et al., (1998) demostraron la co-expresin del RE-beta y sus variantes RNA mensajeros con el RE-alfa en el 60% de los prolactinomas, en el 100% de tumores mixtos productores de hormona de crecimiento/prolactina y en el 29% de los gonadotrofos. Tambin se encontr su expresin independiente del RE-alfa en el 100% de las clulas nulas, en el 80% de los somatotropos y en el 60% de los corticotropos. Estos autores hacen referencia a las interacciones entre estos dos receptores, con un menor rol del RE-beta en la trascripcin de genes en tumores RE-alfa+, pero con una funcin mediadora principal en los tejidos que carecen del RE-alfa y nicamente expresan el RE-beta. Aparentemente debido a las diferencias en la capacidad transcripcional de ambos receptores, la expresin de genes por estimulo del estradiol en la pituitaria normal y neoplsica depende de la expresin del RE-alfa y RE-beta.
Utilizando la tcnica de destruccin de genes en ratones Lubahn et al., (1993) y Korach et al., (1996) demostraron que la deficiencia del gen RE-alfa caus la falta de desarrollo de las mamas en ratones hembras y alteraciones del sistema reproductor, cambios de conducta e infertilidad en ambos sexos. Los estudios con tcnicas de destruccin del gen RE-beta llevados a cabo en ratones por Krege et al., (1998), han evidenciado que este receptor es esencial para una ovulacin normal, como haba sealado Enmark et al., (1997), pero no imprescindible para una diferenciacin sexual normal, fertilidad o lactancia.
En el tejido mamario sano predomina la isoforma beta, mientras que los cnceres expresan preferentemente la isoforma alfa o ambas. La presencia de la isoforma beta, en los tumores con expresin de ambas isoformas, se ha relacionado con la ausencia del RPg, invasin ganglionar, mayor tamao tumoral y altos grados histolgicos. Dotzalaw et al., (1999) objetivaron una disminucin de la expresin del RNA mensajero de la isoforma beta en la lnea celular T47D cuando fueron tratadas con progesterona, sugiriendo la posibilidad de que la isoforma beta constituya un marcador de respuesta al tratamiento hormonal. (Speirs et al., 1999; Dotzalaw et al., 1999).
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Los estrgenos, al unirse con su receptor, favorecen el paso de clulas en G0 a G1 acortando la duracin del ciclo celular y promoviendo el desarrollo y diferenciacin del tejido mamario. Los estrgenos actan sobre los genes de respuesta temprana (c-fos, c-jun, c-myc) de la fase G1 del ciclo celular, estimulando la actividad de las ciclinas, especialmente la D1, considerada esta como el paso limitante en el ciclo de divisin celular (Musgrove y Sutherland 1994). Adems, el estradiol regula positivamente la protencinasa C (PKC), mientras que esta enzima y sus ligandos (steres de forbol) regulan negativamente los niveles de los receptores de estrgeno. La PKC es una serina/treonina cinasa cuya expresin vara en diferentes tejidos y que participa en las vas de sealizacin que generan segundos mensajeros. Activadores de la PKC como el AMPc de manera sinrgica incrementan la actividad transcripcional del RE de una manera promotora-especfica. De este modo, los estrgenos, los activadores de la PKC y algunos factores de crecimiento aumentan la fosforilacin del RE y las protenas involucradas en las vas de respuestas especficas RE (Katzenellenbogen et al., (1995). El tamoxifn ejerce efectos antiestrognicos, inhibe la actividad de la PKC y la accin de las ciclinas D, pero depende de la integridad del RE, del tipo de clula y, principalmente, del promotor para ejercer acciones antiestrognicas o estrognicas.
En el modelo de cascada propuesto por Schuchard et al., (1993) los esteroides interaccionan rpidamente, en cuestin de minutos, con protooncogenes nucleares de respuesta temprana que codifican protenas reguladoras que, a su vez, controlan positivamente o negativamente la transcripcin de genes estructurales de respuesta tarda y el procesamiento del RNA mensajero. Los protooncogenes nucleares funcionan como importantes genes reguladores iniciales codificando factores de transcripcin y enzimas necesarias para la transcripcin de genes estructurales. Los receptores esteroideos a travs de la unin con sus elementos de respuesta esteroidea (EREs) regulan localmente la transcripcin de genes y de las unidades de respuesta esteroidea (SRU), compuestas de 2 o ms EREs. Las SRU pueden actuar a grandes distancias de los genes iniciales para incrementar la transcripcin regulada por los esteroides. En el proceso de transcripcin tambin intervienen protenas de la matriz nuclear a travs de un factor de unin (RBF-1) para los receptores esteroideos de estos genes. La matriz nuclear es un complejo RNA-protena muy dinmico que organiza la cromatina y regula el metabolismo del DNA nuclear. Su estudio ha permitido demostrar la existencia de protenas (NMBCs) que se asocian con el DNA nuclear de lneas celulares de cncer de mama dependientes de hormona y lneas celulares independientes de hormonas. Hasta el momento se han identificado 3 protenas NMBCs exclusivas de clulas RE+ (dependientes de hormonas) y 2 NMBCs de clulas RE(independientes de hormonas). Se han observado cambios en las NMBCs en lneas celulares transformadas de un estado de dependencia hormonal (RE+) al de independencia (RE-). La
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protena vimentina se encontr asociada al DNA de las clulas MDA-MB-231 (RE-) que poseen un importante potencial metastsico (Spencer et al., 2000).
Un nmero variable de sustancias depende de la estimulacin estrognica y de un receptor funcionalmente intacto, entre ellas se incluyen: el receptor de progesterona, la Hsp27, los factores de crecimiento transformantes alfa y beta, el factor de crecimiento insulnico tipo 1, el factor de crecimiento epidrmico, la catepsina D, el activador del plasmingeno tisular, la alfa 1 antiquimiotripsina, la pS2; los protooncogenes c-fos, c-myc, C-erbB-2; ciclinas y otras sustancias reguladoras que actan en las vas de sealizacin transcripcional y activacin de protooncogenes cuyo resultado final es la divisin y diferenciacin celular (Schneider y Jackisch, 1998). Los estrgenos y progesterona regulan los niveles de sus receptores, siendo esta accin necesaria para limitar la actividad de las hormonas en sus clulas blanco. Alarid et al., (1999) han demostrado en la lnea celular PR1 (lactotropo de la pituitaria anterior) y en MCF7 (lnea celular de cncer de mama) que los estrgenos disminuyen rpidamente los niveles de sus receptores a travs de la estimulacin de la actividad proteoltica por el proteasoma; esta accin no requiere la transcripcin, ni la sntesis de protena, y podra constituir una va reguladora comn para el RE.
Varios trabajos experimentales basados en diversos modelos de carcinognesis mamaria apuntan la existencia de mltiples vas de comunicacin interconectadas entre s en las que participan los esteroides, factores de crecimiento, factores de transcripcin y protooncogenes. Lee et al., (1990) examinaron la relacin cuantitativa existente entre el RNAm del EGF y las concentraciones de RE en 10 lneas celulares de cncer de mama. Las lneas celulares REexpresaron cantidades significativamente mayores de EGFR-RNAm en comparacin con las lneas RE+. Este hecho se comprob mediante anlisis de regresin lineal, por tanto, parece existir una relacin recproca inversa en la regulacin de los genes RE y EGR-R. Se ha constatado experimentalmente que las clulas de cncer de mama que sobreexpresan el C-erbB2 adquieren un crecimiento y desarrollo independiente de la estimulacin hormonal. La activacin del receptor C-erbB-2 por su ligando, la heregulina, induce la fosforilacin del RE en residuos de tirosina ocasionando la interaccin de ste con su elemento de respuesta con la consiguiente activacin de la transcripcin, dando origen a la sntesis del receptor de progesterona. Ms an, la sobreexpresin de C-erbB-2 produjo una disminucin de los receptores RE que fue independiente del ligando y un retraso en la supresin de los mecanismos autorreguladores de los productos de transcripcin dependientes del RE (Pietras et al., 1995).
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El factor de crecimiento insulnico tipo-1 (IGF-1) es mitognico y ejerce un efecto regulador de la expresin y actividad transcripcional del RE. La exposicin de clulas MCF-7 a 40 ng/ml de IGF-1 caus una disminucin de un 60% del RE y un 80% del RE-RNAm motivada por una inhibicin de la expresin del gen RE. Aparte del efecto inhibitorio sobre el RE, el IGF-1, contrariamente indujo la expresin de RPg y pS2, dos protenas dependientes de la va estrognica. La administracin de un agente antiestrognico puro (IC-164, 384) impidi la sntesis de estas protenas y lo mismo sucedi con el empleo de inhibidores de la protencinasa A y del fosfatidilinisitol 3- cinasa (Stoica et al., 2000). Cuando se administr un pptido antisentido al receptor del IGF-1 a ratones desnudos transplantandos con la lnea celular MDAMB-435 (altamente metastsica) se observ una significativa disminucin de las metstasis pulmonares y un aumento de la supervivencia (Chernicky et al. 2000). La relacin entre las vas de comunicacin de los receptores de factores de crecimiento y el RE fue estudiada en dos lneas celulares de cncer de mama (MCF-7 y T47D) mediante la administracin de un agente antiestrgenico parcial (4-OH-tamoxifn) y un antiestrognico puro (ZM182780). La estimulacin con GF-1 y heregulina caus un aumento del crecimiento celular que fue abolido por el ZM182780 en la las clulas MCF-7, pero no en las clulas T47D. En cambio, la proliferacin celular estimulada por los factores de crecimiento se increment en ambas lneas celulares expuestas al 4-OH-tamoxifn; efecto que pudo ser inhibido por el ZM182780. La administracin conjunta de estradiol, IGF-1 y heregulina nicamente disminuy la eficacia antiestrognica del 4-OH-tamoxifn. Por tanto, la interconmunicacin entre los RE y los receptores de los factores de crecimiento es diferente en ambas lneas celulares (Lichtner et al., 2000). Estos hallazgos apoyan la teora que el RE es un mediador del IGF-1 y que existe una intercomunicacin entre las vas de factores de crecimiento y la va estrognica, aunque, pueden haber variaciones dependiendo del tipo de clulas.
Los andrgenos tambin estimulan la proliferacin de clulas de cncer de mama a travs de la activacin directa del receptor de estrgeno (Maggioloni et al., 1999). La activacin transcripcional del gen c-Ha-ras inducida por los estrgenos ha sido demostrada en un modelo de metstasis de cncer de mama en el ratn (Pethe y Shekhar, 1999). Mediante experimentos de transfeccin, Fan et al., (1999) demostraron que la protena BRCA1 inhibe la va de sealizacin del RE activado por su ligando a travs del ERE y por bloqueo del dominio AF2 en la regin carboxi-terminal del RE. De este modo, la protena silvestre BRCA1 inhibe la proliferacin del epitelio mamario dependiente de la estimulacin estrognica por inhibir la va transcripcional del RE.
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Los factores de transcripcin AP-2 intervienen en el crecimiento y morfognesis del tejido mamario normal y en el control de la proliferacin y diferenciacin de las clulas de cncer de mama (Turner et al., 1998). Se han demostrado sitios de unin AP-2 en los promotores de los receptores de estrgeno y del C-erbB-2. Los genes que codifican estos factores de transcripcin se encuentran expresados en varias lneas celulares de cncer de mama. Existe una correlacin muy significativa entre la expresin del AP-2 alfa y la expresin del RE, as como de la expresin del AP-2 alfa y gamma y la sobreexpresin de C-erbB-2. La protena AP-2 puede regular la transcripcin del receptor del factor de crecimiento insulnico implicado en la va de traduccin de seales en el cncer de mama. Un receptor coactivador nuclear, la protena de unin al receptor activado proliferador-peroxisoma (PBP), interacciona con el receptor de estrgeno favoreciendo la transcripcin dependiente de la va de sealizacin de estrgenos. La regin de 273 a +1 del gen contiene una caja CCAT, mltiples elementos cis (C/EBPbeta, YY1, c-Ets-1, AP-1. Ap-2) y sitios de unin NfkappaB. El gen que codifica este coactivador del RE se encuentra sobrexpresado y en algunos casos amplificado en varias lneas celulares de cncer de mama y podra desempear una funcin importante en la diferenciacin del epitelio y en la carcinognesis mamaria (Zhu et al., 1999).
En el cncer de mama la positividad del receptor de estrgeno y progesterona vara segn el estado hormonal. Las premenopusicas presentan niveles inferiores del receptor de estrgeno en comparacin con las postmenopusicas. En cambio, los niveles de progesterona suelen ser hasta 3 veces superiores en las premenopusicas con RE- si se comparan con las pacientes postmenopusicas. Este hecho ha sido atribuido a los elevados niveles de estrgeno circulante de las mujeres premenopusicas que producen un enmascaramiento de los receptores de estrgeno y un aumento de la actividad estrognica. En un anlisis de 1095 pacientes con cnceres de mama, estudiadas por el Grupo Interdisciplinario para la Valoracin y Cuidado del Cncer en Italia, se demostr que los niveles de RE aumentan con la edad de las pacientes. Las pacientes de 66 aos tuvieron una probabilidad 3 veces superior de tener un tumor RE+ en comparacin con las de edad inferior a los 40, sin embargo, la proporcin de tumores RPg+ fue inferior en las pacientes postmenopusicas (G.V.I.O., 1995). Helin et al., (1988) demostraron en 190 cnceres de mama, tanto por radioinmnuoensayo como por IHQ, que los niveles de RE fueron superiores en las pacientes postmenopusicas (87 fmol/mg prt y histocore de 270) en comparacin con las premenopusicas (31 fmol/mg prt y histocore de 207). Adems, objetivaron niveles citoslicos significativamente superiores de RE en aquellas pacientes con bajos niveles sricos de estradiol.
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Los niveles de expresin del RE son superiores en los cnceres en comparacin con el tejido mamario normal. Esta sobreexpresin se ha intentado relacionar con alteraciones del gen RE. Nembrot et al., (1990) analizaron el gen RE en 21 cnceres de mama y una metstasis ganglionar axilar, observando en 6 de 14 tumores RE+ una amplificacin del gen que vari entre 1,6 a 3 veces. No objetivaron amplificacin del gen en ninguno de los 8 tumores RE negativo y aunque sealaron que el aumento en la expresin del RE puede ser el resultado de una amplificacin del gen, no pudieron establecer una relacin entre ste y la cantidad de receptores presentes en los cnceres. Petrangeli et al., (1994) encontraron niveles de RE significativamente mayores en tejido neoplsico que en el tejido perineoplsico atribuyendo este efecto a la hipometilacin del gen. En el caso contrario Lapidus et al., (1996) demostraron que la hipermetilacin de islas de CpG del gen RE y RPg se relaciona con una falta de expresin de sus receptores en un porcentaje significativo de cnceres de mama humanos.
En el cncer de mama la positividad del RE y RPg es proporcional al grado de diferenciacin y del tipo histolgico de los tumores, as, un 90% de los carcinomas ductales y lobulillares infiltrantes son RE+. Aproximadamente un 54% de los carcinomas in situ expresan el RE y de stos, un 66% de las variantes no comedo, lobulares y papilares expresan el RE. Por el contrario, el 80% de la variedad comedo son RE- (Pallis et al., (1992). No se han observado diferencias significativas entre los niveles del RE del cncer primario y sus metstasis cuando se han realizado estudios secuenciales de los receptores. Coradini et al., (1984) analizaron en 48 cnceres la distribucin de los receptores hormonales (RE y RPg) en los primarios y sus metstasis axilares, de este modo, la positividad para el receptor de estrgeno se observ en el 73% de los primarios y el 62,4% de los ganglios afectados y el RPg se detect en 73% de los primarios y en el 50% de sus metstasis ganglionares. La concordancia para el RE y RPg fue de 89,6% y 77,1% respectivamente, as la mayora de los ganglios expresaron el mismo receptor que sus tumores primarios y en ningn caso objetivaron ganglios RE+ con primarios RE-. De manera similar, Li et al., (1994) compararon la concordancia de los RE (n=83) y RPg (n=32) entre los tumores primarios, las recidivas y los segundos primarios. Adems, analizaron la influencia que ejerce el tratamiento adyuvante sobre la expresin de los receptores. En el 71% de los casos coincidi la positividad para el RE en el primario/recidiva y en el 56% para la positividad del RPg en el primario/recidiva. Independientemente que la recidiva fuera local, a distancia o un segundo primario, no afect la concordancia para los receptores hormonales, como tampoco lo hizo el tipo de tratamiento adyuvante. Observaron sin embargo, una disminucin de la supervivencia libre de enfermedad en aquellos tumores primario RE +/recidiva RE- y primarios RPg+/recidiva Rpg-. Nomura et al., (1985), en su serie de 942 cnceres de mama, objetivaron en 42 recidivas que 10 de los 27 tumores RE+ cambiaron a un
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estado RE- al contrario de los 15 tumores RE- que mantuvieron la negatividad del receptor. Por otro parte, el anlisis de cnceres de mama avanzados sometidos a diferentes terapias endocrinas y citotxicas evidenci un cambio en el estado del RE de positivo a negativo. Concluyeron que algunos cnceres de mama el RE y RPg cambian de fenotipo positivo a negativo durante la progresin tumoral y con algunas terapias, especialmente la endocrina.
La actividad del RE y RPg ha servido para definir grupos de riesgo de recidiva y para valorar la respuesta a varias formas de manipulacin endocrina. El 60% de los cnceres RE+ y el 10% de los RE- responden a la administracin de estrgenos o a medidas ablativas hormonales. McGuire et al., (1990) observaron un 80% de respuesta objtetiva a la terapia endocrina en enfermas cuyos tumores posean niveles de RE iguales o superiores a los 100 fmol/mg prt frente a un 46% de respuesta en pacientes con niveles inferiores a este valor. Stewart et al., (1982) analizaron la respuesta a la terapia endocrina en 156 cnceres de mama avanzados con relacin a 4 subgrupos fenotpicos basados en la determinacin de los niveles de RE y RPg (punto de corte: 5 fmol/mg prt). La respuesta a la primera terapia endocrina segn el fenotipo tumoral fue de: RE+/RPg+ 50%, RE+/RPg- 27%, RE-/RPg+ 27% y RE-/RPg- 6%. Cuatro de diecisis tumores RE+/RPg+ respondieron a una segunda lnea hormonal, hecho que no se repiti con otros fenotipos tumorales. Los tumores RE-/RPg- tuvieron una supervivencia significativamente ms corta. Thorpe (1988) describe en la revisin de los resultados del estudio realizado por el Grupo Cooperativo Nacional Dans sobre 4.000 pacientes con cncer de mama, la existencia de tres grupos de tumores biolgicamente y clnicamente bien definidos. Un primer grupo estara constituido por tumores RE+/RP+ y RE-/RP+ que responden bien al tratamiento hormonal; un segundo grupo representado por tumores RE-/RPg- que no responden a las terapias endocrinas y un tercer grupo RE+/RPg- con respuestas dudosas al tratamiento hormonal, observado predominantemente en pacientes postmenopusicas. Clark et al., (1987), en un estudio basado en 1015 pacientes con enfermedad metastsica, citan que el lugar de la primera recidiva y el estado del RE son importantes para predecir la supervivencia. En este anlisis fueron de valor pronstico la presencia de metstasis axilares y el contenido del RE. Las recidivas seas se objetivaron en pacientes con tumores RE+, en cambio, las metstasis viscerales y en tejidos blandos fueron ms frecuentes en cnceres RE-. Los cnceres RE+ tuvieron un mejor pronstico independientemente del lugar de asiento de las metstasis. Elledge et al., (2000) compararon la utilidad del RE y RPg determinados por IRMA e IHQ, para predecir la respuesta al tamoxifn en 205 pacientes RE+ con enfermedad metstasica. Observaron una relacin directa entre la respuesta al tamoxifn y altos ndices de RE, RPg y pS2. Elevados niveles de RE, RPg y pS2, tanto por LBA como por IHQ, se relacionaron significativamente con una buena respuesta al tratamiento hormonal y a una prolongada supervivencia.
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La determinacin conjunta del receptor de estrgeno y la medicin de la fraccin de proliferacin celular ha sido de utilidad para predecir la mejor respuesta a tratamientos endocrinos y quimioterpicos. Silvestrini et al., (1979), en su anlisis de 199 cnceres de mama, hacen referencia a la relacin inversa entre la actividad proliferativa y la cantidad del receptor de estrgeno. La medicin de la actividad proliferativa mediante el ndice de timidina tritiada y los niveles de RE le permitieron identificar 3 grupos con diferente cintica celular. Un primer grupo constituido por pacientes postmenopusicas con cnceres RE+ con baja actividad proliferativa; un segundo grupo de pacientes premenopusicas con cnceres RE+ y postmenopusicas con cnceres RE- con actividad proliferativa intermedia y un tercer grupo de pacientes premenopusicas con cnceres RE- con elevada actividad proliferativa. En los tumores con bajo ndice de proliferacin, los niveles del RE fueron ms bajos en las premenopusicas en comparacin con las postmenopusicas. Skoog et al., (1992 ) tambin analizaron la actividad proliferativa y los niveles de estrgeno en 12 pacientes postmenopusicas con cnceres de mama en tratamiento con tamoxifn exlusivamente por rechazo a la ciruga y en 7 pacientes premenopusicas con carcinomas inflamatorios y avanzados que recibieron quimioterapia preoperatoria. Las pacientes con buena respuesta al tamoxifn y en aquellas con enfermedad estabilizada presentaban tumores con baja actividad proliferativa y positividad para el RE. En cambio, se observ una elevada actividad proliferativa y la presencia de menos del 25% de los RE en dos enfermas con progresin de su enfermedad. La respuesta objetiva clnica a la quimioterapia tambin se relacion con una baja fraccin de proliferacin.
Por el contrario, Romain et al., (1994), en un estudio sobre 542 cnceres de mama en pacientes postmenopusicas, objetivaron que algunos tumores RE+ mostraban una elevada actividad proliferativa. Estratificaron los pacientes en grupos de alta, intermedia y baja expresin del RE, basndose en una curva de distribucin de frecuencias de los valores de la tincin IHQ transformados a logaritmos. Una alta expresin de catepsina, un aumento de la actividad de la timidina quinasa (actividad proliferativa) y una mala evolucin se apreci en el grupo con baja expresin del RE. Paradjicamente, elevados niveles de catepsina y alta
actividad proliferativa tambin se encontraron en pacientes con altos niveles de expresin del RE. Este grupo tuvo una evolucin desfavorable, al igual que sucedi con los tumores con baja expresin del RE. De manera similar, Thorpe et al., (1993), en un anlisis de 952 cnceres de mama de pacientes postmenopusicas sin tratamiento adyuvante, identificaron un grupo de pacientes (47% de la cohorte) con elevados niveles de RE (108 > fmol/mg prt) cuyo pronstico fue tan desfavorable como las pacientes con tumores RE-. Estos autores utilizaron una escala de graduacin de valores del RE (10 <, 10 107, y 108 > fmol/mg prt) para estratificar los
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pacientes en grupos de bajos, intermedios y elevados niveles de expresin del RE. En el anlisis multivariante un alto contenido de RE fue de mayor valor para predecir un menor intervalo libre de enfermedad que el grado de anaplasia y que el tamao tumoral.
La presencia de un receptor de estrgeno integro es fundamental para que exista una buena respuesta al tratamiento hormonal. Sin embargo, aproximadamente un 3540 % de los tumores RE+ no responden adecuadamente a los agentes antiestrognicos y de aquellos que responden, eventualmente algunos se hacen insensibles a pesar de expresar an el receptor. La prdida del RE o su funcionalidad se ha relacionado con tumores agresivos, insensibles al tratamiento hormonal y con mayor capacidad para desarrollar metstasis (Osborne et al., 1980, McGuire et al., 1982). Estos hechos han motivado la bsqueda de mecanismos que puedan explicar el fenmeno de hormonorresistencia observado en algunos cnceres de mama. Encarnacin et al., (1993), investigaron el cambio de fenotipo RE y RPg por radioinmunoensayo e IHQ en 34 cnceres de mama en tratamiento con tamoxifn, de las que 30 mostraban resistencia a este agente. Ocho de once pacientes con franca progresin de la enfermedad presentaban tumores RE+/RPg+ y otras seis mostraban cnceres RE+/RPg-. Tan slo se registraron cnceres RE/RPg- en 12 pacientes por ambos mtodos, insinuando un mecanismo de independencia hormonal. Concluyeron que en muchos tumores en franca progresin, a pesar de recibir tratamiento hormonal, existen otros mecanismos de resistencia a parte de la prdida de expresin de los receptores. Scott et al. (1991), al explorar en 38 cnceres de mama la capacidad del RE de unirse a su elemento de respuesta afn, evidenciaron que algunos tumores RE+ eran incapaces de unirse al DNA y otros lo hacan en baja proporcin. El anlisis de estos receptores demostr que se trataban de formas truncadas constituidas por homodmeros de 50 kDa y heterodmeros de 67 y 50 kDa. De esta manera, la prdida del dominio de unin al DNA del RE podra ser una de las causas de la resistencia clnica a la terapia antiestrognica. Karnik et al., (1994) analizaron por SSCP (conformacin de polimorfismos de una sola banda) los 8 exones de DNA complementario del RE de 20 cnceres de mama resistentes y 20 tumores sensibles al tamoxifn, encontrando nicamente un reemplazo de 42 pares de bases en el exon 6 de un tumor resistente a tamoxifn. Tambin, observaron la delecin de un par de bases en el mismo exon presente en un tumor metastsico resistente al tamoxifn que no estaba presente en el tumor primario. En los 18 tumores restantes resistentes a tamoxifn no se objetivaron mutaciones en ninguno de los 8 exones, lo que indica que la baja frecuencia de mutaciones no puede explicar el mecanismo de resistencia a este agente. Roodi et al., (1995) analizaron el gen RE en 118 cnceres de mama RE+ y en 70 RE- para investigar posibles alteraciones en el gen inductoras de un fenotipo RE negativo resistente a la hormonoterapia. Mediante amplificacin de los exones del 1 al 8 del gen y anlisis por SSCP, electroforesis y secuenciacin del DNA
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objetivaron, tanto en tumores RE+ como en RE-, la existencia de polimorfismos en los codones 10, 87, 243, 325 y 594. No demostraron asociacin significativa alguna entre estos polimorfismos y los parmetros clnico-patolgicos clsicos, aunque las alteraciones en el codon 325 mostraron una fuerte asociacin con una historia familiar de cncer de mama en pacientes pre y postmenopusicas. Tampoco encontraron deleciones/inserciones y tan solo dos mutaciones en los codones 69 y 396. En consecuencia, nicamente el 1% de los cnceres de mama en esta serie mostr alteraciones del gen y, por tanto, la expresin negativa del RE se debe mas bien a una deficiente expresin a nivel transcripcional o postranscripcional. Por otra parte, la transfeccin de genes RE silvestres y mutantes a clulas RE negativas para revertir la hormonoindependencia produjo un efecto paradjico en el que los estrgenos en vez de estimular, inhibieron el crecimiento tumoral (Levenson y Jordan 1994).
Sluyser y Mester (1985) hipotetizaron que la prdida de la dependencia hormonal de ciertos cnceres de mama poda ser debida a una mutacin del gen o a un receptor truncado que activa la transcripcin sin la presencia del ligando. Desde la identificacin de variantes del RNA mensajero del receptor de estrgeno, producidas por inserciones de pares de bases, transiciones, deleciones y separaciones alternativas que producen deleciones de los exones 3, 5, 7, existe un gran inters por las alteraciones en la estructura del receptor estrognico (McGuire et al., 1991). Estos autores en modelos de levaduras demostraron la existencia de receptores estrognicos dominantes positivos que inducen la transcripcin en ausencia del ligando y receptores dominantes negativos qu, aunque transcripcionalmente inactivos, impiden la funcin normal del RE (Fuqua et al., 1991; Fuqua et al., 1992; Dowsett et al., 1997). Fuqua et al., (1991), mediante un DNA complementario amplificado por PCR, detectaron la variante delta 5 originada por la delecin del exon 5. Esta variante que se expresaba predominantemente en tumores RE-/RPg+ era capaz de activar constitutivamente la transcripcin del gen RE y su coexpresin con el RE silvestre confera una resistencia al tratamiento con tamoxifn. (Fuqua et al., 1993), adems, identificaron en pacientes con tumores RE+/RPg- una variante del RE por delecin del exon 3 que inhiba la unin del RE silvestre a su elemento de respuesta (ERE) e interfera de manera dominante negativa con la funcin del RE. Castles et al., (1993), tambin demostraron variantes del RE-RNAm en las lneas celulares RE- (BT-20) y RE+ (MCF7). Encontraron deleciones del exon 5 en ambas lneas celulares, sin embargo, esta variante predominaba en clulas RE-. La variante delta 5 era el resultado del procesamiento alternativo del RE-RNAm originando un RE truncado de 42 kDa carente del dominio de unin hormonal. Aparte de su presencia en el tejido tumoral, tambin se comprob su existencia en tejido mamario sano y endometrial. Posteriormente Zhang et al., (1993) constataron que su presencia no slo se limitaba a tumores RE- ya que 19 de 20 tumores RE+/Rpg+ y RE+/RPg- mostraron
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la variante. Adems, la delta 5 siempre se coexpresaba con el receptor silvestre y en cambio, no se objetivaba en tumores RE-/RPg-. Fuqua et al., (1995) al transfectar la variante del RE delta 5 por medio de un vector a clulas MCF7 lograron la transcripcin de un receptor de 40 kDa, la sntesis del RPg y el crecimiento de colonias independientes de la estimulacin estrognica, demostrando de este modo, la capacidad transcripcional de esta variante.
Castles et al., (1995) exploraron recientemente mediante RT-PCR las variantes producto de deleciones del exon 5 y 7 en varias lneas celulares de cncer de mama. Al contrario de las lneas RE+, solo 3 lneas celulares RE- (BT-20, MDA-MB-33, T47-Dco) expresaron el receptor silvestre y las variantes, aunque, los niveles de expresin fueron muy inferiores en comparacin con clulas RE +. Segn estos autores, la actividad de esta variante confiere un fenotipo de independencia estrognica y adems, supone que algunos tumores RE- son clasificados inadecuadamente.
Murphy et al., (1996) descubrieron nuevos productos de transcripcin del gen RE originados por la insercin de nucletidos en el 9,4% de 212 cnceres de mama analizados mediante clonacin y secuenciacin de los productos de RT-PCR. Encontraron la duplicacin completa del exon 6 en el 7,5% de los casos, la duplicacin de los exones 3 y 4 en un tumor y la insercin de 69 nucletidos entre los exones 5 y 6 en 3 tumores. El anlisis de la lectura del exon 6 evidenci la transcripcin de un RE de 51,4 kDa. Los exones 3 y 4 codifican un RE de 83,3 kDa, mientras que la insercin de 69 nucletidos introdujo 23 nuevos residuos entre los residuos 412 y 413 para producir una protena de 68,8 kDa. Se desconoce sin embargo, la translacin estable de los nuevos RE-RNAm in vivo.
De todas las variantes, las delta 5 y 7 han sido las ms estudiadas. En diferentes lneas celulares la delta 5 muestra una activacin constitutiva que vara entre un 15 y un 60% en relacin con de la actividad del receptor natural. Estas variantes existen en tejido mamario normal, sin embargo, las concentraciones aumentan en el tejido neoplsico y se incrementan durante la progresin tumoral. La variante delta 7 se relaciona con tumores RE+RPg-, mientras que la delta 5 lo hace con tumores RE-RPg+. Se consideran de importancia en la carcinognesis mamaria debido a que su incremento durante la progresin tumoral se relaciona con alteraciones en la va de sealizacin del estrgeno, adquisicin de independencia hormonal y por consiguiente, resistencias a los tratamientos con tamoxifn y progestgenos. En el momento actual se especula sobre la importancia de estas variantes como factores pronstico.
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RECEPTOR DE PROGESTERONA.
En el cncer de mama el receptor de progesterona (RPg), al igual que el receptor de estrgeno (RE), es un factor de pronstico y un marcador de respuesta al tratamiento hormonal (Horwitz et al., 1978; Osborne et al., 1980; McGuire et al., 1982). Los tumores RE+/RPg+ se han relacionado con menores tasas de proliferacin celular, mejor grado de diferenciacin histolgica, menor tamao tumoral, buena respuesta al tratamiento hormonal y pronstico favorable (Thorpe et al.,1987; Barbi et al., 1987;. McGuire et al., 1991; Bernoux et al., 1998).
Horwitz y McGuire, (1975) emplearon el progestgeno R5020, que se une especficamente al RPg, logrando el aislamiento del receptor en 11 de 33 cnceres de mama, estableciendo su coeficiente de sedimentacin (8 S en gradiente de sucrosa) y su constate de disociacin (1x10-9 M). El RPg se localiza en el ncleo y su sntesis es estimulada por el estradiol y por dosis de tamoxifn inferiores a 0,1 micromoles (Horwitz et al., 1978). La determinacin del RPg se ha realizado mediante mtodos bioqumicos (DCC), ensayo inmunoenzimtico, tincin IHQ e hibridacin in situ. Los niveles de RPg obtenidos por mtodos bioqumicos e inmunoenzimticos son comparables (Foekens et al., 1989), en cambio, los porcentajes de positividad son discretamente mayores con las tcnicas inmunohistoqumicas. Las pruebas de hibridacin in situ han sido de gran utilidad para el estudio de las variantes del RNAm del receptor. (Goussard et al., 1998; Tong et al., 1999; Nargessi et al., 1998)
Mediante tcnicas de hibridacin in situ se ha localizado el gen del receptor de progesterona en el cromosoma 11, entre las bandas q22-q23 (Rousseau-Merck et al, 1987; Mattei et al., 1988). Este gen codifica una protena de aproximadamente 933 aminocidos con un peso molecular de 98,8 kDa (Misrahi et al., (1987). La protena RPg est constituida por varios dominios estructurales y funcionales designados con las letras A,B,C, D y E, codificados por 8 exones del DNA del gen. La regin A/B en el extremo amino-terminal rica en prolina posee dos dominios de activacin transcripcional, AF3 y AF1. La regin C bsica, por su alto contenido de cistena, constituye el dominio de unin al DNA. La regin E situada en el extremo carboxiterminal contiene el dominio de unin al ligando y representa, a su vez, un dominio de activacin transcripcional dominio AF2.
Dos isoformas del RPg, la RPg-A y la RPg-B, han sido identificadas en tejido mamario normal y en neoplasias. La isoforma RPg-A corresponde a la forma truncada de la RPg-B por delecin de 164 aminocidos en la regin NH2-terminal. Dos promotores distintos del mismo gen bajo el control estrognico generan los productos de transcripcin de ambas isoformas; la A se origina por inicio de la transcripcin en AUG2 (codon 164) y la B en AUG1 (Kastner et al.,
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1990). El anlisis de los RNAm demostr que la isoforma A carece del extremo 5 situado por delante de AUG1 (Figura 4). La transcripcin para esta isoforma se inicia en +737 y +842 (promotor localizado entre +464 y 1105), mientras que para la isoforma B el sitio de inicio se sita entre +1 y +15 (promotor entre 711 y +31).
La RPg-A y la RPg-B activan la transcripcin de genes que poseen un elemento de respuesta a la progesterona (PRE), sin embargo, ambas exhiben diferentes funciones biolgicas dependiendo del tipo de clula y de las regiones promotoras en los genes. En las clulas donde el RPg-A es transcripcionalmente inactivo esta isoforma acta como un inhibidor de la funcin del RE-dependiente de progesterona (dominante negativo), as, la coexpresin del RE con la isoforma A, pero no con la isoforma B, causa una inhibicin de la transcripcin de genes mediada por el RE (McDonnell y Goldman, 1994). El RPg-B funciona como un activador transcripcional de los genes de respuesta a la progesterona. La interaccin de ciertos antiprogestgenos con el tercer dominio de activacin transcripcional de la isoforma B explica los efectos agonistas producidos por estos agentes (Horwitz et al., (1995). La isoforma A puede ejercer un efecto represor sobre la isoforma B y el RE (Chalbos y Galtier, 1994; Kraus et al., 1995). Las mutaciones creadas experimentalmente en la regin carboxi-terminal han desvelado que la represin inducida por la isoforma A sobre el RE depende de su expresin absoluta, de este modo, parece que la accin inhibitoria ejercida sobre el RE es la consecuencia de la interaccin no competitiva de la isoforma A con diferentes dianas celulares o con distintos sitios de contacto en la misma diana (Wen et al., 1994). Estos autores consideran que la RPg-A facilitara la comunicacin ligando-dependiente entre diversas vas de sealizacin de los receptores esteroideos dentro de una clula.
Chalbos y Galtier (1994) sealan que la expresin diferencial de las isoformas del RPg podra explicar la inhibicin tisular especfica causada por los progestgenos sobre los genes dianas del estrgeno. Estos autores transfectaron de manera independiente una de las dos isoformas del RPg y el RE en la lnea celular MDA-MB231, exponindolas posteriormente a la accin del progestgeno R5020. Pudieron constatar que este agente produjo una inhibicin de la transcripcin de genes inducidos por el estradiol, el pS2 y la Catepsina D, slo en las clulas que expresaban la isoforma B; efecto que fue confirmado en otras lneas celulares que expresaban la misma isoforma. En cambio, cuando se transfectaron ambas isoformas en una misma clula, la inhibicin dependi del radio de expresin RPg-A/RPg-B; en este caso en concreto, se objetiv un efecto dominante de la isoforma B sobre la A.
FIGURA 4. RECEPTOR DE PROGESTERONA
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ATG-B
TGA
DNA
ATG-A
TGA
RPg-B
NH2
A/B
_______AF3/AF1_______
E
____________AF2_____________
COOH
_Unin_ DNA
__Unin al ligando__
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Por otra parte, Kraus et al., (1995), investigaron el efecto inhibitorio sobre la transcripcin dependiente del RE inducida por la accin de los agonistas y antagonistas del receptor de progesterona. Comprobaron que ambas isoformas de manera ligando-dependiente pueden actuar como potentes inhibidores de la actividad del RE. La magnitud de la represin dependi de la clase de isoformas (RPg-A RPg-B), de los niveles de RPg y de la concentracin y tipo de ligando. La regin promotora del gen diana fue de vital importancia para determinar tanto la magnitud como la especificidad de la isoforma, as, la RPg-A ocupada por un ligando produjo una mayor inhibicin de la transcripcin mediada por el RE en comparacin con la unin ligando-RPg-B. Sin embargo, la represin de la transcripcin fue mayor en los casos en que el receptor de progesterona fue ocupado por un antogonista. Se sugiere que el complejo RPgligando inhibe la actividad del RE impidiendo la interaccin de ste con la maquinaria transcripcional. Cuando se inducen mutaciones en el dominio A/B del RE que impiden su fosforilacin a este nivel, se incrementa el efecto inhibitorio de la transcripcin del RE causado por la ocupacin de un ligando en el RPg. En el caso del RPg la sustitucin de sus residuos en la posicin 11-beta-fenilo caus una intensa represin de la actividad de transcripcin del RE. La alteracin de la estructura de los ligandos de RE y de su elemento de respuesta careci de efecto sobre esta represin. Estos datos refuerzan el concepto que el RPg ocupado por un ligando produce una interferencia que impide la adecuada interaccin del RE con la maquinaria transcripcional. Ms importante an, todo parece indicar que esta represin ocurre posteriormente a la conversin del RE a una forma transcripcionalmente activa, es decir, cuando el RE ya ha sido ocupado por un ligando (Kraus et al., 1997).
La expresin normal del RPg depende de la estimulacin del RE por el estradiol y, por tanto, de una va de sealizacin estrognica funcionalmente activa (Horwitz y McGuire, 1978; Clark et al., 1983). En el tejido mamario los estrgenos y la progesterona por mecanismos directos e indirectos son capaces de estimular la proliferacin celular. En la fase ltea del ciclo menstrual se produce una alta tasa de actividad mittica con una notable disminucin del nmero de receptores de estrgeno y un aumento de la actividad sulfatasa, enzima que convierte la estrona sulfato en estradiol. En cambio, los niveles de los receptores de progesterona se mantienen elevados durante el ciclo menstrual. La administracin conjunta de estrgenos y progestgenos, en comparacin con la administracin individual de estradiol, produce una mayor proliferacin celular, una disminucin de los RE y un aumento del RNAm del factor de crecimiento insulnico. La presencia del IGF-1 sugiere la participacin de otras vas indirectas en la proliferacin del tejido mamario. La progesterona ejerce una notable influencia en la funcin y crecimiento de las clulas mamarias normales, siendo uno de sus principales efectos regular la actividad estrognica produciendo una disminucin de la expresin de los RE y la induccin de
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enzimas que metabolizan el estrgeno para convertirlos en productos con baja actividad estrognica (Clarke y Sutherland, 1990; Graham y Clarke 1997). Kroman et al., (2000) analizaron las fluctuaciones que se producen en los receptores hormonales en funcin del ciclo menstrual y su relacin con cambios en los factores de pronstico en 1060 pacientes con cncer de mama. Estas enfermas presentaban menstruaciones regulares, no utilizaban hormonas y la ciruga se realiz en un solo paso. No se encontr una relacin significativa entre las fluctuaciones hormonales que se producen durante el ciclo menstrual y el estado de los RE y RPg en las clulas cancerosas, como tampoco, variaciones en el ndice mittico, el tamao del tumor y la afectacin de los ganglios axilares.
Los progestgenos inhiben in vivo la proliferacin de clulas epiteliales mamarias normales y de las clulas de cncer de mama in vitro. La progesterona ejerce un efecto bifsico sobre la proliferacin de las clulas de cncer de mama estimulando el crecimiento en la primera fase del ciclo y provocando un arresto en G1/S. Formby y Wiley (1998) utilizando dos lneas celulares diferentes, la T47-D (RPg+) y la MDA-231 (RPg-), expuestas a altas concentraciones de progesterona (10 microM durante 72 horas) similares a las observadas durante el tercer trimestre del embarazo, demostraron un efecto inhibitorio del 90% de la actividad proliferativa por induccin de la apoptosis en la lnea celular que expresaba el RPg (T47-D). No objetivaron ninguna respuesta en las clulas MDA-231 carentes del RPg. Un 48% de las clulas sufrieron apoptosis; efecto que se relacion con una disminucin de la expresin del bcl-2 y un aumento de la expresin de la p53. Lin et al., (1999) tambin confirmaron el efecto inhibitorio de la progesterona sobre la sntesis de DNA. Para poder estudiar los efectos de la progesterona de manera independiente de la va de sealizacin estrognica (RE y EREs) transfirieron vectores RPg a clulas MDA-MB231 (RE-/ RPg-). De este modo, pudieron demostrar que la progesterona inhibe de manera dosis-dependiente la sntesis del DNA, produciendo un arresto de las clulas en G0/G1. Constataron adems, que este efecto poda ser revertido si se administra un anti-progestgeno. Este estudio experimental es importante porque demuestra que la progesterona puede ejercer una inhibicin del crecimiento celular si se restituye el gen RPg en clulas RE- y RPg-. Lin et al., (2000) empleando un modelo idntico observaron que la progesterona induce cambios en la morfologa celular y la adhesibilidad de las clulas de cncer de mama. Las clulas en medio de cultivo tratadas con progesterona adquirieron una forma aplanada y, aunque se extendieron ampliamente sobre la superficie, se mantuvieron unidas. Este efecto se asoci con un aumento del nmero de fibras de estrs, de los contactos focales entre clulas y del citoesqueleto de actina. Se objetiv adems, un incremento en la actividad de las cinasas y de las protenas de adhesin fosforiladas en tirosina. La protena beta1-integrina fue fundamental en la formacin del citoesqueleto de actina. Este estudio muestra la implicacin de
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la progesterona en el fenmeno de adhesibilidad celular y su probable relacin con el desarrollo de metstasis.
Varios estudios experimentales avalan la importancia de las vas proliferativas dependiente del RPg en la tumorognesis mamaria. Montecchia et al., (1999) a travs de la administracin de MPA (medroxiprogesterona) a ratones hembras BALB/c lograron inducir adenocarcinomas ductales mamarios con elevada expresin de RE y RPg. Despus de varias fases de crecimiento pudieron seleccionar un grupo de clulas tumorales capaces de crecer en ausencia de progesterona (IP), pero que continuaban expresando el RE y el RPg. La exposicin de estas clulas a los estrgenos y a los antagonistas del RPg (onapristona y mifepristona) caus una completa regresin tumoral. Concluyeron que la va del RPg es esencial en el crecimiento de tumores IP. Lydon et al., (1999) mediante modelos de carcinognesis experimental empleando en ratones la tcnica de destruccin de genes, tambin comprobaron la importancia del RPg como mediador de las vas de sealizacin intracelular esenciales para el inicio y desarrollo de tumores mamarios inducidos por el DMBA (7,12-dimetilbenzeno antraceno).
Hay evidencias que muestran la convergencia de la progesterona y las vas de sealizacin de los factores de crecimiento y ciclinas a mltiples niveles. Richer et al., (1998) han demostrado en lneas celulares de cncer de mama que la progesterona regula los niveles de las protenas Stat5a, Stata5b, Stat1 y Stat3 (transductores de seales y activadores de la transcripcin) necesarios para el crecimiento y diferenciacin celular. Los Stat son factores de transcripcin latentes citoplsmicos que pueden ser activados en respuesta a molculas de sealizacin de la membrana celular. El Stat5 se transloca al ncleo al ser fosforilado en su residuo 694 por accin de la progesterona. La progesterona tambin aumenta la capacidad de la prolactina para estimular la actividad del Stat5 en el promotor de la beta-casena. La progesterona y el EGF de manera sinrgica controlan la transcripcin de p21 y los promotores de c-fos. Lange et al., (1998) observaron que la exposicin de clulas de cncer mamario al progestgeno R5020 induca un aumento en los niveles de EGFR, C-erbB-2 y C-erbB-3 a travs de la fosforilacin en tirosina de las molculas de sealizacin estimuladas por el EGF. Este agente, de manera independiente del EGF, produjo un aumento de los niveles de Stat 5, la asociacin de Stat5 con protenas con residuos de fosfotirosinas y la fosforilacin de JAK2 y Shc. Entre otros efectos, los progestgenos potenciaron la actividad de las cinasas estimuladas por EGF (MAPK, p38 MAP) y JNK. Los niveles de ciclina D1, E y p21 se incrementaron bajo la accin del R5020, pero tambin lo hicieron de manera sinrgica con el EGF. Miller et al., (1997) desarrollaron 2 lneas celulares de cncer de mama que expresaban establemente, bien el RPg-A el RPg-B. A un grupo de cada lnea celular se les trat o no con el agente R5020 y se
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determinaron los productos de transcripcin generados. Unicamente se detectaron 2 RNAm en las variantes RPg-B, uno de ellos expresado de manera independiente del ligando. El R5020 indujo un tercer mensaje en las clulas RPg-B que codificaba la flavina-5 monoxigenasa (FMO5), enzima implicada en la activacin metablica de ciertas drogas, incluida el tamoxifn. Este hallazgo supone que la progesterona podra incrementar el efecto carcinognico del tamoxifn en aquellos tejidos que sobreexpresan la isoforma B. Owen et al., (1998) han demostrado que la progesterona regula la transcripcin del inhibidor de la cinasa dependiente de ciclinas (p21). A pesar de la falta de un elemento de respuesta progestgeno (PRE) en el promotor de este gen, la progesterona induce la transcripcin de p21. La progesterona interacciona con el promotor p21 de manera indirecta por medio del factor de transcripcin Sp1 (sitios de unin 3 y 4) y con CBP/p300 formando un complejo multiproteco. La convergencia de varias vas de sealizacin sobre este promotor, segn estos autores, explicara el porqu la progesterona puede inducir la proliferacin o diferenciacin en diferentes dianas celulares.
En las clulas de cncer de mama la exposicin a progesterona induce una rpida disminucin de ms del 95% de sus receptores en aproximadamente 6 horas. La destruccin del RPg se realiza a travs de dos rutas alternativas. Una de ellas es independiente de la unin con el ligando e implica la rpida degradacin de intermediarios RPg a travs de la va del proteasoma 26S. La otra ruta ms especifica depende de un mecanismo mediante el cual la unin con el ligando activa la fosforilacin del RPg en el residuo serina 294 por las MAPs cinasas (p42 y p44). La fosforilacin de este residuo es fundamental para dirigir el RPg a su degradacin por el proteasoma 26S (Lange et al., 2000).
Una menor proporcin de mujeres postmenopusicas expresan el RPg en comparacin con las premenopusicas, efecto que ha sido atribuido a una disminucin de los niveles sricos de estradiol necesarios para una adecuada estimulacin del RE y la consiguiente expresin inducida del RPg (Clark et al., 1984; Thorpe, 1988; Helin et al., 1988; Ferno et al., 1990; Romain et al., 1995). Sin embargo, el anlisis de la concentracin de estradiol en el tejido mamario de las postmenopusicas muestra ser similar a las observadas en mujeres premenopusicas, probablemente por la capacidad que posee el tejido mamario de sintetizar localmente el estradiol (van Landeghem et al., 1985). De la misma manera los fenotipos tumorales RE+/RPg- son mas frecuentes en postmenopusicas y los RE-/RPg+ en pacientes jvenes (Thorpe et al., 1988; Bonnier et al., 1995). Thomlinson et al., (1996) sealan que la falta de expresin del RPg en algunos tumores podra estar en relacin con la prdida de heterocigocidad en la regin 11q22, un rea inestable con prdidas frecuentes observadas en el cncer de mama (Carter et al., 1994; Hampton et al., 1994). En cambio, Mialhe et al., (1999),
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que analizaron mediante FISH el cromosoma 11 en 15 pacientes con cncer de mama, no objetivaron diferencias en el nmero de cromosomas 11 en tumores RPg+ o RPg-. Para estos autores, la ausencia de expresin del RPg en algunos cnceres no puede ser explicada nicamente por deleciones en ste cromosoma.
El anlisis simultneo de la expresin del RPg en el tumor primario y sus metstasis concuerda en el 70-90% de los casos (Gross et al., 1984; Coradini et al., 1984; Li et al., 1994). Sin embargo, algunos trabajos describen una prdida progresiva de expresin del RPg durante el proceso de diseminacin tumoral y como sta se relaciona con un peor pronstico y resistencia al tratamiento hormonal. Kuukasjarvi et al., (1996) determinaron la expresin de RE y RPg en los tumores primarios y sus metstasis en 50 pacientes sin tratamiento adyuvante. En 18 casos (36%) se observ el cambio de expresin ocasionado por la prdida de positividad del RE en 6 casos, del RPg en 6 cnceres y de ambos en otros 6 casos. La prdida de expresin del RE se relacion con una pobre respuesta al tamoxifn. Balleine et al., (1999) estudiaron la expresin del RE y RPg en los cnceres primarios y los secundarios y entre los primarios y sus metstasis ganglionares. El 63,3% de los tumores primarios fueron RE+ en comparacin con el 45,3% de los secundarios y el 53,7% de los primarios RPg+ frente al 33,1% de los secundarios, siendo estas diferencias significativas. Al dividir las enfermas segn el estado menopusico, objetivaron una disminucin significativa de la expresin de RPg en las postmenopusicas. Las pacientes premenopusicas mantuvieron los mismos fenotipos hormonales en los cnceres primarios y secundarios. En cambio, en las postmenopusicas el fenotipo predominante en el primario fue RE+/RPg+ observando un importante aumento de los fenotipos RE-/RPg- y RE+/RPg- en los secundarios. El anlisis multivariante confirm que la expresin del RPg era ms comn en los tumores primarios que en los secundarios independientemente de la edad y el estado del RE. El examen de los tumores primarios y sus metstasis ganglionares objetiv una elevada concordancia para el RE (92%) y el RPg (93%). nicamente 4 de 27 tumores primarios RPg+ (14,8%) presentaron metstasis ganglionares RPg-. Concluyeron sobre la base de estos resultados que la expresin de los receptores se mantiene estable durante la progresin de la enfermedad y la ausencia de expresin del RPg en los tumores primarios en estos casos se relaciona con progresin de la enfermedad, es decir, los primarios RPg- son ms susceptibles de de desarrollar metstasis.
Los cnceres primarios de pacientes sometidos a tratamiento endocrino experimentan en algunos casos una significativa reduccin de los niveles del RPg en sus metstasis, de tal modo, que la desaparicin de la positividad del receptor podra ser atribuida al tratamiento hormonal (Nomura et al., 1985; Encarnacin et al., 1993). Gross et al., (1984) observaron una prdida de
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expresin del RPg de un 44% a un 11% entre el primario y sus metstasis ganglionares. La terapia endocrina influy notablemente en la ausencia de expresin, puesto que un 56% de tumores inicialmente RPg+ se convirtieron en RPg- tras el tratamiento hormonal. Jakesz et al., (1985) tambin objetivaron una falta de concordancia del 25% entre los niveles de RPg en el primario y las metstasis ganglionares. En el caso del RE la discordancia fue de un 15%. Esta diferencia se increment notablemente (55% para RE y 84% para RPg) entre la primera biopsia y la segunda realizada despus de haber recibido tratamiento hormonal. Del mismo modo, Raemaekers et al., (1984) analizaron el grado de concordancia del RE y RPg mediante biopsias secuenciales en 75 pacientes con cncer de mama avanzado. Encontraron una falta de concordancia en el 18,7% de los casos de tumores RE y en el 28% de los casos de tumores RPg.
En funcin del pronstico algunos autores consideran al RPg de mayor valor que el RE. La falta de expresin del RPg se ha relacionado con progresin de la enfermedad y con la prdida de la funcionalidad del RE. Para Saez et al.,(1983), a largo plazo, el RPg fue de mayor valor pronstico que el RE en pacientes que no recibieron tratamiento adyuvante. En el anlisis de 148 cnceres de mama objetivaron un 9% de recidivas en tumores RPg+ frente al 24% en tumores RPg-; en ausencia de afectacin ganglionar recidivaron 6/61 tumores, 5 de estas recidivas correspondan a tumores RPg-. Clark et al., (1983), en el anlisis multivariante de 189 cnceres de mama, citan que el RPg fue significativamente de mayor valor que el RE para predecir la recidiva en el estadio II. Di Fronzo et al., (1984) estudiaron el valor pronstico del RPg en un subgrupo de 187 pacientes (total = 1144) sometidas a mastectoma exclusivamente. A los 36 meses de seguimiento los tumores RPg- tuvieron un peor pronstico en comparacin con los tumores RPg+. Thorpe et al., (1987) analizaron el valor pronstico del RE y RPg en 807 cnceres de mama con ganglios negativos. Durante el seguimiento (mediana de 50 meses) no observaron diferencias en el intervalo libre de enfermedad entre tumores RE+ y RE-. En cambio, los tumores RPg+ presentaron un intervalo libre de enfermedad significativamente superior a los tumores RPg-. La positividad para el RE y RPg fue de valor pronstico nicamente en pacientes premenopusicas, aunque en el anlisis multivariante el pleomorfismo nuclear fue la nica variable con verdadero valor pronstico. Bernoux et al., (1998) examinaron 529 cnceres RE- encontrando en este grupo 62 tumores RPg+ (12%). Los tumores RE-/RPg+ fueron de menor tamao, de grado histolgico 1 y tuvieron un mayor intervalo libre de enfermedad y supervivencia en comparacin con tumores RE-/RPg-. Castagnetta et al., (1999) no objetivaron diferencias en los patrones de tincin IHQ para el RPg entre premenopusicas y postmenopusicas, pero s advirtieron una mayor supervivencia libre de enfermedad en aquellos tumores RPg+.
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La ausencia de expresin del RPg tambin se ha relacionado con un aumento del tamao tumoral, con la presencia de metstasis ganglionares, con un aumento de expresin del C-erbB2, EGFR y p53 y con una disminucin de los niveles de pS2, Catepsina D y Bcl-2 (Gross et al., 1984; Thorpe et al., 1988; Thor et al., 1992; Frankfurt et al., 1997; Thor et al., 1992; Gion et al., 1995).
La respuesta a la terapia endocrina se ve favorecida por la presencia del RPg. McGuire et al., (1982) citan el valor pronstico del RPg y sugieren que es un mejor indicador de respuesta al tratamiento hormonal que el RE. Un 78% de respuesta a la terapia endocrina se objetiv en tumores RE+/RPg+ frente al 38% observada en tumores RE+/RPg- (Horwitz, 1981). Para Alanko et al., (1985) la mayor supervivencia observada en pacientes con receptores hormonales positivos se debi a la buena respuesta al tratamiento endocrino. Nardelli et al., (1986) tambin analizaron la respuesta al tratamiento hormonal entre 1548 cnceres de mama (RE: n=263 y RPg: n=224). Esta se produjo en el 76% de los tumores RE+/RPg+, en el 28% de los RE-/RPg+ y tan solo en el 3,1% de los tumores RE+/RPg-. Segn Vollenweider-Zerargui et al., (1986) el receptor de estrgeno fue un marcador de pronstico ms sensible que el RPg, especialmente en el estadio II o con afectacin de ms de 3 ganglios. Los porcentajes de prediccin de respuesta a la terapia endocrina fueron de un 77% cuando se expresaba el RE, un 69% con la expresin de RPg y de un 79% cuando se expresaban ambos receptores. Ferno et al., (2000) valoraron el beneficio de dar tamoxifn durante 2 5 aos en funcin de la expresin de los RE y RPg a pacientes postmenopusicas con cncer ductal infiltrante en estadios precoces. Este estudio demostr que las pacientes con RE+ y RPg+ se beneficiaron significativamente del tratamiento prolongado (5 aos) con tamoxifn. Un importante nmero de pacientes que recidivaron recibiendo tamoxifn tenan tumores con receptores hormonales negativos. En el grupo en tratamiento prolongado se objetiv una disminucin de la tasa de recidivas en funcin de los niveles del RPg (elevadas vs baja, baja vs negativa). El tratamiento durante 5 aos con tamoxifn fue beneficioso para pacientes con tumores RE+/RPg+, pues estas pacientes gozaron de una mayor supervivencia libre de enfermedad.
El RNAm producto de la transcripcin de los genes RE y RPg sufre una serie de separaciones alternativas que dan origen a una amplia variedad de isoformas RNAm. Algunas han sido identificadas en tejido mamario normal y neoplsico, aunque el significado y funcin de algunas de ellas no se conoce an con exactitud. Mediante amplificacin por PCR y anlisis de secuencia del RPg y sus isoformas, Leygue et al., (1996) aislaron en tejido mamario normal y en neoplsico las variantes RPg-RNAm por delecin del exon 4, delecin del exon 6, doble delecin del exon 3 y doble delecin del exon 5 y 6. Yeates et al., (1998) identificaron una
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pequea protena de 78 kDa, la RPg78 kDa. Esta protena diferente de las isoformas RPg A y B careca de la porcin amino-terminal y era capaz de unir un ligando. Se desconoce su funcin exacta. Richer et al., (1998), en extractos de cnceres de mama, tambin aislaron diversas variantes del RPg-RNAm por delecin del exon 2 (RPg delta 2), del exon 4 (RPg delta 4), del exon 6 (Rpg delta 6) y de los exones 5 y 6 (RPg delta 5,6). Estas variantes contienen deleciones de secciones que codifican dominios de unin al DNA y dominios de unin al ligando. Las variantes delta 6 y delta 5,6 mostraron ser inhibidores transcripcionales de los receptores RPg-A y RPg-B.
La variante delta 6 originada por una delecin del exon 6 codifica un RPgA y B truncado en el dominio E que corresponde a la regin de unin del ligando y donde se encuentra uno de los dominios de activacin transcripcional (AF2). La delta 6 es capaz de unirse al elemento de respuesta del RPg que une al DNA ejerciendo una actividad dominante negativa sobre la transcripcin inducida por RPg-A y RPg-B. Leygue et al., (1999) analizaron la variante delta 6RPg-RNAm en 10 muestras de tejido mamario sano, en 9 cnceres con elevado contenido de RPg (> 100 fmol/mg prt) y en 8 cnceres con bajo contenido de RPg ( 15 < fmol/mg prt). Este receptor alterado se encontr en mayores concentraciones en las neoplasias que en la glndula mamaria sana y en tumores RPg- con relacin a tumores RPg+. La importancia en la clnica deriva de su probable interferencia con la deteccin del RPg en las pruebas inmunohistoqumicas y su posible implicacin en la tumorognesis. Asimismo, Balleine et al., (1999) examinaron conjuntamente las variantes RE-RNAm y RPg-RNAm en cnceres de mama RE+ exclusivamente. En 35 cnceres RE+ se detectaron las variantes RE-RNAm por: delecin del exon2 y por delecin del exon 7 en el 100% de los tumores; por delecin del exon 4 en el 94% y por delecin del exon 5 en el 83%. En 25 de estos casos que tambin presentaban positividad para el RPg se detectaron en ms del 90% de estos tumores las siguientes variantes RPg-RNAm: delecin del exon 4; delecin del exon 6; doble delecin del exon 4,2 y una variante con parte de delecin del exon 4. Objetivaron mayores niveles de expresin de las variantes del RE-RNAm que de las RPg-RNAm, siendo la RE-delta 7 la ms abundante con niveles que variaron entre el 29 y 83% con respecto al RE silvestre. Las variantes RPg-RNAm representaron menos del 10% de expresin en comparacin con los niveles del RPg silvestre. Segn las experiencias de estos autores, en el cncer de mama, estas variantes son tan comunes y diversas que su utilidad como discriminadores de respuesta hormonal plantea serias dudas. Adems, la baja expresin de alguna de ellas pone en tela de juicio el impacto que puedan ejercer sobre la funcin del receptor.
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pS2/TFF 1.
La MCF-7 es una lnea celular aislada del derrame pleural de un cncer de mama humano ampliamente estudiada y fundamental en diversos estudios experimentales, debido a su propiedad de expresar los receptores de estrgeno y progesterona, y que depende del estradiol para lograr un adecuado crecimiento. Masiakowsky et al., (1982) aislaron por clonacin, en esta lnea celular, un DNA complementario cuyo RNA mensajero correspondiente era inducido por estimulacin con estradiol. Jakowley et al., (1984), del mismo laboratorio, completaron la secuencia completa del RNA mensajero de 600 pares de bases y demostraron que la protena codificada por este gen corresponda a un polipptido de 84 aminocidos y de 10 kDa de peso molecular. El tratamiento de las clulas MCF-7 con estradiol indujo la aparicin precoz (15 minutos) de pS2-RNAm; efecto que no pudo ser abolido tras exposicin a inhibidores de la sntesis proteica (Brown et al., 1984).
El polipptido traducido por el RNA mensajero posea una seal peptdica que supona su divisin en dos unidades antes de ser exportado al exterior de la clula. Esta nueva protena no guardaba similitud con ninguna otra ni con ningn factor de crecimiento. Marcando con aminocidos radioactivos diferentes secuencias del polipptido, Nuez et al., (1987), demostraron que la protena madura era secretada al exterior de la clula. La separacin del polipptido se produca en la seal peptdica por rotura enzimtica en el extremo N terminal despus de la alanina nmero 26, dando origen a una protena final de 58 aminocidos y 6.45 kDa de peso molecular.
La protena pS2/TFF-1 pertenece a una familia de pptidos (TFF-1, TFF-2, TFF-3) presentes en diferentes fuentes biolgicas relacionadas entre s por su similitud estructural y por poseer caractersticas similares al factor de crecimiento insulnico (FCI) y al polipptido espasmoltico pancretico, PSP/TFF-2, (Thim et al., 1985, Baker et al., 1988, Rose et al., 1989). La pS2/TFF1 fue aislada en el jugo gstrico y en el medio de cultivo de la lnea celular de cncer de mama MCF-7. El polipptido espasmoltico pancretico (PSP/TFF2) de 106 aminocidos, fue separado en el jugo pancretico porcino y otro pptido similar de 49 50 aminocidos se identific en la epidermis de la rana Xenopus laevis (Thim 1988). Una caracterstica comn de estos pptidos es la presencia de uno o dos dominios altamente conservados de 40 aminocidos que contienen 6 residuos de cistena casi en la misma posicin. De este modo, el dominio protenico incluye 3 puentes disulfuro que le confieren 3 estructuras en forma de asa dando origen a una configuracin muy caracterstica similar a una hoja de trbol (Chadwick et al., (1997). Polshakov et al., (1995), al determinar la estructura tridimensional del pS2/TFF-1 mediante espectroscopia por RMN, objetivaron un dominio en forma de trbol constituido por
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tres uniones disulfuro en los pares 1-5, 2-4, y 3-6 de los residuos de cistena y una pequea estructura secundaria en forma de hlice alfa empaquetada contra dos bandas antiparalelas de lmina beta. Este dominio constituye la cabeza compacta de la molcula y fuera de ella las bandas amino y carboxilo-terminal estn estrechamente relacionadas formando una cola extendida con una estructura parcial en forma de lmina beta. Esta protena puede formar dmeros merced a sus residuos libres en la posicin carboxi-terminal (Newton et al., 2000).
El pS2-RNAm/TFF-1 consta de 3 exones. El dominio de trbol es codificado por el exon 2. Los genes TFF-1, TFF-2 y TFF-3 estn localizados dentro de una regin de 55 kb en el cromosoma 21, en la posicin 21q22.3 (Jabowlew et al., 1984; Jelftsch et al., 1987; Seib et al., 1997). Los genes TFF-1 y TFF-2 se encuentran a una distancia de solo 12,5 kb y, todo parece indicar que, los dos se originan por duplicacin y comparten elementos reguladores comunes (May y Westley 1997).
Se ha demostrado en la lnea celular MCF-7 (Thim, 1988) y HCT116 (Hoosein et al., 1989) un aumento dosis-dependiente de la incorporacin de 3[H]timidina tras la administracin de PSP/TFF-2 sugiriendo que el polipptido espamoltico pancretico posee la propiedad de estimular el crecimiento. Kida et al., (1989) y Tomasetto et al., (1989) confirmaron que la pS2/TFF-1 es inducida por los estrgenos pero, a diferencia del PSP/TFF-2, fue incapaz por si misma de estimular el crecimiento de clulas cebadas con estradiol. Neri et al., (1991) objetivaron la induccin del pS2-RNAm por D-Trp6-GNRH (anlogo de la hormona liberadora de gonadotropina); sin embargo, la expresin de la protena no tuvo efecto sobre el crecimiento celular.
Roberts et al., (1988) confirmaron, en las clulas MCF-7, que el gen pS2 era inducido por los estrgenos. El estradiol, al unirse a su RE, estimula la activacin o transcripcin del gen pS2/TFF-1 a travs de su unin con un ERE (elemento de respuesta estrognico) que interacciona con el extremo 5 del gen. La regin -3000 a + 10 pares de bases acta como un promotor inducible por los estrgenos. En esta interaccin segn, Stack et al., (1988), interviene la regin N terminal (dominios A y B) del RE a travs del ERE-pS2 (elemento de respuesta al estrgeno-pS2). Giamarchi et al., (1999) han descubierto en el extremo 5del gen dos sitios hipersensibles a las DNAasas inducidos por los estrgenos y el FCI 1: el pS2-HS1 localizado en la regin promotora proximal y el pS2-HS4 localizado a 10. Kb del sitio CAP. Existe otro sitio pS2-HS2 situado inmediatamente despus del pS2-HS1 y que ha sido identificado en lneas celulares que carecen del receptor de estrgeno. La secuencia 5 del gen contiene regiones con elementos de respuesta que interaccionan con los estrgenos, con el 12-0-tetradecanoil-forbol-
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13-acetato (TPA), con el EGF, con c-Ha-ras, y con c-jun. Cavailles et al., (1989) objetivaron la induccin del RNAm de la catepsina D y pS2 por diversos factores en las clulas MCF-7. El TPA produjo una induccin de hasta 8 veces el pS2-RNAm, el EGF 4 veces, y hasta 3 veces el factor de crecimiento de los fibroblastos, el factor de crecimiento insulnico tipo I y la insulina. Tanto el EGFcomo el factor de crecimiento transformante alfa y el FCI-1 fueron capaces de inducir el pS2-RNAm en ausencia de estradiol, sin embargo, se requiri de la presencia de un RE intacto (El-Tanani y Green 1997). El rojo fenol, debido a su dbil actividad estrognica, tambin estimul la produccin de pS2-RNAm y la sntesis proteica, efecto que fue inhibido por el tamoxifn (Berthois Y et al., 1986). La induccin de la sntesis de pS2 por mecanismos diferentes a la estimulacin estrognica podra explicar su presencia en aquellos tejidos que carecen del RE y en tumores de mama RE negativo.
La pS2/TFF-1 es una protena estable, normalmente secretada en el estmago y aislada ectpicamente en lesiones inflamatorias de los tractos gastrointestinal y respiratorio y en diferentes cnceres. Es un factor pleiotrfico que interviene en la motilidad celular, polimerizacin de la mucina y en la proliferacin y diferenciacin celular (Lugmani et al., 1989; Tomaseto et al., 1990; Hanby et al., 1993; Itoh et al., 1996; Lefebvre et al., 1996; Hirota et al., 2000; dos Santos Silva et al., 2000). La pS2 es secretada normalmente en la glndula mamaria, (Poulson et al., 1997) en estmago (cuerpo y antro gstrico) y en intestino delgado (Rio MC et al., 1988). Sus funciones no estn totalmente definidas pero se considera implicada en la proteccin de las mucosas, en los mecanismos de defensa mucociliar respiratorio contra agentes antimicrobianos, estabilizacin de la capa de moco y en la cicatrizacin del epitelio (Hanby et al., 1993; dos Santos Silva et al., 2000; Itoh et al., 1996; Lefebvre et al., 1996). Se detectan mayores concentraciones de pS2 en tejido mamario sano de mujeres premenopusicas que en postmenopusicas. Khan et al., (1997) observaron en 69 pacientes con carcinoma mamario una mayor expresin de la protena durante la fase ltea del ciclo menstrual. Por el contrario, Pujol et al., (1999) registraron mayores concentraciones durante la fase folicular del ciclo celular en una muestra de 339 mujeres con cncer de mama.
La determinacin de la pS2/TFF1 se realiza por mtodos inmunoenzimticos, inmunorradiomtricos, inmunohistoqumicos e hibridacin in situ. Las concentraciones citoslicas de la protena varan en el epitelio mamario sano y en el neoplsico. Mediante ELISA, Predine et al., (1992) objetivaron en la glndula mamaria sana concentraciones que oscilaron entre 0 y 2,16 ng/mg, elevndose esta cifra en los cnceres. Segn Hhnel et al., (1993) las concentraciones citoslicas de pS2 en el tejido mamario sano fluctuaron entre 0 y 10,5 ng/mg (mediana:0,2), en comparacin con los tumores malignos que oscilaron entre 0,3 y
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43 ng/mg (mediana: 5,7). Por IHQ los porcentajes de tincin positiva en las neoplasias malignas varan entre un 46% 77%, observndose un patrn de tincin citoplsmico a nivel de la membrana celular. Existe una buena correlacin entre los mtodos inmunorradiomtricos e inmunohistoqumicos, segn citan Detre et al., (1994), al comparar ambas tcnicas en 35 biopsias de cncer de mama. La tincin positiva para pS2 se relacion con la presencia del RE en las pacientes con una edad igual o inferior a los 50 aos y tambin, aunque en menor proporcin, con el receptor de progesterona.
La protena ha sido detectada en tumores malignos de mama, pncreas, vescula biliar, colon, estmago, endometrio, cervix uterino, ovarios con diferenciacin mucinosa, vejiga, prstata y en tumores neuroendocrinos (Henry et al., 1991; Seitz et al., 1991; Lugmani et al., 1992; Wang et al., 1997; Saegusa et al., 2000). El pS2-RNAm se encuentra en mayor cantidad en tejido cancergeno mamario que en tejido sano, mientras que en el tejido neoplsico gstrico ocurre lo contrario, existiendo una correlacin inversa con el grado de diferenciacin tumoral; as, la metaplasia intestinal y los adenocarcinomas gstricos presentan niveles disminuidos de pS2. (Lugmani et al., 1989; Fujimoto et al., 2000). En el cncer de mama la expresin de la protena es mayor en los carcinomas intraductales (54%) que en los infiltrantes (27%) y mayor en los comedocarcinomas en comparacin con otros tipos histolgicos. Segn sealan Yamakawa et al., (1995), existen diferencias en la expresin del pS2 en distintas zonas del mismo tumor, al observar variaciones en el patrn de tincin en diferentes zonas tumorales. La tincin IHQ de 40 cnceres de mama revel un 52,5% de tincin positiva en el rea central del componente infiltrante, un 77,5% de inmunotincin en el rea central del componente intraductal y un 85% de tincin positiva en la zona que est por delante del componente intraductal.
Inicialmente los estudios sobre la pS2 fueron dirigidos al anlisis de los mecanismos moleculares reguladores de la actividad estrognica y la pS2, junto con la catepsina D, se ha utilizado en diversos experimentos para valorar y medir la integridad de las vas de sealizacin dependiente del RE (Westley et al., 1984; Cavailles et al., 1989; Lane et al., 1999). En el cncer de mama la expresin de pS2 se ha relacionado directamente con la edad, el estado premenopusico, el grado de diferenciacin tumoral, la afectacin ganglionar axilar, la presencia de RE y RPg, Hsp27, la expresin del oncogn c-myb y una mejor respuesta al tratamiento hormonal (Guerin et al., 1990; Schwartz et al., 1991; Thor et al., 1992; Gion et al., 1993; Detre et al., 1994; Valeron et al., 1997; Thompson et al., 1998). Su expresin vara inversamente con: el tamao tumoral, as los tumores pequeos se tien intensamente; con el grado histolgico, mostrando mayor tincin los tumores bien diferenciados; con la actividad proliferativa, con mayor expresin de pS2 en tumores con bajos ndices de proliferacin; y con
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la diferenciacin histolgica, tiendo intensamente los tumores bien diferenciados (Henry et al., 1991; Cappelletti et al., 1992). Los cnceres familiares asociados al BRCA-1 y BRCA-2 presentaron bajos niveles de expresin de pS2; lo mismo sucedi con los RE, RPg, catepsina D y ciclina D1 (Osin et al., 1998).
La pS2 ha sido considerada como un factor de pronstico al objetivar en algunos estudios un mayor intervalo libre de enfermedad y mejor supervivencia de los carcinomas mamarios pS2+. La mayora de estos estudios se han apoyado en los resultados obtenidos en la determinacin de la pS2 por tcnicas inmunoenzimticas. As Foekens et al., (1990), mediante
enzimoinmunoanlisis de la pS2 en 205 pacientes con un seguimiento de 47 meses, observaron una significativa disminucin del intervalo libre y la supervivencia en pacientes con tumores pS2 negativos (dintel de positividad 11 ng/mg prt). No encontraron asociacin significativa con el tamao tumoral, afectacin ganglionar o grado de diferenciacin. Foekens et al., (1993), en un estudio ms amplio basado en la determinacin de la pS2 por ensayo inmunorradiomtrico en 710 tumores, confirmaron la utilidad pronstica de la pS2 en el anlisis univariante y multivariante. Los pacientes con una concentracin citoslica inferior a 2 ng/mg (punto de corte) presentaron una recada 4,5 veces superior frente a los tumores con concentraciones por arriba de este dintel. En otro estudio, Foekens et al. (1994) analizaron la concentracin citoslica de la pS2 y de los receptores de estrgeno y progesterona en 230 pacientes con cnceres avanzados de mama que recibieron tamoxifn como terapia de primera lnea. Elevados niveles de la protena (10 > ng/mg-1 prt) se relacionaron, aunque sin significacin estadstica, con una buena respuesta al tamoxifn y una mayor supervivencia post-recidiva. Sin embargo, en el anlisis multivariante, la presencia de pS2 se relacion positivamente con la sobrevida libre de progresin de la enfermedad y mayor supervivencia post-recidiva nicamente en el grupo de tumores (n=83) con valores intermedios (10 > y 75 < fmol/mg prt) de RE y RPg. Del mismo modo, Gion et al., (1993) determinaron la pS2 por ensayo inmunorradiomtrico en 446 cnceres de mama. Los tumores pS2+ se correspondieron con un mayor intervalo libre y supervivencia global. En el anlisis multivariante el pS2 fue un factor pronstico despus de la afectacin ganglionar. Thompson et al., (1998) midieron el pS2-RNAm por Northern blotting en 90 tumores. Durante el seguimiento de 6 aos no se registraron defunciones en el grupo de tumores con ganglios negativos y pS2 positivo en comparacin con el 41% de mortalidad en tumores N+/pS2-. En el anlisis univariante la pS2 fue factor pronstico para el intervalo libre y la supervivencia. En cambio, en la regresin mltiple de Cox la pS2 fue pronstica solo para la supervivencia libre de enfermedad.
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Algunos autores no han podido demostrar la utilidad de esta protena como factor pronstico en el cncer de mama, destacando adems, que estos trabajos se han realizado con tcnicas inmunohistoqumicas. Henry et al., (1991) analizaron la pS2 mediante tincin IHQ en 172 cnceres de mama. La inmunotincin positiva de la pS2 (68%) se relacion significativamente con un menor tamao, mejor diferenciacin histolgica, presencia del RE, y una buena respuesta al tratamiento hormonal. No observaron variaciones en la positividad del tumor primario y sus correspondientes metstasis ganglionares. Tampoco objetivaron asociacin significativa alguna entre la deteccin de pS2 y el intervalo libre de enfermedad o la supervivencia global, aunque la tincin positiva para pS2 se correspondi significativamente con una buena respuesta a la terapia endocrina en los tumores que recidivaron. Para Thor et al., (1992) la pS2 no ofrece ventajas como factor pronstico si se conoce el contenido del RE, segn lo pudieron constatar en el anlisis univariante y multivariante de un estudio basado en la determinacin IHQ de pS2 en 290 pacientes. Cappelletti et al., (1992) no observaron diferencias en el intervalo libre de enfermedad en tumores con tincin IHQ negativa o positiva (pS2+ = 56%, punto de corte: 5%) en una serie de 200 cnceres de mama con ganglios negativos. Sin embargo, los tumores RE-/pS2+ tuvieron un menor intervalo libre de enfermedad. Tampoco, Dookeran et al., (1993) en el anlisis de 178 tumores, objetivaron una asociacin entre la determinacin IHQ de pS2 (77% positividad, dintel: 5%) y la supervivencia, aunque sta fue mejor en los tumores con tincin positiva.
Se observan mayores diferencias en los dinteles de positividad con los mtodos inmunoenzimticos en comparacin con los inmunohistoqumicos y esta falta de uniformidad dificulta una adecuada comparacin y anlisis de los resultados. En la actualidad aparte de su posible valor como factor pronstico la protena pS2/TFF-1 es considerada un factor de prediccin de respuesta al tratamiento hormonal en tumores RE negativo.
P29/Hsp27.
La p29 es una serina fosfoprotena citoplsmica de 29 kDa de peso molecular inicialmente detectada por inmunoprecipitacin con el anticuerpo monoclonal D5. Este anticuerpo monoclonal fue el producto de la seleccin (King et al., 1987) de una serie de anticuerpos dirigidos contra una preparacin de receptores estrognicos solubles purificados, obtenidos del endometrio humano mediante cromatografa de afinidad al estradiol. El anticuerpo monoclonal D5 reconoce la serina fosfoprotena relacionada exclusivamente con el receptor de estrgeno humano activado por su unin con el estradiol, y puede separar esta protena de las protenas solubles de unin al estradiol tipo I y II. El tratamiento con sulfato de amonio, fosfatasas, calor, cloruro de potasio, pH bajo, y KCNS activan la precipitacin, mientras que el molibdato y el
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GTP la inhiben. El anticuerpo no reconoce el receptor estrognico nuclear ni reacciona con los receptores de andrgeno, progesterona, glucocorticoide y globulinas de unin de las hormonas sexuales (Coffer y King 1988). La protena p29 se ha detectado en el 96% de los casos en el citoplasma (Dunn et al., 1993; Zhu et al., 1994). Su purificacin se logr mediante fraccionamiento con sulfato de amonio y cromatografa por inmunoafinidad sobre un sistema de tres columnas utilizando la sefarosa Protena A acoplada al D5. Los estudios de la secuencia parcial de la regin N-terminal de la protena demostraron que sta comparte un 100% de homologa con la protena del citomegalovirus murino pp89 (Hayward et al., 1990).
La protena p29 pertenece a un grupo de protenas que son fosforiladas rpidamente en las plaquetas humanas tras la exposicin a la trombina. El anticuerpo monoclonal murino reconoce selectivamente a la protena de 29 kDa y a una protena bsica no fosforilada de 27 kDa. As Mendelsohn et al., (1991) aislaron y determinaron la secuencia mediante clonacin del DNA de la protena HsP27 (heat shock protena; protenas de choque trmico), demostrando adems, mediante estudios de inmunoprecipitacin, que tres de las protenas de 29 kDa no eran ms que diferentes formas fosforiladas de la protena HsP27. Varios estudios de inmunoprecipitacin e inmunoblott han confirmado que la HsP27 es idntica a la p29 y se han identificado 3 isoformas de un solo polipptido: la HsP27 B, C y D (Mendelsohn et al., 1991; Ciocca y Luque 1991). Estas isoformas son fosforiladas por protena-cinasas en residuos de serina78, serina82 (Laundry et al., 1992) y, a su vez, las protena-cinasas son activadas en una variedad de clulas cuando stas son estimuladas por calor, estmulos qumicos, TPA, trombina, histamina, factores de crecimiento, factor de necrosis tumoral, H2O2 e interleuquina 1, produciendo la rpida aparicin de las isoformas fosforiladas Hsp27 (Chretien y Laundry 1988; Santell et al., 1992; Zhou et al., 1993; Faucher et al., 1993; Huot et al., 1995; Konishi et al., 1997). Los estrgenos y la protena-cinasa C regulan la expresin y fosforilacin de esta protena; adems, modificaciones postranslacionales pueden tambin afectar su funcin.
Las protenas de choque trmico fueron descritas por Ritosa (1962), al observar que clulas expuestas al calor, a agentes qumicos o cualquier otro estrs ambiental inducan la expresin de unas protenas que de alguna manera influan en la supervivencia o muerte celular (apoptosis). Estas protenas constituyen un grupo de polipptidos agrupados en familias que se diferencian entre s, por su peso molecular y la composicin de aminocidos. Se reconocen las familias Hsp100 (hsp110, 104, 90), HsP70 (hsp70, hsp72, hsp73, hsp78), HsP60, HsP40, HsP27, HsP16,5. La expresin y funcin de cada una vara dependiendo del tejido o linaje celular, del tipo de estmulo o estrs medioambiental y de la duracin del mismo. Una de las propiedades fundamentales de algunas de ellas es la proteccin que confieren a determinadas protenas
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dentro de la clula, actuando como especie de escudos protectores e impidiendo de esta manera que estas puedan ser lesionadas. Las Hsp se unen a polipptidos no plegados promoviendo su plegamiento, ensamblaje, translocacin y tambin la secrecin de protenas recin sintetizadas. Entre otras funciones, contribuyen a la activacin de las protenas a las que se encuentran unidas, evitan la agregacin no controlada de protenas y participan en la reparacin y eliminacin de protenas desnaturalizadas. Tambin intervienen en la supresin de ciertas respuestas inflamatorias y en los mecanismos de inmunidad celular (Haley et al., 2000; Coronato et al., 2000; Feldman y Frydman, 2000; Clark y Muchowski et al., 2000; Pearl y Prodromou et al., 2000).
La transcripcin de los genes de las protenas de choque trmico requiere la activacin de un factor de transcripcin de choque (HSF-1) que posee capacidad constitutiva para unirse al DNA. En condiciones basales el HSF-1 se encuentra en forma de monmeros y, tras un estmulo, es fosforilado por HSP-cinasas formando oligmeros, lo que conlleva su translocacin al ncleo. All, al unirse a un elemento de choque trmico (HSE), constituido por varias secuencias repetitivas nGAAn en la regin promotora de los genes de choque trmico, induce la expresin de los mismos por transactivacin (Zimarino et al., 1990; Zhou et al., 1993; Mivechi et al., 1995). En los primeros 200 pares de bases del extremo 5 de estos genes se concentra la mayor parte de su actividad transcripcional. La actividad depende fundamentalmente de una regin rica en G/C que contiene regiones que coinciden con sitios de unin para los factores de transcripcin Sp1 y AP2 (Oesterreich et al., 1996). La aparicin de RNA-hsp27 se correlacion con la activacin de HSF en las clulas MDA-MB-231 estimuladas por calor (Fuqua et al., 1994). En esta misma lnea celular se ha demostrado la participacin de los iones de calcio y de la protena-cinasa A en la regulacin de la sntesis de las protenas Hsp72 y Hsp90 (Kiang et al., 2000).
Hickey et al., (1986) clonaron un DNA complementario que codificaba la Hsp27 en la clula HeLa. La secuencia completa del gen Hsp27 se determin por exposicin de este cDNA a una genoteca humana. La Hsp27 de 199 aminocidos guarda una homologa estructural con la protena alfa del cristalino y con las pequeas protenas de choque por calor (heat shock) de la Drosophila. El 20% de sus residuos de aminocidos pueden ser fosforilados, siendo un proceso fundamental para algunas de sus funciones. Mediante anlisis de hbridos de clulas somticas, McGuire et al., (1989) localizaron el Hsp27 en el cromosoma 7q.
La Hsp27 es inducida por calor (Norris et al., 1997). Interviene en la activacin y secrecin plaquetaria (Zhu et al., 1994), en la regulacin del ensamblaje de filamentos de actina con
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reorganizacin del citoesqueleto (Zhu et al., 1994; Huot et al., 1995; Piotrowicz et al., 1998), en la termoregulacin (Chretien y Landry 1988), en las vas de transduccin de seales homeostticas contra diferentes estmulos que implican estrs celular e inmunidad mediada por clulas T (Mahvi et al., 1993) y en funciones ligadas con las vas de sealizacin del crecimiento y diferenciacin celular (Konishi et al., 1997). Lemieux et al., (1997) demostraron experimentalmente que la transfeccin de Hsp27 a clulas MDA-MB-231, aunque produjo una disminucin de la motilidad celular, caus un aument en la adhesibilidad, crecimiento e invasin celular. El efecto contrario se logr transfectando pptidos antisentidos Hsp27 en clulas MDA-MB-435. La correlacin entre sobreexpresin de Hsp27 y el desarrollo de metstasis fue confirmada al objetivar un aumento de las metstasis pulmonares en ratones inyectados con clulas transfectadas con Hsp27. Por otra parte, Osterreich et al., (1993), mediante transfeccin del gen Hsp27 en dos lneas celulares de cncer de mama (MDA-MB231, MCF-7), lograron inducir resistencia a la doxorrubicina y un aumento del crecimiento celular.
Se ha clonado un DNA complementario en clulas de ratones que codifica una protena antiapopttica BAG-1. La BAG-1 interacciona con protenas de la familia del gen Bcl-2, la quinasa de Raf-1, tirosinas cinasas de varios receptores de factores de crecimiento y receptores de hormonas esteroideas. Se considera que esta interaccin se realiza merced a su capacidad de unirse y de regular la familia de protenas de choque por calor, HSP70. Yang et al., (1995) han demostrado mediante estudios de delecin, mutagnesis puntuales, y anlisis de transcripcin translacional que la protena humana producto del gen BAG-1 se expresa en 4 isoformas de diferentes pesos moleculares (p50, p46, p33 y p29). Los productos de expresin de este gen se unen a varios receptores hormonales y factores de crecimiento para modular sus funciones, sin embargo, an no se conoce con exactitud todas las propiedades de este gen, aunque se ha observado una mayor expresin de las isoformas p46 y p33 en los cnceres de mama. La protena BAG-1 en su regin amino-terminal posee un dominio similar a la ubiquitina que le permitira su asociacin con el proteasoma 26S formando un complejo proteoltico. Se ha demostrado en las clulas HeLa que cuando se dirige la protena BAG-1 al proteasoma 26S se promueve la unin de las chaperonas HsC70/HsP70 con el complejo proteoltico, siendo este proceso regulado por la hidrlisis de ATP e implicado en la degradacin de protenas. (Luders et al., 2000).
La p29/Hsp27 ha sido aislada en: clulas osteoblsticas, epidermis, anejos de la piel, msculo liso de las arteriolas de la dermis, msculos arrectores del pelo, pulmn, tejido mamario, crvix, endometrio, placenta, plaquetas y tejido linfoide. (Colston et al., 1989;
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Kindas-Mugge et al., 1994; Kanitakis et al., 1989; Carper et al., 1990; iocca et al., 1991; Mendelsohn et al., 1991). En el endometrio la p29 se incrementa por accin de los estrgenos y disminuye por la progesterona. La expresin de esta protena es mayor en pacientes postmenopusicas que en las premenopusicas (Cano et al., 1988; Artero Mora et al., 1989).
En el cncer de mama los porcentajes de tincin IHQ varan entre el 40 y 70%, detectndose adems, una gran heterogeneidad tumoral (Ciocca et al., 1993; Araya et al., 1994). Los patrones de tincin tambin fluctan en funcin del estado hormonal y del fenotipo tumoral. Existe una relacin positiva entre la expresin de p29/Hsp27 y la presencia del RE, siendo la mayora de los tumores RE+/p29+, aunque no todos. Los niveles de la protena son superiores en los cnceres RE+RPg+ en comparacin con los RE-/RPg+ y RE-/RPg-. En tumores RE-, la p29/Hsp27 puede an ser detectado en pequeas cantidades (King et al., 1986; King et al., 1987). Asimismo, se ha observado una relacin positiva con la afectacin ganglionar axilar, estadios T avanzados, la presencia de pS2/TFF1, catepsina D, respuesta al tratamiento hormonal y con una disminucin de la supervivencia (Heyderman et al., 1989; Thor et al., 1991; Marsigliante et al., 1992; Marsigliante et al., 1992).
Algunos autores no han encontrado diferencias entre el contenido de p29/Hsp27 en tumores primarios y sus metstasis, ni relacin con el tamao tumoral, el estado ganglionar y los niveles de RPg (Cano et al., 1988; Artero Mora et al., 1989). En el cncer de mama la presencia de Hsp27+ se ha relacionado con una evolucin favorable, sin embargo, la mayora de los estudios otorgan un escaso valor pronstico a esta protena. Thor et al., (1991) determinaron inmunohistoqumicamente la expresin de Hsp27 en 300 pacientes con carcinoma mamario seguidas durante 8 aos. Encontraron una asociacin significativa entre la expresin positiva de Hsp27 y: la presencia de RE, positividad para pS2, estadio T avanzado, afectacin vascular y ganglionar y disminucin de la supervivencia. El anlisis mediante regresin logstica demostr que la Hsp27 era un factor pronstico en el grupo de tumores con afectacin de 1-3 ganglios. Sin embargo, en el anlisis multivariante de Cox, la sobreexpresin de Hsp27 no fue de valor pronstico. En otro estudio basado en la determinacin IHQ de Hsp27 en 361 cnceres de mama, Love et al., (1994) observaron que los tumores de mama Hsp27-/ RE+ tuvieron un mayor intervalo libre de enfermedad y supervivencia en comparacin con los Hsp27+/RE-; sin embargo, en el anlisis multivariante la Hsp27 careci de valor pronstico. Tetu et al., (1995) tampoco objetivaron diferencias en el intervalo libre y supervivencia global entre tumores Hsp27+ o Hsp27-, en la determinacin IHQ de la Hsp27 (43% de positividad) en 890 cnceres de mama con ganglios positivos.
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La importancia de esta protena deriva de su asociacin positiva con el receptor de estrgeno, sirviendo como testigo para validar la integridad de la maquinaria transcripcional dependiente de estrgeno.
RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDRMICO. (EGFR).

