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NUTRIO MINERAL DE PLANTAS

INTRODUO PARTE I - A AQUISIO DE NUTRIENTES Captulo 1 Elementos Essenciais Captulo 2 Razes Captulo 3 Micorrzas Captulo 4 Solues Nutritivas Captulo 5 Absoro de Nutrientes Captulo 6 Fixao Biolgica de N2 Captulo 7 Efeitos Fisiolgicos de Substncias Hmicas Captulo 8 Efeitos Fisiolgicos do xido Ntrico PARTE II - OS MACRONUTRIENTES Captulo 9 Nitrognio Captulo 10 Potssio Captulo 11 Fsforo Captulo 12 Clcio, Magnsio e Enxofre PARTE III - OS MICRONUTRIENTES Captulo 13 Micronutrientes PARTE IV - OS ELEMENTOS BENFICOS Captulo 14 Silcio, Sdio e Cobalto PARTE V - OS ELEMENTOS TXICOS Captulo 15 Alumnio Captulo 16 Metais Pesados

CAPTULO 1 ELEMENTOS ESSENCIAIS E BENFICOS S PLANTAS SUPEIRORES Antonio Roque Dechen(1);Gilmar Ribeiro Nachtigall(2)
(1) (2)

Professor do Departamento de Solos e Nutrio de Plantas ESALQ/USP C. Postal 9, 13418-900, Piracicaba, SP. ardechen@esalq.usp.br. Eng. Agr. Pesquisador da Embrapa Uva e Vinho, C. Postal 130, 95700-000, Bento Gonalves, RS. gilmar@cnpuv.embrapa.br.
SUMRIO

1 2 3

INTRODUO............................................................................................................................................. 2 CRITRIOS DE ESSENCIALIDADE ......................................................................................................... 3 REFERNCIA BIBLIOGRFICA............................................................................................................... 7

INTRODUO

O uso de tcnicas de cultivos hidropnicos com solues de composio qumica bem definida e a possibilidade de obteno de compostos qumicos de alto grau de pureza foram fatores que contriburam muito para os avanos nas pesquisas em nutrio mineral de plantas, j que possibilitaram o crescimento normal das plantas e permitiram um controle mais preciso no fornecimento de nutrientes s razes. Revendo a histria da nutrio mineral de plantas, provavelmente Woodward em 1699, realizou os primeiros experimentos em cultivo de plantas em meio lquido sem o uso de substratos slidos. Em 1804, Saussure realizou uma das primeiras tentativas para analisar os fatores envolvidos no cultivo de plantas em meios nutritivos, estabelecendo a necessidade de fornecer nitrato soluo destes cultivos. No sculo XIX foram realizadas intensas pesquisas envolvendo solues nutritivas e o crescimento de plantas. Pesquisadores como Sachs, Boussingault e Knop, realizaram experimentos que ajudaram a determinar que certos elementos eram importantes para o crescimento das plantas. O alemo Justus von Liebig compilou em seus livros e cartas publicadas entre 1840 e 1855, informaes da poca quanto a importncia dos elementos minerais para as plantas, referindo-se que os elementos minerais essenciais para as plantas eram: nitrognio (N), fsforo (P), potssio (K), clcio (Ca), magnsio (Mg), enxofre (S), silcio (Si), sdio (Na) e ferro (Fe), todos retirados do solo, alm dos elementos essenciais carbono (C), hidrognio (H) e oxignio (O), retirados da gua e do ar. Knop, em 1865, publicou os resultados de seu experimento envolvendo o efeito da composio de uma soluo nutritiva sobre o crescimento das plantas, bem como props uma frmula de uma soluo nutritiva simples, baseada em relaes moleculares, a qual foi o

ponto de partida para modificaes posteriores por outros autores (Ploeg et al., 1999; Furlani, 2004; Epstein & Bloom, 2005). 2 CRITRIOS DE ESSENCIALIDADE

Em termos mdios, o protoplasma de uma planta contm 85 a 90% de gua. O contedo de gua nas razes, expresso em peso fresco, varia de 71 a 93%, dos ramos de 48 a 94%, das folhas de 77 a 98% e dos frutos entre 84 e 94%. A presena de elementos qumicos nas cinzas de uma planta no um indicador das necessidades quantitativas e qualitativas dos diferentes elementos qumicos para uma planta fotoautotrfica, como demonstraram Arnon & Stout (1939), utilizando cultivos hidropnicos. Estes autores estabeleceram trs critrios que devem sem atendidos para que um elemento possa ser considerado como essencial: Critrio 1: Um elemento essencial se a sua deficincia impede que a planta complete o seu ciclo vital. Critrio 2: Para que um elemento seja essencial, este no pode ser substitudo por outro elemento com propriedades similares. Por exemplo: O sdio (Na) apresenta propriedades semelhantes ao potssio (K), contudo no pode substituir o potssio completamente. Critrio 3: O ltimo critrio que deve ser cumprido que o elemento deve participar diretamente no metabolismo da planta e que seu benefcio no esteja somente relacionado ao fato de melhorar as caractersticas do solo, melhorando o crescimento da microflora ou algum efeito similar. A presena de um elemento em altas concentraes em uma planta no um indicador seguro de sua essencialidade, j que as plantas apresentam uma capacidade de absoro seletiva limitada, de modo que podem absorver pelas razes elementos minerais no essenciais e/ou mesmo txicos. Assim, mesmo que um elemento possibilite melhorar o crescimento ou

um processo fundamental de uma planta, no se considera como essencial se no atender os trs critrios da essencialidade. Todos os 17 elementos apresentados na Tabela 1 cumprem estas exigncias e devem ser fornecidos s plantas para que estas germinem, cresam, floresam e produzam sementes. Tabela 1. Relao dos elementos essenciais s plantas superiores, com as concentraes mdias na matria seca da parte area de plantas e os respectivos autores que demonstraram a sua essencialidade e o ano em que ocorreu a descoberta. Elemento Concentrao na massa seca Demonstrao da Essencialidade Saussure Saussure Saussure Saussure Sachs & Knop Sachs & Knop Ville Sachs & Knop Sachs & Knop Broyer et al. Maz, McHargue Warington Sommer & Lipman Sachs & Knop Lipman & McKinney Brown et al. Arnon & Stout Ano 1804 1804 1804 1804 1860, 1865 1860, 1865 1860 1860, 1865 1865 1954 1915, 1922 1923 1926 1860, 1865 1931 1987 1938

Carbono (C) 450 g kg-1 Oxignio (O) 450 g kg-1 Hidrognio (H) 60 g kg-1 Nitrognio (N) 15 g kg-1 Potssio (K) 10 g kg-1 Clcio (Ca) 5 g kg-1 Fsforo (P) 2 g kg-1 Magnsio (Mg) 2 g kg-1 Enxofre (S) 1 g kg-1 Cloro (Cl) 100 mg kg-1 Mangans (Mn) 50 mg kg-1 Boro (B) 20 mg kg-1 Zinco (Zn) 20 mg kg-1 Ferro (Fe) 10 mg kg-1 Cobre (Cu) 6 mg kg-1 Nquel (Ni) 3 mg kg-1 Molibdnio (Mo) 0,1 mg kg-1 Fonte: Malavolta (1980); Marschner (1995).

Alguns elementos so classificados como benficos para algumas plantas, como o sdio (Na), selnio (Se), silcio (Si) e cobalto (Co). Por exemplo, existem algumas espcies de plantas de mangue que acumulam Na, j algumas plantas de deserto como Atriplex vesicaria e Halogeton glomeratus que requerem sdio para o seu desenvolvimento, enquanto para a Amaranthus tricolor (espcie C4) o Na essencial quando em condies de baixas

concentraes de CO2; existem plantas como Astragalus, Stanleya e Lecythis que crescem em solos com altas concentraes de Se, constituindo-se em plantas acumuladoras deste elemento. Tem sido proposto que os silicatos presentes em folhas e inflorescncias de gramneas podem impedir ou diminuir o ataque por animais e insetos. O Co essencial e necessrio para a fixao do nitrognio (N) por bactrias presentes nos ndulos das razes de leguminosas, bem como para bactrias de vida livre que fixam N. Desta forma, os elementos requeridos pelas plantas podem ser classificados como essenciais e benficos, contudo, esta listagem atual pode ser ampliada, j que com o avano das tcnicas analticas, outros elementos exigidos em quantidades mnimas podero ser considerados essenciais ou benficos s plantas. O contedo mineral dos tecidos vegetais varivel, dependendo do tipo de planta, das condies climticas existentes durante o perodo de crescimento, da composio qumica do meio e da idade do tecido entre outros. Por exemplo, uma folha madura provavelmente contm uma concentrao de nutrientes maior do que uma folha muito jovem. Por outro lado, uma folha madura pode ter uma concentrao de nutrientes maior do que uma folha velha, devido ao processo de perda de minerais solveis em gua, ao ser lavado pela gua de chuva ou mediante mecanismos de translocao para folhas jovens. Os elementos minerais essenciais so denominados nutrientes minerais e so classificados, conforme as quantidades exigidas pelas plantas em: macronutrientes que constituem aproximadamente o 99,5% da massa seca e em micronutrientes, que constituem cerca do 0,03%. Desta forma, so considerados macronutrientes os nutrientes C, H, O, N, P, K, Ca, Mg e S e como micronutrientes os nutrientes B, Cl, Cu, Fe, Mn, Mo, Ni e Zn. Esta classificao utilizada sob o ponto de vista da nutrio mineral de plantas e da fertilidade do solo.

Segundo Mengel & Kirkby (2001), sob o ponto de vista fisiolgico difcil justificar a classificao dos elementos essenciais s plantas segundo a classificao de macro e micronutrientes, dependente da concentrao do nutriente nos tecidos da planta. Segundo estes autores, a classificao dos elementos essenciais s plantas seguindo um critrio que leve em considerao os processos bioqumicos e as funes fisiolgicas mais apropriada, e estabeleceram uma classificao dos nutrientes em quatro grupos segundo estas caractersticas (Tabela 2). Tabela 2. Classificao dos elementos essenciais s plantas Nutriente 1 Grupo C, H, O, N, S Absoro Na forma de CO2, HCO3H2O, O2, NO3-, NH4+, N2, SO42-,SO2, na forma de ons da soluo do solo, de gases e da atmosfera. Funes Bioqumica Maior constituinte de compostos orgnicos. Elementos essenciais de grupos atmicos que so envolvidos em processos enzimticos. Assimilao por reaes de oxidao-reduo.

2 Grupo P, B

Na forma fosfatos, cido Esterificao com grupos alcolicos em brico ou borato, plantas. Os esteres de fosfato esto absorvidos da soluo do envolvidos em reaes com transferncia de solo. energia.

Na forma de ons da soluo Funes no especficas, estabelecendo 3 Grupo potencial osmtico. Reaes mais K, Mg, Ca, do solo. Mn, Cl especficas nas qual o on proporciona um melhor arranjo em enzimas proticas (ativao de enzima). Balanceamento inico. Controlando a permeabilidade de membrana e o potencial eltrico. Na forma de ons ou Presente predominantemente em formas 4 Grupo Fe, Cu, Zn, quelatos da soluo do solo. quelatadas incorporadas em grupos prostticos. Habilita o transporte de eltron Mo atravs da mudana de valncia. Fonte: Mengel & Kirkby (2001).

REFERNCIA BIBLIOGRFICA

ARNON, D.I.; STOUT, P.R. 1939. The essentiality of certain elements in minute quantity for plants with special reference to copper. Plant Physiology, 14:371-375.

EPSTEIN, E.; BLOOM, A.J. 2005. Mineral nutrition of plants: Principles and perspectives. Sinauer, Massachusetts. 400p.

FURLANI, A.M.C. 2004. Nutrio mineral. In: Kerbauy, G.B. Fisiologia vegetal. Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro. pp.40-75.

MALAVOLTA, E. 1980. Elementos de nutrio mineral de plantas. Ceres, So Paulo. 254p.

MARSCHNER, H. 1995. Mineral nutrition of higher plants. 2th ed. Academic Press, London. 889p.

MENGEL, K.; KIRKBY, E.A. 2001. Principles of plant nutrition. 5. ed. Kluwer Academic, Dordrecht. 849p.

PLOEG, R.R.; BHM, M.; KIRKHAM, M.B. 1999. History of soil science. On the origin of the theory of mineral nutrition of plants and the law of the minimum. Soil Science Society of American Journal, 63:1055-1062.

CAPTULO 2 O SISTEMA RADICULAR E SUAS INTERAES COM O AMBIENTE EDFICO

Everaldo Zonta1; Felipe da Costa Brasil2; Silvia Regina Goi3; Maria Mercedes Teixeira da Rosa4 1 Prof. Dr. Departamento de Solos UFRRJ ezonta@ufrrj.br 2 - Prof. da Universidade Severino Sombra, Vassouras, RJ. 3 - Prof. Dr. Departamento de Silvicultura UFRRJ 4 - Prof. Dr. Departamento de Botnica UFRRJ

1. INTRODUO Durantes muitos anos (at meados do sculo passado), as razes foram consideradas como a metade oculta dos vegetais (Waisel, et al, 2002), com uma significativa escassez de resultados de pesquisa sobre este tema em todo o mundo. As razes para esta carncia de dados so historicamente explicveis pelas dificuldades metodolgicas (Van Noordwijk, 1993), a prpria inacessibilidade ao sistema radicular como objeto de experimentao, sua complexidade tridimensional e sua marcada variabilidade espacial e temporal (Van Noordwijk, 1993). Hoje existe consenso da importncia desses estudos com observaes in situ no campo, para o manejo das lavouras, que quando associado aos fatores edafoclmaticos so fundamentais para a otimizao das prticas de adubaes e aplicaes de pesticidas de solo, alm das demais como, tratos culturais, densidade de plantio, irrigao, cultivos intercalares e na arborizao urbana. Os estudos das razes so ainda fundamentais para o entendimento das relaes de absoro de gua e

nutrientes, necessrios aos avanos das pesquisas bsicas que nortearo os estudos aplicados. Neste captulo, sero apresentados de forma sucinta os conhecimentos acumulados sobre sistemas radiculares, tanto bsicos como prticos, obtidos nas ultimas dcadas, de estudos sobre o assunto. 2. Origem e funes das razes Filogenticamente, as razes so rgos recentes, cujo aparecimento data da fixao dos vegetais na terra, da diferenciao do sistema vascular e novas rotas metablicas conducentes sntese de substncias fenlicas e ligninas (Chriqui et al, 1996). Os ancestrais mais antigos conhecidos de plantas vasculares pertencem ao gnero Rhynia, que existiram durante o perodo Siluriano e Devoniano (h cerca de 354 a 435 milhes de anos). Eram plantas aquticas sem sementes, no havendo diferenciao morfolgica de suas partes (raiz, caule e folha), constitudas unicamente de um eixo com ramificaes dicotmicas, possuindo, no entanto, estmatos e um sistema fotossinttico rudimentar. muito provvel que as razes tenham surgido ao longo da evoluo, a partir da parte subterrnea do eixo da Rhynia, ou de uma subespcie um pouco mais evoluda, no final do perodo Devoniano ou no incio do perodo Carbonfero da Era Paleozica. Inicialmente, este sistema radicular pouco definido morfologicamente, tinha como funo a fixao da planta no seu ambiente e substrato, visto que a absoro de gua e nutrientes era primordialmente processada pela parte area, j que estas viviam em meio aquoso (Raven et al, 1996). Especificamente, as razes, como rgos distintos da parte area, evoluram nas esporfitas, quando da maior ocupao do ambiente terrestre, onde, estruturas semelhantes a razes penetravam a quase um metro dentro do substrato, aumentando o

volume de material mineral sujeito intemperizao, pelo aumento do nvel de CO2 gerado pela respirao das plantas e microrganismos em materiais com contacto restrito com a atmosfera. Estruturas mais refinadas envolvidas na absoro de nutrientes de baixa difuso no solo evoluram a pelo menos 400 milhes de anos atrs, como as micorrizas arbusculares (capitulo 3 deste volume) ou plos radiculares. (Raven et al, 1996). Com essa evoluo, o sistema radicular, subterrneo e heterotrfico, passou a desempenhar funes mais complexas, como a fixao das plantas e a absoro e conduo de gua e nutrientes do meio externo at o caule. Funes estas, primordiais para o desenvolvimento vegetal e indiscutivelmente necessrias para a sobrevivncia de toda e qualquer espcie (Raven & Edwards, 2001). Particularmente, em algumas espcies, alm das funes primrias de sustentao e absoro de gua e nutrientes, houve evolutivamente, a necessidade das razes cumprirem outras funes, em parte moduladas pelo ambiente a que estavam submetidas, tais como: a) dreno final no armazenamento de substncias de reserva, b) propagao e disperso da espcie, c) nicho ecolgico para simbiontes e organismos livres associados rizosfera, d) produo de metablitos secundrios, e) aerao (oxidao) da rizosfera, e, f) sntese de reguladores de crescimento (Raven et al, 1996). Ainda, em modelos singulares de sistemas radiculares (como em orqudeas) os sistemas radiculares podem ser areos e fotossintetizantes (Peres & Kerbauy, 2000). Independentemente das caractersticas especficas, o primrdio do sistema radicular em plantas vasculares o embrio (esporfito jovem), formado por um eixo caulinar (hipoctilo-epictilo), uma ou duas folhas embrionrias (cotildones) e por uma raiz embrionria (radcula). Com a germinao da semente, a radcula sofre divises e alongamentos celulares por um perodo de tempo e espao variado e com

tendncia catica at o seu desenvolvimento total (Figura 1), e originando razes laterais de primeira, segunda, terceira e demais ordens.

