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Dicroismo Circular

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Dicroísmo Circular

Yraima Cordeiro
Departamentos de Fármacos Faculdade de Farmácia UFRJ

Yraima Cordeiro

DICROÍSMO CIRCULAR DE PROTEÍNAS

Yraima Cordeiro Dicroísmo Circular é a medida da absorbância diferencial entre as duas rotações de luz circularmente polarizada por uma molécula assimétrica.

Dicroísmo Circular de Proteínas

Elliptical polarized light (purple) is composed of unequal contributions of right (blue) and left (red) circular polarized light. Eric Y. Hayden

CD gera luz elipticamente polarizada

Yraima Cordeiro

= eixo menor(b)/eixo maior (a)

ER e EL, magnitudes dos vetores elétricos da luz circularizada para a direita e para a esquerda, respectivamente; Quando ER = EL, θ é 0° luz linearmente polarizada; luz circularmente polarizada. Quando ER ou EL = 0, θ é 45°

O efeito de CD é geralmente pequeno, então a tanθ é pequena e pode ser aproximada de Dessa forma a elipcicidade é diretamente proporcional ao CD. θ em radianos.

Luz linearmente x circularmente polarizada Yraima Cordeiro Circular Linear .

500) + (#Tyr)(1. 1948.Edelhoch. Anal. água.Gill & von Hippel. 1967. 1989.0 M GdmHCl/H2O . Biochem. Aλ = ε.Pace et al.l . Protein Science. M-1 cm-1) = (#Trp)(5. 4. 319 .Yraima Cordeiro Um pouco de espectroscopia aplicada a sistemas biológicos Determinação de Concentração de Proteínas 1) Bradford (1976) Comassie blue 2) Lowry (1951) Cu2+ Ensaios colorimétricos 3) Coeficiente de Extinção Molar @ 6.. 1995. 2411 ε (280. 1812.490) + (#Cistina)(125) .c. Biochemistry 6.

.Expressão do CD Diferença de absorbância dos dois componentes (lcp e rcp). New York. Circular Dichroism and the Confromational Analysis of Biomolecules (1996) Plenum Press.. E. centímetros C. Relação entre elipcicidade molar e ∆ε εL – εR = (AL– AR)/(lC) [θ](λ) = 100θ(λ)/(lC) l. Massachusetts. Optics 3rd Edition (1998) Addison Wesley Longman.εR) em M-1cm-1 Importante: especificar a notação utilizada! Fasman. moles. . Yraima Cordeiro Ou medir a elipcicidade → pode ser usada como medida pois a luz plano polarizada se torna elipticamente polarizada após passar através de um meio opticamente ativo. Hecht.D. G.cm2dmol-1 (εL.L-1 Elipcicidade molar por resíduo Dimensões: [θ] em deg.

exp(-Ar/2)]/[exp(-Al/2) + exp(-Ar/2)] Yraima Cordeiro Convertendo para deg.Relação elipcicidade vs CD θ = elipcicidade θ (rad) ≈ tan θ = (|El| –|Er |)/ (|El|+|Er |) = [exp(-Al/2) .29578 deg .98 ∆A Elipcicidade é diretamente proporcional ao CD 1 rad = 57. θ(deg) = 180 x ln 10 x ∆A/4π = 32.

98/ M o Millidegrees A*32980 mA*32.98) Degrees A*32.98 [θ]*C*l/ (3.298*M) mo*M/ (C*l*32980) [θ]/3298 mo/1000 [θ]*C*l/ (100*M) mo [θ]*C*L*10/ (M) mo*M/(10*l*C) [θ] .98 ε*C*l*32980/ M o*1000 Molar ellipticity A*M*3298/ (l*C) mA*M*3.03298 Molar Extinction A*M/(C*l) A*M/(C*l*1000) ε o*M/(C*l*32.298/ (l*C) ε*3298 o*M*100/(l*C) mo/32980 [θ]*C*l/ (3298*M) mo/32.Yraima Cordeiro Unidades Dicroísmo Circular From to → (A) (mA) (ε) (o) (mo) [θ] Absorbance A mA/1000 ε*C*l/M o/32.98 mA*0.03298 ε*C*l*32.98 Milli absorbance A*1000 mA ε*C*l*1000/M o/0.

