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Universidade Catlica de Gois

Quimioluminescncia

Wilson de Melo Cruvinel

Quimioluminescncia
Fenmeno que se obtm energia luminosa a partir de uma reao qumica; Opo de ensaio com elevada sensibilidade e especificidade adequada. Um dos mtodos para substituir o radioimunoensaio;

Radioimunoensaio: um dos mtodos mais sensveis para anlise quantitativa antgeno-anticorpo Limitaes do radioimunoensaio: sensibilidade e especificidade elevadas, custo, licena, vida mdia do traador, risco operacional, dispensa de reagentes.

Histrico da Luminescncia
1667- Identificao de Bioluminescncia 1877- Descrio dos compostos luminescentes 1947- Luciferase do vagalume
inadequados

1952- Utilizao da luciferase em um ensaio - resultados 1976- Primeiro ensaio quimioluminescente - Luminol 1978-1994- Caracterizar steres de acridina que so marcadores em imunoensaios

Princpio da Quimioluminescncia:
A energia qumica gerada como resultado da dissociao de ligaes fracas produz compostos intermedirios em um estado eletronicamente excitado que, quando retornam ao estado de energia inicial emitem luz que medida.

Equilbrio Mudana de pH
LUZ

Luminescncia: a emisso de luz associada com a dissipao de energia de uma substncia que se encontra em um estado eletricamente excitado

Vantagens da Luminescncia
Elevada sensibilidade (atomol at zeptomol) Linearidade da curva dose resposta Rapidez no sinal gerado e estvel Custo (uso de pequenas quantidades de reagentes) Procedimento simples

Trs tipos de luminescncia:


1. Fotoluminescncia (fluorescncia): excitao por ftons de luz infravermelho, ultravioleta ou visvel; 2. Bioluminescncia: mediada por enzimas em sistemas biolgicos; (luciferase-luciferina) 3. Quimioluminescncia: Excitao por reao qumica (mais utiizado)

Bioluminescncia
Exemplo: vagalume, bactrias marinhas

Ao da luciferase Luciferina (substrato)


Oxidao

Estado de equilbrio

Fton de luz

Luminol
Um dos representantes da Quimioluminescncia Limitaes: Necessita de um catalisador; Apresenta uma srie de interferncias de fundo ao emitir sua luz; Reao de luz lenta, gradual; Depende do pH; Quando est conjugada a emisso de luz reduzida.

Peroxidase
P P P-iodofenol-luminol perxido

Perxido de Hidrognio
Oxidao

Luminol Retorno ao estado basal Radical Luminol Endoperxido


Decomposio

Dinio 3-aminoftalato
eletronicamente excitado

Luz emitida

ster de Acridina
Anis cclicos em equilbrio com base neutra; Aumento do pH seguido de equilbrio emite fton de luz; Vantagens:
No requer um catalisador; Baixas interferncias de fundo; Muito estvel, grande vida mdia; Alto rendimento - linear; Tempo de reao rpido - fcil de medir o relmpago - flash; A conjugao no limita o rendimento; Alta sensibilidade

N + CO2 O + LUZ

Mecanismo Imunoensaio quimioluminescente com ster de acridina

ster de Acridina

Perxido-cido agente oxidante Hidrxido de sodio altera o pH para que ocorra a reao de oxidao

ster de Acridina

N + CO2 O + LUZ

Vantagem do ster de Acridina Estvel com vida mdia podendo chegar a anos Sem interferncia de contagens de fundo; No requer catalisador Tempo de reao rpido adequado para sua medio (flash) Quando conjugada a elementos proticos a emisso de luz no reduzida. Sensibilidade pode chegar a 10-15 Moles (>RIE)

Magic Lite
Reativos para a emisso de luz (flash) Reativo 1: Soluo cida de perxido Reativo oxidante (age no ster de acridina) pH cido Reativo 2: Soluo de Hidrxido de sdio Aumento do pH, reao (emisso imediata do flash de luz)

CPS

Segundos

Ensaio Imunoquimioluminomrico

Anticorpo (limalha de ferro)

Antgeno fase slida

Anticorpos marcados com ster de acridina

Tubo de acrlico com reao

Colocar em esteira imantada

Fazer deteco de luz

Instrumentos que detectam luz:


Espectrofotmetro; Fluormetro Luminmetro

Luminmetro:

Detector de flash; Tubo fotomultiplicador que transforma a luz em sinal 2 Bombas de aspirao que injetam os reativos (oxidao e Alcalinizao) Mede somente luz emitida da amostra; Menos interferncia que o fluormetro; Muito sensvel

Esquema do Luminmetro

Detectores de luz Fotomultiplicador

Reativo 1 Bomba Reativo 2 Bomba

Deteco

sensibilidade

Estabilidade

concentrao

RIE QL EIA

Direta Direta Indireta

alta (+) alta moderada

ruim MB boa

pico fento nano