Figura 1. Desenvolvimento de uma eudicotilednea (sombreiro), mostrando a raiz principal e razes laterais de primeira e segunda ordem. Desenho de Maria Mercedes Teixeira da Rosa, Depto de Botnica IB UFRRJ (2005). 3. Anatomia Radicular A unidade bsica e estrutural da anatomia a clula, que se caracteriza pela presena de parede celular envolvente, que mantm sua forma independente da clula estar viva ou no. Agrupadas, estas estruturas compem todo o vegetal desde suas razes at o plen. A organizao particular e especializada de parte destas clulas determina a anatomia radicular das plantas, conforme mostra Figura 2.

Figura 2. Estrutura anatomica da raiz principal de Ravenala madagascariensis, na regio de ramificao. Seco transversal. Desenho de Maria Mercedes Teixeira da Rosa, Depto de Botnica IB UFRRJ (2005). 3.1. pice da raiz O pice da raiz (Figura 3a) em crescimento protegida pela coifa que consiste de camadas de clulas concntricas que envolvem o meristema apical onde novas clulas so produzidas. freqentemente coberta por uma grossa camada de mucilagem (Figura 3b), usualmente considerada um lubrificante, para ajudar o pice a atravessar o solo. A mucilagem tambm protege contra a dessecao, especialmente se contm arabinogalactanas que se associam a partculas do solo e ajudam a garantir a continuidade do filme de gua entre o solo e a raiz (Lynch, 1990). A mucilagem tambm tem a funo de proteo contra substncias txicas do solo e funciona como superfcie de absoro, afetando a troca inica, dissolvendo e provavelmente formando quelatos com certos nutrientes. medida que novas clulas so produzidas, as clulas da periferia da ponta da raiz so destacadas (Figura 3b). Quando a raiz para de crescer, o

pice da raiz pode ser protegido por suberizao das suas clulas externas. Essa metacutinizao, que uma modificao das pontas das razes dormentes por suberizao de uma ou mais camadas de clulas da coifa (Romberger, 1963), no produzida em espcies anuais, mas produzida em espcies perenes como as rvores, presumivelmente como uma forma de proteo contra fatores adversos do solo (Brundrett & Kendrick, 1990).

Figura 3. a) pice da raiz de cebola. No detalhe, clulas em diferentes fases de diviso. Depto de Botnica IB UFRRJ (2005); b) Clulas da periferia radicular destacadas e mucigel em raiz de plntula de cana-de-acar. Silvia Regina Goi Departamento de Cincias Ambientais IF - UFRRJ (2005). 3.2. Epiderme A epiderme, chamada por alguns autores de rizoderme, presente na estrutura primria, funciona como interface entre a planta e o solo. A parede celular de clulas da epiderme podem ser suberizadas, lignificadas ou relativamente no modificadas. Clulas da epiderme de razes novas secretam mucilagem.

3.3 Crtex O crtex, regio compreendida entra a epiderme e o cilindro central, freqentemente composto por clulas do parnquima. O crtex pode se diferenciar em aernquima (Figura 2), com espaos intercelulares representados por grandes lacunas. O aernquima das razes considerado como um tecido que serve ao transporte de gases e como reservatrio de oxignio necessrio respirao dos tecidos principalmente em solos alagados. As clulas do crtex so altamente vacuoladas, seus plastdeos usualmente no possuem clorofila, mas acumulam amido. A camada interna do crtex diferenciada em endoderme, e uma ou mais nas camadas externas, podem desenvolver uma exoderme. 3.4 Exoderme A camada de clulas abaixo da epiderme chamada exoderme. a camada mais externa do crtex, podendo, apresentar vrios estratos celulares, cujas paredes poder ser suberizadas e/ou lignificadas (Raven et al, 1996). 3.5 Endoderme Na regio de absoro das razes, as clulas da endoderme contm suberina em uma regio que se estende completamente ao redor das clulas, nas paredes radiais e transversais, formando as estrias de Caspary. Nas razes que no apresentam crescimento secundrio, como nas monocotiledneas, onde portanto o crtex retido, verifica-se um depsito adicional de camadas alternadas de suberina e cera internamente s paredes das clulas endodrmicas, formando-se o chamado espessamento em U (Figura 4).

Espessamento em U

Estria de Caspary

Figura 4. Clulas da endoderme com espessamento em U e estria de Caspary de raiz de Heliconia sp em diferentes fases de desenvolvimento. Depto de Botnica IB UFRRJ (2005). 3.6 Tecido vascular e Cilindro central O cilindro central compreende os feixes vasculares e uma ou mais camadas de clulas no vasculares denominadas de periciclo. O xilema freqentemente forma uma slida medula com projees cnicas dispostas radialmente no periciclo. Feixes de floema se alternam com os cones do xilema. Se o xilema no se diferencia no centro da raiz, um cerne, consistindo de parnquima ou esclernquima aparece (encontrado em muitas monocotiledneas). 4. Morfologia Radicular A morfologia radicular refere-se s caractersticas intrnsecas externas do sistema, sendo fundamental tambm na identificao e classificao das espcies. Em geral morfologicamente que se pode visualizar as principais alteraes no sistema

devido a efeitos biticos e/ou abiticos (McCully, 1999). Essas alteraes so devidas s caractersticas de elasticidade e plasticidade intrnseca dessa parte do vegetal. A maioria das plantas ramifica suas razes a partir do eixo principal em eixos laterais de ordens superiores. Essas diferentes ordens de razes podem variar suas caractersticas, com relao espessura, taxa de crescimento, capacidade de crescimento secundrio, durao, estruturas e adaptaes. Essas variaes por sua vez, vo influenciar a capacidade de obteno de gua, nutrientes, sobrevivncia a condies adversas e a possibilidade de servir de habitat para microrganismos da rizosfera. A radcula a raiz inicial da planta e est geralmente presente no embrio dentro da semente. Ela forma a raiz principal da plntula. Em certas espcies o embrio to pequeno e imaturo, como nas micro-sementes de orqudeas, que a radcula no est presente. Em gimnospermas e dicotiledneas, a raiz principal e suas ramificaes constituem o sistema radicular. Nas monocotiledneas, a primeira raiz comumente tem um curto perodo de vida e o sistema radicular formado por razes adventcias (Figura 5) que emergem da parte area, freqentemente em conexo com as gemas axilares (Esa, 1977). Um esquema da morfologia externa de uma raiz apresentado na figura 6.

Figura 5. Razes adventcias de Pandanus sp. No detalhe, a presena de espinhos. Fotografia de Lucia Helena Cunha dos Anjos Depto de Solos IA UFRRJ (2003).

Figura 6. Morfologia de eixo radicular principal ou de raiz lateral. Modificado de Raven et al (1996), por Orlando Carlos Huertas Tavares CAPGA-CS Depto de Solos IA - UFRRJ (2006). 4.1 Plos Radiculares A epiderme pode apresentar projees que so os plos radiculares (Figura 7), podendo ser curtos, longos, raros ou densos. Os plos radiculares so estruturas cilndricas e tubulares derivadas de clulas epidrmicas da raiz chamadas tricoblastos (Mller & Schmidt, 2004).

Figura 7. Plos radiculares de Ravenala madagascariensis. A e B) Tecido submetido a diferentes corantes; C) Detalhe do Plo (unicelular). Departamento de Botnica IB UFRRJ (2005). Os plos radiculares so importantes no processo de aquisio de nutrientes, pois aumentam a superfcie de absoro radicular. Resultados obtidos por Itoh & Barber (1983) mostram a contribuio dos plos radiculares no aumento da superfcie da raiz de alface, tomate e Salsola kali L.. A distribuio, densidade e comprimento dos plos radiculares, pode variar de acordo com fatores genticos e ambientais. Experimentos com tomate, canola e espinafre mostraram que a formao do plo fortemente influenciada pelo suprimento de nitrato e fosfato (Foehse & Jungk, 1983). O etileno parece estar envolvido na regulao do desenvolvimento dos plos radiculares de Arabidopsis thaliana L. crescida em baixa concentrao de fsforo; a inibio do

etileno sob deficincia de fsforo resultou em reduo do crescimento da raiz, diminuio do nmero de clulas formadoras de plos radiculares e reduo no comprimento dos plos (Zhang et al 2003). Essas mudanas morfolgicas so sinergsticas aquisio de fsforo, aumento da capacidade e competitividade da planta quando este elemento o fator limitante (Bates & Lynch, 2000; Bates & Lynch, 2001). O crescimento dos plos radiculares regulado por vrios genes, como RHD2, RHD3, RHD4 e T!P! (Aeschbacher, 1994). Esses genes podem codificar produtos que afetam o crescimento da ponta do plo, tal como o fluxo de clcio. Antes da emergncia do plo radicular, a maioria dos feixes de microfilamentos nos tricoblastos so orientados longitudinalmente ao eixo da raiz; durante o desenvolvimento do plo, eles mantm essa orientao. O primeiro passo a formao de uma protuberncia no tricoblasto. Os microfilamentos ficam nesta protuberncia com a mesma orientao das clulas epidrmicas. As protuberncias se desenvolvem em plos radiculares e inicialmente apresentam dimetro pequeno e tm feixes finos de microfilamentos no citoplasma, mas que no chegam ponta do plo. No estgio intermedirio de crescimento, o vacolo principal fica encostado na ponta e os microfilamentos podem se estender at a ponta, mas no so to finos como no incio do crescimento. O plo totalmente crescido possui um grande vacolo no centro da clula e o citoplasma localizado perifericamente. Os microfilamentos ficam no citoplasma e se dirigem at a ponta do plo, contornando-a (Miller et al 1999). Outras modificaes na morfologia de plos radiculares tem sido mais intensivamente estudadas em plantas inoculadas com Rhizobium (Ervin & Hubbell, 1985; Crdenas et al 2000). A especificidade das interaes simbiticas entre Rhizobium e as leguminosas hospedeiras governada por um nmero de fatores que atuam em vrios estgios. Fatores Nod so os principais determinantes da especificidade para

vrias espcies de Rhizobium (Dnairi et al. 1996). Fatores Nod so lipo-quitina oligopolissacardeos que aplicados em razes de leguminosas podem induzir vrias respostas, tais como deformao do plo radicular e diviso de clulas corticais

(Walker & Downie, 2000). A estrutura bsica de fatores Nod permite ao Rhizobium leguminosarum bv. viciae entrar no plo radicular e os genes nod nodO ou nodE promoveram o desenvolvimento subseqente do cordo de infeco em Vicia hirsuta (Walker & Downie, 2000). Em plos radiculares, a presena de feixes finos de microfilamentos subapicais esto correlacionados com o crescimento da ponta do plo. Aps a aplicao de fatores Nod especficos de Rhizobium, o nmero de feixes de microfilamentos subapicais aumentou em todos os estgios de desenvolvimento do plo radicular de Vicia sativa, mostrando de uma maneira quantitativa, como a aplicao de Fatores Nod pode mudar a configurao dos microfilamentos do citoesqueleto. As mudanas so muito rpidas para terem sido causadas pela transcrio de um novo gene e para sntese proteica de novo. Isso implica em que os fatores Nod lipochito-oligossacardeos (LCO) acionam um sinal de transduo que termina produzindo molculas que influenciam o citoesqueleto de microfilamentos. Aps a percepo da sinalizao do LCO, ocorre um influxo de ons de clcio dentro dos plos radiculares de Medicago sativa (Felle et al. 1998). Vrios trabalhos tem demonstrado o efeito da inoculao de bactrias diazotrficas endofticas, no s em gramneas mas tambm em outras plantas cultivadas, causando modificaes nos plos radiculares. Azospirillum pode produzir in vitro os fitohormnios AIA, giberelina e citocinina A aplicao de giberelina teve efeito similar inoculao de Azospirillum lipoferum, aumentando a densidade dos plos radiculares (Bashan & Holguin, 1997). Estirpes de Azospirillum brasilense e A.

