Introduo aos Mtodos Cromatogrficos

ANLISE INSTRUMENTAL Prof. Bruno Cortez 1 semestre - 2008

DEFINIO

Conjunto de tcnicas de separao cujo princpio depende da distribuio diferenciada dos componentes de uma mistura entre duas fases, uma considerada estacionria, e a outra, mvel.
KROMA
(COR)

GRAPH
(ESCREVER)

DEFINIO

Diferenas nas propriedades das fases mvel e estacionria possibilitam com que os componentes da amostra se desloquem atravs do material cromatogrfico com velocidades desiguais, gerando a separao

ANLISE CROMATOGRFICA

AFINIDADE SEPARAO

PRINCIPAIS FATOS HISTRICOS

Separao de pigmentos; proposio do termo Cromatografia em cromatografia papel Primeira publicao em fase gasosa Martin e Synge 1952

Mikhail Tswett
1903-1906

Izmailov e Shraiber 1938

1897-1903
David Talbot Day Separao de HC do petrleo

1930

1941

1958
Egon Stahl Cromatografia em camada delgada

Kuhn e Lederer Martin e Synge Cromatografia em coluna Particio em cromatografia lquida; Princpios de fase gasosa

CROMATOGRAFIA

PLANAR

COLUNA

LQUIDA

GS

FLUDO SUPERCRTICO

LQUIDA

Lquida (CP) Slida (CCD)

Lquida (CGL) Slida (CGS) Slido (CSS) Ligada (CSFL) Lquida (CLL) Slida (CLS, CE) Ligada (CFLF, CTI e CB)

Ligada (CCD) Ligada (CGFL)

TIPOS DE CROMATOGRAFIA
SIGLA CP CCD CCD-FL CGL CGS CGFL Papel Camada Delgada Camada Delgada com Fase Quimicamente Ligada Gs-Lquido Gs-Slido Gasosa com Fase Quimicamente Ligada NOME TIPO DE SEPARAO Partilha Partilha Partilha e Adsoro Distribuio Adsoro Adsoro

CSS
CSFL CLL CLS CE CLFL CTI CB

Slida com Fase Mvel Super-crtica

CSS com Fase Quimicamente Ligada Lquido-Lquido Lquido-Slido Excluso Lquida com Fase Quimicamente Ligada Troca Inica Bioafinidade

Adsoro
Adsoro Partilha Adsoro Permeao Partilha e Adsoro Interaes Polares Bioatividade

TIPOS DE SEPARAO

Os princpios fsico-qumico bsicos de separao so:

Adsoro: O soluto retido pela superfcie da fase estacionria atravs de interaes qumicas ou fsicas. Partio: O soluto se dissolve na parte lquida que envolve a superfcie do suporte slido. Troca inica: O on da amostra se liga carga fixa (grupo funcional) da fase estacionria. Excluso molculas: As molculas so separadas por tamanho, havendo reteno das maiores. Bioafinidade: Ocorre uma ligao molecular especfica e reversvel entre o soluto e o ligante fixado fase estacionria.

CROMATOGRAFIA PLANAR

CROMATOGRAFIA PLANAR

CROMATOGRAFIA PLANAR

CROMATOGRAFIA PLANAR

CROMATOGRAFIA PLANAR

CROMATOGRAFIA PLANAR

CROMATOGRAFIA CIRCULAR

ANLISE CROMATOGRFICA

Separao em colunas convencionais

Considere a aplicao de uma mistura de compostos orgnicos no topo de uma coluna cromatogrfica

ANLISE CROMATOGRFICA

Separao em colunas convencionais

Estabelecida a percolao da FE com o eluente (FM), os componentes da mistura passaro a migrar com velocidades desiguais caso o sistema seja adequado para a separao

ANLISE CROMATOGRFICA

Separao em colunas convencionais

Uma boa seletividade cromatogrfica garantir uma boa separao entre os componentes da amostra

ANLISE CROMATOGRFICA

Separao em colunas convencionais

Cada componente da amostra poder ser coletado isoladamente, atravs de um coletor de fraes (neste caso, um simples frasco coletor)

ANLISE CROMATOGRFICA

Separao em coluna
O monitoramento do eluato da coluna pode ser feito atravs de um detector, cujo sinal identifica a sada de cada componente da mistura, isoladamente

ANLISE CROMATOGRFICA

Separao em coluna
A resposta do detector traduzida em um grfico, ou CROMATOGRAMA, que relaciona o seu sinal com o tempo necessrio para a eluio de cada componente.

