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Aula 5 - Técnicas cromatográficas I

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Técnicas de Separação Cromatográficas Princípios gerais I

Métodos Instrumentais de Análise: 2011/2012

Sumário
• Breve introdução histórica • Mecanismo de separação • Classificação dos métodos cromatográficos
Escala da separação Suporte do leito cromatográfico Mecanismo de separação Estado físico da fase móvel

• Equipamento básico para a realização de uma cromatografia em coluna

23 Skoog 7ª ed (biblioteca) Cap. 28 Introdução às Separações Analíticas Cromatografia gasosa (GC) Cromatografia Líquida de Elevada Eficiência (HPLC) Cap.Biblio Tópico Harris. 24 Cap. 25 Cap. 29 Cap. 30 . 5ª ed (biblioteca) Cap.

Métodos de separação Os detalhes moleculares de um processo bioquímico não podem ser totalmente elucidados até todas as moléculas participantes terem sido isoladas e caracterizadas Classe Separações mecânicas Força da separação Gravidade Força centrífuga Pressão Gradiente de concentração Pressão Campo eléctrico Gradiente de concentração Exemplo Filtração Centrifugação Filtração sob pressão Diálise Ultrafiltração Electrodiálise Técnicas cromatográficas Técnicas electroforéticas Separações através de membranas Separações governadas por difusão Separações eléctricas Campo eléctrico .

Cromatografia – breve introdução histórica • • 1903 – 1906: técnica desenvolvida por Mikhail Tswett (botânico russo) separação de pigmentos através da passagem de extractos de plantas por colunas empacotada com CaCO3 finamente dividido Cromatografia • • • Croma = cor Graphien = escrever os pigmentos fotossintéticos separados apareciam como bandas ou zonas coradas na coluna .

Cromatografia – breve introdução histórica Etapas importantes no desenvolvimento das técnicas cromatográficas 1850 Runge separa corantes tendo por base a sua adsorção diferencial em papel Tswett inventa a cromatografia líquida em coluna – separação de extractos de folhas de plantas em solventes orgânicos através de colunas empacotadas com pó de giz Martin e Synge desenvolvem a cromatografia de partição (Prémio Nobel Química. usando inicialmente a cromatografia em colunas de amido e posteriormente através do desenvolvimento da cromatografia de troca iónica Piel desenvolve a cromatografia líquida de elevada eficiência (HPLC) 1903 1906 1942 1946 1965 1969 . 1952: princípios teóricos da cromatografia e desenvolvimento da cromatografia gasosa) Stein and Moore determinam pela primeira vez a composição em residuos de aminoácidos de uma proteína.

Quantitative Chemical Analysis .6e B A A emerge B emerge .Cromatografia – Definição IUPAC é um método físico de separação em que os componentes de uma amostra se distribuem entre duas fases: fase estacionária: de grande superfície (sólida ou líquida) fase móvel: fluido (gás ou líquido) que transporta a amostra numa direcção definida ao longo da fase estacionária Harris.

Factores que influenciam a retenção de um soluto • a separação é efectuada tendo por base a afinidade química relativa de cada componente da amostra para as fases móvel e estacionária • este parâmetro dependente de: tipo e propriedades da fase estacionária tipo e propriedades da fase móvel forças intermoleculares: • Forças de dispersão de London (interacções dipolo induzido – dipolo induzido) • • analito e fase móvel analito e fase estacionária • • • Interacções dipolo – dipolo induzido Interacções iónicas Pontes de hidrogénio temperatura .

Vm: volume da fase estacionária/ móvel Coeficiente de distribuição efectivo (K) – quantidade total de soluto em cada fase Quanto > KD ⇒ o soluto permanece mais tempo na fase estacionária ⇒ a velocidade de migração é inversamente proporcional a Kd .Cromatografia – Mecanismo de separação KD: Coeficiente de partição ou distribuição do soluto S entre as duas fases Sst Sm M st Vst Kd = = Cm M m Vm Cst Cst. Cm: concentração de soluto na fase estacionária/ móvel Mst. Mm: massa de soluto na fase estacionária/ móvel Vst.

Modelo para a separação cromatográfica Admitindo que a fase móvel se move na coluna por incrementos de 1 cm3 em vez de uma forma contínua: Cst • KD (A) = 1 Kd = • fase estacionária granular sólida Cm • h = 5 cm • fase móvel líquida 1 cm3/cm coluna Cst. concentração de soluto na fase estacionária • 32 µg composto em 1 cm3 solvente Cm. o composto distribui-se ao longo da coluna mas está mais concentrado no seu centro . concentração de soluto na fase móvel 1 A B C D E 32 16 16 2 16 16 8 8 8 8 3 8 16 8 4 8 4 4 8 4 4 4 12 12 4 2 6 6 2 2 6 6 2 5 2 8 12 8 2 Após 5 equilíbrios.

. maior será a concentração do soluto numa parte da coluna.Separação cromatográfica • KD (A)>1 Pico de concentração acima do centro da coluna • KD (A) = 1 Pico de concentração no centro da coluna • KD (A) < 1 Pico de concentração abaixo do centro da coluna Quanto maior o número de equilíbrios.

relativa de soluto n = 1000 n = 100 n=6 Distribuição relativa na coluna .SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA Factores que influenciam o padrão de separação duma mistura de compostos Resolução situação real coluna normal coeficiente de distribuição efectivo nº de equilibrios equilibrio ocorre continua/ milhares de equilibrios nº de equilibrios nº de pratos teóricos nº de pratos teóricos Qt. mais eficiente é uma coluna cc.