lipoferum aumentaram a formao de plos radiculares e produziram um nmero maior de razes laterais em trigo, tomate e pimento (Bashan, 1998). O Azospirillum

promoveu um efeito especfico na deformao do plo radicular de trigo, semelhante ao efeito causado por Rhizobium na deformao de plos radiculares de leguminosas (Patriquin et al 1983). Considerando o efeito da presena de bactrias no crescimento dos plos radiculares, estas poderiam modificar a expresso dos genes que codificam o crescimento dos plos em funo da mudanas no nvel de fitohormnios (Jain & Patriquin, 1985) ou mesmo em funo de mudanas na absoro de nutrientes minerais (Lin et al, 1983). Foram observadas variaes na distribuio e tamanho dos plos radiculares nas diferentes zonas de razes de plantas cana-de-acar inoculadas com bactrias diazotrficas; plos radiculares de tamanho maior foram obtidos com a inoculao da estirpe Mex 77 de Azospirillum lipoferum; a inoculao com a estirpe PAL 5 de Gluconacetobacter diazotrophicus promoveram um aumento da densidade de plos radiculares na zona proximal da raiz (Baldani et al., 1999). Em relao forma do plo, foram observados plos radiculares bifurcados (em forma de garfo) em plntulas de cana-de-acar inoculadas com Burkholderia brasilensis. Plos radiculares helicoidais foram observados em plntulas de cana-deacar inoculadas com a estirpe PAL-5 de Acetobacter diazotrophicus (Goi et al 1998). 4.2 Formao de razes laterais A formao das razes laterais um processo multifsico que inclui pelo menos a iniciao, emergncia dos primrdios da raiz e ativao dos meristemas das razes laterais. Estas razes se originam no periciclo, onde clulas quiescentes individuais so estimuladas a se diferenciar e proliferar para formar primrdios de razes laterais (Figura 8). Os primrdios crescem via diviso e expanso celular. A emergncia

dos primrdios a partir das razes parentais ocorre primariamente por expanso celular. Imediatamente aps a emergncia o primrdio fica ativado para formar um sistema meristemtico funcional da raiz lateral, que direciona o crescimento deste estgio em diante. Vrios trabalhos indicam que a auxina seria necessria para a iniciao e subseqente crescimento das razes laterais (Lloret & Pulgarin, 1992; Reed et a, 1998). A aplicao exgena ou aumento da sntese endgena de auxina resulta em aumento significativo do nmero de razes laterais (Boerjan et al. 1995). A citocinina juntamente com a auxina teria uma importante atuao na morfognese da planta, influenciando a formao da raiz e da parte area e seu crescimento relativo. Segundo Wightman et al. (1980) as citocininas so formadas na ponta da raiz e interagem com a auxina na regulao da formao das razes laterais, tendo ao inibitria em relao emergncia das razes laterais. Resultados recentes mostram que as citocininas (cinetina e transzeatina) tiveram efeito inibitrio na iniciao da raiz lateral e efeito estimulatrio no alongamento da raiz lateral em arroz (Debi et al, 2005). Da mesma forma, em Lotus japonicum a expresso do gene ARR5 (que controla a expresso de citocinina em Arabidopsis) no foi observado nas clulas em diviso nos primrdios das razes laterais, mas foi observada alta expresso nas etapas seguintes da formao da raiz lateral (Lohar et al. 2004); estes autores observaram tambm a expresso do ARR5 nos plos radiculares deformados e tambm nos primrdios de ndulos, em resposta inoculao com rizobio. Em plntulas de Pinus pinea a formao de razes laterais estaria controlada por fatores de estmulo localizados na parte area (Atzmon et al 1994)

Traquedes Raiz Lateral Raiz Lateral C Endoderme

Xilema

Figura 8. Emisso das razes laterais de Ravenala madagascariensis. a) Corte transversal; b) Corte longitudinal, evidenciando os traquedeos, que so clulas relativamente alongadas e com a parede primria e secundria lignificada, com funo de conduo de solutos e de sustentao; c) Detalhes do xilema primrio da raiz lateral e do rompimento das clulas da endoderme. Depto de Botnica IB UFRRJ, 2005. 4.3 Formao de razes adventcias Comumente, as razes adventcias se formam a partir do caule, originadas da diviso celular do crtex ou menos freqentemente, a partir de gemas axilares

escondidas na casca. Geralmente tem origem endgena e surgem prximo aos tecidos vasculares. Em caules novos de eudicotiledneas e gimnospermas, as razes adventcias comumente surgem no parnquima interfascicular e em caules velhos, no raio hipottico dos tecidos vasculares, prximo ao cmbio. Portanto a nova raiz aparece prxima ao xilema e floema. Quando as razes adventcias so formadas em explantes, elas provavelmente se originam no tecido que se localiza na base do explante. Os primrdios das razes adventcias so iniciados por diviso de clulas do parnquima, lembrando as divises que iniciam a formao de razes laterais a partir do periciclo de razes jovens. Antes da emergncia das razes adventcias do caule ou raiz, so diferenciados um meristema apical, uma coifa e o comeo do cilindro vascular e do crtex. Quando os elementos vasculares se diferenciam, a partir das clulas do parnquima, localizadas na extremidade proximal do primrdio, estes passam a fornecer uma conexo com os elementos correspondentes do rgo principal. A formao das razes adventcias tem sido bem estudada em conexo com os reguladores de crescimento. Em explantes, possvel regenerar razes, atravs da aplicao de auxinas, o que aumenta o nmero de razes adventcias (Esa, 1977). Durante a formao das razes adventcias podem ser distinguidos diferentes estgios de desenvolvimento: iniciao, desenvolvimento inicial, crescimento e emergncia do primrdio da raiz. A iniciao da raiz adventcia a partir de clulas diferenciadas de tabaco determinada pela expresso do gene HRGPnt3, induzido antes da diviso celular dos primrdios. O desenvolvimento de primrdios de razes adventcias e razes laterais de Arabidopsis caracterizado pela expresso do gene LRP1, que em razes laterais foi mostrado como desligado antes da emergncia do primrdio. Em arroz inundado o crescimento de razes adventcias induzido pelo

etileno. Quando as plantas so submersas, a concentrao de etileno aumenta (Mtraux & Kende, 1983) e a expresso das ciclinas sugerem que o etileno atua sistematicamente e o primrdio da raiz responde ao etileno no estgio inicial de desenvolvimento (Lorbiecke & Sauter, 1999). Recentemente isolado, o gene que controlaria a iniciao dos primrdios de raiz adventcia em arroz: ARL1 seria um gene responsivo a auxina e etileno. ARL1 estaria envolvido na diferenciao celular mediado pela auxina e promove a diviso inicial nas clulas do periciclo, adjacentes ao cilindro vascular perifrico no caule (Liu et al., 2005). 4.4 Outras razes especializadas So razes especializadas, os pneumatforos, que so razes areas e esponjosas de plantas de mangue, e se constituem em razes respiratrias, que possuem canais de ar (lenticelas), para troca gasosa com a atmosfera e existe uma via interna para distribuio de O2 dentro da raiz, para suprimento das razes submersas. Ainda, as razes adventcias do tipo escora, com espinhos, como as de Pandanus sp, que servem como suporte mecnico planta, seriam tambm uma outra especializao (Figura 5). As razes proteides ou razes em cluster (Figura 9) so adaptaes encontradas em um nmero grande de famlias, incluindo Leguminosae, Betulaceae, Myricaceae, Elegnaceae, Casuarinaceae, Proteaceae e Moraceae (Skene, 2000; Neumann & Martinoia, 2002).

C A

Figura 9. Raizes proteides ou razes em cluster de diferentes espcies. a) Lupinus albus; b) Hakea sp; c) Lupinus sp e d) Imagem obtida por endoscopia de solo. Dimetro do eixo radicular menor ou igual a 0,2 mm (Fotografia de 18 x 13,5 mm). Fontes: a b Nemoy, 2006; c Schimidt, 2006; d Brasil, 2005. Do ponto de vista ecolgico, as razes em cluster, embora ocorram em vrias famlias, pertencem a um nmero limitado de ecotipos. Muitas espcies que possuem essas razes so espcies pioneiras e muitas no se associam com micorrzas ou exibem infeco micorrzica reduzida. Essas razes so consideradas juntamente com as micorrizas e ndulos das leguminosas, as maiores adaptaes para a aquisio de nutrientes. Cada raiz em cluster composta por pequenas razes de desenvolvimento determinado, que surgem do periciclo, opostas ao plo do protoxilema, e do raiz o

formato de escova de lavar mamadeira. A iniciao est ligada a vrios fatores, incluindo deficincia de fosfato. Essas razes combinam adaptao de ramificao da raiz, alterao da rizosfera, desenvolvimento da raiz e absoro de nutrientes em uma nica via. A formao das razes em cluster parece ser induzida pela diminuio da disponibilizao de fsforo e pelo menos em algumas espcies, pela deficincia de ferro (Neumann & Martinoia, 2002). Existem evidncias fortes de que ocorram mudanas metablicas durante o desenvolvimento das razes proteides, contribuindo para um aumento no acmulo de carboxilato no tecido da raiz e finalmente a liberao temporria desses compostos na rizosfera. Durante o estgio de desenvolvimento destas razes, grandes quantidades de carboxilatos, prtons, fosfatases cidas e compostos fenlicos so liberados na rizosfera durante um perodo de 1 a 3 dias. Este padro de desenvolvimento da raiz em cluster associado a um aumento na concentrao de carboxilatos no tecido da raiz e uma troca na acumulao de malato por citrato, antes da exsudao. A liberao temporria de carboxilatos pelas razes em cluster provavelmente mediada por mecanismos de transporte controlado. Em Lupinus albus, estudos com inibidores sugerem o envolvimento de canais inicos para exsudao de citrato acoplados com a concomitante liberao de prtons para manter o balano de cargas (Neumann & Martinoia, 2002). 4.5 Rizosfera e Rizoplano Em termos nutricionais, a interface solo-raiz bastante importante e os eventos que ocorrem na rizosfera, sero referenciados nos prximos captulos. O termo rizosfera foi introduzido por Hiltner em 1904, e a zona de influncia das razes, que vai desde a sua superfcie at uma distncia de 1 a 3 mm. Entretanto, atualmente, outros autores em trabalhos mais recentes, consideram uma distncia de at 5 mm. A sua

extenso varia com o tipo de solo, espcie considerada, idade e muitos outros fatores, mas assume-se que esta se estenda a partir da superfcie da raiz (rizoplano) at poucos milmetros para dentro do solo, ou possivelmente poucos centmetros, em alguns casos especiais (Lynch, 1990). neste volume do meio de crescimento do sistema radicular que se processa uma infinidade de eventos fsico-quimico-biolgicos que podem alterar a morfologia e a dinmica do sistema radicular e a disponibilidade de nutrientes, ao mesmo tempo, que este espao pode ser alterado pelo sistema radicular. 5. Fisiologia das Razes. O sistema radicular como um todo, independente de seu desenvolvimento fsico ou idade, apresenta regies espacialmente mais ou menos ativas, em relao capacidade intrnseca de absorver gua e nutrientes, de exsudarem molculas orgnicas, ou de fazer extruso de prtons. Em relao absoro de gua, nutrientes e outros solutos, faz-se necessrio o entendimento da interface solo/planta, das rotas de absoro e das barreira existentes nos tecidos radiculares, que podem acelerar ou reduzir a velocidade do movimento radial, da superfcie radicular at o cilindro central. 5.1. Rotas de Absoro O movimento da gua, nutrientes e outras substncias a partir da superfcie da raiz - considerando a rizosfera - ao interior das plantas, ocorre em dois espaos distintos denominados de apoplasto e simplasto, at a endoderme (Figura 10). O apoplasto definido como um "continuum" entre as paredes celulares, espaos intercelulares e os vasos xilemticos ao longo de todo o corpo da planta desde o crtex da raiz at os traquedes e elementos de vaso que chegam s folhas. A caracterizao do apoplasto remonta ao botnico Ernst Mnch, que em 1930, distinguiu a planta em dois compartimentos: o morto, que denominou de apoplasto e o vivo, que denominou simplasto. Mnch sugeriu, na poca, que a funo do apoplasto era

exclusivamente o transporte de gua e solutos. Hoje sabemos que este compartimento tem funes mais numerosas, e que os nutrientes simplesmente no apenas atravessam o apoplasto, mas podem ser adsorvidos ou fixados na parede celular, por exemplo, com implicaes diretas na aquisio de nutrientes, alm de poder conferir tolerncia de algumas plantas toxidez por metais (Al, Mn). Este espao pode ser colonizado por microorganismos, que podem contribuir diretamente para a nutrio da planta (Sattelmacher, 2001). De acordo com a compreenso atual, todos os compartimentos alm da plasmalema constituem o apoplasto, incluindo o espao interfibrilar e intermicelar das paredes celulares, o lumem das clulas mortas e os espaos intracelulares do xilema (com gua e gases), sendo as suas bordas externas formadas pela superfcie do rizoplano e da cutcula na parte area (Sattelmacher, 2001). Entretanto, pode existir uma interrupo neste contnuo apoplstico, quando considerada a planta toda, esta interrupo representada pela endoderme, mais especificamente pelas estrias de Caspary, onde uma camada mais ou menos suberizada pode apresentar maior ou menor permeabilidade a gua e solutos.

Figura 10. Rotas para absoro de gua e nutrientes. A partir do crtex at o cilindro central o movimento acontece entre os espaos celulares (rota apoplstica) ou atravs dos plasmodesmos (rota simplastica) ou aquaporinas (para gua). Desenho de Orlando Carlos Huertas Tavares CAPGA-CS Depto de Solos IA - UFRRJ (2006).

Atualmente, considera-se a endoderme, com as estrias de Caspary, uma barreira, porm, no totalmente impermevel, ao movimento radial da gua e ons nos dois sentidos (Pimentel, 2004). RANATHUNGE et al (2005) usando uma nova tcnica de precipitao de sais, estudaram a permeabilidade da parede celular, e, em especial das estrias de Caspary da endoderme, utilizando como modelo de estudo razes jovens de milho e arroz. Os autores concluram que em termos de permeabilidade da estria de caspary para ons no representa uma barreira absoluta. Esses autores verificaram que alguns ons podem eventualmente ultrapassar a barreira da endoderme, mas consideram este fenmeno pouco relevante, do ponto de vista da nutrio da planta. A permeabilidade da barreira endodrmica pode variar em funo das condies e fases do crescimento radicular. Em particular, observaram os autores, que em arroz pode haver um fluxo apoplstico significativo pelas regies onde o surgimento das razes laterais rompe a barreira endodrmica. O simplasto por sua vez considerado como todo o citoplasma e membranas de todas as clulas vivas. Muitas vezes faz-se referncia ao simplasto como uma unidade devido existncia dos plasmodesmos, observados apenas em clulas vegetais, e que so interligaes entre membranas de clulas vizinhas, criando pontes citoplasmticas (Figura 11). Os plasmodesmos, so estruturas tubulares da membrana plasmticas de 40 a 50 nm de dimetro que atravessam a parede celular e conectam os citoplasmas das clulas adjacente (Taiz & Zeiger, 2004), e ocorrem em uma densidade que pode variar de 0,1 a 10,0 por m2 (cerca de 20.000 por cada parede tangencial, ou 5108 unidades/cm2). Anatomicamente, apresentam uma estrutura interna complexa, constituda pelo eixo central, desmotbulo (que um prolongamento do retculo

endoplasmtico), cavidade central e protenas filamentosas, entre outras organelas, sendo que o movimento do on se faz exclusivamente pela cavidade central. O papel do desmotbulo, que envolve o eixo central, ainda incerto quanto ao movimento de solutos e outras substncias, pois no parece existir espao entre essas membranas para tal fim.

Figura 11. Plasmodesmatas. Microfotografia de microscpio eletrnico de transmisso de ndulo radicular de Mimosa caesolpiniaefolia. Silvia Regina Goi Departamento de Cincias Ambientais IF - UFRRJ (2005). 5.2. Absoro de gua.

Para as plantas terrestres, o solo o reservatrio natural de gua, e ela est presente no solo como gua gravitacional, capilar e higroscpica. A gravitacional pouco utilizada, pois drenada rapidamente atravs do macroporos. A higroscpica constitui uma frao que est quimicamente ligada s partculas do solo, formando uma pelcula lquida, e no utilizada pela planta devido a grande tenso de reteno. A frao de gua capilar, retida nos microporos, por sua vez de extrema importncia por representar a fonte direta para a planta.

