Espectroscopia de Absorcin.

Dicrosmo Circular Infrarrojo

MILAGROS MEDINA FACULTAD DE CIENCIAS UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA

Dicrosmo Circular
La Luz Polarizada en un Plano es la suma de la luz polarizada circularmente a derecha y izquierda.

Dicrosmo Circular Luz Circularmente polarizada

Espectroscopia Dicrosmo Circular

Cuando la luz polarizada en un plano atraviesa una muestra pticamente activa sus componentes de luz circularmente polarizada se absorben en distinta cantidad.

Espectroscopia Dicroismo Circular

La nueva recombinacin produce luz elpticamente polarizada

= elipticidad

Luz polarizada en un plano

Luz polarizada elpticamente

Dispersin ptica Rotatoria

Dispersin ptica Rotatoria

Efecto de la diferencia en el ndice de refraccin para la luz polarizada circularmente a izquierdas y a derechas. Luz polarizada emergente polarizada en el plano y rotada

Molculas pticamente activas

Toda molcula que no dispone de un plano de simetra o centro de inversin. No es superponible con su imagen especular. La mayor parte de las molculas sintetizadas por los organismos vivos son pticamente activas (L-aminoacidos predominan sobre D-)

Phe

A qu se debe el comportamiento rotatorio de macromolculas?

la estructura primaria es intrnsecamente asimtrica Las estructuras secundarias de muchos biopolmeros son helicoidales La estructura terciaria de la macromolcula

Absorcin molecular Dicrosmo circular Luz polarizada (UV/Vis)

Especie pticamente activa

Aderecha

Aizquierda

Diferencia entre Aderecha y Aizquierda es la seal de dicrosmo circular

Dicrgrafo: Jasco J-715

Cubetas

Espectroscopia Dicrosmo Circular

CD se define como la diferencia de coeficientes de extincin A() = AL() - AR(l) = [L() - R()].l.c = .l.c Por razones histricas los espectrmetros presentan CD como elipticidad, , que relaciona la medida a la DOR. A = /32.98 y por tanto la expresin con es la elipticidad molar, que incluye un factor arbitrario de 100 y se da en deg.dl/(mol.dm) (o deg cm2/dmol) [] = 3298.
Bandas positivas o negativas es unos rdenes de magnitud menor que Algunas bandas intensas en absorcin son dbiles en DC y viceversa.

Espectroscopia Dicrosmo Circular Principales Cromforos en Protenas Los cromforos en UV/vis Enlace peptdico
2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 200

Cadenas laterales de los aminocidos aromticos Grupos protticos y coenzimas

Absorbancia (UA)

300

400

500

600

Longitud de Onda (NM)

Espectroscopia Dicrosmo Circular Principales Cromforos en Protenas UV-Lejano: El enlace peptdico

El cromforo mas importante presente en protenas es el grupo amida del enlace peptdico, un carbono asimtrico entre dos grupos amida.

n -> * 220 NM -> * 190 NM n -> * O del CO -> * electrones del CO

La intensidad y energa de estas transiciones depende de y

Las estructuras secundarias formadas por enlaces peptdicos son asimtricas y tienen espectros de CD caractersticos.

hlice

banda negativa a 222 nm (n->*) cuplete negativo-positivo a 208 y 190 nm (Componentes paralelo y perpendicular de una transicin >*). banda negativa a 215-218 nm (->*) banda positiva a 196-198 nm (n->*)

hoja

Giro (desordenado) positiva a 212 nm (->*) negativa a 195 nm (n->*) CD de una protena nativa depende de la fraccin de sus componentes de estructura secundaria. Cambios en las conformaciones de pptidos y protenas debidas a calentamiento, cambio de solvente u otra variacin pueden seguirse fcilmente por CD.

Espectroscopia Dicrosmo Circular Principales Cromforos en Protenas UV-Cercano: Cadenas laterales de aminocidos aromticos
El CD de los cromforos en protenas puede indicar interacciones con las molculas en la vecindad inmediata. CD inducido. Si una molcula simtrica que absorbe se disuelve en un solvente quiral, se observa CD en la regin de absorcin del soluto no quiral. Este es el caso de las cadenas laterales de los aminocidos aromticos al formar parte de la estructura tridimensional de una protena.

Espectroscopia Dicrosmo Circular Principales Cromforos en Protenas Visible: Cofactores y Coenzimas

Muchas protenas contienen o interaccinan con cofactores o coenzimas que cromforos nativos y presentan CD inducido. Grupos hemo (hemoglobina, mioglobina, citocromos), retinol (rodopxina), centros sulfofrricos (ferredoxina), metales, flavinas, nucletidos, etc
Elipticidad Molar (x 103)

0,5 0,4

UV-Vis

200

CD

Absorbancia

0,3 0,2 0,1 0,0 300 400 500 600

100

250

300

350

400

450

500

Longitud de Onda (NM)

Longitud de onda (NM)

Ventajas:
- Uso de poco material: 200 L de 0.5 mg/mL de solucin -Mtodo no destructivo -Estudio de cambios de entorno: pH, agentes desnaturalizantes, T - Desempea un papel importante en la determinacin de los componentes estructurales de las protenas. -Es rpido y se puede utilizar para analizar un numero de protenas candidatas a posteriores estudios estructurales ms detallados como RMN y Rayos-X. -Capacidad de detectar cambios estructurales en una protena que ha sufrido alguna perturbacin. -Comparacin de estructuras manipuladas por ingeniera de protenas frente a la especie nativa.