El estudio de los factores de crecimiento se inici cuando Cohen et al., (1954) aislaron, en un sarcoma de ratn y en veneno de serpiente, un pptido de 20 kDa (NGF) capaz de estimular el crecimiento de fibras nerviosas en ganglios simpticos de pollos. Estos autores en 1960 descubrieron un segundo factor de crecimiento muy abundante en las glndulas salivares de ratones adultos. La inyeccin de extractos de stas glndulas conteniendo el factor en ratones recin nacidos caus una rpida erupcin de los incisivos y la apertura de los prpados. El factor de crecimiento epidrmico (EGF) debi su nombre a las acciones inducidas en los epitelios.
EL EGF es un polipptido de 53 aminocidos termoestable que se encuentra en la mayora de las secreciones y sangre de humanos y animales. La concentracin en fluidos corporales oscila entre 1 800 ng/ml, siendo menor de 1 ng/ml en la circulacin perifrica (Taylor et al., 1972). Como otros factores de crecimiento es capaz de ejercer mltiples funciones en diferentes clulas y tejidos, efecto que ejerce a nivel local o paracrino (Partanen et al., 1985; Lippman et al., 1986; Ma et al., 1998). El EGF por medio de su receptor situado en la membrana celular interviene en el transporte de iones, cambios morfolgicos, estimulacin del crecimiento, proliferacin y diferenciacin de mltiples clulas, a excepcin de las clulas del sistema inmune que carecen de su receptor (Taylor et al., 1972; Schlessinger et al. 1983). El EGF es mitognico para clulas epiteliales, endoteliales y fibroblastos, adems, inhibe la secrecin de jugo gstrico, estimula la secrecin de prolactina y de gonadotropina corinica. En el tejido mamario el EGF (Kirkland et al., 1979; Fitzpatrick et al., 1984) junto con IGF-1 (Lippman et al., 1986; Pollak et al., 1988), FGF (Yang, 1980), TGF alfa (Fernndez et al., 1987), estrgenos (Briand et al., 1999) y progesterona (Murphy et al., 1985; Lange et al., 1998), son necesarias para el crecimiento y supervivencia del epitelio mamario, siendo capaces de inhibir la apoptosis o revertir los efectos de sustancias (TGF beta, TNF alfa) que inducen la muerte celular (Hoffman et al., 1998; Rosfjord y Dickson, 1999).
El EGF es un potente mitgeno para muchos tejidos incluyendo la mama. Osborne et al., (1980) comprobaron el crecimiento dosis y tiempo dependiente de la lnea celular de cncer de mama MCF-7 tras la administracin de EGF. Cohen et al., (1980) por medio de cromatografa de afinidad aislaron una protena de membrana de 170 kDa en la lnea celular de cncer de
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vulva, A431. Las membranas de estas clulas tenan una actividad tirosina cinasa que era estimulada por EGF. Posteriormente se demostr que la actividad enzimtica estaba relacionada con la protena de 170 kDa. La fosforilacin se produca en residuos de tirosina y la actividad PTK de las clulas A431 tras tratamiento con EGF era intrnseca del receptor (Ushiro y Cohen 1980; Hunter et al., 1984). Este hecho fue ratificado mediante estudios de clonacin del DNA del gen que codificaba al receptor (Ullrich et al., 1984).
Diversos trabajos confirmaron que el receptor del EGF es una protena transmembranal con actividad tirosina cinasa en el que destacaban dos componentes de diferente peso molecular. Ambos posean fosfotirosina y fosfotreonina, excepto el de mayor peso molecular que adems contena fosfoserina (Carlin y Knowles 1982). El gen que codifica el receptor fue identificado en el cromosoma 7, posicin 7p13-q22 (Kondo y Shimizu 1983), cuyo locus es de unos 110 kb (Haley et al., 1987).
Downward et al., (1984) demostraron la similitud existente entre el producto del oncogn verbB con actividad tirosina cinasa que produce la eritroblastosis de las aves y el receptor del factor de crecimiento epidrmico. La clonacin de ambos DNA evidenci que sus pptidos compartan secuencias muy similares, pero a diferencia del EGFR, el producto del oncogn verbB careca de parte del dominio extracelular y era capaz de activarse constitutivamente, es decir, posea la actividad tirosina cinasa en ausencia de estimulacin por un ligando.
Existe una variedad de factores capaces de elevar los niveles de EGFR, entre los que destacan los estrgenos (Dickson et al., 1986; Derthois et al., 1989), la progesterona (Murphy et al.,1985), los glucocorticoides (Ewing et al., 1989), el factor transformante alfa (Arteaga et al., 1988) y los steres de forbol (Bjorge y Kudlow 1987; Lee et al., 1989). La vida media del receptor depende de los niveles de EGF, as, en ausencia de ste, su vida media es de 24 horas, reducindose a 12 con concentraciones de 9 10 nM de EGF. La exposicin de clulas MDA468 (lnea celular que carece de RE) al EGF produce un incremento en los niveles de EGF-RNA mensajero dosis y tiempo dependiente. El EGF es capaz de regular la sntesis y degradacin de su receptor. Un exceso de receptores activados es dirigido al compartimento lisosomal donde es degradado. En estos casos la disminucin del nmero de receptores en la membrana celular es el fruto de un proceso de degradacin y no de una disminucin de la sntesis. De este modo, el EGF ejerce un control negativo de su receptor ( Behzadian et al., 1982; Kudlow et al., 1986; Lyall et al., 1985). La vitamina D3 ocasiona una disminucin en el nmero de receptores de EGF en la membrana celular (Koga et al., 1988). Tambin una deficiencia de fosfolipidos en la
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membrana plasmtica interfiere con la fosforilacin del receptor produciendo una disminucin del proceso de internalizacin (Kano-Sueoka et al., 1990).
El EGF-R es una glicoprotena transmembranal perteneciente a la familia de receptores tipo I (EGFR/p170, erbB2/p185, erbB3/p160, erbB4/p180) con actividad tirosina cinasa y con una estructura tpica con tres dominios, comn en muchos receptores de factores de crecimiento (Ullrich y Schlessinger 1990). El dominio extracelular glicosilado de 621 aminocidos, o sitio de unin con su ligando, que en el caso del EGF es rico en residuos de cistena, le confiere una estructura tridimensional fundamental en el proceso de dimerizacin necesario para la transmisin de la seal inducida por el EGF de la membrana celular al citoplasma. Otra parte de la protena se encuentra inmersa en el espesor de la membrana celular constituyendo el dominio transmembranal y caracterizado por una secuencia de aproximadamente 23 aminocidos hidrofbicos responsables de esta propiedad. Por ltimo, en el interior del citoplasma se encuentra el dominio citoplsmico o cataltico de 542 aminocidos, representado por una secuencia peptdica que vara entre 250 a 300 aminocidos, en donde se reconocen once subdominios conservados en los que se intercalan secuencias de aminocidos que constituyen regiones de diversidad (Gullick et al., 1985; Hanks et al., 1988). Esta configuracin produce una estructura tridimensional globular que le permite el plegamiento de las regiones variables, de tal modo, que las regiones conservadas se aproximan entre s. Estas regiones participan en las reacciones enzimticas de unin y transferencia del ATP a las protenas sustratos, siendo una lisina en el subdominio II fundamental para esta actividad enzimtica. En el extremo carboxiterminal, entre aminocidos cercanos a la membrana plasmtica y el dominio cataltico, se han identificado residuos de tirosina implicados en la autofosforilacin del receptor por su unin con el ligando (Fanti et al., 1993). Tambin, se reconocen secuencias reguladoras que poseen residuos de serina y treonina, base de los sustratos de serina/treonina cinasas, localizadas en el citoplasma, y que son activadas en respuestas a otros estmulos diferentes del ligando, pero con capacidad de modular la actividad del receptor (Heissermann y Gill 1988).
En 1986 Schlessinger propuso el modelo de dimerizacin alostrica para explicar el mecanismo de activacin del receptor del EGF; mediante este modelo el receptor se encuentra en un equilibrio entre formas monomricas inactivas con dmeros activados. La unin con su ligando desplaza el equilibrio hacia el estado dimrico ms estable y, de alguna forma, se produce un cambio conformacional en el dominio extracelular por el cual una molcula de EGF es capaz de unir dos receptores (Greenfield et al., 1989). En el proceso de dimerizacin pueden intervenir el EGF formando homodmeros o bien heterodmeros entre la familia de ligandos (erbB2, erbB3, erbB4). Una vez formado el complejo, el receptor sufre un proceso de
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endocitosis, mecanismo implicado tambin en el proceso de degradacin, regulacin y reciclamiento del receptor (Findlay et al., 1982; Lyall et al., 1985; Decker 1988; Earp et al., 1995). La dimerizacin tiene la ventaja de producir una mayor afinidad por el ligando y permitir la interaccin entre dos dominios catalticos por proximidad, siendo este mecanismo fundamental en el proceso de autofosforilacin (Honegger et al., 1990) necesario para la amplificacin y transmisin de la seal.
La unin del ligando al receptor representa el primer paso en la cascada de transmisin de las seales. Los residuos de tirosina fosforilados en el dominio cataltico del receptor son esenciales para la actividad biolgica, ya que son los sitios de interaccin con los diferentes sustratos involucrados en la cascada de transmisin de la seal desde la membrana al ncleo. Las protenas sustratos localizadas en el citoplasma poseen dominios bien conservados, en algunos casos de 100 aminocidos denominadas SH2, y en otros casos de 50-75 aminocidos denominadas SH3, que reconocen especficamente diferentes residuos de fosfotirosina en el receptor (Koch et al., 1991). En relacin con estos dominios se reconocen dos tipos de protenas: unas que poseen dominios SH2 y dominios catalticos como es el caso de la fosfolipasa Cy (PLCy), la PI3 cinasa, la protena activadora Gtpasa de ras (rasGAP), la Syp y la src (Gulbins et al., 1993; Pawson y Schlessinger 1993), y otras protenas con dominios SH2 y SH3, que funcionan como protenas adaptadoras estableciendo y regulando un enlace entre los receptores y otras protenas con actividad cataltica como es el caso de la protena p85, la Grb2/sem5 (Lowenstein et al., 1992), la Sbc (Pelicci et al., 1992), Crk (Mayer et al., 1988) y la Nck (Lehman et al., 1990). La unin de estas protenas con el receptor, en algunos casos, induce un cambio conformacional que facilita la fosforilacin y, por consiguiente, se logra una ganancia en la actividad enzimtica (Carpenter et al., 1993). El aumento en la actividad cataltica permite, en otros casos, la translocacin de la molcula del citoplasma hacia la membrana plasmtica en donde se encuentran sustratos para ser fosforilados (PLCy, PI3K y GAP).
Se conocen varias vas de transmisin de la seal por el receptor de EGF activado. Una de ellas es mitognica e incluye una serie de enlaces entre protenas citoplsmicas (Grb-2, Sos, Ras, Raf) que inducen a travs de la cascada de las MAP cinasas la fosforilacin de factores de trascripcin y protenas en el ncleo. En ausencia de unin con el ligando el receptor se encuentra desfosforilado, la protena p21Ras esta unida a GDP e inactiva; la protena Grb2 se encuentra en el citoplasma formando un complejo de unin con Sos, a travs del dominio SH3 de Grb2 con una regin rica en residuos de prolina del extremo carboxilo terminal de Sos; esta ltima protena, posee actividad intercambiadora GDP/GTP (Buday y Downward 1993;
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Rozakis-Adcock et al., 1993; Egan et al., 1993; Li et al., 1993; Gale et al., 1993). La unin del EGF con el receptor induce la fosforilacin del residuo Y1068 del receptor que ocasiona la unin con el dominio SH2 de la protena Grb2-Sos y su consiguiente translocacin a la membrana celular (Lowenstein et al., 1992). En la membrana, el complejo por accin de la actividad intercambiadora de Sos, produce el cambio de GDP a GTP unido a Ras originando un complejo p21Ras-GTP. Este complejo es capaz de interaccionar con una protena producto del oncogn c-Raf con actividad serina/treonina cinasa (Moodie et al., 1993; Vojtek et al., 1993; Zhang et al., 1993). Raf activada es capaz de fosforilar a la enzima MAP cinasa e iniciar una cascada de cinasas, con el objetivo de fosforilar una serie de factores de transcripcin y protenas nucleares y, en ltima instancia, activar la maquinaria gentica produciendo una respuesta de proliferacin o diferenciacin (Pellecii et al., 1992; Hunter y Karin 1992). An no se conocen con exactitud todas las funciones de estas protenas. (Figura 5.)
Otra va de transmisin de la seal incluye la fosforilacin y activacin directa de transductores de seal y activadores de transcripcin (Stats) en el citoplasma y su consiguiente translocacin al ncleo. La unin en este caso del EGF con el receptor, induce la fosforilacin en el residuo Y701 de la protena p91 (Stat 1 alfa). Esta protena posee un dominio SH2 que le permite interaccionar con los residuos de fosfotirosina del EGFR (Shuai et al., 1993; Fu y Zhang, 1993; Quelle et al., 1995). La autofosforilacin del EGFR en los residuos de tirosina de su extremo carboxilo parece necesaria para estimular la unin al DNA de p91. Segn este modelo la unin del receptor con la p91 precisa de la internalizacin del complejo. La protena p91 o factor de transcripcin (Stat 1 alfa) interacciona con un factor de transcripcin inducible (SIF) formando un complejo de unin con secuencias especficas, SIE, del DNA en las regiones promotoras de los genes de respuesta temprana (c-fos, c-jun, c-myc) donde induce su transcripcin. Se han identificado 3 Stats adicionales que participan en las vas de transmisin: el Stat 1 beta o protena p84, el Stat 3 o protena p89 y el Stat 5 a y b o protena p92. Tras la administracin de EGF se han demostrado tres complejos de unin SIE activos (SIF A, B, C) en el ncleo, uno que contiene Stat3, otro que contiene Stat1 y un tercer complejo que contiene ambas protenas (Ruff-Jamison et al., 1993; Ruff-Jamison et al., 1994). El Stat 5, o factor inducible por la prolactina en el tejido mamario, se demostr en el ncleo de clulas hepticas del ratn tras administracin de EGF. Tanto el Stat 5 como los factores de transcripcin anteriormente mencionados se unen especficamente a elementos inducibles por prolactina en la regin promotora de la beta-casena (Ruff-Jamison 1995).
FIGURA 5. VIA DE TRANSDUCCION DE LA SEAL CELULAR MEDIADA POR EL EGFR

EGF DIMERO DE EGFR Dominio rico en cistenas---------Dominio transmembranal----------p-y--p-y----p-y-----
Dominios SH3 ( Dominios SH2 (
) )
GAP
---y-p --y-p --y-p DAG IP3 Ca++
RasGDP
RasGTP
MEMBRANA CELULAR
Dominio cataltico----------p-y ---p-y ---p-y ---Syp STAT1 STAT2 STAT3 sustratos ? PLCy PKC Efector Raf Grb2 Sos RasGTP
Raf
Cascada de Cinasas
Raf, MAPKKK ? IkB MAPKK/MEK MAPK/ERK Ser/Tre/ k Ser/Tre/Tyr K Ser/Tre K
p91
STAT activa 701 p-y
CITOPLASMA
MAPK NUCLEO
ELEMENTOS GAS
FACTORES DE TRANSCRIPCION c-Myc, c-Jun, PEA, EGFR-1, Elk-1
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Existe un segundo modelo por el cual la p91, en vez asociarse directamente al receptor, necesitara de una protena tirosina cinasa citoplsmica a modo de puente entre el receptor y la p91, de manera anloga como sucede con las protenas citoplsmicas tipo JAK1, JAK2, JAK3 TYK2, que poseen actividad tirosina cinasa y que son utilizadas por los receptores del interfern. Se producira as, una dimerizacin por medio del dominio SH2 de p91 que interaccionara con SIE y activara la maquinaria transcripcional. (Montminy 1993).
El EGFR juega un papel importante en la carcinognesis y progresin del cncer de mama (Osborne et al., 1980; Fitzpatrick et al., 1984). Entre los mecanismos implicados en el proceso tumoral destacan: la activacin o sobreexpresin del receptor por amplificacin del gen; mutaciones que aumentan la transcripcin y estabilidad del RNAm; sobreexpresin del receptor y su ligando induciendo un crecimiento controlado por mecanismos autocrinos y paracrinos; y sinergismo con el producto de expresin del oncogn C-erbB-2 (Ullrich et al., 1984; Filmus et al., 1987; Kern 1990; Osaki 1992). Experimentalmente Worthylake et al., (1999) han demostrado en clulas mamarias humanas que la sobreexpresin de erbB2 por amplificacin del gen produce una activacin constitutiva del erbB2 y del EGFR independiente del ligando, adems, erbB2 no inhibi la actividad del receptor activado. Tambin la presencia de C-erbB-2 dificulta la destruccin lisosomal del complejo una vez internalizado y acelera el reciclamiento e incorporacin del receptor a la membrana celular. En los tumores que expresan C-erbB2, el EGF a travs de su receptor estimula la actividad de la enzima hidroxi-metil-glutaril coenzima A reductasa, importante en la sntesis de compuestos isoprenoides necesarios en el crecimiento y diferenciacin celular. Tanto el EGF como factores de crecimiento (IGF, IGF-1, FGF), citoquinas (TNFalfa, IL-1beta) y albmina (HSA), inducen la sntesis de estrona (Purohit et al., 1999) sulfato en clulas de cncer de mama. Se ha demostrado adems, que el EGF estimula la actividad de Calmodulina-protena cinasa III dependiente de calcio, enzima que posiblemente interviene en la interaccin de receptores con factores de crecimiento, sntesis de protena e induccin de la proliferacin de clulas de cncer de mama (Parmer et al., 1999). La enzima es selectivamente activada en las clulas en proliferacin activa, y en el cncer de mama, el incremento de su actividad es significativamente mayor que en el tejido mamario normal. La inhibicin de esta enzima indujo un bloqueo de sta clulas en la fase G0/G1-S.
Paradjicamente, el EGF puede actuar como un inhibidor del crecimiento. Imai et al., (1982) observaron, en 9 lneas celulares de cncer de mama, que una concentracin de EGF superior a los 10 ng/ml en el medio de cultivo, produca diferentes grados de inhibicin en la mayora de las clulas. Thomas et al., (1999) demostraron en la lnea celular MDA-MB-468 que el efecto inhibitorio en el crecimiento celular producido por mecanismos apoptticos tras exposicin a
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EGF, se debi a la induccin de p21 y alteracin en la sntesis de poliaminas con la consiguiente reduccin en la sntesis de DNA. Mur et al., (1999) tambin objetivaron una inhibicin del crecimiento de la lnea celular MDA-MB-231 dependiendo del tiempo de exposicin al EGF.
El EGFR es expresado en la mayora de las lneas celulares de cncer de mama y hasta en un 83% de los cnceres de mama in vivo (Murphy et al., 1990). La medicin de EGFR se ha realizado mediante ensayos de unin al radioligando. Su estabilidad a los procedimientos de fijacin histolgica permite su determinacin en muestras parafinadas mediante IHQ. Por este mtodo se detecta el receptor en la membrana celular, aunque la distribucin vara ampliamente entre diferentes tumores y en diferentes regiones dentro del tumor. Estudios de ligando han demostrado la existencia de receptores de alta y baja afinidad importantes en las respuestas mitognicas (Perez et al., 1984; Nicholson et al., 1988). Toi (1988) examin la expresin de EGFR por mtodos bioqumicos (ensayo con radioligando) e inmunohistoqumicos en 86 cnceres de mama. Por ensayo bioqumico un 34,4% de los tumores fueron EGFR+ y por tincin inmunocitoqumica el 31,6%, siendo ambos mtodos comparables. El EGF tambin ha sido aislado en la orina de pacientes con cncer de mama (Eckert et al., 1989). Mediante RTPCR para el EGFR, Leitzel et al., (1998) demostraron que su presencia en la circulacin perifrica de pacientes con neoplasias malignas de mama se relacionaba con la progresin de la enfermedad metastsica.
Algunos tumores exhiben un mayor porcentaje de EGFR en las metstasis en comparacin con el tumor primario y algunos trabajos experimentales sugieren su implicacin en el desarrollo de metstasis. Sainsbury et al., (1985), en un estudio basado en la determinacin del EGFR por tcnicas inmunoenzimticas en 61 cnceres de mama y 9 metstasis ganglionares, demostraron un mayor contenido de EGFR en los ganglios metastsicos en comparacin con sus tumores primarios. Macias et al., (1986) analizando el contenido del EGFR, en 36 cnceres de mama y en su metstasis, observaron mayores niveles de EGFR en los ganglios metastsicos (48%) en comparacin con los tumores primarios (25%). Tambin Battaglia et al., (1988) objetivaron, en 89 cnceres y 23 ganglios positivos, la presencia de EGFR en el 57% de los cnceres y en el 72,2% de sus metstasis ganglionares, siendo el nivel de EGFR muy superior en las metstasis que en sus respectivos tumores primarios.
Diversos estudios en cncer de mama han demostrado la existencia de una relacin inversa entre la deteccin de EGFR y el contenido de los receptores hormonales (RE y RPg), traducindose en un peor pronstico los fenotipos tumorales EFGR+/RE- y EGFR+/RPg-. Sainsbury et al., (1987) demostraron, mediante determinacin IHQ del EGFR en 135 cnceres
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de mama, una asociacin negativa entre la expresin del EGFR y el RE. Los tumores EGFR+ fueron de mayor tamao e indiferenciados. En el anlisis multivariante la positividad para EGFR fue de valor pronstico en pacientes con ganglios negativos y la segunda variable en importancia en tumores con ganglios positivos. Nicholson et al., (1988) sealan en 246 cnceres de mama analizados por enzimoinmunoanlisis (dintel de positividad 10 fmol/mg) la relacin inversa entre EGFR y el RE y su asociacin significativa con la recidiva precoz y la muerte. Para Cappelletti et al., (1988) el contenido de EGFR en 136 cnceres de mama fue mayor en los tumores RE- (72,6 +/- 54,4 fmol/ml) y RPg (63,8 +/- 54,4 fmol/ml) en comparacin con RE+ (33 +/- 37,4 fmol/ml) y RPg+ (35,4 +/-54,4 fmol/ml). Reubi et al., (1989) tambin observaron una relacin inversa en la expresin de EGFR (positividad 27,7%) con el RE y los receptores de somatostatina. Cattoretti et al., (1988) encontraron una relacin positiva entre la expresin de EGFR (anticuerpo Pab421, 67,7% de positividad) y p53. La positividad para el EGFR fue mayor en los tumores ductales (34%) que en los lobulares (21%). Ratnakar et al., (1998) objetivaron por tincin IHQ en tumores de cncer de mama, una mayor expresin de EGFR (42,5%) y C-erbB-2 (45%) en pacientes postmenopusicas, en comparacin con EGFR (22,5%) y C-erbB-2 (15%) en premenopusicas.
La presencia del EGFR se relaciona positivamente con: una elevada actividad proliferativa tumoral medida por el anticuerpo Ki-67; un aumento de la fraccin S y aneuploida; altos grados histolgicos o peor diferenciacin tumoral y con la presencia del producto del oncogn C-erbB2. Gasparini et al., (1992), en un estudio basado en la determinacin inmunocitoqumica de EGFR (56% de positividad), no evidenciaron asociacin con la afectacin ganglionar, tamao tumoral y grado histolgico. La relacin con la actividad proliferativa medida por Ki-67 fue pobre, sin embargo, la positividad para EGFR fue indicador de recidiva. En cambio, Nicholson et al., (1993) en 105 cnceres de mama, observaron una asociacin significativa entre la tincin IHQ positiva de EGFR (59%) con C-erbB-2+ y con Ki-67+. Los tumores C-erbB-2 + y tincin moderada para EGFR tuvieron un peor pronstico. Torregrosa et al., (1997), en su estudio sobre la determinacin por radioensayo del EGFR, C-erbB-2 y receptores hormonales en 825 cnceres de mama, sealan que la positividad de estos marcadores fue de valor pronstico para el intervalo libre de enfermedad en el anlisis univariante. El fenotipo EGFR+/C-erbB-2+ se relacion significativamente con un peor pronstico. En el anlisis multivariante C-erbB-2 fue de valor pronstico para la recidiva y EGFR para la supervivencia global. Naidu et al., (1998) tambin citan la asociacin positiva entre el EGFR (67%) y C-erbB-2 (67%).
Por el contrario, hay estudios que no han demostrado una asociacin significativa entre la expresin del EGFR y el tamao tumoral, diferenciacin histolgica, estado menstrual,
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afectacin de ganglios linfticos y diferenciacin histolgica del tumor. Toi et al., (1994) en un estudio de 126 cnceres de mama, no observaron relacin entre la tincin IHQ del EGFR con el tamao tumoral, afectacin ganglionar, y expresin de C-erbB-2. La asociacin fue positiva para Ki-67 y en el anlisis multivariante el EGFR fue de valor pronstico para la recidiva. Klijn et al., (1994) tampoco demostraron una asociacin del EGFR con los parmetros clsicos, a excepcin de la relacin negativa con los receptores de estrgeno. Las pacientes con valores altos y bajos de EGFR, especialmente en el grupo con ganglios positivos, tuvieron intervalos libres de enfermedad ms cortos. Para Cerra et al., (1995) el contenido del EGFR (dintel de positividad de 5fmol/mg) en 70 cnceres de mama (80% de positividad), no se relacion con ningn parmetro pronstico clsico. El EGFR mostr una asociacin significativa directa con la tincin positiva para Ki-67 y negativa para los receptores hormonales. Schroeder et al., (1997) en la determinacin IHQ de EGFR (19% de positividad) en 111 cnceres nicamente observaron una relacin inversa entre la positividad del EGFR y los receptores de estrgeno.
En un estudio prospectivo basado en la determinacin por ensayo con radioligando de EGFR en 459 pacientes, Koenders et al., (1993), objetivaron en el anlisis univariante que niveles de EGFR de 50 fmol/mg o ms se correspondieron con una disminucin del intervalo libre y la supervivencia global. Sin embargo, este efecto se perdi en el anlisis multivariante. Bolla et al., (1994) tampoco pudieron demostrar el valor pronstico de la determinacin de EGFR en 229 tumores T1/T2, N0/N1 en el anlisis de riesgos proporcionales de Cox. Para Noguchi et al., (1994) el valor pronstico del EGFR est ligado a la presencia de metstasis ganglionares. En el anlisis multivariante de 93 pacientes con cncer de mama, la afectacin ganglionar fue de valor pronstico para la supervivencia. Unicamente cuando se retir del modelo el estado ganglionar el EGFR adquiri valor pronstico.
La expresin de EGFR se ha relacionado con una pobre respuesta al tratamiento adyuvante. Nicholson et al., (1988) observaron en 61 pacientes ancianas con cncer de mama en tratamiento con tamoxifn, una relacin significativa entre la expresin de EGFR con la recidiva precoz y la muerte en el grupo con pobre respuesta a la terapia endocrina. Del mismo modo, Harris et al., (1989), mediante ensayo por radioligando contra EGFR y RE en 221 cnceres de mama, objetivaron en el grupo de pacientes con recidivas tratadas con tamoxifn como agente de primera lnea, una escasa sensibilidad a la terapia endocrina en tumores RE- y EGFR+. Newby et al., (1997) tambin demostraron que la expresin positiva de EGFR y C-erbB-2 se relacion significativamente con una pobre respuesta al tratamiento con tamoxifn. Mediante determinacin IHQ de EGFR y C-erbB-2, en 155 pacientes con cncer de mama en progresin de su enfermedad, observaron una peor respuesta cuando se expresaban ambos receptores.
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Adems evidenciaron mediante biopsias secuenciales, que los niveles de expresin de los receptores fueron los mismos antes de recibir tratamiento y despus de la respuesta inicial a la terapia, es decir, que no existi un aumento en la expresin de los receptores que se pudiese atribuir a la falta de respuesta a la terapia endocrina.
El conocimiento de la estructura molecular y funciones del EGFR ha permitido el desarrollo de nuevos agentes antitumorales. Akiyama et al., (1987) demostraron en la lnea celular A431 que el compuesto genistein induca una disminucin en la fosforilacin de los residuos de serina, treonina y tirosina del receptor estimulado por EGF. Esta sustancia se comportaba como un inhibidor de la actividad tirosina cinasa. Ennis et al., (1989) utilizaron diferentes anticuerpos monoclonales (225 IgG, 108.4 IgG, 96 IgM, 42 IgM) dirigidos contra el EGFR en varias lneas celulares de tejido mamario benigno y cncer de mama que expresaban el receptor. Se observ una inhibicin del crecimiento debido al bloqueo por los anticuerpos del sitio de ocupacin del ligando en el receptor. Baselga y Mendelsohn (1994) desarrollaron una serie de anticuerpos monoclonales obtenidos de hbridos humano:murino contra la porcin extracelular del EGFR. Demostraron una inhibicin del crecimiento en lneas celulares de cncer de mama en divisin activa que expresaban el receptor. Experimentalmente se han ensayado diferentes sustancias que inhiben la actividad tirosina cinasa y entre las que destacan el metabolito anlogo a la
leflunomida que caus una inhibicin del crecimiento y muerte por apoptosis del 99% de una lnea celular de cncer humano (Ghosh et al., 1998). La 2,5-dihidrometilcinimato produjo una disminucin de un 20-50% de la actividad tirosina cinasa de la lnea celular ZR-75-1 resistente a tamoxifn. La administracin conjunta de un ihnibidor de la actividad tirosina cinasa y un anticuerpo monoclonal contra el EGFR indujo una significativa disminucin del crecimiento en la lnea celular de cncer de mama MD-468 (Ciardiello et al., 1999). Similares resultados se obtuvieron con el empleo concomitante de un ihnibidor de la actividad tirosina cinasa, el PD153035, y un anticuerpo monoclonal contra el receptor del EGF, logrando una importante disminucin del crecimiento de lneas celulares que expresaban el receptor (Bos et al., 1997).
C-erbB-2.
El oncogn v-erbB fue identificado como un gen con capacidad transformante responsable del desarrollo de las eritroleucemias y sarcomas en los pollos. Este gen constituye una parte del genoma viral de la eritoblastosis aviar que codifica la gp74v-erbB, una glicoprotena transmembranal, que corresponde estructuralmente a una forma truncada del receptor del factor de crecimiento epidrmico. Esta protena era capaz de ser fosforilada en ausencia del ligando y comparta con el EGFR una serie de aminocidos, pero se diferenciaba del mismo por carecer del dominio extracelular y de un nmero variable de aminocidos en el dominio cataltico,
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segn el tipo de virus implicado (Downward et al., 1984). El anlisis de la secuencia de aminocidos demostr que el virus de la eritroblastosis aviar haba adquirido parte del genoma del v-erbB del pollo (Gullick et al., 1985).
El C-erbB-2 es un oncogn que forma parte de la familia ERBB, inicialmente denominado NEU, se identific en una lnea celular de neuroblastoma/glioblastoma de ratas BDIX (Schechter et al., 1984). La transfeccin de DNA procedente de neuroblastomas y glioblastomas inducidos en la rata por exposicin al agente etilnitrosourea, e inyectado en la placenta de ratones, dio como resultado la aparicin de tumores del sistema nervioso central y perifrico, cuyas clulas expresaban un antgeno de superficie de 185 kDa. La mitad de la gestacin era el perodo de mayor susceptibilidad para el desarrollo de estos tumores tras tratamiento con el agente alquilante y se corresponda con el perodo de expresin del gen en el sistema nervioso. La transfeccin de clones de DNA del alelo transformante de neu insertados en un vector (pSV2) a clulas NIH3T3, indujo la aparicin de focos de clulas que expresaban el antgeno p185 (Bargmann et al., 1986). El anlisis de clones de DNA complementario confirm que este gen codifica una glicoprotena transmembranal de 185 kDa con actividad tirosina cinasa y con semejanza estructural al receptor del factor de crecimiento epidrmico humano (erbB1). Aproximadamente un 50% de la secuencia de aminocidos y ms del 80% de los residuos de aminocidos del dominio cataltico de neu eran idnticos a los del EGFR (Bargmann et al., 1986). Akiyama et al., (1986) produjeron anticuerpos dirigidos contra un pptido sinttico producto de una secuencia de nucletidos del gen ERBB2 que codificaba 14 aminocidos de la regin carboxi-terminal. De este modo, lograron la precipitacin de la glicoprotena en clulas de adenocarcinoma y demostraron que posea actividad tirosina cinasa.
El anlisis del gen neu tras tratamiento con etilnitrosourea revel que este agente induca una transicin T-A, responsable de la sustitucin de valina por cido glutmico en la posicin 664 del dominio transmembranal del receptor (Bargmann y Weinberg 1988). Unicamente dos aminocidos, la glutamina y el cido glutmico, fueron capaces de producir la activacin oncognica al remplazar la valina. La sustitucin de los residuos 663 665 por cido glutmico no produjo la activacin transformante del gen. Esta mutacin puntual (transformante) de un aminocido no polar como es la valina produce un cambio estructural hacia una configuracin en forma de hlice alfa, en vez de la configuracin normal en pliegue tpica (no transformante) en ausencia del ligando. La configuracin en hlice alfa conferida por esta mutacin facilita la formacin de complejos multimricos del receptor en la membrana, simulando el efecto que produce el ligando al unirse a su receptor. El proceso de dimerizacin espontneo tambin es responsable de la activacin enzimtica del receptor (Weiner et al., 1989). Aproximadamente un
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9% de las secuencias no transformantes de C-erbB-2 existen como hlice alfa, de tal modo, que si la concentracin de la protena normal aumentase 10 veces se podra inducir la transformacin celular (Brandt-Rauf et al. 1990). Bargmann y Weinberg (1988) confirmaron que la actividad tirosina cinasa era intrnseca del receptor transformado, necesaria para su actividad y estaba ligada fundamentalmente a la alteracin del dominio transmembranal. La delecin de secuencias del gen transformante neu demostr que no se requieren mas de 420 aminocidos de los 1260 codificados para una completa actividad transformante.
Mediante anlisis southern blot (Coussens et al., 1985) y estudios de hibridacin in situ en hbridos de clulas somticas (Yang-Feng et al., 1985) se localiz el gen que codifica el CerbB-2 en el cromosoma 17q21-q22. Coussens et al., (1985) le asignaron el nombre de HER2. Varios investigadores, con pequeas variaciones en relacin con las bandas, han confirmado la localizacin del gen en el cromosoma 17 (Fukyshige et al., 1986; Kaneko et al., 1987; Di Fiore et al., 1987; Popescu et al., 1989). Finalmente Muleris et al., (1997) por FISH (hibridacin in situ con fluorescencia) demostraron que el gen se localiza en el cromosoma 17 banda q21.1.
Kraus et al., (1989) detectaron en una lnea celular de cncer humano un fragmento de DNA relacionado con la familia del gen ERBB que codificaba una protena de 148 kDa y le denominaron HER3 o ERBB3. Los estudios de hibridacin in situ desvelaron que el gen se localizaba en el cromosoma 12q13. Plowman et al., (1990) aislaron un cuarto receptor con actividad tirosina cinasa, el HER 4. Los estudios mediante expresin recombinante del DNA complementario demostraron que codificaba una protena transmembranal con actividad tirosina cinasa de180 kDa, cuyo dominio extracelular guardaba homologa con ERBB3 y el dominio cataltico citoplasmtico un 79% de homologa con el ERBB2. EL gen de ERBB4 se ha identificado en el cromosoma 2q33.3-33.4. Todos pertenecen a la familia de receptores tipo I con actividad tirosina cinasa y comparten ligandos similares; su expresin sin embargo, vara en diferentes tejidos y en distintos tipos de tumores.
Se sugiri la existencia de ligandos especficos para el receptor p185C-erbB-2 sobre la base de la falta de unin con los ligandos del EGFR a pesar de la semejanza estructural con esta glicoprotena. De este modo, se aisl en el medio de cultivo de fibroblastos transformados por accin del oncogn ras una glicoprotena de 44 kDa capaz de inducir la fosforilacin de p185CerbB-2 en residuos de tirosina en clulas de carcinoma de mama que expresaban el receptor (Peles et al., 1992). La administracin de esta protena a clulas de carcinoma de mama indujo alteraciones en la ploida, arresto del crecimiento celular por parada en la fase G2/M y cambios fenotpicos de diferenciacin, adquiriendo las clulas capacidad para secretar componentes de la
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leche (casena y lpidos). Los trabajos de Orr-Urtreger et al., (1993), en embriones de ratones de 14,5 das de vida, objetivaron la expresin normal de esta protena en el tejido nervioso central y perifrico. Al ligando de se le denomin NDF (factor de diferenciacin neuronal). En la lnea celular de cncer de mama, AU-565, el NDF indujo la expresin de la protena ICAM-1 implicada en los fenmenos de adhesin celular. Los tumores que expresaban esta protena crecieron agrupados en forma de cpula semejando carcinomas in situ tipo comedo (Bacus et al., 1993).
El estudio del DNA mediante clonacin del gen demostr que la protena NDF se sintetiza como un precursor transmembranal que se procesa proteolticamente originando una protena soluble que contiene dominios extracelulares tipo IgC2 y EGF. La forma soluble sera el ligando del receptor Neu/p185C-erbB-2, mientras que la porcin transmembranal podra participar en los contactos entre clulas. Lee y Wood en 1993 utilizando clulas hbridas humanas/roedores por PCR identificaron el gen que codifica el NDF en el cromosoma 8p22-p11. Orr-Urtreger en (1993), mediante hibridacin in situ con sondas marcadas con tritio en clulas humanas en metafase, localizaron el gen en el cromosoma 8p21-12.
Otra protena de 45 kDa, la heregulina (HRG), fue aislada por Holmes et al., (1992) en medio de cultivo de clulas de carcinoma de mama humano. Esta protena al igual que el NDF produca la fosforilacin de la p185C-erbB-2, pero a diferencia de NDF, la heregulina era capaz de estimular el crecimiento de clulas de carcinoma de mama en medios de cultivo. El estudio de clones de DNA de heregulina permiti el aislamiento de una serie de pptidos (HRG alfa, HRG Beta1, HRG Beta 2 y HRG Beta 3) de la misma familia que son sintetizados como precursores transmembranales.
Las neuregulinas (NDF, HRG, GGF, ARIA) al igual que sus receptores, se expresan diferencialmente en distintos tejidos y en diferentes estadios del desarrollo. Estos pptidos estimulan la fosforilacin de los residuos de tirosina de la p185C-erbB-2, y son productos codificados de formas alternativas del RNAm del gen (Marchioni et al., 1993). Estos ligandos precisan de sus receptores especficos, aunque un receptor por la accin de su ligando puede interaccionar con otro receptor de la misma familia. La formacin de heterodmeros produce un fenmeno denominado transfosforilacin cruzada (Plowman et al., 1990). El ligando de CerbB-2/HER2 es Neu y el de HER4 es el NDF/HRG. Mediante este proceso el NDF/HRG a travs de su unin con su receptor HER4 puede estimular la fosforilacin de HER2 en ausencia de su ligando NEU. Sin embargo, si no est presente HER4, el NDF/HRG no podra inducir la fosforilacin de HER 2.
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El receptor p185C-erbB-2 tambin forma un complejo con la subunidad gp130 del receptor de interleuquina 6 (IL6), de este modo, un receptor de citoquina puede ampliar sus vas de sealizacin involucrando un receptor de un factor de crecimiento (Qiu et al., 1998). La inhibicin de la actividad del receptor HER2 produce una inhibicin de la va de sealizacin de la IL6 a travs de la MAP quinasas (Ver va de sealizacin del EGFR).
Doherty et al., (1999) describieron una protena soluble de 68 kDa, denominada herstatin que corresponde al producto de transcripcin alternativo por retencin del intron 8 del gen CerbB-2. Este intron especifica 340 residuos correspondientes a los dominios extracelulares I y II y 79 residuos de la porcin carboxi-terminal de la p185C-erbB-2. Su importancia radica en que este producto capaz de unirse con el receptor C-erbB2, acta como un inhibidor del mismo, produciendo la rotura de los dmeros con la consiguiente reduccin de la fosforilacin de tirosina y disminucin de la actividad cinasa. La expresin de herstatin se encuentra reducida en clulas de carcinoma de mama que presentan amplificacin del gen.
Diversos estudios experimentales y clnicos avalan la importancia del oncogn Neu/C-erbB2 en el desarrollo, progresin y tendencia a producir metstasis en el cncer de mama. Se observ la aparicin eventual de focos de carcinoma mamario en ratones transgnicos hembras que expresaban el oncogn Neu/C-erbB-2 bajo el control de un promotor y un aumento en la cantidad de RNAm y de la protena Neu/C-erbB-2 con una elevada actividad tirosina cinasa. Estos ratones desarrollaron metstasis pulmonares y el anlisis de ellas corrobor que al igual que sus homlogos primarios sobreexpresaban el oncogn Neu/C-erbB-2. Estos hallazgos sugirieron que la sobreexpresin del gen es importante en el desarrollo y progresin tumoral (Guy et al., 1992). La transfeccin del gen Neu/erbB-2 normal humano en fibroblastos no provoc la transformacin neoplsica; este efecto sin embargo, se consigui al inducir la sobreexpresin mediante un LTR viral. Los estudios experimentales corroboran que tanto las mutaciones del gen como la sobreexpresin del gen normal son capaces de estimular la transformacin maligna (DiFiore et al., 1987). Xu et al., (1993), utilizando una serie de anticuerpos monoclonales dirigidos contra diferentes eptopes del dominio extracelular del receptor p185C-erbB-2, lograron la inhibicin del crecimiento de la lnea celular SKBr3,. La presencia de receptores alterados por deleciones de parte del dominio extracelular se observ en ratones transgnicos que desarrollaron mltiples tumores de mama. Los tumores con un nmero elevado de receptores fosforilados en residuos de tirosina de C-erbB-2 y C-erbB3,
frecuentemente producan metstasis pulmonares. El anlisis de clulas humanas de cncer de mama, tambin evidenci la presencia de formas activadas del receptor C-erbB-2 por delecin de 16 aminocidos en el dominio extracelular. La transfeccin de este receptor activado por una
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mutacin fue capaz de inducir la transformacin maligna de fibroblastos Rat-1 ( Siegel et al., 1999). Pietras et al., (1995) introdujeron por transfeccin un DNA complementario de C-erbB-2 en clulas de cncer de mama carentes del receptor. Por este mtodo demostraron que las clulas adquiran la capacidad de expresar el receptor y de crecer de manera independiente del estrgeno y de la accin inhibitoria del tamoxifn. Estas clulas al ser estimuladas por heregulina produjeron una rpida fosforilacin del receptor de estrgeno y este a su vez activ la transcripcin y produccin del receptor de progesterona. Adems, la sobreexpresin de CerbB-2 indujo una disminucin de la regulacin del RE independiente de su ligando y un retardo en la autoregulacin de la supresin de los productos de transcripcin del RE. Este mecanismo podra explicar porqu las clulas que sobreexpresan C-erbB-2 desarrollan una resistencia al tratamiento endocrino. Por otra parte, Yu et al., (1998) han demostrado que la sobreexpresin de C-erbB-2 confiere una resistencia a la apoptosis inducida por taxol a travs de la activacin de la CDKN1. El taxol activa la cdc2 en clulas MDA-MB-435 lo que ocasiona un arresto en la fase G2/M y la subsiguiente apoptosis. La CDKN1 inhibe la activacin de la cdc2 producida por taxol.
Se han empleado diferentes mtodos para valorar la actividad del gen. El anlisis del DNA cromosomal mediante Southern blot y slot blot mide la amplificacin del gen y el mtodo semicuantitativo PCR (reaccin en cadena de la polimerasa) determina el nmero de copias del gen. Una desventaja atribuible a esta tcnica es no permitir la valoracin individual de las clulas. Las tcnicas inmunoenzimticas e inmunocitohistoqumicas miden la sobreexpresin del gen. Mediante IHQ se tie la membrana celular de las clulas de cncer de mama C-erbB2+; destaca la ausencia de tincin en las neoplasias benignas. Entre las desventajas de la IHQ se sealan la falta de estandarizacin de la tcnica como consecuencia de variaciones en el procesamiento de la muestra y diferencias en la sensibilidad de los anticuerpos monoclonales. Dawkins et al., (1993) en un anlisis de 74 cnceres de mama compararon la amplificacin del gen medida mediante Southern blot y slot blot y la sobreexpresin determinada por ELISA e IHQ. La amplificacin del gen fue detectada en el 18,9% de los casos por Southern blotting y slot blot, mientras que la sobreexpresin se determin por ELISA en 21% y por IHQ en el 19% de los tumores. Los cuatro mtodos fueron comparables en cuanto a sus resultados, sin embargo, resultaron ms baratos la IHQ y el slot blot. Dalifard et al., (1998) encontraron una buena correlacin (r=0,85) entre la determinacin de la C-erbB-2 por ensayo inmunoenzimtico y la determinacin de la amplificacin del gen por Southern blot.
La tcnica FISH (hibridacin in situ con fluorescencia de doble color) descrita por Sauter et al., (1996) aporta grandes ventajas, pues permite valorar la amplificacin del gen, su
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distribucin espacial y heterogeneidad en el ncleo y sirve para determinar el nmero de copias o deleciones del cromosoma 17 (Mezzelani et al., 1999). Esta tcnica ha puesto de manifiesto la existencia de un mayor nmero de clulas aneuploides, ausencia de receptores hormonales y elevadas tasas de proliferacin en los tumores C-erbB-2+ por amplificacin del gen (Farabegoli et al., 1999). Con este mtodo tambin se ha demostrado una ausencia de sobreexpresin de la protena cuando existe una baja amplificacin del gen y explica porqu en estos casos los mtodos inmunohistoqumicos son incapaces de detectar la protena.
No se ha encontrado la sobreexpresin de C-erbB-2 en las lesiones hiperplsicas y displsicas de la mama, en cambio, un 56% de los carcinomas ductales in situ, un 77% de la variedad comedo de carcinoma ductales in situ y un 15% de los cnceres infiltrantes expresan C-erbB2 (Allred et al., 1992). Se ha observado una mayor amplificacin y sobreexpresin del gen en los cnceres in situ (48%65%) y en el componente intraductal (60%) que en los cnceres infiltrantes. Entre un 11 y 15% de los cnceres infiltrantes presentan una sobreexpresin del RNAm y de la protena sin amplificacin del gen. El gen aparece amplificado en el 20% 55% de los cnceres infiltrantes (Liu et al., 1992; Singleton y Strickler 1992). En los cnceres ductales infiltrantes RE+, la sobreexpresin de C-erbB-2 flucta con las diferentes fases del ciclo menstrual, siendo los niveles de expresin mas elevados durante la fase folicular en comparacin con la fase ltea. Balsari et al., (1999) analizaron la expresin de C-erbB-2 en 198 premenopusicas intervenidas en distintas fases del ciclo menstrual. Un 20% de los tumores resecados durante la fase folicular fueron C-erbB-2+ frente al 8% extirpado en la fase ltea. El anlisis por Southern blot indic que la sobreexpresin de C-erbB-2 inducida en tumores RE+ no se debi a la amplificacin del gen, por consiguiente, el medio hormonal parece influir en la sobreexpresin de la protena.
El dominio extracelular del receptor ha sido cuantificado en la circulacin perifrica, su concentracin se correlaciona directamente con la expresin en el tumor primario y con la aparicin de enfermedad metastsica. Breuer et al., (1994) compararon los niveles sricos de CerbB-2 y myc en 36 pacientes con cncer de mama y en 25 mujeres sanas. En las enfermas con cncer en comparacin con las sanas se detectaron niveles significativamente altos de C-erbB2 (29% vs 4%) y c-myc (19% vs 0%). Los niveles sricos elevados de C-erbB2 concordaban con un aumento de la expresin de la protena en los cnceres primarios y se normalizaban despus de la exresis del tumor. Por tanto, los autores concluyeron que estas protenas se encuentran aumentadas en una proporcin de pacientes con cncer de mama y su deteccin en la circulacin debe su origen a los tumores primarios. Fontana et al., (1994) determinaron la concentracin srica de C-erbB-2 antes del tratamiento quirrgico en 236 pacientes con cncer
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de mama no metastsico. La mediana de los niveles en suero de C-erbB-2 correspondi a 4 u/ml (4 150) y el dintel de positividad seleccionado fue de 8 u/ml. Se detectaron niveles positivos en el 21% de las enfermas correlacionndose esta positividad con la enfermedad metstasica y con tumores T3-T4, ganglios positivos y altos niveles de CA 15.3. Estos autores consideran que es necesaria la determinacin srica de C-erbB2 antes de cualquier actuacin terapetica debido a su posible valor para pronosticar recidivas. Watanabe et al., (1994) determinaron mediante enzimoinmunoanlisis (punto de corte 12 u/ml) niveles elevados de C-erbB-2 en el 12% de las pacientes con un cncer primario de mama, en el 4,9% de pacientes operadas sin evidencia de recidivas y en el 31,4% de los casos con enfermedad metastsica. En las mujeres portadoras de un cncer y en los casos de recidiva, la concentracin srica de la protena se corresponda con la elevacin de los marcadores CEA y CA15.3. Tambin, Molina et al., (1999) compararon los niveles en sangre de C-erbB-2, CEA y CA15.3 en 250 enfermas intervenidas sin enfermedad residual y con una media de seguimiento de 2,5 aos. Los dinteles de positividad para el CerbB-2, CEA y CA15.3 fueron >20 u/ml, >10 u/ml, >60 u/ml y la expresin positiva se detect en el 28,4%, 31,6%, 46,3% respectivamente. La elevacin de al menos un marcador se produjo en el 69,5% de los casos antes de la aparicin de la recidiva. Los niveles sricos de C-erbB2 mostraron una buena concordancia con sus respectivos tumores primarios y fueron, junto con los de CA15.3, de valor para pronosticar la recidiva con un intervalo de 4,2/ +/-2,4 meses antes de producirse. Por otra parte, Shimizu et al., (2000) compararon la expresin de C-erbB-2 y p53 en los tumores primarios y sus metstasis mediante tincin IHQ en 42 muestras de 21 pacientes con cncer de mama, de las que el 67% recibi tratamiento adyuvante. No encontraron diferencias en la expresin de C-erbB-2 (38%) y p53 (39%) entre los tumores primarios y su metstasis, como tampoco existieron variaciones en los casos que recibieron tratamiento adyuvante.
Desde que Slamon et al., (1987) hicieron referencia al valor del gen neu/ERBB2 como factor de pronstico en el cncer de mama, se han publicado una gran cantidad de trabajos que citan el valor pronstico de la sobreexpresin/amplificacin del gen en el cncer de mama. Estos autores demostraron la sobreexpresin del gen (2 hasta 20 veces) en el 30% de un total de 189 cnceres de mama. El C-erbB-2 fue de valor pronstico para la recidiva y la supervivencia global superando incluso a los receptores hormonales y al estado de los ganglios axilares.
En el cncer de mama varios trabajos han puesto de manifiesto que la activacin del oncogn (amplificacin/sobreexpresin) se relaciona con: el inicio y progresin del tumor, aumento en la actividad mitsica, pleomorfismo nuclear, altos grados histolgicos y nucleares, ausencia de infiltrado inflamatorio peritumoral, estadios clnicos avanzados (III y IV), estado y nmero de
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adenopatas axilares, ausencia de receptores de estrgenos y progesterona, alteraciones de la p53, aumento en las concentraciones uAP, disminucin de los niveles de Bcl-2, enfermedad metastsica, un menor intervalo libre de enfermedad y supervivencia global y una falta de respuesta al tratamiento hormonal y citotxico. Stal et al., (1994) objetivaron en 172 cnceres que la expresin de C-erbB-2 medida por tincin IHQ (37% de positividad) se relacionaba significativamente con aumento de la fraccin S, aneuploida y negatividad para el RE. Los tumores C-erbB-2+ presentaron un mayor porcentaje de metstasis. Delarue et al. (1994), mediante tincin IHQ de C-erbB-2 y EGFR en 73 cnceres, tambin evidenciaron que el CerbB-2 se relacionaba significativamente con tumores grandes y con la presencia de metstasis ganglionares. En el anlisis multivariante el C-erbB-2 fue de valor pronstico para la recidiva a corto plazo, mientras que el EGFR lo fue a largo plazo. Por otra parte, Prost et al., (1994) determinaron la amplificacin del gen por hibridacin en 178 pacientes con cncer de tipo no inflamatorio y lo compararon con 67 enfermas con carcinoma inflamatorio. El gen se encontr amplificado en el 17% de los cnceres infiltrantes y en el 36% de los inflamatorios. En el anlisis multivariante el C-erbB2 nicamente se asoci a un mayor riesgo de muerte en el grupo no inflamatorio con ganglios positivos. Wiesener et al., (1998) examinaron por IHQ la expresin de C-erbB-2, Ki-67 y p34cdc2. El C-erbB-2 se asoci significativamente a una elevada expresin de Ki-67 y a un alto grado histolgico. Tanto el Ki-67 como el C-erbB-2 se relacionaron significativamente con la supervivencia global. Gago et al., (1999) analizaron 205 cnceres de mama con una media de seguimiento de 5 aos. Fueron de valor pronstico en el anlisis univariante el tamao tumoral, la afectacin ganglionar, el grado histolgico, la presencia de RE, p53, C-erbB-2, PCNA y glicoprotena P. En el anlisis multivariante el CerbB-2 fue la variable de mayor valor pronstico seguida por el tamao tumoral, receptores hormonales, grado histolgico y PCNA. De manera similar Quin et al. (1999) estudiaron, mediante tincin IHQ en 108 pacientes con carcinoma ductal in situ y 25 carcinomas infiltrantes, la relacin entre la expresin de la protena Bcl-2 y el RE, C-erbB2 y p53. La positividad para Bcl-2 se asoci significativamente a tumores bien diferenciados y a la presencia de RE. La ausencia de Bcl2- se relacion significativamente con tumores indiferenciados y positividad para C-erbB-2 y p53.
En cambio, en algunos estudios el C-erbB-2 carece o es de dudoso valor pronstico. As, van de Vijver et al., (1988) observaron que las clulas de cncer de mama tipo comedo sobreexpresaban el producto del gen Neu/C-erbB-2, sin embargo, no encontraron una asociacin significativa entre la sobreexpresin y la afectacin ganglionar y la recidiva tumoral. Rilke et al., (1991) en su serie basada en el examen inmunohistoqumico de muestras archivadas de 1.210 pacientes con un seguimiento de 19 aos, observaron que los tumores que
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sobreexpresaban C-erbB-2 y con ganglios positivos tuvieron una mala evolucin. La presencia de C-erbB-2 se relacion con parmetros clsicos de mal pronstico (tumores grandes, indiferenciados y con un menor infiltrado linfoplasmocitario). Sin embargo, en el anlisis multivariante fueron de valor predictivo los parmetros de pronstico clsicos. Para Gasparini et al., (1994) el C-erbB-2 y C-erbB-3 (IHQ) carecieron de valor pronstico en el anlisis multivariante de 211 cnceres de mama con ganglios negativos. Del mismo modo, Quenel et al., (1995) realizaron determinacin IHQ de C-erbB2 y receptores hormonales en 942 pacientes con cncer. Un 24% de los tumores fueron inmunorreactivos para la protena, encontrando una asociacin positiva significativa con el grado histolgico y negativa con el RE y el RPg. En el anlisis univariante el C-erbB-2 fue de valor pronstico para la recidiva y la supervivencia en el grupo con ganglios negativos. Sin embargo, en el anlisis multivariante el valor pronstico de C-erbB-2 fue inferior al grado histolgico, a la afectacin de los ganglios axilares, al tamao tumoral y al estado de los receptores hormonales. Igualmente, Reed et al., (2000) sealan que el C-erbB-2 y la p53 carecieron de valor pronstico, en su estudio de 613 cnceres de mama con ganglios negativos y seguimiento durante 30 aos. En estos enfermos el grado histolgico y el tamao tumoral fueron las variables que mejor predijeron la evolucin de las pacientes. El 35% de las enfermas con tumores con grados histolgicos 2-3 y un tamao tumoral mayor de 2 cm (T2N0M0) haban fallecido despus de 10 aos de seguimiento en comparacin con el 6% de las pacientes con tumores con un grado histolgico I y un tamao tumoral inferior a los 2 cm (T1N0M0).
La expresin/amplificacin de neu/C-erbB-2 en cnceres de mama se ha relacionado con una mayor agresividad tumoral y una pobre respuesta a los tratamientos complementarios. Varios autores han definido un subgrupo de tumores RE+/C-erbB-2+ que responden mal a la terapia endocrina. Entre ellos destacan los trabajos de Allred et al., (1992) quienes examinaron la expresin de C-erbB-2 por tincin IHQ (14,3% de positividad) en 613 pacientes. Los dividieron en un grupo de bajo riesgo (n=307) que inclua tumores 3 < cm, RE+ y sin tratamiento adyuvante, y un grupo de alto riesgo (n=306) caracterizado por tumores grandes y ausencia del RE. Se observ una disminucin del intervalo libre de enfermedad y de la supervivencia en los tumores infiltrantes/C-erbB-2+. Tuvieron un mejor pronstico las pacientes con tumores CerbB-2 negativo que recibieron tratamiento adyuvante en comparacin con las enfermas con tumores C-erbB-2 positivo tratadas de manera idntica. Tambin, Wright et al., (1992) examinaron la expresin de C-erbB-2 por IHQ en 65 pacientes de un total de 72 recidivas tratadas con tamoxifn como agente de primera lnea. Hubo una significativa mayor respuesta al tratamiento endocrino en los tumores C-erbB-2 negativos-, reducindose significativamente la respuesta de un 48% a un 20% en los tumores con el fenotipo tumoral RE+/C-erbB-2 +. Del
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mismo modo, Giai et al., (1994) observaron en 159 pacientes que la expresin de C-erbB-2 se asoci a una corta supervivencia en cnceres con ganglios negativos, aunque en el anlisis multivariante la afectacin ganglionar fue de mayor valor pronstico. La respuesta al tratamiento CMF y tamoxifn fue menor en las pacientes cuyos tumores expresaban conjuntamente el oncogn ras y C-erbB-2. Igualmente, Borg et al., (1994) en un anlisis de 871 pacientes con cncer de mama encontraron que la expresin de C-erbB-2 se correlacionaba con un intervalo libre de enfermedad corto y una menor supervivencia en el grupo tratado con tamoxifn en comparacin con el grupo no tratado. Los tumores C-erbB-2+, RE+ y ganglios positivos tuvieron un peor pronstico.
De una manera distinta, Leitzel et al., (1995) estudiaron el efecto que produca la sobreexpresin de C-erbB-2 en la respuesta a la terapia hormonal. Determinaron la expresin en la sangre de 300 pacientes con cncer de mama metastsico randomizadas para recibir acetato de megestrol o fradazole. Un 19,3% de las pacientes presentaron niveles sricos elevados de CerbB-2 y tanto la respuesta al tratamiento endocrino como la supervivencia fue significativamente menor en el grupo con tumores RE+/C-erbB-2+. Houston et al., (1999) sealan en su estudio de 241 pacientes con cncer de mama avanzado tratadas con terapia endocrina tras la primera recada, la peor respuesta y un tiempo de progresin de la enfermedad relativamente mas corto en tumores C-erbB-2 positivos. La expresin conjunta de C-erbB-2 y el RE defini un grupo con resistencia al tratamiento endocrino.
La ausencia de expresin de C-erbB-2 se ha relacionado con una mejor respuesta al tratamiento quimioterpico adyuvante. As lo sealaron, Bitran et al., (1996), al analizar la expresin de C-erbB-2 en 25 pacientes en estadio II y IIIA tratadas con 6 ciclos de CAF y posterior quimioterapia a altas dosis con transplante autlogo de mdula sea. Los tumores de las 4 pacientes que recidivaron tuvieron una elevada expresin de C-erbB-2 en comparacin con las 21 restantes con baja o nula expresin, siendo esta asociacin significativa. Igualmente, Makris et al., (1997), citan la respuesta significativa que se produjo al tratamiento neoadyuvante (mitozantrone, metrotexate, mitomicina y tamoxifn) en 90 pacientes con tumores C-erbB-2 negativo. La respuesta al tratamiento quimioendocrino fue mejor en los cnceres RE+, RPg+ y Bcl-2+, aunque en estos casos, la asociacin no alcanz la significacin estadstica. Del mismo modo, Willsher et al., (1998) en su serie de 50 pacientes con cncer avanzado de mama sealan que se produce una buena respuesta (73%) al tratamiento quimioterpico neoadyuvante, en tumores C-erbB-2 negativo. Asimismo, Tetu et al., (1998) observaron en el anlisis multivariante de 458 pacientes con cncer de mama y ganglios positivos, una mejor superviviencia en aquellas enfermas con expresin negativa para c-erbB-2 y p53 y que haban
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recibido ciclos prolongados (10 >) de quimioterapia. De manera similar, Vargas-Roig et al., (1999) analizaron la relacin entre la presencia de C-erbB-2, p53 y glicoprotena P y la resistencia a la quimioterapia de induccin (FAC o FEC) en 60 biopsias de pacientes con cncer de mama avanzado. No observaron diferencias significativas entre la expresin de los marcadores antes y despus de la terapia. La p53 y la glicoprotena P no fueron de valor pronstico para la supervivencia libre de enfermedad. En cambio, el 50% de las pacientes que recidivaron tenan tumores C-erbB2+ frente al 7% que se mantuvo libre de enfermedad. Los tumores C-erbB-2+ tuvieron una significativa menor supervivencia y por tanto, la relacin con la progresin de la enfermedad y resistencia al tratamiento fue objetiva.
Por otra parte, Bewick et al., (1999) valoraron en 57 pacientes con cncer de mama metastsico la expresin srica del dominio extracelular de C-erbB-2 y su relacin con la respuesta al tratamiento intensivo con altas dosis de quimioterapia y transplante de mdula sea. En el anlisis multivariante la presencia de C-erbB-2 en la circulacin perifrica se relacion significativamente con una disminucin en la supervivencia libre de progresin de la enfermedad y la supervivencia global. Bezwoda, (2000) estudi la sobreexpresin de C-erbB-2 y su relacin con la respuesta al tratamiento adyuvante en 92 pacientes con cncer de mama avanzado. La expresin de C-erbB-2 y RE no tuvo influencia sobre la respuesta al tratamiento endocrino, contrariamente a lo que sucedi con el tratamiento citotxico CAF, en donde, se observ una disminucin de la respuesta y del intervalo de fracaso a la terapia de tumores CerbB-2+ frente a tumores C-erbB-2-. Debido a que previamente los tumores C-erbB-2+ haban recibido tratamiento quimioterpico, sta variable fue la nica de valor predictivo de respuesta a la terapia CAF en el anlisis multivariante.
Algunos trabajos sealan que los tumores C-erbB-2+ presentan una buena respuesta a los tratamientos intensivos de quimioterapia. As, Thor et al., (1998) analizaron en 992 cnceres de mama con ganglios positivos la expresin de C-erbB-2 y p53 con relacin a la respuesta al tratamiento con dosis intensivas de CAF (ciclofosfamida, adriamicina y fluorouracilo). Un 37% de los cnceres eran C-erbB-2+. En el anlisis multivariante se objetiv el beneficio de la quimioterapia intensiva en los grupos con tincin positiva para C-erbB-2 y que haban recibido dosis moderadas y altas de CAF. De manera similar, Muss et al., (1994) valoraron en 442 pacientes seleccionadas al azar de un total de 1572 mujeres con cncer de mama y ganglios positivos, la utilidad del ndice de DNA, fraccin S, expresin de C-erbB-2 y p53 para predecir la respuesta a dosis altas, medias y bajas de ciclofosfamida, doxorrubicina y fluorouracilo. Unicamente objetivaron un mayor intervalo libre y supervivencia global en el grupo que recibi altas dosis de quimioterapia y cuyos tumores expresaban el C-erbB-2. Asimismo, Paik et al.,
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(1998) objetivaron un beneficio del tratamiento adyuvante PAF (mostaza L-fenilalanina, adriamicina y 5-fluorouracilo) sobre PF en tumores C-erbB-2+. Este estudio se bas en el seguimiento durante una media de 13,5 aos de 682 pacientes. La sobreexpresin de C-erbB-2 se relacion con un mayor tamao tumoral, ausencia de RE y el nmero de ganglios afectados. El intervalo libre de enfermedad y la supervivencia global fueron significativamente mejores en el grupo con tumores C-erbB-2+ y que inclua la adriamicina (doxorrubicina) como parte del tratamiento.
El mejor conocimiento de la estructura molecular del gen y de su producto ha permitido el desarrollo experimental de terapias dirigidas contra el gen. Colomer et al., (1994) han ensayado oligonucletidos antisentido en lneas celulares SK-BR3 y BT-474 demostrando una inhibicin del 60% del crecimiento celular y una reduccin de los niveles de la protena C-erbB-2 en las clulas con amplificacin del gen. Los oligonucletidos antisentido carecieron de efecto en las clulas que sobreexpresaban el gen sin amplificacin del mismo. Por otra parte, Hollywood et al., (1995) describieron la inhibicin de RNAm del gen mediante la inhibicin del promotor OB2-1 con el frmaco aurotiomalato sdico.
Harweth et al., (1993) demostraron in vivo la inhibicin del crecimiento de tumores que expresaban C-erbB-2 tras tratamiento con 4 anticuerpos recombinantes monoclonales (FRP5, FSP16, FWP51, FSP77) dirigidos contra el dominio extracelular del receptor. Los anticuerpos FWP51 y el FSP77 inhibieron el crecimiento de clulas transformadas NIH3T3 implantandas en ratones desnudos. La administracin conjunta de estos dos anticuerpos dirigidos contra dos regiones distintas del receptor obtuvo un mejor efecto citosttico que la administracin individual. Sin embargo, los tumores reanudaron el crecimiento tras la suspensin del tratamiento. Baselga et al., (1996) informaron de un 11,6% de respuesta en 46 pacientes con cnceres de mama en estadio IV que sobreexpresaban el oncogn C-erbB-2 tratadas con 10 inyecciones (100 mg/inyeccin) semanales del anticuerpo monoclonal recombinante humanizado, rhumAb-HER2. Observaron una buena respuesta en el hgado, mediastino, ganglios linfticos, y pared torcica.
Boyer et al., (1999) investigaron los eptopes ptimos blanco de las inmunotoxinas. Para ello, ensayaron 7 anticuerpos combinados con inmunotoxinas (anti-HER-2 ricina A) dirigidos contra diferentes eptopes del dominio extracelular del receptor C-erbB-2 en 2 lneas celulares distintas de cncer de mama que sobreexpresaban el receptor. Estos autores obtuvieron niveles de citotoxicidad variable que era independiente del tipo de anticuerpo, de la afinidad de unin, de la posicin relativa y de la internalizacin del receptor. Adems, observaron que los eptopes
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se disponan en un arreglo lineal en la regin N-terminal y fueron de vital importancia las regiones con residuos de aminocidos del 78 242.
Pregam et al., (1999) estudiaron el sinergismo que se produce con la utilizacin del anticuerpo humanizado HER 2 y diferentes agentes quimioteraputicos. Los estudios in vivo se condujeron en ratones desnudos implantndoles injertos de clulas MCF-7 transfectadas con el gen C-erbB-2 seguido por la administracin de anticuerpos rhuMAb HER-2 y combinaciones de agentes alquilantes, anlogos de platino, inhibidores de la topoisomerasa II, taxanos, antraciclinas y antimetabolitos. La administracin conjunta de rhuMab- HER2 con ciclofosfamida, doxorrubicina, paclitaxel, metrotexate, etopsido y vinblastina fue ms efectiva causando una significativa reduccin del volumen tumoral que la administracin exclusiva de quimioterpicos.
Wei et al., (1999) han demostrado que es posible la adquisicin de inmunidad antitumoral especfica contra C-erbB-2. Estos autores desarrollaron 3 mutantes DNA de C-erbB-2 que codificaban la protena receptora completa y que posteriormente fueron utilizadas como vacunas. A uno de los mutantes se le elimin la actividad tirosina cinasa (ErbB-2 A), a otro la posibilidad de ser procesado en el citoplasma (cyt ErbB-2) y al tercer mutante ambas posibilidades (cyt ErbB-2 A). Unicamente las vacunas de mutantes sin actividad tirosina cinasa (ErbB-2 A) inhibieron el crecimiento de tumores que expresaban C-erbB-2 en ratones BALB/c.
Ki-67.
Gerdes et al., (1983) describieron un anticuerpo monoclonal de ratn, Ki-67, que reaccionaba con un antgeno nuclear de clulas en proliferacin activa. Sus estudios experimentales en clulas estimuladas con mitgenos demostraron que el anticuerpo reconoca un antgeno presente en todas las fases del ciclo de divisin celular (G1, S, G2, M). Sin embargo, no reaccionaba con clulas quiescentes ni con clulas en la fase G1 precoz (G1T, G1A) que haban sido estimuladas por primera vez con mitgenos. La inmunotincin con Ki-67 desvelaba una reactividad nuclear en varias lneas de clulas humanas en divisin celular activa (clulas corticales del timo, clulas germinales del centro de folculos corticales, clulas de la regin del cuello de la mucosa gstrica, espermatogonias indiferenciadas) y por el contrario, careca de efecto en clulas bien diferenciadas (linfocitos, monocitos, hepatocitos, clulas renales, clulas parietales de la mucosa gstrica y clulas cerebrales). La expresin del antgeno reapareca en linfocitos tras ser estimulados con un mitgeno (fitohemaglutinina) y desapareca en las clulas HL-60 inducidas a diferenciarse a macrfagos maduros por exposicin a steres
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de forbol. Estos hallazgos sugirieron la posibilidad de utilizar el antgeno Ki-67 para valorar la fraccin de crecimiento, es decir, la proporcin de clulas que se estn dividiendo en un tumor.
Entre las primeras aplicaciones clnicas del anticuerpo contra el antgeno Ki-67 destacan los trabajos de Gerdes et al., (1984) en linfomas no Hodgkin. Estos autores, utilizando la mediana de expresin como parmetro de discriminacin, lograron correlacionar linfomas de alto y bajo grado de la clasificacin de Kiel con elevadas y bajas tasas de divisin celular respectivamente. Para valorar la actividad proliferativa de clulas de linfoma en suspensin, Silvestrini et al., (1988), emplearon tres mtodos distintos que incluan la tincin con el anticuerpo monoclonal Ki-67, la autorradiografa con timidina {(3H) TdR LI} y la tincin con bromodeuxiridina (BrdU LI). Estos autores, basndose en el valor de la mediana (punto de corte) para definir tumores de proliferacin celular lenta o rpida, objetivaron que los 3 mtodos, salvo algunas variaciones, servan para estimar la cintica celular. La determinacin de la protena Ki-67 era til para medir la fraccin de crecimiento de una poblacin celular y comparable a mtodos fiables como la medicin de la fraccin S por citometra de flujo.
Estudios en diferentes tejidos humanos han demostrado que el anticuerpo monoclonal Ki-67 se une a un antgeno de 35 40 kDa en las clulas que se estn dividiendo activamente (Danova et al., 1988; Landberg et al., 1990; Landberg y Roos 1993). Valindose de la citometra de flujo, Sasaki et al., (1987), comprobaron que los niveles de expresin del antgeno aumentaban durante la ltima mitad de la fase S y alcanzaban un pico mximo durante la fase G2/M. El tratamiento de las clulas HeLa S3 con inhibidores de la sntesis de DNA increment la expresin del antgeno, mientras que el tratamiento con DNAasa le hizo desaparecer. Sobre la base de estos resultados se lleg a la conclusin que el antgeno Ki-67 se encuentra unido al DNA, que su expresin es independiente de la sntesis de DNA y que puede ser esencial para mantener el estado de proliferacin celular. Con microscopa electrnica y de barrido confocal con lser en las clulas humanas MR65, Verheijen et al., (1989), localizaron el antgeno en la corteza del nucleolo y en los componentes fibrilares densos. Asimismo, Guillaud et al., (1989) mediante citometra de imagen objetivaron en las clulas MCF-7 y MRC-5, que el antgeno se encontraba principalmente en el nucleolo en la fase G1 y en el nucleoplasma en las subsiguientes fases del ciclo celular y sealaron adems, que la sntesis de RNAr nucleolar es esencial para la expresin del antgeno. Peled et al., (1997) por Western blot y anlisis inmunocitolgico empleando el anticuerpo monoclonal del ratn PRA72, tambin demostraron que el antgeno de 35 40 kDa presentaba una distribucin nuclear perifrica durante todas las fases del ciclo celular, a excepcin de la mitosis, donde los cromosomas se envolvan con el mismo.
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Estudios con doble inmunofluorescencia han confirmado que durante la mayora de la interfase el antgeno Ki-67 se localiza dentro del nucleolo. En la fase G1 precoz se sita en un gran nmero de focos repartidos en el nucleoplasma que se extienden hasta la envoltura nuclear. Durante la mitad de la fase G1 precoz el antgeno se encuentra asociado con el nucleolo en unas regiones distintas a los dominios que contienen los mayores antgenos nucleolares (fibrilarina y RNA polimerasa I). En el nucleolo ya maduro, el Ki-67, se localiza en los dominios que contienen fibrilarina o B23/nucleofosmina y est ausente en regiones que poseen RNA polimerasa I. Cuando se induce la rotura del nucleolo se observa la translocacin del antgeno a focos nucleoplsmicos carentes de fibrilarina o RNA polimerasa I. As, aparentemente el Ki-67 se encuentra en regiones del componente fibrilar denso del nucleolo deficientes en fibrilarina (Kill, 1996). Estudios posteriores han corroborado que la localizacin de Ki-67 vara de manera dependiente del ciclo celular. Durante la mitosis este antgeno cubre a los cromosomas, se acumula en focos nucleares durante la fase G1 y se mantiene dentro del nucleolo en la fase tarda de G1, en la fase S y en G2. En la fase G1 precoz se ha observado su localizacin en las siguientes regiones satlites del DNA: alfa satlite (centrmero), minisatlite (telmero) y satlite III (bloques heterocromticos). En la fase G1 tarda existen mnimas regiones satlites con Ki-67, desplazndose ste hacia el nucleolo. Sin embargo, las regiones centromricas y brazos cortos de los cromosomas acrocntricos prximas a los genes de RNA ribosomal (RNAr) contienen Ki-67. En la fase de reformacin postmittica y nucleognesis disminuyen progresivamente las regiones satlites del DNA que permanecen asociadas con Ki-67 (Bridger et al., (1998). Sobre la base de estos hallazgos se ha llegado a la conclusin que el antgeno Ki67 se localiza en el nucleolo durante la interfase, mientras que en la mitosis se distribuye en la periferia de los cromosomas.
MacCallum y Hall (1999) realizaron un detallado anlisis inmunoqumico de Ki-67 en las clulas HeLa, descubriendo 2 isoformas, una hiperfosforilada durante la mitosis y otra defosforilada en la interfase. El Ki-67 pudo ser fosforilado in vitro por la cdc2/ciclina B y la protena cinasa; sta ltima caus un cambio en la motilidad del antgeno, as, la isoforma fosforilada presentaba una baja movilidad. El tratamiento con fosfatasas produjo una conversin de la isoforma mittica a la isoforma de interfase. De este modo, la defosforilacin ocasion el desvo de Ki-67 desde la periferia de los cromosomas a puntos citoplsmicos conteniendo nucleolina. A juzgar por estos datos, parece que la localizacin de Ki-67 puede ser regulada por las cinasas y fosfatasas especficas que actan en el ciclo de divisin celular. Estos dos autores, MacCallum y Hall (2000), mediante microscopa confocal de barrido con laser de alta resolucin y tinciones dobles y triples para el antgeno Ki-67, han analizado en las clulas MCF7 su localizacin y relacin con diferentes protenas nucleolares (nucleolina, fibrilarina,
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p130, p120. RH-II/ Gu helicasa y topoisomerasa II beta). Estas protenas se hallan con Ki-67 alrededor de los cromosomas durante la mitosis, con la excepcin de la fibrilarina y la p130 que muestran una distribucin extra-nucleolar en la fase G1 precoz.. Gran parte de la p120 y la RHII/Gu se localizan con Ki-67 en el centro fibrilar difuso del nucleolo, mientras que con la nucleolina y la fibrilarina coincide solo en parte. De esta manera, el Ki-67 se sita en una zona del centro fibrilar difuso del nucleolo relacionada con el procesamiento tardo del RNA ribosomal, lo que hace suponer que el Ki-67 actuara como un eficiente factor en la biognesis del RNAr.
Empleando hbridos de clulas humanas/roedores Schonk et al, (1989) localizaron el gen responsable de la expresin del antgeno en el cromosoma humano 10. Por hibridacin in situ Fonatsch et al, (1991) situaron el gen humano en el locus 10q25-qter. Mediante FISH (hibridacin in situ con fluorescencia) Traut et al., (1998) encontraron el gen MKi-67 del ratn en el cromosoma 7F3-F5.
En el cncer de mama la determinacin IHQ del antgeno Ki-67 ha sido de utilidad para estimar la cintica celular. Segn Dervan et al., (1989), el nmero de AgNOR (regiones organizadoras nucleolares, teidas con plata) y la determinacin de Ki-67 muestran una significativa correlacin, aportando ambos mtodos informacin complementaria sobre la cintica celular. Estos autores intentaron correlacionar el ndice Ki-67 y el nmero de AgNOR en 27 lesiones benignas mamarias y en 70 cnceres ductales. Mediante tincin IHQ los ndices de expresin del antgeno Ki-67 en las lesiones benignas mamarias variaron entre un 0 y 4%, mientras que en los cnceres se situaron entre un 3 y 98%. Las clulas de fibroadenoma y mastopatas fibroqusticas contenan un promedio de 2,65 6,8 pequeos y uniformes AgNOR/clula, en comparacin a un promedio de 4,2 26,9 frecuentemente irregulares AgNOR/clula en los cnceres. La correlacin entre el contaje de AgNOR y el ndice Ki-67 fue altamente significativa. De manera similar, Ruschoff et al., (1990), en su serie de 30 lesiones benignas y 50 cnceres de mama, citan la buena correlacin entre el nmero de AgNOR por clulas con el ndice de proliferacin medido por tincin IHQ. Adems tanto el nmero de AgNOR como el ndice Ki-67 se relacionaron significativamente con altos grados histolgicos, aneuploida y disminucin del contenido de los RE y RPg. Isola et al., (1990) estudiaron en 102 cnceres de mama la cintica celular mediante tincin IHQ para Ki-67 y lo compararon con el ndice mittico y la fase S por citometra de flujo. El ndice de clulas Ki-67 se correlacion con un elevado nmero de mitosis y con la fase S en tumores con DNA aneuploide. Sin embargo, el pleomorfismo nuclear, la formacin de tbulos y el estado de los ganglios axilares no se relacionaron con el ndice Ki-67. Para Sahin et al., (1991) la tincin con el anticuerpo
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monoclonal Ki-67 es comparable a la citometra de flujo para determinar la fraccin de proliferacin celular en diferentes tumores slidos. Existi una buena correlacin entre ambos mtodos en los casos de tumores con valores intermedios y elevados de la fase S. Brown et al., (1996) valoraron en 674 cnceres de mama el valor pronstico de Ki-67 y lo compararon con la medicin de la fraccin S por CMF. Estos autores constataron una buena correlacin entre ambos mtodos y en el anlsisis multivariante el Ki-67 fue de valor pronstico para la recidiva. De manera similar McGrogan et al., (1997), al comparar en 112 cnceres de mama el mtodo semicuantitativo basado en la inmunotincin con anticuerpo monoclonal Ki-67 con el mtodo cuantitativo de medicin de la fraccin S por citometra de flujo, encontraron una buena correlacin entre ambos mtodos. Utilizando como dintel de positividad un valor superior a la mediana de expresin del antgeno (27,5%), demostraron que una elevada expresin del mismo se asociaba significativamente con un alto grado histolgico, con un elevado ndice mittico y con la ausencia del receptor de progesterona.
La expresin del antgeno Ki-67 en los cnceres de mama, salvo con algunas leves discrepancias, se relaciona con tumores con elevada actividad mitsica, altos grados histolgicos y nucleares, invasin vascular, afectacin ganglionar, ausencia de receptores hormonales, aumento de la expresin de C-erbB-2 y p53. Adems, se ha observado una disminucin de la sobrevida libre de enfermedad y de la supervivencia en los cnceres de mama Ki-67. Varios trabajos aportan estas evidencias y entre ellos destacan los trabajos iniciales de Barnard et al., (1987) que determinaron la presencia del antgeno en 65 cnceres de mama utilizando como ndice el cociente de clulas positivas entre el total de clulas tumorales. Estos autores encontraron una fuerte asociacin entre la expresin del antgeno y el ndice mittico; una dbil asociacin con la edad, el grado histolgico, y la necrosis tumoral; y una ausencia de relacin con el tamao tumoral, el estado ganglionar, el estado hormonal y los niveles de RE. Concluyeron que el anticuerpo era de utilidad para medir parmetros biolgicos, pero de escaso valor para predecir la evolucin de las pacientes. Charpin et al., (1988), en una serie ms amplia de 257 tumores malignos de mama, citan una relacin significativa entre la deteccin positiva del antgeno Ki-67 y el grado de diferenciacin del tumor, la invasin vascular, la presencia de metstasis ganglionares y la ausencia de RE y RPg. En otro estudio basado en 136 cnceres, Bouzubar et al., (1989) sealan la asociacin existente entre la alta expresin del antgeno Ki-67 con una elevada actividad mittica, con una pobre diferenciacin tumoral y con la recidiva precoz tras la mastectoma. Segn Sahin et al., (1991), en su serie de 42 pacientes con cncer ductal infiltrante sin afectacin ganglionar, el mayor porcentaje de clulas con tincin positiva para Ki-67 (mediana 14) se observ en tumores con un alto grado nuclear y con una elevada actividad mittica. En el anlisis univariante la recidiva y la disminucin de la supervivencia se
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relacionaron significativamente con una elevada expresin del antgeno. Para Gasparini et al., (1991) la tincin con Ki-67 mostr una buena correlacin con la medicin de la fase S tanto en tumores diploides como aneuploides. Estos autores en una serie de 122 cnceres de mama objetivaron adems, que elevados ndices de Ki-67 se relacionaron con la presencia de metstasis ganglionares, con una pobre diferenciacin histolgica e invasin vascular peritumoral. En cambio, la inmunotincin de Ki-67 no se relacion con la expresin del CerbB-2 y el EGFR. En un anlisis de 568 cnceres de mama, Weikel et al., (1991) encontraron una correlacin positiva entre la tincin con Ki-67 y el grado nuclear. Los tumores con grado nuclear III exhibieron una fuerte inmunotincin que se correspondi con una ausencia de receptores de estrgeno, con una mayor expresin de C-erbB-2 y con un menor intervalo libre de enfermedad. No observaron diferencias en la supervivencia entre los cnceres con grado nuclear II y III, sin embargo, existi una significativa disminucin de la supervivencia de ambos en comparacin con los tumores de grado nuclear I.
Gaglia et al., (1993), en el anlisis multivariante de 385 pacientes intervenidas por cncer de mama, citan el valor pronstico independiente del ndice de Ki-67 (mediana 9%) y de la afectacin ganglionar. Veronese et al., (1993), en un estudio de 129 neoplasias malignas de mama, describen que la probabilidad de recidiva y muerte a 4 aos fue significativamente superior en los tumores que presentaban elevados ndices de Ki-67 (20 % >) en comparacin con aqullos con bajos ndices. Para Pierga et al., (1996) en el anlisis multivariante de 127 cnceres de mama, la fraccin de crecimiento determinada por la inmunotincin con Ki-67 (punto de corte: mediana 8%) fue de valor pronstico para la recidiva, pero inferior a la afectacin ganglionar y la edad por debajo de los 45 aos. Molino et al., (1997), en una serie de 322 cnceres de mama, sealan una asociacin significativa del Ki-67 con el tamao tumoral, afectacin ganglionar, y el contenido de RE y RPg. En el anlisis multivariante la tincin positiva para Ki-67 fue de valor pronstico para la recidiva y la supervivencia. De manera similar, Rudolph et al., (1999), hacen referencia al valor pronstico de la medicin de la proliferacin celular, en un estudio de 351 pacientes con cnceres de mama sin afectacin ganglionar. Las pacientes con un ndice de clulas ki-S2 (anticuerpo monoclonal contra Ki-67) superior al 10% tuvieron un riesgo de mortalidad hasta 20 veces superior. En el anlisis multivariante el ndice de tincin ki-S2 fue el factor de mayor prediccin para el intervalo libre de enfermedad y la supervivencia global. Otros estudios tambin han objetivado una disminucin del intervalo libre y de la supervivencia en aquellos tumores con un alto ndice de Ki-67 y: 1- la presencia de p53 (Beck et al., 1995); 2- la positividad para EGFR y C-erbB-2 y la negatividad para los receptores de estrgeno y progesterona (Archer et al., 1995; Ioachim et al., 1996; Oehler et al., 1997); y 3- la ausencia de pS2 (Racca et al., 1995).
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El anticuerpo monoclonal Ki-67 ha sido de utilidad para predecir la respuesta biolgica tumoral al tratamiento neoadyuvante. As, Bottini et al., (1996) examinaron el efecto producido sobre la expresin de Ki-67, RE y C-erbB2 por la quimioterapia neoadyuvante (CMF o epirrubicina) y el tratamiento endocrino en 99 cnceres de mama T2-4 NO-1 M0. Se objetiv una reduccin de ms del 50% del tamao tumoral en el 70,9% de los tumores; de stos, un 30,3% obtuvieron una respuesta completa. El ndice de Ki-67 disminuy de un 13% antes de la terapia a un 4,5% postmastectoma. Por el contrario, no observaron diferencias en la expresin de los RE y C-erbB-2 antes y despus del tratamiento neoadyuvante. En otro estudio de caractersticas muy similares al anterior basado en 76 cnceres de mama, Bottini et al., (1998), sealan que la reduccin de la expresin de Ki-67 se relacion con una buena respuesta clnica. En cambio, observaron un mayor nmero de recidivas y un menor intervalo libre de enfermedad en las pacientes cuyos tumores presentaron un aumento en el nmero de clulas Ki-67 al final de la quimioterapia. Adems, consideraron que la reduccin en el tamao y la expresin de Ki67 demostrada en tumores RE+ se debi a una disminucin de la actividad proliferativa, en contraste con lo observado en los RE-, en cuyo caso actuaron otros mecanismos como la apoptosis. De manera similar, Makris et al., (1998) compararon los cambios producidos en los niveles de los receptores hormonales y la expresin del antgeno Ki-67, en 21 pacientes con cncer de mama tratadas con tamoxifn antes y despus de la ciruga. De este modo, objetivaron que la respuesta al tratamiento hormonal se correspondi con una disminucin en los niveles de expresin del antgeno Ki-67 y de los RE, junto con el aumento de los RPg a los 14 das de estar recibiendo tamoxifn. Otro estudio realizado por el mismo autor publicado en 1999, en el que se contrastaron la expresin del antgeno Ki-67, los niveles de receptores hormonales, la presencia de p53 y la expresin de Bcl-2 en 31 pacientes con cncer de mama que recibieron secuencialmente tratamiento con mitomicina C, metotrexato y tamoxifn, tambin evidenci una disminucin de los RE y del antgeno Ki-67 y un aumento en los niveles del RPg, en las pacientes con una buena respuesta a la terapia. Por otra parte, cuando se valor la relacin entre el ndice apopttico y la tasa de proliferacin medida por el anticuerpo monoclonal Ki-67 antes y despus de recibir tratamiento quimioterpico, se observ una reduccin del ndice apopttico y de la expresin del antgeno Ki-67 con respecto a los valores pretratamiento, tanto en los casos con respuesta como en las lesiones residuales. La nica excepcin fue el aumento de la expresin de Bcl-2 en los tumores residuales (Ellis et al., 1998).
Aparte de su posible consideracin como factor de pronstico en el cncer de mama, estos estudios avalan la utilidad del anticuerpo monoclonal para predecir la respuesta a tratamientos quimioterpicos y endocrinos antes de la intervencin quirrgica.
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ANTIGENO NUCLEAR DE PROLIFERACIN CELULAR. (PCNA).