At superfcie das razes, que representam o acesso para o interior do vegetal, a gua se movimenta por difuso ou por fluxo de massa, e a partir da, flui e penetra pela camada epidrmica. Uma vez na superfcie da raiz, a absoro e/ou movimento da gua pode ocorrer atravs de trs rotas (simplstica, apoplstica ou transmembranar), at atingir o cilindro central onde ascender pela planta para as demais partes do vegetal. Esse deslocamento se d sempre de zonas hipotnicas (menos concentradas) para zonas hipertnicas (mais concentradas), ou seja, de zonas com elevado potencial hdrico para zonas de baixo potencial hdrico. Um efeito tpico, que viabiliza este mecanismo, a prpria absoro ativa de ons (Captulo 5 deste volume), fazendo com que as razes acumulem nutrientes, e outros solutos e elementos em concentraes centenas de vezes superiores ao do meio externo. Este transporte torna a soluo interna ainda mais hipertnica, diminuindo o potencial hdrico e causando mais entrada de gua por osmose. Pela rota apoplstica, da rizoderme at o xilema no cilindro central, passando pela endoderme, onde pode haver dificuldade sua passagem, mas no impedimento, em funo da composio qumica da endoderme, ao seu desenvolvimento e especificidade (mono e eudicotiledneas; Pimentel, 1998). Durante este movimento, por um ou outro mecanismo, pode haver absoro de gua pelas clulas corticais. Pela rota simplstica, a absoro preferencial para as clulas da raiz se d atravs dos plos radiculares, onde a gua se movimenta pelo citoplasma, passando de clula a clula, pelos plasmodesmos at o cilindro central. A rota transcelular (ou simplstica), sendo um movimento clula a clula, atravessa pelo menos duas membranas, via aquaporinas, descobertas na dcada de 90, que so canais seletivos para gua, regulados pelo seu estado de fosforilao, de modo que as clulas podem regular a sua permeabilidade gua ao acrescentando ou removeno grupos fosfato a resduos de

aminocidos especficos. Esta modulao da atividade da aquaporina pode ento alterar a taxa de movimento da gua atravs da membrana (Taiz & Zeiger, 2004). Espacialmente, considerando um nico eixo radicular, a absoro e movimentao da gua tende a ocorrer mais rapidamente atravs das regies que oferecem menor resistncia sua movimentao. Essas regies variam de acordo com a espcie, idade e velocidade de desenvolvimento da raiz. Atualmente, sabe-se que a mxima absoro de gua ocorre na regio de diferenciao celular onde o xilema est bem diferenciado e na qual a suberizao e lignificao ainda no reduziram a permeabilidade das paredes celulares, destacando-se em especial as regies de plos radiculares. Nas regies meristemticas, a absoro de gua bastante limitada, devido principalmente grande resistncia oferecida pelo protoplasma denso e a falta de elementos de conduo nesta regio. Quando considerado o sistema radicular como um todo, sob condies normais de hidratao da planta (e do solo), a absoro de gua feita preferencialmente via simplstica. Com a reduo da gua disponvel, ou aumento da transpirao, o mecanismo apoplstico ativado. Por fim, sob condies de dficit, o transporte transmembrana ativado (aquaporinas). Destes mecanismos, o apoplstico, resulta tambm em maior arraste de solutos da rizosfera, aumentando a zona de depleo (Pimentel, 2004). A velocidade de deslocamento de gua pela via apoplstica pode ser cerca de 60 vezes superior prevista para movimentos citoplasmticos, e, considera-se que este deva ser o percurso preferencial, nos momentos de demanda elevada. 5.3 Absoro de nutrientes A absoro de nutrientes e o seu movimento radial at o cilindro central acontece da mesma forma que o descrito para a gua, exceto para a rota transmembranar. As plantas adquirem numerosos ons e substncias, mesmo

desnecessrias ou txicas, do solo, pelas vias apoplsticas e simplsticas. Estes podem se movimentar at o cilindro central, serem assimilados em tecidos prprios ou ainda ficarem retidos nas cargas da superfcie radicular (CTC radicular). Isso implica inclusive na possibilidade de disperso de substncias potencialmente txicas para os seres vivos, sendo, porm esta capacidade das plantas, proveitosa para a remediao de solos contaminados (Capitulo 15 neste volume). O deslocamento via simplasto por sua vez dependente inicialmente de um mecanismo qualquer (bomba, canal ou transportador; Capitulo 6 neste volume), que permita a sua entrada na clula vegetal, ultrapassando a membrana plasmtica, o que pode acontecer em qualquer parte da raiz, em clulas compreendidas entre o espao fsico da superfcie radicular e o cilindro central, resguardando a variabilidade relativa para cada elemento e espcie vegetal. Este deslocamento, ao contrrio do que se imagina, no totalmente livre, pois estas superfcies radiculares, em geral, apresentam um quantidade relativa de cargas, que podem reduzir ou aumentar a velocidade de deslocamento do on neste espao. Porm, indubitavelmente, a velocidade de movimento neste espao sempre maior que pela rota simplastica. Quando o on de uma forma ou outra cruza a endoderme, tambm pode regressar ao apoplasto, difundindo-se para dentro de um traquedeo ou elemento de vaso no xilema, sendo conduzido at o local especfico de sua absoro, e, para participar ativamente do metabolismo necessita ser reabsorvido (Taiz & Zeiger, 2004). ainda possvel, que alguns elementos, principalmente os no estruturais como o potssio, possam de uma ou outra forma retornar mais facilmente para os espaos intercelulares (apoplasto), aps a reabsoro. Indiscutivelmente, porm, a presena da estria de Caspary permite planta manter uma concentrao inica mais elevada em seus tecidos do que na soluo do solo (Taiz & Zeiger, 2004).

5.4 Zonas e taxas de absoro O termo taxa de absoro de nutrientes, embora usado com conotaes variadas na literatura, tende a englobar as contribuies dos processos associados sua aquisio do solo, que produto da interao entre as propriedades absortivas do sistema radicular, o seu estgio de desenvolvimento (arquitetura e tamanho), e a concentrao do nutriente na soluo do solo e na superfcie radicular (Jungk, 1991; Williams & Yanai, 1996). A taxa de absoro de um dado nutriente pode ser estimada a partir da rea superficial e da cintica de absoro, tal como mostra a equao (Williams & Yanai, 1996): TAn = 2 . .r L.. C ................................. ...............Equao 1

onde TAn a taxa de absoro do nutriente, r o raio radicular, L o comprimento radicular, o poder de absoro radicular (relacionado aos mecanismos de transporte do nutriente a nvel de membrana), e C a concentrao do soluto na superfcie radicular, expressos em dimenses e unidades homogneas. A equao 1 ainda uma representao parcial do processo de aquisio de nutrientes, na medida que no integra efeitos importantes, tais como exsudao radicular ou variaes do pH rizosfrico, induzidas pelo prprio processo de absoro (Fernandes & Rossiello, 1995). Entretanto ela tem sido extensivamente usada em modelos de simulao de absoro, ao explicitar os principais fatores envolvidos (Williams & Yanai, 1996). Por outro lado, a qualquer instante, a taxa de absoro representa o produto da intensidade do influxo do nutriente (ou taxa de absoro por unidade de rea radicular) pelo tamanho do sistema radicular (a sua rea superficial total).

Destaca-se ainda, que esses modelos avaliam o sistema radicular como um todo, mas consideram que apenas a superfcie radicular responsvel pela absoro. Isso leva a uma superestimativa da atividade absortiva das clulas epidrmicas. Essa superestimativa acontece tambm quando se avalia o influxo ou efluxo em plantas de diferentes idades. Neste caso, sabendo-se que as regies mais novas da raiz tem maior capacidade absortiva, pode-se explicar porque um sistema radicular novo tem maior influxo, pois proporcionalmente, existem mais superfcies aptas absoro, do que regies suberizadas. Quando se estuda um eixo unitrio do sistema radicular, seja de uma raiz principal ou de uma lateral, pode-se observar a existncia de um gradiente ativo entre seu pice e a sua base, j que apresentam anatomia e fisiologia semelhantes, variando apenas em magnitude e funo. Sabendo-se que a atividade radicular pode ser medida pela intensidade do efluxo de prtons, o trabalho de Fan & Neumann (2004) mostra que a acidificao ao longo da zona de alongamento de uma raiz, tende a alcanar um mximo a aproximadamente 4 mm do pice, quando em condies de controle de deficincia hdrica, como mostrado na figura 12, e, a partir dos 6 mm, o ritmo desacelerado, tendendo a ficar constante.

15 Efluxo de H (nmol m s )
-1

0,3 Efluxo TCR TCR Raiz (h ) 0,2


-1

-2

12 9 6 3 0 0 2 4 6 8

0,1

0 10 Distncia do apice radicular (mm)

Figura 12. Variao espacial do efluxo de prtons e da taxa de crescimento relativo da raiz (TCRRaiz) em razes de milho, sob condies hdricas favorveis. Modificado de Fan & Neumann (2004). Enquanto as razes principais tm como principal funo a fixao, e as laterais, a absoro, ambas possuem as respectivas zonas de crescimento, alongamento e maturao. Assim podem possuir regies mais ou menos ativas fisiologicamente, quando da absoro de nutrientes, e este tem sido um tpico de considervel interesse. Taiz & Zeiger (2004) expem claramente as diferentes linhas, onde alguns autores consideram que os nutrientes sejam absorvidos somente nas regies apicais dos eixos principais ou de menor calibre, enquanto outros consideram a absoro ao longo de toda a superfcie radicular. Isto est, entretanto relacionado com a espcie estudada e com a tecnologia adotada para estudar a absoro, que pode ser mais ou menos sensvel a ponto de identificar tais diferenas. Trabalhos clssicos da literatura demonstram diferentes variaes na absoro de nutrientes pelas razes em funo da espcie estuda. Por exemplo, na cevada, o ferro

absorvido mais intensamente na regio apical, enquanto que no milho, a absoro do mesmo elemento no tem tal diferenciao. Potssio, nitrato e amnio, na maioria das espcies so absorvidos igualmente em toda superfcie, mas, em particular no milho, na zona de alongamento que encontramos as taxas mximas de absoro. Taiz & Zeiger (2004), explicam que uma possvel maior absoro nas zonas apicais resultado da elevada demanda metablica por nutrientes nestes tecidos. De qualquer maneira porm, a absoro de ons mais pronunciada na zona de ocorrncia de plos radiculares, do que nos meristemas de crescimento ou na zona de alongamento. Isto se deve ao fato de que estas clulas completaram seu alongamento, mas no iniciaram seu crescimento secundrio, e tm grande superfcie de contato com o solo, aumentando a superfcie de absoro (Taiz & Zeiger, 2004). A partir da zona de pelos radiculares, at o local onde surge a primeira raiz lateral, tem-se uma rea com absoro reduzida (onde acontece o crescimento secundrio, nas eudicotiledneas). Quando surge a primeira raiz lateral, as regies fisiolgicas acima descritas se repetem, e as mesmas explicaes so vlidas. Um ponto duvidoso, mas importante, na absoro de gua e nutrientes o local de surgimento das razes laterais, onde h o rompimento da endoderme (figura 8). Temporariamente, esta regio pode ficar sujeita a fluxos intensos para o interior da planta de gua, nutrientes, molculas orgnicas e elementos txicos. 5.5 Extruso de prtons O efluxo ativo de prtons na raz, por H+-ATPases ligadas a membrana plasmtica, na raiz, de importncia fundamental para a planta, participando de seu crescimento atravs de processos como absoro de nutrientes, gerao de turgncia celular, acidificao externa para relaxamento da parede celular e desenvolvimento de polaridade em clulas em crescimento (Frana et al, 2005). Quando um excesso de

ctions absorvido pelas clulas radiculares, (Capitulo 6 deste volume), uma quantidade equivalente de carga positiva deve ser deslocada para o espao extracelular, para evitar excessiva despolarizao atravs da plasmalema, com efeitos lesivos para a funcionalidade da membrana e evitando flutuaes acentuadas no pH do citossol (Fernandes e Rossiello, 1995). Este efeito notrio quando acontece a absoro de ctions de alta demanda metablica como por exemplo NH4+ e K+. Isso ocasiona a acidificao no meio rizosfrico, como resultado do efluxo lquido de H+ gerado no processo (Frana et al, 2005). Na literatura encontram-se referncias de estimativas do efluxo liquido expressas por unidade de massa de raiz fresca ou seca, ou ainda por planta inteira (Frana et al, 2005), porm uma estimativa mais apropriada para o efluxo instantneo, considerando o sistema radicular como um todo e um volume fixo de soluo ou meio, pode ser aproximado pela equao descrita por Frana et al (2005):
+ EH =

1 dU H + ................................. ...............Equao 2 AR dT

onde; UH+ contedo total de prtons livres na soluo, t o tempo, e AR a rea radicular atravs da qual prtons permeiam soluo segundo a uma certa taxa dU H + dT .

Na prtica

dU H + dT

aproximado por

UH + T

, mas mesmo assim a aplicao da

Equao 2 envolve muita incerteza, considerando a variao axial do influxo-efluxo de H+ no pice radicular, das dificuldades tcnicas associadas determinao da atividade de H+ ao nvel da superfcie radicular e da quantificao precisa da rea radicular (Zonta, 2003).