Inconvenientes:
-La absorbancia del solvente interfiere en la regin de UV. Hay que trabajar con tampones muy diluidos y que no absorban a < 200 NM -Medidas sujetas a errores experimentales -La determinacin de los porcentajes de elementos de estructura secundaria no es realista. -Poca informacin de estructura terciaria o cuaternaria

Espectroscopia de Infrarrojos
Absorcin vibracional Cada tomo tiene tres grados de libertad: traslacin. La molcula tiene tres grados de libertad traslacional y, si es no lineal, tres grados de libertad rotacional. Los restantes grados de libertad para una molcula no lineal de n tomos, 3n-6 (3n-5, si es lineal), son modos vibracionales del estado fundamental. Estas vibraciones son grados internos de libertad, y se expresan en termino de las coordenadas del centro de masas. Estos modos presentan ligeras diferencias en energa.
MODOS DE VIBRACIN DE LOS ENLACES Hay diferentes modos normales de vibracin en las molculas, llevan asociado un movimiento caracterstico de los tomos, los principales son: las deformaciones de enlace, ngulos de valencia, ngulos diedros, deformaciones fuera del plano, etc.

Espectroscopia de Infrarrojos

Las energas de estas transiciones vibracionales se encuentran en la regin del infrarrojo del espectro electromagntico. Las transiciones entre modos vibracionales se estudian por IR y RAMAN. Utiliza la radiacin del espectro electromagntico cuya longitud de onda est comprendida entre los 800 y los 400000 nm. Tcnica de Espectroscopia de Absorcin empleada principalmente en la elucidacin de estructuras moleculares.

Espectroscopia de Infrarrojos

Los espectros se miden en %T (o Abs) vs frecuencia. Las frecuencias van desde 5000 cm1(2000 nm) a 200 cm-1 (50000 nm). Sigue la ley the Beers Lambert y reglas similares a UVVis. Cada absorcin observable en el espectro corresponde a una vibracin determinada de algn enlace dentro de la molcula. Los picos observados indican la presencia de determinados grupos funcionales.

Espectroscopia de Infrarrojos
La molcula de formaldehido presenta un espectro de infrarrojo sencillo con 6 modos normales de vibracin.
modo normal simetra

valor Expt. (cm-1) 2782 1746 1500 2843 1249 1167

valor calc. HF/3-21G (cm-1) 3160 2027 1680 3232 1383 1335

descripcin

1 2 3 4 5 6

A1 A1 A1 B1 B1 B2

C-H (deformacin de enlace simtrica) C=O (deformacin de enlace) H-C-H (deformacin de ngulo) C-H (deformacin de enlace asimtrica) H-C=O (deformacin de ngulo de enlace asimtrico) (deformacin de ngulo de enlace fuera del plano)

El efecto sobre la materia orgnica de la radiacin IR es producir deformaciones de los enlaces de la sustancia. La absorcin de estas radiaciones de baja energa produce excitaciones en lo niveles vibracionales y rotacionales de los grupos de tomos que componen la molcula, permitiendo la identificacin de grupos funcionales.

Bandas Caractersticas en IR
Vibraciones X-H Hidroxilo Aminas Anillos aromticos Alquenos Alcanos Enlaces triples Enlaces dobles Deformacin/tomos pesados enlace O-H N-H C-H C-H C-H Longitud onda (cm-1) 3610-3640 3300-3500 3000-3100 3020-3080 2850-2960 2500-1900 1900-1500 1500-

Regiones vibracionales en el espectro de infrarojo.

La complejidad del espectro en la regin 1450 -600 cm-1 hace difcil la asignacin de todas las bandas. Sin embargo, esta regin se denomina regin de huella dactilar ya que presenta seales nicas para cada compuesto

Frecuencias de grupos
Las bandas de absorcin en la regin 4000 - 1450 cm-1 suelen deberse a vibraciones de estiramiento de unidades de dos tomos.

Espectroscopia de Infrarrojos
Inconvenientes IR: Menos usada que UV-Vis. -Las bandas IR son menos intensas, los coeficientes de extincin son mucho menores y por tanto se requiere utilizar concentraciones mayores. -Dipolos inducidos o de transicin. La intensidad de una banda vibracional depende de la magnitud del dipolo inducido. Este dipolo transitorio tiene un termino electrnico y otro vibracional. Adems, la direccin del dipolo inducido depende del tipo de vibracin. -H2O absorbe intensamente en muchas regiones de inters biolgico. muestras desecadas en pelcula -El sistema de deteccin de los instrumentos es menos sensitivo. Instrumentacin para IR D2O,

FTIR. No se suele hacer barrido normal, se mide a todas frecuencias y luego 2 FT.

Protenas: el enlace peptdico

El cromforo ms importante va a ser el enlace peptdico, se repite a lo largo de la estructura. El espectro es complicado ya los enlaces peptdicos estn en distintos entorno y los puentes de hidrgeno de las amidas cuando forman estructuras secundarias produce importantes desplazamientos de las correspondientes bandas vibracionales. La simetra de las estructuras secundarias, helice y hoja , produce bandas considerablemente manejables que ofrecen informacin sobre la conformacin de estructura secundaria en que se encuentra el enlace peptdico.

Espectroscopia de Infrarrojos Caractersticas de las principales bandas de absorcin del enlace peptdico
Vibracin Estiramiento N-H Amida I estiramiento C=O Amida II estiramiento C-N-H Hlice
3290-3300 1650-1660

Hoja
3280-3300 1630

No puente H
3400 1680-1700

1540-1520

1520-1525

<1520

Espectroscopia de Infrarrojos Caractersticas de las principales bandas de absorcin del enlace peptdico
Vibracin Estiramiento N-H Amida I estiramiento C=O Amida II estiramiento C-N-H Hlice
3290-3300 1650-1660

Hoja
3280-3300 1630

No puente H
3400 1680-1700

1540-1520

1520-1525

<1520

Espectroscopia de Infrarrojos La banda amida I del enlace peptdico

Deconvolucin de la banda amida I