Tan et al., (1986) publicaron el aislamiento de una protena auxiliar necesaria para la actividad de la DNA polimerasa delta, pero carente de actividad polimerasa, primasa, ATPasa y nucleasa. La protena era incapaz de unirse a una hebra simple o doble de DNA, sin embargo, permita a la DNA polimerasa delta duplicar moldes con bajos radios de poli dA/oligo dT, 20:1 y adems, era especfica para esta enzima, careciendo de efecto sobre la DNA polimerasa alfa del timo del carnero y de la DNA polimerasa I de la E coli. La observacin de una banda simple de 37.000 daltones en la electroforesis en gel de sulfato de dodecil sdico sugiri su existencia como un dmero de subunidades idnticas. Bravo et al., (1987) demostraron mediante estudios de inmunofluorescencia y autorradiografa que el antgeno nuclear de proliferacin celular, PCNA, era idntico a la protena nuclear de 36 kDa (ciclina) cuya sntesis y aparicin durante la fase S, se relacionaba con el estado proliferativo celular y que haba sido identificada en lneas celulares humanas, del ratn, del hmster y de las aves. Tambin constataron que esta protena era semejante a una ciclina auxiliar necesaria para la actividad cataltica de la DNA polimerasa delta aislada en el timo del carnero por Tan. Los estudios sobre duplicacin del genoma del virus del simio SV40 (Prelich et al., 1987), cuyo mecanismo de replicacin semeja a los cromosomas humanos, permiti el aislamiento y purificacin de esta protena de 36 kDa necesaria para la fase de elongacin del DNA duplicado del virus. Estos autores comprobaron que las propiedades fsicas y el patrn electrofortico eran similares al de una protena que regulaba la actividad enzimtica de la DNA polimerasa delta del timo del carnero. Por otra parte, Lee et al., (1989) confirmaron que el DNA polimerasa alfa y delta, el inhibidor de elongacin I, el activador I y el PCNA eran necesarios en el proceso de duplicacin del virus SV40.
La importancia de este cofactor en la sntesis de DNA fue sealada por Suzuka et al., (1989), al demostrar que anticuerpos contra el PCNA humano reaccionaban con los ncleos de clulas en proliferacin de diferentes especies de animales y de plantas. La comparacin de la secuencia de aminocidos del PCNA de la rata y del hombre revel una diferencia en solo 4 de sus 261 aminocidos, por tanto, el PCNA es una protena que ha permanecido muy conservada durante la evolucin. El gen del PCNA consta de 6 exones y est presente en una sola copia (Travali et al., 1989). Mediante anlisis Southern blot del DNA de hbridos de clulas somticas, Ku et al., (1989), localizaron el gen en el cromosoma humano 20. Estudios de hibridacin in situ le han asignado el locus 20p13 (Webb et al., 1990) y el 20 p12 (Rao et al., 1991).
Diversos estudios experimentales han demostrado la participacin activa del PCNA en la sntesis y reparacin del DNA. Jaskulski et al., (1988) objetivaron en clulas en proliferacin
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activa Balb/c3T3, que la administracin de oligodeoxynucletidos antisentido al PCNA, inhiban la sntesis de DNA y la mitosis. La exposicin de estas clulas a oligodeoxynucletidos del mismo sentido al PCNA careci de efecto certificando, de esta manera, la accin inhibitoria de la sntesis del DNA producida por el bloqueo de la actividad del PCNA. Zuber et al., (1989) demostraron que el PCNA estimulaba la actividad de la DNA polimerasa delta. Inyectaron un anticuerpo humano anti-PCNA en huevos sin fertilizar de Xenopus laevis y examinaron los efectos ocasionados sobre la replicacin de plsmidos y de los cromosomas. El anticuerpo inhibi la duplicacin de los plsmidos en un 67% y la duplicacin residual fue abolida inyectando un anticuerpo monoclonal contra la DNA polimerasa alfa. Por el contrario, en los cromosomas el anticuerpo anti-PCNA suprimi un 30% de la sntesis de DNA, siendo el resto anulada por un anticuerpo anti-DNA polimerasa alfa. Las diferencias en la inhibicin de la sntesis de DNA se debieron al mayor contenido de DNA polimerasa delta en los plsmidos que en los cromosomas. De este modo, se confirm la influencia del PCNA sobre la actividad de la enzima DNA polimerasa delta.
La DNA polimerasa delta (122 kDa) posee una actividad exonucleasa 3 - 5, siendo esencial en el proceso de duplicacin y reparacin del DNA. Esta enzima, junto con la DNA polimerasa epsilon que tambin posee actividad exonucleasa 3- 5, son necesarias para mantener la fidelidad del DNA. Estas enzimas se encargan de escindir nucletidos que han sido incorporados errneamente durante la replicacin (Byrness, 1984; Syvaoja, 1990) permitiendo que el proceso de sntesis del DNA contine correctamente a travs de la accin de la DNA polimerasa alfa (Perrino y Loeb, 1990). La DNA polimerasa est formada por un complejo constituido por el PCNA, la DNA polimerasa delta y el factor de replicacin C. El PCNA se une especficamente a la subunidad cataltica p125 (regin N2) de la DNA polimerasa delta (Zhang et al., 1999). Otra enzima, la DNA ligasa I, interacciona con el PCNA produciendo una inhibicin de la sntesis del DNA por la DNA polimerasa delta; a su vez a travs del PCNA, la DNA ligasa es capaz de estimular la sntesis de DNA por medio de la DNA polimerasa epsilon. En consecuencia, la DNA ligasa puede influir de diferentes maneras sobre estas polimerasas a travs de la accin del PCNA (Mossi et al., 1998).
Los trabajos de Podust et al., (1994) han demostrado que se requiere la presencia del factor C y el PCNA para el adecuado ensamblaje de la DNA polimerasa delta completa sobre el DNA. Adems, es de importancia fundamental la estructura circular del DNA que sirve de sustrato para la correcta interaccin de estas protenas auxiliares con las DNA polimerasas. Ambas, el factor de replicacin C y el PCNA, forman una especie de abrazadera que se desliza a lo largo de la doble hebra de DNA. Flores-Rozas et al., (1994) observaron que la protena p21 (Cip1)
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regulada por la p53 produca una inhibicin in vitro de la sntesis del DNA del virus SV40 por interaccin con el PCNA. La p21 de alguna manera interfiere con el movimiento de la DNA polimerasa delta durante el proceso de elongacin de la cadena de DNA. Chen et al., (1996) demostraron que la p21 inhibe la sntesis de DNA por su interaccin con el PCNA y por desacoplar el complejo PCNA-Fen1. El Fen1 es una exonucleasa 5- 3 que degrada las uniones DNA-prmeros RNA en los extremos 5de los fragmentos inmaduros de Okazaki previos a su unin en una hebra continua de DNA. De este modo, el complejo PCNA-Fen1-DNA pol delta participa en el proceso replicativo. Tres molculas de p21 se unen al PCNA constituyendo un trmero que interfiere con la formacin o desacopla el complejo PCNA-Fen1. Matsuoka et al., (1994), tras analizar un conjunto de mutantes con deleciones en las regiones amino y carboxiterminal, comprobaron que el PCNA interacciona directamente con las ciclinas tipo D y, por tanto, el PCNA participa en el control del ciclo de divisin celular.
Recientemente Coll et al., (1997) mediante fraccionamiento, cromatografa, sedimentacin y coinmunoprecipitacin aislaron un complejo multiproteico, el DNA sintesoma, involucrado en la sntesis del DNA de las clulas de cncer de mama. El DNA sintesoma est constituido por un eje central con fuertes interacciones entre las DNA polimerasas alfa y delta, la DNA primasa, el PCNA y el factor de replicacin C. Otras enzimas, la polimerasa poly (ADP-ribosa), la DNA polimerasa epsilon y la DNA ligasa interaccionan con el complejo directamente por medio del PCNA o de la DNA polimerasa alfa. Estos autores afirmaron en su estudio que en el cncer de mama las DNA polimerasas alfa, delta y epsilon participan activamente en la sntesis del DNA.
En el cncer de mama la determinacin IHQ del PCNA se ha considerado de utilidad para valorar la proliferacin celular. As, Dawson et al., (1990) midieron y compararon el contenido del DNA y la actividad proliferativa en 54 cnceres de mama y en 15 lesiones benignas empleando la medicin de la fraccin S por citometra de flujo (CMF) y la tincin IHQ con los anticuerpos monoclonales para Ki-67 y PCNA. La tincin positiva para Ki-67 fue mayor en los cnceres (21, 6% +/-13,1%) que en los tejidos mamarios normales (7,9% +/- 5,6%), al igual que el PCNA con un 10,2% de positividad de los cnceres frente a un 2,7% de las lesiones benignas. Tambin los porcentajes de la fraccin S fueron superiores en los cnceres (7,9%) en comparacin con las lesiones benignas (3,2%). La aneuploida y altos grados nucleares se correspondieron con una elevada fraccin S y con la sobreexpresin de PCNA y Ki-67. Segn estos autores, los mtodos inmunohistoqumicos, salvo leves discrepancias, fueron equiparables a la medicin de la fraccin S por CMF en la estimacin de la proliferacin celular. Tambin Visscher et al., (1992) compararon en 70 cnceres de mama, el ndice cintico mediante la determinacin del porcentaje de clulas teidas PCNA frente a la medicin de la fraccin S por
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CMF. Existi una buena correlacin entre ambos mtodos. La inmunotincin positiva para PCNA se relacion significativamente con aneuploida, altos grados nucleares, invasin angiolinfomatosa y necrosis tumoral. Un mayor porcentaje de clulas teidas para el PCNA se observ en los tumores aneuploides (14,5%) en relacin con los diploides (10,7%). Por otra parte Yu et al., (1995) compararon en 40 muestras parafinadas de cncer de mama la capacidad para medir la actividad proliferativa de varios anticuerpos monoclonales a mnimas diluciones (PC10, PC2, PC5, PC8, 19F4 y MIB-1). Cuando se contrastaron los resultados de la tincin IHQ con la medicin de la fraccin S por CMF, se evidenci que slo dos anticuerpos, el PC10 y el MIB-1 (Ki-67), eran tiles para identificar las clulas en proliferacin, ofreciendo el resto de anticuerpos muy pocas ventajas. Por el contrario, para Gillet et al (1993) la tincin IHQ del PCNA fue de escasa utilidad para medir la actividad proliferativa.
La intensidad de la tincin IHQ para el PCNA vara en diferentes reas del tumor y su positividad no siempre se corresponde con un aumento en la actividad proliferativa celular. Segn Van Dierendonck et al., (1991), los anticuerpos monoclonales contra PCNA son excelentes para detectar in situ las clulas con contenido de DNA en la fase S, sin embargo, esto no significa que la inmunotincin positiva sea una medida de la actividad proliferativa. Estos autores examinaron la distribucin del PCNA mediante tincin IHQ con dos anticuerpos monoclonales (19A2 y 19F4) en clulas de cncer de mama en cultivo. Las clulas en divisin mostraban un patrn de tincin intensamente granular en contraste con la tincin ms difusa observada en las clulas que no se encontraban en la fase S. En clulas MCF7 tratadas con tamoxifn se apreci una disminucin del porcentaje de ncleos en proliferacin (48% a 8%) en los primeros 8 das, en cambio, la deteccin de los antgenos PCNA y Ki-67 permaneci estable. La exposicin de esta lnea celular al agente metrotexate produjo una rpida acumulacin de clulas con contenido de DNA en la fase S precoz que fue detectada por anticuerpos anti-PCNA. De este modo, los anticuerpos detectaron un contenido de DNA en clulas que no se estaban dividiendo activamente o cuyo ciclo celular se haba interrumpido por la accin de los agentes administrados. En otro estudio basado en la determinacin IHQ para PCNA en 175 cnceres de mama, Aaltomaa et al., (1992), objetivaron importantes variaciones en la inmunotincin en diferentes reas del tumor. Las zonas del tumor correspondientes a los mrgenes infiltrantes presentaban una tincin ms intensa. Elevados porcentajes de ncleos teidos se relacionaron con peor grado histolgico y con la recidiva tumoral. En el anlisis multivariante la positividad para PCNA determin un menor intervalo libre de enfermedad y supervivencia global. Asimismo, Siitonen et al., (1993) observaron en 88 cnceres de mama variaciones en los patrones de tincin (anticuerpo 19F4) en diferentes reas del tumor debido a heterogeneidad intratumoral. La proporcin del rea nuclear-PCNA+ en todo el tumor vari de
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un 0,7% a un 45,2% (promedio: 14,4%). En el 79% de los casos los ndices de PCNA fueron ms elevados en la periferia que en el centro del tumor. A pesar de las variaciones en los patrones de tincin, la actividad proliferativa medida por la tincin IHQ mostr una buena correlacin con la obtenida mediante la medicin de la fraccin S por CMF.
Segn citan varios autores, los porcentajes de positividad para el PCNA son ms bajos en las lesiones benignas mamarias que en las neoplasias malignas. En los cnceres de mama, los porcentajes de ncleos teidos tambin varan en funcin del tipo histolgico y del grado de diferenciacin del tumor. Adems, se ha observado un incremento en los ndices de proliferacin celular medidos por la inmunotincin contra PCNA desde las lesiones con cambios histolgicos anaplsicos incipientes hasta el establecimiento de un cncer y el desarrollo de metstasis. Sherestha et al. (1992) determinaron la proliferacin celular en 4 tejidos mamarios lactantes y en 98 lesiones benignas y malignas de la mama. Los porcentajes de clulas PCNA+ fueron significativamente inferiores en el tejido mamario lactante (promedio: 3,6%) en comparacin con las mastopatas y los fibroadenomas (promedio: 23,7%). En los cnceres infiltrantes la tincin positiva vari entre un 236% (promedio: 12,3%), incrementndose en los cnceres metastsicos (promedio: 28,5%). Elevados ndices de clulas PCNA+ se relacionaron con un alto grado histolgico y con la expresin de C-erbB-2, y EGFR. De la misma manera, Kalogeraki et al., (1994) al comparar el porcentaje de positividad al PCNA en 20 pacientes con fibroadenomas, en 20 mujeres con enfermedad fibroqustica y en 20 enfermas con carcinomas ductales infiltrantes, comprobaron un mayor ndice de PCNA en los carcinomas (56%) que en el resto de patologas y a su vez, un mayor ndice en los fibroadenomas (25%) que en la enfermedad fibroqustica. Cardillo et al., (1995) tambin examinaron la expresin de PCNA en 74 patologas benignas, en 3 hiperplasias epiteliales atpicas, en 5 carcinomas in situ y en 13 cnceres infiltrantes. La tincin IHQ fue positiva en el 40% de las enfermedades benignas, en el 75% de las hiperplasias atpicas/carcinomas in situ y en el 92% de los cnceres infiltrantes. Cuando las lesiones se estratificaron segn un ndice de tincin bajo, moderado y alto, se observ que el 50% de las hiperplasias atpicas/carcinomas in situ y el 54% de los cnceres infiltrantes presentaron elevados niveles de expresin de PCNA (> 50%). Los ndices fueron bajos (18% <) y moderados (18 50%) en los quistes, adenosis esclerosantes y epiteliosis. En cambio, Sasa et al., (1993) contrastaron en 40 casos de cncer de mama, la proliferacin celular mediante la determinacin IHQ del PCNA en el componente intraductal, en el rea infiltrante y en sus respectivas metstasis ganglionares. El ndice fue mayor en las metstasis ganglionares que en el rea infiltrante primaria y sta mayor que en el componente intraductal. En otro estudio basado en la determinacin IHQ del PCNA en 509 cnceres de mama, Haerslev et al., (1994) encontraron elevados ndices de PCNA en el
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carcinoma intraductal tipo comedo y en el carcinoma infiltrante con relacin a otros tipos histolgicos. Tambin las metstasis ganglionares axilares tuvieron ndices superiores que sus respectivos tumores primarios. La elevada expresin de PCNA se relacion significativamente con la afectacin ganglionar, alta tasa mitsica, pleomorfismo nuclear severo, altos grados histolgicos y ausencia de los RPg. En el anlisis univariante la elevada expresin de PCNA se asoci significativamente a una disminucin del intervalo libre y a la supervivencia global.
La relacin entre la expresin de PCNA y p53 fue estudiada por Schimmelpenning et al., (1994), en 180 cnceres de mama. Existi una buena correlacin entre tumores con altos ndices de PCNA (20% >) y la presencia de p53, alto grado histolgico y aneuploida. La sobrevida libre de enfermedad fue menor en los pacientes con tumores PCNA+/p53+. Igualmente, Haerslev, (1995) analizaron en 490 pacientes con cncer de mama, la expresin de p53 y su relacin con la actividad proliferativa determinada por la positividad IHQ del PCNA. Aunque observaron en el anlisis univariante una relacin directa entre la deteccin de p53 y elevados ndices de PCNA, la protena p53 careci de valor pronstico. Sin embargo, estos dos autores hacen referencia al mal pronstico de las pacientes con cncer de mama cuyos tumores presentaron elevados ndices de PCNA y alta expresin de p53. Para Gohring et al., (1994), el PCNA fue indicador de menor intervalo libre slo en las enfermas con ganglios axilares positivos. No observaron una asociacin significativa con la edad, estado hormonal, afectacin axilar y RE. Tambin Sheen-Chen et al., (1997) demuestran en el anlisis multivariante de Cox de 123 cnceres de mama con ganglios positivos, que un alto ndice de PCNA (35% >) es un factor pronstico de menor intervalo libre y supervivencia global.
Diferentes grupos consideran al PCNA como un marcador de escaso valor pronstico. En un estudio sobre 144 casos de cncer de mama Thomas et al., (1993) valoraron la utilidad del anticuerpo monoclonal PC10 como parmetro pronstico. Utilizando el ndice de inmunotincin positiva basado en el promedio del porcentaje de clulas tumorales con ncleos teidos (18%) no observaron una asociacin significativa con los parmetros clnico-patolgicos clsicos y concluyeron sealando que el PCNA careci de valor pronstico. Asimismo, Gasparini et al., (1994) analizaron el papel predictivo de la medicin de la fase S por CMF y la determinacin IHQ con los anticuerpos para el antgeno Ki-67 y el PC10 (PCNA) en el cncer de mama. En el anlisis univariante se relacionaron significativamente con la sobrevida libre de enfermedad la medicin de la fraccin S, la inmunotincin positiva para Ki-67, el grado histolgico y la afectacin de los ganglios axilares. Sin embargo, en el estudio multivariante nicamente fueron pronstico la determinacin de la fraccin S y el estado de los ganglios axilares. En otro trabajo basado en 471 cnceres de mama, Schonborn et al., (1995), citan el limitado valor del PCNA
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como factor pronstico en comparacin con los factores clsicos, aunque observaron en el anlisis univariante una pobre supervivencia en pacientes con altos ndices de PCNA (20% >) y ganglios negativos; efecto que desapareci en el anlisis multivariante. Heimann et al., (1997) hacen referencia a la virulencia del tumor determinada por la deteccin del PCNA y el grado nuclear en pacientes sometidas a tratamiento quirrgico exclusivamente y con un seguimiento a largo plazo. Aunque, no se observaron diferencias significativas en el intervalo libre de enfermedad en funcin del PCNA, despus de los 5 aos de seguimiento se apreciaron importantes discrepancias. En las pacientes con elevados ndices de PCNA el 80% de las metstasis se produjeron en los 3 primeros aos, en contraposicin con las pacientes con bajos ndices de PCNA que precisaron mas de 10 aos para la aparicin del 80% de las metstasis. De manera similar, en tumores con un grado nuclear III, el 80% de las metstasis se hicieron evidentes en los primeros 4 aos, en comparacin con los 12 aos transcurridos para los tumores con grado nuclear II. As, las diferencias en la expresin del PCNA seran un reflejo de la virulencia del tumor y las observadas con el grado nuclear expresaran divergencias en la metastagenicidad.
En un intento por predecir la respuesta a la terapia con drogas citotxicas, Botti et al., (1993), examinaron inmunohistoqumicamente la expresin de la glicoprotena P (anticuerpo C219) y el PCNA (PC10), en 25 pacientes con carcinoma de mama avanzado. Encontraron una elevada expresin de glicoprotena P (76%) y PCNA (100%) en las pacientes que desarrollaron recidivas locorregionales y a distancia. Sin embargo, a diferencia de la glicoprotena P que mostr una asociacin estadsticamente significativa con la respuesta a la quimioterapia y la supervivencia, un alto ndice de PCNA careci de valor en predecir la respuesta a la quimioterapia y la supervivencia. Por otra parte, Frassoldoti et al., (1997) estudiaron los cambios celulares producidos antes y despus de recibir citotxicos en 29 cnceres de mama, mediante el anlisis de la expresin de los receptores hormonales, Ki-67, PCNA, EGFR, bcl2, p53 y glicoprotena P. Objetivaron un significativo aumento en el ndice apopttico y en los niveles de PCNA, EGFR y glicoprotena P, al completar el tratamiento que fue independiente del tipo de quimioterapia empleada. Los pacientes que respondieron mostraron una significativa disminucin en los niveles de RE y, por el contrario, se apreci un aumento en los ndices de PCNA y EGFR en el grupo sin respuesta.
En el momento actual existen controversias sobre el valor pronstico y predictivo del PCNA.
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P53.
Inicialmente la p53 fue detectada como una protena asociada al antgeno T en clulas transformadas por el virus SV40. El gen p53 fue clasificado como un gen nuclear promotor de procesos tumorognicos debido a su capacidad de cooperar con el oncogn ras en el proceso de transformacin maligna de fibroblastos primarios de ratones en cultivo. En los experimentos se utilizaron plsmidos que contenan el oncogn de genotecas obtenidas de RNA extrado de clulas transformadas. Estos plsmidos en cooperacin con el oncogen ras eran capaces de inmortalizar, transformar y aumentar el potencial metastsico de clulas tumorales. Adems, in vivo, inducan el desarrollo de tumores en clulas no tumorognicas. Se le consider como un oncogn tipo myc por su similitud funcional, aunque posteriormente el anlisis de los alelos demostr que se haban producido mutaciones y que la protena p53 normal en realidad no cooperaba con el oncogn ras (Rassouizadegan et al., 1982; Land et al., 1983; Quintanilla et al., 1986; Ullrich et al., 1992). Introduciendo deleciones selectivas en uno y ambos alelos de la p53 mediante la tcnica de destruccin gnica se pudo determinar el carcter supresor del gen. Los ratones con ausencia de los dos alelos (homocigotos) eran aparentemente normales, sin embargo, presentaban precozmente una elevada susceptibilidad al desarrollo de tumores. La incidencia de tumores en ratones heterocigotos era ms baja que en los homocigotos, pero superior a la observada en ratones normales (Klein, 1993). En la clnica encontramos tumores que poseen un alelo mutado y el normal, expresando conjuntamente la protena normal y la mutada. En estos casos el p53 se comporta como un gen dominante recesivo. En cambio, los individuos pertenecientes a familias con sndromes hereditarios de predisposicin al cncer, como es el caso del sndrome de Li-Fraumeni, heredan una mutacin del gen p53 por lnea germinal, adquiriendo eventualmente otra mutacin del alelo normal por va somtica (Levine y Momand 1990).
La p53 es una fosfoprotena nuclear que acta como un factor de transcripcin con mltiples funciones, interviniendo en el control de la progresin del ciclo celular, la regulacin de factores de transcripcin, el mantenimiento de la integridad del DNA y la supervivencia de las clulas expuestas a agentes que causan un dao al DNA, permitiendo as su reparacin y, si no es posible, conducindolas a la muerte celular. Uno de los principales mecanismos de proteccin es el arresto del ciclo de divisin celular posterior al dao al DNA evitando, de este modo, la duplicacin de una plantilla de DNA alterado que se pueda transmitir a otras generaciones celulares. La p53 es capaz de detectar e interaccionar especficamente con secuencias de DNA que han sido daadas, accin que ejerce en el punto de control G1. Se precisa de la p53 para mantener el estado diploide durante la divisin celular, su deficiencia produce alteraciones en la ploida (Cross et al., 1995). La protena puede ser fosforilada/defosforilada por una serie de
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protenas cinasas y fosfatasas y adems, puede ser activada por autoprotelisis. La rotura proteoltica se produce tras el contacto directo de la protena con zonas lesionadas del DNA.
Los estudios en ratones transgnicos con mutaciones en uno de los dos alelos de p53 permitieron demostrar a Lee y Bernstein (1993) que la ausencia de la protena silvestre induce una resistencia celular a la radiacin gamma. La protena p53 mutada ejerce un efecto dominante negativo evitando la apoptosis o muerte de las clulas sometidas a la radiacin. ElDeiry et al., (1993) sealaron que la p53 no es esencial para el desarrollo celular normal, sin embargo, en situaciones de estrs o dao al DNA se produce una estimulacin de p53 que a su vez activa la transcripcin de ciertos genes. Entre ellos, la p53, activa la transcripcin del gen WAF1 o gen CIP1 (Harper et al., 1993), cuyo producto de expresin se une e inhibe la actividad cinasa dependiente de ciclinas evitando, de esta forma, la fosforilacin de las ciclinas lo que conlleva a un bloqueo en la progresin del ciclo celular. As pues, ante un dao importante en el DNA, en la mayora de las clulas se produce una parada del ciclo celular en G2. Este proceso se logra si las clulas contienen p53 silvestre y son capaces de activar transcripcionalmente la protena inhibidora de las cinasas dependiente de ciclinas, p21 (Bunz et al., 1998). En consecuencia, la protena p53 puede actuar directa o indirectamente sobre la maquinaria encargada de la reparacin del DNA. En situaciones de estrs se produce un aumento en la expresin de p53 y esta a su vez es capaz de interaccionar con las protenas p21, ERCC3 y GADD45; stas dos ltimas intervienen en los mecanismos de reparacin del DNA. La GADD45 (arresto del crecimiento y dao al DNA) es una protena nuclear que es inducida cuando se produce una lesin al DNA y en parte regulada por la p53. Esta protena se une a las cinasas dependiente de ciclinas y al PCNA, y acta inhibiendo la entrada de las clulas en la fase S y estimulando la excisin y reparacin de segmentos de DNA daados. Junto con la p53 participa en el punto de control del ciclo celular y en la reparacin del DNA (Smith et al., 1994; Carrier et al., 1994)
Mediavilla et al., (1999) han demostrado el efecto inhibitorio que ejerce la melatonina a concentraciones fisiolgicas sobre el crecimiento de las clulas MCF-7. Esta disminucin del crecimiento coincidi con un aumento en la expresin de la p53 y la protena p21WAF, de este modo, la melatonina produce un arresto del ciclo celular dependiente de p21 mediado por va del p53. Por tanto, ambas protenas, la p53 y la p21, son fundamentales para supervisar, controlar y mantener en G2 las clulas humanas. La p53 tambin ejerce una importante funcin mediadora en la muerte celular, siendo necesaria para evitar la proliferacin celular inducida por la activacin de oncogenes. La activacin del oncogen c-Myc en fibroblastos de ratn quiescentes que expresaban la p53 silvestre, produjo reentrada en el ciclo de divisin celular y
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apoptosis, en cambio, la activacin de c-Myc en fibroblastos carentes de p53 estimul la proliferacin celular sin objetivar la muerte celular (Hermeking y Eick 1994). Experimentos bioqumicos y farmacolgicos sugieren que la muerte celular o apoptosis mediada por p53 se debe a la induccin transcripcional de genes relacionados con las reacciones redox, con la formacin de oxgeno reactivo y con la degradacin oxidativa de componentes mitocondriales (Maxwell y Roth 1994).
Con el empleo de clones de DNA complementarios de clulas hbridas de roedores-humanos y mediante translocacin e hibridacin in situ, McBride et al., (1985) y Benchimol et al., (1985) localizaron el locus del gen p53 en el brazo corto del cromosoma 17p13. Los estudios con hbridos somticos realizados por van Tuinen y Ledbetter (1987) le asignaron el locus 17p13.105-p12.
El gen p53 codifica 11 exones y posee dos regiones promotoras. La primera se localiza 100 a 250 pares de bases por arriba del primer exon y la segunda, un promotor ms fuerte que el primero, se encuentra dentro de las 10.738 pares de bases del primer intrn, 1.000 bases posteriores al primer exon. Reisman et al., (1996) clonaron el DNA de esta segunda regin promotora asignndole al producto de su expresin el nombre de Hp53int1. Estos autores identificaron un aumento de Hp53int1 en las clulas HL-60 durante el proceso de diferenciacin a granulocitos.
El pptido p53 consta de 393 aminocidos con un peso molecular de 53 kDa. Posee una regin central (aminocidos 100 a 300) en la que se incluye el dominio de unin al DNA (Cho et al., 1994). El centro es resistente a la protelisis y en los extremos se encuentran por un lado, la regin carboxi-terminal relacionada con la oligomerizacin y en el otro extremo la regin amino-terminal que contiene una potente seal de activacin de la transcripcin (Volgenstein y Kinzler, 1994). La estructura tridimensional de la protena semeja un emparedado constituido por grandes lminas beta que actan como peldaos para 3 elementos en forma de asa. El emparedado est compuesto por 2 lminas beta antiparalelas que contienen 4 y 5 hebras beta respectivamente. La primera asa se une al DNA a travs del primer espacio o surco mayor, la segunda asa se une al DNA a travs del segundo surco menor y la tercera asa se empaqueta contra la segunda para estabilizarla. Esta estructura, segn Vogelstein y Kinzler, se correlaciona con los datos sobre mutaciones, observando la mayora de stas en las regiones cercanas a la interfase DNA-protena. Las dos terceras partes de las mutaciones sin sentido se localizan en una de las 3 asas de DNA. El-Deiry et al., (1992) mediante clonacin de DNA humanos identificaron el sitio de unin consenso que consiste en dos copias de un motivo de 10 pares de
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bases separadas por 0 13 pares de bases. Demostraron que una sola copia del motivo era insuficiente para unirse al DNA y cuando existen alteraciones en una de las copias por pequeas que sean y an ante la presencia de mltiples copias, se pierde la afinidad de la p53 por el DNA. El modelo propuesto por Vogelstein y Kinzler (1992) seala que la protena en forma de tetrmero se une a sitios de unin en el DNA activando, de esta manera, la funcin de genes que inhiben el crecimiento e invasin tumoral. La tetramerizacin se consigue mediante la unin de monmeros que interaccionan en el dominio C-terminal (aminocidos 325-356) de la protena. La estructura cristalina de la tetramerizacin ha sido confirmada por Jeffrey et al., (1995). El receptor de estrgeno de manera independiente del ligando (estradiol) interacciona con el extremo amino-terminal de la p53 evitando, as, la desactivacin de la protena por el factor regulador hdm2 (human double minute-2). La interaccin entre el RE y la p53 no interfiere con la unin de p53 y el hdm2, mas bien forman un complejo ternario, estableciendo un mecanismo de regulacin de la actividad de p53. (Liu et al., 2000).
Se han propuesto diferentes modelos de carcinognesis basados en los mecanismos de inactivacin de la protena p53. La delecin o de uno o dos de los alelos reduce la expresin de los tetrmeros lo que conlleva a una disminucin en la expresin de los genes inhibitorios del crecimiento celular. Mutaciones puntuales producen una protena truncada incapaz de sufrir oligomerizacin y, por tanto, una disminucin en los tetrmeros p53. Las mutaciones sin sentido inducen efectos dominantes negativos con una mayor reduccin de la funcin de los tetrmeros inactivos. Este tipo de mutaciones es frecuente en el cncer de mama. Las mutaciones monoallicas asociadas a deleciones monoallicas ocasionan la presencia de la p53 mutada exclusivamente. Las clulas carentes de la p53 silvestre pueden desarrollar tumores por la falta de regulacin del ciclo celular y en estos casos, la p53 mutada bien interfiere con las acciones de la p53 silvestre o directamente acta como un oncogn de iniciacin.
La protena p53 puede ser secuestrada por unin a la protena E6 (producto de expresin del gen del virus del papiloma humano) induciendo su inactivacin y aumento en su degradacin (Werness et al., 1990). La protena p53 tambin puede ser inactivada por una alteracin en el producto de expresin del gen MDM2, que ha mostrado ser un regulador de p53 (Fakharzadeh et al., 1991). En condiciones normales o de no-estrs, la protena MDM2 unida al p53 ejerce un efecto inhibitorio sobre sta. La unin de la protena MDM2 inactiva la p53 por degradacin a travs de la va de la ubiquitina. Shieh et al., 1997 han demostrado que cuando se produce un dao del DNA la p53 es fosforilada en los residuos de serina 15 y 37. La fosforilacin induce un cambio conformacional que le permite liberarse de la protena MDM2. La amplificacin del gen MDM2 con sobreexpresin de su protena ha sido constatada por Oliner et al., (1992) en varios
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sarcomas humanos. La p53 posee adems un sitio de unin para el JNK, la formacin de complejos p53-JNK bloquean la degradacin de p53 por la va de la ubiquitina, as, su ausencia ocasiona un aumento de la vida media de p53 (Fuchs et al., 1998). Los complejos p53-JNK se han observado en las fases G0/G1, mientras que los p53-MDM2 en la fase S/G2M.
Li et al., (1999) han demostrado que el extremo amino-terminal de la protena (hTEP1) asociada a la telomerasa humana (DNA polimerasa de los telmeros) interacciona con la regin carboxi-terminal de la p53 ejerciendo de este modo, la p53, un efecto inhibitorio sobre la actividad de esta enzima. La incubacin de p53 recombinante con extractos de telomerasa nucleares produjo una inhibicin de la actividad de esta enzima y lo mismo ocurri cuando se introdujo un pptido derivado de la regin amino-terminal de la hTEP1. Tanto la DNA polimerasa como la p53 estn implicadas en varios cnceres humanos, as, la prdida de la regulacin de la telomerasa por una p53 inactiva favorecera el desarrollo e inmortalidad de las clulas cancerosas.
Jerry et al., (2000) mediante un modelo de carcinognesis mamaria comprobaron que la prdida de la p53 puede ser suficiente para el desarrollo de tumores mamarios y, an mas, la tumorogenicidad ocasionada por su ausencia se ve incrementada al proveer un estmulo hormonal. El experimento consisti en eliminar el tejido mamario de ratones huspedes BALB/c poseedores de p53 silvestre y transplantar en su lugar tejido mamario carente de p53. Establecieron dos grupos de tejido mamario, uno conteniendo el p53 silvestre y el otro carente de p53 (nulo). Ambos grupos fueron sometidos a 5 tratamientos distintos: ausencia de tratamiento, estmulo hormonal continuo mediante isoinjerto de pituitaria, embarazos mltiples, administracin de DMBA y DMBA ms isoinjerto de pituitaria. En todos los ratones p53 nulos se desarrollaron adenocarcinomas mamarios (62% - 100%), siendo la mayora aneuploides. En el grupo con p53 silvestre la incidencia de tumores fue 0 con los primeros 3 tipos de tratamiento, sin embargo, aparecieron con la administracin de DMBA (4%) y se incrementaron con la combinacin de DMBA y estmulo hormonal (14%).
Entre un 20 y 60% de los cnceres de mama presentan alteraciones del gen p53. El 90% de las mutaciones se han descrito en los exones 5 8 (dominios 2 5 de la protena) distribudos en: 73% de mutaciones puntuales, 6% de mutaciones sin sentido, 13% de inserciones o deleciones que producen alteraciones en la lectura, y 8% de diversos cambios como separaciones, variantes complejas y deleciones e inserciones dentro de una franja. Mediante anlisis REF (Restriction endonuclease fingerprinting), Feng et al., (1999), objetivaron en 48 muestras de cncer de mama un 80% de mutaciones localizadas dentro de la regin de 200 pares
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de bases del gen. Esta tcnica permiti determinar la existencia de 2 haplotipos comunes y 4 infrecuentes. Los dos haplotipos comunes fueron frecuentes en 3 razas distintas y sugeran un origen ancestral. El haplotipo II fue mucho ms abundante en la raza china que en la caucsica y japonesa. De manera similar, Meng et al., (1999) examinaron las mutaciones en los exones 5 8 del gen p53 mediante clones de DNA amplificados por PCR entre 384 mujeres con cncer de mama pertenecientes a una cohorte del sur de la Florida. Estos autores encontraron un importante nmero de tumores con mutaciones en el gen (61%). En 36 cnceres observaron ms de una mutacin, en 31 cnceres 2 mutaciones, en 3 cnceres 3, en un cncer 5 y hasta 6 mutaciones en un solo tumor. La mayora fueron mutaciones sin sentido (n=45) y mudas (n=35), producindose gran parte de ellas en un mismo exon. Tambin el anlisis del gen p53 en una cohorte de 178 mujeres espaolas (Asturias) con cncer de mama mostr en el 59% de los casos (n=105) una o ms mutaciones en el gen (Meng et al., (1999). La mayora se distribuyeron entre los codones 128 a 305 y las ms frecuentes correspondieron a los codones 278, 273, 213 y 227 y fueron descubiertas nuevas mutaciones en 16 codones. Se observaron un 88% de transiciones, un 7% de transgresiones, un 3,5% de separaciones de unin, y un 1,5% de deleciones. En 83 casos (61,5%) existieron mutaciones puntuales, en 45 casos (33,5%) silenciosas o mudas, en 5 casos (3,5%) sin sentido y en 2 (1,5%) cambios de lectura. De las 120 transiciones, 80, fueron G:C a A:T. Este estudio objetiv que existen diferencias raciales, siendo las mutaciones de este grupo diferentes a las observadas en los Estados Unidos y en el norte de Europa.
Segn Lukas et al., (2000), las mutaciones en el gen p53 se producen precozmente y durante la progresin del cncer. Han llegado a estas conclusiones tras investigar mediante SSC-PF y anlisis secuencial del DNA, las mutaciones que se producen en el gen p53 (exones 2 11) en las biopsias congeladas de 27 carcinomas de mama in situ puros (CIS) y de 31 carcinomas in situ con reas de carcinoma infiltrante (CIS+CI). Encontraron un 22% de mutaciones y un 7% de alteraciones en el DNA en los CSI frente a un 19% de mutaciones y un 3% de alteraciones del DNA en los CSI+CI. La sobreexpresin de p53 se objetiv en el 22% de los CSI en comparacin con el 35% de los CSI+CI. En los tumores CSI+CI, las mutaciones que se produjeron en el componente in situ fueron idnticas a las encontradas en el componente infiltrante, sugiriendo la existencia de una relacin clonal de los dos componentes. Asimismo, se observ una significativa asociacin entre las mutaciones y la sobreexpresin en los CSI y CSI+CI.
La p53 se detecta en una amplia variedad de clulas tumorales, pero tambin en clulas normales que proliferan activamente. En cambio, en clulas quiescentes existe en pequeas o
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nulas cantidades. En el cncer de mama, la distribucin celular de la protena ha sido estudiada por Moll et al., (1992). En 10 de 27 casos (37%) la p53 se localiz en el citoplasma exclusivamente, en 8 casos (30%) en el ncleo y en 9 casos (33%) existi una ausencia total de la protena. El anlisis realizado de la secuencia de nucletidos demostr que en los casos de tincin citoplsmica, la mayora correspondieron a alelos que codificaban la protena silvestre y, por el contrario, se objetivaron mutaciones puntuales y sin sentido en los casos de tincin nuclear. Los tumores con falta de inmunotincin presentaban alelos normales. Adems, en una biopsia de tejido mamario lactante normal apreciaron un patrn de tincin citoplsmica intensa con ausencia de tincin nuclear. Estos autores hacen referencia al hecho de que algunos tumores de mama inactivan la p53 mediante su secuestro en el citoplasma; un fenmeno anlogo al observado en la lactancia. En condiciones fisiolgicas el secuestro de p53 en el citoplasma permitira una transitoria proliferacin celular. A este fenmeno se le denomin exclusin nuclear.
La tincin IHQ esta basada en la deteccin de la protena. La mutacin del gen origina una protena mutada que se acumula en el ncleo y citoplasma debido a un cambio conformacional que alarga su vida media (mutada: 4 5 horas, normal: 15 20 minutos). Algunos anticuerpos monoclonales, sin embargo, tienen el inconveniente de ser poco discriminativos, siendo incapaces de diferenciar entre la protena silvestre y la mutada. Aproximadamente en un 20% de los casos se producen mutaciones que originan una protena truncada incapaz de ser detectada por tinciones inmunohistoqumicas. En el caso contrario, la tincin positiva de la protena nuclear no siempre se corresponde con la forma mutada. MacGeoch et al., (1993) han analizado la expresin del gen p53 en diferentes tumores slidos empleando anticuerpos monoclonales para seleccionar el DNA de los tumores p53+. Mediante amplificacin PCR y secuenciacin directa de los exones 5 - 9 del gen examinaron 9 melanomas, 8 carcinomas nasofarngeos, 16 cnceres de mama espordicos, y 11 cnceres de mama familiares. Encontraron una alteracin indicativa de mutacin nicamente en el 19% de los cnceres de mama. En contraste, Younes et al., (1995) investigaron la expresin de p53 en el tejido mamario normal y en las lesiones benignas de la mama. Mediante tincin IHQ con el anticuerpo (BP53-12) advirtieron un 9% de positividad en el tejido normal y un 16% en las lesiones benignas; estas ltimas distribuidas en un: 8% de mastopatas fibroqusticas, 11% de mastitis, 23% de fibrosis, y 30 % en los fibroadenomas. El seguimiento de estos casos demostr que el 12% de las lesiones p53+ y el 7% de las p53- desarrollaron un cncer. Por otra parte, Elledge et al., (1994) investigaron en 169 cnceres de mama con ganglios negativos, la relacin entre la p53 y la presencia de la Hsp70, una chaperona que se une al p53 mutado y se cree que de alguna manera regula la localizacin y cmulo de p53. Empleando combinaciones de anticuerpos monoclonales contra p53 y 2
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anticuerpos contra Hsp70, no pudieron demostrar una asociacin entre la acumulacin de la p53 y los niveles de Hsp70 citoplsmico o nuclear. Los tumores p53-/Hsp70+ tuvieron una mejor supervivencia. La tincin nuclear de p53 se observa en carcinomas medulares y ductales de alto grado, siendo rara en los lobulares; sin embargo, para Domagala et al., (1993) la positividad de p53 valorada en diferentes tipos histolgicos de cncer de mama no siempre se relaciona con un mal pronstico. Este conjunto de hallazgos demuestra que la presencia de p53 no siempre es sinnimo de malignidad.
Algunos pacientes desarrollan inmunidad humoral contra la protena p53 mutada, as, lo demuestran los trabajos de Green et al., (1994) que analizaron mediante ELISA la presencia de autoanticuerpos p53 detectndolos en 45 (25,6%) de 176 mujeres con cncer de mama. La incidencia de estos autoanticuerpos fue superior (29,4%) en los cnceres de tipo espordico que en los familiares (9,1%). Tambin se descubrieron autoanticuerpos en un 11,1% de mujeres normales con historia familiar de cncer de mama. De manera similar, Mudenda et al., (1994) analizaron por ELISA el suero de 182 cnceres de mama encontrando anticuerpos contra p53 en el 26% (n=48) de los casos frente al 1,3% (1 de 76) de mujeres normales. Los autoanticuerpos se detectaron en carcinomas in situ, cnceres infiltrantes y metastsicos y su presencia se asoci con la sobreexpresin de la protena en el tumor primario, con altos grados histolgicos y con la aparicin de un segundo cncer primario. La incidencia de los autoanticuerpos fue ms baja en mujeres con familiares de primer grado de consanguinidad que desarrollaron un cncer de mama; aparentemente la protena sera menos inmunognica en estos casos. La determinacin de los anticuerpos p53, segn estos autores, provee informacin adicional para identificar grupos de pacientes con tumores ms agresivos y servira adems para caracterizar pacientes con cnceres de mama hereditarios. Por el contrario, para Dalifard et al., (1999), en su estudio de 196 cnceres de mama, la deteccin de autoanticuerpos (7,9%) p53 no se correlacion con la concentracin citoslica de la protena ni con otros factores de pronstico. Igualmente, Angelopoulo et al., (2000), citan que aunque los anticuerpos tienden a desarrollarse en pacientes con cmulo de p53, esta no es suficiente ni necesaria para el desarrollo de inmunidad humoral. Por medio de ensayo inmunofluoromtrico realizado en 195 cnceres de mama, pudieron demostrar autoanticuerpos sricos en 17 pacientes (9%) y sobreexpresin de la protena en 77 (40%). De las 17 pacientes seropositivas, en 10 se objetiv la presencia de p53, mientras que las 7 restantes carecieron de expresin para p53; en este caso, la asociacin estadstica aunque significativa fue dbil. Adems analizaron las mutaciones del gen p53 en 16 pacientes seropositivas y 16 seronegativas. Cinco de las pacientes seropositivas y ocho de los seronegativas presentaban mutaciones en el gen p53. Destacaba nicamente la presencia de una mutacin en un residuo de tirosina en 4 de las 5 pacientes seropositivas. En consecuencia, las
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pacientes con autoanticuerpos p53 no presentaron un mayor nmero de mutaciones en comparacin con las carentes de autoanticuerpos.
Diversos estudios han analizado el valor pronstico de la p53 en el cncer de mama, sin embargo, los resultados publicados muestran ciertas discrepancias. Algunos autores no han encontrado diferencias significativas entre la expresin de la p53 y la supervivencia, concedindole a este marcador un escaso valor pronstico. Entre ellos destacan Isola et al., (1992), que en un estudio de 298 cnceres de mama seleccionados al azar examinaron la expresin de la protena p53 y C-erbB-2 utilizando los anticuerpos monoclonales CM-1 y T 250 respectivamente. La presencia de p53 se relacion con altos grados histolgicos, ausencia de RE y sobreexpresin de C-erbB-2. Aunque, las pacientes con elevada expresin de p53 y C-erbB-2 tuvieron significativamente una menor supervivencia, nicamente el tamao tumoral y la fraccin S resultaron los parmetros con valor pronstico independiente cuando todas las variables fueron introducidas en el anlisis de riesgos proporcionales de Cox. Para Bianchi et al., (1997) la inmunotincin positiva de p53 careci de valor pronstico en su anlisis univariante y multivariante de 221 cnceres de mama con seguimiento durante 10 aos. El tamao tumoral y el grado nuclear en esta serie se mostraron como factores de pronstico independiente. Igualmente, Lipponen et al., (1993) en un estudio basado en 193 tumores con determinacin IHQ de p53 (58% de positividad), sealan el nulo valor pronstico de la p53 con relacin a otros parmetros. En el anlisis univariante los tumores con tincin intensa tuvieron un peor pronstico y, al contrario, tumores con ausencia de expresin de p53 presentaron intervalos libres de enfermedad cortos. Lo mismo sucedi en pacientes con ganglios negativos y p53-. En cambio, observaron un mayor intervalo libre de enfermedad en tumores con ganglios positivos y p53+. En el anlisis multivariante la p53 careci de valor pronstico. Por el contrario, Fresno et al., (1997) citan el valor pronstico de la determinacin IHQ de p53 (anticuerpo DO-7), en su anlisis de 151 cnceres infiltrantes de mama con ganglios negativos. La sobreexpresin de p53 definida como ms de un 50% de clulas teidas, se relacion significativamente con un alto grado histolgico, presencia de necrosis tumoral, elevados ndices de proliferacin celular y ausencia del RE. En el anlisis multivariante la elevada expresin de p53 se relacion significativamente con una corta supervivencia.
En el cncer de mama varios grupos coinciden al sealar que las alteraciones en el gen y la sobreexpresin de p53 estn relacionadas con tumores ms agresivos y con un peor pronstico. Estos tumores se caracterizan por un mayor tamao tumoral, aumentada proliferacin celular, aneuploida, elevados grados histolgicos y nucleares, ausencia de receptores hormonales y sobreexpresin de C-erbB-2. Thor et al., (1992) empleando el anticuerpo monoclonal P1801
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objetivaron una acumulacin de la protena nuclear en el 21% de los carcinomas in situ, en el 22% de los cnceres espordicos, en el 34% de los cnceres familiares de mama y en el 52% de los tumores de pacientes con cnceres de mama y ovario. Tambin observaron una asociacin significativa entre la expresin de p53 y la negatividad de los RE y con un alto grado nuclear. El cmulo nuclear de p53 mostr ser un factor pronstico independiente de menor intervalo libre y supervivencia tanto en cnceres espordicos como en familiares. Barnes et al., (1993) en un estudio basado en 195 cnceres de mama con ganglios positivos y negativos y con un seguimiento durante 10 aos, constataron un 19% de positividad para la p53 por IHQ. El anlisis multivariante demostr que despus de la afectacin ganglionar, la tincin positiva para p53 denota una disminucin de la supervivencia. Para Silvestrini et al., (1993) la tincin IHQ con el anticuerpo P1801 y el ndice de timidina fueron los parmetros que mejor se
relacionaron con la recidiva y con la disminucin de la supervivencia en un grupo de 256 cnceres de mama con ganglios negativos.
La comparacin entre el cmulo nuclear y citoplsmico de p53 mediante tincin IHQ con el anticuerpo P1801, fue realizada por Stenmark-Askmalm et al., (1994) en 164 cnceres de mama en estadio II. Estos autores encontraron un 9% de positividad nuclear y un 21% de positividad citoplasmtica. La presencia de p53 se asoci a cnceres con dimetro superior a 2 cm, ausencia del RE, aneuploida, elevada fraccin S y positividad para C-erbB-2. Los tumores con tincin positiva citoplsmica y negativa nuclear tuvieron un menor intervalo libre de enfermedad. Fueron factores pronstico independiente la acumulacin de p53 junto con el estado de los ganglios axilares y el contenido de los RE.
Beck et al., (1995) valoraron 462 cnceres de mama mediante tincin con el anticuerpo monoclonal para la p53 DO-1, objetivando una disminucin de la supervivencia en tumores con sobreexpresin de p53 y de Ki-67. La p53 en este estudio se relacion significativamente con el grado histolgico II, con la ausencia de RE y RPg y con un elevado ndice de Ki-67. Gohring et al., (1995) registraron un 38% de positividad para p53 en 204 cnceres de mama utilizando el anticuerpo P1801. No hubo asociacin significativa entre la expresin positiva de p53 y el estado hormonal, la edad, el tamao tumoral, la afectacin ganglionar, y el estado de los receptores hormonales. La tincin positiva de p53 se relacion significativamente con la prdida de diferenciacin tumoral y fue de valor pronstico slo en tumores con ganglios positivos. Mediante ELISA, Levesque et al., (1994) examinaron 998 extractos citoslicos de clulas de cncer ductal infiltrante para p53. Estos autores objetivaron tanto en el anlisis univariante como en el multivariante, que concentraciones de p53 superiores a la mediana predecan un mayor riesgo de recidiva y muerte, especialmente en pacientes con ganglios positivos. Tsuda et
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al., (1998) tambin examinaron 150 cnceres con ganglios positivos para determinar alteraciones cromosmicas, mutaciones de p53 y amplificacin de oncogenes. En el anlisis univariante fueron factores de pronstico para la recidiva y la muerte: el grado histolgico, el nmero de ganglios afectados, la inmunotincin nuclear de p53, la amplificacin de C-erbB-2 y los receptores hormonales. En cambio, en el anlisis multivariante la afectacin ganglionar, el grado histolgico y la positividad para p53 constituyeron parmetros de pronstico para la supervivencia.
Algunos trabajos conceden un mayor valor pronstico a las mutaciones que se producen en el gen p53 que a la expresin de la protena en s. Seshadri et al., (1996) investigaron en 919 cnceres de mama las alteraciones del gen p53 por PCR-SSCP (anlisis de polimorfismos de la conformacin unicatenaria del DNA y reaccin en cadena de la polimerasa) y la sobreexpresin de p53 y Ki-67 y la amplificacin de C-erbB-2. Las alteraciones en el gen p53 (expresin 29%, mutaciones 8%) se relacionaron con elevados ndices de MIB-1(Ki-67), amplificacin de CerbB-2 y ausencia de receptores de estrgenos. Tuvieron significativamente un mayor riesgo de muerte los pacientes con ganglios negativos, mutaciones en el exon 5 y 6 y elevados ndices de MIB-1. De una manera similar, Soong et al., (1997) en un estudio prospectivo de 375 cnceres de mama investigaron la relacin entre las mutaciones del gen p53 y la supervivencia. Mediante anlisis SSCP encontraron un 19% de mutaciones en los exones 4-10. Estas mutaciones mostraron una asociacin significativa con altos grados histolgicos, ausencia RE, aneuploida y elevada fraccin S. El anlisis univariante y multivariante confirm que las pacientes cuyos tumores presentaban mutaciones en el gen p53 tuvieron una significativa disminucin de la supervivencia. Asimismo, Iacopetta et al., (1998) analizaron alteraciones en los exones 4 8 del gen p53 por PCR-SSCP, en 422 cnceres con ganglios axilares negativos. Encontraron un 18% de mutaciones que se asociaron significativamente a un mayor tamao tumoral, altos grados histolgicos, bajo contenido de RE, elevada expresin de Ki-67, amplificacin de C-erbB-2 y cmulo de p53. En el anlisis multivariante la mutacin de p53 result ser un factor de pronstico independiente. De manera similar, mediante PCR-SSCP, Berns et al., (1998) observaron un 31% de mutaciones en el gen p53 entre 222 cnceres examinados. El 78% de las mutaciones se detectaron en un solo punto, la mayora en el codon 248 y en 6 tumores se localizaron en el codon 213. El anlisis multivariante de Cox desvel que los tumores con mutaciones en el codn 213, que contacta directamente con el DNA, tuvieron una media de supervivencia menor.
Los cnceres que expresan la p53 silvestre presentan una alta proporcin de clulas apoptticas, siendo adems, sensibles al tratamiento con radiaciones ionizantes y agentes
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citotxicos. En cambio, los tumores deficientes en p53 silvestre poseen un nmero reducido de clulas apoptticas y cuando son tratados con los mismos agentes, en general, mantienen un crecimiento continuado. Por tanto, la funcin normal de p53 es necesaria para una adecuada respuesta al tratamiento adyuvante, as, la inactivacin de la protena normal se relaciona con una resistencia a la muerte celular por prdida de los mecanismos apoptticos, y esto conlleva a una disminucin de la sensibilidad a la radioterapia y a la quimioterapia (Lowe SW et al., 1994; Mcllwrath AJ et al., 1994; Koechli OR et al., 1994). Aas T et al., (1996) investigaron la relacin entre las mutaciones en el gen p53 con la resistencia a la doxorrubicina y la recidiva precoz. Las mutaciones en las regiones 2 - 5 se asociaron a metstasis ganglionares y a una evolucin desfavorable. El tratamiento adyuvante con tamoxifn y la radioterapia fueron de escaso valor en pacientes que presentaban mutaciones en el gen p53 (Bergh et al., (1995). Las enfermas cuyos cnceres sobreexpresaban p53 y bajos niveles de los RE y RPg tuvieron una peor respuesta al tamoxifn y una menor supervivencia, segn un estudio publicado por Berns et al., (1998).
En la ltima dcada los ensayos experimentales y clnicos han sido dirigidos a restablecer la funcin normal de los genes supresores. En algunos casos la terapia incluye la integracin permanente del gen en las clulas diana, mientras que en otros se logra la induccin de la transcripcin del producto normal del gen. La transferencia de material gentico sano se realiza con combinaciones del gen p53 y un promotor insertados en un vector viral, incapaz de replicarse, pero con capacidad para transfectar una clula. Baker et al., (1990) demostraron que clulas de cncer de colon con alteraciones en el gen p53 podan revertir su fenotipo a no tumorognicas al transfectarles un alelo p53 normal por medio de plsmidos portadores. Liu et al., (1994) transfectaron el gen p53 silvestre mediante un vector adenovrico con un promotor de citomegalovirus (Ad5CMV-p53) en una lnea celular de cncer de cabeza y cuello, objetivando por Nothern blotting un aumento de 10 veces el RNAm-p53 normal y la expresin de la protena. La inyeccin peritumoral de Ad5CMV-p53 en ratones desnudos indujo cambios apoptticos y una significativa disminucin, hasta 60 veces, en el nmero de clulas de cnceres de cabeza y cuello implantados subcutneamente. Tambin Fujiwara et al., (1994) lograron inducir cambios apoptticos en clulas en cultivo de la lnea celular de pulmn H358, al transfectar el gen p53 normal por medio de un vector adenovrico. Lograron demostrar que la inyeccin directa de Ad-p53 en tumores H358 implantados subcutneamente en ratones inmunosuprimidos, aument la sensibilidad al cisplatino, producindose una apoptosis masiva tras la administracin del citotxico. Experimentos similares en lneas celulares humanas de cncer de cabeza y cuello, ovario, prstata y mama llevados a cabo por Gurnani et al., (1999) demostraron la efectividad de la quimioterapia combinada con la terapia gnica por medio de un
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vector adenovrico-CMV-p53. En ensayos clnicos, Roth et al., (1996), observaron en cnceres de pulmn (variedad clulas no pequeas) la regresin tumoral en 3 pacientes y la estabilizacin en otros 3, tras la administracin del gen p53 por medio de un vector retroviral. Vinyals et al., (1999) han comprobado en la lnea celular de cncer de mama (MDA-MB468) homocigota para la p53, que la transfeccin del gen p53 silvestre induce una muerte por apoptosis con una disminucin del nmero de colonias. Sin embargo, algunas clulas son capaces de sobrevivir y seguir creciendo a pesar de la transfeccin del p53 normal. Adems, el anlisis del clon celular superviviente revel que se haban producido mutaciones en el gen p53 silvestre transfectado. Sobre la base de estos hallazgos, los autores concluyeron que la presencia de mutaciones en el p53 confiere inestabilidad genmica y la capacidad de producir mutaciones que le permiten a la clula tumoral escapar de los efectos del p53 silvestre transfectado.
La investigacin sobre la estructura y funcin del gen ha posibilitado el desarrollo de nuevas terapias contra el cncer. Conseiller et al., (1998) construyeron un quimrico supresor tumoral (CST1) mediante delecin del dominio involucrado en la inactivacin del gen p53 normal. Demostraron que el CST1 era resistente a la inactivacin por la MDM2, capaz de inducir un arresto del crecimiento celular tumoral y producir una acelerada apoptosis. Por otra parte, Foster et al., (1999), identificaron una serie de pequeas molculas con un peso que vara entre los 300500 daltones que inducen en la p53 silvestre una estabilidad conformacional en toda su longitud y en los dominios de unin al DNA. Estos pptidos tambin permitieron mantener una conformacin activa en la protena mutada. La administracin experimental de un compuesto prototipo a clulas tumorales de ratn con p53 mutada, produjo la acumulacin de molculas p53 con conformacin activa ocasionando un retardo en el crecimiento tumor.
Estos hallazgos abren nuevas vas de investigacin encauzadas a lograr tratamientos ms racionales contra el cncer, basados en un mejor conocimiento de la estructura y funcin de ciertos genes.
CATEPSINA D.
Los estudios sobre los efectos del estradiol en los mecanismos de proliferacin celular y carcinognesis mamaria dieron como resultado el aislamiento de una glicoprotena de 46 kDa (Westly y Rochefort, 1980) secretada al medio de cultivo en 3 lneas celulares de cncer de mama RE positivas (MCF7, ZR75, T47D). El posterior anlisis, mediante electroforesis e inmunoprecipitacin con anticuerpos monoclonales de las protenas sintetizadas y secretadas en clulas MCF7, revel un peso molecular de 52 kDa para la citada glicoprotena (Veith et al., 1983). Vignon et al., (1984) tambin demostraron en la lnea celular R27, una variante de la
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MCF7 capaz de crecer en presencia de tamoxifn, que su secrecin poda ser inducida por tratamiento con tamoxifn e hidroxitamoxifn, aunque en menor proporcin que con el estradiol.
Vignon et al., (1986) por medio de cromatografa sobre concanavalina A y anticuerpos monoclonales anti-52 kDa lograron la purificacin de la glicoprotena con un 99% de pureza. Administrando siete concentraciones nanomolares distintas de esta fraccin objetivaron un aumento del crecimiento de las clulas MCF 7 deprivadas de estrgenos que represent un 40% del efecto mitognico del estradiol. Tanto la 52 kDa como el estradiol indujeron la expresin de microvellosidades en la superficie celular, efecto precoz con la exposicin a 52kDa. Concluyeron que los estrgenos inducan el crecimiento de las clulas de cncer de mama a travs de la estimulacin de la secrecin de algunas protenas que actuaran por va autocrina o paracrina y que la glicoprotena posea propiedades mitognicas.
La purificacin de la glicoprotena y su secuenciacin utilizando clones de DNA complementario obtenidos de las clulas MCF7 permiti demostrar a May y Westley (1986), que la glicoprotena secretada se trataba de la forma precursora de la catepsina D, homloga a la presente en los tejidos normales. Rochefort (1987) y Briozzo (1988) aportaron evidencias convincentes de que la catepsina D es secretada al medio exterior como una aspartil proteasa lisosomal portadora de una seal peptdica manosa 6- fosfato. La enzima intracelularmente es dirigida a los lisosomas que poseen receptores de manosa 6 fostato y es almacenada en formas maduras de 48 kDa, 34 kDa y 14 kDa (Garca et al., 1985). La proenzima secretada al medio exterior es autoactivada en un pH de 4,5 cambiando su peso molecular a 51 kDa por procesamiento proteoltico del NH2 terminal (Freiss et al., 1988). Una vez activada es capaz de degradar la membrana celular, la matriz extracelular y los proteoglicanos (Briozzo et al., 1988). La catepsina D tambin ha sido implicada en la diseminacin metastsica al demostrar Rochefort et al., (1990) que la transfeccin del DNA complementario humano de catepsina D bajo el control de un promotor viral (SV40) aumentaba el potencial metastsico de clulas 3YA1-Ad12 inyectadas en ratones desnudos. Entre otras propiedades, la catepsina D facilita la biodisponibilidad de factores de crecimiento locales (Briozzo eta al., 1991), causa la inactivacin de un inhibidor del crecimiento (Liaudet et al., 1995) y evita la apoptosis (Saftig et al., 1995).
Las clulas de cncer de mama, mediante sobreexpresin del gen y por procesamiento alterado de la protena, secretan elevadas cantidades de procatepsina D llegando a ser la produccin en las clulas cancerosas 8 veces superior a la sintetizada por las clulas normales
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(Rochefort et al 1990). El 50% de la produccin en las clulas neoplsicas es inducida por los estrgenos (Capony et al., (1989). La salida y maduracin de la proenzima est alterada posiblemente por saturacin de los receptores manosa 6 fostato/IGF II, lo que conlleva a la acumulacin de la proteasa activa en grandes endosomas y a un aumento en la secrecin del precursor (Rochefort, 1990). Mediante microscopa de alta resolucin y tinciones para
compartimentos acdicos, Montcourrier et al., (1990) observaron un nmero superior de vesculas intracelulares (1,5 a 20 micras de dimetro) en las clulas de cncer de mama en comparacin con los tejidos normales. Estas vesculas compuestas principalmente por enzima madura eran mviles y capaces de degradar material extracelular fagocitado. En contraste, los experimentos de Johnson (1993), basados en la secrecin e inmovilidad de la catepsina D en la cmara de Boyden, no han corroborado la relacin entre la secrecin de la proteasa y su potencial de invasin.
Los trabajos de Mathieu et al.,(1990) empleando radioligandos demostraron que la catepsina D y el IGF-II utilizan el receptor IGF-II/manosa 6 fosfato. La enzima por medio de estos receptores es capturada en las clulas MCF7. Sin embargo, un estudio reciente realizado por Laurent-Matha et al., (1998) mediante anlisis con doble inmunofluorescencia y microscopa confocal objetiv que anticuerpos monoclonales dirigidos especficamente unos contra la procatepsina D y otros contra el receptor manosa 6 fostato/IGF II sufran una endocitosis de manera independiente. Estos hallazgos sugirieron la existencia de un receptor alternativo, distinto del manosa 6 fosfato/IGF-II, para la procatepsina D en las clulas de cncer de mama.
Con la utilizacin de clones de DNA complementario Cavailles et al., (1988) demostraron un aumento entre 4 y 10 veces los niveles de RNAm - cat. D (2,2 kb) en las clulas MCF7 tras su estimulacin con estradiol. De manera similar, el EGF, la insulina y el FGF produjeron un aumento dosis dependiente del RNAm catep. D, que en el caso del EGF fue rpido, pero inferior al propiciado por el estradiol. La insulina, el IGF y el FGF lograron aumentar hasta 3 veces el RNAm de la catepsina D. El tamoxifn en cambio, careci de efecto en esta lnea celular. El empleo de inhibidores de transcripcin y translacin del gen 52 kDa confirmaron que el estradiol aumenta la transcripcin del gen en las clulas MCF7. La regulacin estrognica es mayoritariamente transcripcional, mientras que los factores de crecimiento estabilizan el RNA. Los trabajos experimentales de Touito et al., (1991), basados en la transfeccin del gen RE a clulas MDA-MB231 y Hela y su posterior estimulacin con estradiol, corroboraron que los estrgenos podan inducir la produccin de catepsina D.
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Por hibridacin in situ empleando genotecas de DNA complementario, Augereau et al., (1988), asignaron el locus 11p15 al gen de la catepsina D. Cavailles et al., (1991) clonaron la regin promotora de la catepsina D de las clulas MCF7 demostrando EREs en la regin 5 del gen. Utilizando recombinantes quimricos portando diferentes fragmentos del extremo proximal 5 del gen y cotransfeccin transitoria con vectores de expresin del RE en clulas MCF, Cavailles et al., (1993), descubrieron un fragmento en la regin 5 proximal del gen de 240 bp capaz de mediar la activacin transcripcional de estrgenos. El promotor del gen de la catepsina D tiene una estructura compleja compuesta por genes domsticos (alto contenido de G+C y sitios para el factor de transcripcin Sp1) y secuencias reguladoras TATA. La transcripcin se inicia en 5 sitios (TSS I a V). La caja TATA es esencial para la transcripcin en TSS I. El gen de la catepsina D dependiendo de las condiciones se comporta como un gen domstico con mltiples lugares de unin o como un gen regulado por hormonas que puede ser controlado por la caja TATA; as, en las clulas de cncer de mama, el gen es controlado por un promotor mixto y los estrgenos solamente estimulan la transcripcin dependiente de TATA. Se han encontrado 2 sitios hipersensibles a DNAasa en el gen de la catepsina D en las secuencias del extremo 5 el cual es regulado por los estrgenos. En clulas con expresin de catepsina D independientes de hormonas se evidenci la regin CatD HS4 localizada en la posicin 4,3 Kb que podra controlar la expresin constitutiva en clulas independientes de hormonas (Giamarchi et al., 1999).
Se han demostrado elevadas concentraciones de catepsina D en pacientes con mastopatas fibroqusticas y proliferativas (Rochefort et al., 1987). En carcinomas mamarios RE positivos Vasishta et al., (1989) objetivaron una mayor actividad enzimtica proteoltica producida por catepsinas, tripsinas, elastasas y activador del plasmingeno. Altos niveles de catepsina D tambin se han observado en pacientes con mastitis (Gonzalez-Cancedo 1990).
Existen controversias en la literatura con relacin al valor pronstico de la catepsina D en el cncer de mama, si bien en los estudios inmunoenzimticos e inmunorradiomtricos su valor como parmetro de pronstico parece bien establecido, con los mtodos inmunohistoqumicos es mas dudoso. Segn publica Madeulonde et al., (1988), en un estudio basado en la determinacin inmunoenzimtica de catepsina D en 182 cnceres de mama, la concentracin citoslica de catepsina D no se relacion con la edad, el tamao tumoral, el grado histolgico y el estado del receptor de progesterona. Unicamente observaron una asociacin estadsticamente significativa con el estado del receptor de estrgeno. Spyratos et al., (1989) constataron, en 122 pacientes con cncer de mama sin afectacin ganglionar, que elevadas concentraciones citoslicas de catepsina D se relacionaban con una disminucin del intervalo libre y la
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supervivencia global. Thorpe et al., (1989) determinaron la expresin de catepsina D por enzimoinmunoanlisis en 242 pre/perimenopusicas y en 154 postmenopusicas. Dividiendo las pacientes en grupos de tumores con baja, intermedia y alta concentracin de catepsina D, no encontraron una relacin significativa entre las concentraciones de catepsina D y la edad, la afectacin ganglionar, el tamao tumoral, y el grado de anaplasia, aunque, s observaron elevados niveles de catepsina D en tumores con una concentracin de receptores de estrgeno mayor de 10 fmol/mg prt. Tuvieron un menor intervalo libre de enfermedad y supervivencia, las pacientes premenopusicas con concentraciones de catepsina D superior a 78 pmol/mg prt y las postmenopusicas con niveles mayores de 24 pmol/mg prt. El anlisis multivariante confirm el valor pronstico de los niveles de catepsina en ambos grupos. Tandon et al., (1990) tambin demostraron en 397 cnceres de mama, de ellos 198 con ganglios positivos, una disminucin del intervalo libre y la supervivencia en las pacientes cuyos tumores presentaban una elevada concentracin de catepsina D y ganglios negativos.
La alta expresin de catepsina D se asocia a metstasis ganglionares, as, Brouillet et al., (1990) evidenciaron en 140 cnceres de mama y 64 ganglios axilares, una mayor concentracin de catepsina D en las metstasis ganglionares. Elevadas concentraciones de catepsina D se relacionaron con la amplificacin de c-myc. En cambio, no objetivaron asociacin alguna entre los niveles de Catepsina D y la sobreexpresin de C-erbB-2 e interleuquina 2. En un estudio prospectivo basado en la determinacin inmunoenzimtica de catepsina D (punto de corte 20,8 pmol/mg prt) en 123 pacientes, Pujol et al., (1993), demostraron en el anlisis multivariante, el valor pronstico de la catepsina D en pacientes con ganglios positivos y RPg-. Barbi et al., (1994) tambin comprobaron en 158 pacientes con cncer de mama, la buena correlacin de las concentraciones citoslicas de catepsina D (40 > pmol/mg) con el grado histolgico y las metstasis ganglionares y la ausencia de asociacin con la edad, estado de los receptores de estrgeno y progesterona y el tipo histolgico. Ferno et al., (1994) sealan el valor pronstico de altas concentraciones de catepsina D (dintel: 45 pmol/mg prt) medidas por ensayo inmunorradiomtrico en pacientes con ganglios positivos. Estos autores describen adems, el efecto beneficioso del tamoxifn en pacientes con alta expresin de catepsina D, ganglios positivos y RPg+. En otro estudio basado en la determinacin inmunorradiomtrica de la catepsina D en 1752 pacientes, Gion et al., (1995), citan una asociacin significativa entre la elevada concentracin citoslica de catepsina D y el tamao tumoral, el grado histolgico y la presencia de RE y PPg. Tambin describen una significativa mayor concentracin de catepsina D en tumores con ganglios positivos, aunque en este caso, la catepsina D no fue de valor para predecir el riesgo de desarrollar metstasis axilares.
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Algunos trabajos sealan que altas concentraciones de catepsina D se relacionan con un pronstico desfavorable que es independiente del estado de los ganglios axilares. Ardavanis et al., (1998) en un estudio basado en 173 cnceres de mama en estadios I, II y III citan el valor pronstico de la catepsina D en pacientes con ganglios positivos y negativos. Las pacientes con una elevada concentracin citoslica de catepsina D tuvieron ms recidivas locorregionales y una menor supervivencia. Solomayer et al., (1998) hacen referencia al mal pronstico de las pacientes con clulas metastsicas extradas de la mdula osea y que presentaban aumentados niveles de catepsina D. Foeken et al., (1999) en un estudio de 2810 extractos citoslicos de catepsina D (punto de corte: 45,2 pmol/mg prt) objetivaron, en el anlisis multivariante, que altos niveles de catepsina D se relacionaron con una disminucin del intervalo libre y la supervivencia global, tanto en tumores con ganglios positivos como con ganglios negativos. No encontraron, sin embargo, una asociacin significativa entre los niveles de catepsina D y los parmetros de pronstico clsicos.
Gohring et al., (1996) compararon el valor pronstico de la catepsina determinada por mtodos inmunohistoqumicos (IHQ) e inmunorradiomtricos (IRMA) en 270 cnceres infiltrantes de mama. Aunque existi una buena correlacin entre la IHQ (punto de corte 52%) y el IRMA (40 fmol/mg), nicamente la determinacin de la expresin de catepsina D por IHQ se relacion significativamente con la evolucin clnica. En el anlisis multivariante la expresin de catepsina D en pacientes con ganglios negativos fue de valor pronstico.
Joensuu et al., (1995) determinaron mediante tincin IHQ la expresin de catepsina D en las clulas ductales y estromales de 213 pacientes con cncer de mama. Observaron una mejor supervivencia en aquellas enfermas cuyos tumores presentaban un bajo contenido de catepsina D en las clulas estromales, aunque en el anlisis multivariante este dato careci de valor pronstico. Altas concentraciones de catepsina D en el componente estromal se relacionaron con una elevada actividad proliferativa celular. Objetivaron adems, una mayor expresin de la catepsina D en los cnceres ductales que en los lobulares. De manera similar, Losch et al., (1998) compararon la tincin IHQ de la catepsina D en el componente epitelial y estromal. La sobreexpresin de catepsina D en las clulas ductales se relacion con un alto grado nuclear y con la estadificacin y existi una ausencia de asociacin con las metstasis ganglionares y con el contenido del receptor estrognico. La tincin en las clulas estromales careci de valor pronstico, en cambio, en el componente epitelial se objetiv una asociacin significativa con la supervivencia. No obstante, este efecto desapareci en el anlisis multivariante y, por tanto, la catepsina D no fue de valor pronstico. En un estudio basado en 102 pacientes con cnceres de mama infiltrantes Gonzalez-Vela et al., (1999) demostraron que tumores con moderada a
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intensa inmunotincin de catepsina D en las clulas estromales, sta se relacion significativamente con un aumento en la densidad de los vasos sanguneos en el tumor, con una mayor agresividad tumoral, con un mayor ndice mittico, con peor grado histolgico y con una disminucin del RE. En una publicacin reciente basada en 1348 pacientes con cancer infiltrante de mama, Tetu et al., (1999) valoraron mediante tincin IHQ la expresin de la catepsina D en las clulas epiteliales y estromales de manera independiente. Estos autores encontraron que la expresin de catepsina D en las clulas estromales (43,6% de positividad) a diferencia de las clulas epiteliales (38,9% de positividad) se asociaba significativamente con varios factores de peor pronstico y con una disminucin del intervalo libre y de la supervivencia. Adems, la alta expresin de catepsina D en las clulas estromales en el subgrupo que recibi tratamiento citotxico adyuvante, se relacion con un mal pronstico. De este modo, afirmaron que el valor pronstico de la expresin de catepsina D parece depender del componente estromal que es influenciado por las clulas cancerosas.
Los
estudios
inmunoenzimticos
inmunorradiomtricos,
diferencia
de
los
inmunohistoqumicos, se basan en la determinacin indiscrimanada de la catepsina D en las clulas ductales y estromales. La distinta expresin de la catepsina D en un componente u otro podra explicar las divergencias observadas con relacin al valor pronstico de la catepsina D.
GLICOPROTENA P (PGY 1, MDR1, MDR2).