5.6 Exsudao radicular Os sistemas radiculares acrescentam quantidades significativas de carbono ao solo, em suas mais diversas formas, independente da quantidade estocada nos seus tecidos e disponibilizada aps a colheita ou morte da planta. O carbono acrescentado rizosfera durante o crescimento ativo da raiz raramente excede 1% de peso seco (Nye, 1981) sob condies normais de crescimento. Porm, essas taxas podem ser 2 a 4 vezes maiores sob condies de estresse, onde, dependendo da espcie e condies ambientais, at 40% do carbono fixado pelas plantas pode ser depositado diretamente na rizosfera (Zonta, 2003), o que significaria 5 - 25% do C lquido assimilado pela planta, resultando em uma perda lquida de fotossintatos. Exemplos tpicos de exsudaes radiculares so os cidos orgnicos, por estarem diretamente envolvidos na tolerncia das plantas ao Al (Zonta, 2003) (Capitulo 16 deste volume). Os cidos orgnicos tm relao especial com a toxicidade por Al e outros metais e com a nutrio da planta (Jones, 1998; Ryan, 2001), participando como componente chave no sistema operacional da interface solo-raiz (Bcio et al, 2000). Alm destes, uma grande quantidade de substncias so exudadas pelas razes, entre elas podem ser citados: acares, compostos aminados, cidos orgnicos, cidos graxos, esteris, nucleotdeos, flavonas, enzimas e outras substncias. 6. Dinmica do desenvolvimento radicular O crescimento das razes ocorre quando clulas da regio meristemtica (coifa) dividem-se, alongam-se e levam a ponta da raiz atravs do material adjacente. A presso de turgor nas clulas que se alongam direcional, que deve ser suficientes para se sobrepor resistncia da parede celular ou s demais resistncias externas do meio. Assim, a presso de turgor celular e a resistncia da parede celular, somadas as

resistncias do meio deformao, so fatores importantes para avaliao do crescimento radicular atravs do solo (Camargo & Alleoni, 1997). Plantas cultivadas, tipicamente possuem razes que crescem 1 cm ou mais por dia (Russel, 1977), enquanto que razes de plantas em ecossistemas naturais podem crescer 1 mm ou menos por dia (Brundrett & Kendrick, 1990). 6.1 Rizocrescimento Nos vegetais, a maior parte do desenvolvimento ocorre aps a embriognese atravs das atividades de seus meristemas, os quais continuam formando rgos (razes, ramos, folhas, verticilos florais e frutos) ao longo de todo o ciclo de vida. Essa continua formao de rgos, parece ser uma adaptao das plantas vida fixa em substratos, permitindo que seu desenvolvimento seja ajustado s variaes de gua, luz e nutrientes (plasticidade fenotpica). Dentre os principais grupos de hormnios envolvidos no crescimento dos vegetais, as auxinas e citocininas parecem estar intimamente associadas atividade dos meristemas radicular PERES & KERBAUY (2000). Como um todo, o sistema radicular repete-se indiscriminadamente e de forma catica, existindo um diferencial a nvel hierrquico (magnitude do sistema), sempre modulado pelas condies ambientais. 6.2 Economia de carbono e nutrientes nos sistemas radiculares

As razes so rgos heterotrficos das plantas (com exceo de alguns tipos singulares, fotossintetizantes, como das orqudeas), e por tal motivo, os gastos com carbono no sistema radicular se constituem em limitao primria para o crescimento de plantas cultivadas, comuns em solos com baixa disponibilidade de nutrientes (Nielsen et aI., 1999), como os solos brasileiros, pois o crescimento e a atividade do sistema

radicular apresenta um custo metablico significativo, especialmente, quando a planta est sob estresse edfico (Lynch, 1995). MOREIRA & SIQUEIRA (2002) citam que at 60% do carbono fotoassimilado pode ser consumido pelo sistema radicular, sendo que metade deste em mdia utilizado pela respirao (25% do carbono fotossintetizado), e o restante, utilizado para a formao de tecidos, do mucigel e exudao radicular. Estes fotossintatos so translocados de suas fontes at o sistema radicular atravs do floema, e seu movimento atravs dos tecidos se d via plasmodesmatas, podendo, a qualquer momento, compor novos tecidos, formar o mucigel ou ainda deixar o simplasto e penetrar no apoplasto, podendo ser eventualmente exudados para o solo ou ser trocados por ons. Pimentel (1998), revisando diversos autores, indica que 44% do carbono fixado pela fotossntese v para a raz, com 1/4 desse valor utilizado no crescimento, e o restante na respirao de manuteno. O mesmo autor afirma que para plantas em simbiose com o Rhizobium, pelo menos 12% dos fotossintatos produzidos pela planta so gastos na respirao e crescimento dos ndulos, assim como em plantas micorrizadas, 5 a 10% destes fotossintatos so usados pelo fungo. A quantidade de fotoassimilados na planta , geralmente, proporcional rea foliar, resguardando as particularidades devidas. Sabe-se que o alongamento de razes cessa num perodo de 24 horas, quando 40-50% da parte area removida, tanto em plantas de metabolismo fotossinttico C3, como C4 (Richards, 1993). Assim, o desenvolvimento de novas folhas, a partir do momento que assumem o papel de fonte, correlaciona-se positiva e linearmente com o alongamento radicular. Matthew et al (2001), mostraram que a reduo no metabolismo e senescncia do sistema radicular diferenciada de acordo com o fitmero de origem da raiz. Razes

mais velhas, que crescem a partir de fitmeros mais distantes da coroa da planta, recebem menor quantidade de fotoassimilados, o que determina a reduo na taxa de alongamento e a progressiva diminuio na respirao destas razes, sinalizando o avanar do processo de senescncia e eventual morte. Logo, pode-se conjecturar que a alocao de fotossintetizados inversamente proporcional distncia das razes em relao coroa da planta, ou seja, h maior partio de carbono para as razes mais prximas da fonte de fotoassimilados (folhas). MATTHEW et al (2001) demonstraram que a maior reduo no carboidrato alocado raiz ocorre em sua ponta, onde se concentra a atividade meristemtica. As razes recm formadas (mais jovens) e portanto, mais prximas superfcie do solo, foram as que receberam a maior parte do carbono direcionado ao sistema radicular. Neste contexto, estabelece-se um aparente paradoxo, em que a planta investe no metabolismo de razes superficiais, mais sujeitas ao dficit hdrico do solo, enquanto provoca a morte de razes (velhas) estabelecidas em maiores profundidades do solo, onde h maior disponibilidade de gua. Portanto, a seleo de plantas com sistema radicular bem desenvolvido, para profundidade e rea radicular, apesar da raiz no ser um rgo colhido na maioria das culturas, permitir aumentos de produtividade (Pimentel, 1998). 6.3 Arquitetura e topologia radicular Um sistema radicular pode ser definido como um objeto que apresenta autosemelhana e complexidade infinita, ou seja, tm sempre cpias aproximadas de si mesmo em seu interior. Essa a prpria definio de fractal, e assim o sistema radicular de toda e qualquer espcie, apresentando aparncia consensual e crescimento catico.

A arquitetura radicular nada mais primordialmente do que a forma determinada geneticamente, de ordenar e organizar no espao este rgo, de forma a obter sua melhor eficincia de uso, na aquisio de recursos. A topologia de um sistema radicular, por sua vez, est contida no sistema arquitetnico radicular, e permite a quantificao desta organizao. A figura 13, mostra a arquitetura radicular de vrias espcies (Lynch, 1995), onde a diversidade estrutural dos sistemas radiculares vista como uma adaptao para o desempenho mais eficiente das funes das razes.

Figura 13. Exemplos de variao da arquitetura radicular. Imagens obtidas a partir de escavao parcial de diversas eudicotiledneas Europias. Modificado de Lynch (1995), com permisso da American Society of Plant Biologists.

Um sistema radicular eficiente aquele que otimiza a relao entre quantidade de recursos adquiridos e empregados para sua obteno, e, a arquitetura do sistema radicular fundamental para a aquisio de recursos no solo (Miller et al., 1999). Sua definio muito complexa, por envolver vrios aspectos, como taxa de crescimento, ramificao, orientao e longevidade dos diferentes tipos de raiz (Bonser et aI., 1996). O desenvolvimento espacial do sistema radicular determina a habilidade da planta em explorar recursos que esto mal distribudos (Fan et aI., 2003), e a arquitetura do sistema radicular pode alterar o custo dessa explorao em termos de carbono, e, definir a capacidade de competio do sistema radicular (Fan et aI., 2003). Lynch (1995) afirma no existir uma ferramenta quantitativa adequada que caracterize o sistema radicular, j que estes sistemas variam amplamente em funo da caracterstica gentica e da sua interao com vrios fatores fsicos, qumicos e biolgicos no solo, alm dos temporais e espaciais. A geometria radicular tem importante papel na dinmica global do ecossistema pastoril (Jarvis, 1999), atravs de efeitos sobre a aquisio de nutrientes de baixa mobilidade, como o fsforo; a captura e reciclagem de outros nutrientes em profundidade, como o nitrato, e o estabelecimento de associaes com a biota do solo (Mc Cully, 1999; Salcedo, 1999). O estudo desses aspectos, que relacionam a distribuio radicular s suas funes de aquisio de gua e nutrientes, demandam a separao das razes em classes funcionais, e a quantificao da sua contribuio ao sistema total (Rossiello et al., 1995). A resposta da arquitetura radicular disponibilidade de fsforo parece ser extremamente especfica (Bates & Lynch, 2000; Williamson et aI., 2001; Lpez-Bucio et aI., 2002), influenciando o ngulo de crescimento das razes basais em relao gravidade (Bonser et aI., 1996).

Estudos relativos arquitetura do sistema radicular so teis na quantificao da eficincia fisiolgica de sistemas radiculares contrastantes, fornecendo ferramentas para a investigao de mecanismos especficos, viabilizando a formao de variedades cultivadas com maior eficincia no uso de fsforo (Nielsen et aI., 1999). 6.4 Caractersticas de interesse quantitativo Na tabela 1 so apresentados as principais caractersticas radiculares a serem medidas de acordo com suas funes (Adaptadas do trabalho de Atkinson, 2000). Tabela 1. Principais caractersticas radiculares mensuradas, unidades e funes. Modificada e adaptada de Atkinson (2000). Caracterstica Comprimento Radicular Massa Radicular (fresca ou Seca) Volume Radicular rea radicular Unidade m ou Km de razes g ou Kg de razes cm3 ou m3 de razes. cm2 ou m2 de razes. Funo Determina o potencial de Somatrio do absoro de gua e nutrientes comprimento de do solo. Indicador da todos os eixos interao das razes com os radiculares microorganismos do solo. Somatrio em massa Estoque total de massa de todos os eixos subterrnea alocada. radiculares. Contedo de Reserva. Espao ocupado Volume de solo explorado pelo sistema pelas razes. radicular. Superfcie de Absoro de gua e contato ente as nutrientes do solo. razes e o solo. Potencial do desenvolvimento de associaes com Dimetro mdio dos microorganismos; indicao eixos radiculares. da regulao do stress Geralmente assumehdrico; potencial do se a raiz como um crescimento radicular; cilindro. indicador da influencia e respostas das condies fsicas e qumicas do solo. Definio

Dimetro Radicular

mm

Os valores da Tabela 1, podem ser expressos por unidade de volume de solo extrado, sendo apresentados como densidade da rea radicular (DRA), do comprimento

radicular (DRC) e da massa seca radicular total (DMR), expressas em cm2 dm-3, m dm3

e g dm-3, respectivamente (Van Noordwijk, 1993; Brasil et al., 2005). Durante muitos

anos, o tempo gasto nas atividades de quantificao desses parmetros, e as incertezas quanto aos resultados, constituram fortes desestmulos ao trabalho com razes. Outros valores podem ser derivados das caractersticas morfolgicas das razes, como por exemplo, a utilizao dos valores da rea e do comprimento especfico, obtido pela razo entre a rea ou o comprimento e a massa radicular, respectivamente (cm2 g-1 e m g-1 de razes) como indicadores da espessura ou do dimetro radicular, (Oliveira et al., 2000). Os dados de densidade radicular podem ser a ajustados a uma funo exponencial decrescente, da forma: DR = a(-bz), onde a o parmetro de ajuste, b a taxa de decrscimo relativo da DR (m-1) e z a profundidade (m) para solos de textura homognea, ou para diversas outras funes (Nicoullaud et al., 1994), com o objetivo de se estudar a distribuio vertical das razes em profundidade. O que pode ser feito por classes de dimetro. Embora em estudos de razes no campo, a caracterstica de maior enfoque seja a massa radicular (fitomassa de razes), o comprimento radicular, tem sido a caracterstica mais utilizada como base de clculo para inmeras funes de determinao de variaes temporais do sistema radicular, sendo considerado como caracterstica padro para a determinao da densidade (m de raz m-3 de solo) e do crescimento radicular (Van Noordwijk, 1993, Rossiello et al., 1995). Tal caracterstica um indicador do potencial de absoro de gua e nutrientes, sendo proporcionalmente maior o volume ocupado e explorado do solo, quanto maior for o comprimento radicular total (Atkinson, 2000). Adicionalmente, os estudos sobre o influxo lquido de nutrientes deve levar em conta a influencia do dimetro radicular e a distancia mdia entre razes (Frana et al.,

1999). Outros estudos, ligados produtividade primria, necessitam de dados sobre as quantidades totais de biomassa e sua partio entre parte area e razes. 6.5 Magnitude dos sistemas radiculares Em parte, a eficincia na captao de recursos das plantas est associada capacidade de explorar o meio, e via de regra, quanto mais escassos os recursos no meio, maior o investimento em sistema radicular. Segundo TAIZ & ZEIGER (2004), a habilidade das plantas em obter gua e nutrientes minerais est relacionada sua capacidade de desenvolver um extenso sistema radicular. Os autores retornam a

Dittmer, que em 1930, examinou o sistema radicular de uma nica planta de centeio depois de 16 semanas de crescimento e estimou que a mesma tinha 13 milhes de eixos radiculares primrios e secundrios, estendendo-se por aproximandamente 500 km (comprimento total) e proporcionando 200 m2 de rea radicular superficial, que somados aos 300 m2 de rea dos plos radiculares do sistema, faziam contato com 500 m2 de solo. TAIZ & ZEIGER (2004), tambm destacam as razes das plantas do gnero Prosopis, que podem, em reas desrticas, estender-se a 50 m de profundidade para alcanar a gua subterrnea. Por outro lado, plantas cultivadas anualmente tm razes que normalmente crescem entre 0,1 e 2,0 m em profundidade e se estendem lateralmente a distncias de 0,3 a 1,0 m. Plantas perenes, atingem, em mdia, um comprimento total de 12 a 18 km por rvore. A produo anual de razes, principalmente em ecossistemas naturais, pode facilmente ultrapassar a de partes areas, j que podem crescer continuamente ao logo de todo o ano, sendo que a proliferao das mesmas, no entanto, depende da disponibilidade de gua e nutrientes. Em geral, se a rizosfera pobre em nutrientes ou

muito seca, o crescimento radicular lento, havendo retomada do mesmo quando as condies na rizofera melhoram. Em azevm, Matthew et al. (2001), mostraram que o comprimento do sistema radicular atingiu 2,5 m por fitmero (unidade bsica das gramneas, constituda de de lmina, bainha, entren,n e gema, ou, simplesmente perfilho) , o que resultou em cerca de 82 km de razes/m2 de superfcie, para uma profundidade de 70 cm. 6.6 Plasticidade radicular A capacidade de adaptao do sistema radicular, atravs de mudanas morfolgicas e fisiolgicas s condies do meio ambiente dada pela plasticidade fenotpica (Lpez-Bucio et aI., 2002), sendo que as plantas que apresentam maior plasticidade so mais competitivas (Fan et aI., 2003). Essas alteraes em geral no modificam a arquitetura, de modo a afetar as caractersticas bsicas do sistema radicular como a fasciculao e a pivotncia, dentre outras. A relao entre raiz e parte area determinada pela diferena fisiolgica entre esses rgos. Razes geralmente se desenvolvem no escuro, portanto, so dependentes de fotoassimilados. As partes areas, por sua vez, so dependentes da absoro de gua e nutrientes pelas razes. As atividades da parte area, bem como do sistema radicular, so decisivas para definir a massa e o volume de ambos. As relaes entre esses rgos so coordenadas e reguladas por fitohormnios, com destaque para auxinas e citocininas. O balano entre parte area e sistema radicular dinmico e sujeito a modificaes. A comprovada correlao existente entre parte area e sistema radicular, no entanto, no deixa claro o que causa ou efeito (Moreira, 2004).

O efeito de estresses nutricionais sobre a alocao de carbono, geralmente, proporciona aumento do sistema radicular, ou seja, da capacidade de absoro. O P por exemplo, apresenta baixa mobilidade no solo e freqentemente limita a produtividade (Lpez-Bucio et aI., 2002), e a resposta do sistema radicular bem especfica (Williamson et aI., 2001), e, ocorre atravs de diversas caractersticas do sistema radicular, tal como proliferao de razes em stios onde ocorre maior disponibilidade deste elemento (Bonser et aI., 1996). As razes de Pocea (gramneas), proliferadas em regies mais frteis do substrato, so finas e apresentam aumento de diversas caractersticas, tais como comprimento especfico, nmero de razes laterais de primeira e segunda ordem, comprimento do eixo radicular principal e comprimento mdio da raiz principal em relao ao comprimento do eixo principal (Larigauderie & Richards, 1994). 6.7 Gravitropismo Gravitropismo a resposta especfica de crescimento em relao fora da gravidade, e faz com que uma planta colocada na horizontal, curve sua parte area para cima e seu sistema radicular para baixo. Razes em geral, apresentam gravitropismo positivo, sendo que as razes principais so orientadas mais verticalmente que as laterais de primeira ordem, enquanto razes laterais de segunda ou de ordem superior, podem se desenvolver quase que em todas as direes (Salisbury & Ross, 1992). A resposta mudana de gravidade pode ser divida em trs fases: percepo, traduo e resposta (Taiz & Zeiger, 2004). A percepo ou a deteco inicial da gravidade parece ocorrer na coifa, nos ltimos milmetros da raiz. Essa resposta, uma alterao no padro de crescimento, que conduz curvatura para baixo, ocorre na zona de alongamento (Evans et al., 1986).

