Experimento AIA

1 Preparar a soluo estoque de AIA I a 10 mg/mL Dissolver 100 mg de AIA em Etanol 99% - 100% PA 2 Preparar a soluo estoque de AIA II a 1 mg/mL ( esta soluo que ser usada no experimento) A soluo II obtida a partir de uma diluio de 10X da soluo I Ex: Dissolver 1mL da soluo I em 9 mL de Etanol 99% - 100% PA 3 Para o preparo da curva de AIA: Preparar 0.5 mL de cada ponto (sero lidos 10 pontos) Ponto 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) Concentrao (ug) 0 300 200 150 100 75 50 25 10 5 1 gua (uL) 500 350 400 425 450 463,5 475 487,5 495 497,5 495 AIA (soluo II uL) 0 150 100 75 50 37,5 25 12,5 5 2,5 0,5 Reagente de Salkowski (uL) 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 Volume final (uL) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000

Numerar os tubos de 0 10; O tubo nmero 0 corresponde ao branco; Colocar primeiro a gua em todos os tubos; Colocar a soluo contendo AIA; Colocar o Reagente de Salkowski (que o revelador do AIA); Incubar por 30 min no escuro a temperatura ambiente; Realizar a leitura do ensaio a 535 nm; Recomenda-se que a curva seja realizada em triplicata. Anotar os dados da curva e plotar na planilha do Excel; Verificar a validade da curva, se a confiabilidade da curva for menor que 95% descartar e repetir.

4 Realizar a dosagem das estirpes

a) Crescer as estipes por 72h; b) Medir a OD600 e anotar; c) Usar 1x109 clulas para o ensaio Ex: se na OD600 a leitura for de 1x109 voc vai usar 500 uL desta cultura; se na OD600 a leitura for de 1,63x109 voc vai usar 306 uL desta cultura; se na OD600 a leitura for de 1,39x109 voc vai usar 360 uL desta cultura; Como chegar a este valor: A leitura do espectro deu: OD600 = 1,63x109 (chamaremos de C1) ento: C1 . V1 = C2 . V2 1,63x109 . V1 = 1,0x109 . 500 uL V1 = 500X109 uL/1,63x109 V1 = 306 uL d) Pegar o volume da cultura necessrio para o ensaio e centrifugar a velocidade mxima por 5 min; e) Descartar o pellet e usar o sobrenadante. Caso o volume recuperado seja menor que 500 uL, completar o volume para 500 uL; Ex: se vc usou 300 uL da cultura, completar com 200 uL de gua. k) Depois de obter todos os sobrenadantes das estirpes, adicionar 500 uL do Reagente de Salkowski (que o revelador do AIA); l) Incubar por 30 min no escuro a temperatura ambiente; m) Realizar a leitura do ensaio a 535 nm; n) Recomenda-se que o experimento seja realizado em triplicata. o) Anotar os dados e plotar na planilha do Excel; p) Realizar o clculo para se obter a concentrao de AIA, produzido por 1x10 9 clulas da estirpe. q) Repetir o ensaio 3X para se obter os dados estatsticos.