ANLISE CROMATOGRFICA

Separao em coluna
As molculas de cada componente tambm migram com velocidades desiguais devido a fenmenos de difuso e transferncia de massa

ANLISE CROMATOGRFICA

Eluio tpica em cromatografia lquida

DEFINIO DE TERMOS

Tempo de reteno
O tempo gasto desde o ato de injeo at a sada do ponto mximo do pico do sistema O tempo de reteno engloba todo o tempo que o componente em questo fica no sistema cromatogrfico, quer na fase mvel quer na fase estacionria

DEFINIO DE TERMOS

Tempo de reteno corrigido

Quando as molculas do soluto ficam na fase mvel, elas devem movimentar-se com a mesma velocidade das molculas da prpria fase mvel. Parte do tempo em que as molculas do soluto esto na fase mvel igual ao tempo gasto para as molculas da fase mvel percorrerem a coluna, tm SENDO ASSIM, PARTE DO TEMPO EM QUE AS MOLCULAS DO SOLUTO FICAM RETIDAS NA FASE ESTACIONRIA CALCULADA PELA DIFERENA

DEFINIO DE TERMOS

Seletividade
Para a cromatografia em coluna, o fator de separao (SELETIVIDADE) calculado pela razo entre os respectivos fatores de reteno que, por sua vez, so relacionados aos tempos de reteno corrigidos

DEFINIO DE TERMOS

Seletividade

DEFINIO DE TERMOS

Capacidade

MTODOS CROMATOGRFICOS

TEORIAS
Martin e Synge Biochem. J. 35, 1358 (1941) Meio descontnuo anlogo s colunas de destilao fracionada, constitudo por um grande nmero de estgios de equilbrio ou PRATOS TERICOS (TEORIA DOS PRATOS TERICOS) Van

Deemerter, Zuiderweg e Klinkenberg Chem. Eng. Sci. 5, 271 (1956)

Meio contnuo atravs do qual a separao ocorre por fenmenos de difuso e transporte de massa (TEORIA DA VELOCIDADE)

TEORIA DOS PRATOS TERICOS

Nmero de pratos tericos

Coluna cromatogrfica definida como uma srie de estgios independentes onde acontece um quase-equilbrio entre o analito dissolvido na fase estacionria (FE) e o gs de arraste

TEORIA DOS PRATOS TERICOS

Nmero de pratos tericos

O coeficiente Kc determina a distribuio da amostra (A) entre as fases mvel (M) e estacionria (S) em um determinado estgio do equilbrio, obviamente hipottico. Quanto mais efetiva for a presena de A na fase mvel (M) menor ser o seu tempo de reteno

TEORIA DOS PRATOS TERICOS

Nmero de pratos tericos

TEORIA DOS PRATOS TERICOS

Nmero de pratos tericos

TEORIA DOS PRATOS TERICOS

Clculo do nmero de pratos tericos

TEORIA DOS PRATOS TERICOS

Altura equivalente um prato terico

DEFINIO DE TERMOS

RESOLUO CROMATOGRFICA

Equao geral

RESOLUO CROMATOGRFICA

Otimizao de Separaes

DETECTORES

Definies Gerais
Dispositivos

que geram um sinal eltrico proporcional quantidade eluda de um analito

~60 detectores j usados em CG ~15 equipam cromatgrafos comerciais 4 respondem pela maior parte das aplicaes

Detector por Condutividade Trmica DCT Detector por Ionizao em Chama DIC Detector por Captura de Eltrons DCE Detector Espectromtrico de Massas EM