La glicoprotena P fue descubierta a raz de los estudios experimentales de Juliano y Ling (1976) sobre la resistencia a la colchicina y a diversas drogas hidrfobas en clulas seleccionadas de ovario de hmster. La presencia de una glicoprotena de 185 kDa muy abundante en las membranas celulares fue demostrada empleando carbohidratos y protenas marcadas y mediante protelisis selectiva. Constataron en sta, y otras lneas celulares, que el grado de resistencia a los frmacos estaba directamente relacionado con la cantidad de glicoprotena presente en la superficie celular. Le asignaron el nombre de glicoprotena P debido a la supuesta alteracin que induca en la permeabilidad al paso de drogas a travs de la membrana celular.
Utilizando varios anticuerpos monoclonales dirigidos contra 3 eptopes distintos de los dominios conservados en la regin carboxi-terminal de la glicoprotena P, Kartner et al., (1985), comprobaron en diferentes clulas de mamferos resistentes a mltiples medicamentos, la relacin existente entre la sobreexpresin de la protena y el fenmeno de resistencia a mltiples drogas. Las clulas con baja expresin de glicoprotena P eran sensibles a los frmacos; lo contrario sucedi con la sobreexpresin. Adems, una clula seleccionada para ser insensible a
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un medicamento rpidamente adquira una resistencia cruzada a una amplia variedad de drogas y, este hecho, estaba relacionado con la sobreexpresin de la glicoprotena P. La clonacin del cDNA que codifica la glicoprotena P fue realizado Riordan et al., (1985). El anlisis del DNA por Southern blot del hmster, ratn y humano, empleando como sonda el DNA complementario de la glicoprotena P, demostr un elevado grado de conservacin de la protena entre las diferentes especies y que en su codificacin y amplificacin interviene una familia de genes muy relacionados.
Shen et al., (1986) vincularon la resistencia a la colchicina, vinblastina y adriamicina de las clulas cancergenas humanas KB con la amplificacin de secuencias especficas de DNA denominadas locus de resistencia a mltiples drogas (mdrl). La expresin y amplificacin de estas secuencias fueron confirmadas en sublneas celulares de leucemia y en clulas de cncer de ovario. En la misma lnea celular KB, Roninson et al., (1986) objetivaron la amplificacin de 2 secuencias distintas de DNA que guardaban homologa con el gen mdr de los hmsteres; les designaron mdr1 y mdr2. Las secuencias mdr1 constituidas por RNAm poly A de 4,5 kb estaban presentes en aquellas sublneas con alta resistencia a frmacos. En cambio, no evidenciaron RNAm mrd2, aunque las secuencias s aparecan co-amplificadas con el mdr1 en algunas sublneas tumorales.
La evidencia definitiva de que la glicoprotena P era el producto del gen mdr1 la realizaron Ueda et al., (1986) al confirmar la similitud en los cDNA del gen mdr1 y PGY1, mediante hibridacin cruzada con un clon de DNA complementario en las clulas de cncer humano KB. Por medio de hibridacin in situ del DNA, los genes mdr1 y mdr2 humanos fueron localizados en el cromosoma 7q21.1 (Fojo et al., 1985; Trent y Witkowski, 1987; Callen et al., 1987). El gen mdr3 fue descubierto por Van der Bliek et al., (1987) tras el aislamiento de un DNA complementario en bancos de clulas hepticas. Este gen est situado dentro de las 500 kb del mdr1 en el locus 7q21.1, mide 74 kb de longitud y est separado del gen mdr1 por 34 kb, siendo su RNAm 400 nucletidos ms corto que el de mdr1. Los genes mdr humanos se transcriben en la misma direccin, en este caso, el mdr3 se encuentra por debajo del mdr1. El mdr3 corresponde al mdr2 de Roninson et al., (1986); por tanto, en el humano existen dos genes mdr, mientras que en el ratn se han aislado tres genes.
La secuencia completa de nucletidos del DNA y la estructura primaria del producto del gen mdr fue descrita por Gros et al., (1986). La glicoprotena P se compone de 1276 aminocidos con 6 pares de dominios transmembranales y un grupo de sitios de glicosilacin ligados a N cercanos a la regin amino-terminal. La protena posee segmentos internos duplicados de 500
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aminocidos que incluyen sitios consenso para la unin del ATP. Este arreglo transmembranal permanece muy conservado en un gran nmero de sistemas de transporte de membranas de procariotas y eucariotas. Tanto Gross et al., (1986) como Chen et al., (1986) objetivaron que la glicoprotena P, involucrada en el fenmeno de resistencia a drogas en las clulas tumorales, guardaba una fuerte homologa con una serie de protenas bacterianas, las permeasas, involucradas en el mecanismo de transporte a travs de la membrana celular. Gross et al., (1986) comprobaron que la transferencia de un clon de DNA complementario del gen mdr a una clula sensible a drogas, era capaz de inducir en sta un fenotipo de resistencia por amplificacin del gen. En este mecanismo estaban implicados minsculos elementos extacromosomales en forma de diminutos cromosomas dobles circulares denominados episomas. De manera similar, Ruiz et al., (1989) demostraron la presencia del gen mdr1 en episomas que se replicaban autnomamente en una lnea celular humana resistente a mltiples drogas.
Algunas lneas celulares humanas resistentes a mltiples drogas contienen elevadas cantidades de protena cinasa C. La estimulacin de la actividad de esta cinasa inducida por agonistas (steres de forbol y Diacilglicerol) produce una elevacin del RNAm mdr1 y una sobreexpresin de la glicoprotena P. De este modo, en la expresin del gen mdr1 podra intervenir la va de la protena cinasa (Chaudhary y Roninson 1992). Por otra parte, Slovak et al., (1987) relacionaron el fenmeno de resistencia con las frecuentes alteraciones observadas en la regin 7q en lneas celulares con resistencia adquirida a la doxorrubicina. Otro mecanismo implicado en el proceso de amplificacin, descubierto recientemente en una lnea celular seleccionada resistente a la adriamicina, es la translocacin del cromosoma 4q al 7q (Mickley et al., 1997). La delecin de los primeros 68 residuos del gen mdr1 durante la trasnlocacin dio origen a un RNAm, producto de un nuevo gen hbrido, cuya expresin era controlada por el gen del cromosoma 4. Estos RNAm hbridos han sido detectados en otras lneas celulares y en pacientes con leucemias refractarias a la quimioterapia.
La purificacin de la glicoprotena P la realizaron Hamada y Tsuruo (1988) por medio de cromatografa, utilizando un anticuerpo monoclonal en la lnea celular k562 de leucemia mieloide resistente a la adriamicina. Demostraron que la glicoprotena P posee una actividad ATPasa intrnseca y por tanto, la hidrlisis de ATP acoplado a la protena estara involucrada en el mecanismo de bombeo de drogas al exterior de la clula. Los modelos animales han confirmado la importancia de la glicoprotena P en la eliminacin de diversas sustancias al exterior de la clula, evitando as, una acumulacin txica intracelular. Shinckel et al., (1994) observaron que los ratones homocigotos para el gen mdr1 eran extremadamente sensibles a un
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pesticida neurotxico y a la droga carcingena vinblastina. Cuando se compararon los ratones homocigotos con los normales, se demostr que los animales con deficiencia de glicoprotena P presentaban una acumulacin txica de ambas drogas en el sistema nervioso central. De este modo, concluyeron que la glicoprotena P-mdr1 es la principal glicoprotena de la barrera hematoenceflica. Varios trabajos experimentales tambin han ratificado que la glicoprotena P de la placenta es fundamental en limitar el transporte de drogas potencialmente dainas al feto (Schinkel et al., 1994; Umbenhauer et al., 1997; Lankas et al., 1998).
La glicoprotena P pertenece a una familia de protenas de membrana especializadas en el transporte o bombeo de sustancias de una manera dependiente de energa (ATP) al exterior de la clula. Se encuentra en altas concentraciones en la glndula suprarrenal y el rin, en concentraciones intermedias en el pulmn, hgado, intestino delgado, colon, recto y a bajos niveles en otros tejidos (Fojo et al., 1986). La protena est presente en la superficie apical de los epitelios. En el hgado la glicoprotena P se localiza fundamentalmente en la membrana canalicular de los hepatocitos y en la superficie apical de los pequeos conductillos biliares. En el pncreas se limita a los pequeos conductos pancreticos, mientras que en el colon y yeyuno se sita en la superficie apical del epitelio cilndrico columnar (Thiebaut et al., 1987). En el rin se concentra en la superficie apical de las clulas de los tbulos proximales y es la protena de membrana responsable de la secrecin de digoxina y drogas relacionadas (quinidina, verapamilo, amiodarona, espironolactona y ciclosporina), evitando as, una acumulacin txica en la nefrona (De Lannoy y Silverman, 1992). Es adems, una de las principales protenas de la barrera hematoenceflica controlando la penetracin y cmulo de drogas en el sistema nervioso central. Un buen ejemplo de ello, es la restriccin de la entrada en el sistema nervioso central de las proteasas inhibidoras utilizadas en la terapia contra el HIV, reduciendo de este modo, la eficacia de estos medicamentos (Kim et al., 1998). Las glicoprotenas mdr1 y mdr3 son necesarias para la secrecin de fosfatidilcolina en la bilis, siendo la mdr3 fundamental en el proceso de translocacin de lpidos de cadena corta a travs de la membrana celular. Las alteraciones de estos genes producen una variedad de trastornos colostticos. La mdr1 tambin est involucrada en los mecanismos de presentacin del antgeno en la inmunidad mediada por clulas T (Randolph et al., 1998).
Los productos del gen mdr han sido detectados en tumores de glndula suprarrenal y colon (Fojo et al., 1987), leucemias, tumores del sistema nervioso central, cncer renal y cncer de mama. En el cncer de mama, Efferth et al., (1992), observaron que la expresin conjunta de glicoprotena P y glutatin transferasa se corresponde con una disminucin de la topoisomerasa II. En el neuroblastoma, Chan et al., (1991), hacen referencia a la utilidad de la determinacin
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IHQ de la glicoprotena P antes de la terapia para predecir su xito o fracaso. Baldini et al., (1995) citan el mal pronstico de osteosarcomas con elevada expresin de la glicoprotena P.
En el cncer de mama la elevada expresin de glicoprotena se ha asociado a tumores con altos ndices de proliferacin celular y una menor respuesta al tratamiento adyuvante. En un estudio basado en la determinacin IHQ de la glicoprotena P con los anticuerpos monoclonales C219 y MRK16 en 41 cnceres de mama, De la Torre et al., (1994), observaron una mayor expresin de esta protena en los tumores diploides, con altos grados histolgicos, y sin afectacin ganglionar. Si embargo, esta asociacin careci de significacin estadstica. Objetivaron adems, una ausencia de asociacin con la edad, el tamao tumoral y el estado de los RE. En una serie de 25 cnceres de mama localmente avanzados tratados con quimioterapia neoadyuvante, Botti et al., (1993) relacionaron la elevada expresin de glicoprotena P con una pobre respuesta a la quimioterapia y con una disminucin de la supervivencia. Estos autores encontraron una asociacin positiva entre las altas tasas de proliferacin celular y la presencia de glicoprotena P; tambin observaron una elevada expresin de PCNA y glicoprotena P en las pacientes que desarrollaron metstasis locorregionales y a distancia. Charpin et al., (1994), en un estudio basado en 213 cnceres de mama, describen una asociacin directa muy significativa entre la expresin de glicoprotena P y la p53, Ki-67, catepsina D y RE. La inmunotincin de la glicoprotena P fue independiente de la edad, tamao tumoral, gradacin histolgica y nuclear, afectacin ganglionar y el estado del RPg. El contenido de glicoprotena P intracelular determinado mediante IHQ se correlacion con la cantidad de RNAm-P-gp. Por el contrario, Moriki et al., (1995), que valoraron la actividad proliferativa en 35 cnceres de mama, no observaron asociacin entre la expresin de glicoprotena P y la proliferacin celular ni con los parmetros de pronstico clsicos. Sin embargo, estos autores sealan que en el cncer de mama la sobreexpresin conjunta de C-erbB-2 y glicoprotena P podran estar implicadas en el proceso de transformacin maligna.
Algunos carcinomas mamarios expresan de manera significativa la glicoprotena P y el receptor de cido hialurnico protena CD44; una glicoprotena de adhesin celular implicada en la diseminacin metastsica. De la Torre et al., (1995) hacen referencia a los elevados niveles de expresin de ambas protenas en un anlisis de 52 pacientes con cncer de mama. Sin embargo, la elevada concentracin de CD44 no se relacion significativamente con los parmetros de pronstico clsicos (edad, tamao tumoral, grado histolgico, ploida, y RE).
Se han ensayado varios medicamentos capaces de revertir la resistencia a drogas inducida por la sobreexpresin de la glicoprotena P y entre ellos destacan los bloqueadores de los
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canales del calcio (verapamilo), esteroides y sus antagonistas (tamoxifn), antagonistas de la calmodulina (trifluoperacina), antiarrtmicos (amiodarona y quinidina) y el anticuerpo monoclonal MRk16. El verapamilo, la trifluoperacina y los steres de forbol son capaces de revertir el fenotipo de resistencia produciendo una acumulacin txica de drogas en las clulas resistentes (Cornwell et al., 1987). Hamada et al., (1987) demostraron, en la lnea celular resistente a drogas K562/ADM, que la glicoprotena en su estado basal se encuentra fosforilada y sustancias como el verapamilo, la trifluoperacina, 4 beta-forbol 12 beta-miristato 13 alfa acetato y el 1-oleico 2-acetilglicerol incrementaron la fosforilacin de la glicoprotena (p170 a p180) en distintos residuos de serina. La utilizacin conjunta de verapamilo con quimioterapia logr revertir parcialmente la resistencia a la doxorrubicina y vincristina en 3 de 8 pacientes con mieloma mltiple y linfomas no Hodgkin. (Dalton et al., 1989). Sin embargo, la utilidad de estos medicamentos se ha visto limitada por sus efectos secundarios, toxicidad y las dificultades para obtener concentraciones tisulares adecuadas.
Lindman et al., (1994) sealan al suramn como un agente potencialmente teraputico en aquellas pacientes con cnceres de mama con resistencia a mltiples drogas y que expresan la glicoprotena P. La exposicin a este agente inhibidor del crecimiento en 3 lneas celulares de cncer de mama (Zr-75-1, BT 549, HS-578T) y en dos sublneas resistentes a la doxorrubicina (Zr-75-1-dox, HS-578T-dox), ocasion una significativa reduccin de la supervivencia en las sublneas celulares resistentes a la doxorrubicina que expresaban la glicoprotena P.
Existen contradicciones respecto al valor pronstico de la glicoprotena P, siendo los trabajos publicados discordantes en cuanto a sus resultados; no obstante, la determinacin de la expresin de glicoprotena P servira como un indicador de prediccin de respuesta al tratamiento con diversos frmacos.
JUSTIFICACION DEL TRABAJO.

El cncer de mama constituye un importante problema de salud de la poblacin femenina espaola y, por ende, todos nuestros objetivos y esfuerzos van dirigidos a lograr una reduccin en la mortalidad causada por esta neoplasia. Sabemos que la supervivencia de este tumor depende principalmente de su extensin en el momento del diagnstico y de los tratamientos quirrgicos y complementarios. Sin embargo, existen ciertos aspectos de la biologa tumoral que desconocemos y que, de alguna manera, inciden directamente en el pronstico de la enfermedad.
De los datos recabados de la literatura y reseados en la introduccin entendemos que los marcadores tumorales son molculas que actan en las vas de sealizacin, algunos como factores de transcripcin, con el objetivo de activar y regular la maquinaria gentica responsable de la divisin, organizacin y muerte celular. Los cambios objetivados en las clulas neoplsicas en muchos casos son anlogos a los observados en la embriognesis y desarrollo de rganos, cicatrizacin de heridas, blastognesis de clulas hemato-linfoides y en las respuestas al trauma y sepsis. Las alteraciones moleculares que podemos medir en las clulas cancerosas con nuevas tcnicas inmunohistolgicas reflejan anomalas del ciclo de divisin celular. Por consiguiente, interesa saber si existe una relacin entre el comportamiento biolgico de un tumor debido a la presencia o ausencia de determinados marcadores tumorales moleculares en las clulas neoplsicas, si la expresin de estos marcadores biolgicos no es ms qu la consecuencia de un proceso de multiplicacin celular.
Los parmetros clsicos no siempre predicen adecuadamente la evolucin clnica de la enfermedad y, del mismo modo, se necesitan estudios clnicos para valorar si los marcadores tumorales moleculares son equiparables o complementarios a las variables de pronstico clsicas; si son idneas para predecir qu pacientes poseen un exceso de riesgo de desarrollar metstasis; si poseen la capacidad para discriminar entre individuos o grupos de riesgo tributarios de tratamientos agresivos o seguimientos ms estrictos; y por ltimo, si los beneficios logrados justifican los costes de determinacin en el laboratorio.
Este trabajo intenta aportar informacin adicional en este campo, contribuyendo a la ampliacin de los conocimientos en este apartado de la biologa tumoral.
HIPOTESIS DE TRABAJO
En este trabajo partimos de la hiptesis conceptual basada en que los marcadores tumorales moleculares estudiados, que intervienen en eventos de sealizacin, organizacin, divisin, diferenciacin y muerte celular, se relacionan entre s. Por tanto, su medicin y valoracin permitira considerarlos como factores a tener en cuenta para el establecimiento del pronstico.
Se establece como hiptesis nula que:
No existe asociacin entre los marcadores tumorales moleculares y los parmetros de pronstico clsicos (tamao tumoral, estado de los ganglios axilares, grado nuclear e histolgico). Los marcadores tumorales moleculares no poseen capacidad para pronosticar las recidivas precoces, es decir, aquellas que se producen durante los 36 meses de seguimiento.
Nuestra hiptesis alternativa propone que los marcadores tumorales moleculares sobre la base de su expresin o ausencia, sirven como parmetros de pronstico a un grupo de tumores que desarrollan enfermedad metastsica en un breve perodo de tiempo (36 meses). Adems estos marcadores moleculares son comparables en capacidad pronstica a las variables clsicas actuales.
OBJETIVO
De acuerdo con las hiptesis establecidas, los objetivos de este estudio comprenden:
1. El anlisis de la posible asociacin entre los diferentes marcadores tumorales moleculares (receptor de estrgeno, receptor de progesterona, pS2, Hsp27, EGFR, p185C-erbB-2, ki67, PCNA, p53, catepsina D y glicoprotena P).
2. La comparacin de la capacidad para pronosticar recidivas precoces (durante los 36 meses de seguimiento) de los marcadores tumorales moleculares con relacin a los parmetros clnico-patolgicos (la estadificacin TNM, el grado nuclear, el grado histolgico).
3. La valoracin de los marcadores moleculares como factores pronstico de recidiva en el plazo que incluye los primeros 36 meses postciruga.
4. La seleccin del mejor marcador y asociacin de marcadores que permitan establecer un valor pronstico.
MATERIAL Y MTODO.
DISEO
Estudio de cohorte ambispectivo. Pacientes intervenidas por cncer de mama en el Servicio de Ciruga II del Hospital General Universitario Gregorio Maran, en el perodo comprendido entre junio de 1992 y diciembre de 1996.
POBLACIN
Nuestra poblacin objeto de estudio incluye 108 pacientes de raza blanca con carcinoma ductal infiltrante de mama, pertenecientes al rea de salud 1 de la comunidad de Madrid, seleccionadas de un total de 145 basndose en criterios de inclusin y exclusin prefijados que se detallan a continuacin:
Criterios de Inclusin: 1. Cncer de mama tipo ductal infiltrante. Estadios I. II y III. 2. Seguimiento mnimo de 36 meses para cada una de las integrantes del estudio. 3. Pacientes tratadas con mastectoma parcial o total con diseccin axilar. 4. Determinacin IHQ de receptores de estrgeno (RE), receptores de progesterona (RPg), el receptor del factor de crecimiento epidrmico (EGFR), productos de expresin de oncogenes (p185C-erbB-2, p53), protenas citoslicas (pS2, Hsp27), protenas de membrana (glicoprotena P), antgenos nucleares de proliferacin celular (Ki-67, PCNA) y proteasas (catepsina D).
Criterios de Exclusin: 1. Carcinoma ductal in situ. 2. Carcinoma lobulillar. 3. Cncer ductal infiltrante en estadio IV. 4. Pacientes con cncer ductal infiltrante que han recibido tratamiento hormonal o quimioterapia neoadyuvante. 5. Muestras con determinaciones IHQ de marcadores moleculares incompletas. 6. Aquellas pacientes perdidas de seguimiento que no han completado al menos los 36 meses objeto del estudio.
Material y mtodo.
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RECOGIDA DE DATOS
Revisin en consultas externas y en archivo de historias clnicas, siguiendo un protocolo en el que hemos registrado 177 variables en la ficha de cada paciente, reduciendo a 29 variables, objeto ltimo de nuestro estudio.
De las 145 pacientes iniciales, aplicando los criterios de exclusin, fueron rechazadas por carcinoma in situ 5, por carcinoma lobulillar in situ 4, por carcinoma ductal infiltrante en estadio IV 11, por haber recibido quimioterapia neoadyuvante 5, por determinaciones de marcadores IHQ incompletas 7, por prdida de seguimiento por traslado a otros centros 3. En total fueron estudiadas 108 enfermas intervenidas por carcinoma ductal infiltrante. El diagnstico se confirm previa biopsia intraoperatoria y la tcnica quirrgica empleada se bas en el tamao tumoral. Todas las piezas de reseccin y los ganglios axilares fueron examinadas y las tinciones inmunohistoqumicas realizadas por el mismo patolgo el Dr. Luis Carretero Albiana del Servicio de Anatoma Patolgica del Hospital General Universitario Gregorio Maran. Los grados histolgicos se obtuvieron mediante sistema de puntuacin, de acuerdo con los criterios de clasificacin de Scarff-Bloom-Richardson. La estadificacin se bas en el sistema TNM modificado por la AJCC ( American Joint Committee on Cancer).
El seguimiento de las enfermas se realiz cada 6 meses en las consultas externas de ciruga y oncologa. Los datos del seguimiento se obtuvieron en las propias consultas externas. Cuando no era posible, la revisin del historial clnico se realiz en el archivo de historias clnicas del hospital. Cada una de las enfermas ha completado el seguimiento de 36 meses preestablecido en el diseo.
VARIABLES DEL ESTUDIO

1) CUANTITATIVAS: incluye la edad, el intervalo libre de enfermedad y la supervivencia global. a) Edad: indica la edad en aos de las pacientes en el momento del diagnstico de la enfermedad. b) Intervalo libre de enfermedad: define el perodo transcurrido en meses desde el momento que es intervenida quirrgicamente hasta que se diagnostica la recidiva. c) Supervivencia global: tiempo de vida en meses desde el momento en que es intervenida hasta que fallece. En los casos donde no se produce la recidiva equivaldra al perodo libre de enfermedad durante el seguimiento.
Material y mtodo.
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2) CUALITATIVAS: incluye las recidivas, los exitus, los parmetros clnico-patolgicos y los marcadores tumorales moleculares. a) Recidivas: enfermedad metastsica aparecida tras la ciruga. En nuestro estudio debido a la ausencia de recidivas locales empleamos el trmino recidiva como sinnimo de metastsis o enfermedad diseminada. En este estudio se definen las recidivas precoces como aquellas que se diagnostican durante los 3 aos de seguimiento. Es una variable dicotmica. En la base de datos, recibe un valor de 1 la presencia de metstasis y 0 la ausencia. b) Exitus: fallecimientos que se producen durante los 36 meses de seguimiento objeto del estudio. En la base de datos se atribuye un valor de 1 a la defuncin y 0 al continuar viva. c) Parmetros clnico patolgicos. d) Marcadores tumorales moleculares. PARAMETROS CLINICO-PATOLOGICOS: 1) Estado Hormonal: comprende 2 categoras: a) La premenopausia: pacientes que no han alcanzado la menopausia y presentan perodos menstruales en el momento del diagnstico del cncer. En la base de datos recibe el valor de 1. b) La postmenopausia: enfermas con cese espontneo o provocado de la menstruacin. En la base de datos recibe el valor 2.
2) El tipo de tumor: determina dos categoras: a) Tumores nicos: existe un nico foco de cncer ductal infiltrante. En la base de datos se le atribuye un valor de 1. b) Tumores multicntricos: hay 2 o ms focos de cncer ductal infiltrante en la misma mama. En la base de datos recibe un valor de 2.
3) Tamao tumoral: se definen 3 categoras: a) Tamao menor de 2 cm: tumores con un dimetro en su eje mayor menor de 2 cm. En la base de datos se le atribuye a este dato un valor de 1. b) Tamao entre 2 y 5 cm: tumores con un dimetro en su eje mayor superior a los 2 cm, pero inferior a 5 cm. El valor en la base de datos a esta categora corresponde a 2. c) Tamao mayor de 5 cm: corresponde a tumores con un dimetro en su eje mayor superior a los 5 cm. En la base de datos a esta categora se le asigna un valor de 3.
Material y mtodo.
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4) Afectacin ganglionar: establece 3 categoras segn la afectacin ganglionar de la clasificacin TNM: a) N0: ausencia de afectacin ganglionar axilar. En la base de datos a esta categora se le atribuye un valor de 0. b) N1: ganglios axilares positivos mviles. En la base de datos se le asigna un valor de 1. c) N2: ganglios axilares positivos fijos ipsilaterales. En la base de datos esta categora recibe un valor de 2.
5) Nmero de ganglios axilares afectados: comprende 3 categoras: a) N de ganglios =0: ausencia de afectacin ganglionar. En la base de datos se le asigna un valor 0. b) N de ganglios =1 3: afectacin de mas de 1 ganglio, pero menos de 4. En la base de datos se le atribuye a esta categora un valor de 1. c) N de ganglios =4: afectacin de 4 o ms ganglios axilares. En la base de datos recibe esta categora un valor de 2.
6) Tamao ganglionar: incluye la mediana del dimetro de los ganglios axilares positivos medidos en cm en su eje mayor. El valor de la mediana corresponde a 1,8 cm. Existen dos categoras: a) Tamao ganglionar inferior a 1,8 cm: en la base de datos corresponde a un valor de 1. b) Tamao ganglionar superior a 1,8 cm: en la base de datos corresponde a un valor de 2.
7) Desbordamiento de la cpsula ganglionar: define los ganglios axilares positivos con compromiso de la cpsula del ganglio y la posibilidad de infiltracin del tejido graso circundante. Distingue dos categoras: a) Cpsula rota: cuando existe el desbordamiento de la cpsula. Se le asigna un valor de 1 en la base de datos. b) Cpsula intacta: cuando la metstasis queda confinada al interior del ganglio. En la base de datos se le atribuye un valor de 0 a esta categora.
8) Grado nuclear: definido por la puntuacin obtenida segn el sistema de clasificacin de la escala de Bloom-Richardson, basado en las variaciones en el tamao y forma de los ncleos. Comprende 3 categoras: a) Grado nuclear I: ncleos con mnimas variaciones en tamao y forma. Se corresponde con tumores bien diferenciados. En la base de datos a esta categora se le asigna un valor de 1.
Material y mtodo.
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b) Grado nuclear II: ncleos con moderadas variaciones en tamao y forma. Comprende tumores moderadamente indiferenciados. Se le atribuye un valor de 2 a esta categora. c) Grado nuclear III: gran pleomorfismo nuclear. Se observa en tumores indiferenciados. En la base de datos esta categora recibe un valor de 3.
9) Grado Histolgico: distingue 3 categoras basndose en el sistema de puntuacin de la escala de clasificacin de Bloom-Richardson. a) Grado histolgico I: de 3- 5 puntos. Corresponde a tumores bien diferenciados. En la base de datos esta categora recibe un valor de 1. b) Grado histolgico II: de 6-7 puntos. Comprende tumores moderadamente diferenciados. Se le atribuye un valor de 2 a esta categora. c) Grado histolgico III: de 8 9 puntos. Incluye a tumores indiferenciados. Se le asigna un valor de 3 en esta categora.
10) Estadificacin: incluye 3 categoras del sistema de clasificacin TNM. a) Estadio I: tumores T1N0M0. En la base de datos a esta categora se le asigna un valor de 1. b) Estadio II: tumores T1N1M0, T2N0M0, T2N1M0, T3N0M0. En la base de datos se le atribuye un valor de 2. c) Estadio III: tumores T1N2M0, T2N2M0, T3N1M0, T3N2M0, T4 cualquier N M0. En la base de datos a esta categora se le asigna un valor de 3.
11) Radioterapia: define haber recibido o no tratamiento radioterpico. Existen dos categoras: a) Radioterapia s (+): pacientes que han sido radiadas en el postoperatorio. Incluye la radiacin del lecho tumoral, la axila, fosa supraclavicular y cadena mamaria. Se le asigna un valor de 1. b) Sin radioterapia (-): enfermas que no recibieron radiaciones ionizantes postciruga. En la base de datos a esta categora se le otorga un valor de 0.
12) Quimioterapia: determina las pacientes que han sido tratadas o no con citotxicos. Hay dos categoras: a) Quimioterapia s (+): enfermas tratadas en el postoperatorio con citotxicos. Se le atribuye un valor de 1. b) Quimioterapia no (-): pacientes sin tratar. Se le asigna un valor de 0.
Material y mtodo.
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13) Hormonoterapia: abarca a todas las pacientes tratadas o no con tamoxifn. Se especifican 2 categoras: a) Hormonoterapia s (+): enfermas que recibieron tamoxifn postciruga o posterior a la quimioterapia. En la base de datos esta categora corresponde a un valor de 1. b) Hormonoterapia no (-): pacientes que no recibieron en ningn momento tamoxifn. A este dato le corresponde un valor de 0. MARCADORES TUMORALES MOLECULARES.
Determinacin Inmunohistoqumica.
Para lograr una correcta tcnica y unos buenos resultados se han tenido en cuenta: 1. La obtencin de un tejido representativo en buenas condiciones. 2. La adecuada fijacin y procesamiento de la muestra. 3. Las diluciones, tiempos, temperatura y programas de procesamiento. 4. La realizacin de controles positivos y negativos con los anticuerpos monoclonales antes de realizar las determinaciones inmunohistoqumicas en el tejido canceroso.
Los dos procedimientos utilizados en la determinacin IHQ de los marcadores tumorales moleculares han sido el mtodo de la peroxidasa-antiperoxidasa y el mtodo de la avidinabiotina-peroxidasa. A continuacin se exponen las soluciones y los pasos seguidos en el proceso de inmunotincin.
Mtodo de la peroxidasa-antiperoxidasa (PAP).

Las soluciones utilizadas incluyen: a) Solucin de metanol-perxido de hidrgeno al 3%. El preparado est compuesto por 3 ml de una solucin de proxido de hidrgeno al 30% y 97 ml de metanol absoluto. b) Solucin salina de fosfato estabilizadora (PBS) compuesta por 1,48 g de fosfato de sodio, dibsico, anhidro; 0,43 g de fosfato de sodio monobsico, anhidro; 7,20 g de cloruro de sodio; y 1.000 ml de agua destilada. c) Solucin sustrato de diaminobencidina constituido por 42,0 g de 33 Diaminobencidina y 100 ml de solucin salina de fosfato estabilizadora a un pH de 7.0 - 7.6. d) Solucin de tripsina compuesta por 0,1 g de tripsina y solucin salina de fosfato estabilizadora a un pH de 7.0 - 7.6. e) Solucin de hematoxilina de Mayer. f) Suero normal de la misma especie que el anticuerpo primario. g) Suero normal de la misma especie que el anticuerpo puente. h) Solucin de anticuerpo primario.
Material y mtodo.
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i) j)
Solucin de anticuerpo puente. Solucin del complejo peroxidasa-antiperoxidasa (PAP)
La fijacin se realiza con formalina neutra al 10% estabilizada. Las muestras incluidas en parafina se cortan en secciones de 5 micrones, sobre lminas cubiertas de pegamento.
Pasos del Procedimiento: 1. Hay que desparafinizar las lminas e hidratarlas con agua destilada. 2. Es necesario bloquear la actividad de la peroxidasa endgena con solucin de perxido de hidrgeno-metanol durante 30 minutos. 3. Se enjuaga 2 veces con agua destilada durante un minuto cada vez. 4. A continuacin se colocan las lminas durante 2 minutos en una solucin salina de fosfato estabilizadora (PBS). 5. Digerir las secciones con una solucin de tripsina a 37C de 3 a 10 minutos. 6. Volver a enjuagar con solucin PBS. 7. Colocar las lminas durante 30 minutos en solucin de anticuerpo puente (suero normal de la misma especie animal), una vez transcurrido este tiempo se escurren las lminas sin enjuagarlas. 8. Durante otros 30 minutos o ms, segn las diluciones o especificaciones del fabricante, se colocan las lminas con el anticuerpo primario. 9. Enjuagar nuevamente con la solucin PBS. 10. Colocar con el anticuerpo secundario, durante 30 minutos. 11. Volver a enjuagar con la solucin PBS. 12. Colocar en la solucin del complejo peroxidasa antiperoxidasa, durante 30 minutos. 13. Enjuagar con la solucin PBS. 14. Colocar en la solucin sustrato de diaminobencidina, durante 10 minutos. 15. Enjuagar primero con solucin PBS y a continuacin con agua destilada. 16. Contrastar con la solucin de hematoxilina de Mayer durante 5 minutos. 17. Lavar durante 10 minutos con agua tibia templada. 18. Deshidratar y aclarar con alcohol etlico al 95%, alcohol etlico absoluto y xileno, 2 cambios cada uno, durante 2 minutos cada uno. 19. Montar con un medio resinoso.
Mtodo del complejo de avidina-biotina (ABC).

Las soluciones se emplean a las mismas concentraciones que en el mtodo PAP: a) Solucin de perxido de hidrgeno-metanol al 3%.
Material y mtodo.
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b) Solucin PBS. c) Solucin sustrato de diaminobencidina. d) Solucin de tripsina. e) Solucin de hematoxilina de Mayer. f) Suero normal de la misma especie que el anticuerpo puente. g) Suero normal de la misma especie que el anticuerpo primario. h) Solucin primaria de anticuerpos. i) j) Solucin de anticuerpos puente. Solucin de anticuerpos puente biotinilados.
Para este procedimiento se siguen los primeros 9 pasos del mtodo PAP: 10. Durante 30 minutos colocar en la solucin biotinilada de anticuerpo secundario. 11. Volver a enjuagar con la solucin PBS. 12. Durante 30 minutos colocar en la solucin del complejo avidina-biotina. 13. Enjuagar con la solucin PBS. 14. Completar el procedimiento siguiendo los pasos del 14 19 segn el mtodo PAP
1. Determinacin inmunohistoqumica del receptor de Estrgeno (RE):

Para la determinacin IHQ del RE se utiliz el anticuerpo monoclonal ER1D5 (Immunotech, Marseille, France). Este anticuerpo tipo IgG1 se obtiene por estimulacin antignica del ratn con la protena recombinante del receptor de estrgeno de 67 kDa. El ER1D5 reacciona especficamente con el dominio N-terminal del receptor de estrgeno humano tiendo clulas miometriales, estromales, clulas hiperplsicas del epitelio ductal y lobular de las glndulas mamarias, clulas del cancer de tero y mama. Los controles positivos se realizaron con clulas de endometrio y de tejido mamario.
La determinacin IHQ de los RE se efectu en muestras incluidas en parafina, fijadas previamente en formalina. A las muestras desparafinizadas se les practic un tratamiento con calor en el horno de microondas. Las lminas se colocaron en discos termorresistentes llenos con solucin estabilizadora de citrato a un pH 7,6 (constituida por 9 ml de una solucin 0,1 M de cido ctrico, 41 ml de una solucin 0,1 M de citrato de sdico y 450 ml de agua destilada) y se realizan de 3 5 ciclos cada uno a 750 watt. Se retiran los discos del horno de microondas y se les permiti enfriar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las lminas se enjuagaron con una solucin salina estabilizadora de Tris (TBS). Se continu el procedimiento de inmunotincin con la tcnica de avidina-biotina segn los pasos descritos previamente,
Material y mtodo.
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incubando el anticuerpo monoclonal ER1D5 con los tejidos durante 60 minutos a temperatura ambiente.
Se contabilizaron 200 clulas y se cuantific el porcentaje de clulas con ncleos teidos. Un porcentaje inferior al 20% fue considerado bajo, entre un 20 60% moderado, y alto superior al 60%.
Para la variable RE se consideraron dos categoras. En la base de datos se le asign un valor de 1 (+) a un porcentaje del 10% o ms de clulas con tincin nuclear positiva y un valor de 0 (-) a un porcentaje de 0 o inferior al 10%.
2. Determinacin inmunohistoqumica del receptor de progesterona (RPg):

Para la determinacin IHQ del receptor de progesterona se utiliz el anticuerpo monoclonal del ratn RPG 88 (IgG1, kappa, Super sensitive Ready-to-Use Antibody de los laboratorios BioGenex) cuyo inmungeno es la protena del RPG humano purificada. El anticuerpo se obtiene del fluido asctico y es diluido en una solucin salina estabilizadora de fosfato a un pH de 7.6 que contiene albmina srica bovina al 1% y azida sdica al 0.09%. El anticuerpo tie las clulas de la capa basal de la epidermis, clulas estromales del endometrio, clulas del msculo liso del miometrio, clulas del tejido mamario y clulas de carcinoma de mama humano. En clulas de cncer de mama la tincin es predominantemente nuclear. Los controles positivos se realizaron con clulas de cncer ductal infiltrante de mama.
Las muestras fueron fijadas en formalina y posteriormente embebidas en parafina. Para la recuperacin de la mayor cantidad de antgenos, las muestras desparafinizadas fueron tratadas en una solucin estabilizadora de citrato (HK086/87-5K) en el horno de microondas. La inmunotincin se realiz siguiendo los pasos descritos para el mtodo PAP.
Se contabiliz el porcentaje de clulas con tincin nuclear positiva examinando 200 clulas. Consideramos bajo un 20% de clulas con tincin positiva, moderado entre un 20 - 60%, y alto mas de un 60% de las clulas teidas.
En la base de datos se consideraron dos categoras para la variable RPg; al porcentaje del 10% o ms de clulas con tincin nuclear positiva se le asign el valor de 1 (+) y de 0 (-) a la ausencia o porcentaje inferior al 10%.
Material y mtodo.
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3. Determinacin inmunohistoqumica de la protena pS2:

Para la determinacin IHQ de la protena pS2 se utiliz el anticuerpo monoclonal del ratn pS2.1 (Laboratorios BioGenex). Este anticuerpo tipo IgG1 se obtiene por estimulacin antignica del ratn a un pptido sinttico de 31 aminocidos de la porcin carboxi-terminal de la protena humana pS2. El anticuerpo se obtiene del sobrenadante diluido en una solucin estabilizadora de fosfato de pH 7,6 con albmina srica bovina al 1% y azida sdica al 0,1%.
El anticuerpo monoclonal reacciona con una protena de 6,5 kDa y tie clulas RE- de la mucosa del antro gstrico y clulas de cncer de mama, siendo el patrn de tincin predominantemente citoplsmico. Los controles positivos se realizaron con clulas de cncer de mama siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Las muestras fijadas en formalina, embebidas en parafina y posteriormente desparafinizadas, y rehidratadas fueron incubadas a 4C durante 18 horas con una solucin del anticuerpo prediluido 1:700, la tincin se complet siguiendo los pasos descritos para el procedimiento de del complejo avidina-biotina-peroxidasa.
Se examinaron 200 clulas y se cuantific el porcentaje con tincin citoplsmica positiva, de este modo, se consider como inmunotincin positiva cuando existieron ms de un 10% de clulas teidas.
Para la variable pS2 se consideraron dos categoras; en la base de datos a la inmunotincin de un 10% o ms de clulas con tincin citoplsmica positiva se le asign un valor de 1 (+) y a la ausencia o un porcentaje de tincin inferior al 10% un valor de 0 (-).
4. Determinacin inmunohistoqumica de la protena p29 (Hsp27):

El anticuerpo monoclonal del ratn D5 (Super Sensitive Ready-to-Use Antibody, Laboratorios BioGenex) fue utilizado para la determinacin IHQ de esta protena. El anticuerpo tipo IgG1 reconoce una protena de 29 kDa unida al receptor de estrgeno localizado en el citoplasma. El inmungeno es una protena de afinidad del receptor de estradiol citoslico de clulas de miometrio humano. El anticuerpo se obtiene del fluido asctico del ratn diluido en una solucin salina estabilizadora de fosfato de pH de 7,6 con albmina bovina srica al 1% y azida sdica al 0,09%.
El anticuerpo tie positivamente clulas del sistema reproductor femenino, clulas del epitelio ductal y alveolar de la mama, msculo liso de vasos sanguneos, clulas de
Material y mtodo.
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fibroadenoma y cncer de mama. Los controles positivos se realizaron con clulas de cncer ductal infiltrante de mama.
Los procedimientos de tincin IHQ se realizaron sobre muestras fijadas en alcohol y embebidas en parafina, siguiendo los pasos descritos del procedimiento del complejo avidinabiotina-peroxidasa y utilizando un anticuerpo prediluido.
Los patrones de tincin se obtuvieron examinando 200 clulas tumorales y cuantificando el porcentaje con tincin positiva de este total. Entre un 10 30% se consider un porcentaje de tincin dbil, entre un 30 y 70% moderado y ms de un 70% alto.
En la base de datos a esta variable le correspondieron dos categoras. Para fines estadsticos consideramos como tincin positiva la presencia de un 10% o ms de las clulas tumorales con tincin citoplsmica positiva, asignndole un valor de 1 (+) y como negativo la ausencia de tincin o un porcentaje de clulas teidas inferior al 10%. A este ltimo dato se le atribuy un valor de 0 (-).
5. Determinacin inmunohistoqumica del receptor del factor de crecimiento epidrmico (EGFR):

En la determinacin IHQ del EGFR fue utilizado el anticuerpo monoclonal E30 (Super Sensitive Ready-to-Use Antibody, Laboratorios BioGenex, San Ramon, CA) que reconoce la porcin proteica del dominio extracelular del receptor. Este anticuerpo de la clase IgG1 del ratn se obtiene del sobrenadante del cultivo celular de ratones inmunizados con un receptor de EGF purificado y desnaturalizado. El anticuerpo est diluido en una solucin salina estabilizadora de fosfato de pH 7,6 que contiene albmina bovina al 1% y azida sdica al 0,09%.
El anticuerpo ha teido inmunohistoqumicamente clulas de carcinoma escamosos del pulmn, carcinomas escamosos de vulva, cervix, y ovario. Los controles positivos se efectuaron con clulas de carcinomas escamosos.
Las tinciones inmunohistoqumicas se han realizado en muestras fijadas en formalina y embebidas en parafina siguiendo los pasos descritos para los procedimientos del complejo avidina-biotina-peroxidasa.
Material y mtodo.
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El patrn de tincin es citoplsmatico a nivel de la membrana celular. Se cuantific el porcentaje de clulas con tincin citoplsmica de un total de 200 examinadas, as, se consider un porcentaje bajo cuando se contabilizaron entre un 10 30% de clulas teidas, moderado cuando se cuantificaron entre un 30 70% de las clulas y alto con mas de un 70% de clulas tumorales con tincin positiva. A la variable EGFR se le asignaron dos categoras. En el manejo estadstico se consider como tincin positiva la presencia de un 10% o ms de clulas cancerosas, atribuyndole a esta categora un valor de 1 (+) y de 0 (-) la ausencia de tincin o un porcentaje inferior al 10%.
6. Determinacin inmunohistoqumica de la protena p185C-erbB-2:

Para la determinacin IHQ de esta oncoprotena se emple el anticuerpo monoclonal CB11 (Laboratorios Novocastra, Newcastle, U.K.). El anticuerpo tipo IgG1 se obtiene de un hibridoma del ratn (p3-NS1-Ag4-1) mediante estimulacin inmunognica con un pptido sinttico del dominio interno de la oncoprotena C-erbB-2. La recuperacin del anticuerpo se obtiene del sobrenadante de cultivo liofilizado que contiene 15 mM de azida sdica reconstituido con 1 ml de agua destilada estril.
El patrn de tincin es positivo en la mayora de los casos de enfermedad de Paget de la mama, en el 70% de los casos de carcinoma de mama ductal in situ, entre un 15 y un 30% de los casos de cncer ductal infiltrante de mama, y en un 20% de los cnceres de clulas transicionales, ovario y tracto gastrointestinal. El patrn de tincin es citoplsmico a nivel de la membrana plasmtica. Los controles positivos los hemos realizado con clulas de cncer ductal infiltrante.
La tincin IHQ se efecta sobre muestras fijadas en formalina y embebidas en parafina siguiendo los pasos descritos del procedimiento del complejo avidina-biotina, incubando las lminas con el anticuerpo a una dilucin de 1:40 durante 60 minutos a una temperatura de 25C.
Se valor el porcentaje de clulas teidas realizando un contaje de 200 clulas cancerosas. Un porcentaje entre un 10 y un 30% de clulas neoplsicas teidas se consider bajo, entre un 30 70% moderado y superior al 70% como alto.
Para esta variable se consideraron dos categoras. En la base de datos la presencia de inmunorreactividad en un 10% o ms de clulas tumorales se consider positiva y recibi un valor de 1 (+). La ausencia de clulas teidas o un porcentaje de tincin inferior al 10% se consider negativo y se le dio un valor de 0 (-).
Material y mtodo.
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7. Determinacin inmunohistoqumica del antgeno nuclear de proliferacin celular Ki-67:

En la determinacin IHQ de este antgeno se utiliz el anticuerpo monoclonal MIB-1 (Laboratorios Inmunotech, Marseille, France) que reconoce un antgeno nuclear relacionado con la proliferacin celular (fases G1, S, G2, M). Este anticuerpo tipo IgG1 se obtiene de un hibridoma de ratn (Mieloma X63. Ag.8653 x Balb/c spleen cells) mediante estimulacin con un pptido recombinante humano correspondiente a un fragmento de DNA complementario de 1002 pares de bases. El anticuerpo se recupera mediante cromatografa por afinidad sobre Sefarosa protena A del fluido asctico, es diluido en una solucin estabilizadora de fosfato que contiene albmina srica bovina y azida sdica al 0,1%.
La determinacin IHQ se efectu en muestras fijadas en formalina y embebidas en parafina, siguiendo los pasos descritos para el procedimiento del complejo avidina-biotina peroxidasa, con anticuerpo purificado diluido en 1:100 incubado con las lminas durante 60 minutos.
Se examinaron 200 clulas y se determin de este total el porcentaje de clulas con tincin nuclear positiva. Obteniendo el valor de la mediana del porcentaje de clulas tumorales con tincin positiva como punto de corte, se consider para fines estadsticos el valor por encima de la mediana como elevado ndice de proliferacin y por debajo de la mediana como bajo ndice. En la base de datos la categora elevado ndice de proliferacin se le asign un valor de 2 (+) y la categora bajo ndice un valor de 1 (-).
8. Determinacin inmunohistoqumica del antgeno nuclear de proliferacin (PCNA).

El anticuerpo monoclonal PC10 (NCL-PCNA, Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, UK), reconoce el antgeno nuclear de proliferacin celular de todas las especies de vertebrados. Es un anticuerpo de la clase IgG2a, cuyo inmungeno es el PCNA de la rata obtenido por expresin de la protena A, mediante el vector pR1T2T, producida en la clula de mieloma del ratn (sp2/0-Ag14). El anticuerpo se extrae del fluido del sobrenadante y es diluido en una solucin de 15 mM de azida sdica.
El anticuerpo tie los ncleos de clulas en proliferacin. Los controles positivos se realizaron con ganglios linfticos reactivos.
Material y mtodo.
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La determinacin IHQ se realiz en muestras fijadas en formalina e incluidas en parafina, siguiendo los pasos descritos para la tcnica ABC, trabajando con una dilucin de 1:100 del anticuerpo incubndolo con las lminas durante 30 minutos.
Los patrones de tincin se obtuvieron examinando 200 clulas y contabilizando el porcentaje con tincin nuclear positiva. Cuantificando el valor de la mediana se estableci como bajo ndice de proliferacin un valor inferior al 16% y como elevado ndice un valor superior al 16%.
De este modo la variable PCNA consta de dos categoras segn el valor de la mediana. As se consider para el manejo estadstico el valor de 1 (-) para tumores con bajo ndice y un valor de 2 para tumores con elevado ndice (2).
9. Determinacin inmunohistoqumica de la protena p53.

El anticuerpo monoclonal DO-7 (NCL p53 DO7, Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, UK) reconoce la protena humana silvestre y mutante p53. Este anticuerpo de la clase IgG2b se obtiene de una clula hibridoma del ratn (X63-Ag.653) por estimulacin con una protena recombinante p53 silvestre humana. El anticuerpo se recupera del sobrenadante del cultivo y es diluido en 15 mM de azida sdica.
El patrn de tincin es nuclear, tiendo una alta proporcin de cnceres de colon, pulmn, vejiga y mama. Los controles positivos se realizaron con cnceres de colon.
La determinacin IHQ se realiz en muestras de cnceres ductales infiltrantes fijadas en formalina e incluidas en parafina. La tincin se efectu segn la tcnica ABC, empleando una dilucin de 1:100 del anticuerpo, incubndolo con las muestras durante 60 minutos a una temperatura de 25C.
Los patrones de tincin variaron segn el porcentaje de clulas con tincin nuclear positiva de un contaje sobre 200 clulas. Se consider bajo un porcentaje inferior al 10% de clulas cancerosas con tincin nuclear positiva, moderado entre un 10 50%, y alto un porcentaje superior al 50%.
En el anlisis estadstico se utilizaron 2 categoras. Se le asign un valor de 1 (+) la presencia de un ms de un 10% de clulas tumorales con tincin nuclear positiva y un valor de 0 (-) la ausencia o un porcentaje de tincin inferior al 10%.
Material y mtodo.
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10. Determinacin inmunohistoqumica de la catepsina D.

La determinacin IHQ de la catepsina D se realiz utilizando el anticuerpo monoclonal C5 (NCL-CDm, Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, UK). Este anticuerpo de la clase IgG2b que reconoce la catepsina D, se obtiene del sobrenadante de cultivo celular de un hibridoma de ratn (p3-NS1-Ag4-1) estimulada con catepsina D purificada del bazo humano.
Se aprecia una tincin finamente granular en el citoplasma de los macrfagos debido a la localizacin lisosomal de la enzima. Los controles positivos se realizaron con macrfagos, clulas hepticas y clulas de cncer de mama.
La determinacin IHQ se realiz en muestras fijadas en formalina e incluidas en parafina. Una vez desparafinadas e hidratadas las muestras se tieron siguiendo los pasos descritos de la tcnica ABC, utilizando una dilucin 1:200 del anticuerpo e incubndolo durante 60 minutos.
Sobre la base de un contaje de 200 clulas se obtuvo el porcentaje de clulas con tincin citoplsmica positiva. Un porcentaje entre 10 30% de clulas positiva en el tumor se consider bajo, entre un 30 70% moderado y superior al 70% como alto.
A la variable catepsina D, se le atribuy 2 categoras. A la presencia de ms de un 10% de clulas tumorales positivas se le atribuy un valor de 1 (+) y a un porcentaje inferior al 10% o la ausencia un valor de 0 (-).
11. Determinacin inmunohistoqumica de la glicoprotena P.

El anticuerpo monoclonal JSB-1 (NCL-JSB1, Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, UK) reconoce una protena de membrana celular de 170 180 kDa relacionado con el fenmeno de resistencia a drogas. Este anticuerpo es de la clase IgG. La glicoprotena P se encuentra en tejidos con epitelios relacionados con el transporte a travs de la membrana celular que incluyen el hgado, colon, riones, glndulas suprarrenales y cerebro. Los controles positivos se realizaron con hepatocitos.
La determinacin IHQ se efectu en muestras fijadas en formalina e incluidas en parafina. Se practic un tratamiento con calor en solucin estabilizadora de citrato para permitir la recuperacin de los antgenos. La tincin fue realizada siguiendo los pasos descritos para la tcnica ABC utilizando una dilucin del anticuerpo 1:20.
Material y mtodo.
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Los patrones de tincin se obtuvieron contabilizando el porcentaje de clulas tumorales con tincin citoplsmica positiva de un total de 200 clulas examinadas. Se consider un porcentaje bajo entre un 10 30% de clulas tumorales con tincin positiva, moderado entre un 30 70% y alto un porcentaje superior al 70%.
Para la variable glicoprotena P se establecieron 2 categoras. Para fines estadsticos se atribuy un valor de 1 (+) un porcentaje de clulas tumorales con tincin positiva superior al 10% y un valor de 0 a la ausencia o porcentaje inferior al 10%.
ANLISIS ESTADSTICO DE DATOS.