A percepo da gravidade dada pela movimentao de amiloplastos. Esses possuem dois ou mais grnulos de amido e se localizam nas clulas da coifa da raiz (Taiz & Zeiger, 2004). Conforme o posicionamento da raiz em relao gravidade, os amiloplastos se sedimentam sobre os retculos endoplasmticos, localizados na parte basal da clula, proporcionando a liberao de clcio. O clcio se liga uma protena denominada calmodolina. Quando desprovida de clcio, a calmodolina inativa. A clcio-calmodolina, originria dessa ligao, ativa as bombas de clcio e a auxina localizadas nas partes basais da membrana celular, proporcionando aumento na concentrao de auxina e clcio. A elevada concentrao de auxina inibe o crescimento dessa regio da raiz, provocando a curvatura da mesma (Evans et aI., 1986; Figura 14).

20 min.

120 min.

Figura 14. Sucesso de mudanas do padro de pH na superfcie da raiz principal de milho exposta a um estmulo geotrpico. Regies de pH alto so representadas pelo vermelho e regies de pH baixo so representadas por amarelo. O tempo de exposio ao estmulo (posio horizontal do eixo radicular) foi de 20 minutos e 120 minutos. Adaptado a partir de de Mulkey e Evans (1981). Quando a raiz est na posio horizontal, ocorre migrao de Ca para a coifa. O acmulo desse on na parte basal estimula a movimentao diferencial e baspeta da auxina para a zona de alongamento. Ao longo do estmulo da gravidade, o balano entre o movimento acrpeto (da base para o pice) da auxina, como estimulador do

crescimento, e o movimento baspeto do ABA, que inibe o crescimento, alterado. Como conseqncia, ocorre o crescimento longitudinal e assimtrico entre os lados inferior e superior (Jesko, 1994). Existe ainda outra hiptese, onde o sinal que desencadeia a resposta seria eltrico, ou eletroqumico, e no hormonal (Taiz & Zeiger, 2004). Essa hiptese considera uma corrente eltrica simtrica ao longo do sistema radicular, quando esse est na posio vertical. Quando as razes so colocadas na horizontal, essa corrente passa a ser assimtrica. H evidncias da participao do fluxo de H+ na formao dessa corrente eltrica. (Evans et aI., 1986; Salisbury & Ross, 1992). O fluxo de H+ estaria refletindo o fluxo de clcio para a parte basal da coifa, para manuteno do equilbrio de cargas (Evans et aI., 1986). 6.8 Variabilidade e arranjo espacial e temporal Os estudos sobre o desenvolvimento, a distribuio e a profundidade efetiva das razes tm permitido aprimorar os conhecimentos sobre essa relao, atravs da determinao da camada de solo a ser umedecida pela aplicao de gua, assim como a profundidade de monitoramento da gua no solo. A figura 15 mostra a distribuio espacial das razes de cana-de-aucar, em condies de campo.

0,0 0,5 1,0 Profundidade (m) 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 1,0 2,0 3,0

Raizes superficiais

Raizes de sustentao

Raizes-cordo

Distncia do centro da touceira (m )

Figura 15.

Distribuio vertical e horizontal do sistema radicular da cana-de-aucar.

O tolete foi plantado aos 25 cm de profundidade, destacando: Razes superficiais, mais ramificadas responsveis pela absoro da maior parte da gua e dos nutrientes; Razes de sustentao ou fixadoras, responsveis pela ancoragem da touceira, e, Razes-cordo, profundas e importantes no processo de ciclagem de nutrientes e absoro de gua nos perodos de veranicos. Adaptado de Orlando Filho (1983) e Smith et al (2005). Neves et al. (2000) analisaram o sistema radicular de trs cultivares de acerola em um Latossolo Roxo e verificaram que a profundidade efetiva do sistema radicular das trs variedades variou de 0,50 a 0,69m, pois nesta profundidade foram encontrados 80% do sistema radicular das plantas analisadas. Com relao distribuio horizontal das razes no perfil do solo, os autores observaram que 80% do sistema radicular concentravam-se a 0,75 metro de distncia da planta. Diante disto, recomenda-se que sejam feitas avaliaes da distribuio do sistema radicular das plantas, no sentido de se determinar a profundidade efetiva das razes de absoro de gua e nutrientes para locais especficos e, conseqentemente, os

volumes de gua disponveis no perfil do solo para as plantas. Somente, a partir dessas informaes, ser possvel otimizar a freqncia e ou a intermitncia da irrigao e as lminas de gua a aplicar em cada irrigao. Avaliando a distribuio e variao temporal de caractersticas radiculares de B. humidicula em Planossolo arenoso, Brasil (2001) verificou a importncia de trs classes de razes (finas (<0,8mm), mdias (1,5-0,8mm) e grossas (2,5-1,6mm) para o comprimento e biomassa radicular em amostras de solo coletadas em camadas paralelas de 10cm de solo at 70cm de profundidade. Estes autores verificaram que as razes finas contriburam com a quase totalidade do comprimento total e mais da metade da biomassa acumulada at 70cm de profundidade, concentrando-se principalmente nos primeiros 20cm (Figura 16). Estes resultados revelam que a cuidadosa separao de razes por classes de dimetro essencial para o entendimento da dinmica de resposta do sistema radicular de B. humidicola s flutuaes nas condies ambientais e que a frao razes finas contribuem significativamente no somente para o comprimento total do sistema radicular como tambm para a biomassa total do mesmo.
Comprimento Radicular (m dm ) 0 0 0,1 Profundidade (m) 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Grossa Mdia Fina Muito Fina Total 40 80 120 160 200
-3

Figura 16. Variao da densidade do comprimento radicular (Total; m dm-3) de Brachiaria decumbens em funo do dimetro de razes (Grossa, mdia, fina e muito fina), em profundidade. Brasil, 2005. 7. Fatores abiticos e biticos que alteram o desenvolvimento radicular Os fatores abiticos que influenciam a fisiologia das razes e, por conseqncia, o crescimento e o desenvolvimento das culturas, podem ser classificados, quanto sua natureza, em qumicos (pH, a concentrao de elementos txicos e nutrientes), fsicos e fisico-hdricos (oxigenao, temperatura, umidade, textura, densidade/porosidade). Quase todos estes fatores so interdependentes. A influncia da umidade do solo com relao resistncia penetrao das razes, e pode estar relacionado com fatores biticos, como exemplos, a influncia da temperatura e do pH na atividade microbiana (decompositores, FBN e micorrizas), a oxigenao interagindo com os fatores qumicos e biolgicos (oxidao, respirao, etc.). De modo geral, o crescimento das plantas reduzido drasticamente na presena de camadas compactadas; com impedimentos de natureza qumica (acidez e toxidez por Al+3); e fsico-hdrica (alagamento, seca). No entanto algumas diferenas entre espcies so observadas (Taylor, 1981; Materechera et al., 1991). As razes no podem alterar o dimetro de seu pice, para penetrar em poros menores sua proporo tecidual (dimetro e rea superficial), por isto ao crescer em solos compactados, as plantas necessitam deslocar partculas minerais (areia, argila, etc.), para alongar e expandir seus eixos radiculares. Muitas espcies sofrem limitaes de crescimento na presena de horizontes ou camadas compactadas, ocorrendo freqentemente o encurtamento e aumento do dimetro dos eixos radiculares, e, alm disso, podem ocorrer alteraes anatmicas

significativas como a relao entre a espessura do crtex e a espessura do cilindro vascular das razes (Bassoi et al., 1999). No entanto, a simples reduo no alongamento dos eixos principais no pode ser considerada como uma diminuio do crescimento radicular, e sim uma alterao na distribuio espacial das razes, em proporo horizontal, j que em condies de limitao do crescimento radicular em profundidade, ocorre uma intensa proliferao de eixos laterais finos (secundrios e de ordens superiores, com dimetro < 0,8 mm) e plos radiculares (dimetro < 0,1 mm), que contribuem para o aumento significativo da superfcie especfica radicular superficialmente (Dias Correia, 1986), o que pode ser limitante em regies com perodos prolongados de seca. Por esta razo, a profundidade em que as camadas compactadas aparecem no solo, determinar a importncia agrcola do mesmo. A estrutura a propriedade fsica do solo que diz respeito aglutinao das partculas primrias em partculas secundrias (agregados), delimitadas umas das outras por superfcies de fraqueza ou separadas por descontinuidades, dando origem a agregados de configuraes peculiares. Esta propriedade exerce influncia direta sobre o crescimento das razes, reduzindo a sua extenso em funo de alteraes significativas provocadas pelo stress mecnico no alongamento das diferentes espcies cultivadas. Dexter (1988) define a estrutura do solo como sendo a heterogeneidade espacial dos diferentes componentes do solo, e por isto ainda existe uma grande lacuna na pesquisa, sobre mtodos de estudos para determinar as interaes entre a estrutura do solo e o desenvolvimento do sistema radicular, que precisam ser melhor desenvolvidos. Esta propriedade controla os espaos vazios e, conseqentemente, a quantidade de gua e oxignio que pode ser armazenada no solo e a velocidade com que so liberados para

as razes das plantas. Desta forma, a porcentagem de espaos vazios no volume do solo e, especialmente, seus aspectos geomtricos, como nmero, tamanho, forma, distribuio, direo, continuidade e conexo so portanto, bastante relevantes e podem alterar o crescimento das razes. A forma e a orientao dos agregados dentro do solo podem afetar a penetrao das razes, pois esses fatores influenciam o ngulo de contato no qual a coifa encontra a superfcie dos mesmos. A chance de penetrao menor quando o ngulo de contato coifa-superfcie do agregado mais agudo. Por outro lado, a falta de ancoragem (apoio) em camadas mais soltas (frouxas) do solo pode impedir a penetrao de razes em camadas mais duras. Por exemplo, se a semente plantada em solo desagregado e a plntula encontra uma crosta superficial, em vez de emergir poder ser empurrada para baixo. Da mesma forma acontece com razes, quando encontram superfcies duras, se a camada acima no oferecer apoio suficiente ela no conseguir penetr-la, mesmo que tenha fora suficiente para tal (Rezende, 2000). A infiltrao e a capacidade de armazenamento de gua tambm esto intimamente relacionadas com a porosidade do solo e as razes das plantas. A dinmica destas propriedades, pode sofrer modificaes na sua poro superficial com o passar do tempo, atravs de prticas de manejo como arao, tratos culturais, calagem, adubao, incorporao de matria orgnica, dentre outras. A distribuio vertical das caractersticas radiculares dos vegetais tambm pode ser alterada em funo da variao de textura nos horizontes superficiais e subsuperficiais do solo (Atkinson, 2000). Em solos argilosos as rvores muitas vezes formam razes dispersantes concentradas no horizonte superficial, podendo muitas vezes o sistema radicular estar limitado s zonas de coveamento de plantio (Figura 17).

Figura 17. Razes dispersantes - efeito de coveamento na distribuio radicular da Acerola. A linha pontilhada representa o espao tridimensional da cova de plantio. Fotografia de Felipe da Costa Brasil (2002). Os solos com textura homognea (textura mdia a arenosa), ao longo de toda sua profundidade efetiva, apresentam normalmente uma distribuio radicular que declina conforme uma funo exponencial decrescente (Brasil, 2001), o que pode ser alterado por ao de agentes de impedimento, como os j descritos anteriormente, ou em funo do manejo do solo. Em solos com variao de textura entre os horizontes (Ex. A-AB-BA-Bt), ou com camadas de adensamento, tal distribuio passa a ser afetada de forma bimodal, ocorrendo zonas de acmulo radicular aps a camada de impedimento. No caso de solos coesos dos tabuleiros costeiros, estes apresentam normalmente uma reduo grande da porosidade entre o horizonte superficial e subsuperficial. Cintra (1997), estudando um Podzlico acinzentado fragipan (Segundo a antiga Classificao de Solos), encontrou uma reduo de 41% a 34% da biomassa radicular, entre o horizonte Ap e o BA, e, salienta que esta reduo, deve em grande parte, resultar da diminuio de macroporos do horizonte compactado.

A distribuio horizontal de razes tambm pode ser afetada, uma vez que comum observar agrupamentos de razes concentrados em rachaduras, gretas ou covas de animais (Figura 18). a b

Figura 18. Fissuras em um solo Mediterrnico (Luvisol) no perodo de seca na na Regio do Alentejo em Portugal; a) na superficie; b) no perfil. Foto de Felipe da Costa Brasil (2004). Agrupamentos ou acmulos de razes no espao ocorrem naturalmente em certas regies, especialmente em sistemas radiculares que possuem elevado nmero de ramificaes curtas por unidade de comprimento da raiz parental (Bingham & Bengough, 2003). Um exemplo tpico a proliferao do sistema adventcio de razes nas gramneas, nos primeiros centmetros do solo, onde a concentrao de fatores de crescimento maior que no subsolo. Como propriedade qumica limitante, a acidez do solo comum em todas as regies onde a precipitao suficientemente elevada para lixiviar quantidades apreciveis de bases permutveis das camadas superficiais dos solos. To generalizada a sua ocorrncia e to pronunciada a sua influncia sobre os vegetais, que se transformou numa das mais discutidas propriedades do solo. Especificamente a presena de Al+3 a nveis txicos para a maioria das plantas cultivadas, um dos principais fatores que limitam a produo agrcola (Ma et al., 2001) (Figura 19).