Instrumentação Yraima Cordeiro .

Geração de luz circularmente polarizada a partir de feixes lineares Geração de luz elipticamente polarizada a partir de feixes circulares .Relação entre luz linearmente x luz circularmente polarizada Yraima Cordeiro Vetor elétrico da luz linearmente polarizada – soma de luz rcp e lcp de = magnitude.

jpg . ∆A = log (IO/IL) .log(IO/IR) = log(IR/IL) www.edu/images/cd_fig1.Yraima Cordeiro Equipamentos atuais de CD: modulam a luz entre as 2 rotações e medem a ≠ de absorbância a cada λ.protein.iastate.

Permite quantificação da luz rcp e lcp. Modulador fotoelástico – gera luz circularmente polarizada. .Instrumentação Yraima Cordeiro Jasco J-810 Fonte de luz: lampada de xenônio 150w (180 a 800nm). Monocromador prismático para dispersão da luz em diferentes comprimentos de onda. Detecção – tubo fotomultiplicador.

• Absorção de UV pelo oxigênio. • Ozônio: degradação da óptica. • Nitrogênio: remoção de oxigênio dos compartimentos da lâmpada. photophysics (Chirascan). Banho térmico.. Stopped flow → cinética rápida. proteção do usuário. do monocromador e da amostra.. . Acessório Peltier (0 a 100oC).Equipamentos atuais Yraima Cordeiro • Jasco.

Calibração • Ácido d-10-canforsulfônico Yraima Cordeiro .

esta absorbância é alcançada com concentração protéica de 0.89 Para uma cubeta com 1mm de caminho óptico. ↑ Voltagem do PMT . ↑ a concentração? ↑ a absorção – redução na quantidade de luz que chega nos detectores.1 a 0.3 mg/mL.Yraima Cordeiro Concentração da amostra A intensidade do CD é proporcional a concentração da espécie ativa. Absorbância ótima para medidas de CD: Abs = 0. .↑ do ruído.

9 Johnson.0 → amostra + solvente + cubeta Abs amostra normalmente válida → 0.3 ~0.Relação sinal/ruído em função da absorção da amostra Yraima Cordeiro Solvente também absorve! Abs máxima a 1. 1985 .

c.1 mm → ~ 50µL (outro suporte necessário) Yraima Cordeiro A concentração ótima protéica depende do caminho óptico da cubeta utilizada Aλ = ε.Cubetas • Caminho óptico: 1.00 cm → quantidade de amostra (~ 3mL) 1.0 mm → 200 a 300µL 0.l .

15M NaClO4 0.Yraima Cordeiro Importância da escolha do tampão Solvent system Cut off (nm) for 1mm path length Solvent system Cut off (nm) for 1mm path length Water Trifluoroethanol Hexafluoroisopropanol Acetonitrile Methanol Ethanol 2-Propanol Cyclohexane Dioxane < 185 <185 <185 185 195 196 196 <185 232 (NH4)2SO4 0.15M NaNO3 0.15M NaCl 0.15M Phosphate 100mM Tris 100mM Pipes 100mM Mes 100mM GdnHCl 4M Urea 4M 191 196 <185 245 <185 195 215 205 210 210 .

Yraima Cordeiro Determinação da estrutura secundária de proteínas por CD .