El anlisis estadstico fue realizado con el programa SPSS/Win versin 6.1.2. 1995.
Se utiliz un contraste de hiptesis unilateral (una cola) cuando el sentido del anlisis slo era posible de forma unidireccional, es decir, cuando el resultado de la comparacin mostr una desigualdad que slo era posible en un sentido o tena una alternativa. La Ho fue aceptada o rechazada, segn se encontraran o no diferencias significativas en las comparaciones realizadas con la prueba descrita, con una probabilidad de error inferior al 5%.
Para el clculo del estadstico de contraste entre las variables cualitativas, empleamos la prueba de chi cuadrado y la prueba exacta de Fisher.
El mtodo de Kaplan-Meir fue utilizado para el anlisis del intervalo libre de enfermedad a 36 meses. Se emple el test del logaritmo del rango o prueba de Mantel Haenszel (logrank test) para las diferencias entre las curvas.
Efectuamos un anlisis multivariante mediante anlisis de la supervivencia de riesgos de proporciones de Cox, considerando como variable dependiente la recidiva y como tiempo el intervalo libre de enfermedad a 36 meses.
Se realiz con intervalos de 3 meses una bsqueda sistemtica de la bibliografa relacionada con el tema de la que obtuvimos los trabajos ms relevantes. La bsqueda se realiz a travs de las bases de datos Medline, Indice Mdico Espaol y la base de datos TSEO con los descriptors: estrogen receptor, progesterone receptor, pS2 TFF1, p29 Hsp27, EGFR, CerbB-2, Ki-67, PCNA, cathepsin D, glycoprotein P, breast cancer and prognosis.
RESULTADOS
I-A. DESCRIPCIN GENERAL DE LA SERIE.
La edad media de las 108 pacientes con carcinoma ductal infiltrante fue de 62,074 aos (I.C. al 95%: 59,864,3). Con relacin al estado hormonal, el 19,4% de las pacientes fueron premenopusicas (21 casos), con una media de edad de 44,7 aos (I.C. al 95%: 41,7 47,2 ) y el 80,5% postmenopusicas (87 casos) con una media de edad de 66,3 aos (I.C. al 95%: 64,5 68,1). A todas las enfermas se les realiz biopsia intraoperatoria. Se practicaron: tumerectoma en 16 pacientes (14,8%), cuadrantectoma en 30 enfermas (27,8%) y mastectoma radical modificada en 62 casos (57,4%), distribuidas entre Madden (38 casos) y Patey (24 casos). Los 108 procedimientos quirrgicos fueron acompaados de diseccin axilar, divididos segn el nivel de vaciamiento ganglionar realizado en: a) nivel I, en 15 casos (13,8%), b) nivel II, en 67 casos (62,0%) y c) nivel III, en 24 casos (22,2%).
Noventa y siete de los cnceres (89,8%) correspondieron a tumores nicos, siendo multicntricos once de ellos (10,2%). De los 11 casos de tumores multicntricos, 8 se diagnosticaron en piezas de mastectoma, 2 en especimenes de cuadrantectomas y 1 en el examen de una tumorectoma. Segn la estadificacin, 3 cnceres multicntricos fueron clasificados en un estadio I, 6 en un estadio II y 2 en un estadio III.
Segn el tamao, el 44,4% de los cnceres (n=48) medan menos de 2 cm, el 46,3% entre 2 y 5 cm (n=50) y el 9,3% ms de 5 cm (n=10). Los cnceres han sido clasificados segn el grado histolgico y nuclear basado en el ndice de Scarff-Bloom, de este modo: 15 fueron catalogados como grado histolgico I (13,9%), 70 como grado histolgico II (64,8%) y 23 como grado histolgico III (21,3%). Han sido clasificados como grado nuclear I 10 tumores (9,3%), como grado nuclear II 71 tumores (65,7%) y como grado nuclear III 27 tumores (25,%).
En 52 pacientes (48,1%) se objetivaron ganglios axilares positivos y ausencia de afectacin en 56 casos (51,9%). En 33 cnceres (30,6%) se contabilizaron entre 1 y 3 ganglios axilares afectados y en 19 tumores (17,6%) ms de 4 ganglios colonizados. (Tabla 1). Los ganglios axilares afectados medan una media de 1,49 cm (I.C. al 95%: 1,4 - 1,6). Se evidenci desbordamiento de la cpsula ganglionar en 20 de los 52 casos con ganglios axilares positivos.
Resultados
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Tabla 1.Ganglios infiltrados clasificados por nmero Nmero de Ganglios 0 1-3 Ms de 4 Total Frecuencia 56 33 19 108 Porcentaje 51,9 30,6 17,6 100,0
Siguiendo las directrices de la AJCC (American Joint Commettee on Cancer), las 108 pacientes, se clasificaron en: estadio I, 42 casos (38,9%); estadio II, 46 casos (42,6%) y estadio III, 20 casos (18,5%). Los tamaos tumorales T1 y T2 comprendieron el 89,8% de los tumores (n=97). Las tablas 2 y 3 muestran la distribucin de los cnceres clasificados segn el sistema de clasificacin TNM.
Tabla 2. ESTADIO T (TNM) Frecuencia T1 T2 T3 TOTAL 53 44 11 108 Porcentaje 49,1 40,7 10,2 100,0
Tabla 3. ESTADIO N (TNM) Frecuencia N0 N1 N2 TOTAL 56 37 15 108 Porcentaje 51,9 34,2 13,9 100,0
En 71 tumores (65%) la tincin IHQ de los ncleos mostr positividad para los RE, en 64 para los RPg (59,3%) y en 23 para la protena p53 (21,3%). Las protenas dependientes de estrgeno pS2 y Hsp27 se detectaron en 31 (28,7%) y en 78 (72,2%) de los cnceres respectivamente. En 46 cnceres (42,6%) se detect la expresin del oncogn c-erbB-2 (p185CerbB-2
). En 18 tumores (16,7%) la inmunotincin fue positiva para el EGFR. La expresin de la
enzima citsolica catepsina D se objetiv en 49 casos (45,4%). La determinacin de la glicoprotena P fue realizada en 58 pacientes, demostrndose su positividad en 18 tumores (16,7%). Para el Ki-67, con un valor de corte considerado positivo por encima del 15% de los ncleos teidos, se demostr inmunorreactividad positiva en 46 neoplasias (42,6%), y de igual manera, el PCNA, con un valor de corte superior al 16% de los ncleos teidos, se consider positivo en 49 cnceres (45,4%). (Tabla 4).
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Tabla 4. Distribucin de frecuencia de las tinciones inmunohistoquimicas de los marcadores moleculares de significacin pronostica. Total de casos: 108 Marcador molecular. R. Estrgeno R. Progesterona C-erBb2 Catepsina D F. C. E PS2 P29 P53 Glicoprotena p Valor Marcador de molecular Corte % Ki67 PCNA 15 16 Positivo n= % 71 64 46 49 18 31 78 23 18 65.7 59.3 42.6 45.4 16.7 28.7 72.2 21.3 16.7 Negativo n= % 32 42 52 51 76 69 14 78 40 29.6 38.9 48.1 47.2 70.4 63.9 13.0 72.2 37.0 Ausencias n= % 5 2 10 8 14 8 16 7 50 4.6 1.9 9.3 7.4 13.0 7.4 14.8 6.5 46.3
Inferior a 15% n= % 46 49 42.6 45.4
Superior a15% n= % 46 46 42.6 42.6
Ausencias n= % 16 13 14.8 12.0
Inicialmente recibieron tratamiento adyuvante administrado secuencialmente 95 pacientes (radioterapia 57 casos, quimioterapia 41 casos y tamoxifn 64 casos). Trece enfermas fueron sometidas a vigilancia exclusivamente. En las 41 pacientes tratadas con quimioterapia se emplearon los siguientes esquemas: a) 6 ciclos de CMF en 31, b) 4 ciclos de CMF en 2 (no completaron los 6 ciclos por intolerancia), c) 4 ciclos de AC en 1, d) 6 ciclos de FAC en 5, y e) quimioterapia a altas dosis con transplante autlogo de mdula sea en 2.
De las 16 pacientes sometidas a tumorectoma 13 (81,3%) recibieron radioterapia postoperatoria, 6 (37,5%) quimioterapia adyuvante y 7 (43,8%) tamoxifn. Fueron radiadas 24 (80%) de las 30 pacientes tratadas con cuadrantectoma, a 10 (33,3%) se les administr citotxicos y a 16 (53,3%) tamoxifn. Han sido radiadas 22 (35,5%) de las 62 enfermas mastectomizadas, tratadas con quimioterapia adyuvante 22 (35,5%) y con tamoxifn 42 (67,7%). Con ganglios axilares positivos el 57,7% (n=30) de las pacientes recibi citotxicos y el 67,3% (n=35) hormonoterapia; el tamoxifn se administr posteriormente a la quimioterapia. En las pacientes con ganglios axilares negativos solo el 14,3% (n=8) fueron tratadas con citotxicos y el 53,6% (n=30) con tamoxifn.
Resultados
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Segn el estado hormonal, recibieron quimioterapia adyuvante 13 (61,9%) de las 21 pacientes premenopusicas y 25 (28,7%) de las 87 postmenopusicas. Se les administr tamoxifn a 5 (23,8%) de las premenopusicas y a 60 (69%) de las postmenopusicas. La distribucin del tratamiento adyuvante por estadios objetiva: en el estadio I (n=42) fueron radiadas 23 pacientes (54,8%), recibieron citotxicos 6 (14,3%) y hormonoterapia 21 (50%); en el estadio II (n=46), la radioterapia se administr a 20 (43,5%), quimioterapia a 18 (39,1%) y tratamiento con tamoxifn a 28 (60,9%); y el estadio III (n=20) recibieron radiaciones 16 pacientes (80%), citotxicos 14 (70%) y hormonoterapia 16 (80%). La media de seguimiento ha sido de 49,5 meses (I.C. al 95%: 46,7 - 52,2) completando cada una de las enfermas un seguimiento mnimo de 36 meses. Desde mayo de 1992 a diciembre de 1999 se han contabilizado 19 casos de metstasis (17,6%) y 12 muertes (11,1%). (Tabla 5). De las 19 metstasis, 2 han sido axilares (10,5%) y 17 sistmicas (89,4%). Las metstasis a distancias se ilustran en la Tabla 6.
Tabla 5. Distribucin de las 19 recidivas por mes de aparicin Mes 5 6 10 12 13 18 24 26 30 33 34 36 40 62 84 Total Pacientes 1 1 2 1 1 1 2 1 1 1 1 3 1 1 1 19 Porcentajes 5,3 5,3 10,5 5,3 5,3 5,3 10,5 5,3 5,3 5,3 5,3 15,8 5,3 5,3 5,3 100,0
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Tabla 6. Distribucin de la frecuencia de los 19 casos de metstasis Localizacin anatmica Axila seas Hepticas Pulmonares cerebrales Pleurales N 2 6 10 6 5 2 % 10,5 52,6 31,1 26,3 10,5 5,3
En los 36 meses de seguimiento para cada una de las pacientes, han aparecido metstasis en 16 enfermas, que corresponde al 84,2% de las 19 recidivas y al 14,8% de las recidivas de la serie. La densidad de recidivas equivale a 5,5 /100 enfermas/ao. Han fallecido durante estos 36 meses 8 pacientes (7,4%).
El 43,75% de las recidivas (n=7) se produjeron en tumores clasificados en el estadio III, el 37,5% en el estadio II (n=6) y el 18,75% en el estadio I (n=3). En el caso del estadio III, 3 pacientes desarrollaron metstasis seas exclusivamente (42,9%), 3 enfermas presentaron metstasis seas y hepticas (42,9%) y 1 paciente metstasis hepticas (14,3%). Para el estadio II, se objetivaron metstasis seas en 2 casos (33,3%), pulmonares en 1 caso (16,7%), hepticas en un caso (16,7%), cerebrales y pulmonares simultneamente en 1 caso (16,7%) y axilar en otro caso (16,7%). En el estadio I, 1 enferma present 1 recidiva local (33,3%), 1 desarroll metstasis seas (33,3%) y otra present metstasis seas y pulmonares (33,3%).
El 50% de las muertes correspondi a tumores clasificados en el estadio III (n=4), el 37,5% en pacientes clasificadas en el estadio II (n=3) y el 12,5% en el estadio I (n=1). Las tablas 7 y 8 muestran las recidivas y muertes clasificados por estadios (TNM) respectivamente.
Tabla 7. DISTRIBUCIN DE LAS RECIDIVAS A 36 MESES SEGN ESTADIO TNM. Estadio I II III Total Recidivas 3 6 7 16 Porcentajes 18,75 37,5 43,75 100
Tabla 8. DISTRIBUCIN DE LAS MUERTES A 36 MESES SEGN ESTADIO TNM. Estadio I II III Total Exitus 1 3 4 16 Porcentajes 12.5 37,5 50,0 100
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I-B. ANLISIS DE LA ASOCIACIN ENTRE LOS MARCADORES TUMORALES MOLECULARES Y LOS PARMETROS CLNICOPATOLGICOS.
1-a) Anlisis de la asociacin entre el receptor de estrgeno y los parmetros clnico-patolgicos.
Setenta y un tumores (65,7%) fueron inmunorreactivos positivos para el RE, 32 fueron negativos (29,6%) y en 5 no se realiz la tincin (4,6%).
Segn se aprecia en la tabla 9, el anlisis de la asociacin del RE con los parmetros clnicopatolgicos y con los marcadores tumorales moleculares en esta serie evidenci:
1) Una asociacin estadsticamente significativa entre la inmunotincin positiva para el RE y: a) El tamao de los ganglios axilares negativos. El 61,2% de los cnceres RE+ (n=41) presentaron ganglios con un tamao inferior a los 2 cm (p=0,02). b) La diferenciacin del tumor segn el grado nuclear. Mayor porcentaje de positividad para el RE entre los cnceres GN I y GN II (p=0,0004). c) La diferenciacin tumoral segn el grado histolgico. Mayor proporcin de cnceres RE+ bien diferenciados (p=0,0001). d) El tratamiento hormonal. Han recibido tamoxifn el 67,6% de los tumores RE+ (p=0,02).
2) No se ha encontrado asociacin estadsticamente significativa entre el RE y: estado hormonal, el tipo de tumor, el tamao tumoral, la afectacin ganglionar, el nmero de ganglios positivos, el desbordamiento de la cpsula ganglionar, la estadificacin, la radioterapia, la quimioterapia adyuvante.
1-b) Anlisis de la asociacin entre el receptor de estrgeno y los marcadores tumorales moleculares.
1) En esta serie hemos observado una relacin directa muy significativa entre la inmunotincin positiva para el RE y: a) La inmunoreactividad positiva para el receptor de progesterona. El 74,3% de los cnceres RE+ (n=52) fueron RPg+ (p=0,00001)
Resultados
128
b) La inmunotincin de la protena pS2. En 27 casos (40,9%) la tincin fue positiva para ambos marcadores (p=0,004).
2) Tambin hemos objtetivado una relacin inversa significativa entre el RE y: a) El EFGR. nicamente el 6,7% de los cnceres RE+ (n=4) fueron EFGR+. Se evidenci una mayor proporcin de cnceres RE+EGFR- (p=0,00002). b) El antgeno nuclear de proliferacin celular ki67; as, la presencia del receptor estrognico se correspondi con clulas con bajos porcentajes de nucleos teidos para el ki67. De este modo, el 58,3% de los cnceres RE+ (n=35) fueron ki67- (p=0,008). c) El antgeno nuclear de proliferacin, observando un 59,7% de cnceres (n=37) RE+ PCNA- (p=0,009). d) La protena p53. El 83,3% de los cnceres RE+ (n=55) tenan tincin negativa para la p53 (p=0,03).
3) El 58,7% de los cnceres (n=37) fueron RE+ C-erbB-2 -. La asociacin entre el RE y el CerbB-2 se situ en el lmite de la significacin estadstica (p=0,05).
4) No se encontr asociacin estadsticamente significativa entre la tincin positiva para el RE y: la Hsp27, la catepsina D, y la glicoprotena P.
Resultados
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Tabla 9. Asociacin entre la inmunorreactividad del RE y los parmetros clnicopatolgicos y marcadores tumorales moleculares. Chi cuadrado. Prueba exacta de Fisher.
Parmetros Premenopausia Postmenopausia Tumor nico T. Multicntrico Tamao Tumor < 2 (cm) 25 5 > Ganglios + No N1 N2 N Ganglios + 0 1-3 ms de 4 Tamao Gangl. 1,8 < (cm) 1,8 > Cpsula rota + Grado nuclear I II III Grado histol. I II III Estadificacin I II III Radioterapia + Quimioterapia + Hormonoterapia + RPg + PS2 + Hsp27 + EGFR + C-erbB-2 + Ki67 + PCNA + P53 + Catepsina D + Glicoprotena P + RE + n= % columna 13 13,4 58 81,7 62 87,3 9 12,7 32 45,1 33 46,5 6 8,5 41 57,7 23 32,4 7 9,9 40 56,3 21 29,6 10 14,1 41 61,2 26 38,8 12 16,9 59 83,1 8 11,3 53 74,6 10 14,1 12 16,9 52 73,2 7 9,9 30 42,3 29 40,8 12 16,9 40 53,3 31 43,7 20 28,2 51 71,8 48 67,6 23 32,4 52 74,3 18 25,7 27 40,9 39 59,1 51 87,9 7 12,1 4 6,7 56 93,3 26 41,3 37 58,7 25 41,7 35 58,3 25 40,3 37 59,7 11 16,7 55 83,3 32 48,5 34 51,5 14 36,8 24 63,2 RE N= % columna 7 21,9 25 78,1 30 93,8 2 6,3 13 40,6 16 50,0 3 9,4 13 40,6 12 37,5 7 21,9 14 43,8 10 31,3 8 25,0 11 36,7 19 63,3 7 21,9 25 78,1 1 3,1 15 46,9 16 50,0 2 6,3 15 46,9 15 46,9 10 31,3 16 50,0 6 18,8 16 50,0 16 50,0 14 43,8 18 56,2 14 43,8 18 56,3 9 28,1 23 71,9 4 12,9 27 40,9 25 83,3 5 16,7 14 46,7 16 53,3 19 61,3 12 38,7 20 71,4 8 28,6 20 69,0 9 31,0 11 36,7 19 63,3 17 54,8 14 45,2 4 22,2 14 77,8 Total % Fila 19,4 80,6 89,3 10,7 43,7 47,6 8,7 52,4 34,0 13,6 56,3 29,6 14,1 53,6 46,4 18,4 81,6 8,7 66,0 25,2 13,6 65,0 21,4 38,8 43,7 17,5 54,4 45,6 33,0 67,0 60,2 39,8 59,8 40,2 32,0 68,0 86,4 13,6 20,0 80,0 47,9 52,1 51,1 48,9 49,5 50,5 22,9 77,1 50,5 49,5 32,1 67,9 Ausencias 5 5 5 Valor p= 0,43 0,27 0,91
0,15
5 11 5 5
0,33 0,02 0,36 0,0004
0,0001
5 5 5 5 6 11 20 18 14 20 17 12 11 52
0,56 0,35 0,09 0,02 0,00001 0,004 0,38 0,00002 0,05 0,008 0,009 0,030 0,36 0,22
Resultados
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2-a) Anlisis de la asociacin entre el receptor de progesterona y los parmetros clnico-patolgicos.

Sesenta y cuatro cnceres (59,3%) mostraron positividad para los receptores de progesterona (RPg), cuarenta y dos fueron negativos (38,9%) y en 2 no se realiz la tincin (1,9%). En la tabla 10 se resumen los datos del anlisis de la asociacin de los RPg con los parmetros clnico-patolgicos. Hemos observado que:
1) La inmunotincin positiva para el RPg vari inversamente con el grado de diferenciacin del tumor, segn el grado nuclear e histolgico. Esta asociacin es significativa con el grado nuclear y muy significativa con el grado histolgico. a) EL 4,8% de los cnceres RPg + (n=8) correspondieron a un GN I. Sin embargo, la mayora de estos tumores fueron RPg+ (p=0,02). b) Lo mismo sucede con el grado histolgico. El 18,8% de los cnceres RPg + (n=12) fueron clasificados como un GH I, sin embargo tambin se apreci una mayor proporcin de positividad para el RPg en cnceres bien diferenciados (p=0,005).
2) No se ha observado una asociacin estadsticamente significativa entre el RPg y: el estado hormonal, el tipo de tumor, el tamao tumoral, la afectacin ganglionar axilar, el nmero de ganglios axilares positivos, el tamao de los ganglios afectados, la rotura de la cpsula ganglionar, la estadificacin y el tratamiento adyuvante.
2-b) Anlisis de la asociacin entre el receptor de progesterona y los marcadores tumorales moleculares.
1) En nuestra serie la inmunotincin positiva del RPg se relacion significativamente con la tincin IHQ para la protena pS2. Aunque el 60% de los cnceres RPg + (n=36) fueron pS2 -, se observ una mayor proporcin de tumores pS2+ Rpg+ (p=0,02).
2) Se evidenci una relacin inversa significativa entre la tincin positiva para el RPg y: a) El antgeno nuclear de proliferacin celular ki67. De tal modo que el 61,1% de los cnceres RPg + fueron ki67 negativo (p=0,008). b) El antgeno nuclear de proliferacin PCNA. El 64,3% de las neoplasias con tincin positiva para el RPg (n=30) tuvieron tincin negativa para el PCNA (p=0,002). c) El EGFR, con un 88,9% de neoplasias RPg + (n=48) con inmunorreactividad negativa para el EGFR (p=0,02).
Resultados
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d) La protena p185C-erbB-2. El 60,3% de los tumores RPg + (n=35) fueron p185CerbB-2 - (p=0,048).
3) La presencia del receptor de progesterona en esta serie se relacion con la ausencia de tincin para la protena p53, as el 83,1% de los cnceres PR+ (n=49) carecan de inmunorreactividad para la protena p53. Sin embargo la asociacin no alcanz la significacin estadstica (p=0,06).
4) No se ha demostrado en esta serie una asociacin estadsticamente significativa entre el RPg y la catepsina D, y la glicoprotena P.
Resultados
132
Tabla 10. Asociacin entre la inmunorreactividad del RPg y los parmetros clnicopatolgicos y marcadores tumorales moleculares. Chi cuadrado. Prueba exacta de Fisher.
Parmetros Premenopausia Postmenopausia Tumor nico T. Multicntrico Tamao Tumor 2 < (cm) 25 5 > Ganglios + No N1 N2 N Ganglios + 0 1-3 ms de 4 Tamao Gangl. 1,8 < (cm) 1,8 > Cpsula rota + Grado nuclear I II III Grado histol. I II III Estadificacin I II III Radioterapia + Quimioterapia + Hormonoterapia + PS2 + HSp27 + EGFR + C-erbB-2 + Ki67 + PCNA + P53 + Catepsina D + Glicoprotena P + RPg + n= % columna 14 21,9 50 78,1 56 87,5 8 12,5 31 48,4 26 40,6 7 10,9 35 54,7 21 56,8 8 12,5 36 56,3 16 25,0 12 18,8 33 53,2 29 46,8 11 17,2 53 82,8 8 4,8 45 57,1 11 17,2 12 18,8 44 68,8 8 12,5 28 43,8 24 37,5 12 18,8 34 53,1 30 46,9 22 34,4 42 65,6 42 5,6 22 34,4 24 40,0 36 60,0 43 82,7 9 17,3 6 11,1 48 88,9 23 39,7 35 60,3 21 38,9 33 61,1 20 35,7 36 64,3 10 16,9 49 83,1 32 54,2 27 45,8 15 37,5 25 62,5 RPg n= % columna 6 14,3 36 85,7 39 92,9 3 7,1 15 35,7 24 57,1 3 7,1 19 45,2 16 43,2 7 16,7 18 42,9 17 40,5 7 16,7 19 50,0 19 50,0 9 21,4 33 78,6 2 4,8 24 57,1 2 38,1 2 4,8 25 59,5 15 35,7 12 28,6 22 52,4 8 19,0 23 54,8 19 45,2 15 35,7 27 64,3 22 52,4 20 47,6 7 17,9 32 82,1 34 87,2 5 12,8 12 30,8 27 69,2 23 59,0 16 41,0 24 66,7 12 33,3 25 67,6 12 32,4 13 32,5 27 67,5 17 42,5 23 57,5 3 16,7 15 83,3 Total Ausencias % Fila 18,9 2 81,1 89,6 2 10,4 43,4 2 47,2 9,4 50,9 2 34,9 14,2 50,9 31,1 2 17,9 52,0 8 48,0 18,9 2 81,1 9,4 2 65,1 25,5 13,2 2 65,1 21,7 37,7 2 43,4 18,9 53,8 2 46,2 34,9 2 65,1 60,4 2 39,6 31,3 9 68,7 84,6 17 15,4 19,4 15 80,6 47,4 11 52,6 50,0 18 50,0 51,6 15 48,4 23,2 9 76,8 49,5 9 50,5 31,0 50 69,0 Valor 0,24 0,29 0,25 p=
0,62
0,23 0,46 0,38 0,02
0,005
0,24 0,51 0,52 0,12 0,02 0,38 0,02 0,048 0,008 0,002 0,06 0,17 0,09
Resultados
133
3-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la protena pS2 y los parmetros clnico-patolgicos.
Se demostr la expresin positiva de la protena pS2 en 31 cnceres (28,7%) y la ausencia de expresin en 78 neoplasias (72,2%). En 8 tumores (7,4%) no se realiz la tincin.
La tabla 11 resume los resultados del anlisis de la asociacin de la pS2 con los parmetros clnico-patolgicos que mostr: 1) Una asociacin significativa entre la protena pS2 y el grado de diferenciacin tumoral segn: a) El grado histolgico. La ausencia de tincin IHQ para la pS2 se relacion con cnceres indiferenciados. El 85,5% de los cnceres moderadamente diferenciados e indiferenciados (n=59) presentaron tincin negativa para la pS2 (p=0,04). b) El grado nuclear. El 31,9% de los cnceres con tincin negativa para la pS2 (n=22) fueron clasificados como un grado nuclear III, en comparacin con el 9,7% de tumores con tincin positiva para pS2 (n=3) que fueron clasificados como un grado nuclear I. Se objetiv una mayor proporcin de positividad para pS2 en tumores con grado nuclear I (p=0,04).
2)
Una relacin significativa entre los cnceres pS2 + y el tratamiento radioterpico adyuvante. El 60,9% de los tumores con tincin negativa para pS2 (n=42) recibieron radioterapia (p=0,03).
3)
Una ausencia de asociacin estadsticamente significativa entre la inmunotincin positiva para pS2 y: el estado hormonal, el tipo tumor, el tamao tumoral, el estado ganglionar, el nmero de ganglios axilares positivos, el tamao ganglionar, el desbordamiento de la cpsula ganglionar, la estadificacin, la quimioterapia adyuvante y la hormonoterapia.
3-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la protena pS2 y los marcadores tumorales moleculares.
Los datos del anlisis de la protena pS2 y los marcadores tumorales moleculares se presentan en la tabla 11 y en las tablas 9 y 10. 1) Objetivamos una asociacin positiva significativa entre la expresin de la pS2 y la tincin positiva para catepsina D, de tal modo, que el 69% de los cnceres pS2 + (n=20) fueron catepsina D + (p=0,02).
Resultados
134
2) No se ha encontrado una asociacin estadsticamente significativa entre la expresin de pS2 y la protena Hsp27, el EGFR, la expresin del oncogn C-erbB-2, el antgeno ki67, el antgeno nuclear de proliferacin PCNA, la p53 y la glicoprotena P.
Resultados
135
Tabla 11. Asociacin entre la inmunorreactividad de la pS2 y los parmetros clnicopatolgicos y marcadores tumorales moleculares. Chi cuadrado. Prueba exacta de Fisher.
Parmetros Premenopausia Postmenopausia Tumor nico T. Multicntrico Tamao Tumor 2 < (cm) 25 5 > Ganglios + No N1 N2 N ganglios + 0 1-3 ms de 4 Tamao gangl.1,8 < (cm) 1,8 > Cpsula rota + Grado nuclear I II III Grado histol. I II III Estadificacin I II III Radioterapia + Quimioterapia + Hormonoterapia + HSP27 + EGFR + C-erbB-2 + Ki67 + PCNA + P53 + Catepsina D + Glicoprot. P + PS2 + PS2 Total Ausencias Valor n= % columna N= % columna % Fila 5 26 28 3 13 12 6 19 9 3 19 8 4 20 10 3 28 4 24 3 5 24 2 14 11 6 12 19 9 26 16 14 24 2 3 24 15 13 13 16 14 15 5 24 20 9 7 12 16,1 83,9 90,3 9,7 41,9 38,7 19,4 61,3 29,0 9,7 61,3 29,0 9,7 66,7 33,3 9,7 90,3 12,9 77,4 9,7 16,1 77,4 6,5 45,2 35,5 6,5 38,7 61,3 25,7 74,3 54,8 45,2 92,3 7,7 11,1 88,9 53,6 46,4 44,8 55,2 48,3 51,7 17,2 82,8 69,0 31,0 36,8 63,2 12 57 61 8 30 35 4 32 25 12 32 22 15 29 35 16 53 6 41 22 10 39 20 24 31 14 42 27 26 43 45 24 50 12 15 48 30 34 29 27 29 32 17 48 28 37 10 27 17,4 82,6 88,4 11,6 43,5 50,7 5,8 46,4 36,2 17,4 46,4 31,9 21,7 45,3 54,7 23,2 76,8 8,7 59,4 31,9 14,5 56,5 29,0 34,8 44,9 20,3 60,9 39,1 37,7 62,3 65,2 34,8 80,6 19,4 23,8 76,2 46,9 53,1 51,8 48,2 47,5 52,5 26,2 73,8 43,1 56,9 27,0 73,0 17,0 83,0 89,0 11,0 43,0 47,0 10,0 51,0 34,0 15,0 51,0 30,0 19,0 52,1 47,9 19,0 81,0 10,0 65,0 25,0 15,0 63,0 22,0 38,0 42,0 20,0 54,0 46,0 35,0 65,0 62,0 38,0 84,1 15,9 20,0 80,0 48,9 51,1 49,4 50,6 47,8 52,2 23,4 76,6 51,1 48,9 30,4 69,6 8 8 8 0,56 0,54 0,10 p
0,35
8 14 8 8
0,35 0,20 0,18 0,04
0,04
8 8 8 8 20 18 16 23 18 14 14 52
0,58 0,03 0,27 0,22 0,15 0,14 0,36 0,35 0,56 0,25 0,02 0,32
Resultados
136
4-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la protena Hsp27 y los parmetros clnico-patolgicos.
En 68 cnceres (72,2%) la tincin IHQ fue positiva para la protena Hsp27, en 14 fue negativa (12,9%) y en 16 tumores (14,8%) no se realiz la tincin.
En la Tabla 12 se presentan los datos del anlisis de la asociacin de la protena Hsp27 con los parmetros clnico-patolgicos. En esta serie se objetiva que:
Hemos observado una asociacin directa significativa entre la tincin positiva para la Hsp27 y el grado de diferenciacin tumoral, as, el 92,3% de los cnceres Hsp27+ (n=72) correspondieron a grados histolgicos medios y altos, en comparacin con el 7,7% de Hsp27+ con GH I (p=0,01).
1) En nuestra serie no encontramos una asociacin estadsticamente significativa entre la inmunotincin positiva para la Hsp27 y el estado hormonal, el tipo de tumor, el tamao tumoral, la afectacin ganglionar axilar, el nmero de ganglios axilares positivos, el tamao ganglionar, el desbordamiento de la cpsula ganglionar, el grado nuclear, la estadificacin, el tratamiento radioterpico, la quimioterapia adyuvante y la hormonoterapia.
4-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la protena Hsp27 y los marcadores tumorales moleculares.
Las tablas 9, 10, 11 y 12 expresan los resultados del anlisis de la relacin de la Hsp27 con los marcadores tumorales moleculares.
1) La tincin IHQ positiva para la Hsp27 se relacion directamente y muy significativamente con la tincin positiva para el antgeno nuclear de proliferacin PCNA. El 55,8% de los tumores Hsp27+ (n=43) fueron PCNA+. Se objetiv una mayor proporcin de tumores Hsp27+PCNA+ (Hsp27+ y PCNA+=43/44, 97,7%;Hsp27+ y PCNA-=34/43, 79%; p=0,006).
2) Con el antgeno nuclear de proliferacin ki67 la relacin tambin fue positiva, observando mayor proporcin de tumores Hsp27+ ki67 +, aunque en este caso la asociacin no alcanz la significacin estadstica (p=0,08).
Resultados
137
3) No se ha demostrado una relacin significativa entre la Hsp27 y: el EGFR, la p185C-erbB2, la expresin del oncogn supresor p53, la catepsina D, y la glicoprotena P. Tabla 12. Asociacin entre la inmunorreactividad de la Hsp27 y los parmetros clnicopatolgicos y marcadores tumorales moleculares. Chi cuadrado. Prueba exacta de Fisher.
Parmetros Premenopausia Postmenopausia Tumor nico T. Multicntrico Tamao Tumor 2 < (cm) 25 5 > Ganglios + No N1 N2 N Ganglios 0 1-3 ms de 4 Tamao Gangl.1,8 < (cm) 1,8 > Cpsula rota + Grado nuclear I II III Grado histol. I II III Estadificacin I II III Radioterapia + Quimioterapia + Hormonoterapia + EGFR + C-erbB-2 + Ki67 + PCNA + P53 + Catepsina D + Glicoprotena P + n= 15 63 69 9 33 39 6 38 26 14 38 23 17 40 34 16 62 5 51 22 6 52 20 29 33 16 42 36 30 48 47 31 15 61 39 37 38 34 43 34 21 55 38 35 15 27 Hsp27 + % columna 19,2 80,8 88,5 11,5 42,3 50,0 7,7 48,7 33,3 17,9 48,7 29,5 21,8 4,1 45,9 0,5 79,5 6,4 65,4 28,2 7,7 66,7 25,6 37,2 42,3 20,5 53,8 46,2 8,5 61,5 0,3 39,7 19,7 80,3 51,3 48,7 52,8 47,2 55,8 44,2 27,6 72,4 52,1 47,9 35,7 64,3 n= 1 13 12 2 5 6 3 6 7 1 6 6 2 5 7 2 12 3 6 4 5 6 3 3 8 3 9 5 4 10 10 4 2 8 4 9 2 7 1 9 2 12 6 7 1 7 Hsp27 % columna 7,1 92,9 85,7 14,3 35,7 42,9 21,4 42,9 50,0 7,1 42,9 42,9 14,3 41,7 58,3 14,3 85,7 21,4 50,0 28,6 35,7 42,9 21,4 21,4 57,1 21,4 64,3 35,7 28,6 71,4 71,4 28,6 20,0 80,0 30,8 69,2 22,2 77,8 10,0 90,0 14,3 85,7 46,2 53,8 12,5 87,5 Total % Fila 17,4 82,6 88,0 12,0 41,3 48,9 9,8 47,8 35,9 16,3 47,8 31,5 20,7 52,3 47,7 19,6 80,4 8,7 63,0 28,3 12,0 63,0 25,0 34,8 44,6 20,7 55,4 44,6 37,0 63,0 62,0 38,0 19,8 80,2 48,3 51,7 49,4 50,6 50,6 49,4 25,6 74,4 51,2 48,8 32,0 68,0 Ausencias 16 16 16 Valor p= 0,25 0,53 0,28
16
0,39
16 22 16 16
0,58 0,31 0,45 0,17
16
0,01
16 16 16 16 22 19 27 21 18 22 58
0,48 0,33 0,35 0,32 0,63 0,14 0,08 0,006 0,24 0,46 0,19
Resultados
138
5-a) Anlisis de la asociacin entre el receptor del factor de crecimiento epidrmico y los parmetros clnico-patolgicos.
En 18 cnceres (16,7%) la tincin IHQ fue positiva para el EGFR, en 76 fue negativa (70,4%) y no se realiz en 14 (13,0%).
En la tabla 13 se resumen los resultados del anlisis del grado de asociacin entre el EGFR y los parmetros clnico-patolgicos. Este anlisis objetiv:
1)
Una asociacin muy significativa entre la deteccin IHQ positiva del EGFR y el grado de diferenciacin tumoral, observando: a) Una importante proporcin de cnceres indiferenciados (GN III) EGFR+. El 66,7% de los tumores EGFR+ (n=12) fueron catalogados como un grado nuclear III (p=0,0001). b) El 61,1% de los cnceres EGFR+ (n=11) haban sido clasificados con un grado histolgico III (p=0,0003).
2)
Una ausencia de asociacin estadsticamente significativa entre el EGFR y: el estado hormonal, el tipo de tumor, el tamao tumoral, la afectacin ganglionar, el nmero de ganglios axilares positivos, el tamao ganglionar, la rotura de la cpsula ganglionar, la estadificacin, la radioterapia, la quimioterapia y la hormonoterapia.
5-b) Anlisis de la asociacin entre el receptor del factor de crecimiento epidrmico y los marcadores tumorales moleculares.
Los resultados se presentan en la tabla 13 y las tablas 9 12.
1) El 66,7% de los cnceres (n=12) tieron positivamente para el EGFR y la p185C-erbB-2. Sin embargo, la asociacin no alcanz la significacin estadstica (p=0,07).
2) En esta serie no objetivamos una relacin estadsticamente significativa entre el EGFR y: el antgeno nuclear de proliferacin celular ki67, el antgeno nuclear de proliferacin PCNA y la catepsina D.
Resultados
139
Tabla 13. Asociacin entre la inmunorreactividad del EGFR y los parmetros clnicopatolgicos y marcadores tumorales moleculares. Chi cuadrado. Prueba exacta de Fisher.
Parmetros Premenopausia Postmenopausia Tumor nico T. Multicntrico Tamao Tumor 2 < (cm) 2 5 5 > Ganglios + No N1 N2 N Ganglios + 0 1-3 ms de 4 Tamao Gangl.1,8 < (cm) 1,8 > Cpsula rota + Grado nuclear I II III Grado histol. I II III Estadificacin I II III Radioterapia + Quimioterapia + Hormonoterapia + C-erbB-2 + Ki67 + PCNA + p53 + Catepsina D + Glicoprot. P + n= 3 15 17 1 8 10 7 7 4 7 6 5 7 9 3 15 6 12 1 6 11 6 9 3 6 12 6 12 12 6 12 6 10 6 11 7 7 11 10 8 2 7 EGFR + % columna 16,7 83,3 94,4 5,6 44,4 55,6 38,9 38,9 22,2 38,9 33,3 27,8 43,8 56,3 16,7 83,3 33,3 66,7 5,6 33,3 61,1 33,3 50,0 16,7 33,3 66,7 33,3 66,7 6,7 33,3 66,7 33,3 62,5 37,5 61,1 38,9 38,9 61,1 55,6 44,4 22,2 77,8 n= 13 63 68 8 31 35 10 39 26 11 39 24 13 39 34 14 62 7 55 14 9 55 12 28 32 16 43 33 28 48 6 30 32 40 32 34 33 38 16 55 33 37 14 32 EGFR % columna 17,1 82,9 89,5 10,5 40,8 46,1 13,2 51,3 34,2 14,5 51,3 31,6 17,1 53,4 46,6 18,4 81,6 9,2 72,4 18,4 11,8 72,4 15,8 36,8 42,1 21,1 56,6 43,4 36,8 63,2 59,2 40,8 44,4 55,6 48,5 51,5 46,5 53,5 22,5 77,5 47,1 52,9 30,4 69,6 Total % Fila 17,0 83,0 90,4 9,6 41,5 47,9 10,6 48,9 35,1 16,0 48,9 31,9 19,1 51,7 48,3 18,9 81,9 7,4 64,9 27,7 10,6 64,9 24,5 36,2 43,6 20,2 52,1 47,9 36,2 63,8 60,6 39,4 48,9 51,1 51,2 48,8 49,4 50,6 25,8 74,2 48,9 51,1 29,1 70,9 Ausencias 14 14 14 Valor p= 0,63 0,45 0,26
14
0,58
14 19 14 14
0,51 0,34 0,58 0,0001
14
0,0003
14 14 14 15 18 26 19 19 20 53
0,82 0,06 0,50 0,38 0,07 0,23 0,19 0,13 0,35 0,48
Resultados
140
6-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin del oncogen C-erbB-2 (p185C-erbB-2) y los parmetros clnico-patolgicos.
La determinacin IHQ de la protena p185C-erbB-2, producto del oncogn C-erbB-2, fue positiva en 46 tumores (42,6%), en 52 la tincin fue negativa (48,1%) y en 10 no se realiz (9,3%). Los datos se presentan en la tabla 14. El anlisis de la asociacin entre la p185C-erbB-2 y los parmetros clnico-patolgicos evidenci que: 1) Un 58,7% de pacientes con p185C-erbB-2+ (n=27) no fueron radiadas. Esta asociacin es significativa (p=0,04).
2)
No se observ una asociacin estadsticamente significativa entre el C-erbB-2 y: el estado hormonal, el tamao tumoral, el estado nodal, el nmero de ganglios afectados, el desbordamiento de la cpsula ganglionar, el grado histolgico, el tipo de tumor, el grado nuclear, el recibir quimioterapia y la administracin de tamoxifn.
6-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin del oncogen C-erbB-2 (p185C-erbB-2) y los marcadores tumorales moleculares.
Los datos se resumen en la tabla 14 y las tablas 9 13. 1) Hemos observado una relacin directa entre la expresin de p185C-erbB-2 y la tincin positiva del antgeno nuclear Ki67, as, el 60% de los cnceres p185C-erbB-2+ (n=24) fueron ki67+. Sin embargo, la asociacin se situ en el lmite de la significacin estadstica (p=0,05).
2) Tambin se objetiv una relacin positiva, sin alcanzar la significacin estadstica prefijada en el diseo, entre la inmunotincin positiva para la p185C-erbB-2 y los tumores PCNA+, de tal modo, que el 58,1% de los cnceres (n=25) mostraron inmunorreactividad positiva para ambos marcadores (p=0,08).
3) Careci de significacin estadstica la relacin entre C-erbB-2 y: la p53, la catepsina D y la glicoprotena P.
Resultados
141
Tabla 14. Asociacin entre la inmunorreactividad del C-erbB-2 y los parmetros clnicopatolgicos y marcadores tumorales moleculares. Chi cuadrado. Prueba exacta de Fisher.
Parmetros Premenopausia Postmenopausia Tumor nico T. Multicntrico Tamao Tumor 2 < (cm) 25 5 > Ganglios + No N1 N2 N Ganglios + 0 1-3 ms de 4 Tamao Gangl.1,8 < (cm) 1,8 > Cpsula rota + Grado nuclear I II III Grado Histol. I II III Estadificacin I II III Radioterapia + Quimioterapia + Hormonoterapia + Ki67 + PCNA + P53 + Catepsina D + Glicoprot. P + n= 7 39 41 5 15 24 7 25 13 8 25 11 10 28 16 11 35 5 26 15 6 26 14 18 20 8 19 27 19 27 26 20 24 16 25 18 11 33 23 20 8 17 C-erbB-2 + % columna 15,2 84,8 89,1 10,9 32,6 52,2 15,2 54,3 28,3 17,4 54,3 23,9 21,7 3,6 36,4 3,9 76,1 10,9 56,5 32,6 13,0 56,5 30,4 39,1 43,5 17,4 41,3 58,7 1,3 58,7 56,5 43,5 60,0 40,0 58,1 41,9 25,0 75,0 53,5 46,5 32,0 68,0 n= 10 42 47 5 27 22 3 24 22 6 24 20 8 21 28 7 44 4 36 12 7 37 8 19 23 10 32 20 16 36 32 19 18 27 19 27 12 38 22 27 8 22 C-erbB-2 % columna 19,2 80,8 90,4 9,6 51,9 42,3 5,8 46,2 42,3 11,5 46,2 38,5 15,4 42,9 57,1 15,4 84,6 7,7 69,2 23,1 13,5 71,2 15,4 36,5 44,2 19,2 61,5 38,5 30,8 69,2 63,5 36,5 40,0 60,0 41,3 58,7 24,0 76,0 44,9 55,1 26,7 73,3 % Total Fila 17,3 82,7 89,8 10,2 42,9 46,9 10,2 50,0 35,7 14,3 50,0 31,6 18,4 52,7 47,3 19,4 80,6 9,2 63,3 27,6 13,3 64,3 22,4 37,8 43,9 18,4 52,0 48,0 35,7 64,3 60,2 39,8 49,4 50,6 49,4 50,6 24,5 75,5 48,9 51,1 29,1 70,9 Ausencias 10 10 10 Valor p= 0,40 0,55 0,09
10
0,32
10 15 10 10
0,29 0,03 0,21 0,43
10
0,19
10 10 10 10 23 19 14 16 53
0,95 0,03 0,19 0,31 0,05 0,08 0,55 0,27 0,44
7-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin del antgeno nuclear de proliferacin clular ki 67 y los parmetros clnico-patolgicos.
Para el antgeno nuclear de proliferacin celular Ki67 se utiliz un valor de corte correspondiente a una tincin positiva de mas del 15% de los ncleos teidos, as 46 tumores
Resultados
142
(42,6%) fueron positivos, 46 negativos (42,6%) y en 16 tumores no se realiz la tincin (14,8%). En la tabla 15 se resumen todos los datos del anlisis de la asociacin del ki67 con los parmetros clnico-patolgicos. Este demuestra:
1)
Una asociacin muy significativa entre la inmunorreactividad positiva para el ki67 y la diferenciacin tumoral segn: a) El grado nuclear. El 97,8% de los tumores ki67+ (n=45) correspondieron a tumores con grado nuclear II y III. Se observa una mayor proporcin de tumores ki67 + indiferenciados (p=0,0007). b) El grado histolgico. El 93,4% de los cnceres ki67+ (n=43) se distribuan en grados histolgicos medios y altos, de estos el 39,1% (n=18) correspondan a un grado histolgico III (p=0,0004).
2)
Una ausencia de significacin estadstica entre el ki67 y: el estado hormonal, el tipo de tumor, el tamao tumoral, el estado nodal, el nmero de ganglios, el tamao ganglionar, el desbordamiento de la cpsula ganglionar, la estadificacin, la radioterapia, la administracin de citostticos y tamoxifn.
7-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin del antgeno nuclear de proliferacin celular ki67 y los marcadores tumorales moleculares.
Los resultados se presentan en la tabla 15 y en las tablas 9 14.
1) En esta serie hemos observado una asociacin fuertemente significativa entre los antgenos nucleares de proliferacin celular ki67 y PCNA. El 81% de los cnceres con tincin positiva para el ki67 (n=34) fueron inmunorreactivos positivos para el PCNA (p=0,0000),
2) Se objetiv una relacin positiva significativa entre los tumores ki67+ y la protena p53. El 63,6% de los cnceres con inmunotincin positiva para ki67 (n=28) mostraron ausencia de tincin para la protena p53, sin embargo, se objetiv una mayor proporcin de cnceres ki67+p53+ (p=0,01),
3) En esta serie no hemos evidenciado una asociacin estadsticamente significativa entre los tumores ki67+ y la catepsina D, y la glicoprotena P.
Resultados
143
Tabla 15. Asociacin entre la inmunorreactividad del Ki-67 y los parmetros clnicopatolgicos y los marcadores tumorales moleculares. Chi cuadrado. Prueba exacta de Fisher.
Parmetros Premenopausia Postmenopausia Tumor nico T. Multicntrico Tamao tumor 2 < (cm) 25 5 > Ganglios + No N1 N2 N Ganglios + 0 1-3 ms de 4 Tamao Gangl.1,8 < (cm) 1,8 > Cpsula rota + Grado nuclear I II III Grado Histol. I II III Estadificacin I II III Radioterapia + Quimioterapia + Hormonoterapia + PCNA + P53 + Catepsina D + Glicoprot. P + n= 10 36 41 5 15 27 4 22 16 8 22 14 10 19 25 10 36 1 27 18 3 25 18 14 22 10 20 25 21 25 24 22 34 8 16 28 22 21 6 17 Ki67 + % columna 21,7 78,3 89,1 10,9 32,6 58,7 8,7 47,8 34,8 17,4 47,8 30,4 21,7 43,2 56,8 21,7 78,3 2,2 58,7 39,1 6,5 54,3 39,1 30,4 47,8 21,7 5,7 54,3 5,7 54,3 2,2 47,8 81,0 19,0 36,4 63,6 51,2 48,8 26,1 73,9 n= 9 37 41 5 25 17 4 26 14 6 25 14 7 28 19 7 39 7 35 4 10 33 3 22 17 7 28 18 13 33 28 18 11 32 6 37 21 22 12 15 Ki67 % columna 39,1 80,4 89,1 10,9 54,3 37,0 8,7 56,5 30,4 13,0 54,3 30,4 15,2 55,8 44,2 15,2 84,8 15,2 76,1 8,7 21,7 71,7 6,5 47,8 37,0 15,2 60,9 39,1 28,3 71,7 60,9 39,1 74,4 25,6 14,0 86,0 48,8 51,2 44,4 55,6 Total % Fila 20,7 79,3 89,1 10,9 43,5 47,8 8,7 52,2 32,6 15,2 51,1 30,4 18,5 49,4 50,6 18,5 81,5 8,7 67,4 23,9 14,1 63,0 22,8 39,1 42,4 18,5 53,3 46,7 37,0 63,0 56,5 43,5 52,9 47,1 25,3 74,7 50,0 50,0 36,0 64,0 Ausencias 16 16 16 Valor p= 0,50 0,63 0,09
16
0,69
16 21 16 16
0,69 0,17 0,29 0,0007
16
0,0004
16 16 16 16 23 21 22 58
0,23 0,10 0,06 0,26 0,0000 0,01 0,50 0,15
8-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin del antgeno nuclear de proliferacin PCNA y los parmetros clnico-patolgicos.
Se utiliz como dintel de positividad para el PCNA la tincin positiva superior al 16% de los ncleos teidos, de este modo, 49 tumores (45,4%) fueron considerados PCNA positivos y 46 PCNA negativos (42,6%). En 13 casos (12%) no se realiz la tincin IHQ.
Resultados
144
Segn se expresa en la tabla 16 donde se resumen los datos, el anlisis de la asociacin entre el PCNA y los parmetros clnico-patolgicos revel:
1)
Una relacin inversa significativa entre la tincin IHQ positiva del antgeno nuclear (PCNA) y la diferenciacin tumoral medida segn: a) El grado nuclear. El 97,9% de los cnceres PCNA+ (n=45) correspondieron a grados nucleares medios y altos. De estos, el 37% (n=17) correspondieron a cnceres indiferenciados (p=0,009). b) El grado histolgico, correspondindose tambin con cnceres moderadamente y mal diferenciados. El 32,6% de los cnceres PCNA+ (n=15) fueron clasificados con un grado histolgico III (p=0,002),
2)
Una ausencia de asociacin estadsticamente significativa entre el PCNA y: el estado hormonal, el tipo de tumor, el tamao tumoral, el estado ganglionar, el nmero de ganglios afectados, el tamao ganglionar, la rotura de la cpsula ganglionar, la estadificacin, recibir radioterapia, la administracin de citotxicos y tamoxifn.
8-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin del antgeno nuclear de proliferacin PCNA y los marcadores tumorales moleculares.
Los datos estn representados en la tabla 16 y las tablas 9 15.
1) Se observ una asociacin muy significativa entre los tumores con inmunorreactividad positiva para el antgeno nuclear PCNA y tincin positiva para la protena p53. Aunque el 61,4% de los cnceres PCNA+ (n=27) fueron p53-, se evidencia una mayor proporcin de tumores PCNA+p53+ p=0,002).
2) No objetivamos una asociacin estadsticamente significativa entre los tumores PCNA+ y la catepsina D y la glicoprotena P.
Resultados
145
Tabla 16. Asociacin entre la inmunorreactividad de la PCNA y los parmetros clnicopatolgicos y los marcadores tumorales moleculares. Chi cuadrado. Prueba exacta de Fisher.
Parmetros Premenopausia Postmenopausia Tumor Unico T. Multicntrico Tamao tumor 2 < (cm) 25 5 > Ganglios + No N1 N2 N Ganglios + 0 1-3 ms de 4 Tamao Gangl. 1,8 < (cm) 1,8 > Cpsula rota + Grado nuclear I II III Grado Histol. I II III Estadificacin I II III Radioterapia + Quimioterapia + Hormonoterapia + p53 + Catepsina D + Glicoprot. P + n= 10 36 41 5 18 25 3 22 15 9 22 13 11 21 22 10 36 1 28 17 1 30 15 15 21 10 21 25 19 27 24 22 17 27 23 21 10 15 PCNA + % columna 21,7 78,3 89,1 10,9 39,1 54,3 6,5 47,8 28,3 23,9 47,8 28,3 23,9 48,8 51,2 21,7 78,3 2,2 60,9 37,0 2,2 65,2 32,6 32,6 45,7 21,7 45,7 54,3 41,3 58,3 52,2 47,8 38,6 61,4 52,3 47,7 40,0 60,0 n= 7 42 43 6 23 20 6 26 17 6 25 16 8 26 21 7 42 7 35 7 11 32 6 20 21 8 30 19 14 35 34 15 5 40 22 23 8 21 PCNA Total Ausencias Valor p= % columna % Fila 14,3 17,9 13 0,25 85,7 82,1 87,2 88,4 13 0,54 12,2 11,6 46,9 43,2 13 0,35 40,8 47,4 12,2 9,5 53,1 50,5 13 0,62 34,7 33,7 12,2 15,8 51,0 49,5 13 0,64 32,7 30,5 16,3 20,0 55,3 52,2 18 0,34 44,7 47,8 14,3 17,9 13 0,25 85,7 82,1 14,3 8,4 0,009 13 71,4 66,3 14,3 25,3 22,4 12,6 0,002 13 65,3 65,3 12,2 22,1 40,8 36,8 13 0,67 42,9 44,2 16,3 18,9 61,2 53,7 13 0,09 38,8 46,3 28,6 34,7 13 0,14 71,4 65,3 69,4 61,1 13 0,06 30,6 38,9 11,1 24,7 0,002 19 88,9 75,3 51,1 50,6 19 0,46 48,9 49,4 27,6 33,3 54 0,25 72,4 66,7
9-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin del oncogen supresor (p53) y los parmetros clnico-patolgicos.
En 23 tumores (21,3%) se detect la protena producto del oncogn supresor p53, en 78 tumores (72,2%) la tincin fue negativa y en 7 no se efectu (6,5%) la determinacin.
Los datos relacionados con el anlisis del grado de asociacin entre la p53 y los parmetros clnico-patolgicos estn representados en la tabla 17. Esta comparacin mostr:
Resultados
146
1) Una asociacin muy significativa entre la expresin positiva del oncogn supresor p53 y el grado de diferenciacin tumoral, as se observ una mayor proporcin de cnceres p53+ con: a) El grado nuclear III. El 56,5% de cnceres p53+ (n=13) correspondieron a un GN III (p=0,0006). b) Un alto grado histolgico. Tambin un 56,5% de los cnceres p53+ (n=13) fueron clasificados en un grado histolgico III (p=0,00006).
2) Una ausencia de asociacin estadsticamente significativa ente la p53 y: ninguno de los otros parmetros clnico-patolgicos.
9-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin del oncogn supresor (p53) y los marcadores tumorales moleculares.
Los datos del anlisis del grado de asociacin de la protena p53 con los marcadores tumorales moleculares se resumen en las tablas 17 y las tablas 9 16.
No hemos observado una asociacin estadsticamente significativa entre la p53 y: la catepsina D y glicoprotena P.
Resultados
147
Tabla 17. Asociacin entre la inmunorreactividad de la p53 y los parmetros clnicopatolgicos y marcadores tumorales moleculares. Chi cuadrado. Prueba exacta de Fisher.
Parmetros Premenopausia Postmenopausia Tumor Unico T. Multicntrico Tamao Tumor 2 < (cm) 25 5 > Ganglios + No N1 N2 N Ganglios + 0 1-3 ms de 4 Tamao Gangl.1,8 < (cm) 1,8 > Cpsula rota + Grado nuclear I II III Grado Histol. I II III Estadificacin I II III Radioterapia + Quimioterapia + Hormonoterapia + Catepsina D + Glicoprot. P + n= 5 18 22 1 8 12 3 12 5 6 12 5 6 9 12 4 19 10 13 1 9 13 6 10 7 12 11 9 14 14 9 12 10 4 10 p53 + % columna 21,7 78,3 95,7 4,3 34,8 52,2 13,0 52,2 21,7 26,1 2,2 21,7 26,1 42,9 57,1 17,4 82,6 43,5 56,5 4,3 39,1 56,5 26,1 43,5 30,4 52,2 47,8 39,1 60,9 60,9 39,1 54,5 45,5 28,6 71,4 n= 15 63 68 10 38 34 6 39 30 9 39 26 13 41 33 15 63 9 55 14 13 55 10 34 31 13 42 36 28 50 45 33 33 38 12 27 p53 Total Ausencias Valor p= % columna % Fila 19,2 19,8 7 0,49 80,8 80,2 87,2 89,1 7 0,23 12,8 10,9 50,0 50,5 7 0,44 38,5 34,7 11,5 14,9 50,0 50,5 7 0,14 38,5 34,7 11,5 14,9 50,0 50,5 33,3 30,7 7 0,44 16,7 18,8 55,4 52,6 13 0,22 44,6 47,4 19,2 18,8 7 0,55 80,8 81,2 11,5 8,9 0,0006 7 70,5 64,4 17,9 26,7 16,7 13,9 0,00006 7 70,5 63,4 12,8 22,8 43,6 39,6 7 0,21 39,7 40,6 16,7 19,8 53,8 53,5 7 0,53 46,2 46,5 35,9 36,6 7 0,48 64,1 63,4 57,5 58,4 7 0,49 42,3 41,6 46,5 48,4 15 0,34 53,5 51,6 30,8 30,2 55 0,58 69,2 69,8
10-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin de Catepsina D y los parmetros clnico-patolgicos.

La presencia de la proteasa citoslica catepsina D fue detectada en 45 de los cnceres (45,4%), en 51 no se detect (47,2%) y en 8 no se pudo determinar (7,4%).
El anlisis de la relacin de esta proteasa con los parmetros clnico-patolgicos expresado en la tabla 18 reflej: 1) Una asociacin significativa entre la falta de tincin positiva para la catepsina D y haber recibido tratamiento hormonal. Al 70,6% de los cnceres catepsina D- (n=36) se les administr tamoxifn (p=0,04).
Resultados
148
2) Una falta de relacin estadsticamente significativa entre la catepsina D y el resto de los parmetros clnico-patolgicos.
10-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin de Catepsina D y los marcadores tumorales moleculares.
En las tablas 9 a 17 se representan los resultados del anlisis del grado de asociacin entre la catepsina D y los marcadores tumorales moleculares. 1) Hemos observado una relacin directa entre la tincin positiva de catepsina D y la tincin positiva de glicoprotena P. Esta asociacin se aproxim a la significacin estadstica (p=0,06). Tabla 18. Asociacin entre la inmunorreactividad de la catepsina D y los parmetros clnico-patolgicos y la glicoprotena P. Chi cuadrado. Prueba exacta de Fisher.
Parmetros Premenopausia Postmenopausia Tumor nico T. Multicntrico Tamao tumor 2 < (cm) 25 5 > Ganglios + No N1 N2 N Ganglios + 0 1-3 ms de 4 Tamao Gangl. 1,8 < (cm) 1,8 > Cpsula rota + Grado nuclear I II III Grado Histol. I II III Estadificacin I II III Radioterapia + Quimioterapia + Hormonoterapia + Glicoprotena P + Catepsina D + n= % columna 8 16,3 41 83,7 41 83,7 8 16,3 25 51,0 20 40,8 4 8,2 28 57,1 17 34,7 4 8,2 29 59,2 13 26,5 7 14,3 26 54,2 22 45,8 7 14,3 42 85,7 11 22,4 34 69,4 4 8,2 6 12,2 32 65,3 11 22,4 21 42,9 22 44,9 6 12,2 29 59,2 20 40,8 15 30,6 34 69,4 25 51,0 24 49,0 12 16 42,9 57,1 Catepsina D Total Ausencias Valor p= n= % columna % Fila 11 21,6 19,0 8 0,34 40 78,4 81,0 48 94,1 89,0 8 0,08 3 5,9 11,0 20 39,2 45,0 8 0,49 26 51,0 46,0 5 9,8 9,0 24 47,1 52,0 8 0,17 16 31,4 33,0 11 21,6 15,0 23 45,1 52,0 8 0,32 16 31,4 29,0 12 23,5 19,0 20 43,5 48,9 14 0,20 26 56,5 51,1 12 23,5 19,0 0 0,18 39 76,5 81,0 15 29,4 26,0 8 0,73 32 62,7 66,0 4 7,8 8,0 6 11,8 12,0 8 0,99 33 64,7 65,0 12 23,5 23,0 17 33,3 38,0 8 0,22 21 41,2 43,0 13 25,5 19,0 28 54,9 57,0 8 0,41 23 45,1 43,0 21 41,2 36,0 8 0,19 30 58,8 64,0 36 70,6 61,0 0,03 8 15 29,4 31,0 6 23 20,7 79,3 31,6 68,4 51 0,06
Resultados
149
11-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la Glicoprotena P y los parmetros clnico-patolgicos.

La determinacin de glicoprotena P se realiz en 58 tumores, objetivando una tincin positiva en 19 casos (16,7%) y negativa en 40 casos (37%).
En la tabla 18 estn expresados los resultados del anlisis de la asociacin entre la glicoprotena P y los parmetros clnico-patolgicos. Este anlisis mostr una:
1) Asociacin significativa entre la tincin positiva para la Glicoprotena P y tamao tumoral, as, un 66,7% de los cnceres glicoprotena P+ (n=12) medan menos de 2 cm (p=0,02).
2) Ausencia de asociacin significativa entre la glicoprotena P y el resto de los marcadores tumorales moleculares.
11-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la Glicoprotena P y los marcadores moleculares tumorales.
Los datos se presentan en la tabla 19. El grado de asociacin con los marcadores tumorales moleculares se comenta en los apartados anteriores y en las tablas 9 18 y 20 y 21.
Resultados
150
Tabla 19. Asociacin entre la inmunorreactividad de la glicoprotena P y los parmetros clnico-patolgicos. Chi cuadrado. Prueba exacta de Fisher.
Parmetros Premenopausia Postmenopausia Tumor nico T. Multicntrico Tamao Tumor 2 < (cm) 25 5 > Ganglios + No N1 N2 N de Ganglios + 0 1-3 ms de 4 Tamao Gangl. 1,8 < (cm) 1,8 > Cpsula rota + Grado nuclear I II III Grado Histol. I II III Estadificacin I II III Radioterapia + Quimioterapia + Hormonoterapia + Glicopr. P + n= % columna 8 41 16 2 12 5 1 12 4 2 12 4 2 12 6 1 17 2 11 5 2 12 4 11 4 3 12 6 5 13 9 9 16,3 83,7 88,9 11,1 66,7 27,8 5,6 66,7 22,2 11,1 66,7 22,2 11,1 66,7 33,3 5,6 94,4 11,1 61,1 27,8 11,1 66,7 22,2 61,1 22,2 16,7 66,7 33,3 27,8 72,2 50,0 50,0 Glicopr. P n= % columna 11 40 36 4 11 22 7 20 14 6 20 13 7 18 19 8 32 3 27 10 6 26 8 12 19 9 20 20 17 23 22 18 21,6 78,4 90,0 10,0 27,5 55,0 17,5 50,0 35,0 15,0 50,0 32,5 17,5 48,5 51,4 20,0 80,0 7,5 67,5 25,0 15,0 65,0 20,0 30,0 47,5 22,5 50,0 50,0 42,5 57,5 55,0 45,0 % Total Fila 19,0 81,0 89,7 10,3 39,7 46,6 13,8 52,2 31,0 13,8 52,2 29,3 15,5 54,5 45,5 15,5 84,5 8,6 65,5 25,9 13,8 65,5 20,7 39,7 39,7 20,6 55,2 44,8 37,9 62,1 53,4 46,4 Ausencias 50 50 50 Valor p= 0,34 0,61 0,02
50
0,49
50 53 50 50
0,49 0,16 0,15 0,86
50
0,92
50 50 50 50
0,07 0,18 0,22 0,47
TABLA 20. GRADO DE ASOCIACIN ENTRE LOS PARMETROS CLNICO-PATOLGICOS Y LOS MARCADORES TUMORALES MOLECULARES.
Marcador/valor p= Estado hormonal Tipo de tumor Tamao tumoral Estadio Nodal Nmero de ganglios Tamao ganglionar Rotura capsular Grado nuclear Grado histologico Estadificacin Radioterapia Quimioterapia Hormonoterapia
RE 0,43 0,27 0,91 0,15 0,33 0,02 0,36 0,0004 0,0001 0,56 0,35 0,09 0,02
RPg 0,24 0,29 0,25 0,62 0,23 0,46 0,38 0,02 0,005 0,24 0,51 0,52 0,12
pS2 0,56 0,54 0,10 0,35 0,35 0,20 0,18 0,04 0,04 0,58 0,03 0,27 0,22
Hsp27 0,25 0,53 0,28 0,39 0,58 0,31 0,45 0,17 0,01 0,48 0,33 0,35 0,32
EGFR 0,63 0,45 0,26 0,58 0,51 0,34 0,58 0,0001 0,0003 0,82 0,06 0,50 0,38
C-erbB-2 0,40 0,55 0,09 0,32 0,29 0,03 0,21 0,43 0,19 0,95 0,03 0,19 0,31
Ki-67 0,50 0,63 0,09 0,69 0,69 0,17 0,29 0,0007 0,0004 0,23 0,10 0,06 0,26
PCNA 0,25 0,54 0,35 0,62 0,64 0,34 0,25 0,009 0,002 0,67 0,09 0,14 0,06
p53 0,49 0,23 0,44 0,14 0,44 0,22 0,55 0,0006 0,00006 0,21 0,53 0,48 0,49
Catep. D 0,34 0,08 0,49 0,17 0,32 0,20 0,18 0,73 0,99 0,22 0,41 0,19 0,03
Glic. P 0,34 0,61 0,02 0,49 0,49 0,16 0,15 0,86 0,92 0,07 0,18 0,22 0,47
TABLA 21. GRADO DE ASOCIACIN ENTRE LOS MARCADORES TUMORALES MOLECULARES.
Marcador/valor p= RE RPg pS2 Hsp27 EGFR C-erbB-2 Ki-67 PCNA P53 Catepsina D Glicoprotena P
RE
RPg
pS2
Hsp27
EGFR
C-erbB-2
Ki-67
PCNA
p53
Catep. D
0,00001 0,004 0,38 0,00002 0,05 0,008 0,009 0,03 0,36 0,22 0,02 0,38 0,02 0,05 0,008 0,002 0,06 0,17 0,09 0,15 0,14 0,36 0,35 0,56 0,25 0,02 0,32 0,63 0,14 0,08 0,006 0,24 0,46 0.19 0,07 0,23 0,19 0,13 0,35 0,48 0,05 0,08 0,55 0,27 0,44 0,0000 0,01 0,50 0,15 0,002 0,46 0,25 0,34 0,58 0,06
Resultados
153
I-C. ANLISIS DE LOS TUMORES QUE DESARROLLARON METSTASIS DURANTE LOS 36 MESES DE SEGUIMIENTO.
1-a) Anlisis de la asociacin entre los parmetros clnico-patolgicos y las recidivas precoces.
Durante los 36 meses posteriores al tratamiento quirrgico aparecieron metstasis en 16 pacientes (14,8%). En la tabla 22a y 22b se representan los datos del anlisis del grado de asociacin y del riesgo relativo de recidiva a 36 meses con relacin a los parmetros clnicopatolgicos. Esta comparacin mostr: 1) Una relacin directa entre el desarrollo de metstasis y la afectacin ganglionar axilar. Diez de las pacientes (62,5%) que recidivaron presentaban cnceres con positividad de los ganglios axilares. Esta asociacin no alcanz la significacin fijada en el diseo (p=0,08). 2) Las recidivas tambin se relacionaron con el nmero de ganglios axilares. En seis de las enfermas (37,5%) que desarrollaron metstasis se haban contabilizado previamente 4 o ms ganglios axilares infiltrados por tumor. La asociacin tambin es directa sin alcanzar la significacin estadstica (p=0,07). 3) Se observ una asociacin entre los tumores que desarrollaron enfermedad metastsica y el desbordamiento de la cpsula de la cpsula ganglionar. El 62,5% de los casos que recidivaron (n=10) tuvieron ganglios axilares positivos con su cpsula intacta. Sin embargo, si examinamos la tabla 22a apreciamos una mayor proporcin de recidivas en los cnceres cuyos ganglios presentaron rotura de la cpsula ganglionar (recidivas/cpsula rota: 6/20, vs recidiva/cpsula intacta: 10/88, 11,4%; p= 0,04). 4) Siete de las recidivas (43,8%) correspondieron a pacientes clasificados en un estadio III (p=0,01). 5) El 75% de las metstasis (n=12) se produjeron en pacientes con cnceres nicos, sin embargo, hay una mayor proporcin de recidivas en el grupo de cnceres mlticntricos (4/11, 36,4%) en comparacin con los nicos (12/97, 12,4%), (p=0,05). 6) En esta serie no se objetiv una asociacin estadsticamente significativa entre las recidivas y: a) El tamao tumoral, aunque en el 68,8% de los casos que desarrollaron metstasis (n=11), los cnceres medan ms de 2 cm. b) El tamao ganglionar. En el 61,5% (n=8) de los cnceres con ganglios axilares positivos sus adenopatas medan menos de 2 cm de dimetro. c) El grado nuclear. No recidiv ningn cncer de grado nuclear I; en cambio el 31,2% de las recidivas (n=5) se produjeron en cnceres de grado nuclear III.
Resultados
154
d) El grado histolgico, producindose el 87,5% de recidivas (n=14) en cnceres con grados histolgicos medios y altos. e) El estado hormonal. El 81,3% de las enfermas que desarrollaron enfermedad metastsica (n=13) correspondieron a pacientes postmenopusicas. f) Radioterapia. Haban sido radiadas ms de la mitad (56,2%) de las pacientes que recidivaron. g) Tratamiento con citostticos. Al 56,3% de las pacientes que desarrollaron metstasis (n=9) no se les haba administrado quimioterapia. h) Hormonoterapia. La mitad de las pacientes que recidivaron (n=8) estaban recibiendo tamoxifn.
Tabla 22a. Asociacin entre parmetros clnico-patolgicos y recidiva a 36 meses. Chi cuadrado. Prueba exacta de Fisher.
Parmetros Premenopausia Postmenopausia Tumor nico T. Multicntrico Tamao tumoral 2 < (cm) 25 5 > Ganglios + No N1 N2 N de ganglios + 0 1-3 ms de 4 Tamao Gangl. 1,8 < (cm) 1,8 > Cpsula rota + Grado nuclear I II III Grado histolgico I II III Estadificacin I II III Radioterapia + Quimioterapia + Hormonoterapia + n= 3 13 12 4 5 8 3 6 5 5 6 4 6 8 5 6 10 0 11 5 2 10 4 3 6 7 9 7 7 9 8 8 Recidiva Sin Recidiva % Total Valor % columna n= % columna Fila p= 18,7 18 19,6 19,4 0,62 81,3 74 80,4 80,6 75,0 85 92,4 89,8 0,056 25,0 7 7,6 10,2 31,3 43 46,7 44,4 0,27 50,0 42 45,7 46,3 18,8 7 7,6 9,3 37,5 50 54,3 51,9 0,08 31,3 32 34,8 34,3 31,3 10 10,9 13,9 37,5 50 54,3 51,9 0,07 25,0 29 31,5 30,6 37,5 13 14,1 17,6 61,5 44 49,4 51,0 0,30 38,5 45 50,6 49,0 37,5 14 15,2 18,5 0,04 62,5 78 84,8 81,5 10 10,9 9,3 0,35 68,7 60 65,2 65,7 31,3 22 23,9 25,0 12,5 13 14,1 13,9 0,92 62,5 60 65,2 64,8 25,0 19 20,7 21,3 18,8 39 42,4 38,9 0,01 37,5 40 43,5 42,6 43,8 13 14,1 18,5 56,3 50 54,3 54,6 0,55 43,8 42 45,7 45,4 56,3 31 33,7 35,2 0,30 43,8 61 66,3 64,8 50,0 57 62,0 60,2 0,26 50,0 35 38,0 39,8
Resultados
155
Tabla 22b. Estimacin del riesgo relativo de recidiva a 36 meses con relacin a los parmetros clnico-patolgicos.
Parmetros Postmenopausia/Premenopausia Tumor nico/T. Multicntrico Tamao tumoral 25 cm / 2 cm < 5 cm > / 2-5 cm 5 cm > / 2 cm < Ganglios afectados N1/N0 N2/N1 N2/N0 N de ganglios + 1- 3/0 ms de 4/1-3 ms de 4/0 Tamao Gangl. 1,8 cm </1,8 cm > Cpsula rota/Cpsula intacta Grado nuclear II/I III/II III/I Grado histolgico II/I III/II III/I Estadificacin II/I III/II III/I Radioterapia S/Radioterapia No Quimioterapia Si/Quimioterapia No Hormonoterapia S/Hormonoterapia No Riesgo Relativo I.C. al 95% 0,95 0,34 1,53 1,90 2,88 1,26 2,50 3,11 1,13 2,60 2,94 0,65 2,64 3,51 1,20 4,32 1,07 1,20 1,30 1,82 2,70 4,90 1,06 1,43 0,66 0,29 0,13 0,54 0,60 0,81 0,41 0,80 1,09 0,34 0,80 1,07 0,22 1,08 0,22 0,50 0,26 0,26 0,40 0,27 0,48 1,03 1,41 0,42 0,57 0,26 3,05 0,87 4,36 - 5,90 10,14 - 3,83 - 7,30 - 8,81 - 3,71 - 8,10 - 8,05 - 1,86 - 6,41 - 55,52 - 3,10 - 71,80 - 4,39 - 3,50 - 6,25 - 6,84 - 7,00 - 16,99 2,65 3,54 1,62
1-b)
Anlisis
de
la
asociacin
entre
los
marcadores
tumorales
moleculares y las recidivas precoces.