Figura 19. Efeito do contedo de Al+3 no desenvolvimento de plntulas de arroz, variedade Caiap (Zonta, 2003). Particularmente, na raiz que se verifica o principal sintoma de toxicidade e maior sinal de danos, sendo a inibio do crescimento longitudinal uma das caractersticas que pode variar entre espcies tolerantes e sensveis, em diferentes graus (Kochian, 1995). Este ction, quando em contato com as razes, promove rapidamente a paralisao do crescimento radicular, tornando-as atrofiadas em funo da morte ou injria do meristema radicular. Especificamente, a parte distal da zona de transio no pice das razes, onde as clulas esto entrando em fase de alongamento, o stio da ao txica primria do Al+3 (Sivaguru & Horst, 1998). Ainda, o Al+3, atua fixando fsforo em formas menos disponveis nas superfcies das razes, diminuindo a respirao desta, alm de interferir na atividade das enzimas de fotofosforilao, reduzindo a absoro, transporte, e a eficincia de uso de gua e vrios nutrientes essenciais (Ca, Mg, K, P e Fe), entre outros efeitos diretos e indiretos (Nichol & Oliveira, 1995). Em sntese, plantas afetadas por Al tambm apresentam sintomas de deficincia de nutrientes, tais como P, Ca, Mg, K e Mo, devido interferncia do Al nos

processos de absoro, transporte e uso destes nutrientes. Tais deficincias aparentemente ocorrem porque o Al induz a deposio de calose nos canais plasmodesmticos, inibindo fisicamente o transporte simplstico entre clulas (Sivaguru et al., 2000). Esse assunto ser melhor discutido no capitulo 16 neste volume. A matria orgnica do solo afeta significativamente sobre diferentes aspectos diretos e indiretos, para o desenvolvimento e a dinmica do sistema radicular. Funciona como fonte e reserva de nutrientes, e atua sobre os principais processos pedogenticos, participando na migrao ou fixao de alguns elementos (Ca, Fe, Al) e argilas; reduzindo o efeito txico de metais (Al, Mn); estabilizando o pH do meio, alm de regular o regime trmico e hdrico do solo; melhorando a densidade e a estrutura do solo (SANTOS & CAMARGO, 1999). No obstante a estes efeitos conhecidos da matria orgnica do solo, a importncia das substncias hmicas como bioativadoras do crescimento vegetal tem sido relatada por alguns autores. Os resultados demonstram que estas substncias podem alterar o arranjo tridimensional, com um aumento substancial da superfcie especfica do sistema radicular, alm de atuar sobre a ativao das H+-ATPases e na permeabilidade das membranas (Capitulo 4 neste volume), com isto tornando-o mais eficiente nos processos de absoro de gua e nutrientes (Faanha et al., 2002). Outro aspecto a ser abordado na dinmica do crescimento radicular, que governa as demais propriedades acima discutidas, a prpria natureza mineralgica dos solos. Tomando-se como exemplo solos Cauliniticos (Ki e Kr > 0,75 ) e solos Oxdicos (Kr < 0,75) (Embrapa, 1999), que diferem quanto ao grau de intemperismo, e conseqentemente apresentam diferenas significativas nas propriedades fsicas e

qumicas dos solos e de suas interaes com o crescimento radicular das culturas. Como exemplo de propriedades fsico-hdricas, podemos citar as diferenas entre os

Argissolos (caulinticos), que apresentam uma descontinuidade de capilaridade na transio do Horizonte A (mais arenoso) com o Horizonte Bt (argiloso), onde so observadas maior microporosidade no horizonte B do que no A, e o inverso em relao macroporosidade, tendo influncia direta na maior umidade da camada subsuperficial. Comparativamente, a homogeneidade da macro e microporosidade em todos os horizontes dos Latossolos (Oxdicos), facilita a evaporao da gua, sua drenagem, e conseqentemente a distribuio do sistema radicular em profundidade. Embora os Latossolos tenham propriedades fsicas mais favorveis que os Argissolos, devido a seu estgio avanado de intemperismo, inmeros problemas de natureza qumica so acentuados, tais como: pH, alumnio, baixo contedo de matria orgnica, baixa CTC, fsforo, etc. (Oliveira, 2001). Tais propriedades conforme j descrito anteriormente, alteram o crescimento radicular, sendo encontrados na literatura inmeros trabalhos, sobre o manejo e correo dos solos, principalmente atravs de calagem e adubaes de NPK, em solos da regio do Cerrado brasileiro, com predomnio de solos Oxdicos. 7.1. Micorrizao As razes podem ser ajudadas em suas funes por microrganismos encontrados no solo. Entre essas associaes, a mais generalizada interao entre as plantas e microrganismos a micorriza. Os fungos micorrzicos arbusculares (FMA) esto sendo apresentados em detalhes no capitulo 3 neste volume. Algumas modificaes nas razes, resultantes da interao com fungos ectomicorrzicos so aqui apresentadas. De uma maneira geral, a rede de Hartig distribuda ao redor das clulas corticais e a manta de fungos pode envolver a raiz como uma bainha. A infeco no se espalha em tecidos meristemticos ou dentro dos vasos condutores. A ectomicorriza penetra

enzimaticamente e mecanicamente entre as clulas epidrmicas e entre a lamela mdia das clulas corticais.

A penetrao enzimtica primeiramente hidroltica via enzimas pectolticas e pode progredir at a endoderme. O grau de desenvolvimento do fungo no crtex da raiz aparentemente mediado pela agressividade do fungo e pela resposta do hospedeiro (Marx & Krupa, 1978). Brundrett (2002) sugere que presses de seleo causaram divergncias morfolgicas em razes com diferentes tipos de micorrizas. A espessura e suberizao da exoderme so maiores em plantas micorrzicas obrigatrias, enquanto plantas no micorrizadas possuem tendncia a ter razes finas, com mais plos radiculares e defesas qumicas avanadas. Espcies em associao com ectomicorrizas geralmente possuem razes laterais curtas e grossas, resultando um sistema radicular distinto. Existem plantas que parecem ter razes curtas quando em associao com fungos micorrzicos vesculo-arbusculares (VAM), como as angiospermas Acer e Ulmus e a gymnosperma Podocarpus. Arisaema atrorubens com razes grossas e relativamente sem ramificaes e sem plos radiculares considerada altamente dependente de micorrizas (Brundrett & Kendrick, 1988). Contudo, existem excees, como Geranium robertianum que apresenta razes altamente ramificadas e considerada como tendo baixa necessidade de micorrizas. As razes micorrizadas da espcie arbrea btula (Betula alleghaniensis) so mais grossas que as razes da mesma ordem no micorrizadas, dado manta de hifas na superfcie (Brundrett, 2002). O padro de crescimento das razes das plantas hospedeiras freqentemente alterado pelo desenvolvimento de fungos ectomicorrzicos (ECM) no sistema radicular. Por exemplo, em Pinus a proliferao de razes curtas estimulada pela colonizao com o fungo, bem como a bifurcao das razes curtas (Reid, 1990). A colonizao com MA mudou a morfologia do sistema radicular de Annona cherimola,

aumentando o nmero total de razes, o nmero de razes laterais de primeira ordem e de segunda ordem (Padilla et al., 2005). Outra importante interao da raiz com microrganismos a produo de ndulos radiculares em leguminosas (Capitulo 9 neste volume). Esses ndulos so estruturas que se desenvolvem em muitos membros da famlia Leguminosae em presena do rizbio apropriado (Sprent & Sprent, 1990) ou Burkholderia (Chen et al 2005) e que suprem a planta de nitrognio fixado. Pode ocorrer tambm a formao de ndulos radiculares fixadores de nitrognio em membros das famlias Rosaceae, Eleagnaceae, Rhamnaceae, Betulaceae, Casuarinaceae, Myricaceae, Coriariaceae e Datiscaceae, em associao com Frankia (Sprent & Sprent, 1990). Fatores ambientais podem afetar o processo de enraizamento de esplantes e citase que para E globulus e E. saligna, baixas temperaturas ocasionaram uma demora no enraizamento dos explantes. Neste caso, foram identificadas caractersticas preferenciais por espcie, sendo que E. saligna prefere temperaturas mais elevadas e E. globulus, temperaturas mais baixas (Corra & Fett-Neto, 2004). 7.2. As razes e a formao de agregados no solo Apesar de representarem uma pequena frao dos constituintes orgnicos do solo, as razes exercem tambm grande influncia direta e indireta, na formao e estabilidade dos agregados no ambiente edfico (Silva & Mielniczuck, 1997). A dinmica radicular, atravs da transferncia direta dos produtos da fotossntese para a matriz do solo, tem sido considerada a principal fora propulsora na manuteno da qualidade do solo. Tais produtos so representados pelo tecido radicular vivo, exsudatos e diversos constituintes orgnicos derivados das razes em crescimento, razes mortas e pelos radiculares, alm de microrganismos rizosfricos e seus subprodutos de elevado poder agregante (Mielniczuck, 1999). Estes compostos, ao se

associarem com a matria mineral do solo, formam agregados estveis em gua, onde permanecem menos acessveis ao ataque de microorganismos decompositores (Haynes & Beare, 1996). As razes atuam na primeira fase de formao dos agregados, sendo este um resultado de interaes de componentes fsicos, qumicos e biolgicos, onde os principais agentes so o clima, as razes, os microorganismos, a fauna e o prprio tracionamento do solo (Silva & Mielniczuck, 1997). Durante seu crescimento, exercem presses biofsicas (axial e radial), no seu avano atravs do espao poroso, aproximando as partculas minerais, e conseqentemente aumentando a densidade do solo nas regies mais prximas superfcie radicular. Paralelamente a absoro de gua pelas razes ocasiona um secamento das partculas adjacentes, provocando presses capilares que intensificam a compresso dos grnulos minerais. Como componente bioqumico, o ambiente da rizosfera, rico em energia, estimula a proliferao de microorganismos que liberam substncias hmicas e polissacardeos responsveis pela estabilizao dos microagregados formados (partculas < 250 m), e sua aglutinao em unidades maiores (Figura 20). Ao lado desta atividade, que ocorre enquanto o sistema radicular est em crescimento, a matria orgnica oriunda da decomposio do tecido radicular aps a sua senescncia, razes no decompostas, hifas de fungos e micorrizas tambm atuam na formao e estabilizao, principalmente dos macroagregados (partculas > 250 m) (Mielniczuck, 1999).

Figura 20. Diagrama esquemtico de um microagregado. Adaptado de Haynes & Beare (1996) por Orlando Carlos Huertas Tavares CAPGA-CS Depto de Solos IA - UFRRJ (2006). Em conjunto, e analisando a dinmica radicular, atravs de seus processos bioqumicos e fsico-qumicos em interao com a matriz mineral do solo, pode-se admitir que o sistema radicular o principal componente formador dos micro e macroagregados do solo (Figura 21). Porm, a ao das razes finas (< 800 m) e dos plos radiculares (1 mm de comprimento por 10 m de dimetro) (Dias Correia, 1986), tanto pelo seu arranjo tridimensional (distribuio espacial, vertical e horizontal), que pode contribuir com mais de 90 % da rea superficial e do comprimento radicular total (alta superfcie especfica) (Brasil, 2001), em conjunto com os processos de absoro de gua e exudao de substncias orgnicas, constituem a frao do sistema radicular mais efetiva na gnese e estabilidade dos agregados do solo (Haynes & Beare, 1996; Mielniczuck, 1999).

Figura 21. Diagrama esquemtico de um macroagregado de solo. Adaptado de Haynes & Beare (1996) por Orlando Carlos Huertas Tavares CAPGA-CS Depto de Solos IA - UFRRJ (2006). Em adio aos componentes de formao dos agregados e a prpria morfologia radicular, uma anlise comparativa pode ser feita, quando da dinmica (crescimento e renovao) de um sistema radicular denso, bem desenvolvido e atuante por vrios anos no mesmo local, como por exemplo o das gramneas forrageiras perenes, verificamos que o mesmo distribui uniformemente os efeitos de agregao em toda a matriz do solo, por favorecerem as ligaes dos pontos de contato entre partculas minerais e constituintes orgnicos, quando comparado com as culturas anuais, cujo sistema radicular menos desenvolvido e atua por curtos perodos de tempo no solo (Silva & Mielniczuck, 1997). 10. Literatura citada ATKINSON, D. Root characteristics: Why and what to measure. In: SMIT, A.L.; BENGOUGH, A.G.; ENGELS, C.; VAN NOORDWIJIK, M.; PELLERIN, S.;

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CAPTULO 3

FUNGOS MICORRZICOS ARBUSCULARES: MUITO ALM DA NUTRIO


Ricardo L.L. Berbara1; Francisco A. de Souza2; Henrique M.A.C. Fonseca3 Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Departamento de Solos, Seropdica, Itagua, RJ, CEP 23851-970, Brasil. Berbara@ufrrj.br 2 Embrapa Agrobiologia, BR-23851970, Seropdica, Seropdica, Itagua, RJ, Brasil. 3 Centro de Biologia Celular, Departamento de Biologia, Universidade de Aveiro, 3810193, Aveiro, Portugal
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SUMRIO 1. INTRODUO ................................................................................................................ 3 2. EVOLUO E CARACTERIZAO.......................................................................... 6 3. CARACTERSTICAS GENTICAS E MORFOLGICAS .................................... 16 3.1 ASPECTOS GENTICOS......................................................................................................16 3.2 MORFOTIPOS....................................................................................................................18 4. CLASSIFICAO E NOMENCLATURA ................................................................. 23 6. MICORRIZAS E A DINMICA DO CARBONO ..................................................... 30 6.1 GLOMALINA.....................................................................................................................34 7. NUTRIO MINERAL ................................................................................................ 38 8. MANEJO DE FMA ........................................................................................................ 45 9. CONCLUSES............................................................................................................... 47 10. REFERNCIAS ........................................................................................................... 49

1. INTRODUO Plantas no tm razes, elas tm micorrizas. Esta sentena foi proferida dcadas atrs por J. L. Harley com o intuito de alertar ecologistas e bilogos para o fato de que, em condies naturais, a maioria das espcies de plantas se encontram associadas a determinados fungos de solo numa simbiose mutualstica do tipo micorrzico, do grego mico [fungo] e riza [raiz]. Indo alm das relaes funcionais que se estabelecem entre plantas e estes fungos, van der Heijden & Sanders (2002) enfatizaram que associaes micorrzicas devem sempre serem consideradas quando se busca entender a ecologia e evoluo de plantas, suas comunidades e ecossistemas. Esta considerao est baseada em experimentos que demonstram o papel desta simbiose no resultado da competio e sucesso de plantas bem como na hiptese de que a evoluo de plantas terrestres ter sido dependente da presena desta simbiose (van der Heijden et al., 1998a; 1998b; Kiers et al., 2000; Klironomos et al., 2000; Allen et al., 2003; Cairney 2000; Brundrett 2002). Atualmente so reconhecidos seis tipos diferentes de associaes micorrzicas, sendo algumas delas muito especficas, encontradas em apenas algumas famlias de plantas terrestres (Arbuscular-, Arbutoide-, Ericoide-, Ecto-, Monotropoide-, e Orquidoide). Para detalhes destes tipos ver Siqueira (1996). Este captulo ir enfatizar as micorrzas arbusculares, em particular devido ao seu carter ubquo, seu papel vital para a sustentabilidade da agricultura em regies tropicais, e seu potencial biotecnolgico, impacto na estrutura de comunidades vegetais e no dreno de carbono atmosfrico. O carter cosmopolita desta simbiose advm de levantamentos que indicam que 80% das famlias de plantas so formadas por espcies que formam micorrzas arbusculares (MA). Ela encontrada em todas as latitudes, estando presente em quase todos os