Classificação dos métodos cromatográficos I Escala da separação Cromatografia analítica • pretende-se determinar a composição química de uma amostra: separar e quantificar os seus componentes em pequena escala Cromatografia preparativa • pretende-se purificar e colectar um ou mais componentes de uma amostra em grande quantidade (µg a g).1 – 30 mL/min • colunas com um diâmetro interno (ID) tipicamente entre 7 . num grau de pureza elevado • colunas com um diâmetro interno (ID) máximo de 10 mm. • velocidade do fluxo 20 – 1 200 mL/min .50 mm. • velocidade do fluxo 0.

Biochemistry.Classificação dos métodos cromatográficos II Suporte do leito cromatográfico Cromatografia em coluna • a fase estacionária está inserida num tubo/ coluna Cromatografia planar • a fase estacionária tem a forma ou é suportada por uma superfície plana (cromatografia em papel ou em camada fina) • a coluna pode ser operada sob pressão ou por acção da gravidade Voet. 3e .

7e .Classificação dos métodos cromatográficos III Mecanismo de separação Cromatografia de adsorção • a separação tem por base as diferentes afinidades adsorventes dos componentes da amostra pela superfície de um sólido activo. com um nº finito de centros de ligação Cromatografia de partição • a separação tem por base as diferentes solubilidades dos componentes da amostra na fase estacionária (cromatografia gasosa) ou nas fases móvel e estacionária (cromatografia líquida) Harris.

7e .Classificação dos métodos cromatográficos III Mecanismo de separação Cromatografia de troca iónica Cromatografia de exclusão estérea ou molecular • a separação tem por base as diferenças de raio de Stokes (forma e tamanho) dos componentes da amostra • a separação tem por base as diferenças de carga dos componentes da amostra Harris.

7e .Classificação dos métodos cromatográficos III Mecanismo de separação Cromatografia de afinidade • separação baseada no estabelecimento de uma interacção bioespecífica entre os componentes da amostra e um ligando ligado á matriz Harris.

líquido Líquido adsorvido num sólido Espécie orgânica ligada covalentemente a uma superfície sólida Sólido Cromatografia Gás .sólido Permuta iónica Exclusão Molecular Líquido nos interstícios de um gel Gás .Classificação dos métodos cromatográficos IV Estado físico da fase móvel Classificação Geral Método específico Líquido .líquido Fase estacionária Líquido adsorvido num sólido Espécie orgânica ligada covalentemente a uma superfície sólida Sólido Resina de troca iónica Tipo de equilíbrio Partição entre líquidos imiscíveis Partição entre a fase líquida e a fase “ligada” Adsorção Permuta iónica Exclusão estérea Cromatografia Fase líquida líquida (LC) “ligada” fase móvel: líquido Líquido .fase ligada gasosa (GC) fase móvel: gás Partição entre o gás e o líquido Partição entre o gás e a fase “ligada” Adsorção Gás .sólido .

Equipamento básico para cromatografia em coluna Bomba peristáltica Coluna Detector UV λ= 280nm Colector Registador .

Tubos de vidro ou seringas com lã de vidro na parte inferior .Colunas comerciais: • vidro de borossilicato • suporte da fase estacionária • prato de vidro poroso • adaptadores com posição variável • camisa para circulação de líquido termostatizado • tubagem capilar • válvulas e torneiras de várias vias .Colunas .

proteger a superfície da coluna para não se formarem poços durante a aplicação da amostra .Enchimento da coluna a fase estacionária (mistura semi-sólida) deve ser adicionada à coluna com a saída fechada. de preferência de uma só vez a fase estacionária vai-se depositando por acção da gravidade - .nunca deixar secar a coluna .abrir a coluna e iniciar o fluxo da fase móvel se for necessário repetir este procedimento. evitar a criação de interfaces entre as várias etapas .

Bomba peristáltica Pressão operativa em A e B: pressão (em cm de água) medida em termos da distância que separa a superfície de líquido: (A) na coluna ou (B) no reservatório da solução tampão e a saída do tubo capilar .Eluição por acção da gravidade (reservatório Mariotte) (A) (B) Pressão operativa .Controlo do fluxo da fase móvel .

• não diluir a amostra • não deixar secar a coluna durante a aplicação da amostra • a densidade da amostra pode ser aumentada por adição de sacarose a 1% • não sobrecarregar a coluna com amostra (separações irregulares) .Cuidados a observar na aplicação da amostra • não perturbar a superfície do gel empacotado na coluna aplicada na coluna .

Desenvolvimento da coluna Definições: eluente: fase móvel eluição: migração do analito na coluna devido ao movimento da fase móvel eluído: fase móvel que vai saindo da coluna Desenvolvimento da coluna: Separação isocrática Eluição por gradiente ∆ pH ∆I ∆ polaridade .

nº de gotas vazadas • Análise das fracções .Contagem de cintilações (radioactividade) .Colector automático • tambor circular que suporta tubos de ensaio • movimento periódico do porta tubos pré-determinado: ..Recolha e análise das fracções • Recolha das fracções: .volume vazado .tempo .Colorimetria ..Manual .Absorção no UV (detector de UV) .RIA . .Fluorimetria .

produtos farmacêuticos.Vantagens das técnicas cromatográficas • • • Processo muito selectivo devido ao grande número de combinações possíveis de fases móveis e estacionárias Permite separar misturas muito complexas: glícidos. proteínas.. drogas.. enantiómeros . Os componentes separados podem ser colectados individualmente ou analisados posteriormente por outras técnicas (técnicas hífenadas) que auxiliam a sua identificação No caso de separações analíticas são necessárias amostras de tamanho muito reduzido As análises podem ser muito exactas e precisas Em geral.. trata-se de uma técnica simples e rápida • • • .

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