1) En las tablas 23a y 23b estn representados los datos del anlisis del grado de asociacin y del riesgo relativo de recidiva a 36 meses con relacin a los marcadores tumorales moleculares. Este anlisis evidenci: 2) Una asociacin significativa entre el desarrollo de enfermedad metastsica y la tincin positiva para el antgeno nuclear de proliferacin celular Ki67, de tal modo, que el 81,2% de las recidivas (n=13), tuvieron tumores ki67+ (p=0,0004). Es decir, recidivaron un porcentaje importante de tumores con altos ndices de proliferacin celular. 3) Una asociacin significativa entre las recidivas y la pS2 objetivando as, una ausencia de tincin para esta protena en el 93,8% de los casos (n=15) con metstasis (p=0,01). En este caso la mayora de las recidivas se han producido en pacientes con tumores pS2 negativo. 4) No encontramos una asociacin estadsticamente significativa entre las recidivas y:
Resultados
156
a) El RE. El 62,5% de los casos con metstasis (n=10) correspondieron a tumores con tincin positiva para RE, aunque proporcionalmente se aprecian ms recidivas en cnceres RE negativo. b) El RPg. El 56,2% de las recidivas (n=9) presentaron cnceres primarios RPg+. c) La protena Hsp27. El 92,3% de los casos que desarrollaron metstasis, sus cnceres haban sido Hsp27+. d) El EGFR. En el 71,4% de los casos con enfermedad metastsica (n=10) los cnceres primarios fueron EGFR-. e) La p185C-erbB-2. Se encontr similar proporcin de cnceres p185C-erbB-2 positivos y negativos en los casos que desarrollaron enfermedad metastsica. f) El antgeno nuclear PCNA. En el 64,3% de las recidivas (n=9), los cnceres primarios haban teido positivamente para el PCNA. g) La protena p53. El 73,3% de las pacientes con metstasis (n=11) tuvieron cnceres p53 negativos. h) La catepsina D. El 60% de los cnceres que desarrollaron enfermedad metastsica (n=9) fueron catepsina D+. i) La glicoprotena P. En el 91% de los casos con metstasis (n=10), la glicoprotena P fue negativa, aunque su determinacin se haba realizado en 11 de las 16 pacientes (p=0.07). Tabla 23a. Asociacin entre marcadores tumorales moleculares y recidiva a 36 meses. Prueba exacta de Fisher.
Marcador Molecular RE + Rpg + PS2 + Hsp27 + EGFR + C-erbB-2 + Ki-67 + PCNA + P53 + Catepsina D + Glicoprot.P + Recidiva n= % columna 10 62,5 6 37,5 9 56,3 7 43,8 1 6,3 15 93,8 12 92,3 1 7,7 4 28,6 10 71,4 7 50,0 7 50,0 13 92,9 1 7,1 9 64,3 5 35,7 4 26,7 11 73,3 9 60,0 6 40,0 1 9,1 10 90,9 Sin Recidiva % Total Valor Ausencias n= % columna Fila P= 61 70,1 68,9 5 0,37 26 29,9 31,1 55 61,1 39,6 2 0,46 35 38,9 60,4 30 35,7 31,0 0,01 8 54 64,3 69,0 66 83,5 84,8 16 0,37 13 16,5 15,2 14 17,5 19,1 14 0,26 66 82,5 80,9 39 46,4 46,9 10 0,51 45 53,6 53,1 33 42,3 50,0 0,0004 16 45 57,7 50,0 37 45,7 48,4 13 0,16 44 54,3 51,6 19 22,1 22,8 7 0,46 67 77,9 77,2 40 47,1 49,0 8 0,26 45 52,9 51,0 17 63,8 31,0 50 0,07 30 36,2 63,8
Resultados
157
Tabla 23b. Estimacin del riesgo relativo de recidiva a 36 meses con relacin a los marcadores tumorales moleculares.
Marcador Molecular RE+/RERpg+/RpgpS2+/pS2Hsp27+/Hsp27EGFR+/EGFRC-erbB-2+/C-erbB-2Ki-67+/Ki67PCNA+/PCNAP53+/p53Catepsina D+/Catepsina DGlicoprot. P+/Glicoprot. PRiesgo Relativo 0,75 0,84 0,14 2,15 1,68 1,13 13,0 1,91 1,23 1,56 0,22 I.C. al 95% 0,29 0,34 0,02 0,3 0,59 0,42 1,77 0,69 0,43 0,60 0,03 1,88 2,09 1,07 15,28 4,77 2,98 95,37 5,29 3,50 4,06 1,60
2-a) Anlisis de la asociacin entre los parmetros clnico-patolgicos y las recidivas precoces en pacientes con ganglios axilares positivos.
De las 52 pacientes con cnceres con ganglios axilares positivos, 10 (19,2%) enfermas desarrollaron enfermedad metastsica y que correspondieron al 62,5% de las 16 recidivas totales registradas durante los primeros 36 meses de seguimiento. Los datos del anlisis del grado de asociacin entre los parmetros clnico-patolgicos y las recidivas se representan en la tabla 24. La comparacin en este subgrupo objetiv nicamente una asociacin significativa con la estadificacin, puesto que el 70% de las recidivas (n=7) se produjeron en pacientes en el estadio III (p=0,04). Con el resto de los parmetros clnico patolgicos no se evidenci ninguna asociacin estadsticamente significativa.
Resultados
158
Tabla 24. Asociacin entre los parmetros clnico-patolgicos y recidiva a 36 meses en pacientes con ganglios axilares positivos. Chi cuadrado. Prueba exacta de Fisher.
Parmetros Premenopausia Postmenopausia Tumor nico Multicntrico Tamao tumoral (cm) Ganglios + N de ganglios n= 5 5 7 3 2 5 3 5 5 0 4 6 6 4 6 4 0 7 3 1 6 3 0 3 7 6 4 7 3 5 5 Recidiva % columna 50,0 50,0 70,0 30,0 20,0 50,0 30,0 50,0 50,0 40,0 60,0 60,0 40,0 60,0 40,0 70,0 30,0 10,0 60,0 30,0 30,0 70,0 60,0 40,0 70,0 30,0 50,0 50,0 Sin Recidiva n= % columna 17 40,5 25 59,5 38 90,5 4 9,5 11 26,2 28 66,7 3 7,1 32 10 1 28 13 20 21 14 28 2 26 14 4 26 12 2 28 12 25 17 23 19 30 12 76,2 23,8 2,4 66,7 31,0 48,8 51,2 33,3 66,7 4,8 61,9 33,3 9,5 61,9 28,6 4,8 66,7 28,6 59,5 40,5 54,8 45,2 71,4 28,6 Total % Fila 42,3 57,7 86,5 13,5 25,0 63,5 11,5 71,2 28,8 1,9 61,5 36,5 51,0 49,0 38,5 61,5 3,8 63,5 32,7 9,6 61,5 28,8 3,8 59,6 36,5 59,6 40,4 57,7 42,3 67,3 32,7 Valor p= 0,42 0,12 0,12 0,10 0,21 0,39 0,11 0,74
2 < 25 5 > N1 N2
0 1-3 ms de 4 Tamao Gangl. 1,8 < (cm) 1,8 > Cpsula rota + Grado nuclear I II III Grado Histolgico I II III Estadificacin I II III Radioterapia + Quimioterapia + Hormonoterapia + -
0,99
0,04 0,63 0,30 0,17
2-b)
Anlisis
de
la
asociacin
entre
los
marcadores
tumorales
moleculares y las recidivas precoces en pacientes con ganglios axilares positivos.

Los datos se resumen en la tabla 25. El anlisis de la asociacin de los marcadores tumorales moleculares en las 10 pacientes con metstasis y ganglios positivos objetiv que:
1) La tincin positiva para el antgeno ki67 se relacion significativamente con las metstasis en pacientes con afectacin ganglionar. En el 100% (n=10) de los casos los cnceres fueron ki67+ (p=0,0007). 2) La tincin positiva para la catepsina D se asoci significativamente con la aparicin de enfermedad metastsica cuando existieron ganglios axilares positivos. El 77,7% (n=7) de
Resultados
159
los casos con metstasis, los cnceres haban teido positivamente para la catepsina D (p=0,02). 3) No se demostr una asociacin estadsticamente significativa entre la enfermedad metastsica registrada en cnceres con ganglios axilares positivos y: a) El RE, as, el 60% de las recidivas (n=6) correspondieron a cnceres RE+. b) El RPg, observando un 60% de metstasis (n=6) en cnceres primarios RPg+. c) La protena pS2, objetivando la ausencia de tincin en el 90% de estos cnceres (n=9). d) La Hsp27. El 100% de las recidivas (n=10) en este grupo tuvieron tumores Hsp27+. e) El EGFR. El 77,8% de los cnceres recidivados (n=7) fueron EGFR-. f) La expresin de C-erbB-2. En el 55,6% de los casos (n=5) los cnceres primarios haban sido p185C-erbB-2+. g) El PCNA. En el 66,7% de las recidivas los cnceres (n=6) haban teido positivamente para el PCNA. h) La p53, de tal modo, que en el 80% de los casos con metstasis (n=8), sus cnceres fueron p53-. i) La glicoprotena P, as el 83,3% de los cnceres primarios (n=5) haban sido glicoprotena P negativo.
Tabla 25. Asociacin entre los marcadores tumorales moleculares y recidiva a 36 meses en pacientes con ganglios axilares positivos. Prueba exacta de Fisher.
Marcador Molecular RE + RPg + PS2 + Hsp27 + EGFR + P185C-erbB-2 + Ki67 + PCNA + P53 + Catepsina D + Glicoprot. P + n= 6 4 6 4 1 9 9 0 2 7 5 4 10 0 6 3 2 8 7 2 1 5 Recidiva % columna 60,0 40,0 60,0 40,0 10,0 90,0 100,0 22,2 77,8 55,6 44,4 100,0 66,7 33,3 20,0 80,0 77,8 22,2 16,7 83,3 Sin Recidiva n= % columna 24 61,5 15 38,5 23 54,8 19 45,2 11 28,2 28 71,8 31 79,5 8 20,5 9 81,8 30 76,9 16 40,0 24 60,0 14 41,2 20 58,8 18 47,4 20 52,6 9 22,5 31 77,5 14 35,9 25 64,1 5 25,0 15 75,0 Total % Fila 61,2 38,8 55,8 44,2 24,5 75,5 83,3 16,7 22,9 77,1 42,9 57,1 54,5 45,5 51,1 48,9 22,0 78,0 56,3 43,8 23,1 76,9 Ausencias 3 0 3 4 4 3 8 5 2 4 26 Valor 0,60 0,52 0,22 0,16 0,66 0,31 0,0007 0,25 0,62 0,02 0,57 p=
Resultados
160
3-a) Anlisis de la asociacin entre los parmetros clnico-patolgicos y las recidivas precoces en pacientes con ganglios axilares negativos.
De las 56 pacientes con cnceres con ganglios axilares negativos, 6 (10,7%) desarrollaron metstasis, que equivalen a un 37,5% del total de recidivas (n=16) producidas durante los primeros 36 meses de seguimiento. Segn se resume en la tabla 26, en este subgrupo ningn parmetro clnico-patolgico se asoci significativamente con la aparicin de metstasis, aunque destaca que no recidiv ningn tumor con un grado nuclear I y la mayor proporcin de recidivas se produjeron en los tumores con grado nuclear e histolgico III. Ningn tumor sobrepas los 5 cm, siendo en la mitad de los casos menores de 2 cm. Cinco de estas 6 recidivas correspondieron a pacientes postmenopusicas y segn la estadificacin desarrollaron enfermedad metastsica 3 pacientes en el estadio I y 3 pacientes en el estadio II. Con relacin al tratamiento adyuvante, a la mitad se le administr radiacin postoperatoria y tamoxifn. Llama la atencin que ninguna de las 6 pacientes que desarrollaron enfermedad metastsica recibi quimioterapia en el postoperatorio.
Tabla 26. Asociacin entre parmetros clnico-patolgicos y recidiva a 36 meses en pacientes con ganglios axilares negativos. Chi cuadrado y prueba exacta de Fisher.
n= Premenopausia 1 Postmenopausia 5 Tumor nico 5 T. Multicntrico 1 Tamao tumoral 2 < 3 (cm) 25 3 5 > 0 Tamao Gangl. 1,8 < 2 1,8 > 1 Grado nuclear I 0 II 4 III 2 Grado Histol. I II III 1 4 1 3 3 0 3 3 0 6 3 3 Parmetros Recidiva Sin Recidiva Total Valor p= % columna n= % columna % Fila 16,7 15 30,0 28,6 0,44 83,3 35 70,0 71,4 83,3 47 94,0 92,9 0,37 16,7 3 6,0 7,1 50,0 32 64,0 62,5 0,47 50,0 14 28,0 30,4 4 8,0 7,1 66,7 24 50,0 51,0 0,51 33,3 24 50,0 49,0 8 16,0 14,3 0,39 66,7 34 68,0 67,9 33,3 8 16,0 17,9 16,7 66,7 16,7 50,0 50,0 50,0 50,0 100,0 50,0 50,0 9 34 7 37 12 1 25 25 8 42 27 23 18,0 68,0 14,0 74,0 24,0 2,0 50,0 50,0 16,0 84,0 54,0 46,0 17,9 67,9 14,2 71,4 26,8 1,8 50,0 50,0 14,3 85,7 53,6 46,4 0,98
Estadificacin I II III Radioterapia + Quimioterapia + Hormonoterapia + -
0,38
0,66 0,37 0,59
Resultados
161
3-b)
Anlisis
de
la
asociacin
entre
los
marcadores
tumorales
moleculares y las recidivas precoces en pacientes con ganglios axilares negativos.

El anlisis de los marcadores biolgicos moleculares, en este grupo de 6 pacientes con enfermedad metastsica sin afectacin ganglionar, mostr que nicamente la ausencia de tincin para la protena pS2 se asoci significativamente con la aparicin de metstasis (p=0,049). Segn se resume en la tabla 27, no se encontr asociacin estadsticamente significativa con el resto de los marcadores moleculares.
Tabla 27. Asociacin entre los marcadores tumorales moleculares y recidiva a 36 meses en pacientes con ganglios axilares negativos. Prueba exacta de Fisher.
Marcador Molecular RE RPg PS2 Hsp27 EGFR P185C-erbB-2 Ki67 PCNA P53 Catepsina D Glicoprot. P + + + + + + + + + + + n= 4 2 3 3 0 6 3 1 2 3 2 3 3 1 3 2 2 3 2 4 0 5 Recidiva Sin Recidiva Total Ausencias Valor p= % columna n= % columna % Fila 66,7 37 77,1 75,9 2 0,45 33,3 11 22,9 24,1 50,0 32 66,7 64,8 2 0,35 50,0 16 33,3 35,2 19 42,2 37,3 0,049 5 100,0 26 57,8 62,7 75,0 35 87,5 86,4 12 0,45 25,0 5 12,5 13,2 40,0 5 12,2 15,2 10 0,16 60,0 36 87,8 84,8 40,0 23 52,3 51,0 7 0,48 60,0 21 47,7 49,0 75,0 19 43,2 45,8 8 0,24 25,0 25 56,8 54,2 60,0 19 44,2 45,8 8 0,42 40,0 24 55,8 54,2 40,0 10 21,7 23,5 5 0,33 60,0 36 78,3 76,5 33,3 26 56,5 53,8 4 0,26 66,7 20 43,5 46,2 12 44,4 37,5 24 0,07 100,0 15 55,6 62,5
Resultados
162
II- ANLISIS DEL INTERVALO LIBRE DE ENFERMEDAD A 36 MESES CON RELACIN A LOS PARMETROS CLNICOPATOLGICOS Y LOS MARCADORES TUMORALES
MOLECULARES. MTODO DE KAPLAN-MEIER Y ANALISIS UNIVARIANTE.

1) Anlisis del intervalo libre de enfermedad con relacin a los
parmetros clnico-patolgicos.
1-) Segn se expresa en las grficas donde estn representadas las curvas de supervivencia, presentaron una disminucin significativa del intervalo libre de enfermedad las pacientes que tuvieron: a) Tumores multicntricos (p=0,03), (Grfica 1). b) Ganglios axilares positivos (p=0,04), (Grfica 2). c) Mas de 4 ganglios axilares afectados (p=0,04), (Grfica 3). d) Desbordamiento de la cpsula ganglionar (p=0,02), (Grfica 4). e) Estadio III (p=0,005), (Grfica 5). f) Cnceres con grado nuclear III y ganglios N2 (p=0,01), (Grfica 10). g) Ausencia de expresin de la protena pS2 (p=0,02), (Grfica 15).
El anlisis de las grficas de supervivencia libre de enfermedad no objetiv diferencias significativas entre las curvas con relacin a: a) El tamao tumoral (Grfica 6). b) El tamao de los ganglios axilares, (Grfica 7). c) El grado nuclear, (Grfica 8). d) El grado histolgico, (Grfica 9). e) El estado hormonal, (Grfica 11). f) El tratamiento radioterpico, (Grfica 12). g) La administracin de quimioterapia, (Grfica13). h) La hormonoterapia, (Grfica 14).
Resultados
163
2)
Anlisis del intervalo libre de enfermedad con relacin a los
marcadores tumorales moleculares.
2-) Segn se refleja en las grficas donde estn representadas las curvas de supervivencia, presentaron una disminucin significativa del intervalo libre de enfermedad las pacientes con: a) Ausencia de expresin de la protena pS2 y ganglios negativos (p=0,048), (Grfica 16). b) Tumores Ki-67 positivos (p=0,0005), (Grfica 17). c) Cnceres Ki-67 positivo y ganglios positivos (p=0,001), (Grfica 18). d) Cnceres catepsina D positivo y ganglios positivos (p=0,02), (Grfica 20).
El anlisis de las grficas de supervivencia libre de enfermedad no objetiv diferencias significativas entre las curvas con relacin a: a) El estado del RE, (Grfica 21). b) El estado del RPg, (Grfica 22). c) La expresin de la protena Hsp27, (Grfica 23). d) La expresin del EGFR, (Grfica 24). e) La expresin de C-erbB-2, (Grfica 26). f) El antgeno nuclear de proliferacin celular PCNA, (Grfica 27). g) La expresin de la protena p53, (Grfica 28). h) La expresin de la catepsina D, (Grfica 19). i) La expresin de la glicoprotena P, (Grfica 29).
En pacientes con ganglios axilares negativos la presencia del EGFR (p=0,06) y la positividad para la Glicoprotena P (p=0,07) se relacionaron con una disminucin del intervalo libre de enfermedad a 36 meses, aunque en estos casos no se alcanz la significacin estadstica prefijada en el diseo. (Grficas 25 y 30).
Segn el anlisis univariante, presentado en la tabla 28, se asociaron a un mayor riesgo de aparicin de metstasis durante los primeros 36 meses de seguimiento: la presencia de ms de un foco de cncer ductal infiltrante en la misma mama; los cnceres con ganglios en estadio N2, afectacin de 4 o ms ganglios y rotura con desbordamiento de la cpsula ganglionar; las pacientes clasificadas en el estadio III (TNM) y los cnceres con porcentajes de clulas Ki-67 por arriba del valor de la mediana.
Resultados
164
Tabla 28. Anlisis univariante de los parmetros clnico-patolgicos y marcadores tumorales moleculares con relacin a las recidivas a 36 meses.
Parmetros Postmenopausia/Premenopausia Tumor Multicntrico/T. Unico Tamao tumoral 25cm/2cm < 5cm >/2cm < Ganglios afectados N1/N0 N2/N0 N de ganglios + 1- 3/0 Ms de 4/0 Tamao Gangl. 1,8 cm </1,8 cm > Cpsula rota/Cpsula intacta Grado nuclear I/II I/III Grado nuclear y N2 III/1 Grado histolgico II/I III/I Grado histolgico y N2 III/1 Estadificacin II/I III/I Radioterapia S/Radioterapia No Quimioterapia Si/Quimioterapia No Hormonoterapia S/Hormonoterapia No RE+/RERPg+/RPgPS2+/pS2PS2+/pS2- y NHsp27+/Hsp27EGFR+/EGFRC-erbB-2+/C-erbB-2Ki-67+/Ki-67PCNA+/PCNAP53+/P53Catepsina D+/Catepsina DCatepsina D+/Catepsina D- y N+ Glicoprotena P+/Glicoprotena PRazn de Riesgo 1,02 3,3 1,6 3,6 1,3 3,7 1,2 3,7 0,66 3,1 0,8 1,6 x 106 7,4 1,1 1,4 4,5 1,9 6,3 1,06 1,5 0,65 0,7 0,8 0,14 0,02 2,3 1,8 1,2 15,0 2,0 1,3 1,7 5,1 0,2 I.C. 95% 0,3 3,6 1,06 10,87 0,5 48,0 0,9 15,1 0,4 4,4 1,2 - 13,0 0,3 4,2 1,2 - 11,4 0,2 2,0 1,1 8,7 0,3 2,2 0,0 , 1,2 46,4 0,2 5,0 0,3 7,9 0,7 - 25,0 0,5 7,5 1,6 - 24,3 0,4 2,8 0,6 4,1 0,24 1,7 0,2 1,9 0,3 2,2 0,02 1,04 2x10-5 - 20,3 0,3 - 18,0 0,6 5,8 0,4 3,3 1,9 - 114,0 0,7 - 61,0 0,4 4,0 0,6 4,7 1,1 - 27,7 0,02 1,5
CURVAS DE SUPERVIVENCIA. INTERVALO LIBRE DE ENFERMEDAD A 36 MESES CON RELACION A PARAMETROS CLINICO-PATOLOGICOS Y MARCADORES TUMORALES MOLECULARES
G r f ic a 1 . T I P O D E T U M O R
p= 0 ,03
1 ,1
G r fic a 2 . E S T A D IF IC A C IO N . C A T E G O R IA N . p= 0 ,04 Supervivencia acum.

1,1 1,0 ,9 ,8 ,7 ,6 0 10 20 30 40
Supervivencia acum.
g an g lio s ax ilar es N2 N 2 - c en s u r ad o N1 N 1 - c en s u r ad o N0 N 0 - c en s u r ad o
1 ,0 ,9 ,8 ,7 ,6 0 10 20 30 40
T ip o d e tu m o r M u ltic n tr ic o M ltic n tr ic o - c e n s . U n ic o U n ic o - c e n s u r a d o
I n te r v a lo lib r e a 3 6 m e s e s
In te rv a lo lib re a 3 6 m e s e s
G r f ic a 3 . N U M E R O D E G A N G L I O S p = 0 ,0 4 Supervivencia acum.
1,1 1,0 ,9 ,8 ,7 ,6 0 10 20 30 40
G r fic a 4 . R O T U R A D E L A C A P S U L A G . p = 0 ,0 2 Supervivencia acum.

1,1 1,0 ,9 ,8 ,7 ,6 0 10 20 30 40
N d e g a n g lio s + m s d e 4 m s d e 4 -c en s u rad o 1 - 3 1 - 3 -c en s u rad o 0 0-c en s u rad o
ro tu ra d e la c p s u la SI S I-c ens u rad o NO N O -c en s u rad o
I n t e r v a lo lib r e a 3 6 m e s e s
In te rv a lo lib re a 3 6 m e se s
G r fic a 5 . E S T A D IF IC A C IO N T N M p = 0 ,0 0 5 Supervivencia acum.
G r f ic a 6 . T A M A O T U M O R A L p = 0 ,1 8 Supervivencia acum.
Es tad io II I II I - c en s u r ad o II II - c en s u rad o I I - c en s u r ad o
1,1 1,0 ,9 ,8 ,7 ,6 0 10 20 30 40
1,1 1,0 ,9 ,8 ,7 ,6 0 10 20 30 40
T am a o sup a 5 s up a 5-c ens urado 2 a 5 cms 2 a 5 c m s -c ens u rado in f a 2 in f a 2 - c e n s u r a d o
G rfic a 7. T AMAO G ANG LIO NAR p = 0,43

1,02 1,00 ,98 ,96 ,94 ,92 ,90 ,88 ,86 ,84 0 10 20 30 40
G rfica 8. G R AD O N U C L E AR p=0,4 Supervivencia acum.

1,1
Supervivencia acum.
G rado nuc lear I I - c ens urado II II - c ens urado III III - c ens urado
0 10 20 30 40
T am ao ganglionar 1,8 > 1,8 > - c ensurado 1,8 < 1,8 < - c ensurado
1,0
,9 ,8
Intervalo lib re a 36 meses
Intervalo libre a 36 m eses
G r fic a 9 . G R A D O H IS T O L O G IC O p= 0 ,9 Supervivencia acum.
Supervivencia acum.
1,1
1,2
G rfic a 10. G R ADO NUC LEAR Y N2 p = 0,01

g r ad o h is to lo g ic o r e III I I I - c en s u r ad o II I I - c en s u r ad o I I - c en s u r ad o
1,0 ,8 ,6 ,4 ,2 0 10 20 30 40
1,0
Grado nuc lear y N2 II II - c ensurado III UNO-c ensurado
,9 ,8 0 10 20 30 40
Intervalo lib re a 36 mes es
G r f ic a 1 1 . E S T A D O H O R M O N A L p = 0 ,9
E s ta d o h o r m o n a l p o s tm e n o p u s ic a p o s tm e n o p u s ic a -c ens urado p r e m e n o p u s ic a p r e m e n o p u s ic a -c ens urado
0 10 20 30 40
G rfica 12. R AD IO T E R AP IA p=0,9

1,02 1,00 ,98 ,96 ,94 ,92 ,90 ,88 ,86 ,84 0 10 20 30 40
Supervivencia acum.
1,02 1,00 ,98 ,96 ,94 ,92 ,90 ,88 ,86 ,84
Supervivencia acum.
radioterapia si si-c ensurado no no-c ensurado
G rfic a 13. Q U IM IO T E R A P IA p = 0,4
1,1
G rfic a 14. HO R MO NO T ER AP IA p = 0,4

1,1
Supervivencia acum.
1,0
Supervivencia acum.
qu im io terap ia si
,9
1,0
horm onoterapia si
,9
s i- c en s u rad o no n o -c en s u rado
0 10 20 30 40
si-c ensurado no no-c ensurado

0 10 20 30 40
,8
,8
Intervalo lib re a 36 m es es
Intervalo lib re a 36 meses
G r f ic a 1 5 . p S 2 p = 0 ,0 2 Supervivencia acum.
1,1 1,0
G rfica 16. pS 2 y G AN G L IO S N E G AT IVO S p=0,048 Supervivencia acum.

1,1
pS 2
,9 ,8 ,7 0 10 20 30 40
1,0
pS 2 y N P os itivo P os itivo - c ens urado N egativo N egativo - c ens urado

24 26 28 30 32 34 36 38
P o s it iv o P o s it iv o - c e n s u r a d o N e g a t iv o N e g a t iv o - c e n s u r a d o
,9 ,8 22
I n t e r v a lo lib r e a 3 6 m e s e s
G r fic a 1 7 . K i-6 7 p = 0 ,0 0 0 5 Supervivencia acum.
1,1
G rfica 1 8 . K i-6 7 y G AN G L IO S P O S IT IV O S p = 0 ,0 0 1 Supervivencia acum.

1,1 1,0 ,9 ,8 ,7 ,6 ,5 -10
1,0
Ki- 6 7
,9 ,8 ,7 0 10 20 30 40
Ki-67 y g an glio s + 15% 15% > - c en s urado 15% < 15% < - c en s urado
0 10 20 30 40
15% > 1 5 % > - c en s u r ad o 15% < 1 5 % < - c en s u r ad o
In terv a lo lib re a 3 6 m e se s
G r f ic a 1 9 . C A T E P S I N A D p = 0 ,3 Supervivencia acum.
1,1
G r fic a 2 0 . C A T E P S IN A D Y G A N G L IO S + p= 0 ,02 Supervivencia acum.

1,1 1,0 ,9 ,8 ,7 ,6 0 10 20 30 40
1,0
C a te p s in a D P o s itiv o P o s itiv o - c e n s u r a d o N e g a tiv o N e g a tiv o - c e n s u r a d o

0 10 20 30 40
C atep s in a D y N + P o s itiv o P o s itiv o - c en s u r ad o N eg ativ o N eg ativ o - c en s u r ad o
,9 ,8
G r fic a 2 1 . R E p = 0 ,4 9 Supervivencia acum. Supervivencia acum.
1,1 1,1
G r fic a 2 2 . R P g p = 0,7
1,0
RE P o s itiv o P o s itiv o - c en s u r ad o N eg ativ o N eg ativ o - c en s u r ad o

0 10 20 30 40
1,0
RPg P o s itiv o P o s itiv o - c en s u r ad o N eg ativ o N eg ativ o - c en s u r ad o

0 10 20 30 40
,9 ,8
,9 ,8
G rfica 2 3 . H sp 2 7 p = 0 ,4
1,02 1,00 ,98 ,96 ,94 ,92 ,90 ,88 ,86 ,84 0 10 20 30 40
G rfica 2 4. E G F R p = 0 ,3 Supervivencia acum.

1,1 1,0
Supervivencia acum.
p29 P os itivo P os itivo - c ens urado N egativo N egativo - c ens urado
EG F R
,9 ,8 ,7 0 10 20 30 40
P os itivo P os itivo - c ens urado N egativo N egativo - c ens urado
In terv alo lib re a 3 6 m eses
Intervalo lib re a 3 6 m eses
G r fic a 2 5 . E G F R y N p = 0 ,0 6 Supervivencia acum.
1,0
G r fic a 2 6 . C -e rb B -2 p = 0 .8
1,02 1,00 ,98 ,96 ,94 ,92 ,90 ,88 ,86 ,84 0 10 20 30 40
EG F R
,9 ,8 ,7 22 24 26 28 30 32 34 36 38
Supervivencia acum.
1,1
C -erb B-2 P o s itiv o P o s itivo - c ens urad o N eg ativ o N egativo - c ens urad o
P o s itiv o P o s itio - c en s u r ad o N eg ativ o N eg ativ o - c en s u r ad o
G rfica 27. P C N A p=0,19 Supervivencia acum.

PCNA
1,0 ,9 ,8 ,7 0 10 20 30 40
G rfica 28 . p5 3 p = 0 ,7 Supervivencia acum.

1,1
1,1
16% > 16% > -c ens urado 16% < 16% < -c ens urado
1,0
p53 P os itivo P os itivo - c ens urado N egativo N egativo - c ens urado

0 10 20 30 40
,9 ,8
Intervalo lib re a 3 6 m eses
G rfica 29. G L IC O P R O T E IN A P p=0,08 Supervivencia acum.

1,1 1,0
G rfica 30. G L IC O P R O T E IN A P y N p=0,07 Supervivencia acum.

1,1 1,0
Glic oprotena P
,9 ,8 ,7 0 10 20 30 40
Glic oprotena P y N,9 ,8 ,7 22
pos itivo pos itivo - c ens urado negativo negativo - c ens urado
Pos itivo Pos itivo - c ens urado Negativo Negativo - c ens urado
24 26 28 30 32 34 36 38
Resultados
173
III-
ANLISIS
MULTIVARIANTE Y DE
DE
LOS LOS
PARMETROS MARCADORES
CLNICO-PATOLGICOS
Se han construido diversos modelos de regresin de riesgos proporcionales de Cox para valorar la relacin entre las distintas variables y la contribucin que aporta cada uno de los factores pronstico. Tambin hemos ensayado distintos modelos predictivos para la enfermedad metastsica que nos permiten medir el riesgo y la supervivencia libre de enfermedad de grupos de pacientes con determinados valores en dichos factores pronstico. En estos modelos se han introducido los potenciales factores de riesgo y las variables de control cientficamente relevantes y con una buena justificacin terica, aparte de su significacin estadstica en los anlisis uni y bivariantes. Fueron comprobadas las asunciones de validez de los diferentes modelos y de todos los analizados han sido seleccionados finalmente aquellos que contienen las variables tipo de tumor, estadificacin y ki67.
En el modelo 1, expresado en la tabla 29, la razn de riesgos de metstasis de las pacientes con tumores multicntricos es de 3,35 veces (I.C. al 95%: 1,1 10,45) el de las enfermas con tumores nicos. De manera similar, para la variable estadificacin, la razn de riesgos de metstasis para las pacientes clasificadas en un estadio III es de 6,2 veces (IC: al 95% 1,6 24,0) el de las pacientes en un estadio I. Las grficas 31 y 32 muestran las funciones de supervivencia ajustadas para cada una de las variables y sus covariables correspondientes. Las pacientes con tumores multicntricos y aqullas clasificadas en el estadio III presentaron una disminucin del intervalo libre de enfermedad a 36 meses.
En el modelo 2, mostrado en la tabla 30, la razn de riesgos de metstasis de las pacientes con cnceres Ki-67+ es 15,3 veces superior (IC al 95%: 1,9 117,6) al de las enfermas con cnceres Ki67-, y la razn de riesgos para las pacientes clasificadas en un estadio III es de 9,3 veces (IC al 95%: 1,9 45,3) el de las enfermas clasificadas en un estadio I. En este modelo al realizar el ajuste de una variable por la otra se observ una disminucin de la supervivencia libre de enfermedad a 36 meses de las pacientes con cnceres Ki-67 y las clasificadas en el estadio III. (Grficas 33 y 34).
Por tanto, en esta serie de 108 cnceres ductales infiltrantes, entre las variables correspondientes a los parmetros clnico-patolgicos, las de mayor valor pronstico para la
Resultados
174
enfermedad mestastsica a 36 meses han sido el tipo de tumor multicntrico y el estadio III de la clasificacin TNM. De los marcadores tumorales moleculares, el antgeno nuclear de proliferacin celular Ki-67, fue la variable que mejor predijo un mal pronstico a corto plazo.
Tabla 29. Anlisis multivariante de riesgos proporcionales de Cox.
Modelo 1
Chi-cuadrado 15,372
df 3
Sig. 0,0015
--------------------------------------------------------------------- Variables en la ecuacin ---------------------------------------------------------------I.C. al 95% VARIABLE TIPOTUMO2 ESTADIFICACION ESTADIFICACION (1) ESTADIFICACION (2) 0,5492 1,8244 0,7092 0,6911 B 1,2083 S.E. 0,5808 Wald 4,3289 8,9300 0,5998 6,9690 df 1 2 1 1 Sig. 0,0375 0,0115 0,4386 0,0083 R 0,1256 0,1828 0,0000 0,1835 1,7319 6,1991
(1)= al
H-R 3,3479
Inferior 1,0726
Superior 10,4503
0,4314 1,5998
II/I
6,9533 24,0207
(TNM);
Nota: H-R= Razn de riesgo; TIPOTUMO2 = Estadificacin (2)= al Estadio III/I (TNM).
multicntrico/nico;
Estadificacin
Estadio
Tabla 30. Anlisis multivariante de riesgos proporcionales de Cox.
Modelo 2
Chi-cuadrado
26,354
df 3
Sig. 0,0000
--------------------------------------------------------------------- Variables en la ecuacin ----------------------------------------------------------------
I.C. al 95%
VARIABLE KI67 (1) ESTADIFICACION ESTADIFICACION (1) ESTADIFICACION (2) 0,6010 2,2309 0,8378 0,8078 B 1,2083 S.E. 0,5808 Wald 4,3289 8,9300 0,5145 7,6274 df 1 2 1 1 Sig. 0,0088 0,0031 0,4732 0,0057 R 0,1974 0,2464 0,0000 0,2125 1,8239 9,3082 0,3531 1,9111 9,4212 45,3368 H-R 15,2775 Inferior 1,9846 Superior 117,6037
Nota: H-R= razn de riesgo; KI67 (1)= KI67+/KI67-; Estadificacin (1)= Estadio II/I (TNM), Estadificacin (2)= Estadio III/I (TNM).
ANALISIS MULTIVARIANTE DE LOS PARAMETROS CLINICO-PATOLOGICOS Y DE LOS MARCADORES TUMORALES MOLECULARES
Grfica 31. Tipo de tumor.

Funcin de supervivencia segn el tipo de tumor ajustado por estadiaje
1,0
,9
,8
Supervivencia acumulada
,7
TIPO DE TUMOR
MULTIPLE ,6 0 10 20 30 40 UNICO
Intervalo libre a 36 meses
Grfica 32. Estadiaje.

Funcin de supervivencia segn estadiaje ajustado por tipo de tumor
1,0
,9
,8
,7
ESTADIAJE
Cat 3 Cat 2
,6 0 10 20 30 40
Cat 1
ANALISIS MULTIVARIANTE DE LOS PARAMETROS CLINICO-PATOLOGICOS Y DE LOS MARCADORES TUMORALES MOLECULARES
Grfica 33. Estadiaje.

Funcin de supervivencia segn el estadiaje Ajustado por Ki67
1,0
,9
,8
ESTADIAJE
Cat 3 Cat 2 ,7 0 10 20 30 40 Cat 1
Grfica 34. Ki-67.