DETECTORES

Parmetros Bsicos de Desempenho

Quantidade

Mnima Detectvel

Massa de um analito que gera um pico com altura igual a trs vezes o nvel de rudo

DETECTORES

Parmetros Bsicos de Desempenho

Limite

de Deteco

Quantidade de analito que gera um pico com S/N=3 e wb=1 unidade de tempo

DETECTORES

Parmetros Bsicos de Desempenho

Velocidade

de Resposta

Tempo decorrido entre a entrada do analito na cela do detector e a gerao do sinal eltrico

DETECTORES

Parmetros Bsicos de Desempenho

Sensibilidade

Relao entre o incremento de rea do pico e o incremento de massa do analito.

DETECTORES

Parmetros Bsicos de Desempenho

Faixa

Linear Dinmica

Intervalo de massas dentro do qual a resposta do detector linear

DETECTORES

CLASSIFICAO

DETECTORES

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA

Princpio:

Variao na condutividade trmica do gs quando da eluio de um analito

DETECTORES

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA

SELETIVIDADE

SENSIBILIDADE/ LINEARIDADE

VAZO DO GS DE ARRASTE

DETECTORES

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA

Configurao tradicional do DCT: bloco metlico com quatro celas interligadas em par por duas passa o efluente da coluna e por duas, o gs de arraste puro

DETECTORES

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA

Quando da eluio de um composto com condutividade trmica menor que a do gs de arraste puro:

DETECTORES

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA

Os filamentos do DCT so montados numa ponte de Wheatstone que transforma a diferena de resistncia quando da eluio de amostra numa diferena de voltagem:

DETECTORES

CARACTERSTICAS OPERACIONAIS DO DCT

SELETIVIDADE: Observa-se sinal para qualquer substncia eluda diferente do gs de arraste = UNIVERSAL SENSIBILIDADE/LINEARIDADE: Dependendo da configurao particular e do analito: QMD=0,4 ng a 1 ng com linearidade de 104 (ng = dezenas de g) VAZO DO GS DE ARRASTE: O sinal proporcional concentrao do analito no gs de arraste que passa pela cela de amostra

DETECTORES

Caractersticas Operacionais do DCT

Natureza do Gs de Arraste: Quanto maior a diferena de entre a condutividade trmica do gs de arraste puro, A, e do analito X, MAIOR A RESPOSTA. = A - X Como 1/M (M=massa molecular) QUANTO MENOR A MASSA MOLECULAR DO GS DE ARRASTE, MAIOR A RESPOSTA

DETECTORES

Caractersticas Operacionais do DCT

FATORES DE RESPOSTA: Quanto menor a condutividade trmica do analito, maior o sinal

Os fatores de resposta dependem da condutividade trmica do analito

Quantidades iguais de substncias diferentes geram picos cromatogrficos com reas diferentes!!!

DETECTORES

Caractersticas Operacionais do DCT

TEMPERATURAS

DE OPERAO: Quanto maior a diferena entre a temperatura dos filamentos e do bloco metlico maior a resposta.

DETECTORES

APLICAES

Separao e quantificao de compostos que no geram sinal em outros detectores (gases nobres, gases fixos) Por ser um detector NO-DESTRUTIVO, pode ser usado em CG preparativa ou deteco seqencial com dois detectores em tandem.

DETECTORES
CONDUTIVIDADE TRMICA DE ALGUNS GASES

DETECTORES

DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA

PRINCPIO:

Formao de ons quando um composto queimado em uma chama de hidrognio e oxignio.

