Tecnologia do DNA recombinante

A deficincia de hormnio do crescimento faz com que a pessoa fique com uma estatura baixa. Nesses casos, necessrio o uso hormnio do crescimento para que o crescimento dessas crianas melhore.
O hormnio do crescimento foi um dos primeiros produtos da engenharia gentica. Ele foi produzido em E. coli a partir de um gene humano fusionado com elementos reguladores bacterianos. Esse foi o segundo produto farmacutico aprovado pelo FDA, em 1985.

O primeiro foi a insulina humana, em 1982.

Como amplificar um gene de interesse

Tipo de DNA doador

DNA genmico
cDNA DNA complementar

cDNA contm apenas os xons

DNA de interesse Formao de uma molcula de DNA recombinante

vetor

Enzimas de Restrio

Como funciona a amplificao

VETORES Plasmdeos: so molculas de DNA circulares, extracromossmicas, presentes em microrganismos, sendo que muitos se replicam autonomamente.

Estrutura de dois plasmdeos

Vetores de bacterifagos
A maioria fago labda
Genoma do fago: 48.502pb 15kb so necessrios para a lisogenia e podem ser removidos.

Clonagem usando o fago como vetor

Vetores cosmidiais
um hbrido entre plasmdeos e o fago labda Vantagens: capacidade do plasmdeo de replicao autnoma Capacidade do fago de embalagem do cromossomo Capacidade de 35 a 45kb

Estrutura de um cromossomo artificial bacteriano (BAC) usado para clonar grandes fragmentos de DNA (150 a 300kb)

Construo de bibliotecas de DNA

Conjunto de clones de DNA, contendo coletivamente todo o genoma.
DNA total digesto com enzimas de restrio insero em vetores

 Uma boa biblioteca tem todas as sequencias de DNA do genoma. Para genomas grandes so necessrios milhares de clones O nmero de clones pode ser calculado: N=(ln(1-P)/(ln(1-f) P: probabilidade, f: frao do genoma em um clone de tamanho mdio

Exemplo
Drosophila genoma 100.000kb Inserto 40kb Probabilidade de 99% de certeza de uma seqncia estar na biblioteca: N=(ln(1-0,99)/(ln(1-(40/100000) N=11.513 clones

Exerccio
O genoma humano tem 3 bilhes de nucletdeos Utilizando BACs: insertos de 200kb Quantos clones so necessrios para ter uma certeza de 95% de ter uma seqncia especfica na biblioteca? N=44.979

Microsatlites

Teste de paternidade