Funcin de supervivencia segn Ki67 Ajustado por estadiaje
1,0
,9
,8
KI67
SUP. MEDIANA ,7 0 10 20 30 40 INF. MEDIANA
DISCUSIN
I- A. DESCRIPCIN GENERAL DE LA SERIE
El estudio incluye 108 pacientes con carcinoma ductal infiltrante de mama, cuya evaluacin se inici desde el momento de la intervencin quirrgica. Las enfermas han sido clasificadas de acuerdo con criterios anatomopatolgicos sustentados en la extensin local y regional del tumor y, adems, se han valorado una serie de nuevas variables comnmente denominadas, marcadores tumorales moleculares, con el fin de obtener de una manera ms precisa indicadores de agresividad biolgica tumoral que nos permitan predecir las probabilidades de metstasis. Por tal motivo, el principal objetivo de este estudio ha sido el analizar una serie de factores que puedan influir o condicionar el pronstico del cncer mamario.
A diferencia de los estudios experimentales, donde es posible controlar las distintas variables, los trabajos clnicos poseen el inconveniente de la gran variabilidad de los individuos que componen la cohorte en estudio y de numerosos factores que no son susceptibles de dicho control. Aunque los procedimientos que incluyen el procesamiento de las muestras y las tinciones con sus respectivos controles estn bien estandarizados y el examen
anatomopatolgico ha sido realizado siempre por el mismo patlogo, no es posible excluir sesgos ocasionados por la inadecuada fijacin de los tejidos y las variaciones en la sensibilidad de los anticuerpos monoclonales que pueden alterar la tincin. Por diferentes motivos, tampoco se han efectuado las tinciones en todas las muestras de tejido neoplsico y a esto hay que sumar las dificultades para obtener significacin estadstica en algunas comparaciones cuyo reducido tamao muestral conduce a una falta de potencia estadstica. Teniendo en cuenta estas consideraciones, y a pesar de las limitaciones que imponen los estudios clnicos, creemos haber recogido los datos suficientes para completar nuestros objetivos y obtener unas conclusiones.
En esta serie, la relacin postmenopusica/premenopusica de es de 4:1 ocasionando una elevacin de la edad media por un exceso de pacientes postmenopusicas; sin embargo, si comparamos las medias de edad de las pacientes premenopusicas (44,7 aos IC al 95%: 41,747,2) y postmenopusicas (66,3 aos, IC al 95%: 64,5-68,1) de manera individual, observamos que se corresponden con las medias descritas en otras publicaciones (Henderson et al., 1974; Henderson y Canellos et al., 1980; Parkin et al., 1984; Fisher et al., 1985; Olivotto et al., 1994).
En nuestra serie el porcentaje de cirugas conservadoras practicadas (42,5%) se sita en el rango (30-60%) de las series europeas (Veronesi et al., 1995) y se aleja de los porcentajes
Discusin
180
publicados (25,4%) en series americanas (Osteen et al., 1994). En nuestros objetivos no contemplamos la valoracin del tratamiento quirrgico con relacin al pronstico, porque se ha demostrado que la evolucin final del cncer de mama depende ms de las caractersticas biolgicas que de la extensin ablativa quirrgica (Fisher et al., 1985; Braun et al., 2000). Tampoco consideramos el tratamiento adyuvante, aunque sabemos que puede condicionar un retraso en la aparicin de las metstasis al quedar incluidos sus efectos en el perodo de seguimiento prefijado en el diseo (EBCTCG, 1995).
Los tumores multicntricos constituyeron el 10,2% de todos los tumores. Esta cifra se encuentra dentro de los valores observados en otras publicaciones, si se considera exclusivamente los focos de cncer infiltrante situados en el mismo cuadrante, pero distantes de la lesin primaria o en un cuadrante distinto del asiento del tumor. (Fisher et al., 1975; Tinnemans et al.,1986; Sarnelli y Squartini, 1986; Kurtz et al, 1990).
Con relacin al tamao destaca un 44,4% de tumores con un tamao inferior a los 2 cm, evidenciando que muchos han sido diagnosticados en una fase con buenas posibilidades de curacin como es la tendencia actual. El tamao tumoral es considerado un factor pronstico importante para establecer el riesgo de metstasis, ya que la incidencia vara en relacin directa con el tamao tumoral (Nemoto et al., 1980; Fisher et al., 1981). La mitad de las enfermas (51,9%) presentaban ausencia de afectacin ganglionar axilar y casi un tercio de los tumores presentaban afectacin de 1-3 ganglios (30,6%) y menos de una quinta parte (17,6%) ms de 4 ganglios. La mayora de los autores coinciden que el nmero de los ganglios axilares afectados se correlaciona mejor con el pronstico, siendo 4 el nmero de ganglios positivos un criterio para separar grupos de alto y bajo riesgo de recidiva (Berg, 1955; Fisher et al., 1978; Fisher et al., 1983; Henderson y Canellos 1980; Carbone, 1981). El nivel de los ganglios axilares resecados en nuestra serie revela la tendencia a la disminucin de los procedimientos quirrgicos ms agresivos, puesto que el 22% de los ganglios resecados correspondieron a un nivel III. La diseccin de los niveles I y II se consideran en la actualidad apropiados para estimar la diseminacin de la enfermedad y establecer la necesidad de un tratamiento adyuvante sistmico cuando existe afectacin ganglionar. (Fisher et al.,1981; Boova et al., 1982). En la serie que nos ocupa el 38,5% de los ganglios positivos presentaban infiltracin con rotura de la cpsula ganglionar. Aparte del nmero de ganglios axilares afectados, el desbordamiento de la cpsula ganglionar es considerado un parmetro de evolucin desfavorable (Fisher et al. , 1976; Mambo et al., 1977; Goldstein, 1995; Leonard et al., 1995). En cuanto al estadio en nuestra serie destaca un nmero proporcional de pacientes en los estadios I (38,8%) y II (42,6%). En la actualidad los cnceres en estadio I y II constituyen el 80-85% de los cnceres intervenidos en la
Discusin
181
mayora de los pases occidentales; la cifra de tumores en estadio III y IV se ha reducido a menos del 20% (Haid y Zuckerman 1982; Nemoto et al., 1980).
La media de seguimiento sobrepasa los 4 aos (IC al 95%: 46,7-52,2 meses), habiendo completado cada una de las participantes del estudio un tiempo de seguimiento de 36 meses establecido en el diseo. En el cncer de mama este perodo de vigilancia parece insuficiente debido a que las metstasis pueden aparecer varios aos despus del tratamiento quirrgico. Sin embargo, entre un 5 y un 25 % de las metstasis aparecen durante los primeros 3 aos postciruga en pacientes con ganglios negativos (Rosen et al. , 1989). La estadificacin TNM del cncer de mama es el mejor indicador de pronstico en la actualidad aunque es indiscutible que, an considerando los mejores resultados, un 10% de pacientes en el estadio I y hasta un 40% de enfermas en el estadio II desarrollan enfermedad metastsica durante los 5-10 aos de seguimiento; por tanto, en casos de tumores menores de 2 y 5 cm y ausencia de afectacin ganglionar, la estadificacin TNM no puede definir con exactitud subgrupos de bajo y alto riesgo de metstasis. Una desventaja adicional del sistema TNM es que una estadificacin exacta precisa del examen anatomopatolgico del tumor y de los ganglios y que, sobre la base de la estadificacin principalmente ganglionar, se establece una terapia adyuvante que no deja de ser emprica. Debido a las limitaciones del sistema de clasificacin TNM, se considera necesaria su ampliacin incorporando nuevas variables que definan las caractersticas biolgicas del tumor. De este modo, nuestro estudio pretende estudiar aquellas variables que puedan ser complementarias a este sistema de estadificacin.
Durante los 36 meses de seguimiento se registraron 16 metstasis, de stas, recidivaron el 7,1% (3/42) de las pacientes clasificadas en un estadio I, el 13,0% (6/46) del estadio II y el 35% (7/20) del estadio III. Los porcentajes de metstasis en los estadios I, II y III se sitan en el rango esperado, aunque resulta difcil pronosticar de manera individual qu pacientes del estadio I y del estadio II con N- recidivarn basndonos exclusivamente en la clasificacin TNM. El porcentaje de recidivas regionales ha sido bajo correspondiendo al 1,8% de la serie y las metstasis seas representaron el 50% de las recidivas a distancia, siendo estas cifras muy similares a las que se encuentran en otras series (Lenz et al., 1931; Staley, 1956;Rutgers et al.1989).
Discusin
182
I-B
ANLISIS
DE
LA
ASOCIACIN
ENTRE Y
LOS LOS
MARCADORES
TUMORALES
MOLECULARES
PARMETROS CLNICO-PATOLGICOS.
En nuestra serie hemos observado una asociacin significativa entre la gradacin histolgica y nuclear y los marcadores tumorales moleculares y, de este modo, podemos rechazar la hiptesis nula que establece que no existe asociacin entre los marcadores tumorales moleculares y los parmetros clnico-patolgicos. (Tabla 20). 1-a) Anlisis de la asociacin entre el RE y los parmetros clnico-patolgicos. En nuestro estudio utilizando el Am-ER1D5 y un dintel de positividad correspondiente al 10% o ms de las clulas ductales con ncleos teidos, el 65,7% de los cnceres fueron RE positivos. (Tabla 4). Estos resultados se encuentran dentro del rango publicado en la literatura (Keshgegian et al., 1987; Deligeorgi-Politi et al., 1989; Stierer et al., 1993; Golough et al., 1997; Ramos Fernndez et al., 1998), a pesar de que existen controversias sobre cual debe ser el dintel de positividad para el RE determinado mediante tincin IHQ. Keshgegian et al., (1987) y Bose et al., (1996) consideran que un 10% es un punto de corte adecuado, en cambio, para Pelosi et al., (1994) y Archer et al., (1995) este umbral de positividad se sita en el 5% de las clulas ductales teidas.
Hemos observado que los cnceres RE+ presentaban bajos grados histolgicos y nucleares y un reducido tamao de los ganglios axilares positivos. (Tabla 9 y 20). Esta asociacin inversa y significativa concuerda con la sealada en la literatura donde la expresin del RE se asocia a tumores bien diferenciados (Bloom y Richardson et al., 1957; McCarty et al., 1980; Fisher et al., 1980; Rasmussen et al., 1981; Keshgegian et al., 1987; Elston y Ellis, 1991; Stierer et al., 1992; Ramos-Fernndez et al., 1998). En nuestra serie los ganglios positivos de los cnceres RE- fueron significativamente de mayor tamao que el de los tumores RE+. En cambio, con el tamao tumoral los porcentajes de positividad han sido similares en todas las categoras T, aunque los tumores pequeos tienden a ser RE+. En la literatura se describe que la expresin del RE vara inversamente con el tamao tumoral; en nuestro caso, esta asociacin no ha sido estadsticamente significativa (Hernndez et al., 1983; Clark et al., 1984; Thorpe y Rose, 1986; Pichon et al., 1996). Tambin hemos constatado en este estudio, as como se describe en otras series publicadas, que la positividad del RE no siempre se asocia significativamente con el tamao tumoral, el estadio ganglionar y el nmero de ganglios afectados, si bien, la tendencia observada es que tumores pequeos y aquellos sin invasin ganglionar sean RE+ (Maynard et
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183
al., 1978; Rich et al., 1978; Furmanski et al., 1980; Clark et al., 1984; Molino et al., 1992; Ramos Fernndez et al., 1998; Gorlich y Jandrig,1999). (Tabla 9).
Con relacin al estado hormonal encontramos una discreta mayor proporcin de cnceres RE+ en pacientes postmenopusicas, aunque las diferencias no fueron estadsticamente significativas. (Tabla 9). Los tumores RE+ son ms frecuentes en pacientes postmenopusicas (McGuire et al., 1974; Lippman y Allegra 1980; Helln et al., 1988), sin embargo, algunos autores tampoco observan diferencias entre la expresin del RE y el estado hormonal (Clark et al., 1984; Berger et al., 1991).
La asociacin tambin fue directa y significativa con la terapia hormonal, como era de esperar, debido a la seleccin de pacientes RE+ para este tipo de terapia. A la inversa sucede con el tratamiento quimioterpico donde un mayor nmero de tumores RE-, por considerarse un parmetro de peor pronstico y de pobre respuesta al tratamiento hormonal, son seleccionados a recibir tratamiento con citotxicos. Por otra parte, no se observaron diferencias significativas con el tratamiento radioterpico que se administra segn la tcnica quirrgica o la positividad de los ganglios axilares. (Tabla 9). 1-b) Anlisis de la asociacin entre el receptor de estrgeno y los marcadores tumorales moleculares. En nuestra serie la positividad para el RE se relacion significativamente con la presencia del RPg y la protena pS2, con la ausencia de expresin del EGFR, C-erbB-2 y p53, y con bajos ndices de los antgenos nucleares Ki-67 y PCNA. Segn estos datos, los cnceres RE+ mantienen una dependencia hormonal, parecen no depender de los factores de crecimiento y no acumulan protena p53. (Tabla 21). La asociacin fue directa y muy significativa entre la inmunotincin del RE y la expresin de 2 protenas, el RPg y la pS2, inducidas directamente por estimulacin estrognica lo que sugiere la existencia de una va estrognica funcional y hormonodependencia (Horwitz et al., 1975; Horwitz y McGuire, 1978; Fisher et al., 1983; Clarke et al., 1993). (Tabla 9). La asociacin positiva entre la expresin de la pS2 y los RE y RPg ha sido confirmada en diversas series publicadas basadas en estudios inmunoenzimticos e inmunohistoqumicos (Rio et al., 1987; Foekens et al., 1990; Cappelletti et al., 1992; Thor et al., 1992; Dookeran et al., 1993; Horiguchi et al., 1996; Elledge et al., 2000).
Sin embargo, no se ha objetivado una asociacin entre el RE y la catepsina D; otra proteasa inducida por los estrgenos. (Tabla 9). Esta falta de asociacin podra deberse a una alteracin de la va del RE o que su sntesis se realiza por otras vas diferentes. En la mayora de las
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184
publicaciones, donde la expresin de catepsina D se ha determinado por mtodos bioqumicos o inmunoenzimticos, se seala una asociacin estadsticamente significativa entre este enzima y el RE (Thorpe et al., 1989; Spyratos et al., 1989; Gion et al., 1995). Por el contrario, hay autores que no han constatado una relacin significativa entre la catepsina D y los receptores hormonales (Marsigliante et al., 1992; Barbi et al., 1994; Foekens et al., 1999). Gonzlez-Vela et al., (1999) en un estudio con tincin IHQ citan una asociacin inversa entre la expresin de la catepsina D en el componente estromal y el RE. Losch et al., (1998) quienes compararon inmunohistoqumicamente la expresin de catepsina D en el componente estromal y ductal, no encontraron asociacin alguna con este ltimo. Aunque los mtodos bioqumicos poseen la desventaja de la contaminacin producida por el componente estromal, en cualquier caso, la elevada expresin de catepsina D en el estroma sera ocasionada por un efecto paracrino inducido por el componente ductal. Adems estos estudios demuestran que en algunos cnceres de mama la expresin de la catepsina D no siempre va ligada a la expresin del RE.
Tambin hemos observado una relacin inversa muy significativa entre la expresin del RE y el EGFR, que en caso del C-erbB-2 la asociacin se sito cercana al lmite de la significacin estadstica (p=0,05). (Tabla 9). El RE vara inversamente con la expresin de los receptores de la familia ERBB (EGFR y C-erbB-2), corrobarndose en distintos estudios la existencia de una comunicacin recproca entre las vas del RE y la de los factores de crecimiento (Sansbury et al., 1987; Reubi et al., 1989; Cerra et al., 1995; Quenel et al., 1995; Schroeder et al., 1997; Gago et al., 1998). Las lneas celulares RE- expresan cantidades superiores de RNAmEGFR en comparacin con las RE+ probablemente por una regulacin recproca de ambos genes (Lee et al., 1990). La sobreexpresin de C-erbB-2 induce una disminucin de la expresin del RE que es independiente de la estimulacin del RE por su ligando, aunque se ha demostrado que la estimulacin del receptor C-erbB-2 por la heregulina es capaz de inducir la fosforilacin del RE y estimular por este mecanismo la sntesis de progesterona. Paradjicamente, esta estimulacin del RE ocasiona una disminucin de su expresin (Pietras et al., 1995). Berthois et al., (1989) demostraron en las clulas MCF7 la induccin del RE y en menor medida del RPg por la accin del EGF. Tambin se ha podido comprobar experimentalmente en clulas MCF7 la activacin del RE independiente del ligando (estradiol) por el IGF-1 y otros factores de crecimiento, con la consecuente expresin de progesterona, pS2 y catepsina D, protenas que dependen de la va estrognica para su sntesis (Stoica et al., 2000; Wang et al., 2000). Por tanto, estos estudios muestran la existencia de una compleja interconexin entre las diferentes vas de sealizacin.
La positividad para el RE tambin vari inversamente y muy significativamente con la expresin de los antgenos nucleares de proliferacin celular, Ki-67 y PCNA. (Tabla 9). En
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ambos casos la presencia del RE se asoci a bajos ndices de proliferacin celular. Diferentes tcnicas utilizadas para medir la actividad proliferativa celular han confirmado que la ausencia del RE est relacionada con tumores proliferativos, caracterizados por aneuploida y alta gradacin nuclear, en los que se ha producido una prdida de regulacin de la va estrognica o que son estimulados por factores de crecimiento (Silvestrini et al.,1979; Clark et al., 1989) Los cnceres con elevados ndices de ki-67 se asocian significativamente a una disminucin o ausencia del RE, aneuploidia y alto grado nuclear (Gerdes et al., 1986; Weikel et al., 1991; Pelosi et al., 1994; Ioachim et al., 1996; Oehler et al., 1997). En el caso del PCNA, Guillet et al., (1993) observaron que de 3 anticuerpos (PC10, 19A2, KiS1), nicamente el 19A2 se relacion inversamente con el RE.
Hemos apreciado que la inmunotincin positiva para el RE se asoci significativamente con una ausencia de tincin para la p53. (Tabla 9). La expresin de p53 se ha relacionado con la negatividad para el RE, aneuploida, alta gradacin nuclear, mayor tamao tumoral y elevada actividad proliferativa (Cattoretti et al., 1988; Thor et al., 1992; Stenmark-Askmalm et al., 1994; Beck et al., 1995; Soong et al., 1997). La ausencia de expresin de p53 y la positividad para el RE en nuestra serie indica que se mantiene un grado de diferenciacin, as, algunos tumores mantienen su ploida y muestran un menor pleomorfismo nuclear. Por otra parte, la presencia de un nmero reducido de tumores RE+/p53+ pone de manifiesto que hay tumores que mantienen la va estrognica intacta, pero acumulan ciertas alteraciones en el gen p53. Los dos eventos podran adems ser independientes demostrando por tanto, una gran complejidad de las vas de sealizacin.
Un elevado porcentaje de tumores RE+ presentaban inmunotincin positiva para la protena de choque trmico HSp27 (87,9%), aunque esta asociacin careci de significacin estadstica. (Tabla 9). Esta protena de unin al RE mantiene con ste receptor una relacin directa, siendo la mayora de los tumores RE+/Hsp27+, aunque no todos los tumores RE+ expresan la protena Hsp27 (Ciocca et al., 1993; Oesterreich et al., 1996). En la induccin de esta protena tambin intervienen una serie de factores fsicos y qumicos que pueden ser independientes de la presencia del RE (Chretien y Laundry 1988; Santell et al., 1992; Zhou et al., 1993; Faucher et al., 1993; Huot et al., 1995; Konishi et al., 1997).
La positividad del RE se ha relacionado con una ausencia de expresin de la glicoprotena P, aunque la asociacin no es significativa. (Tabla 9). Los resultados en este estudio concuerdan con los descritos por algunos autores qu a pesar de observar una mayor expresin de la glicoprotena P en tumores diploides, as, como en aqullos con altos grados histolgicos, no
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pudieron demostrar asociacin alguna con los parmetros de pronstico clsicos (De la Torre et al., 1995; Wallner et al., 1991). En cambio, Charpin et al., (1994) en un estudio de 213 pacientes sealan una dbil pero significativa asociacin entre la tincin IHQ de la glicoprotena P y el RE. 2-a) Anlisis de la asociacin entre el receptor de progesterona y los parmetros clnico-patolgicos. En nuestra serie, mediante tincin con el Am-PR88 y utilizando un dintel de positividad del 10%, el 59,3% de los cnceres fueron RPg+. (Tabla 4). Este porcentaje se sita dentro del rango publicado en diferentes series basadas en la tincin imunohistoqumica. La expresin del RPg tambin vara dependiendo del estado hormonal y de la presencia del RE (Thorpe et al., 1986, Wenger et al., 1993, Pichon et al., 1996, Balleine et al., 1999).
De manera similar, como sucedi con el RE, hemos observado que el RPg se asoci significativamente con grados nucleares e histolgicos bajos y por tanto, con tumores bien diferenciados. (Tabla 10). El RPg precisa para su sntesis de una va estrognica funcional y al igual que el RE se relaciona con tumores que presentan una buena diferenciacin tumoral y un menor pleomorfismo nuclear (Pichon et al., 1980; Stierer et al., 1993).
A diferencia del RE, se observ un mayor porcentaje de tumores RPg+ en pacientes premenopusicas que en postmenopusicas, aunque las diferencias no fueron estadsticamente significativas. (Tabla 10). Castagnetta et al., (1999) tambin citan la ausencia de diferencias en los patrones de tincin IHQ de pacientes premenopusicas y postmenopusicas. Nuestros datos concuerdan con los observados en varios estudios en los que se describe una mayor proporcin de tumores RPg+ en premenopusicas (Clark et al., 1984; Thorpe et al., 1988; Ferno et al., 1990; Romain et al., 1995).
Hemos objetivado una mayor expresin del RPg en los cnceres multicntricos en comparacin con los tumores nicos y, aunque esta asociacin carece de significacin estadstica, muestra que la mayora de los tumores multicntricos son hormonalmente activos y por ende, dependientes de la va del RE. (Tablas 9 y 10). En este estudio no se ha evidenciado una asociacin estadsticamente significativa entre los RE y RPg y el resto de los parmetros clnico-patolgicos, a excepcin de la gradacin histolgica y nuclear. (Tabla 20). Nuestros datos concuerdan con los publicados por algunos autores (Clark et al., 1984; Berger et al., 1991; Campani et al., 1991; Molino et al., 1992), sin embargo, en la literatura la ausencia de expresin del RPg se ha relacionado con tumores de gran tamao, la presencia de metstasis ganglionares,
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elevada expresin de C-erbB-2, EGFR y p53 y con la disminucin de los niveles de pS2, Catepsina D y Bcl-2 (Gross et al., 1984; Thorpe et al., 1988; Thor et al., 1992; Frankfurt et al., 1997; Thor et al., 1992; Gion et al., 1995).
Tampoco hemos observado diferencias significativas con relacin al tratamiento adyuvante. (Tabla 10). La positividad o negatividad del RPg no fue un criterio de seleccin para la radioterapia ni la quimioterapia y, aunque una discreta mayor proporcin de pacientes con cnceres RPg+ recibieron tamoxifn, la eleccin de la hormonoterapia se bas en la positividad para el RE. 2-b) Anlisis de la asociacin del receptor de progesterona y los marcadores tumorales moleculares. De manera similar como sucedi con el RE, la expresin del RPg en esta serie se relacion significativamente con la presencia de pS2, ausencia del EGFR y C-erbB-2 y con bajos ndices de los antgenos nucleares de proliferacin celular, Ki-67 y PCNA. Por consiguiente, en nuestra serie la expresin del RPg se asoci a caractersticas citolgicas de diferenciacin, baja actividad proliferativa y hormonodependencia. (Tablas 20 y 21).
Adems hemos observado una asociacin directa y significativa entre el RPg y la protena pS2 ya publicada en otros trabajos (Rio et al., 1987; Cappelletti et al., 1992; Thor et al., 1992; Dookeran et al., 1993; Horiguchi et al., 1996; Valeron et al., 1997; Thompson et al., 1998). Esta protena al igual que el RPg dependen de una va estrognica funcional, sin embargo, del mismo modo que se objetiv con el RE, encontramos un porcentaje de tumores RPg+/pS2- (52,9%), as, no todos los tumores RE+ y RPg+ son pS2+ evidenciando una posible prdida del mecanismo de regulacin transcripcional de los estrgenos y de los mecanismos de diferenciacin celular.
La expresin del RPg se relacion muy significativamente con bajos ndices de los antgenos de proliferacin celular ki67 y PCNA (Tabla 10). En la literatura se describe que los cnceres muy proliferativos se caracterizan por una ausencia del RE y RPg y lo contrario sucede en los cnceres con baja expresin de estos antgenos (Charpin et al., 1988; Haerslev et al., 1994; Archer et al., 1995; Schonborn et al., 1995; Ioachim et al., 1996; Oehler et al., 1997; Molino et al., 1997).
Tambin hemos observado una relacin inversa significativa entre la expresin del RPg y el EGFR y el C-erbB-2, con una mayor proporcin de tumores RPg+/EGFR- y RPg+/C-erbB-2.
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(Tabla 10). En el cncer de mama se ha demostrado una reciprocidad de las vas estrognicas y la de los factores de crecimiento, de manera que, siendo el RPg el producto directo de la estimulacin estrognica no es ajena la existencia de una relacin inversa entre este receptor y el EGFR y C-erbB-2 en aquellos tumores que expresan preferentemente el RE (Cappelletti et al., 1988; Cerra et al., 1995; Quenel et al., 1995; Torregrosa et al., 1997; Gago et al., 1998).
La expresin del RPg en este trabajo se relacion con la ausencia de tincin para la protena p53, aunque dicha asociacin no alcanz la significacin estadstica al obtener un valor de p=0,06. (Tabla 10). Varios trabajos citan que la expresin de p53 se asocia a la ausencia del RE y RPg, siendo este fenotipo tumoral considerado de mal pronstico (Ostrowski et al., 1991; Beck et al., 1995; Gohring et al., 1995; Tsuda et al., 1998).
De manera similar, como ocurri con el RE, encontramos un mayor nmero de tumores RPg+ y Hsp27+, aunque no existieron diferencias significativas entre la proporcin de tumores Hsp27 positivos o negativos en el grupo de tumores RPg+ y por tanto, la asociacin careci de significacin estadstica. (Tabla 10). Los niveles de Hsp27 son mayores en los tumores
RE+/RPg+ (King et al., 1986; King et al., 1987; Oesterreich et al., 1996). Algunos autores sin embargo, no han encontrado una asociacin estadsticamente significativa entre la expresin de la protena Hsp27 y el RPg (Cano et al., 1988; Artero Mora et al., 1989). Los resultados en esta serie son similares a los descritos por estos autores con la excepcin de que la determinacin de Hsp27 en estos trabajos se bas en el anlisis inmunoenzimtico.
No se observ una asociacin estadsticamente significativa entre la tincin positiva para el RPg y la catepsina D, aunque si hubo una mayor proporcin de tumores RPg+/catepsina D+. (Tabla 10). Otros autores tampoco han demostrado esta asociacin por mtodos inmunoenzimticos (Maudelonde et al., 1988; Pujol et al., 1993; Barbi et al., 1994) y por mtodos inmunohistoqumicos (Losch et al., 1998). La expresin elevada de Catepsina D puede ser inducida por estrgenos y factores de crecimiento en clulas RE+ (Cavailles et al., 1988; Touito et al., 1991), sin embargo, la sobreexpresin inducida de catepsina D objetivado en tumores RE- se produce constitutivamente por mecanismos an no conocidos (Giamarchi et al. , 1999).
La expresin del RPg se relacion directamente con la tincin positiva de la glicoprotena, aunque esta asociacin no alcanz la significacin estadstica (p=0,09). (Tabla 10). La elevada expresin de glicoprotena P se ha objetivado en cnceres de mama avanzados, siendo la
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mayora de estos tumores RPg-. Para Charpin et al., (1994) la inmunotincin positiva de la glicoprotena P no se correlacion con la expresin del RPg. 3-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la protena pS2 y los parmetros clnico-patolgicos. En este estudio mediante tincin IHQ y utilizando un punto de corte equivalente a un 10% de las clulas teidas, un 28,7% de los tumores fueron considerados pS2+. (Tabla 4). En dos series los porcentajes publicados han sido del 29% y 40% (Schwartz et al., 1991; Molina et al., 1990). En trabajos donde el dintel de positividad se ha fijado en un 5% o ms de clulas teidas los porcentajes han variado entre un 46% - 68% (Thor et al., 1992; Henry et al., 1991; Cappeletti et al., 1992), mientras que empleando un punto de corte del 10%, la expresin de pS2 se ha situado entre un 66% y 77% (Koerner et al., 1992; Dookeran et al., 1993). Destaca que algunos de estos estudios incluan tumores que contenan una reducida proporcin de clulas pS2 (Henry et al., 1991; Thor et al., 1992). El anticuerpo monoclonal que hemos utilizado se obtiene de la estimulacin antignica contra un pptido sinttico de 31 residuos de aminocidos pertenecientes a la regin carboxiterminal de la protena pS2. En cambio, en la serie de Dookeran et al., (1993) un elevado porcentaje de positividad (77%) se consigui empleando un anticuerpo monoclonal inducido contra el pptido intacto, lo que le permite reaccionar con un mayor nmero de sitios antignicos. La expresin de pS2 depende del tipo de anticuerpo monoclonal utilizado, del dintel de positividad elegido y de la presencia del RE, de este modo, las variaciones en los porcentajes de expresin entre las distintas series y la nuestra, se deben principalmente a las diferencias en la sensibilidad de los anticuerpos monoclonales y al dintel de positividad elegido.
En nuestra serie la expresin de pS2 se relacion significativamente con grados histolgicos y nucleares bajos, es decir, con tumores bien diferenciados. (Tabla 11). Esta asociacin de tipo inversa es similar a la observada entre los receptores hormonales y la gradacin nuclear e histolgica y concuerda con la descrita en la mayora de las series consultadas en donde la expresin de pS2 disminuye en los cnceres indiferenciados (Henry et al., 1991; Thor et al., 1992; Cappelletti et al., 1992; Dookeran et al., 1993; Spyratos et al., 1994; Racca et al., 1995).
No se encontr una asociacin estadsticamente significativa entre la expresin de la pS2 y el estado hormonal, ya que la proporcin de tumores pS2+ en pacientes premenopusicas y postmenopusicas fue similar. (Tabla 11). Algunos autores refieren valores significativamente menores de pS2 en pacientes postmenopusicas en comparacin con mujeres con ciclos menstruales activos (Pujol et al., 1999), sin embargo, en esta serie como ha sucedido en otras
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(Thor et al., 1992; Cappelletti et al., 1992; Dookeran et al., 1993; Racca et al., 1995) no objetivamos una asociacin significativa entre la expresin de pS2 y el estado menstrual. Estos datos parecen indicar que la expresin de pS2 depende de la estimulacin estrognica, pero es independiente del estado hormonal de las enfermas.
En nuestra serie, de manera similar como ocurri con el RE y RPg, esta protena no mostr una asociacin con el tamao tumoral, afectacin ganglionar, tamao ganglionar y tipo de tumor. (Tabla 11). Esta carencia de asociacin entre la expresin de pS2 y el tamao tumoral se ha observado tanto en series donde la determinacin de pS2 se ha efectuado por mtodos inmunoenzimticos (Foekens et al., 1990) como por tinciones inmunohistoqumicas (Cappelletti et al., 1992; Dookeran et al., 1993). En contraste, Henry et al., (1991) describieron en su serie que los tumores pequeos y bien diferenciados tean intensamente. Autores como Foekens et al., 1990; Thor et al., 1992; Cappelletti et al., 1992 y Dookeran et al., 1993, no encontraron diferencias significativas entre la expresin de pS2 y el estado ganglionar y el estadio T. De este modo, la ausencia de asociacin con los parmetros de pronstico clsicos, salvo la gradacin histolgica y nuclear, tambin observada con los receptores hormonales, se mantienen con esta protena dependiente de la va del RE. As, la protena pS2 parece relacionarse con el grado de diferenciacin de un tumor y es independiente del tamao tumoral y de la afectacin ganglionar, salvo los tumores de gran tamao y con ganglios positivos que adems muestran caractersticas citolgicas de desdiferenciacin.
El 41,3% de tumores pS2+ no recibieron radiaciones ionizantes frente a un 22,2% de los pS2+ radiados, siendo estas diferencias significativas y que se deben a un mayor nmero de mastectomas en el grupo no radiado. (Tabla 11). Tambin a un mayor porcentaje de pacientes pS2+ no se les administr quimioterapia ni tamoxifn, aunque en estos casos las diferencias no fueron significativas. Estas enfermas haban sido consideradas de buen pronstico y sometidas a vigilancia exclusivamente. 3-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la protena pS2 y los marcadores tumorales moleculares. En nuestro estudio hemos observado que esta protena al igual que el RE y RPg se asoci a bajos grados histolgicos (p=0,04) y nucleares (p=0,04) y a la presencia del RE (p=0,004), RPg (p=0,02) y catepsina D (p=0,02). (Tablas 20 y 21). Por consiguiente, este marcador se ha relacionado con caractersticas citolgicas de diferenciacin y de dependencia hormonal.
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En esta serie hemos observado una relacin directa y estadsticamente significativa entre la expresin de pS2 y catepsina D. (Tabla 11). Una asociacin positiva significativa entre la protena pS2 y los receptores hormonales y la catepsina D ha sido descrita en estudios inmunoenzimticos e inmunohistoqumicos y que parece lgica si consideramos que los estrgenos y factores de crecimiento inducen la expresin de ambas protenas por interaccin con sus regiones promotoras (Cavailles et al., 1993; Gianmarchi et al., 1999). Este tipo de asociacin entre la pS2 y los receptores de estrgeno y progesterona ya comentada, ha sido descrita por varios autores (Foekens et al., 1990; Thor et al., 1992, Cappelletti et al., 1992; Dookeran et al., 1993; Detre et al., 1994; Spyratos et al., 1994). Ardanavis et al., (1997) citan una asociacin significativa entre la pS2 y la catepsina D. En contraste, Racca et al., (1995) que tambin midieron la expresin de pS2 por mtodos bioqumicos, no observaron una asociacin significativa entre los niveles de pS2 (punto de corte 11 ng/mg) y la catepsina D.
La pS2 se relacion directamente, aunque sin significacin estadstica, con la protena Hsp27. (Tabla 11). La Hsp27 es tambin una protena regulada por los estrgenos y una asociacin positiva con los RE y pS2 fue publicada por Thor et al., (1991). Los datos de nuestra serie tambin sugieren una relacin directa entre ambas. Por otra parte, aunque las dos protenas dependen de la va del RE para su sntesis, otros factores aparte de los estrgenos tambin pueden intervenir en la estimulacin y sntesis de ambas y podran explicar las diferencias observadas (Giamarchi et al., 1999; Osterreich et al., 1996; Kiang et al., 2000).
Tambin se apreci una discreta mayor proporcin de tumores pS2+/C-erbB-2+, aunque las diferencias con relacin a tumores pS2+/CerbB-2- no han sido significativas. (Tabla 11). In vitro se ha demostrado que la expresin de C-erbB-2 disminuye por estimulacin estrognica, mientras que la pS2-RNAm aumenta y por tanto, es de esperar una relacin inversa (Warri et al., 1991). Otros autores por mtodos inmunoenzimticos (Valeron et al., 1997) y por IHQ (Rio et al., 1987) no han podido constatar una relacin estadsticamente significativa entre la pS2 y el C-erbB-2.
En esta serie la expresin de pS2 vari inversamente con la del EGFR, evidenciando una mayor proporcin de tumores pS2+/EGFR- que de pS2+/EGFR+, aunque en este caso la asociacin tampoco alcanz la significacin estadstica. (Tabla 11). Una relacin inversa significativa fue descrita por Foekens et al., 1990, empleando enzimoinmunoanlisis. La pS2 tambin puede ser inducida por el EGF (El-Tanani y Green, 1997), sin embargo, en esta serie, dada la asociacin significativa con el RE, el mayor nmero de tumores RE+ que EGFR+ y
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siendo el estradiol su principal inductor, es muy probable que la mayora de los tumores pS2+ dependan ms de la va estrognica que de la va de los factores de crecimiento.
En nuestro estudio ms de la mitad de los tumores pS2+ fueron PCNA y Ki-67 negativos. Sin embargo, a diferencia de otras series (Henry et al., 1991; Cappelletti et al., 1992) en la nuestra, la asociacin con los antgenos de proliferacin celular careci de significacin estadstica. (Tabla 11). No obstante, el nmero de tumores pS2+ en esas series fue considerablemente superior a los registrados en este trabajo. De manera similar, como sucedi con los cnceres RE+ y RPg+, una mayor expresin de pS2+ se ha observado en los tumores con baja actividad proliferativa.
Hubo tambin una mayor proporcin de tumores pS2+/p53- en comparacin con pS2+/p53+, siendo esta relacin inversa y similar a la observada entre el RE y p53, aunque en este caso la asociacin tambin careci de significacin estadstica. (Tabla 11). Se ha demostrado que la expresin de p53 vara inversamente con los niveles de pS2 (Thompson et al., 1990).
Se observ una relacin directa entre la expresin de pS2 y la glicoprotena P, siendo la proporcin de tumores pS2+/glicoprotena P+ superior a los pS2+/glicoprotena P-. (Tabla 11). Sin embargo, el grado de asociacin no fue estadsticamente significativo de manera anloga al observado entre el RE y la glicoprotena P. Charpin et al., (1994) sealan una dbil asociacin de la glicoprotena P con el RE y la ausencia con el RPg y pS2. Estos datos parecen indicar que la expresin de ambas protenas son eventos independientes. 4-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la protena Hsp27 y los parmetros clnico-patolgicos. Mediante tincin IHQ con el Am-D5 se demostr que el 72,2% de los tumores fueron Hsp27+. (Tabla 4). En el cncer de mama los porcentajes de tincin positiva fluctan entre un 40-70%, aunque los patrones de tincin varan en funcin del estado hormonal y del fenotipo tumoral (Ciocca et al., 1993; Araya et al., 1994).
En esta serie hemos objetivado una asociacin directa significativa entre la expresin de Hsp27 y la gradacin histolgica. Esta relacin tambin se observ con la gradacin nuclear, aunque en este caso la asociacin careci de significacin estadstica. (Tabla 12). De este modo, en este estudio la expresin de Hsp27 se corresponde con una baja diferenciacin celular y contrasta con la publicacin de Love et al., (1994), donde la mxima expresin de Hsp27 se objetiv en tumores bien diferenciados. No obstante, en varios estudios la expresin de Hsp27
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se ha relacionado con tumores muy proliferativos, con el fenmeno de diseminacin metastsica y con la induccin de resistencia a la doxurobicina, y por tanto, con tumores de mayor agresividad (Lemieux et al., 1997; Oesterreich et al., 1993; Fuqua et al., 1994; Kolar et al., 1998).
Tambin se ha observado una mayor proporcin de cnceres Hsp27+ en pacientes premenopusicas en comparacin con las postmenopusicas (Tabla 12). Sin embargo, este dato careci de significacin estadstica y es contrario al publicado por Artero Mora et al., (1989) y Cano et al., (1989) que citan un mayor nmero de tumores Hsp27+ en pacientes postmenopusicas. A diferencia de la serie que nos ocupa, estos estudios emplearon el mtodo inmunorradiomtrico para medir la expresin de la protena, aunque por medio de tincin IHQ Love et al., (1994) tambin demostraron una mayor expresin de Hsp27 en pacientes postmenopusicas.
No se encontr asociacin con el tamao tumoral, el tipo de tumor, el grado nuclear, la afectacin ganglionar, tamao de los ganglios y el desbordamiento de la cpsula ganglionar. (Tabla 12). En los trabajos donde la determinacin de la Hsp27 se ha realizado por mtodos inmunoenzimticos no se han objetivado diferencias significativas entre cnceres Hsp27 positivos y negativos con relacin a estos parmetros (Cano et al., 1988; Artero-Mora et al., 1989; Marsigliante et al., 1992). En cambio, en los estudios inmunohistoqumicos s se ha observado una asociacin estadsticamente significativa entre la expresin de Hsp27 y la afectacin ganglionar y los estadios T avanzados (Thor et al., 1991; Love et al., 1994). En nuestro estudio se apreci una discreta mayor proporcin de tumores Hsp27+ en tumores con ganglios axilares positivos, con ms de 4 ganglios afectados, con el desbordamiento de la cpsula ganglionar y con tumores con un grado nuclear III, sin embargo, las diferencias son escasas y carecen de significacin estadstica. En la serie que nos ocupa los porcentajes de expresin de la Hsp27 tambin han sido superiores a los publicados en otras series: 55% en el estudio de Heyderman et al.,(1989); 26% en tumores con ganglios negativos y 45% con ganglios positivos en la serie de Thor et al., (1991); y 43% en la de Tetu et al., (1995). En estos trabajos se han empleado distintos anticuerpos monoclonales, as, los resultados discordantes podran deberse a la gran variabilidad en los porcentajes de tincin producto de las diferentes sensibilidades de los anticuerpos y de la metodologa empleada.
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4-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la protena Hsp27 y los marcadores tumorales moleculares. En nuestra serie hemos observado una asociacin significativa entre la expresin de la Hsp27 y elevados ndices de PCNA. Esta asociacin careci de significacin estadstica con el antgeno Ki-67 (p=0,08), aunque tambin se evidenci una mayor proporcin de tumores Hsp27+/Ki67+. (Tabla 12). En la literatura la deteccin positiva de Hsp27 se ha relacionado significativamente con: el crecimiento celular in vitro, tumores avanzados, invasin tumoral, y con la induccin de resistencia a drogas. Las Hsp27 pueden participar en el crecimiento de los tumores y en la resistencia a ciertos agentes citotxicos. La expresin de Hsp27 en tumores con elevados ndices de los antgenos de proliferacin celular sugiere la participacin de esta protena en el crecimiento celular (Mahvi et al., 1993; Lemieux et al., 1997; Oesterreich et al., 1993; Fuqua et al., 1994; Kolar et al., 1998). En nuestro estudio la Hsp27 se ha relacionado con tumores proliferativos y con rasgos citolgicos de desdiferenciacin.
La relacin tambin fue directa con la expresin de C-erbB-2, p53, catepsina D y glicoprotena P, con una mayor proporcin de tumores Hsp27+/C-erbB-2+, Hsp27+/p53+, Hsp27+/catepsina D+, aunque en ningn caso la asociacin entre la Hsp27 y estos marcadores fue estadsticamente significativa. (Tabla 12). Con relacin a los receptores hormonales y a la pS2 la relacin tambin ha sido directa y sin significacin estadstica (ver 1-b, 2-b, 3-b). Los resultados de los trabajos publicados son discordantes encontrando algunos una asociacin significativa con los RE (Coffer et al., 1985; King et al., 1986; Giani et al., 1989; Nardelli et al., 1989; Takahashi et al., 1995) y pS2 (Thor et al., 1991), mientras que otros, sealan la ausencia de relacin con los RE y RPg (Cano et al., 1988; Van der Walt et al., 1988; Artero Mora et al., 1989). Marsigliante et al.,(1992), mediante enzimoinmunoanlisis, describen una asociacin significativa entre la Hsp27 y la catepsina D. La relacin con C-erbB-2 y p53 vara inversamente con los tumores RE+/Hsp27+ (Takahashi et al., 1995). 5-a) Anlisis de la asociacin entre el EGFR y los parmetros clnicopatolgicos. Utilizando el Am-E30 y un dintel de positividad del 10% o ms de las clulas teidas, un 16,7% de los cnceres en esta serie fueron considerados EGFR+. (Tabla 4). Los porcentajes de positividad determinados mediante mtodos inmunoenzimticos y tincin IHQ varan en la literatura entre un 14-93% (Klijn et al., 1994), aunque cifras alrededor del 30% se registraron con mayor frecuencia (Toi et al., 1988; Battaglia et al., 1988; Cattoretti et al., 1988; Murphy et al., 1990; Gasparini et al., 1992; Osaki et al., 1992; Schroeder et al., 1997;Ratnakar et al., 1998). El porcentaje de positividad que hemos encontrado en esta serie se encuentra dentro del
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rango publicado aunque, debido a la relacin recproca observada entre el EGFR y el RE, la baja expresin del EGFR en esta serie prodra ser la consecuencia de un elevado porcentaje de tumores RE+ (apartado 1-b).
Los tumores con una gradacin histolgica y nuclear III presentaron una elevada expresin del EGFR en comparacin con aquellos clasificados en GH y GN II y I (Tabla 13). De este modo, en nuestra serie la expresin del EGFR se relacion muy significativamente con tumores indiferenciados. La expresin de este receptor se ha correlacionado con la gradacin histolgica en diversos estudios inmunohistoqumicos, as, los tumores indiferenciados se tien con mayor intensidad (Sainsbury et al., 1987; Delarue et al., 1988; Pirinen et al., 1995). Tambin se ha demostrado un incremento en la expresin de este receptor en las metstasis ganglionares con respecto a sus tumores primarios, siendo generalmente estos tumores de mayor tamao e indiferenciados (Sainsbury et al., 1985; Battaglia et al., 1988).
No hemos encontrado diferencias significativas en la expresin del EGFR con relacin al estado hormonal, tipo de tumor y tamao tumoral. Sin embargo, los porcentajes de positividad observados para el EGFR fueron mayores en tumores en estadio N2, con afectacin de 4 o ms ganglios y similares en los distintos estadios T. (Tabla 13). Tampoco hubo diferencias con relacin al tipo de tratamiento adyuvante administrado. Ratnakar et al., (1998) sealan una mayor expresin de este receptor en las pacientes postmenopusicas. Algunos autores describen que la expresin del EGFR se relaciona significativamente con tumores grandes, con la invasin ganglionar y con una alta gradacin histolgica (Sainsbury et al., 1987; Delarue et al., 1988; Battaglia et al., 1988; Torregrosa et al., 1997). Nuestros resultados concuerdan con los observados por otros autores que no han objetivado una asociacin entre la expresin del EGFR y el tamao tumoral, grado histolgico, afectacin ganglionar y diferenciacin histolgica (Wrba et al., 1988; Gasparini et al., 1992; Toi et al., 1994; Klijn et al., 1994; Pirinen et al., 1995; Schroeder et al., 1997; Oehler et al., 1997). Estos trabajos han sido realizados con tinciones inmunohistoqumicas empleando diferentes anticuerpos monoclonales y la mayora concuerdan en que la expresin del EGFR no se relacion significativamente con los parmetros clnico-patolgicos. Cerra et al., (1995), mediante determinacin inmunoenzimtica del EGFR han obtenido resultados similares. 5-b) Anlisis de la asociacin entre el EGFR y los marcadores tumorales moleculares. En nuestro estudio la tincin positiva para el EGFR se ha relacionado con tumores indiferenciados (p=0,003) y con la ausencia de expresin del RE (p=0,00002) y el RPg
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(p=0,02). (Tabla 20). Por consiguiente, la expresin del EGFR va ligada a una ausencia de hormonodependencia y a la desdiferenciacin celular. En nuestra serie la positividad del EGFR solo podra explicar la patognesis en un pequeo porcentaje de los cnceres. Adems, la ausencia de expresin del EGFR se relacion significativamente con una elevada positividad para el RE, lo que sugiere que en un importante porcentaje de tumores su crecimiento depende ms de la va de sealizacin estrognica. Esta relacin inversa entre el EGFR y los receptores hormonales (apartado 1-b) es descrita en estudios inmunoenzimticos (Prez et al., 1984; Sainsbury et al., 1985; Wyss et al., 1987; Nicholson et al., 1988; Pekonen et al., 1988; Battaglia et al., 1988; Cappelletti et al., 1988; Cerra et al., 1995) e inmunohistoqumicos (Sansbury et al., 1987; Cattoretti et al., 1988; Klijn et al., 1994; Schroeder et al., 1997; Ruibal et al., 1999). En contraste, no hemos observado una asociacin estadsticamente significativa con las protenas dependientes del RE, la pS2 y la catepsina D. Las diferencias entre las proporciones de tumores EGFR+/pS2+ y EGFR+/pS2- y EGFR+/catepsina D+ y EGFR+/catepsina D- no fueron significativas. (Tablas 11 y 13). La falta de asociacin en comparacin con la observada con el RE, se debe al mayor nmero de tumores RE+/EGFR- (n=56), que pS2+/EGFR- (n=24), y catepsina D+/EGFR- (n=33). (Tabla 9,11 y 13).
En nuestra serie la tincin positiva para el EGFR vari directamente con la inmunotincin del C-erbB-2, aunque el nmero de tumores que tieron positivamente para ambos receptores fue reducido (n=12) y la asociacin fue dbil (p=0,07). (Tabla 13). Esta relacin concuerda con los datos sealados en la literatura donde, adems, la expresin simultnea del EGFR y C-erbB2 es considerada de mal pronstico ( Nicholson et al., 1993; Newby et al., 1997; Torregrosa et al., 1997; Naidu et al., 1998; Ratnakar et al., 1998). Sin embargo, para Gusterson et al., (1987); Osaki et al., (1992) y Toi et al., (1994), la expresin del EGFR no se relacion con la de CerbB-2. La expresin conjunta de ambos receptores puede ocasionar un aumento en la va de sealizacin del EGFR como han demostrado experimentalmente Worthylate et al., (1999). De este modo, la sobreexpresin de C-erbB-2 produce una activacin constitutiva de ambos receptores y una inhibicin del proceso de regulacin de los niveles de los receptores EGFR que se traduce en un aumento de la proliferacin y el crecimiento celular.
Se observ una mayor proporcin de tumores EGFR+/Ki67+ y EGFR+/PCNA+ que de EGFR+/Ki67- y EGFR+/PCNA-, siendo la relacin con estos antgenos directa, aunque sin significacin estadstica. (Tabla 13). Gasparini et al., (1992) citan una pobre asociacin del EGFR con el Ki67 que mantienen (p=0,07) en un estudio ms amplio realizado en 1994. En cambio, en otras publicaciones se hace referencia a la asociacin significativa entre el EGFR y el Ki67 (Nicholson et al., 1993; Cerra et al., 1995; Ioachim et al., 1996; Oeheler et al., 1997) y
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el PCNA (Sherestha et al., 1992; Frassoldati et al., 1997). En consecuencia, este marcador tumoral molecular va ligado a tumores con una elevada actividad proliferativa (fase S alta, Ki67+), ausencia del RE y un peor pronstico.
Tambin observamos una relacin directa con el p53, con una mayor proporcin de tumores EGFR+/p53+ en comparacin con EGFR+/p53-, aunque esta asociacin careci de significacin estadstica. (Tabla 13). La proliferacin celular estimulada por los factores de crecimiento pueden favorecer la acumulacin de alteraciones genticas y estas a su vez, ocasionaran una desinhibicin facilitando el crecimiento celular estimulado por la va de los factores de crecimiento. Para Gasparini et al., (1994) la asociacin entre el EGFR y p53 fue dbil (p=0,06). Una relacin directa entre el EGFR y la p53 ha sido citada por Cattoretti et al., (1988).
Se ha observado una relacin inversa sin significacin estadstica entre la expresin del EGFR y la glicoprotena P. (Tabla 13). No obstante, el reducido nmero de casos limita nuestros resultados. Clarke et al., (1992) hacen referencia a que la sobreexpresin de MDR1 (glicoprotena P) se asocia a tumores RE- y una elevada expresin del EGFR, siendo la asociacin positiva en este caso. 6-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin del oncogn C-erbB-2 (p185.C-erbB-2) y los parmetros clnico-patolgicos. Mediante tincin IHQ con el Am-CB11 y estableciendo un dintel de positividad del 10% o ms de las clulas teidas, un 42,6% de los tumores fueron C-erbB-2+. (Tabla 4). Los porcentajes de positividad en este estudio se encuentran dentro del rango descrito en la literatura, que para los cnceres ductales infiltrantes vara entre un 1152,7% (Slamon et al., 1987; Allred et al., 1992; Dawkins et al., 1993; Stal et al., 1994; Marks et al., 1994; Quenel et al., 1995; Balsari et al., 1999; Yokota et al., 1999; Molina et al., 1999; Shimizu et al., 2000; Jakic-Razumovic et al., 2000). La tincin IHQ permite la determinacin de la sobreexpresin de la protena exclusivamente. Sin embargo, estos datos pueden ser analizados con relacin al pronstico ya que varios trabajos han demostrado la existencia de una buena correlacin entre la amplificacin del gen medida por Southern blot y la sobreexpresin determinada por mtodos inmunoenzimticos e inmunohistoqumicos (Venter et al., 1987; van de Vijver et al., 1988; Slamon et al., 1989; Borg et al., 1990; Hanna et al., 1990; Ciocca et al., 1992; Dawkins et al., 1993; Marks et al., 1994; Dalifard et al., 1998).
En este estudio objetivamos una mayor expresin de C-erbB-2 en tumores de tamao superior a los 2 cm y con alta gradacin histolgica, aunque estos datos carecieron de
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significacin estadstica. (Tabla 14). Tampoco se evidenci una asociacin significativa entre la expresin de C-erbB-2 y el estado hormonal, el tipo de tumor, la afectacin ganglionar, el grado nuclear y el estadiaje. Los datos en esta serie concuerdan con los publicados por varios autores que sealan una ausencia de asociacin entre la expresin de C-erbB-2 y los parmetros de pronstico clsicos: edad, tamao tumoral, afectacin ganglionar, gradacin histolgica y nuclear (van de Vijver et al., 1988; Clark y McGuire 1991; OReilly et al., 1991; Ciocca et al., 1992; Marks et al., 1994). Gullick et al., (1991) observaron en una serie de 183 cnceres de mama que la tincin IHQ de C-erbB-2 se relacion significativamente con altos grados histolgicos, pero careci de asociacin con el resto de los parmetros clnico-patolgicos. Por el contrario, otros investigadores inicialmente han encontrado que la amplificacin del gen CerbB-2 se relacionaba con parmetros clsicos de mal pronstico: mayor tamao tumoral, afectacin ganglionar, afectacin de ms de 4 ganglios, alta gradacin histolgica y nuclear (Slamon et al., 1987; Zhou et al., 1987; Berger et al., 1988; Tavassoli et al., 1989; Rilke et al., 1991; Delarue et al., 1994). Posteriormente la medicin de la sobreexpresin por mtodos inmunohistoqumicos en algunos casos ha constatado una asociacin entre tumores C-erbB-2+ con los parmetros clnico-patolgicos clsicos (Gusterson et al., 1988; Iglehart et al., 1990; Baak et al., 1991; Ciocca et al., 1992; Marks et al., 1994; Quenel et al., 1995; Jakic-Razumovic et al., 2000). As, los resultados publicados en la literatura son discordantes. Tambin algunos autores (Varley et al., 1987; Potter et al., 1990; Barnes et al., 1992; Stal et al., 1994; Wiesener et al., 1998) consideran que la expresin de C-erbB-2 puede estar relacionada con la proliferacin celular y la afectacin ganglionar, sin embargo, este hecho no ha podido ser demostrado fehacientemente en otros estudios que midieron la actividad proliferativa celular mediante tincin IHQ para el Ki-67 (Kommos et al., 1990; Bacus et al., 1990).
No se observaron diferencias significativas con relacin a la positividad de C-erbbB-2 y recibir tratamiento adyuvante, aunque a un nmero importante de pacientes C-erbB-2+ (n=27) no fueron radiadas. (Tabla 14). La administracin de citotxicos se relacion con un grupo de tumores RE+/C-erbB-2+ (n=26), considerados de mal pronstico (Allred et al., 1992; Wright et al., 1992; Borg et al., 1994; Houston et al., 1999). 6-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin del oncogen C-erbB-2 (p185. C-erbB-2) y los marcadores tumorales moleculares. En esta serie hemos objetivado que la expresin de C-erbB-2 se ha relacionado con la ausencia del RE y RPg (p=0,05) y dbilmente con la sobreexpresin de Ki-67 (p=0,05), PCNA, (p=0,08) y EGFR (p=0,08). (Tabla 21). De este modo, la expresin de C-erbB-2 se ha asociado, aunque dbilmente, con la independencia hormonal, con la proliferacin celular y con la va de
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los factores de crecimiento. Pietras et al., (1995) demostraron experimentalmente que el CerbB-2 al ser estimulado por la heregulina era capaz de inducir una disminucin de la expresin de los RE y, paradjicamente, estimular la actividad del RE independiente del estradiol ocasionando la sntesis de progesterona. La mayora de los trabajos publicados basados en tcnicas inmunohistoqumicas citan la relacin inversa entre la expresin de C-erbB-2 y los receptores hormonales (Gusterson et al., 1988; OReilly et al., 1991; Ciocca et al., 1992; Allred et al., 1992; Stal et al., 1994; Delarue et al., 1994; Quenel et al., 1995). Por otra parte, la reciprocidad de las vas tampoco excluye que tumores RE+ puedan crecer por la activacin del oncogen C-erbB-2 (Pietras et al.,1995) y de hecho, se ha sealado que un grupo de tumores RE+/C-erbB-2+ se comportan agresivamente (Allred et al., 1992; Wight et al.,1992; Borg et al.,1994).
Hemos objetivado una asociacin directa entre la sobreexpresin de C-erbB-2 y los antgenos nucleares de proliferacin celular, principalmente con el Ki-67 y en menor medida con el PCNA. (Tabla 14). Inicialmente mediante la medicin de la fraccin S por citometra de flujo se observ una correlacin entre la sobreexpresin de la protena y el crecimiento celular (Gusterson et al., 1988; van de Vijver et al., 1988; Baak et al., 1991; Ciocca et al., 1992) que posteriormente tambin se demostr con los estudios inmunohistoqumicos para el Ki-67 y el PCNA (Archer et al., 1995; Ioachim et al., 1996; Wiesener et al., 1998; Gago et al., 1998). As, los tumores C-erbB-2+ tienden a ser proliferativos y su sobreexpresin le concede un fenotipo capaz de crecer independiente de la presencia de factores de crecimiento mitognicos (IGF-1 y EGF) para la clula mamaria, aunque tambin pueden hacerlo de manera sinrgica con stos (Ethier y Cundiff, 1987; Ram et al., 1996; Woods Ignatoski et al., 1999). La C-erbB-2 se encuentra constitutivamente fosforilada en los cnceres de mama que sobreexpresan este receptor; propiedad que favorece el crecimiento independiente del IGF-1 y el EGF. Adems, la activacin constitutiva de C-erbB-2 produce un aumento progresivo en los niveles de C-erbB-3 (Woods Ignatoski et al., 1999). La heregulina posee la propiedad de actuar como un mitgeno similar al IGF-1 o al EGF (Ram et al., 1995; Ethier et al., 1996) y puede activar el C-erbB-2 al formar ste un heterodmero con C-erbB-3. El C-erbB-3 y en menor medida el C-erbB-2 es un potente activador de la va de la fosfatidil inositol 3 cinasa (PI 3) utilizada por el IGF-1. Se ha demostrado experimentalmente que la actividad mitognica del IGF-1 en las clulas mamarias depende de la integridad de sitios de unin en el C-erbB-2 (Myers et al., 1996). De este modo, el C-erbB-2 activado puede estimular la va PI 3 cinasa del IGF-1 y la va de las MAP cinasas del EGF (Marte et al., 1995). Tambin se ha objetivado que muchas clulas inducen la muerte celular programada por bloqueo de los receptores de IGF-1, de la va de la PI 3 cinasa o de la Akt cinasa activada por PI 3 cinasa. As, el C-erbB-2 es un potente oncogn capaz de inducir la
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proliferacin celular y evitar la muerte celular programada (Kulik et al., 1997; King et al., 1997).
A diferencia de otros autores, que mediante tcnicas inmunohistoqumicas han demostrado una asociacin significativa entre la expresin de C-erbB-2 y p53 (Iwaya et al., 1991; Isola et al., 1992; Stenmark-Askmalm;1994; Tsuda et al., 1998), en nuestra serie, al igual que en la serie de Marks et al., 1994 y en la de Harbeck et al., 1998 (ganglios negativos), no se ha observado una asociacin significativa con la p53, siendo la proporcin de tumores C-erbB-2+/p53+ y CerbB-2+/p53- similar. (Tabla 14). Diversos trabajos que han analizado las alteraciones del gen p53 han corroborado que la sobreexpresin de la protena p53 se asocia a tumores con amplificacin de C-erbB-2, elevados ndices de ki67 y ausencia del RE. La expresin conjunta de ambos marcadores se relaciona con parmetros de mal pronstico (Seshadri et al., 1996; Iacopetta et al., 1998). Adems, la amplificacin del gen C-erbB-2 en algunos cnceres de mama antecede a las alteraciones observadas en el gen p53, por tanto, los dos eventos pueden ocurrir de manera independiente y progresivamente (Barnes et al., 1992; Liu et al., 1992; Smith et al., 2000). En la serie de Rudolph et al., (1999), aunque no existi un correlacin significativa entre el C-erbB-2 y la p53, ambos se relacionaron significativamente con tumores de mayor tamao, alta gradacin histolgica, aneuploida, ausencia de receptores hormonales, elevada expresin de la topoisomerasa II alfa y de Ki-67. Lukas et al., (2000) han sealado que las mutaciones en el gen p53 pueden producirse precozmente y durante la progresin del cncer, o ser incluso independientes o estar relacionados con otros eventos.
En nuestra serie no hemos encontrado una asociacin estadsticamente significativa entre la expresin de C-erbB-2, la Hsp27, la catepsina D y la glicoprotena P. Para Brouillet et al., (1990) los niveles elevados de catepsina D no se relacionaron con la sobreexpresin de CerbB2. (Tabla 14). Isola et al., (1993) en su estudio de 262 cnceres con ganglios negativos no encontraron una correlacin significativa entre la expresin de C-erbB-2 y la catepsina D. Harbeck et al., (1999) en su anlisis de correlaciones entre marcadores tumorales moleculares en pacientes con ganglios negativos, tampoco encontraron asociacin alguna. Wallner et al., (1991) no encontraron asociacin alguna entre la expresin de C-erbB-2 y los niveles de RNAm-MDR1. Hegewisch-Becker et al., (1998) tampoco objetivaron, mediante RT-PCR para el RNAm-MDR1 o por IHQ, una correlacin entre la glicoprotena P y el C-erbB-2. Estos datos sugieren que la expresin de un marcador u otro pueden no depender entre s.
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7-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin del antgeno nuclear de proliferacin celular Ki-67 y los parmetros clnico-patolgicos. Empleando el MIB-1 y como punto de corte la mediana del valor correspondiente a un 15% de los ncleos teidos, un 42,6% de los tumores fue considerado ki67+. (Tabla 4). Este anticuerpo ha demostrado ser de utilidad en las muestras parafinadas y comparable e incluso superior al Ki-67 clsico (Barbareschi et al., 1994; Weidner et al., 1994). Una buena parte de los investigadores utilizan la mediana para establecer el dintel de positividad, puesto que para este marcador no se ha fijado an el punto de corte preciso (Gerdes et al., 1984; Wintzer et al., 1991; Sahin et al., 1991; Gaglia et al., 1993; Barbareschi et al., 1994). Sobre la base de la mediana es posible separar dos grupos de poblaciones tumorales, una con un elevado ndice de clulas Ki-67 o tumores muy proliferativos y otra con un ndice Ki-67 bajo, es decir, tumores cuyas clulas se multiplican en menor nmero o lo hacen a un ritmo mas lento. Otra posibilidad es establecer una curva ROC para determinar cul es el porcentaje ideal que debe ser usado como dintel de positividad, aunque este mtodo se aplica a estudios retrospectivos. Sin embargo, la mediana se convierte en el mejor parmetro de discriminacin de tumores con elevada y baja expresin de Ki-67, especialmente en aquellos cuya distribucin de clulas Ki-67 no sigue una distribucin Gaussiana. Los ndices de expresin de este marcador determinado mediante tincin IHQ en las lesiones benignas de la mama son muy bajos de 0 a 4%, en comparacin con los cnceres que varan de 3 a 98% (Dervan et al. , 1989). En consecuencia, el valor de la mediana se situara fuera del rango considerado normal para el tejido mamario sano. Varios trabajos han corroborado la utilidad del antgeno Ki67 para medir la fraccin de crecimiento de una poblacin celular, siendo comparable a mtodos precisos como la autorradiografa con timidina tritiada, el nmero de AgNOR, la citometra de flujo y la tincin con bromodeuxiridina (Silvestrini et al., 1988; Dervan et al., 1989; Ruschoff et al., 1990; Sahin et al., 1991; McGrogan et al., 1997).
En nuestra serie los valores de Ki-67 por encima de la mediana se asociaron significativamente a altos grados histolgicos (p=0,0004) y nucleares (p=0,0007) y por ende, con tumores con arquitectura citolgica de desdiferenciacin. (Tabla 15). En la mayora de los trabajos revisados se cita que la expresin del antgeno va ligada a tumores muy proliferativos (elevado ndice mittico, alta fraccin S), aneuploida y con elevada gradacin histolgica y nuclear (Charpin et al., 1988; Bouzubar et al., 1989; Ruschoff et al., 1990; Vielh et al., 1990; Sahin et al., 1991; Weikel et al., 1991; Pelosi et al., 1994; Weidner et al., 1994; Pinder et al., 1995; McGrogan et al., 1997; Midulla et al., 1999; Harbeck et al., 1999).
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En este estudio hemos observado una relacin directa entre la expresin de Ki67 y el tamao tumoral, siendo el porcentaje tumores Ki-67+/T3 superior a Ki-67+/T1, aunque las diferencias no fueron estadsticamente significativas (p=0,09). (Tabla 15). Tampoco se encontraron diferencias significativas entre la expresin de Ki-67 y la afectacin ganglionar, nmero de ganglios, tamao ganglionar, rotura de la cpsula ganglionar, tipo de tumor, estado hormonal y el estadiaje. (Tabla 15). Sin embargo, la tendencia observada fue una mayor expresin de Ki-67 en tumores con ganglios N2 y cpsula rota (Tabla 15). Autores como Barnard et al., (1987) tambin han encontrado una dbil asociacin entre la inmunotincin positiva del antgeno Ki-67 y el tamao tumoral, el estado ganglionar y el estado hormonal. Pinder et al., (1995) en una serie de 177 cnceres citan una correlacin significativa con el tamao tumoral que fue independiente de la afectacin ganglionar y del estado hormonal. Otros autores no han evidenciado una correlacin entre la expresin del antgeno y el tamao tumoral y las metstasis ganglionares (Lelle et al., 1987; McGurrin et al., 1987; Weikel et al., 1991; Campani et al., 1991). No obstante, diversas series que incluyen un nmero amplio y reducido de casos hacen referencia a la correlacin positiva y significativa entre los tumores con elevados ndices Ki-67 y el tamao tumoral y el compromiso ganglionar (Charpin et al., 1988; Viehl et al., 1990; Weikel et al., 1991; Wintzer et al., 1991; Gaglia et al., 1993;).
Con relacin a la terapia adyuvante un mayor nmero de pacientes con tumores Ki-67+ recibieron quimioterapia en comparacin con cnceres Ki-67 no tratados (p=0,06), aunque esto se debe a que la elevada expresin de Ki-67 se relacion con la ausencia del RE y por tanto, estas pacientes fueron seleccionadas a recibir citotxicos. La proporcin de tumores Ki67+ en tratamiento con tamoxifn fue proporcional al grupo ki67+ sin tratamiento y tampoco se objetivaron diferencias con el tratamiento radioterpico (Tabla 15). 7-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin del antgeno nuclear de proliferacin celular Ki-67 y los marcadores tumorales moleculares. En nuestro estudio los elevados ndices de ki67 se han relacionado de manera muy significativa con caractersticas celulares de desdiferenciacin: alto grado histolgico (p=0,0004) y nuclear (p=0,0007), la ausencia de RE (p=0,008) y RPg (p=0,008), elevada expresin de PCNA (p=0,0000), C-erbB-2 (p=0,05) y p53 (p=0,01). (Tablas 20 y 21). La asociacin del MIB1 con el PCNA fue altamente significativa ya que ambos antgenos estn directamente relacionados con el crecimiento y proliferacin celular, sin embargo, sus funciones son diferentes durante el ciclo de divisin celular. El PCNA funciona principalmente como un cofactor esencial en la actividad de la DNA polimerasa delta y en la sntesis y reparacin del DNA (Tan et al., 1986; Prelich et al., 1987; Jaskuslki et al., 1988; Lee et al., 1989), mientras
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que el antgeno Ki-67 acta como un eficiente factor en la biognesis del RNA ribosomal (McCallum y Hall 2000). Por tanto, la accin de ambos antgenos es esencial durante el proceso de divisin celular. Existe una buena correlacin entre el Ki-67 y el PCNA, adems ambos se asocian a aneuploida, alta gradacin histolgica y nuclear y elevada fraccin S (Dawson et al., 1990; Pelosi et al., 1994; Gasparini et al., 1994; Yu et al., 1995).
En nuestra serie el antgeno Ki-67 tambin se relacion de manera directa y significativa con la expresin de p53. (Tabla 15). Los cnceres de mama con alteraciones en el gen p53 presentan elevados ndices de Ki-67, elevada fraccin S, aneuploida, sobreexpresin de C-erbB-2 y negatividad para el RE y RPg. Estos datos indican que en estos tumores se han producido varias alteraciones genticas (Cattoretti et al., 1988; Beck et al., 1995; Seshadri et al., 1996; Iacopetta et al., 1998; Midulla et al., 1999; Rudolph et al., 1999). Isola et al. (1992) han sugerido que la sobreexpresin de C-erbB-2 o p53 pueden aumentar la tasa de proliferacin celular, as, ambas protenas se relacionan de manera independiente con la proliferacin celular. 8-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin del antgeno nuclear de proliferacin celular PCNA y los parmetros clnico-patolgicos. Con el PCNA tambin se utiliz el valor de la mediana como punto de corte (15,9%; AmPC10) para seleccionar tumores con elevado y bajo ndice de proliferacin celular. (Tabla 4). De este modo, un 42,6% de los tumores fueron considerados PCNA+. En los cnceres los promedios de porcentajes de positividad IHQ para el PCNA varan entre un 10,2% y un 18%, aunque stos tambin oscilan en funcin del tipo de anticuerpo utilizado y la proporcin de ncleos aneuploides y diploides. Este antgeno ha sido considerado de utilidad para valorar la actividad proliferativa celular y adems, ha mostrado una buena correlacin con otros mtodos como la medicin de la fraccin S por citometra de flujo (Dawson et al., 1990; Visscher et al., 1992; Aaltomaa et al., 1992; Sherestha et al., 1992; Siitonen et al., 1993; Thomas et al., 1993). No obstante, algunos autores prefieren expresar sus resultados basndose en el ndice de tincin del PCNA en vez de utilizar el valor de la mediana (Haerslev et al., 1994; Schimmelpenning et al., 1994; Sheen-Chen et al., 1997).
En nuestro estudio este antgeno, al igual que sucedi con el Ki-67, mostr una asociacin muy significativa con altos grados histolgicos (p=0,002) y nucleares (p=0,009). (Tabla 16). Estos resultados concuerdan con los publicados por varios investigadores que, a pesar de haber empleando diferentes anticuerpos monoclonales, objetivaron una relacin inversa entre este antgeno y la desdiferenciacin celular. As, elevados porcentajes de ncleos teidos se relacionaron con un peor grado histolgico y nuclear y con la aneuploida (Visscher et al., 1992;
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Aaltomaa et al., 1992; Siitonen et al., 1993; Guillet et al., 1993; Frierson, 1993;Gohring et al., 1994; Haerslev et al., 1994; Schimmelpenning et al., 1994; Heimann et al., 1997). Se han detectado incrementos progresivos en los ndices de PCNA desde las lesiones con cambios anaplsicos incipientes hasta el desarrollo de un cncer infiltrante, sugiriendo la participacin activa de este marcador en los procesos de proliferacin celular (Sherestha et al., 1992; Kalogeraki et al., 1994; Cardillo et al., 1995).
En nuestro estudio no se han encontrado diferencias estadsticamente significativas entre la elevada expresin de este antgeno y el resto de los parmetros clnico patolgicos. Tan solo hemos observado una discreta mayor proporcin de tumores PCNA+ en los casos N2, cuando estn afectados ms de 4 ganglios, con un tamao ganglionar superior a la mediana, con la rotura de la cpsula ganglionar y en el estadio III (Tabla 16). Gohring et al., (1994) citan una ausencia de asociacin entre este marcador y la edad, estado menopusico y la afectacin ganglionar. Thomas et al., (1993) tampoco observaron una asociacin estadsticamente significativa con los parmetros de pronstico clsicos. No obstante, otros autores hacen referencia a la asociacin significativa entre la expresin de PCNA y el tamao tumoral y la afectacin ganglionar (Frierson, 1993; Haerslev et al., 1994; Schonborn et al., 1995), aduciendo que la expresin de este marcador se relaciona con tumores ms agresivos. 8-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin del antgeno nuclear de proliferacin celular PCNA y los marcadores tumorales moleculares. En nuestra serie la expresin de PCNA se ha relacionado a caractersticas citolgicas de dedisferenciacin, alto grado nuclear (p=0,009) e histolgico (p=0,002), ausencia del RE (p=0,009) y RPg (p=0,002), positividad para Hsp27 (p=0,006) y Ki-67 (p=0,0000) y por tanto, con pleomorfismo nuclear, prdida de dependencia hormonal y aumento de la proliferacin celular.
En esta serie hemos observado una relacin directa y estadsticamente significativa entre la expresin de PCNA y la positividad para la protena p53. (Tabla 16). Esta asociacin ha sido objetivada en tumores con elevado grado histolgico y aneuploida (Schimmelpenning et al., 1994; Haerslev et al., 1995) y concuerda con los hallazgos de este estudio. La p53 no interacciona directamente con la PCNA, pero regula la actividad de este cofactor a travs de la p21 que a su vez es regulada por la p53. La p21 interfiere con el movimiento de la DNA polimerasa durante la fase de elongacin de la cadena del DNA (Flores-Rozas et al., 1994). Tambin la p21 produce el desacoplamiento del complejo PCNA-Fen1 necesario para degradar las uniones DNA-prmeros RNA en los extremos 5 de los fragmentos inmaduros de Ozakazi
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previo a su unin en una hebra continua de DNA (Chen et al., 1996). La protena p21 es necesaria para regular la actividad de la PCNA, as, las alteraciones en la p53 que interfieren con la actividad de esta protena podran ocasionar una desinhibicin del complejo PCNA-Fen1 y un aumento en la sntesis de DNA. La GADD45 es otra protena nuclear en parte regulada por la p53 e inducida ante una lesin al DNA. Esta protena se une a las cinasas dependiente de ciclinas y al PCNA produciendo una inhibicin de la entrada de las clulas en la fase S y estimulando la excisin y reparacin de los segmentos de DNA daados (Smith et al., 1994; Carrier et al., 1994). En este estudio no se han medido los niveles de p21 y GADD45 y por consiguiente, no podemos concluir que la asociacin sea debido a alteraciones en estas protenas, sin embargo, es importante sealar que estos mecanismos podran explicar la relacin observada entre la expresin de p53 y el PCNA.
En este estudio los cnceres con elevados ndices de PCNA han sido independientes de la expresin de la catepsina D y de la glicoprotena P. La expresin conjunta del PCNA y de la glicoprotena P se ha objetivado en tumores avanzados de mama que desarrollaron metstasis locorregionales (Botti et al., 1993). Asimismo, Frassoldati et al., (1997) han evidenciado un aumento en la expresin del PCNA, EGFR y glicoprotena P en un grupo de tumores avanzados que no respondieron a la quimioterapia. 9-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin del oncogn supresor p53 y los parmetros clnico-patolgicos. En esta serie empleando el Am-IgG2b (DO-7) y un dintel de positividad del 10% o ms de los ncleos teidos, se detect la protena p53 en el 21,3% de los tumores. (Tabla 4). En el cncer de mama los porcentajes de positividad para la p53 varan entre un 15,5 - 58%, aunque algunos de los estudios incluyen tumores que contienen pocas clulas con ncleos teidos. La variabilidad en la tincin IHQ tambin depende de variaciones en el ciclo de divisin celular y de la proporcin de clulas aneuploides (Cattoretti et al., 1988; Davidoff et al., 1991; Thor et al., 1992; Isola et al., 1992; Allred et al., 1993; Lipponen et al., 1993; Marks et al., 1994; Bland et al., 1995; Fresno et al., 1997). Cifras similares (20 24%) a la registrada en este estudio han sido descritas utilizando el anticuerpo monoclonal Pab1801 (Davidoff et al., 1991l; Thor et al., 1992; Marks et al., 1994; Bland et al., 1995). Los resultados no difieren excesivamente con la utilizacin de los anticuerpos DO-1 y DO-7 (Levesque et al., 1998; Fresno et al., 1997).
En nuestro estudio la sobreexpresin de p53 se relacion significativamente con altos grados nucleares e histolgicos y por consiguiente, con caractersticas histolgicas y citolgicas de desdiferenciacin.(Tabla 17). Estos resultados estn en consonancia con los publicados en otras
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series donde la sobreexpresin de p53, detectada inmunohistoqumicamente con diferentes anticuerpos monoclonales, va ligada a tumores con prdida de la diferenciacin: altos grados histolgicos y nucleares, aneuploida, elevada fraccin S y Ki-67, negatividad para los RE y RPg, elevada expresin de EGFR y C-erbB-2 (Ostrowski et al., 1991; Thor et al., 1992; Isola et al., 1992; Silvestrini et al., 1993; Lipponen et al., 1993; Friedrichs et al., 1993; StenmarkAskmalm et al., 1994; Beck et al., 1995; Gohring et al., 1995; Seshadri et al., 1996; Fresno et al., 1997; Bianchi et al., 1997; Levesque et al., 1998; Rudolph et al., 1999).
En esta serie hemos objetivado una sobreexpresin de p53 en tumores T3, en los casos con afectacin de 4 o ms ganglios o rotura capsular y en el estadio III, aunque las diferencias con respecto a las otras categoras dentro de cada grupo no fueron estadsticamente significativas. (Tabla 17). Resultados similares a los nuestros se describen en la literatura donde, a pesar de que la expresin de p53 se relacion con altos grados histolgicos y nucleares, no se demostr una asociacin estadsticamente significativa con el tamao tumoral, la afectacin ganglionar y el estado hormonal (Silvestrini et al., 1993; Caleffi et al., 1994; Pietilainen et al., 1995; Beck et al., 1995; Gohring et al., 1995; Bianchi et al., 1997; Levesque et al., 1998; Berns et al., 1998). En cambio, en otros estudios s se ha observado una asociacin entre la sobreexpresin de p53 y tumores con un dimetro superior a los 2 cm y con las metstasis ganglionares (Alrred et al., 1993; Marks et al., 1994; Stenmark-Askmalm et al., 1994). Isola et al., (1992) encontraron una dbil asociacin con el tamao tumoral (p=0,09) y ausencia de relacin con la edad y el estado hormonal.
Con relacin al tratamiento adyuvante no se observaron diferencias significativas, aunque un nmero reducido de pacientes (n=14) con cnceres p53+ no recibieron citotxicos y en cambio, fueron tratadas con tamoxifn. (Tabla 17). 9-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin del oncogn supresor p53 y los marcadores tumorales moleculares. La sobreexpresin del gen p53 se detect casi en una cuarta parte de los cnceres de mama en esta serie, por tanto, las alteraciones de este gen en las partes restantes no pueden explicar la patognesis de estos tumores. Sin embargo, hasta un 20% de las tinciones inmunohistoqumicas no detectan la protena mutada y de producirse este hecho puede ocasionar un error al interpretar los resultados. A pesar de estas consideraciones, la presencia de p53 en nuestra serie como en otras, se ha relacionado con altos grados nucleares (p=0,0006) e histolgicos (p=0,00006), ausencia del RE (p=0,03) y elevados ndices de proliferacin celular, Ki-67 (p=0,01) y PCNA (p=0,002). En consecuencia, en nuestra serie la expresin de esta
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protena se ha relacionado con parmetros de mayor agresividad: falta de diferenciacin, hormonoindependencia y crecimiento celular.
La p53 vari inversa y significativamente con el RE, mientras que con el RPg la asociacin no alcanz la significacin estadstica (p=0,06). (Tablas 9 y 10). En cambio, con los antgenos de proliferacin celular, Ki-67 y PCNA, la relacin fue directa y significativa (Tablas 15 y 16). En varios trabajos se cita la relacin entre la sobreexpresin de p53 y la negatividad para los receptores hormonales, la sobreexpresin de C-erbB-2, la elevada fraccin S y altos ndices de Ki-67. Estos cnceres tienden a ser indiferenciados, proliferativos y relacionados con un mal pronstico (Cattoretti et al., 1988; Isola et al., 1992; Allrred et al., 1993). La prdida de p53 puede liberar la inhibicin de los mecanismos homeostticos que controlan la proliferacin celular, producir deficiencias en la reparacin del DNA que favorecen la acumulacin de alteraciones genticas y sobreexpresin de oncogenes y condicionar la prdida de los mecanismos apoptticos. La sobreexpresin de p53 es un indicador de potencial maligno y debe ser valorado en conjunto con otros marcadores de pronstico.
En nuestra serie no hemos observado una asociacin estadsticamente significativa entre la p53 y la catepsina D, aunque si se objetiv una discreta mayor proporcin de tumores p53+/catepsina D+. En constraste, la proporcin de tumores p53+/glicoprotena P+ fue similar a p53+/glicoprotena P-. (Tabla 17). En la literatura existen controversias con relacin al grado de asociacin entre estos marcadores, as, Isola et al., (1993) mediante determinacin IHQ en 262 cnceres de mama con ganglios negativos, destaca una ausencia de asociacin estadsticamente significativa entre la catepsina D y el C-erbB-2 y la p53. Moriki et al., (1995) en una serie pequea de 35 pacientes describen una relacin entre la expresin de C-erbB-2 y p53 con la elevada actividad proliferativa. No encontraron sin embargo, una asociacin con la glicoprotena P. En cambio Charpin et al., (1994), en un estudio de 213 cnceres de mama, describen una asociacin estadsticamente significativa entre la expresin de la glicoprotena P, la catepsina D y la p53. Se considera que la expresin conjunta de p53 y la glicoprotena P est relacionada con un fenotipo tumoral ms agresivo y resistencia a citotxicos. Algunos experimentos han demostrado que la protena p53 mutada puede activar la regin promotora del gen MDR1 que codifica la glicoprotena P. Adems, el acumulo nuclear de p53 y la expresin de glicoprotena P se ha observado en tumores de mama localmente avanzados (Moriki et al., 1995; Schneider y Romero et al., 1995; Linn et al., 1996). Sin embargo, Lizard-Nacol et al., (1999), que han analizado mediante RT-PCR la expresin del gen MDR1 y p53 en 75 cnceres de mama y 36 muestras de tejido normal, no encontraron una correlacin entre ambos genes. Este examen demostr niveles elevados de MDR1 tanto en tejido neoplsico como en el normal,
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mientras que la expresin de p53 fue alta en el tejido canceroso y baja en el normal. En el caso del gen MDR1 su presencia en tejido normal y neoplsico sugiere un mecanismo de induccin del gen y no de una seleccin clonal. Por tanto, la ausencia de correlacin entre ambos genes puede ser el resultado de dos procesos independientes. 10-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la catepsina D y los parmetros clnico-patolgicos. Con el Am-C5 y utilizando un dintel de positividad del 10% o ms de las clulas teidas, el 45% de los tumores fueron catalogados como catepsina D+. (Tabla 4). En el cncer de mama el porcentaje de clulas ductales que expresan esta proteasa determinada por tcnicas inmunohistoqumicas flucta entre un 38,9% y un 79%, as, las cifras registradas en nuestro estudio se sitan en el rango publicado (Henry et al., 1990; Domagala et al., 1992; Isola et al., 1993; Gohring et al., 1996; Ramrez-Ortega et al., 1997; Losch et al., 1998; Tetu et al., 1999). Algunos autores describen por separado los porcentajes de positividad para la catepsina D en las clulas ductales y estromales compuestas por macrfagos y fibroblastos. La positividad para la catepsina D en el componente estromal vara entre un 18 y 44% (Losch et al.,1998; Tetu et al., 1999). Cuando la determinacin de la catepsina D se ha realizado mediante inmunoensayo cuantitativo, el punto de corte ha variado ampliamente (20-45 pmol/mg prt.), aunque en gran parte de los estudios se ha situado alrededor de los 40 pmol/mg ptr (Pujol et al., 1993; Barbi et al., 1994; Ferno et al., 1994; Gohring et al., 1996; Harbeck et al., 1999; Foekens et al., 1999; Eskelinen et al., 1999). En contraste, en los estudios inmunohistoqumicos an no se ha establecido el valor de mayor sensibilidad y especificidad para la catepsina D. Isola et al., (1993) y Tetu et al., (1999) han considerado un dintel de positividad del 10% o ms de las clulas ductales teidas. Contrariamente a lo que sucede con otros marcadores tumorales, existen discrepancias cuando se compara la expresin de catepsina D por mtodos bioqumicos con los inmunohistoqumicos. Los mtodos inmunohistoqumicos permiten la medicin de la expresin de la catepsina D en las clulas ductales y estromales, en contraposicin con los mtodos bioqumicos donde no es posible estudiar separadamente ambos componentes. Por otra parte, los mtodos bioqumicos estn bien estandarizados en comparacin con los mtodos inmunohistoqumicos que emplean distintos anticuerpos monoclonales que poseen diferentes sensibilidades. Remmele et al., (1993) sealan que existe una buena correlacin entre los mtodos bioqumicos e inmunohistoqumicos en las clulas ductales en comparacin con los macrfagos, sin embargo, los resultados en los casos individuales varan dentro de un amplio rango lo que dificulta las comparaciones de ambos mtodos. Para Razumovic et al., (1997) no existi una correlacin estadsticamente significativa entre la determinacin de la catepsina D por mtodos inmunoenzimticos e inmunohistoqumicos. Hubo sin embargo, una significativa
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asociacin entre la positividad del componente estromal con la concentracin de catepsina D en el componente ductal.
En este estudio hemos valorado la positividad de la catepsina D en las clulas ductales. La expresin de catepsina D no se asoci significativamente con ninguno de los parmetros clnicopatolgicos. (Tabla 18). En la bibliografa consultada encontramos muchas discrepancias en los resultados tanto en series que incluyen un gran nmero de enfermos como aquellas que poseen un nmero reducido. En estos trabajos no se ha podido demostrar una correlacin entre la expresin IHQ de la catepsina D y los parmetros clnico-patolgicos (Domagala et al., 1992; Aaltonen et al., 1995; Ramrez-Ortega et al., 1997; Losch et al., 1998; Gonzlez Vela et al., 1999). Segn Isola et al., (1993) una elevada expresin de catepsina D se relacion significativamente con tumores grandes, pero no con el grado histolgico. Para Nadji et al., (1996) una fuerte tincin de catepsina D en las clulas estromales se asoci significativamente con el tamao tumoral, alto grado nuclear e histolgico. De manera similar, Tetu et al., (1999) encuentran que la expresin de la catepsina D en el componente estromal se relacion significativamente con parmetros de mal pronstico y con la expresin de otras proteasas. Lah et al., (2000) sealan que una intensa tincin para la catepsina D se observ en tumores con altos estadios TNM y con ganglios positivos.
Con la determinacin de la catepsina D por mtodos enzimticos los resultados son variables. As, Thorpe et al., (1989) en un estudio de 396 enfermas (242 pre/perimenopusicas y 154 postmenopusicas) objetivaron que los niveles de catepsina D no se relacionaron significativamente con la edad, tamao tumoral, afectacin ganglionar y grado de anaplasia. Tandon et al., (1990) en una serie de 397 pacientes encuentran que la expresin de Catepsina D en los tumores N- se asoci significativamente con la aneuploida, pero no con la edad y el tamao tumoral. Segn Duffy et al., (1991) la catepsina D no se relacion con la afectacin ganglionar y el estado y nicamente mostr una asociacin con la gradacin histolgica. Barbi et al., (1994) seala que la concentracin citoslica de la catepsina D se correlacion con la gradacin histolgica y la afectacin ganglionar, pero no con la edad, tipo histolgico ni el contenido de RE. Para Gohring et al., (1996) la afectacin ganglionar fue la nica variable que se asoci significativamente con la concentracin de catepsina D. Foekens et al. (1999) hace referencia a una dbil asociacin entre el contenido citoslico de la catepsina D determinado por mtodos inmunoenzimticos y los parmetros clnico-patolgicos.
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Tampoco hemos observado diferencias significativas entre la expresin de la catepsina D y el tipo de tratamiento adyuvante, si bien, este marcador no constituye un parmetro de referencia para la administracin de una terapia complementaria. (Tabla 18). 10-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la catepsina D y los marcadores tumorales moleculares. En nuestra serie la catepsina D no se asoci significativamente con ningn parmetro clnico-patolgico y entre los marcadores tumorales moleculares solamente con la expresin positiva de pS2 y dbilmente con la glicoprotena P (p=0,06). (Tabla 18). Segn refleja la bibliografa consultada existen discrepancias sobre el grado de asociacin de la catepsina D con los parmetros clsicos y con algunos marcadores tumorales moleculares, incluso cuando se han empleado en su medicin mtodos bien estandarizados como son las tcnicas bioqumicas. Estas diferencias hacen que resulte difcil definir el verdadero rol de esta proteasa en el cncer mamario.
En esta serie no se ha observado una asociacin estadsticamente significativa entre la expresin de la catepsina D y el RE y RPg. (Tablas 9 y 10). Esta ausencia de correlacin entre la expresin de catepsina D en las clulas ductales y el RE se ha observado en pacientes con ganglios negativos en estudios inmunoenzimticos (Tandon et al., 1990;) e
inmunohistoqumicos (Isola et al., 1993; Nadji et al., 1996) y tambin en pacientes con ganglios positivos y negativos empleando tcnicas bioqumicas e inmunoenzimticas (Duffy et al., 1991; Pujol et al., 1993; Barbi et al., 1994; Razumovic et al., 1997; Glikman et al., 1997) e inmunohistoqumicas (Gohring et al., 1996; Losch et al., 1998; Gonzlez-Vela et al., 1999). En tumores RE+ la expresin de catepsina D puede ser inducida por los estrgenos, insulina, EGF y FGF (Cavailles et al., 1988; Touito et al., 1991), mientras que en clulas RE- la regin CatD HS4 del gen puede controlar la expresin constitutiva por un mecanismo an no conocido (Giamarchi et al., 1999). Otros autores han observado que la tincin positiva para la catepsina D en las clulas ductales se relaciona significativamente con la presencia del RE (Henry et al., 1990; Gonzlez-Vela et al., 1999) Gion et al., 1995 hacen referencia a la asociacin directa significativa de la catepsina con el RE y RPg. Foekens et al., (1999) tambin cita una dbil asociacin entre la catepsina D y los receptores hormonales. En trminos generales a pesar de la diversidad de trabajos donde se mezclan tumores en diferentes estadios, se emplean distintos mtodos de medicin y diferentes anticuerpos monoclonales, la expresin de la catepsina parece depender de otra serie de factores aparte de la estimulacin estrognica, puesto que a excepcin de algunos pocos trabajos, el grado de asociacin estadsticamente significativa con los receptores hormonales es dbil o nulo. Pujol et al., (1999) citan que en mujeres hormonalmente
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activas el estmulo estrognico influy principalmente en los niveles de expresin de la protena pS2 y fue casi nulo con relacin a la catepsina D.
Un nmero reducido de tumores tieron positivamente para la catepsina D y la glicoprotena P, siendo la relacin positiva, pero sin alcanzar la significacin estadstica prefijada en el diseo (p=0,06). (Tabla 18). Charpin et al., (1994) encuentran una asociacin directa y estadsticamente significativa entre la expresin de la glicoprotena P y la catepsina D. La expresin individual de cada marcador se ha relacionado con un mal pronstico, sin embargo, se desconoce la implicacin en el pronstico de la expresin conjunta de ambos marcadores al no existir suficientes datos en la literatura. 11-a) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la glicoprotena P y los parmetros clnico-patolgicos. La determinacin IHQ de la glicoprotena P se realiz en 58 tumores con el anticuerpo monoclonal JSB-1 y empleando un dintel de positividad mnimo del 10% de las clulas teidas. Por este mtodo, la presencia de la glicoprotena P se detect en el 16,7% de los casos, siendo sta una cifra baja, pero incluida en el rango (14% - 75%) descrito descrita en la literatura. (Tabla 4). La heterogeneidad observada en algunos tumores es tambin un hecho destacado (Wishart et al., 1990; Ro et al., 1990; Sanfilippo et al., 1991; De la Torre et al., 1994; Charpin et al., 1994; Linn et al., 1995; Gregorcyk et al., 1996; Filipits et al., 1996; Hegewisch-Becker et al., 1998).
En nuestro estudio la expresin de glicoprotena P fue independiente del estado hormonal, el tipo de tumor, la afectacin ganglionar, el tamao ganglionar, la rotura de la cpsula ganglionar, la gradacin nuclear e histolgica y el estadiaje. (Tabla 19). Esta ausencia de asociacin entre la expresin IHQ de la glicoprotena P y los parmetros clnico-patolgicos se ha sealado en algunos trabajos (Charpin et al., 1994; De la Torre et al., 1995). Mediante tcnicas que miden los niveles del RNA mensajero del gen MDR1 (glicoprotena P), tampoco se ha observado una correlacin con la edad, estado hormonal, tamao tumoral y afectacin ganglionar (Wallner et al., 1991; Punyammalee et al., 1997). Trock et al.,(1997) citan en un metanlisis que la expresin de la glicoprotena P no se asoci significativamente con el tamao tumoral, afectacin ganglionar, grado histolgico, ni con el contenido de RE. Aunque algunos autores consideran este marcador como factor de pronstico, su expresin est mas relacionada con la respuesta al tratamiento quimioterpico.
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11-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la glicoprotena P y los marcadores tumorales moleculares. El grado de asociacin entre la expresin de la glicoprotena P y los marcadores tumorales moleculares ha sido comentado en las secciones anteriores. No se objetiv asociacin estadsticamente significativa con ninguno de los marcadores tumorales moleculares a excepcin de la relacin positiva con el RPg (p=0,09) y con la catepsina D (p=0,06). (Tabla 21). El nmero de casos en esta serie es reducido, sin embargo, en series con mayor nmero de tumores se obtuvieron conclusiones similares. Experimentalmente Clarke et al., (1992) demostraron que la transfeccin del gen MDR1 induce un estado de resistencia en la clula receptora y un incremento en los niveles de expresin del EGFR, sin producir ninguna alteracin en los niveles de los receptores hormonales. Por otra parte, la sobreexpresin del gen MDR1 en tejidos normales y en neoplasias avanzadas o que han sido tratadas previamente con citotxicos, sugiere un mecanismo de induccin y pone en tela de juicio la funcin directa de esta protena en la patognesis del cncer de mama.
I-C- ANALISIS DE LOS TUMORES QUE DESARROLLARON METASTASIS DURANTE LOS 36 MESES DE SEGUIMIENTO.
1-a) Anlisis de la asociacin entre los parmetros clnico-patolgicos y las recidivas precoces. En nuestro estudio hemos observado una relacin directa entre el desarrollo de enfermedad metastsica y la afectacin ganglionar (p=0,08), especialmente cuando existen metstasis en 4 o ms ganglios (p=0,07) y con la rotura con desbordamiento de la cpsula ganglionar (p=0,01). (Tabla 22a). El riesgo relativo de metstasis de las pacientes con ganglios en estadio N2 es 3 veces (I.C. al 95%:1,09 8,81) el de las pacientes con ganglios en estadio N0 y casi 3 veces superior en aquellas pacientes que presentaban afectacin de 4 o ms ganglios (I.C. al 95%:1,07 8,05) y en los casos de rotura por infiltracin de la cpsula ganglionar (I.C. al 95%: 1,08 6,41). (Tabla 22b). Esta asociacin directa entre las metstasis y la afectacin ganglionar es importante desde el punto de vista clnico, debido a que la probabilidad de metstasis es mayor cuando existen ganglios axilares positivos. La afectacin ganglionar axilar siempre ha constituido un factor de pronstico en los cnceres mamarios, sin embargo, a diferencia de la serie que nos ocupa, los datos de recidivas y supervivencia generalmente se han descrito a intervalos de vigilancia de 5, 10 y 20 aos. Durante este perodo las recidiva ha variado en funcin no slo de la presencia de metstasis ganglionar, sino del nmero de ganglios afectados, fundamentalmente cuando este es igual o superior a 4 (Berg y Robbins, 1966; Fisher et al.,
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1978; Nemoto et al., 1980; Carbone et al., 1981; Carter et al., 1987; Rosen et al., 1989). Tambin la rotura con desbordamiento de la cpsula ganglionar ha sido un parmetro pronstico, siendo el nmero de metstasis superior en los cnceres que presentaban la violacin de la cpsula en comparacin con aquellos que an infiltrados la mantenan intacta (Fisher et al., 1976; Mambo et al., 1977; Goldstein et al., 1995; Leonard et al., 1995).
El estadio III (TNM) se asoci al desarrollo de enfermedad metastsica precoz. (Tabla 22a). El riesgo relativo de metstasis estimado para las pacientes clasificadas en un estadio III es 4,9 veces (I.C. al 95%:1,41 16,99) el de las pacientes en estadio I, mientras que el riesgo relativo de las enfermas en estadio II es 1,8 veces superior (I.C. 95%:0,5 7) al de las pacientes en estadio I y el de las pacientes en estadio III 2,7 veces (I.C. 95%:1,04 7) el de las pacientes en estadio II. (Tabla 22b). Por consiguiente, el estadio III se asocia a la aparicin de enfermedad metastsica precoz, careciendo de significacin estadstica la asociacin entre las metstasis y el estadio II y I. En diferentes series se describe una elevada frecuencia de recidivas locales y a distancia observadas durante los 5 primeros aos de seguimiento en pacientes que haban sido clasificadas en el estadio III (Schottenfeld et al , 1976; Arnold y Lesnick 1979; Scholl et al., 1994; Schwartz et al., 1994). Uno de los factores determinantes de las recidivas en este estadio lo constituye la afectacin ganglionar axilar (Frachia et al., 1980; McCready et al., 1989).
La multicentricidad ha sido otro parmetro clnico-patolgico relacionado directamente con las metstasis precoces, siendo la proporcin de pacientes con cnceres infiltrantes multicntricos que desarrollaron enfermedad metastsica superior a la proporcin en cnceres nicos. (Tabla 22a). El riesgo relativo de metstasis es 2,94 veces mayor (I.C. al 95%:1,15 7,7) cuando se posee ms de un foco de cncer infiltrante en la misma mama que en el caso de padecer un tumor nico. (Tabla 22b). La presencia de multicentricidad se ha relacionado con un aumento del riesgo de recidiva local y de metstasis ganglionares (Lesser et al., 1989; Kurtz et al., 1990; Dawson et al., 1993). En nuestra serie la multicentricidad no se asoci a ningn parmetro clnico-patolgico, lo que nos hace suponer que la presencia de ms de un foco de cncer infiltrante en la misma mama supone un riesgo adicional para la recidiva a distancia probablemente por una mayor carga tumoral.
No hemos objetivado una asociacin estadsticamente significativa entre las metstasis y la gradacin nuclear (p=0,35) e histolgica (p=0,95). (Tabla 22a). La proporcin de metstasis fue similar en las diferentes categoras de gradacin histolgica y nuclear, aunque destaca que no recidiv ninguna paciente con un tumor clasificado en un grado nuclear 1. (Tabla 22a). Varios estudios han constatado que los tumores con altos grados histolgicos y nucleares presentan una
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elevada frecuencia de metstasis ganglionares y recidivas en comparacin con los tumores con bajos grados histolgicos y nucleares (Bloom y Richardson 1957; Black et al., 1975; Andersen et al., 1981; Fisher et al., 1990; Elston et al., 1991; Henson et al., 1991). El riesgo relativo de metstasis de un grado histolgico II con respecto del I fue de 1,07 (I.C. 95%:0,26 4,39) y de 1,3 de un GH III con relacin a un GHI (I.C. 95%:0,27 6,25), aunque estos datos carecen de significacin estadstica al incluir el valor nulo en el intervalo de confianza. (Tabla 22b). El riesgo relativo de metstasis para un tumor con gradacin nuclear III con respecto del 1 fue 4,3 veces superior (I.C. 95%: 0,26 71,8) y de un grado nuclear II con relacin al I que fue 3,5 veces mayor (I.C. 95%:0,22 55,5). (Tabla 22b). En nuestro estudio observamos que la gradacin nuclear parece relacionarse mejor con las metstasis que la gradacin histolgica, aunque este dato carece de valor desde el punto de vista estadstico ya que los intervalos de confianza fluctan ampliamente alrededor del valor nulo y por tanto, no podemos rechazar la Ho. Tambin objetivamos un exceso de pacientes con cnceres clasificados en grados histolgicos y nucleares intermedios, lo que dificulta las comparaciones. As, en esta serie la aparicin de las metstasis precoces fue un evento independiente de la gradacin histolgica y nuclear. En un estudio llevado a cabo por Rosen y Groshen., (1990), basado en 644 pacientes con cncer de mama en estadios I y II, la gradacin nuclear e histolgica se relacion significativamente con las recidivas en pacientes con tumores T1 NO, en cambio, careci de significacin en las recidivas de pacientes en estadios II.
El estado hormonal de las enfermas no influy en la aparicin de las metstasis, puesto que la proporcin de recidivas en premenopusicas y postmenopusicas fue similar. (Tabla 22a). Segn el estado hormonal, el riesgo relativo de metstasis de una premenopusica en comparacin con una postmenopusica equivale a 0,95 (I.C. 95%: 0,29 3,05; p=0,62), aunque este dato carece de significacin estadstica. (Tabla 22b). En nuestra serie el estado hormonal no parece influir en la aparicin de las metstasis. Para Hyman et al., (1972) el estado menstrual no se asoci a la aparicin de la enfermedad metastsica. En la literatura no hay datos
concluyentes que indiquen que el estado hormonal sea un factor de pronstico, aunque se ha sealado que las enfermas menores de 50 aos tienen una mejor evolucin (Adami et al., 1986). Segn algunos autores las pacientes perimenopusicas tuvieron un peor pronstico que las premenopusicas y postmenopusicas (Tough, 1969; Cutler et al., 1970). Para otros, en cambio, la edad mas que el estado hormonal se relaciona con el pronstico. Las pacientes con un cncer a una edad inferior a los 35 aos presentaron un menor intervalo libre y supervivencia global (Nixon et al., 1994; Albain et al., 1994; Bonnier et al., 1995). Sin embargo, para Rosen et al., (1984) el pronstico de stas fue similar al de las pacientes de mayor edad.
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No hubo relacin entre la aparicin de las metstasis y el tratamiento radioterpico. (Tabla 22a). El tratamiento radioterpico no disminuy el riesgo de metstasis (RR:1,06; I.C. 95%:0,42 2,65). (Tabla 22b). Los estudios aleatorizados sealan que la radioterapia postoperatoria produce una disminucin significativa de la recidiva locorregional, sin mejorar la supervivencia global y por tanto, una escasa influencia sobre la enfermedad diseminada (Overgaard et al.,1990; EBCTCG, 1995).
Nueve de las pacientes que recidivaron no haban recibido quimioterapia adyuvante, sin embargo, la proporcin de pacientes tratadas con citotxicos y que desarrollaron enfermedad metastsica fue discretamente superior al grupo no tratado. (Tabla 22a). En nuestra serie la administracin o la ausencia de tratamiento quimioterpico adyuvante no se relacion (RR:1,43; I.C. 95%: 0,57 3,54; p=0,3) ni evit la aparicin de metstasis (Tabla 22b).
En contraste, apreciamos una discreta mayor proporcin de metstasis en el grupo no tratado con tamoxifn, aunque las diferencias carecieron de significacin estadstica (p=0,26). (Tabla 22a). El riesgo relativo de metstasis de pacientes tratadas con tamoxifn fue 0,7 veces (I.C. al 95%:0,26 1,62) el del grupo sin tamoxifn, aunque este dato carece de significacin estadstica. Por consiguiente, el desarrollo de la enfermedad metastsica durante los 36 meses de seguimiento ha sido independiente de la administracin o no de un tratamiento adyuvante. Aunque algunas pacientes han completado los 5 aos de seguimiento y otras se aproximan a este intervalo, desconocemos por el momento en el resto de la serie si la administracin de quimioterapia u hormonoterapia puede condicionar un retraso en la aparicin de metstasis.. 1-b) Anlisis de la asociacin entre los marcadores tumorales moleculares y las recidivas precoces. En nuestra serie la ausencia de expresin de la protena pS2 y la elevada expresin del antgeno Ki-67, superior al valor de la mediana, se relacionaron significativamente con la aparicin de enfermedad metastsica. (Tabla 23a).
El riesgo relativo de metstasis fue 13 veces superior (I.C. al 95%:1,8 95,4) en las pacientes con cnceres con porcentajes de clulas Ki-67 por arriba del valor de la mediana (15%). (Tabla 23b). Por tanto, de todas las variables de nuestra serie, este marcador ha sido el que mejor se ha relacionado con el curso clnico de las enfermas. La tincin IHQ de este antgeno expresado en clulas que se estn dividiendo activamente permite valorar la fraccin de crecimiento y es comparable en su medicin a mtodos ms sofisticados y ms caros como son el ndice de timidina tritiada, la medicin de la fase de sntesis celular por citometra de
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flujo, la medicin de la timidina cinasa, la determinacin del nmero de AgNOR y la tincin con bromodeuxiridina (Silvestrini et al., 1988; Dervan et al., 1989; Ruschoff et al., 1990; Isola et al., 1990; Sahin et al., 1991; McGrogan et al., 1997). En nuestro estudio, como se ha comentado en el apartado 7-b, los tumores con un porcentaje de clulas Ki-67 por encima de la mediana se han asociado a altos grados histolgicos y nucleares, ausencia de receptores hormonales y positividad para C-erbB-2 y p53. Varios trabajos destacan que la elevada expresin de este antgeno se asocia significativamente con el desarrollo de enfermedad metastsica y con parmetros clsicos y con stos marcadores tumorales considerados de mal pronstico (Bouzubar et al., 1989; Sahin et al., 1991; Weikel et al., 1991; Gaglia et al., 1993; Railo et al., 1993; Beck et al., 1995; Racca et al., 1995; Ioachim et al., 1996; Pierga et al., 1996; Oehler et al., 1997; Molino et al., 1997; Rudolph et al., 1999).
En nuestra serie la ausencia de tincin de la protena pS2 se asoci a las metstasis precoces (p=0,01). El riesgo relativo de metstasis de las pacientes con cnceres pS2+ es 0,14 veces el de las pacientes con cnceres pS2-, es decir, la positividad de esta protena disminuye el riesgo de metstasis 7,14 veces (I.C. 95%:0,02 1,07). Sin embargo, la inclusin del valor nulo en el lmite superior del intervalo de confianza no permite rechazar la hiptesis nula. (Tabla 22b). Se observ adems, un mayor nmero de metstasis en tumores pS2- con grados histolgicos y nucleares II y III. (Tabla 22a y 23a). As, en nuestra serie la ausencia de pS2 se asoci a cnceres que presentaron una moderada y escasa diferenciacin celular. Lo contrario se evidenci en el grupo de pacientes que no recidivaron durante los 36 meses, en stos, la tincin positiva de pS2 fue frecuente en tumores con grados histolgicos y nucleares I y II, y por tanto, con mejor diferenciacin celular (p=0,04 y p=0,08, respectivamente). Los fenotipos tumorales pS2-/ki67+ (n=12), ps2-/PCNA (n=9), pS2-/catepsina D+ (n=9) fueron frecuentes en las pacientes que desarrollaron metstasis precoces. (Tabla 23a). Estos datos apoyan la hiptesis que considera que la falta de tincin para pS2, una protena cuya sntesis es inducida principalmente por los estrgenos, traduce en algunos tumores una prdida de la funcionalidad de la va estrognica, una menor diferenciacin citolgica, mayor proliferacin celular y un estado de menor hormonodependencia. En la serie que nos ocupa, la informacin aportada por esta protena ha sido superior a la suministrada por los receptores hormonales. En los trabajos basados en la determinacin de la pS2 mediante tcnicas inmunoenzimticas,
inmunorradiomtricas y Northern blotting, la ausencia de expresin de esta protena se ha relacionado con una disminucin del ILE (Foekens et al., 1990; Foekens et al., 1993; Foekens et al., 1994; Gion et al., 1993; Thompson et al., 1998). En contraste, a lo observado en esta serie, otros autores mediante determinacin IHQ no han objetivado una asociacin entre la recidiva y la positividad de esta protena, si bien, estos estudios a diferencia del nuestro, emplearon un
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dintel de positividad del 5% y la expresin de la protena pS2 fue muy superior a la que hemos registrado (Henry et al., 1991; Thor et al., 1992; Cappelletti et al., 1992; Dookeran et al., 1993).
En esta serie la ausencia de glicoprotena P tambin se relacion directamente con el desarrollo de enfermedad metastsica, aunque sin lograr la significacin estadstica preestablecida en el diseo. (Tabla 23a). El riesgo relativo de metstasis fue menor (RR: 0,22; I.C. 95%:0,03 1,60) en tumores glicoprotena P+ que en glicoprotena P-. (Tabla 23b). La determinacin de glicoprotena P se realiz slo en 11 de las 16 pacientes que eventualmente recidivaron y por tanto, la falta de estos datos y la inclusin del valor nulo en el intervalo de confianza no permite sostener esta afirmacin. Los resultados en esta serie contrastan con los publicados en la literatura donde la elevada expresin y no la ausencia de glicoprotena P se ha relacionado con tumores avanzados, indiferenciados y con elevados ndices de proliferacin celular; con una menor respuesta al tratamiento quimioterpico; con el desarrollo de metstasis locorregionales y a distancia; y con una menor supervivencia (Verelle et al., 1991; Botti et al., 1993; Charpin et al., 1994; De la Torre et al., 1995; Linn et al., 1995; Linn et al., 1996; Gregorcyk et al., 1996). Sin embargo, a diferencia de nuestra serie, la mayora de estos estudios se han basado en la determinacin de la glicoprotena P en tumores de mama avanzados. An as, existen contradicciones con relacin al verdadero valor pronstico de esta glicoprotena. Un metanlisis reciente concluye que la glicoprotena P esta relacionada con la resistencia y pobre respuesta a la quimioterapia (Trock et al., 1997).
En nuestra serie las metstasis precoces han sido independientes de la expresin de los receptores hormonales, y aunque el riesgo relativo de metstasis de las pacientes con cnceres RE+ (RR:0,75; I.C. 95%: 0,3 1,9) y RPg+ (RR:0,8; I.C. 95%: 0,34 2,1) es menor en comparacin con las enfermas con RE y RPg negativo, la inclusin del valor nulo en el intervalo de confianza muestra que el grado de asociacin no es estadsticamente significativo. Al menos la mitad de las pacientes que recidivaron tuvieron tumores RE+/Ki-67+, aunque la asociacin careci de significacin. (Tabla 23a). En cambio, en las 92 pacientes que durante los 36 meses se mantuvieron libre de metstasis, la ausencia de metstasis se relacion con una mayor proporcin de tumores RE+/ki-67- (67,3%) en comparacin con RE-/ki-67+ (32,3%). En estos casos la presencia del RE junto con la baja expresin de ki-67 se asoci significativamente con la ausencia de enfermedad metastsica (p=0,009) y por ende, un mejor pronstico en este grupo. Varios autores han demostrado el valor pronstico de los receptores de estrgeno y progesterona en el cncer de mama (Bishop et al., 1979; Samaan et al., 1981; Crowe et al., 1991; Fisher et al., 1988). No obstante, una elevada expresin del RE tambin se ha relacionado con tumores con un pronstico tan desfavorable como los tumores RE- (Thorpe et al., 1993;
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Encarnacin et al., 1993). Nosotros hemos observado que el RE cuando se mide conjuntamente con el Ki-67 se comporta como una variable de confusin, dependiendo el valor pronstico del antgeno de proliferacin celular Ki-67.
El desarrollo de enfermedad metastsica fue independiente de la expresin de la Hsp27 (p=0,37), aunque el 92,3% (n=12) de las pacientes que recidivaron sus tumores primarios haban teido positivamente para la Hsp27+. (Tabla 23a). Un riesgo relativo de metstasis de 2,15 de tumores Hsp27+ con respecto a Hsp27- (I.C. 95%:0,3 15,3) careci de significacin estadstica. (Tabla 23b). En este estudio la expresin de esta protena se ha relacionado directamente con tumores proliferativos (ki-67: p=0,08; y PCNA: p=0,006) y con rasgos citolgicos de desdiferenciacin con (alto grado histolgico: p=0,01), es decir, con parmetros considerados de mal pronstico. (Tabla 21). Aunque previamente se haba sealado que la expresin de Hsp27 se asociaba a una disminucin del ILE (Chamness et al., 1989), especialmente en pacientes con ganglios negativos (Tandon et al.,1990), estudios posteriores han puesto de manifiesto que este marcador no es de gran valor pronstico, a pesar de que su positividad se ha relacionado con tumores con escasa diferenciacin, estadios T avanzados y disminucin de la supervivencia (Thor et al., 1991; Love et al., 1994; Tetu et al., 1995). Adems, aunque las Hsp27 pueden ser inducidas en las clulas neoplsicas por estrgenos y factores de crecimiento, su escasa especificidad puede deberse a que su sntesis tambin puede ser estimulada tanto en clulas normales como neoplsicas por una amplia variedad de estmulos fsicos y qumicos (Chretien y Laundry 1988; Santell et al., 1992; Zhou et al., 1993; Faucher et al., 1993; Huot et al., 1995; Konishi et al., 1997).
Tampoco hemos observado una asociacin estadsticamente significativa entre las metstasis y la expresin del EGFR, aunque proporcionalmente recidivaron ms tumores EGFR+ que EGFR-. (Tabla 23a). El riesgo relativo de metstasis fue 1,68 mayor (I.C. 95%:0,59 4,77) en tumores EGFR+ que en tumores EGFR-, sin embargo, este dato no es significativo. (Tabla 23b). En la serie en general la expresin de este marcador fue baja, aunque el nmero de tumores EGFR+ que recidivaron (n=6) constituyeron un 37,5% de las metstasis. La expresin del EGFR en el estudio que nos ocupa se ha relacionado con tumores indiferenciados (p=0,0003) y con la ausencia de receptores hormonales (p=0,00002) y por tanto, con parmetros de peor pronstico. (Tabla 21). En las metstasis tambin hemos objetivado una relacin inversa entre la expresin del EGFR y el RE ( 10 tumores RE+/EGFR-; p=0,01). En la serie de Schroeder et al., (1997), que semeja a la nuestra en porcentajes de positividad (19%) y nmero de enfermos (n=111), tan solo observaron una relacin inversa entre el EGFR y el RE, careciendo este
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marcador de valor pronstico. Por el contrario, para algunos autores la positividad para el EGFR es un indicador de recidiva (Gasparini et al., 1992; Toi et al., 1994; Klijn et al., 1994).
En nuestro estudio la expresin de C-erbB-2 no se relacion con la aparicin de metstasis precoces (p=0,51). (Tabla 23a). El riesgo relativo de metstasis de cnceres C-erbB-2+ es de 1,13 veces (I.C. al 95%: 0,42 2,98) el de cnceres C-erbB-2-, aunque este valor carece de significacin estadstica. (Tabla 23b). En nuestra serie cerca de la mitad de los tumores fueron C-erbB-2+ (43%) y esta proporcin se mantiene en las recidivas a distancia (C-erbB-2 +, n=7; C-erbB-2 - n=7). Los resultados publicados con relacin al valor pronstico independiente de ILE del C-erbB-2 son discordantes. Algunos grupos citan que la sobreexpresin de C-erbB-2 se asocia a tumores de mayor tamao, con altos grados histolgicos, metstasis ganglionares, ausencia de RE y mayor nmero de metstasis, aunque en el anlisis multivariante su valor pronstico fue inferior al de los parmetros clsicos (van de Vijver et al., 1988; Rilke et al., 1991; Quenel et al., 1995). Para Gasparini et al., (1994) y Reed et al., 2000 la tincin positiva de C-erbB-2 careci de valor pronstico en pacientes con ganglios negativos. En cambio, en otras publicaciones se seala que la positividad de este marcador se relaciona directamente con el desarrollo de metstasis, destacando adems, que la tincin positiva para C-erbB-2 se acompaaba de sobreexpresin de ki67, EGFR y p53 (Nicholson et al., 1993; Stal et al., 1994; Delarue et al., 1994; Weissener et al., 1998; Gago et al., 1998; Quinn et al., 1999). En la literatura se cita un grupo de tumores RE+/C-erbB-2+ caracterizados por una pobre respuesta al tratamiento endocrino y una corta supervivencia (Allred et al., 1992; Wright et al., 1992; Borg et al.,1994). Nosotros hemos identificado este fenotipo tumoral slo en 3 de los 16 tumores que recidivaron.
Aunque hemos observado una mayor proporcin de metstasis en cnceres con elevados ndices de PCNA y el riesgo relativo de metstasis de los cnceres PCNA+ fue 1,9 veces superior al de los cnceres PCNA- (I.C. 95%:0,6 5,3), la asociacin careci de significacin estadstica. (Tabla 23a y 23b). Tanto el Ki-67 como el PCNA se han utilizado para medir la fraccin de proliferacin celular, pero sus funciones en el ciclo de divisin celular son distintas. Para algunos autores este marcador es de escasa utilidad para medir la fraccin de crecimiento y su positividad no siempre se corresponde con un aumento de la actividad proliferativa (van Dierendonck et al., 1991; Gillet et al., 1993). Por otra parte, en algunos trabajos la elevada expresin de este antgeno mostr una asociacin significativa con la recidiva y con una disminucin de la supervivencia (Aaltomaa et al., 1992; Haerslev et al., 1994; Sheen-Chen et al., 1997). Gohring et al., (1994) sealan que el PCNA es un indicador de recidiva slo en pacientes con ganglios axilares positivos. Destaca en estos estudios que el ndice de PCNA se
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bas en el porcentaje de ncleos teidos y no en el valor de la mediana. En nuestra serie los resultados han sido similares a los descritos en los trabajos que han utilizado el anticuerpo monoclonal PC10 y el dintel de positividad se bas en el promedio o la mediana (Thomas et al., 1993; Gasparini et al., 1994).
En nuestro estudio la expresin de p53 no se relacion con la aparicin de metstasis precoces. Los tumores p53+ supusieron el 21% de la serie y el 25% del total de metstasis (n=4). (Tablas 4 y 23a). Este porcentaje se mantiene en los casos con metstasis, de tal modo, que las partes restantes de las metstasis no pueden ser explicadas por la sobreexpresin de esta protena. La razn de riesgos de metstasis de cnceres p53+ es 1,23 veces el de los cnceres p53- (I.C. al 95%:0,43 3,50), aunque este dato no es estadsticamente significativo (Tabla 23b). Sin embargo, en las enfermas que desarrollaron enfermedad metastsica la sobreexpresin de p53 se relacion significativamente con grados histolgicos (p=0,03) y nucleares (p=0,07) moderados y altos. En el grupo de pacientes sin metstasis durante los 36 meses, la proporcin de fenotipos tumorales p53-/ki67- (p=0,02) y p53-/PCNA- (p=0,01) haba sido significativamente superior a los fenotipos con expresin conjunta de ambos marcadores. De este modo, en el grupo sin metstasis, la ausencia de expresin de p53 y bajos ndices de tumores ki67 y PCNA se relacionaron significativamente con un mejor pronstico. En varios estudios inmunohistoqumicos, tanto en cnceres con ganglios negativos como positivos, la expresin de p53 se ha relacionado significativamente con una disminucin del intervalo libre y de la supervivencia (Thor et al., 1992; Barnes et al., 1993, Silvestrini et al., 1993; Gohring et al., 1995). En estos trabajos se ha utilizado el anticuerpo monoclonal P1801, siendo el nmero de enfermos y los porcentajes de positividad superiores al registrado en nuestra serie. En cambio, en otros estudios como en el nuestro, a pesar de que la expresin de p53 se asoci significativamente a altos grados histolgicos y nucleares, ausencia de receptores hormonales, elevada expresin de C-erbB-2 y altos ndices de proliferacin celular, en el anlisis multivariante otros parmetros fueron de mayor valor pronstico que la p53 (Isola et al., 1992; Bianchi et al., 1997). Lipponen et al., (1993) publican que paradjicamente tumores con ganglios positivos y p53+ tuvieron un mayor intervalo libre de enfermedad. Segn Fresno et al., (1997) la elevada expresin de p53 en tumores con ganglios negativos se relacion significativamente con una disminucin de la supervivencia, con la salvedad que este autor utiliz un dintel de positividad alto (50% > de clulas teidas).
Se observ una relacin directa entre la elevada expresin de catepsina D en el componente ductal y el desarrollo de enfermedad metastsica, aunque las diferencias entre las proporciones de tumores con tincin positiva o negativa no fueron significativas. (Tabla 23a). El riesgo
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relativo de metstasis de las pacientes con cnceres catepsina D+ fue 1,6 veces (I.C. 95%: 0,6 4,1) el de las pacientes con cnceres catepsina D-. En la literatura consultada los resultados con relacin al valor pronstico de la catepsina D determinada por tincin IHQ son variables y contradictorios. Segn algunos autores el valor pronstico de la catepsina D reside en su elevada expresin en el componente estromal (Joensuu et al., 1995; Nadji et al., 1996; Tetu et al., 1999; Gonzalez-Vela et al., 1999). En contraste, una elevada expresin de catepsina D en el componente ductal se relacion con una disminucin del intervalo libre y de la supervivencia (Losch et al., 1998). Algunos autores han encontrado que la catepsina D es de valor pronstico en tumores con ganglios negativos (Tandon et al., 1990; Isola et al., 1993; Gohring et al., 1996), en cambio, Ravdin et al., (1994) citan el valor pronstico nulo de la catepsina D determinada por Western blotting e IHQ en 927 cnceres ductales con ganglios axilares negativos. 2-a) Anlisis de la asociacin entre los parmetros clnico-patolgicos y las recidivas precoces en pacientes con ganglios axilares positivos. Cuando analizamos las metstasis en funcin de la positividad de los ganglios axilares, la estadificacin fue la variable que mostr una asociacin significativa con el desarrollo de la enfermedad metastsica precoz, correspondiendo el 70% de las metstasis en este subgrupo (n=10) al estadio III. (Tabla 24). Tambin se observo una dbil asociacin entre las metstasis y los cnceres con grados nucleares III y ganglios en estadio N2 (p=0,07). 2-b) Anlisis de la asociacin entre los marcadores tumorales moleculares y las recidivas precoces en pacientes con ganglios axilares positivos. Al analizar las metstasis registradas en pacientes con cnceres con ganglios positivos (n=10), un ndice de Ki-67 por encima de la mediana y la elevada expresin de catepsina D se asociaron significativamente con el desarrollo de la enfermedad metastsica precoz. (Tabla 25).
Diversas series, que incluyen un mayor nmero de pacientes que la nuestra, han puesto de manifiesto una buena correlacin entre los elevados ndices de tincin positiva del antgeno Ki67 y la presencia de metstasis ganglionares (Charpin et al., 1988; Gaglia et al., 1993), as como un mayor nmero de metstasis precoces (Bouzubar et al., 1989; Sahin et al., 1991 Weikel et al., 1991; Beck et al., 1995; Archer et al., 1995).
En nuestra serie la expresin de la catepsina D se asoci con las metstasis en pacientes con ganglios axilares positivos. El riesgo relativo de metstasis de las pacientes con cnceres catepsina D+ y N+ fue 5,13 veces superior (I.C. 95%: 1,1 27,7) al de las pacientes con cnceres catepsina D+ y N- y, por consiguiente, las probabilidades de metstasis son mayores
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en este grupo de pacientes. (Tabla 28). Varios estudios en los que la determinacin de la catepsina D se ha realizado mediante mtodos inmunoenzimticos e inmunorradiomtricos hacen referencia a la asociacin de elevados niveles de catepsina D con la afectacin ganglionar y con una disminucin del ILE (Tandon et al., 1990; Brouillet et al., 1990; Pujol et al., 1993; Barbi et al., 1994; Ferno et al., 1994; Gion et al., 1995; Scorilas et al., 1999). Ardanavis et al., (1998) y Foekens et al., (1999) citan el valor pronstico de la catepsina D tanto en pacientes con ganglios positivos como negativos. En cambio, los trabajos basados en la determinacin IHQ de la catepsina D son contradictorios. Gohring et al., (1996) hacen referencia al valor pronstico de la catepsina D slo en pacientes con ganglios negativos. Loshc et al., 1998 sealan una asociacin significativa con las recidivas y una disminucin de la supervivencia en tumores con tincin positiva para la proteasa en el componente ductal. En cambio, para Joensuu et al., (1995) y Tetu et al., (1999) el valor pronstico de la catepsina D reside en su alta expresin en el componente estromal y no en el ductal. Segn Riley et al., (2000) la catepsina D (31 kDa) careci de valor para predecir la recidiva, sin embargo, la supervivencia fue significativamente menor en pacientes con elevada expresin y con ganglios positivos. 3-a) Anlisis de la asociacin entre los parmetros clnico-patolgicos y las recidivas precoces en pacientes con ganglios axilares negativos. La cohorte de pacientes que compone este subgrupo es pequea (n=6), lo que supone ciertas limitaciones para obtener resultados debido al pequeo tamao muestral, sin embargo, el porcentaje de metstasis (37,5%) fue similar al descrito en otras series que incluyen un mayor nmero de pacientes (Rosen et al., 1989; Quiet et al.,1995). Nosotros no hemos observado asociacin entre las metstasis precoces en pacientes con ganglios negativos y los parmetros clnico-patolgicos, lo cual hace que sea un grupo de alto inters y reafirma la necesidad de investigar otros parmetros de pronstico que nos permita identificar este 30% de metstasis y as poder seleccionar una terapia adyuvante ms adecuada. Destaca adems, que la mitad de estas pacientes recibieron radioterapia postoperatoria y tamoxifn como nica terapia adyuvante (n=3), por tanto, este tipo de tratamiento no fue eficaz para evitar la aparicin de enfermedad metastsica. La seleccin para el tratamiento hormonal se bas en el estado menstrual (5 postmenopusicas y 1 premenopusica) y del RE (RE+= 4 vs RE-= 2). Segn Rosen et al., (1989) fallecen un 30% de las pacientes con cnceres con ganglios negativos tratadas con ciruga exclusivamente. Por otra parte, desconocemos en este subgrupo el efecto sobre el desarrollo de las metstasis si se hubiese administrado citotxicos como tratamiento nico o complementario con el tratamiento hormonal.
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3-b) Anlisis de la asociacin entre los marcadores tumorales moleculares y las recidivas precoces en pacientes con ganglios axilares negativos. Aunque faltan datos debido a la ausencia de determinacin de algunos marcadores en este subgrupo, la ausencia de expresin de la protena pS2 se asoci significativamente con las metstasis precoces. De los 6 tumores que recidivaron en este subgrupo destacan los fenotipos tumorales RE+/pS2- (n=4) vs RE-/pS2- (n=2); pS2-/catepsina D- (n=4) vs pS2-/catepsina D+ (n=2) y pS2-/ki67+ (n=3) vs pS2-/ki67- (n=1). (Tabla 27). La ausencia de expresin de esta protena en tumores RE+, junto con una mayor frecuencia de tumores pS2/catepsina D- y pS2/ki67+, sugiere la prdida induccin de la sntesis de esta protena a travs de la va estrognica y su relacin con una mayor actividad proliferativa. Tambin dentro de este subgrupo se observ una mayor proporcin de tumores pS2-/ GH II (n=4) y pS2-/GH III (n=1) y pS2-/GN II (n=4) y pS2-/GN III (n=2). (Tablas 26 y 27). En nuestra serie observamos que esta protena se relaciona con la diferenciacin tumoral y sera un indicador de hormonodependencia definiendo un subgrupo de tumores RE+ de mayor agresividad.
Inicialmente la pS2 conjuntamente con la catepsina D se utiliz en diversos experimentos para medir la integridad de las vas de sealizacin estrognica (Westley et al., 1984; Cavailles et al., 1989; Lane et al., 1999). Nuestros resultados concuerdan con los descritos en otras series donde la expresin de esta protena vara inversamente con el grado de diferenciacin del tumor y con la actividad proliferativa (Henry et al., 1991; Cappelletti et al., 1992). Tambin se ha objetivado en algunos estudios inmunoenzimticos e inmunorradiomtricos un menor nmero de recidivas y mayor supervivencia en los cnceres de mama con elevados niveles de esta protena (Foekens et al., 1990; Foekens et al., 1993; Gion et al., 1993; Foekens et al., 1994). Thompson et al., (1998), que midieron el RNAm-pS2, demostraron un menor nmero de recidivas y mejor supervivencia en tumores con ganglios negativos y expresin positiva de pS2.
En contraste, a lo que hemos observado en este subgrupo de pacientes, otros autores que han determinado la expresin de pS2 mediante tcnicas inmunohistoqumicas no han podido constatar una asociacin entre la positividad de pS2 y las recidivas, aunque si han objetivado una mejor respuesta a la terapia endocrina de los cnceres pS2+ (Henry et al., 1991; Thor et al., 1992; Cappelletti et al., 1992; Dookeran et al., 1993). En un estudio reciente se observ que los tumores RE+/pS2+ presentaron una mejor respuesta al tamoxifn y una supervivencia mas prolongada (Elledge et al., 2000). El porcentaje de expresin de pS2 en nuestra serie fue mas bajo debido que, a diferencia de estos trabajos, utilizamos un dintel de positividad del 10% y un anticuerpo monoclonal diferente. Estos autores han establecido el punto de corte en un 5% de clulas con tincin positiva existiendo, adems, una gran heterogeneidad en los patrones de
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tincin citoplsmica. Quiz un 5% de tincin positiva sea un dintel no adecuado para una protena presente en el tejido sano y que su expresin se eleva significativamente en los cnceres. La concentracin de esta protena en la glndula mamaria normal oscila segn diferentes autores, entre 0 y 2,16 ng/mg prt (Predine et al., 1992) y 0 y 10,5 ng/mg de prt (media 1,6; mediana 0,2), mientras que en el tejido cancergeno flucta entre 0,3 y 43,3 ng/mg prt (media 11,5; mediana:5,7) (Hhnel et al., 1993). Probablemente, los mejores resultados observados en los estudios basados en el anlisis de la concentracin citoslica de la protena en las neoplasias se deban a que los puntos de corte se han escogido tomando en cuenta los valores promedio en los cnceres. Los dinteles de positividad descritos en la literatura segn diferentes autores han sido de: 11 ng/mg prt (Foekens et al., 1990) 2 ng/mg prt (Foekens et al.,1993); 11 ng/mg prt (Foekens et al., 1994); 4 ng/mg prt (Gion et al., 1993); 2 ng/mg prt (FernndezFernndez et al., 1993) y 4 y 11 ng/mg prt (Racca et al., 1995). En cambio, en los estudios inmunohistoqumicos an no se ha seleccionado el dintel de positividad ms adecuado.
II- ANALISIS DEL INTERVALO LIBRE DE ENFERMEDAD A 36 MESES CON RELACION A LOS PARMETROS CLINICOPATOLOGICOS MOLECULARES.
1-) Anlisis del intervalo libre de enfermedad a 36 meses con relacin a los parmetros clnico-patolgicos.
MARCADORES
TUMORALES
En nuestro estudio hemos observado una disminucin del intervalo libre de enfermedad a 36 meses en pacientes que presentaban cnceres multicntricos, ganglios axilares clasificados N2, afectacin de 4 o ms ganglios, rotura con desbordamiento de la cpsula ganglionar y un estadio III.
El ILE disminuy significativamente en las enfermas con ms de una lesin en la misma mama evidenciando un comportamiento ms agresivo de los cnceres multicntricos. (Grfica 1). La razn de riesgos estimada para el ILE de un cncer multicntrico fue 3,3 veces (I.C. 95%: 1,1 10,2) el de un tumor nico, as, en este estudio la presencia de ms de un foco de cncer en el mismo cuadrante o en la mama condicion una peor evolucin. (Tabla 28). En algunos trabajos la multicentricidad se ha relacionado a una mayor frecuencia de metstasis ganglionares y recidivas locales, sin embargo, no hay suficientes datos sobre la evolucin final de estos tumores (Lesser et al., 1982; Kurtz et al., 1990). En la serie que nos ocupa la multicentricidad
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con relacin a las metstasis ha sido independiente de la afectacin ganglionar.
Por
consiguiente, consideramos que la presencia de ms de un foco de cncer infiltrante puede suponer una carga tumoral adicional y una mayor posibilidad de originar metstasis. En el anlisis multivariante este parmetro ha sido de valor pronstico independiente para el ILE.
La comparacin de las curvas de intervalo libre de enfermedad a 36 meses mostr diferencias significativas entre los tumores sin afectacin ganglionar y aquellos con ganglios axilares positivos. La evolucin ha sido significativamente peor, con una cada importante de las curvas en las pacientes con ganglios axilares clasificados N2 (HR:4; I.C. 95%:1,2 13), cuando hubo compromiso de cuatro o ms ganglios axilares (HR: 3,7; I.C 95%:1,2 11,4) y en los casos donde se ha objetiv la rotura con desbordamiento de la cpsula del ganglio infiltrado (HR:3,1; I.C. 95%:1,1 8,7). (Grficas 2,3,4 y Tabla 28). El tamao de los ganglios con metstasis no influy en el curso clnico de las enfermas, siendo las curvas prcticamente paralelas. De este modo la afectacin ganglionar N2, segn el anlisis univariante, constituye un factor pronstico para el desarrollo de enfermedad metastsica; dato que fue confirmado en el anlisis multivariante. Las metstasis aparecieron tempranamente cuando hubo ms ganglios afectados, de tal manera, que a mayor nmero de ganglios infiltrados mayor es la probabilidad de metstasis. Los resultados en nuestro estudio son anlogos a los descritos en otras publicaciones, siendo la afectacin ganglionar (Fisher et al., 1978; Nemoto et al., 1980; Carbone et al., 1980; Carter et al., 1987; Rosen et al., 1989) y especialmente el nmero de ganglios (Fisher et al., 1969; Carbone et al., 1981; Carter et al., 1987) y el desbordamiento de la cpsula ganglionar (Fisher et al., 1976; Mambo et al., 1977; Goldstein et al., 1995; Leonard et al., 1995) importantes parmetros de pronstico para la recidiva y la supervivencia.
Las probabilidades de supervivencia libre de enfermedad a 36 meses postoperatorios fueron significativamente inferiores en pacientes en el estadio III en comparacin con el estadio II y el I. La cada de la curva de las enfermas clasificadas en estadio III es progresiva y acentuada. En cambio, las diferencias entre el estadio II y I no son significativas durante este perodo de tiempo, siendo las curvas casi paralelas, destacando por tanto, el mal pronstico de las pacientes que fueron clasificadas en el estadio III. (Grfica 5). En la serie que nos ocupa, la razn de riesgos estimada para las metstasis de las pacientes clasificada en el estadio III fue 6,3 veces superior (I.C. 95%:1,6 24,3) al de pacientes en el estadio I. (Tabla 28). El valor pronstico de la estadificacin TNM para el ILE objetivado en el anlisis univariante se corrobor en el anlisis multivariante. De manera similar a lo descrito en otros estudios, encontramos una elevada frecuencia de recidivas en pacientes en estadio III (Schottenfeld et al , 1976; Arnold y
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Lesnick 1979; Frachia et al., 1980; McCready et al., 1989; Scholl et al., 1994; Schwartz et al., 1994).
Con relacin al tamao tumoral no se observaron diferencias estadsticamente significativas entre las curvas de ILE a 36 meses. (Grfica 6) La razn de riesgos estimada para el ILE de las enfermas con un cncer de ms de 5 cm fue 3,6 veces (I.C. 95%: 0,9 15,1) el de las enfermas con un tumor inferior a 2 cm, sin embargo, las diferencias no son estadsticamente significativas al incluir el valor nulo en el intervalo de confianza. (Tabla 28). En nuestra serie, tanto en el anlisis univariante como en el multivariante, el tamao tumoral no constituy un parmetro pronstico para la enfermedad metastsica a 36 meses, aunque destaca una disminucin del ILE en los casos de tumores mayores de 5 cm, de tal modo, que se precisara de tiempo de seguimiento mas prolongado o un mayor tamao muestral para demostrar si existen o no diferencias significativas. (Grfica 6) Diversos estudios describen una relacin inversa entre el tamao tumoral y el ILE y la supervivencia global (Eggers et al., 1941; Berg y Robbins 1966; Fisher et al., 1969; Fisher et al., 1986), pero a diferencia de nuestra serie, estos trabajos incluyen un mayor nmero de pacientes y tiempos de seguimiento ms prolongados. No obstante, en nuestra serie el tamao tumoral cuando se valor conjuntamente con la afectacin ganglionar para definir la estadificacin TNM, especialmente el estadio III, constituy un parmetro pronstico para establecer el riesgo de metstasis. Aunque la afectacin ganglionar por si misma mostr ser un parmetro pronstico importante para la recidiva precoz, la razn de riesgos de las pacientes clasificadas en el estadio III es superior (HR:6,3; I.C. 95%:1,6 24,3) al de las pacientes con ganglios axilares N2 (HR:3,9; I.C 95%: 1,2 13), as, de alguna manera el tamao tumoral posee algn efecto aditivo cuando se combina con la afectacin ganglionar. Rosen et al., (1989) demostraron que los tumores T1 presentaron un mayor nmero de recidivas durante los dos primeros aos de seguimiento cuando estaban afectados ms de 4 ganglios (48%), en comparacin con la afectacin de 1 a 3 ganglios (25%) y de 0 ganglios (5%). El estudio de Rosen et al., (1989) corrobor que cuando se comparan tumores con un dimetro de 2 o menos cm, es decir del mismo tamao, el efecto sobre el pronstico para la recidiva del tamao desaparece, siendo la afectacin ganglionar el parmetro de mayor importancia. De manera similar, en el estadio III, el factor principal o determinante de recidivas lo constituye la positividad de los ganglios axilares (Frachia et al., 1980; McCready et al., 1989).
No se observaron diferencias estadsticamente significativas entre las curvas de metstasis a 3 aos segn el tamao de los ganglios infiltrados y la gradacin histolgica y nuclear. (Grficas 7, 8, 9). Sin embargo, las pacientes con grados histolgicos y nucleares I, correspondientes a tumores con caractersticas arquitecturales y citolgicas de buena
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diferenciacin, tuvieron un mejor pronstico con un menor nmero de metstasis que las pacientes con grados histolgicos y nucleares II y III. La razn de riesgos estimada de metstasis para las pacientes con un cncer con un grado nuclear I fue 1,6x10-6 veces (I.C. 95%: 0,0 - --) el de las enfermas con grado nuclear III. Asimismo, la razn de riesgos estimada para el ILE de las enfermas con cncer grado histolgico III fue de 1,4 veces (I.C. 95%:0,3 7,9) el de las pacientes con tumor grado histolgico I y de 1,1 veces (I.C. 95%: 0,2 5) el de pacientes con grado histolgico II en comparacin con aqullas con grado histolgico I. (Tabla 28). Sin embargo, estos datos carecen de significacin estadstica al quedar incluido el valor nulo en el intervalo de confianza y por tanto, no podemos rechazar la hiptesis nula. En nuestra serie observamos un exceso de pacientes clasificadas en grados histolgicos y nucleares intermedios, lo que dificulta las comparaciones entre los grupos y muestra el grado de subjetividad inherente a este sistema de clasificacin. En este caso podemos concluir que en nuestro estudio la gradacin nuclear e histolgica no constituy un parmetro de pronstico para la enfermedad metastsica a 36 meses.
Por otra parte, se observ una mala evolucin con una importante disminucin del ILE a 36 meses en las pacientes con cnceres grado nuclear e histolgico III y ganglios axilares en estadio N2. Cuando la gradacin nuclear se valor con relacin a la afectacin ganglionar se apreciaron diferencias significativas entre las curvas de ILE. (Grfica 10). La razn de riesgos para las metstasis de una paciente con un cncer con ganglios N2 y grado nuclear III fue 7,4 veces (I.C. 95%:1,2 46,4) el de una paciente con idntica afectacin ganglionar y un grado nuclear I. Con relacin a la gradacin histolgica la razn de riesgos de las pacientes con cnceres con ganglios N2 y gradacin histolgica III fue 4,5 veces (I.C. 95%: 0,7 25) el de pacientes con grado histolgico III, careciendo este dato de significacin estadstica. (Tabla 28). Nuestro estudio muestra que existe una relacin entre el grado de diferenciacin celular del tumor medido por la gradacin nuclear y las metstasis ganglionares. En la literatura se describe un aumento en el nmero de recidivas y una disminucin de la supervivencia de tumores con gradacin histolgicia y nuclear III con respecto del I, siendo el efecto menor entre los grados histolgicos y nucleares II en comparacin con el I (Bloom y Richardson 1957; Black et al., 1975; Andersen et al., 1981; Fisher et al., 1990; Elston et al., 1991; Henson et al., 1991; Carter et al., 1992).
Segn se desprende del anlisis de las curvas de intervalo libre de enfermedad, el estado menstrual de las pacientes no influy en la evolucin clnica al menos durante el tiempo de seguimiento establecido en el diseo. Las curvas de ILE de pacientes premenopusicas y postmenopusicas mantienen un paralelismo evidente. (Grfica 11). La razn de riesgos de
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metstasis para las pacientes postmenopusicas fue de 1,02 veces (I.C. 95%:0,3 3,6) el de las pacientes premenopusicas. (Tabla 28). En consecuencia, en este estudio no se ha observado que el estado hormonal constituya un parmetro de pronstico a corto plazo. Algunos autores no encuentran diferencias con relacin al pronstico de pacientes postmenopusicas y premenopusicas, excepto aquellas pacientes premenopusicas que presentaron un cncer antes de los 35 aos de edad (Hyman et al., 1972; Rosen et al., 1984; Nixon et al., 1994; Albain et al., 1994; Bonnier et al., 1995).
No hemos observado diferencias estadsticamente significativas al contrastar las curvas de intervalo libre a 36 meses de las pacientes que recibieron radiaciones ionizantes en el postoperatorio con aqullas sin tratamiento. (Grfica 12). La razn de riesgos para el ILE de enfermas tratadas con radiaciones ionizantes fue 1,06 veces superior (I.C. al 95%: 0,4 2,8) en comparacin con las no tratadas con radioterapia. (Tabla 28). En proporcin haban sido radiadas mas enfermas en el estadio III en comparacin con el estadio I y II, sin embargo, el tratamiento radioterpico postoperatorio no influy en la evolucin clnica de las pacientes en ninguno de los estadios. Si bien es cierto, tan slo se registraron dos recidivas axilares en pacientes que no haban sido radiadas, siendo el resto metstasis a distancia tanto en el grupo radiado como en el que no recibieron radiaciones. Durante este perodo de seguimiento no se objetivaron recidivas locales en ninguna de las pacientes de los dos grupos. Varios estudios han demostrado que la radioterapia adyuvante, algunos independientemente de la administracin de quimioterapia u hormonoterapia, disminuye significativamente la incidencia de recidivas locorregionales sin tener un claro efecto sobre la enfermedad diseminada (Host et al., 1986; Rutqvist et al., 1989; Overgaard et al., 1990; Arraigada et al., 1995). Un metanlisis reciente hace referencia a la escasa influencia sobre la supervivencia global del tratamiento radioterpico tras ciruga conservadora de la mama (EBCTCG, 1995).
Con relacin al tratamiento quimioterpico adyuvante tampoco se apreciaron diferencias estadsticamente significativas entre las curvas de supervivencia para el intervalo libre de enfermedad durante los primeros 3 aos de seguimiento de los grupos que recibieron o no citotxicos en el postoperatorio. (Grfica 13). De las 38 pacientes, 30 con ganglios positivos y 8 con ganglios negativos tratadas con quimioterapia postoperatoria, recidivaron 7 del grupo con ganglios positivos. No recidiv durante el seguimiento de 36 meses ninguna de las 8 pacientes con ganglios negativos y que haban recibido quimioterapia, aunque sabemos que este grupo precisa un tiempo de seguimiento ms prolongado, debido a que las tasas de metstasis son ms bajas y tardas en este grupo en comparacin con las pacientes con afectacin ganglionar. Por tanto, en las 23 pacientes restantes con ganglios positivos la quimioterapia postoperatoria podra
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bien ser beneficiosa o condicionar un retraso en la aparicin de las metstasis. En estos casos el tiempo de seguimiento an corto, no permite esclarecer esta duda. Los resultados del EBCTCG han puesto de manifiesto el beneficio de la poliquimioterapia adyuvante previamente sealado por otros autores (Nissen-Meyer et al., 1978; Fisher et al., 1989; Goldhirsch et al., 1989; Senn et al., 1989; Bonadonna et al., 1995). Segn este estudio las recidivas se reducen principalmente durante el perodo comprendido entre 0 y 4 aos en las pacientes tratadas con poliquimioterapia y por consiguiente, de ser esto as, la quimioterapia podra condicionar un retraso en la aparicin de las metstasis en el grupo de pacientes de nuestra serie tratadas con citotxicos al quedar incluido su efecto en el periodo de seguimiento fijado en el diseo.
Tampoco objetivamos diferencias estadsticamente significativas entre las curvas de intervalo libre de enfermedad de pacientes tratadas o no con tamoxifn durante los primeros 36 meses de seguimiento. (Grfica 14). El nmero de metstasis en el grupo con hormonoterapia (n=8) fue idntico al grupo sin tratamiento (n=8). (Tabla 22a). De las 8 pacientes bajo tratamiento con tamoxifn y que desarrollaron enfermedad metastsica, 4 haban recibido previamente poliquimioterapia. A 21 pacientes de la serie general se les haba administrado citotxicos seguidamente de tratamiento hormonal al final del ltimo ciclo de quimioterapia y de este grupo con tratamiento secuencial recidivaron 4 (19%), de este modo, el 81% restante se mantuvo libre de enfermedad durante los primeros 36 meses. Sin embargo, para determinar si las curvas se siguen manteniendo paralelas o se separan estableciendo diferencias entre los dos grupos es necesario un tiempo de vigilancia ms prolongado. Como se ha sealado anteriormente el beneficio de la terapia adyuvante (quimioterapia y hormonoterapia) se sita entre los 0 a 4 aos (EBCTCG 1995), siendo el tiempo de seguimiento an corto para valorar con exactitud los efectos del tratamiento complementario. Sin embargo, el objetivo de este estudio es detectar las variables que puedan ser de valor pronstico para las metstasis precoces, an a pesar de la influencia que pueda ejercer en algunos casos el tratamiento adyuvante. 2-) Anlisis del intervalo libre de enfermedad a 36 meses con relacin a los marcadores tumorales moleculares. En esta serie se ha objetivado una disminucin del intervalo libre de enfermedad a 36 meses de las pacientes con cnceres que carecan de expresin de la protena pS2, en aquellos cnceres con porcentajes de clulas Ki-67 por encima de la mediana y en los cnceres con ganglios positivos y elevada expresin de catepsina D.
Presentaron una disminucin del ILE a 36 meses las enfermas con cnceres pS2 negativo (Grfica 15). La razn de riesgos estimada para el ILE de pacientes con cnceres pS2+ fue 0,14
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veces (I.C. 95%:0,02 1,0) el de pacientes con cnceres pS2-, indicando un menor riesgo de metstasis para aqullas cuyos cnceres tien positivamente para este marcador, sin embargo, la significacin (p=0,054) se aleja del valor p prefijado en el diseo al quedar incluido el valor nulo en el intervalo de confianza. (Tabla 28). La curva de intervalo libre de enfermedad decrece con mayor rapidez en pacientes con ganglios negativos y ausencia de expresin de pS2, lo que indica que las pacientes con tumores pS2+ y ganglios negativos presentaron un menor nmero de metstasis. (Grafica 16). La razn de riesgos estimada para la metstasis de pacientes con cnceres pS2+ y ganglios negativos fue 0,02 (I.C. 95%: 2,5 x 10-5 20,3), de manera similar a lo expuesto anteriormente, hay una menor proporcin de metstasis en el grupo con positividad para la pS2, sin embargo, el intervalo de confianza incluye el valor nulo y no podemos rechazar la hiptesis nula (p=0,051). (Tabla 28). No obstante, aunque las diferencias no han alcanzado la significacin estadstica prefijada en el diseo, s se ha objetivado una mayor proporcin de metstasis en las pacientes con cnceres pS2- en comparacin con las pacientes con cnceres pS2+. En trabajos basados en la determinacin inmunoenzimtica e inmunorradiomtrica de pS2 se hace referencia al menor intervalo libre de enfermedad y supervivencia observado en pacientes con cnceres pS2 negativo (Foekens et al., 1990; Foekens et al., 1993; Gion et al., 1993; Foekens et al., 1994). La medicin del pS2-RNAm (Northern blotting), en 90 cnceres de mama, tambin demostr un menor nmero de metstasis y mejor supervivencia en el grupo de tumores con ganglios negativos y pS2+ (Thompson et al., 1998).
Los resultados observados en esta serie tambin se corresponden con los publicados por Molina et al., (1990) que, en un estudio basado en la determinacin IHQ de pS2 en 286 cnceres de mama con ganglios negativos, observaron una disminucin del intervalo libre y la supervivencia global en las pacientes con tincin negativa para la pS2. De manera similar Abbondanzo et al., (1990), en una serie basada en la determinacin IHQ de pS2 en 598 cnceres con ganglios axilares negativos, objetivaron una significativa mayor supervivencia en pacientes cuyos cnceres tieron positivamente para esta protena. En cambio, algunos trabajos basados en tcnicas inmunohistoqumicas citan su escaso valor pronstico demostrado en el anlisis multivariante, aunque si objetivaron en algunos casos un menor nmero de recidivas, una mayor supervivencia y una mejor respuesta al tratamiento endocrino de tumores pS2 positivo (Thor et al., 1992; Dookeran et al., 1993; Spyratos et al., 1994). Cappelletti et al., (1992) observaron en 200 cnceres de mama con ganglios negativos que los tumores RE-/pS2+ tuvieron un menor intervalo libre de enfermedad, efecto que atribuyeron a una mayor actividad proliferativa estimulada probablemente por la va de los factores de crecimiento. A diferencia de este estudio, en nuestra serie, la ausencia de expresin de la protena pS2 se asoci a una mayor actividad proliferativa y baja diferenciacin citolgica. Adems, los cnceres pS2+ fueron
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moderadamente y bien diferenciados y presentaban positividad para el RE, por tanto, la ausencia de expresin de esta protena sera de utilidad para definir un grupo de tumores RE+ con mayor riesgo de metstasis.
El anlisis de las curvas de supervivencia para el ILE a 36 meses evidencia una peor evolucin con una cada acentuada de la curva de las pacientes con cnceres con una elevada expresin del antgeno nuclear de proliferacin celular ki67. (Grfica 17). En el anlisis univariante el antgeno Ki-67 fue un parmetro pronstico para la enfermedad metastsica a corto plazo, siendo la razn de riesgos para el desarrollo de enfermedad metastsica de las pacientes con cnceres con valores de Ki-67 por encima de la mediana 15,1 veces superior ( I.C. 95%:1,9 114) al de las pacientes con porcentajes de tincin por debajo de la mediana. (Tabla 28). El aumento de expresin de ki67 conjuntamente con la afectacin ganglionar e independientemente del nmero de ganglios infiltrados (1 3, ms de 4) tambin condiciona un mal pronstico para la enfermedad metastsica precoz. (Grfica 18). Sin embargo, en esta serie el efecto sobre las metstasis en este caso no pudo ser atribuido exclusivamente a la afectacin ganglionar, demostrndose en el anlisis multivariante el valor prnostico de Ki-67. Aunque no en todos los estudios se ha podido demostrar el valor pronstico de la determinacin del antgeno ki67, en la literatura se describe que los cnceres con elevados ndices de ki-67 presentan una elevada actividad mitsica, una menor diferenciacin citolgica, metstasis ganglionares, un mayor nmero de recidivas y una menor supervivencia (Sahin et al., 1991; Gasparini et al., 1992; Railo et al., 1993; Veronese et al., 1993; Gaglia et al., 1993; Beck et al., 1995; Weikel et al., 1995; Pinder et al., 1995; Ioachim et al., 1996; Brown et al., 1996; Pierga et al., 1996; Molino et al., 1997; Rudolph et al., 1999). Las discrepancias observadas en los resultados de los distintos estudios se deben a diferencias en el nmero de pacientes incluidos y en los tiempos de seguimiento, a la falta de un dintel de positividad universal, y a las variaciones en la sensibilidad de los anticuerpos monoclonales utilizados (ki67, kiS2, MIB1). Sin embargo, a pesar de estas divergencias, el antgeno Ki-67 parece ser un mejor parmetro pronstico que los receptores hormonales y que el tamao tumoral. En nuestra serie la determinacin del antgeno ki-67 ha sido de utilidad para identificar un grupo de tumores con mayor probabilidad de metstasis precoces.
No se observaron diferencias significativas entre las curvas de ILE a 36 meses de las pacientes con cnceres con elevada expresin de catepsina D en comparacin con las que presentaban tumores con ausencia de tincin para la catepsina D. (Grfica 19). La razn de riesgos de metstasis de pacientes con tumores catepsina D+ fue 1,7 veces (I.C. 95%:0,6 4,7) el de pacientes con tumores catepsina D-, dato que careci de significacin estadstica. (Tabla
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28). Sin embargo, cuando se examinaron las curvas en funcin de la afectacin ganglionar se objetiv que las pacientes con elevada expresin de catepsina D y ganglios positivos tuvieron un peor pronstico, siendo el ILE menor en este grupo. (Grfica 20). La razn de riesgos de metstasis fue 5,1 (IC 95%: 1,1 27,7) veces superior en pacientes con tincin positiva para la catepsina D en las clulas ductales y con ganglios positivos. (Tabla 28). Por tanto, este marcador segn el anlisis univariante podra ser de utilidad para definir un grupo de pacientes con ganglios positivos con mayor riesgo de metstasis, aunque en el anlisis multivariante no se demostr su valor pronstico para la enfermedad metastsica. En la literatura los resultados con relacin al valor como factor pronstico para el ILE de esta proteasa y probablemente factor mitognico, son discordantes. Algunos estudios basados en tcnicas inmunoenzimticas e inmunorradiomtricas consideran a la catepsina D como un marcador de valor pronstico para el ILE y SG en pacientes con ganglios positivos y negativos (Spyratos et al., 1989; Pujol et al., 1993; Barbi et al., 1994; Ardanavis et al., 1998; Foekens et al., 1999), mientras que otros slo para el ILE (Thorpe et al., 1989; Namer et al., 1991). El valor como parmetro pronstico en pacientes con ganglios positivos ha sido citado por Seshadri et al., (1994) y Ferno et al., (1994). En cambio, para Tandon et al., (1990) y Kute et al., (1992) elevadas concentraciones de catepsina D han sido de utilidad en cnceres con ganglios negativos. Por otra parte, hay grupos que hacen referencia a su nulo valor pronstico para el ILE y SG (Maudelonde et al., 1988; Brouillet et al., 1990; Stonelake et al., 1994).
Los resultados de los estudios inmunohistoqumicos de la catepsina D con relacin a su valor pronstico son an ms contradictorios, debido a la ausencia de un dintel de positividad universal, a las diferencias en la sensibilidad de los anticuerpos monoclonales utilizados en los distintos trabajos y a la valoracin de la expresin que hacen algunos en el componente ductal o estromal. En consecuencia, resulta difcil poder comparar las distintas series. Para Henry et al., (1990), la tincin IHQ del componente ductal fue un indicador de pronstico para el ILE en los cnceres con ganglios positivos, mientras que para Gohring et al., (1996) lo fue en pacientes con ganglios negativos. Domagala et al., (1992) hacen referencia al nulo valor pronstico de la determinacin de catepsina D en las clulas ductales. Aaltonen et al., (1995) citan la mala evolucin observada en pacientes con elevada expresin de catepsina D y ganglios positivos, aunque en el anlisis multivariante la catepsina D no fue de valor pronstico independiente en comparacin con los parmetros clsicos. Para Joensuu et al., (1995), aunque las enfermas con elevada expresin de catepsina D tuvieron una menor supervivencia, este marcador careci de valor pronstico en el anlisis multivariante. Losch et al., (1998) hacen referencia al escaso valor pronstico para la supervivencia de la expresin de catepsina D en el componente estromal en comparacin con el ductal. En cambio, Tetu et al., (1999) citan el valor pronstico
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para el ILE y la supervivencia los cnceres con elevada expresin de la catepsina en las clulas estromales. Segn Riley et al., (2000) la catepsina D (31 kDa) no fue de valor para predecir las metstasis, aunque los cnceres con tincin positiva y ganglios positivos tuvieron una significativa menor supervivencia.
No se observaron diferencias estadsticamente significativas entre las curvas de intervalo libre de enfermedad a 36 meses en pacientes con cnceres RE+ y RE-. (Grfica 21). La razn de riesgos para el ILE de las enfermas con cnceres RE+ fue de 0,7 veces (I.C 95%: 0,2 1,9) el de las pacientes con cnceres RE-. (Tabla 28). El valor de la razn de riesgos estimado para la recidiva por debajo del 1 indicara un efecto protector, es decir, el riesgo de metstasis de los cnceres RE+ es 1,43 veces menor que el de los RE-, sin embargo, el valor de la hiptesis nula queda incluido en el intervalo de confianza y por tanto, la asociacin carece de significacin estadstica. As, en este trabajo se ha observado que el valor pronstico de los RE para el ILE a corto plazo es muy limitado, a pesar que la positividad para el RE se relacion con parmetros considerados de buen pronstico (apartado 1-a y 1-b). Estos resultados contrastan con los publicados basados en la determinacin de la concentracin citoslica de los RE, donde la diferencia de supervivencia libre de enfermedad y supervivencia a 5 aos entre los tumores RE+ y RE- es significativa (Samaan et al., 1981; Clark y McGuire et al., 1988; Fisher et al., 1989). Algunos autores con tiempos de seguimiento a 36 meses tambin encuentran un mayor nmero de metstasis en tumores RE- en comparacin con RE+ y sealan adems, que en el caso de producirse la recidiva esta es ms tarda en los tumores RE+ (Maynard et al., 1978; Cooke et al., 1979; Hubay et al., 1980; Bertuzzi et al., 1981). Por el contrario, y de manera similar a nuestra serie, otros trabajos no confirman el valor pronstico de los RE para la recidiva y la supervivencia (Hilf et al., 1980; Skinner et al., 1982; Shapiro et al., 1982; Butler et al., 1985). Varias de estas publicaciones corresponden a estudios retrospectivos con una mezcla heterogenea de casos N+/N- y donde no se han controlado las posibles interacciones con otras variables mediante anlisis multivariante. En los estudios en que se han realizado anlisis de riesgos proporcionales de Cox se ha demostrado una mayor supervivencia a largo plazo de los cnceres RE+ con ganglios negativos en comparacin con los tumores RE- (Fisher et al., 1989; Crowe et al., 1991;). En pacientes con ganglios positivos, el RE, tambin ha mostrado ser de valor pronstico en el anlisis multivariante (Godolphin et al., 1981; Parl et al., 1984; Clark et al., 1993; Molino et al., 1997) Los estudios inmunohistoqumicos tambin han puesto de manifiesto el mejor pronstico de las enferman con cnceres RE+ (Allred et al., 1990; Reiner et al., 1990; Crowe et al., 1991; Thor et al., 1992; Li et al., 1994). Stierer et al., (1995) en una serie basada en la determinacin IHQ de 288 cnceres de mama objetivaron una mejor supervivencia de tumores RE en el anlisis univariante, efecto que se perdi en el estudio
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multivariante. Klijn et al., (1994) hacen referencia a la prdida progresiva de utilidad pronstica a largo plazo y segn estos autores el valor pronstico del RE para la recidiva fue significativo a los 5 aos (p=0,01) disminuyendo considerablemente a los 10 aos (p=0,4), a diferencia del tamao tumoral, la afectacin ganglionar y el RPg que mantuvieron su valor pronstico.
Tambin observamos que la mitad de los cnceres que recidivaron presentaban el fenotipo tumoral RE+/ki67+ (Tabla 23a). El anlisis de las curvas de intervalo libre del RE+ con relacin a la positividad o negatividad del ki67 desvel que las pacientes con el fenotipo tumoral RE+/ki67+ tuvieron un menor intervalo libre de enfermedad en comparacin con las que presentaban el fenotipo RE+/ki67-, siendo esta diferencias estadsticamente significativas (p=0,003). Sin embargo, el efecto de este fenotipo tumoral para el desarrollo de metstasis se debi a la expresin del antgeno ki-67 comportndose el RE como una variable de confusin. No obstante, autores como Romain et al., (1994), en un estudio de 542 pacientes postmenopusicas, evidenciaron que algunos tumores RE+ mostraban una elevada actividad proliferativa y en este grupo la evolucin fue tan mala como la observada en los tumores con baja expresin del RE. Segn Thorpe et al., (1993) desde el punto de vista clnico es ms importante la concentracin del RE que su positividad o negatividad. Este autor demostr que un elevado contenido de RE (108 > fmol/mg prt) fue de mayor valor pronstico para la recidiva que el grado de anaplasia y el tamao tumoral. Scott et al., (1991) objetivaron que un grupo de tumores RE+ era incapaz de unirse al DNA a travs de su ERE afn. El anlisis confirm que se trataban de formas truncadas del RE constituidas por heterodmeros de 67 y 50 kDa. Encarnacin et al., (1993) observaron en 30 pacientes con cncer de mama en tratamiento con tamoxifn que 8 de 11 pacientes en franca progresin presentaban el fenotipo tumoral RE+/RPg+. Por consiguiente, los hallazgos descritos en estas publicaciones sugieren que no siempre la positividad del RE se corresponde con un buen pronstico y que existen otros mecanismos implicados que determinan el comportamiento evolutivo de los cnceres. Por tal motivo, consideramos que se debe valorar la expresin del RE conjuntamente con otros factores pronstico.
Tampoco observamos diferencias significativas entre las curvas de intervalo libre de enfermedad a 36 meses en pacientes con cnceres RPg positivo o negativo. (Grfica 22). En el anlisis univariante el RPg careci de valor pronstico, siendo la razn de riesgos estimada para la enfermedad metastsica de las enfermas con cnceres RPg+ 0,8 veces (I.C. 95%: 0,3 2,2) el de las pacientes con cnceres RPg-, lo que equivale a una disminucin del riesgo de 1,25 veces menor de los cnceres RPg+ en comparacin con los RPg. (Tabla 28). Algunos autores consideran de mayor valor pronstico al RPg que al RE, as, la ausencia de expresin del RPg se
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ha relacionado con la prdida de funcionalidad del RE y con la progresin de la enfermedad y mayor nmero de recidivas (Pichon et al., 1980; Saez et al., 1983; Clark et al., 1983; Thorpe et al., 1987; Collet et al., 1996). Tambin se cita que la mejor supervivencia observada en tumores RPg+ se debe a la buena respuesta de estos tumores al tratamiento endocrino y en este caso, el RPg es un mejor indicador de respuesta a la terapia hormonal que el RE (Horwitz et al., 1981; McGuire et al., 1982; Alanko et al., 1985; Nardelli et al., 1986; Vollenweider-Zerargui et al., 1986; Ferno et al., 2000). En cambio, en nuestra serie el desarrollo de metstasis ha sido independiente del estado del RPg y del tratamiento hormonal.
No se observaron diferencias significativas entre la proporcin de pacientes que recidivaron precozmente con relacin a la positividad o negatividad de la protena Hsp27. La curva de ILE tiende a decaer en el grupo de tumores Hsp27+, sin embargo, las diferencias a los 36 meses de seguimiento no son estadsticamente significativas. (Grficas 23). La razn de riesgos de metstasis de tumores Hsp27+ fue 2,3 veces (I.C. 95%:0,3 1,18) el de tumores Hsp7-, careciendo este dato de significacin estadstica. (Tabla 28). En este estudio la Hsp27 a pesar de su relacin con grados histolgicos y nucleares moderados y altos y con los antgenos nucleares de proliferacin celular (PCNA y ki67), no fue un parmetro pronstico. Los resultados en esta serie concuerdan con los publicados por otros autores, donde la positividad de este marcador se ha relacionado con tumores indiferenciados, metstasis ganglionares y disminucin de la supervivencia, sin embargo, en el anlisis multivariante no se ha podido demostrar su valor pronstico (Thor et al., 1991; Love et al., 1994; Tetu et al., 1995; Oesterreich et al., 1996).
El examen de las curvas de supervivencia de ILE a 36 meses no demostr diferencias significativas entre tumores EGFR+ y EGFR-. Sin embargo, el descenso de la curva es discretamente mayor en el grupo de tumores EGFR+, sugiriendo que estas pacientes recaen mas pronto. (Grfica 24). La tasa de riesgos estimada para el ILE de las pacientes con cnceres EGFR+ fue 1,8 veces superior (I.C. 95%:0,6 5,8) a la de las pacientes con cnceres EGFR-, aunque este valor careci de significacin estadstica al incluir el valor nulo en el intervalo de confianza. (Tabla 28). Las pacientes con cnceres con ganglios negativos y EGFR+ presentaron un peor pronstico con una disminucin del intervalo libre de enfermedad, aunque las diferencias con relacin a los tumores EGFR- no alcanzaron la significacin estadstica (p=0,06) prefijada en el diseo (HR:4,6; I.C. 95%:0,8 27,8). (Grfica 25). En nuestra serie el EGFR careci de valor pronstico tanto el anlisis univariante como el multivariante, a pesar de que su positividad se haba detectado en el 25% de los cnceres de las pacientes que recidivaron.
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En la literatura los resultados con relacin al valor del EGFR como parmetro de pronstico para el ILE son diversos. Los expresados en esta serie semejan en algunos casos y contrastan en otros con los publicados. Sainsbury et al., (1987) evidenciaron, en el anlisis multivariante de en un estudio basado en la determinacin IHQ de 135 cnceres de mama, que el EGFR fue un parmetro de valor pronstico en pacientes con ganglios negativos y el segundo en importancia en tumores con ganglios positivos. Gasparini et al., (1992) seala que la positividad de EGFR fue un indicador de recidiva. Este autor (Gasparini et al., 1994) al prolongar el tiempo de seguimiento durante 5 aos corrobora en el anlisis multivariante que el EGFR es un indicador pronstico para la recidiva. Nicholson et al., (1993) hacen referencia al peor pronstico de tumores con positividad para C-erbB-2 y EGFR. Segn Toi et al., (1994) el EGFR fue de valor pronstico para la recidiva en el anlisis multivariante; los tumores EGFR+/C-erbB-2+ presentaron un elevado riesgo de recidiva. Para Noguchi et al., (1994) el EGFR fue de utilidad pronstica slo cuando se retir del modelo de riesgos proporcionales de Cox la afectacin ganglionar, de este modo, el EGFR fue pronstico en los cnceres con ganglios negativos, pero su valor pronstico es limitado. Fox et al., (1994) sealan que el EGFR fue un parmetro pronstico para la recidiva y supervivencia en pacientes con ganglios negativos. Otros estudios, basados en la determinacin del EGFR por mtodos inmunoenzimticos e
inmunorradiomtricos, tambin hacen referencia al mayor nmero de recidivas y menor supervivencia de cnceres N+/N- que presentaban concentraciones elevadas de EGFR (Nicholson et al., 1988; Spyratos et al., 1990; Torregrosa et al., 1997). En contraste, varios trabajos basados en la determinacin del EGFR con tcnicas inmunohistoqumicas (Pirinen et al., 1995; Schroeder et al., 1997) e inmunoenzimticas (Koenders et al., 1993; Bolla et al., 1994; Cerra et al., 1995) no demuestran su valor como factor pronstico para el ILE y SG. Para Klijn et al., (1994) el valor pronstico inicial del EGFR se perdi con el seguimiento a largo plazo.
No hemos objetivado diferencias significativas entre las curvas de intervalo libre de enfermedad a 36 meses de cnceres C-erbB-2+ y C-erbB-2-. (Grfica 26). La razn de riesgos estimada para la enfermedad metastsica de las enfermas con cnceres Ce-erbB-2+ correspondi a 1,2 veces (I.C. 95%: 0,4 3,3) el de las pacientes C-erB-2- y por tanto, segn el anlisis univariante el C-erbB-2 no constituy un parmetro de pronstico para las metstasis. (Tabla 28). En la literatura existen discrepancias con relacin al valor como parmetro
pronstico independiente de ILE y SG, si bien, en algunos trabajos se considera la amplificacin/sobreexpresin como un indicador de menor supervivencia en tumores con ganglios positivos (Slamon et al., 1987; Slamon et al., 1989; Tsuda et al., 1989; Tandon et al., 1989; Borg et al., 1990; Guterson et al., 1992; Tetu et al., 1994; Prost et al., 1994; Schonborn et
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al., 1995), otros en cambio, han encontrado que el C-erbB-2 es de valor pronstico para el ILE y supervivencia en pacientes con ganglios negativos (Paik et al., 1990; Allred et al., 1990; Giai et al., 1994; Quenel et al., 1995) y en pacientes con ganglios positivos y negativos (Wright et al., 1989; Gullick et al., 1991; Yamashita et al., 1993; Delarue et al., 1994; Wiesener et al., 1998; Gago et al., 1998). En contraste varias series, al igual que la nuestra, hacen referencia al escaso valor pronstico de este marcador (Van der Vijver et al., 1988; Gusterson et al., 1988; Ali et al., 1988; Thor et al., 1989; Rilke et al., 1991; Bianchi et al., 1993; Gasparini et al., 1994; Reed et al., 2000).
La comparacin de las curvas de supervivencia para el ILE a 36 meses del antgeno nuclear de proliferacin celular, PCNA, desvela un descenso de la curva de las pacientes con elevados ndices de este antgeno. (Grfica 27). La razn de riesgos estimada para el desarrollo de enfermedad metastsica en este grupo de pacientes es 2 veces (I.C. 95%:0,7 61) el de las pacientes con cnceres con bajos ndices de PCNA, sin embargo, la inclusin del valor nulo en el intervalo de confianza demuestra que no hay significacin estadstica y por tanto, en este estudio el PCNA no fue un parmetro de pronstico para las metstasis. (Tabla 28). Los datos consultados en la literatura acerca del valor del PCNA como parmetro de pronstico para el ILE tambin son discordantes. Algunos autores hacen referencia al menor intervalo libre de enfermedad y supervivencia observado en enfermas con cnceres que presentaban elevados porcentajes (20 35%) de ncleos teidos para PCNA (Aaltomaa et al., 1992; Haerslev et al., 1994; Sheen-Chen et al., 1997). Para Ghoring et al., (1994) el PCNA fue de valor pronstico para la recidiva en pacientes con ganglios positivos. Schimmelpenning et al., (1994) y Haerslev et al., (1995) sealan que elevados ndices de PCNA (20% >) y la expresin de p53 se relacionaron con una menor supervivencia. En contraste, los resultados de nuestra serie semejan a los publicados por otros autores que han empleando la mediana de expresin (18% - 25%) y el anticuerpo PC10 y en los que no se demuestra el valor pronstico este marcador (Thomas et al., 1993; Gasparini et al., 1994; Schonborn et al., 1995; Heimann et al., 1997). En nuestra serie el PCNA, a diferencia del Ki-67, no ha sido de valor pronstico para la enfermedad metastsica a corto plazo.
En nuestro estudio la p53 careci de valor pronstico para la enfermedad metastsica a 36 meses. La prueba de Mantel-Haenszel mostr que no existen diferencias entre las proporciones de metstasis en los grupos con positividad o negatividad para la p53. (Grfica 28). El anlisis univariante objetivo que la p53 no fue un parmetro de pronstico para el ILE (HR: 1,3; I.C. 95%: 0,4 4). (Tabla 28). La utilidad como factor pronstico de la p53 ha sido analizado en diversos estudios, sin embargo, los resultados publicados en algunos casos son contradictorios.
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Determinados grupos coinciden en sealar que las alteraciones del gen y la sobreexpresin de p53 se relacionan con cnceres de mayor tamao, aumentada proliferacin celular, aneuploida, elevados grados histolgicos y nucleares, ausencia de expresin de los receptores hormonales y sobreexpresin del C-erbB-2. Estos tumores son de mayor agresividad y se caracterizan por un mayor nmero de recidivas y menor supervivencia (Thor et al., 1992; Barnes et al., 1993; Noguchi et al., 1993; Allred et al., 1993; Silvestrini et al., 1993; Stenmark-Askmalm et al., 1994; Gasparini et al., 1994; Beck et al., 1995; Fresno et al., 1997). Para Levesque et al., (1994), Gohring et al., (1995) y Tsuda et al., (1998) la sobreexpresin de p53 fue de valor pronstico para el ILE y SG en cnceres con ganglios positivos. En cambio, otros autores han observado que las pacientes con cnceres p53+ presentaron una disminucin del ILE y SG, sin embargo, su valor como parmetro pronstico fue inferior al del tamao tumoral, la gradacin nuclear y la medicin de la actividad proliferativa (Isola et al., 1992; Yamashita et al., 1993; Bianchi et al., 1997). Paradjicamente, Lipponen et al., (1993) objetivaron un grupo de
enfermas con cnceres con ganglios positivos y positividad para p53+ gozaron de un mayor intervalo libre de enfermedad. El porcentaje de cnceres con expresin de p53 en nuestra serie ha sido baja, como tambin lo fue el porcentaje de cnceres p53+ que desarrollaron metstasis. Sin embargo, la presencia de p53 se asoci a caractersticas citolgicas de desdiferenciacin, aumento de la actividad proliferativa y ausencia de los receptores hormonales y en estos aspectos los resultados concuerdan con los de los autores anteriormente expuestos. Por
consiguiente, en algunos tumores factores como la desdiferenciacin celular, la afectacin ganglionar, la prdida de hormonodependencia, la elevada actividad proliferativa, la expresin de EGFR, C-erbB-2, p53 y catepsina D condicionaron una peor evolucin, de este modo, el pronstico de una paciente no puede ser juzgado exclusivamente por la positividad o negatividad de un marcador y se hace necesario la valoracin conjunta de varios marcadores.
El anlisis de las curvas de supervivencia del intervalo libre de enfermedad no mostr diferencias significativas entre la proporcin de pacientes con cnceres glicoprotena P positivo o negativo. (Grfica 29). La razn de riesgos de metstasis de pacientes con glicoprotena P+ fue 0,2 veces (I.C. al 95%: 0,02 1,5) el de las pacientes con cnceres glicoprotena P-, sin embargo, este dato careci de significacin estadstica. (Tabla 28). No se apreciaron diferencias estadsticamente negativas entre tumores glicoprotena P+/glicoprotena P- en funcin de la afectacin ganglionar, aunque las metstasis fueron discretamente menores en tumores glicoprotena P+ y ganglios positivos (p=0,07). (Grfica 30). Estos resultados aunque carecen de significacin estadtica contrastan con los publicados que sealan que la expresin de glicoprotena P se ha relacionado con un peor y no con un mejor pronstico (Verrelle et al., 1991; Botti et al., 1993; Schneider et al., 1995; Linn et al., 1995; Linn et al., 1996; Gregorcyk
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et al., 1996). Estos estudios incluyeron cnceres avanzados de mama y tambin se valor la respuesta a la terapia adyuvante, mientras que en nuestra serie el porcentaje de tumores
avanzados es muy reducido y adems la falta de datos en el grupo de pacientes que recidivaron puede tambin modificar las conclusiones acerca del valor pronstico de este marcador. No obstante, en nuestro estudio la glicoprotena P careci de valor pronstico tanto en el anlisis univariante como multivariante. Trock et al., (1997) en un metanalisis concluye que la glicoprotena P est relacionada con la resistencia y pobre respuesta al tratamiento quimioterpico. Lizard-Nacol et al., (1999) hacen referencia a la ausencia de correlacin entre la expresin del gen MDR1 y la presencia de mutaciones en el gen p53, la respuesta a la quimioterapia y la supervivencia. El valor pronstico de este marcador est an por determinar y ms bien podra predecir la respuesta a la quimioterapia.
III- ANALISIS MULTIVARIANTE DE LOS PARAMETROS CLINICO-PATOLOGICOS Y DE LOS MARCADORES
Los modelos de riesgos proporcionales de Cox han permitido medir de manera precisa el efecto recidiva mediante el control de las variables de confusin y de las interacciones entre las diferentes variables incluidas en este estudio. Examinando diversos modelos se ha podido seleccionar y analizar una serie de variables independientes predictoras de respuesta (recidiva), es decir, aquellas variables con capacidad para pronosticar las probabilidades de supervivencia libre de enfermedad de cualquiera paciente a partir de un determinado valor o patrn de valores que adquiere en las variables pronsticas. Tambin, el anlisis multivariante ha permitido valorar la contribucin de cada una de las variables predictoras y as poder seleccionar por orden de importancia aquellas con mejor capacidad pronstica y que se puedan medir a un menor coste econmico. Por consiguiente, de mltiples modelos analizados se han
seleccionado dos que cumplen las asunciones de validez y que incluyen las variables tipo de tumor, estadiaje y Ki-67.
La presencia de ms de un foco de cncer infiltrante en la mama del mismo lado (multicentricidad) ha constituido un parmetro pronstico de importancia para la enfermedad metastsica a 36 meses. La Grfica 31 muestra que una vez realizado el ajuste por el estadiaje, la supervivencia libre de enfermedad es menor en las pacientes que posean un tumor multicntrico. La razn de riesgos estimada para la enfermedad metastsica de las pacientes con un cncer multicntrico fue 3,35 veces superior (I.C. 95%: 1,1 10,45) al de las pacientes con un tumor nico. (Modelo 1, Tabla 29). En la literatura la incidencia de multicentricidad en los
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casos de cnceres ductales infiltrantes exclusivamente, es decir, sin incluir cnceres intraductales ni in situ, vara entre un 4% y 30%, aunque cifras entre un 5% y 10% son ms frecuentes. (Fisher et al., 1975; Schwartz et al., 1980; Westman-Naeser et al., 1981;Tinnemans et al., 1986; Gump et al., 1986; Sarnelli y Squartini, 1986). Existen discrepancias con relacin a la mejor definicin de multicentricidad, ya que para algunos autores este trmino debe ser aplicado slo a aquellas lesiones demostradas en cuadrantes distintos del asiento del cncer primario (Fisher et al., 1975; Fisher et al., 1986). Otros en cambio, han aplicado el trmino multicentricidad a la presencia de ms de un foco de tumor en el mismo cuadrante, pero a una distancia de 2 o ms cm del cncer dominante o lesin considerada ndice (Holland et al., 1985). Nosotros nos hemos adherido a esta ltima definicin incluyendo como tumores multicntricos la existencia de ms de un foco de cncer infiltrante independientemente de su localizacin y tamao, aunque no se excluye en algunos casos la presencia de componente intraductal asociado a estos focos tumorales en la pieza quirrgica. Los estudios citogenticos apoyan la hiptesis que establece que la diseminacin intraductal del tumor es el mecanismo implicado en la patognesis de la multicentricidad, de tal manera que mltiples focos tienen un origen monoclonal (Noguchi et al., 1994; Teixeira et al., 1994). Sin embargo estos estudios, al encontrar clones no relacionados citogenticamente en los focos multicntricos, avalan la posibilidad de que un cncer pueda ser policlonal (Teixeira et al., 1994). Tambin hay indicios que sugieren que en algunos cnceres se produce un cambio clonal durante la transicin de un carcinoma in situ a infiltrante (Fuji et al., 1996). Por tanto, parece que el mecanismo principal que explicara el fenmeno de multicentricidad es la diseminacin intraductal y en unos pocos casos el origen policlonal.
Con relacin al pronstico a largo plazo hay un vaco en la literatura, aunque se ha sealado una relacin entre la multicentricidad con el componente intraductal extenso, el tamao tumoral, la afectacin ganglionar y la aparicin de recidivas locales (Rosen et al., 1975; Fisher et al., 1975; Lesser et al., 1982; Kurtz et al., 1990). Si bien es cierto que la clasificacin TNM prev que en los casos de ms de un tumor en la misma mama, el de mayor tamao, y no el nmero, es el que define la categora T y por ende, tanto la estadificacin como el pronstico final; sin embargo, nuestros resultados muestran que posiblemente los tumores multicntricos deberan ser considerados aparte. En la mayora de los casos de cnceres multicntricos, las recidivas se producen en la vecindad del tumor primario durante los primeros 4 aos. Despus de los 5 aos, las lesiones ocurren a mayor distancia de la lesin primaria, pero la incidencia de recidivas locales se reduce aproximndose a la de un nuevo primario en la mama contralateral y el pronstico tambin es mejor (Dawson, 1993). Por otra parte, tampoco se han observado diferencias significativas con relacin al ILE y SG entre grupos de pacientes con cnceres en
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estadio I y II tratadas con cirugas conservadoras y mastectoma radicales, a excepcin del aumento de las recidivas locales en el grupo de ciruga conservadora sin radioterapia (Veronesi et al., 1995; Fisher et al., 1995; Kato et al., 2000). Por tanto, no parece que la multicentricidad en s condicione un peor pronstico, a excepcin de un aumento en el nmero de recidivas locales en los casos de ciruga conservadora sin radioterapia, donde el volumen de la mama resecada es menor que en el caso de las mastectomas radicales y las posibilidades de dejar focos tumorales sin extirpar son mayores. Segn Fisher et al., (1986) ms que la
multicentricidad, un tamao tumoral superior a los 2 cm, altos grados nucleares e histolgicos y la extensin intralinftica se asociaron significativamente a las recidivas locales en pacientes tratadas con tumorectoma. En estos trabajos sin embargo, se valora la multicentricidad en el contexto del componente intraductal asociado ms que a la presencia de dos o ms focos de cncer infiltrante.
En la actualidad conocemos que existen diferentes vas de diseminacin (linftica y hematgena) de las clulas cancerosas (Fisher et al., 1985; Cote et al., 1991) y que la presencia de clulas micrometastsicas en la mdula sea vara en funcin del tamao tumoral, pero es independiente de la afectacin ganglionar (Braun et al., 2000). No obstante, el efecto que supone una carga tumoral adicional en los casos de tumores multicntricos infiltrantes, no se ha medido con relacin a la posibilidad de diseminacin micrometastsica por va hematgena. En la serie que nos ocupa la multicentricidad tumoral no se ha relacionado con el estado menstrual, tamao tumoral, gradacin nuclear e histolgica, afectacin ganglionar, los marcadores tumorales moleculares, ni con la aparicin de recidivas locales, sin embargo, este parmetro ha mostrado ser de valor pronstico independiente para la enfermedad metastsica a 36 meses. Destaca adems que de las 11 pacientes con cnceres multicntricos que desarrollaron metstasis a distancia, 3 correspondan a un estadio I, 6 al estadio II y 2 al estadio III, de tal modo, que en los estadios I y II, la multicentricidad puede ser considerada de utilidad pronstica.
En el modelo 1 y 2, el estadiaje constituy un parmetro pronstico de importancia para el desarrollo de la enfermedad metastsica precoz. (Tabla 29 y 30). En presente estudio, el estadio III, condicion un mal pronstico para el ILE a 36 meses. En las Grficas 32 y 33 una vez realizado los ajustes por las variables tipo de tumor multicntrico y Ki-67 respectivamente, se observa una menor supervivencia libre de enfermedad de las pacientes clasificadas en un estadio III. En el modelo 1 la razn de riesgos estimada de metstasis a 36 meses de las enfermas clasificadas en estadio III fue 6,2 veces superior (I.C. 95%:1,6 24,02) al de las pacientes en el estadio I, mientras que en el modelo 2, la razn de riesgos estimada para la enfermedad
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metastsica de pacientes en el estadio III fue de 9,3 veces (I.C. 95%:1.9 45,3) el de las pacientes en estadio I. El mal pronstico observado en pacientes clasificadas en un estadio III es un hecho conocido y constatado en la literatura (Fisher et al., 1969; Schottenfeld et al., 1976; Arnold y Lesnick, 1979; Ariel et al., 1979; Ferguson et al., 1982; Carter et al., 1989; Scholl et al., 1994; Schwartz et al., 1994). En la serie que nos ocupa el tamao tumoral careci de valor pronstico, siendo el factor determinante de metstasis en este estadio la afectacin ganglionar. El anlisis univariante mostr que la afectacin ganglionar N2 (HR N2/N0: 3,9; I.C. 95%: 1,2 13) y no el tamao tumoral (HR T3/T1: 3,6 I.C. 95%:0,9 15,1; HR T2/T1:1,6 I.C. 95%:0,5 48) constituy el parmetro pronstico ms importante para la enfermedad metastsica de las pacientes clasificadas en el estadio III. (Tabla 28). En el anlisis multivariante el estadio N2 se comporta como una variable de confusin permitiendo un mejor ajuste de la estadificacin. Estos resultados concuerdan con otros estudios donde se seala que el parmetro discriminatorio ms importante para establecer el estadiaje y por ende, el factor determinante de mayor importancia para las recidivas y supervivencia es la afectacin ganglionar (Hutter, 1980; Fracchia et al., 1980; McCready et al., 1980).
Entre los marcadores tumorales moleculares, el Ki-67 fue el de mayor valor pronstico independiente para la enfermedad metastsica precoz, siendo la razn de riesgos estimada de metstasis a 36 meses de los cnceres Ki-67 positivos 15,3 veces superior (I.C. 95%: 1,9 117,6) al de los cnceres Ki-67 negativos. (Modelo 2, Tabla 30). Al realizar el ajuste por la estadificacin, se objetiva una disminucin del intervalo libre de enfermedad de las pacientes con tumores Ki-67 con valores por encima de la mediana. (Grfica 34). Los resultados encontrados en nuestro estudio coinciden con los descritos por algunos autores, siendo este marcador que mide la proliferacin celular, de valor pronstico en varias series que incluyen nmeros reducidos y amplios de pacientes con tiempos de seguimiento variables y que han empleado distintos anticuerpos monoclonales y diferentes dinteles de positividad. Railo et al., (1993) en un estudio basado en 327 cnceres de mama con seguimiento durante 4 aos (media 2,7), hacen referencia al valor pronstico independiente del ndice Ki-67 demostrado en un modelo de riesgos proporcionales de Cox. Gaglia et al., (1993) citan en una serie de 385 cnceres de mama el valor pronstico independiente para la recidiva del estado nodal y el ndice Ki-67. Estos autores utilizaron como dintel de positividad el valor de la mediana (9%), as, en el anlisis mutivariante comprobaron que la probabilidad de recidiva a los 4 aos postciruga era significativamente menor en las pacientes sin afectacin ganglionar y con un ndice Ki-67 por debajo de la mediana. Pinder et al., (1995) en un estudio de 177 cnceres de mama, sealan que en el anlisis multivariante fueron de valor pronstico para la recidiva el elevado ndice Ki-67 junto con el grado histolgico, el tamao tumoral y la afectacin ganglionar. Si el grado
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histolgico no se inclua en el anlisis el ndice Ki-67 constitua el factor pronstico ms importante para la supervivencia. Brown et al., (1996) en un estudio de 674 cnceres de mama con ganglios negativos y seguimiento prolongado, objetivaron en el anlisis multivariante que los cnceres con un alto ndice Ki-67 (5% > clula con ncleos teidos) presentaron un riesgo de recidiva 1,8 veces superior a pacientes con bajos ndices. En una serie de 140 pacientes con cncer de mama N+/N- y una mediana de seguimiento de 6 aos, Pierga et al., (1996), comprueban en el anlisis multivariante que la elevada fraccin de crecimiento determinada mediante tincin IHQ para Ki-67 (valor por arriba de la mediana 8%) fue de valor pronstico independiente para la recidiva. Molino et al., (1997), al analizar varios factores pronstico mediante el anlisis multivariante en una serie de 322 cnceres de mama, sealan el valor pronstico de los elevados ndices del antgeno Ki-67. Rudolph et al., (1999) tambin hacen referencia al valor pronstico independiente para el ILE y SG de altos ndices del antgeno Ki67 (10% > clulas con ncleos teidos) en el anlisis multivariante de 351 cnceres de mama.
La elevada expresin del antgeno Ki-67 tambin ha mostrado ser de valor pronstico para la recidiva en estudios con seguimiento inferior a los 5 aos y que han sustentados sus conclusiones en el anlisis univariante (Sahin et al., 1991; Wintzer et al., 1991; Veronese et al., 1993). Sin embargo, otros autores no han podido comprobar el valor pronstico para el ILE de la elevada expresin del antgeno Ki-67. As, Bouzubar et al., (1989), en un estudio de 136 cnceres de mama y con seguimiento a 30 meses, citan que la alta expresin del antgeno Ki-67 se relacion con la recidiva precoz tras la mastectoma; sin embargo, en el anlisis univariante no se demostr su valor pronstico. Segn Weikel et al., (1991) la elevada expresin de Ki-67 no fue un factor pronstico en el anlisis univariante de una serie de 568 cnceres y seguimiento durante 36 meses. Para Rudas et al., (1994) tanto el ndice de timidina como el Ki-67 carecieron de valor pronstico independiente para el ILE y la SG segn se demostr en el anlisis univariante y multivariante de un estudio basado en 184 cnceres de mama.
Aunque los resultados en algunos casos son discordantes probablemente porque no existe un dintel de positividad ideal que permita agrupar a los tumores en grupos de alto y bajo riesgo de recidiva, y as poder comparar los resultados entre diferentes series, s parece existir en un buen nmero de estudios una asociacin entre la elevada expresin de este antgeno y un mayor riesgo de metstasis. La determinacin IHQ del antgeno Ki.-67 ha sido til para cuantificar la fraccin de crecimiento de un tumor, y la simplicidad de su medicin y su bajo coste econmico ofrecen ventajas en comparacin con otras tcnicas ms sofisticadas y costosas como son el ndice de timidina tritiada y la medicin de la fraccin S por citometra de flujo (Silvestrini et al., 1988; Sahin et al., 1991; McGrogan et al., 1997).
Discusin
244
Las variables incluidas en los dos modelos pueden ser cuantificadas con facilidad, a bajo coste econmico, sin embargo, el hecho que la incidencia de multicentricidad sea baja (5 10%) hace que el modelo 2 pueda ser ms universalmente aplicado al incluir la estadificacin TNM y la tincin IHQ de Ki-67. De todos modos, en los casos en que se demuestra
multicentricidad creemos que debe aplicarse adems el modelo 1.
Por tanto, nuestro estudio muestra, en definitiva, que puede ser rechazada la hiptesis nula que establece que los marcadores tumorales moleculares no poseen capacidad para pronosticar las metstasis que se producen durante los primeros 36 meses de seguimiento, al observar que al menos un marcador tumoral molecular ha sido de valor pronstico para la enfermedad metastsica precoz.
CONCLUSIONES
Primera. Nuestro estudio muestra que las variables correspondientes a los parmetros clnico-patolgicos tipo de tumor multicntrico, la afectacin de 4 o ms ganglios axilares, la rotura con desbordamiento de la cpsula ganglionar y la estadificacin se asociaron significativamente con el desarrollo de enfermedad metastsica durante los primeros 36 meses postoperatorios. No hubo una asociacin estadsticamente significativa con relacin al estado premenopusico o postmenopusico, al tamao tumoral, al tamao de los ganglios infiltrados, al grado histolgico y nuclear y a los tratamientos complementarios.
Segunda. Los marcadores tumorales moleculares que mostraron una asociacin significativa con la aparicin de enfermedad metastsica durante los 36 meses de seguimiento en esta serie han sido la protena pS2, el antgeno nuclear de proliferacin celular Ki-67 y la catepsina D. No se asociaron significativamente con el desarrollo de metstasis los receptores hormonales RE y RPg, la protena de choque trmico Hsp27, el factor de crecimiento epidrmico EGFR, el antgeno nuclear de proliferacin celular PCNA, la protena p53 y la glicoprotena P.
Tercera. En el anlisis univariante y multivariante la multicentricidad fue un parmetro pronstico de importancia para la enfermedad metastsica a 36 meses. La razn de riesgos de metastatizacin de las pacientes con tumores multicntricos fue 3,35 veces superior al de las pacientes con tumores nicos.
Cuarta. Los ganglios axilares clasificados N2, la presencia de 4 o ms ganglios positivos y la rotura con desbordamiento de la cpsula ganglionar, determinaron una evolucin muy desfavorable, con un riesgo de metstasis 3 veces superior al de las pacientes sin afectacin ganglionar.
Quinta. El estadio III de la clasificacin TNM es un factor pronstico para el desarrollo de enfermedad metastsica a 36 meses. La razn de riesgos de metstasis para las pacientes en este estadio fue 9,3 veces superior al de las pacientes en un estadio I.
Sexta. La expresin negativa de pS2 define un grupo de tumores RE+ y RPg+ de mal pronstico. La ausencia de la protena pS2 se asocia a una disminucin del intervalo libre de enfermedad a 36 meses, especialmente en el grupo de tumores con axila libre.
Conclusiones
246
Sptima.
La tincin positiva para catepsina D aumenta 5,1 veces el riesgo de
enfermedad metastsica a 36 meses en pacientes con ganglios axilares positivos.
Octava. Los antgenos de proliferacin celular, ki67 y PCNA identifican tumores ms agresivos caracterizados por altos grados histolgicos y nucleares, ausencia de receptores hormonales y sobreexpresin de p53.
Novena. Tanto en el anlisis univariante como en el multivariante, el Ki-67, es el marcador tumoral molecular que mejor predice el desarrollo de enfermedad metastsica a 36 meses, constituyendo el principal marcador de pronstico en esta serie. La razn de riesgos de metstasis para las enfermas con cnceres con expresin de Ki-67 por encima del valor de la mediana es 15,3 veces.
Dcima. Desde el punto de vista clnico la estadificacin TNM y la positividad para el Ki-67 (modelo 2) han sido los dos factores que han mostrado utilidad para establecer los grupos pronstico.
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Carcinoma Ductal Infiltrante de Mama - 2002 2