DETECTORES

DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA

DETECTORES

DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA

Regio

de quebra: Mistura dos gases, praquecimento, incio da quebra das molculas de H2, O2 e outros analitos Zona de reao: Reaes exotrmicas com produo e/ou consumo de radicais H, O, OH, HO2 (provenientes do H2), CH e C2 (proveniente do analito) e ons CHO+ (analito) Zona de incandescncia: Emisso de luz por decaimento de espcies excitadas: OH (luz UV), CH e C2 (visvel)

DETECTORES

DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA

DETECTORES

Caractersticas Operacionais do DIC

SELETIVIDADE: Seletivo para substncias que contm ligaes C-H em sua estrutura qumica

Como virtualmente todas as substncias analisveis por CG so orgnicas, na PRTICA o DIC UNIVERSAL)

DETECTORES

Caractersticas Operacionais do DIC

SENSIBILIDADE/LINEARIDADE:

QMD tpicas = 10 pg a 100 pg com linearidade entre 107 e 108 (pg a mg) VAZES DE GASES: Alm do gs de arraste, as vazes de alimentao de ar (comburente) e hidrognio (combustvel) devem ser otimizadas.

DETECTORES

Caractersticas Operacionais do DIC

TEMPERATURA

DE OPERAO: O efeito da temperatura sobre o sinal do DIC negligencivel. TRATAMENTO DO SINAL: Por causa da baixa magnitude da corrente eltrica gerada (pA a nA), ela deve ser amplificada para poder ser registrada.

DETECTORES

Caractersticas Operacionais do DIC

FATORES DE RESPOSTA: O fator de resposta de um determinado composto aproximadamente proporcional ao nmero de tomos de carbono. Presena de heteroelementos diminui o fator de resposta.

DETECTORES

DETECTOR DE NITROGNIOFSFORO
Modificao

do DIC altamente seletiva para compostos orgnicos nitrogenados e fosforados

DETECTORES

DETECTORES POR CAPTURA DE ELTRONS

PRINCPIO: Supresso de um fluxo de eltrons lentos (termais) causada pela sua absoro por espcies eletroflicas

DETECTORES

DETECTOR POR CAPTURA DE ELTRONS

MECANISMO

DE CAPTURA DE ELTRONS

DETECTORES

Caractersticas Operacionais do DCE

FONTE

RADIOATIVA: O nodo deve estar dopado com um istopo radioativo ou emissor

DETECTORES

Caractersticas Operacionais do DCE

Polarizao dos eletrodos: Vrios modos de polarizao possveis

VOLTAGEM CONSTANTE: Pouco usada modernamente picos cromatogrficos podem ser deformados VOLTAGEM PULSADA: Menos anomalias eltricas maior sensibilidade e linearidade

Temperatura do detector: Dependncia do sinal com temperatura de operao bastante significativa

Variao de 3 C na temperatura Erro ~10% na rea dos picos Magnitude e sinal do erro depende do composto analisado! TEMPERATURA DO DCE DEVE SER RIGOROSAMENTE CONTROLADA

DETECTORES

Caractersticas Operacionais do DCE

GS

DE ARRASTE: Funcionamento do DCE muito dependente da natureza do gs de arraste

DETECTORES

Caractersticas Operacionais do DCE

SENSIBILIDADE/LINEARIDADE:

QMD=0,01 pg a 1 pg (organoclorados), linearidade ~104 (pg a ng)

DETECTORES

Caractersticas Operacionais do DCE

SELETIVIDADE/FATORES

DE RESPOSTA

Valores de S maximizados para compostos eletroflicos

DETECTORES

Detector de Captura de Eltrons

APLICAO

DETECTORES

CROMATOGRAFIA GASOSA
Compostos volteis de pontos de ebulio de at 350 C e pesos moleculares menores que 500 Compostos que possam produzir derivados volteis Compostos termicamente estveis na condies de trabalho

CROMATOGRAFIA GASOSA

ALGUMAS APLICAES
Indstria

Petroqumica Alimentos e Bebidas Biocidas Medicamentos Meio ambiente

CROMATOGRAFIA GASOSA

CROMATOGRAFIA GASOSA

GS DE ARRASTE
FASE

MVEL EM CG: NO interage com a amostra apenas a carrega atravs da coluna. Assim usualmente referida como gs de arraste

INERTE:

No deve reagir com a amostra, fase estacionria ou superfcies do instrumento PURO: Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionria

CROMATOGRAFIA GASOSA

Impurezas tpicas em gases e seus efeitos:

H2O, O2 oxida/hidrolisa algumas FE, incompatveis com DCE Hidrocarbonetos rudo no sinal de DIC

CROMATOGRAFIA GASOSA
GASES - FILTROS

CROMATOGRAFIA GASOSA

CUSTO: Gases de altssima pureza podem ser muito caros

CROMATOGRAFIA GASOSA

COMPATVEL COM UM DETECTOR:

Cada

detector demanda um gs de arraste especfico para melhor funcionamento

CROMATOGRAFIA GASOSA

Alimentao do gs de arraste

CROMATOGRAFIA GASOSA

Dispositivos de Injeo de Amostra

Os

dispositivos para injeo (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introduo INSTANTNEA da amostra na coluna cromatogrfica

CROMATOGRAFIA GASOSA

SISTEMAS DE INJEO

CROMATOGRAFIA GASOSA
INJETOR ON-COLUMN CONVENCIONAL

CROMATOGRAFIA GASOSA

Injeo on-column de lquidos

CROMATOGRAFIA GASOSA

INJETORES SPLIT/SPLITLESS

CROMATOGRAFIA GASOSA

SPLIT
Amostras

concentradas onde a diluio com solvente impossvel particularmente devido a co-eluio

SPLITLESS
Amostras

diludas ou anlise de traos Anlise em ampla faixa de ponto de ebulio e polaridade Adequado para anlide de amostras complexas (multicomponentes)

CROMATOGRAFIA GASOSA

Parmetros de Injeo
TEMPERATURA

DO INJETOR: Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposio

REGRA GERAL: Tinj=50 C acima da temperatura de ebulio do componente menos voltil

VOLUME

INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado fsico da amostra

Slidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a soluo

CROMATOGRAFIA GASOSA

MICROSSERINGAS PARA INJEO

LQUIDOS:

capacidades tpicas

1L, 5 L e

10 L

CROMATOGRAFIA GASOSA

COLUNAS CROMATOGRFICAS

Colunas empacotadas

CROMATOGRAFIA GASOSA

CROMATOGRAFIA GASOSA

COLUNAS CROMATOGRFICAS
Coluna

Empacotada VANTAGENS
Simples preparao e uso Tecnologia clssica Grande nmero de fases lquidas Capacidade alta e longa durabilidade Usada para anlise de gases com DCT

DESVANTAGENS
Nmero de pratos limitado Exige controle da vazo da fase mvel Anlises relativamente demoradas Baixa resoluo para amostras complexas

CROMATOGRAFIA GASOSA

Temperatura da Coluna
Alm

da interao da FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSO DE VAPOR (p0)

CROMATOGRAFIA GASOSA

Temperatura da Coluna
CONTROLE

CONFIVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAO EM CG

CROMATOGRAFIA GASOSA

FORNO DA COLUNA
Caractersticas

desejveis de um forno: Ampla faixa de temperatura de uso: Pelo menos de Tamb at 400 C. Sistemas criognicos (T < Tamb) podem ser necessrios em casos especiais Temperatura independente dos demais mdulos: No deve ser afetado pela temperatura do injetor e detector Temperatura uniforme em seu interior: Sistemas de ventilao interna muito eficientes para manter a temperatura homognea em todo forno

CROMATOGRAFIA GASOSA

FORNO DA COLUNA
Caractersticas

desejveis de um forno: Fcil acesso coluna: A operao de troca de coluna pode ser freqente Aquecimento e resfriamento rpido: Importante tanto em anlises de rotina e durante o desenvolvimento de metodologias analticas novas Temperatura estvel e reprodutvel: A temperatura deve ser mantida com preciso e exatido de 0,1 C
EM CROMATGRAFOS MODERNOS (DEPOIS DE 1980) O CONTROLE DE TEMPERATURA DO FORNO TOTALMENTE OPERADO POR MICROCOMPUTADORES

CROMATOGRAFIA GASOSA

Programao Linear de Temperatura

Misturas

complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:

CROMATOGRAFIA GASOSA

Programao Linear de Temperatura

A

temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separao:

CROMATOGRAFIA GASOSA

Programao Linear de Temperatura

POSSVEIS PROBLEMAS ASSOCIADOS PLT

CROMATOGRAFIA GASOSA

DETECTORES: Dispositivos que

examinam continuamente o material eludo, gerando sinal quando da passagem de substncias que no o gs de arraste

CROMATOGRAFIA GASOSA

DETECTORES MAIS IMPORTANTES:

Detector

por condutividade trmica (DCT ou TCD): Variao da condutividade trmica do gs de arraste Detector por Ionizao de Chama (DIC ou FID): ons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar Detector por Captura de Eltrons (DCE ou ECD): Supresso de corrente causada pela absoro de eltrons por eluatos altamente eletroflicos

CROMATOGRAFIA GASOSA

FASES ESTACIONRIAS

CROMATOGRAFIA GASOSA

Caractersticas de uma FE ideal

SELETIVA:

Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra

REGRA GERAL: A FE deve ter caractersticas tanto quanto possvel prximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromtico...)

CROMATOGRAFIA GASOSA

Caractersticas de uma FE ideal

AMPLA

FAIXA DE TEMPERATURAS DE USO: Maior flexibilidade na otimizao da separao BOA ESTABILIDADE QUMICA E TRMICA: Maior durabilidade da coluna, no reage com componentes da amostra POUCA VISCOSIDADE: Colunas mais eficientes (menor resistncia transferncia do analito entre fases) DISPONVEL EM ELEVADO GRAU DE PUREZA: Colunas reprodutveis; ausncia de picos fantasma nos cromatogramas

CROMATOGRAFIA GASOSA

FASES ESTACIONRIAS SLIDAS: ADSORO

O

fenmeno fsico-qumico responsvel pela interao do analito + FE slida a ADSORO

A adsoro ocorre na interface entre o gs de arraste e a FE slida

CROMATOGRAFIA GASOSA

FASES ESTACIONRIAS SLIDAS: ADSORO

CROMATOGRAFIA GASOSA

FASES ESTACIONRIAS SLIDAS

Caractersticas

Gerais:

Slidos finamente granulados (dimetros de partculas tpicos de 105 m a 420 m) Grandes reas superficiais (at 102 m2/g)

CROMATOGRAFIA GASOSA

CROMATOGRAFIA GASOSA

FASES ESTACIONRIAS LQUIDAS: ABSORO

O

fenmeno fsico-qumico responsvel pela interao do analito + FE slida a ABSORO

A ABSORO OCORRE NO INTERIOR DO FILME DE FE LQUIDA (FENMENO INTRAFACIAL)

CROMATOGRAFIA GASOSA

FASES ESTACIONRIAS LQUIDAS: ABSORO

CROMATOGRAFIA GASOSA

FASES ESTACIONRIAS
FAMLIAS

DE FE LQUIDAS

CROMATOGRAFIA GASOSA

FASES ESTACIONRIAS
FAMLIAS

DE FE LQUIDAS

CROMATOGRAFIA GASOSA

FASES ESTACIONRIAS
FAMLIAS

DE FE LQUIDAS

CROMATOGRAFIA GASOSA

FASES ESTACIONRIAS
QUIRAIS

CROMATOGRAFIA GASOSA

FASES ESTACIONRIAS
QUIRAIS

CROMATOGRAFIA GASOSA

FASES ESTACIONRIAS
QUIRAIS

CROMATOGRAFIA GASOSA

CROMATOGRAFIA GASOSA

COLUNAS EMPACOTADAS
Tubo

de material inerte recheado com FE slida granulada ou FE lquida depositada sobre um suporte slido

CROMATOGRAFIA GASOSA

COLUNAS EMPACOTADAS
FE

Lquidas: SUPORTE

CROMATOGRAFIA GASOSA

COLUNAS CAPILARES

CROMATOGRAFIA GASOSA

COLUNAS CAPILARES
DIMETRO

INTERNO

cromatografia