Estrutura secundária de proteínas Ângulos de torção em proteínas phi φ α β P2 -57º -120º -78º psi ψ -47o +120o +150º Yraima Cordeiro .

n→ π* (~ 222 nm). perpendicular ao eixo da hélice. π→ π* (~208 . paralela ao eixo da hélice.de/bednarski_.. fraca.Transição Alfa-hélice: π→ π* (~191 – 193 nm). Forte. . paralela ao eixo da hélice.uni-greifswald. → Yraima Cordeiro pharm1.210 nm).pharmazie..

chembio.ca/educmat/phy456/gif/sheet1.gif .200 nm).Transição folha−β: − π→ π* (~190 . n→ π* (~ 210 .uoguelph. → Yraima Cordeiro http://www.225 nm).

Yraima Cordeiro .

Yraima Cordeiro .

.E proteínas em random coil? Yraima Cordeiro Poly(Pro)II CD de peptídeos desordenados Johnson. 1985.

Proteínas desordenadas Poliprolina (PII) Yraima Cordeiro .

Efeito do solvente sobre estrutura secundária de proteínas e peptídeos Yraima Cordeiro .

Estabilidade térmica de ptns avaliada por CD Yraima Cordeiro Reversibilidade? .

8 0.4 0.6 0.0 0 2 4 6 8 0.0 B 1.CD – monitorar transições induzidas por temperatura e agentes desnaturantes.0 B Fraction aggregated (f) f (fraction denatured) 0.2 0. Pressão → não é possível.2 Yraima Cordeiro 1.6 0. 1.8 0.0 Guanidine hydrochloride [M] 20 30 40 50 60 70 80 Temperature (oC) Efeito de agentes químicos e do incremento de temperatura nas construções da rPrP rPrP23-231 rPrPD51-90 rPrPD32-121 .2 rPrP23-231 rPrP∆51-90 rPrP∆32-121 0.4 0.

Enovelamento protéico Intermediários do enovelamento Yraima Cordeiro .

Panel A: spectra at pH 7.3 and 3.5 pH 2 pH 5 216 nm Far-UV CD spectra of SMA (amyloidogenic light chain variable domain) as a function of pH.5.7.Yraima Cordeiro Detecção de intermediários de enovelamento 230 nm pH 7. Khurana et al. The solid line in panel B is a fit to eq 2 and gives apparent pKas of 6. pH 5 (square). Biochem 2001 . The solid line in panel C is a fit to eq 1 and gives an apparent pKa of 3.5 (dots). and pH 2 (triangle)..

Biol. The concentrations of NBD-556 were 0.. respectively. 20. as indicated in the figure. 2001 Schön et al. Chem. and 300 µM for curves 1-5. 10. Concentration of gp120: 3. J.7 µM. 190 Wavelength (nm) Cordeiro et al. 2006 . Biochem.. 5.Monitorar interação proteína-ligante → Muda Estabilidade? Muda Estrutura? Thermodynamics of Binding of a Low-Molecular-Weight CD4 Mimetic to HIV-1 gp120 20 Yraima Cordeiro C Raw Ellipticity (mdeg) 10 Interação ptn:DNA β 0 -10 -20 α 200 210 220 230 240 250 260 CD spectra of gp120 alone and in the presence of NBD556.

2008.ligante 15 Yraima Cordeiro Elipticidade Bruta (mgrau) 10 5 0 -5 -10 200 220 240 260 280 300 320 Comprimento de Onda (nm) • PrP23-231 • N2aRNA • [PrP23-231 + N2aRNA] • [PrP23-231] + [N2aRNA] Gomes et al. Chem.Interação proteína . . Biol. J.

Maior quantidade de proteína necessária.Near – UV: 250 → 330 nm Informação sobre aminoácidos aromáticos. pontes de enxofre. Intensidade das bandas de CD ~1 ordem de magnitude < far-UV. Yraima Cordeiro . Avaliação de intermediários da via de enovelamento. interação com ligantes.