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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Ciruga

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR

ngel Martn Louredo Mndez

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE CIRUGA

ANGEL MARTN LOUREDO MENDEZ

ESTADO ACTUAL DE LOS MARCADORES TUMORALES MOLECULARES

Hsp27 ................................................................................ EGFR ...................................................................................

JUSTIFICACIN DEL TRABAJO HIPTESIS DE TRABAJO OBJETIVO

106 106 106 107

.................................................................................................. ............................................................................................. ..........................................................................

VARIABLES DEL ESTUDIO

..................................................................... .............................................. ................................

MARCADORES TUMORALES MOLECULARES Determinacin inmunohistoqumica

Mtodo de la peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) Mtodo de la avidina-biotina (ABC)

10. Determinacin inmunohistoqumica de la catepsina D

11. Determinacin inmunohistoqumica de la glicoprotena P. .... ANLISIS ESTADSTICO DE DATOS ....................................................

..................................................................................... 122 ........................................... 122

I-A. DESCRIPCIN GENERAL DE LA SERIE

MOLECULARES. METODO DE KAPLAN-MEIER Y ANLISIS UNIVARIANTE. ................................................................................... 162

2) Anlisis del intervalo libre de enfermedad a 36 meses con

relacin a los marcadores tumorales moleculares.

I-A. DESCRIPCIN GENERAL DE LA SERIE

4-b) Anlisis de la asociacin entre la expresin de la protena

Hsp27 y los marcadores tumorales moleculares.

ganglios axilares negativos.

MOLECULARES. METODO DE KAPLAN-MEIER Y ANLISIS UNIVARIANTE. .............................................................................. 224

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

FIGURA 1. RECEPTOR DE ESTROGENO EXONES 1 2 3 4 5 6 7 8

FIGURA 2. MOTIVO DE UNION AL DNA. DEDOS DE ZINC.

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

FIGURA 3. ACCION DE LOS ESTROGENOS SOBRE EL RE

Unin del estradiol al receptor

Translocacin al ncleo RE RE Dimerizacin

Fosforilacin y unin con protenas adaptadoras

Cambio de conformacin y fosforilacin

ERE 1/2 Separacin de las protenas de choque trmico (HSP) del RE

INTERACCIN CON EL APARATO GRAL. DE TRANSCRIPCION

Modulacin de la RNA polimerasa

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

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Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

FIGURA 4. RECEPTOR DE PROGESTERONA

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

la progesterona en el fenmeno de adhesibilidad celular y su probable relacin con el desarrollo de metstasis.

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.

Estado actual de los marcadores tumorales moleculares.