Protein concentration was 0.0 296 nm 268 nm 287 nm Near-UV CD spectra for SMA.4.9 and 3. respectively. pH 5. .2 and 3. resulting in two apparent pKa values of pH 4.Near-UV – análise de estrutura terciária Yraima Cordeiro Resíduos aromáticos pH 2. which correspond to formation of IU. The lines through the data are fits to eq 1 for peaks at 296 and 287 nm.7. The data at 268 nm are fitted to eq 2.7 mg/mL. Panel B shows the pH dependence of the molar ellipticity. yielding apparent pKas of 3. and pH 2.5. Panel A shows plots of molar ellipticity for pH 7.

. Cada elemento estrutural (como α-hélice ou folha-β) pode ser descrito como um espectro de CD único e o efeito de variabilidade geométrica de elementos de estrutura secundária é desprezível. Somente cromóforos peptídicos são responsáveis pelo espectro de Far-UV e contribuições de outros peptídeos podem ser descartadas.Yraima Cordeiro Estimar conteúdo de estrutura secundária de ptns a partir do espectro de CD: Processo empírico → não há solução única para a deconvolução de um espectro de CD Levar em consideração seguintes fatores: A estrutura 3D obtida por difração de raios-X de proteínas de referência é mantida em solução aquosa. As contribuições dos elementos individuais de estrutura secundária para o espectro total de CD são aditivas e o efeito da estrutura terciária no espectro (Far-UV) é desprezível.

número de estruturas secundárias e fk é a fração da estrutura secundária de k Os espectros base Bk(λ) são calculados a partir de espectros de CD λ de um grupo de proteínas de referência com estrutura 3D conhecida.Yraima Cordeiro Princípios gerais dos métodos disponíveis S(λ) = espectro de CD de uma ptn. . Bk(λ): Onde N. Analisado como combinação linear de k espectros base.

Cn Yraima Cordeiro ∆Aλ = Σ(k1λ.Simplificando ∆Aλ = Σ ∆A1λ + ∆A2λ + . kλn. ∆Anλ ∆Anλ = knλ.l ..fα) + (kβλ..C2 + .fβ)]Cptn.Cn)l f.. fração de estrutura secundária ∆Aλ = Σ[(kαλ.l.C1 + k2λ..

rms deviation xi e yi. n.r. frações de estrutura secundária derivadas de análise de raios-x e calculadas a partir do espectro de CD. Yraima Cordeiro . número de proteínas de referência utilizado. coeficiente de correlação σ.

a natureza e número de proteínas escolhidas e a faixa de comprimento de onda do espectro de CD. para deconvolução do Yraima Cordeiro . Assinalamento da estrutura secundária de proteínas de referência a partir de estudos de difração de raios-X. Procedimento matemático espectro de CD. ex.Cálculo do conteúdo de estrutura secundária e comparação entre diferentes métodos Dependerá: Escolha do espectro de CD de proteínas de referência.

Intensidades menores de folhas-β do que α-hélices em espectros de CD. Correlação entre estimativas de CD e x-ray para folhas-β e β-turns depende de: • Escolha dos polipeptídeos ou ptns de referência.Estimativas Yraima Cordeiro Boas para α-hélices. Predomínio do sinal em α-hélice. • Número de proteínas selecionadas. • Assinalamento da estrutura secundária a partir dos dados de difração. .

Atualmente Melhor banco de dados. . Estruturas resolvidas por ressonância magnética nuclear. Yraima Cordeiro Estrutura cristalina ≠ estrutura em solução.

Base para desenho de enzimas modificadas com características específicas para desempenhar funções existentes ou para novas aplicações. Mutações sítio – dirigidas: efeitos na estrutura. Yraima Cordeiro . Estudo de relação estrutura – atividade.CD na engenharia de proteínas e peptídeos Desenho de variantes enzimáticos. estabilidade e atividade enzimática.

Pequena quantidade de material necessária para efetuar as medidas. Aplicada a moléculas em solução. Técnica não destrutiva. Yraima Cordeiro . Técnica validada. Medidas rápidas.Vantagens da técnica Ótima para estudo de estrutura secundária de biopolímeros em solução.

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