ecossistemas terrestres (Siqueira & Franco, 1988). A simbiose micorrzica arbuscular a mais ancestral dentre todos tipos de micorrzas conhecidas. Evidncias fsseis indicam que as primeiras plantas terrestres j estavam colonizadas por fungos que apresentavam estruturas miceliais e esporos similares a dos atuais fungos arbusculares (FMA) (Redecker et al., 2000a). Atualmente, a maioria das angiospermas, e muitas gimnospermas, pteridfitas e brifitas formam associao com FMA (Smith & Read 1997). Alm disso, provvel que eles sejam os fungos de solo mais abundantes na maioria dos ecossistemas tropicais, principalmente nos sistemas agrcolas, onde eles podem representar quase que 50% da biomassa microbiana (Olsson et al., 1999). Devido a esta ubiqidade, esta simbiose tem sido considerada a mais importante dentre todas as que envolvem plantas. Esta associao simbitica pelo fato dos organismos co-existirem em um mesmo ambiente fsico, raiz e solo, e mutualstica porque, em geral, ambos os simbiontes se beneficiam da associao. Ela considerada como sendo mutualista nutricional, onde a planta supre o fungo com energia para crescimento e manuteno via produtos fotossintticos, enquanto que o fungo prov a planta com nutrientes e gua. Neste sentido, esta simbiose amplia a capacidade de absoro de nutrientes por parte do simbionte autotrfico e, conseqentemente, a sua competitividade inter-especfica e produtividade. A sustentabilidade da produo agrcola est ligada aos efeitos benficos das micorrzas sobre a nutrio de plantas, principalmente com relao absoro de fsforo, que um recurso natural no renovvel. Vrias espcies de plantas respondem positivamente inoculao com fungos MA, dentre elas caf, soja, milho, batata-doce, mandioca, cana-de-acar, alm de varias essncias florestais e frutferas brasileiras. A contribuio dos fungos MA sobre a nutrio fosfatada de plantas est amplamente aceita e documentada na literatura nacional e internacional. No entanto, os servios prestados pelo 4

fungo vo muito alm da nutrio de plantas individualizadas pois eles tambm contribuem para a estruturao de comunidades vegetais. O miclio de fungos MA freqentemente interconecta o sistema radicular de plantas vizinhas da mesma espcie ou de espcies distintas. Neste sentido a maioria das plantas esto interligadas por uma rede de hifas micorrzicas comum, durante alguma fase do seu ciclo de vida (Newman 1988). As consequncias desta trama micelial para a competio inter-especfica em comunidades vegetais sugere que ela seja elemento importante na definio da sucesso vegetal conforme ainda discutiremos. Como decorrncia desta imensa quantidade de hifas produzidas por FMA, existe significante impacto sobre a estruturao e estabilidade de agregados em solos (Jastrow et al., 1998). Esta funo significativa por que a estruturao do solo modifica a capacidade de mobilizao de nutrientes, o contedo de gua, a penetrao de razes e o potencial erosivo dos solos. Fungos MA conferem tambm incrementos resistncia de plantas frente ao ataque patognico (Hwang et al., 1992), tolerncia ao estresse hdrico, eficincia fotossinttica (Brown & Bethlenfalvay 1987), ao intemperismo de minerais (van Breemen et al., 2000). Como consequncia, existem evidncias de que FMA colaboram no aumentos do dreno de carbono da atmosfera, varivel importante e pouco estudada frente aos processos de mudana climticas (Leake et al., 2004). Estas caractersticas fazem com que a simbiose micorrzica arbuscular tenha um potencial biotecnolgico e ecolgico imenso ainda a ser explorado. Neste captulo buscaremos discutir estas associaes em um contexto amplo que ultrapassa seus impactos sobre a nutrio mineral de plantas, uma vez que por mais importante que eles sejam, aspectos relevantes esto por serem desvendados. Consideraes bsicas so tambm abordados de forma a possibilitar a leitura por um pblico mais amplo. 5

2. EVOLUO E CARACTERIZAO Fungos MA, sem exceo, so simbiontes obrigatrios: eles dependem da simbiose com plantas compatveis para sua multiplicao. Alm disso, no existem evidncias comprovadas que indiquem que estes fungos se reproduzam sexualmente. At recentemente, sugeria-se que estes fungos vinham se multiplicando clonalmente, de forma puramente assexuada, por centenas de milhes de anos (Rosendahl et al., 1997; Sanders 2002). No entanto sabe-se que organismos que se multiplicam clonalmente por longos perodos de tempo tendem rapidamente a extino devido acumulao de mutaes deletrias originadas durante o crescimento somtico e a incapacidade de elimin-las e de gerar variabilidade gentica, caractersticas fundamentais para a adaptao a mudanas do ambiente. Recentemente, evidncias de recombinao em fungos MA tm sido observadas pela anlise de seqncias de DNA indicando que estes fungos desenvolveram mecanismos de evoluo que ainda necessitam elucidao (ver caracterizao molecular). Quanto origem desta simbiose, sabemos pelo estudo de fosseis, que o surgimento das plantas na superfcie terrestre ocorre entre 460-500 Mi de anos (Figura 1). enquanto a diviso Glomeromycota (que contm todos os fungos MA) j era encontrada aos 600 Mi de anos. A simbiose com plantas superiores j est perfeitamente registrada em fosseis do Ordoviciano (Redecker et al., 2000a) (450 milhes de anos). Especula-se portanto que estes fungos foram fundamentais para a conquista de ambientes terrestres pelas plantas (Simon et al., 1993b; Simon 1996) . A presena de AM em plantas primitivas (entendidas como plantas no vasculares), sugere a possibilidade desta associao ter evoludo de ambientes aquticos uma vez que as primeiras plantas terrestres encontraram um ambiente inspito para seu desenvolvimento, ressecado e infrtil (Pirozynski & Malloch, 1975). Alm disso,

suas razes eram desprovidas de pelos radiculares ou ramificaes. Eram estruturas similares a rizides, sem tecidos vasculares, similares aos encontrados em brifitas e hepticas (Malloch et al., 1980; Raven & Edwards 2001). Assim, como essas plantas poderiam absorver nutrientes (principalmente P) e evoluir de ambientes onde estes elementos eram mobilizados facilmente (aquticos), sem o auxilio da simbiose? Portanto, apesar da origem da associao ser ainda matria em debate, no se discute o papel central desta relao mutualistas na ecologia e evoluo de espcies vegetais.

Figura 1 Fssil de fungo micorrzico, indicando suas vesculas, associado simbioticamente Aglaophyton, Rhynia e Nothia, plantas vasculares. As vesculas provavelmente se desenvolviam em esporngias. (da pgina: http://www.xs4all.nl/~steurh/engrhyn/eglomit2.html, um excelente local para buscas sobre vegetao fossilizada).

Outra hiptese aceita para o surgimento da simbiose micorrzica vem da relao mutualstica observada entre fungos e cianobactrias. A endossimbiose formada entre o fungo Geosiphon pyriformis e cianobactrias tem sido apontada como sendo uma das possveis origens da simbiose micorrzica, principalmente porque este fungo apresenta morfologia, estrutura e funo prxima dos fungos MA inclusive quanto ao fornecimento de fsforo e o papel regulador deste elemento sobre a simbiose. Alm disso, a filogenia molecular confirma a relao evolutiva entre estes simbiontes (Schler et al., 2001). Infelizmente, no so conhecidas evidenciais fosseis desta relao e os nicos representantes conhecidos desta simbiose foram encontrados em poucas localidades na Europa (ustria e Alemanha). Atualmente, G. pyriformis o nico fungo conhecido capaz de formar simbiose com cianobactrias. Estas observaes portanto permitem expandir o

interesse da simbiose micorrzica para alm das plantas vasculares e brifitas (Schler et al., 1996). A relao micorrzica expresso de um evento mutuamente benfico: plantas suprem o fungo com carbono (fixado via processos fotossintticos pelo simbionte autotrfico), enquanto fungos provm s plantas de nutrientes (Moreira & Siqueira, 2002). A simbiose possvel graas ao fato do fungo produzir hifas intra e extraradiculares capazes de absorver elementos minerais do solo e transferi-los ao ambiente radicular, onde so absorvidos. No espao intraradicular, a troca bi-direcional ocorre principalmente em uma estrutura presente no crtex radicular, similar a um haustrio excessivamente ramificado, os arbsculos. Arbsculos so estruturas formadas pela interao de hifas de fungos MA e a plasmalema de algumas clulas do cortex. Estas estruturas so consideradas chave para o desenvolvimento da simbiose micorrzica e sua formao depende da completa interao gentica e funcional entre combinaes fungo-planta (Harrison 1999). Aps penetrar a parede celular, a hifa se torna extremamente finas, com dimetro menor que 1 m que se ramifica profusamente, formando uma matriz de troca com a plasmalema da clula vegetal sem entretanto a ultrapassar. Como conseqncia, aumenta-se massivamente a superfcie de contato entre as membranas dos simbiontes permitindo uma eficiente troca de sinais, nutrientes e compostos orgnicos entre a planta e o fungo. Hifas extraradiculares por sua vez, so mais eficientes que razes na captura de nutrientes por serem estruturas extremamente longas e finas (Figura 2). Em associaes arbusculares, hifas podem se estender a vrios decmetros da superfcie da raiz (comparado aos 1-2 mm de extenso mdia das radicelas). Por serem finas, com cerca de 2 m de dimetro, hifas arbusculares podem explorar volumes do solo inatingveis por estruturas radiculares (pelos radiculares apresentam valores de 10-20 m de dimetro e razes laterais 9

100-500 m). Portanto hifas so capazes de absorver os elementos minerais, como uma raiz, mas de maneira mais eficiente (Figura 3).

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Figura 2 Fotografia e diagrama de hifas extraradiculares penetrando em raiz de trevo. Note a dimenso da hifa em relao ao pelo radicular. Barra 1mm

Quanto aos mecanismos de absoro e mobilizao de nutrientes, da mesma forma, FMA so ainda mais eficientes que razes. Quando adiciona-se
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P em meio contendo

fungos micorrzicos percebe-se que todo Pi em geral absorvido por hifas (Nielsen et al., 2002). O transporte para as razes entretanto no total devido ao movimento bi-direcional observado em hifas permitir seu deslocamento para drenos do prprio fungo. Neste estudo, a maior quantidade de Pi transportada raiz correlacionou-se no com o comprimento da hifa, mas com o seu nmero total (Bago et al., 2000).

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Figura 3 Cultura em placa Petri de Lunularia cruciata (L.) Lindb. em simbiose com o Glomus proliferum Dalp & Declerck. Vista inferior do talo da heptica mostrando extensa proliferao de hifas e esporos (ver detalhe no canto superior esquerdo). Barras 50 m. Fotografia Fonseca & Berbara, no publicada.

Como FMA dependem do hospedeiro para sua prpria existncia, no existe dvida da importncia central da simbiose para fungos micorrzicos. A condio de simbionte obrigatrio advm do fato de que, ao longo de sua evoluo, estes organismos perderam sua capacidade de fixar C passado a depender exclusivamente do hospedeiro autotrfico como fonte de compostos orgnicos (Gadkar et al., 2001). No caso das plantas, entretanto, existe uma faixa grande de resposta simbiose. Espcies vegetais tm sido classificadas quanto dependncia micorrzica em facultativas, obrigatrias ou no micorrzicas (Smith & Read, 1997). 12

O carter facultativo pode ser observado em condies de solo com alta disponibilidade de nutrientes, onde plantas no necessitam de FMA. Nestas condies a simbiose inibida atravs de mecanismos genticos controlados pela planta (Lambais & Mehdy, 1998; Lambais, 2000; Lambais et al., 2003). Neste caso o hospedeiro perde C ao micobionte de maneira desnecessria. Como exemplo pode-se mencionar Brachiaria decumbens. Esta espcie adaptada a solos com baixos nveis de nutrientes disponveis. B. decumbens tem um sistema radicular bem desenvolvido, contudo no suficiente o bastante para absorver Pi em condies de baixa disponibilidade comuns em solos Brasileiros (Figura 4). Espcies facultativas usualmente se beneficiam da simbiose apenas em situaes onde a fertilidade baixa. Elas em geral apresentam um sistema radicular bem desenvolvido e altas taxas de crescimento, caso tpico de gramneas.

Figura 4 Resposta de uma espcie micorrzica facultativa, a gramnea forrageira Brachiaria decumbens, inoculao com Glomus clarum CNPAB5 em solo sem adio de fertilizante fosfatado. Vasos da esquerda inoculados e os da direita no inoculados (de Souza, no publicado). Outras espcies vegetais desenvolvem obrigatoriamente AM para poderem completar seu ciclo (Amijee et al., 1993; Peng et al., 1993; Johnson et al., 1997). Plantas micorrzicas obrigatrias no crescem na ausncia de fungos MA em nveis normais de

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disponibilidade de nutrientes. Como exemplo temos a leguminosa arbrea nativa da regio amaznica, tax-dos-campos, (Sclerolobium paniculatum) (Figura 5). Esta caracterstica encontrada com frequncia em espcies nativas de solos de baixa fertilidade natural como em boa parte dos solos brasileiros (Siqueira & Saggin-Junior, 2001). Nestes solos, demonstrou-se que inmeras espcies vegetais so incapazes de absorver fsforo na ausncia da MA, como mandioca e batata-doce (Sieverding, 1991; Paula & Siqueira, 1992).

Figura 5 Resposta de uma espcie micorrzica obrigatria, a leguminosa arbrea taxdos-campos (Sclerolobium paniculatum), a inoculao com o fungo Glomus clarum

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CNPAB5 em diferentes nveis de adubao com fsforo. No painel superior plantas no inoculadas e inferior plantas inoculadas. Esta leguminosa apenas se desenvolve na ausncia de fungos MA quando a disponibilidade de P alta, que no ocorre naturalmente nos solos da regio amaznica. (Teles, de Souza e Faria, no publicado).

Plantas que no desenvolvem MA apresentam um sistema radicular bem desenvolvido com muitas razes finas e pelos radiculares. Apesar disso, so plantas ruderais que se desenvolvem, em geral, em solos com altos nveis de nutrientes disponveis apresentando baixa competitividade em solos pobres em fsforo. A colonizao nestas plantas inibida devido incompatibilidade gentica que impede ao fungo ultrapassar as primeiras camadas radiculares. Hifas chegam a produzir haustrios buscando ultrapassar a epiderme, o que no conseguem (Allen et. al., 1989). Provavelmente existem dificuldades estruturais, ou defesas qumicas que impedem a colonizao uma vez que o fungo consegue produzir haustrios. Como exemplo pode-se mencionar as famlias Juncaceae, Caryophyllaceae e Brassicaceae. importante mencionar que a dependncia micorrzica de uma planta varia com a espcie de fungo inoculada, para uma mesma planta a resposta pode variar desde levemente negativa at altamente positiva (Sieverding, 1991). Assim, por parte do simbionte autotrfico, existem excees quanto ao mutualismo da simbiose. Portanto, strictu sensu, micorrzas so associaes simbiticas porm nem todas mutualistas. A dinmica entre mutualismo e parasitismo na simbiose micorrzica, por sinal, tem sido apontada como um dos mecanismos que facilitam a coexistncia de plantas e a diversidade florstica em ecossistemas naturais (van der Heijden et al., 1998a; van der Heijden et al., 1998b); van der Heijden and Kuyper 2003). Como resultado destes mltiplos nveis de dependncia da

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planta ao fungo micorrzico, a associao acaba por influenciar na modelao da estrutura da paisagem sendo um dos componentes definidores da diversidade de espcies vegetais e da produtividade primria. Inversamente, plantas influenciam na diversidade e abundncia da comunidade FMA. Modificaes ambientais como na fertilidade, em especial na oferta de N, tambm alteram a estrutura da comunidade de fungos micorrzicos (e plantas), induzindo a predominncia de espcies cujos esporos apresentam pequenas dimenses, como os Glomus, bem como na reduo da abundncia e riqueza de espcies. Assim, a estrutura da comunidade FMA um importante indicador da qualidade ambiental bem como de alteraes climticas como as causadas por precipitaes cidas e ricas em xidos de N (Jeffries & Barea 2001; Corkidi et al., 2002). Voltaremos a estes temas no item 5. 3. CARACTERSTICAS GENTICAS E MORFOLGICAS 3.1 Aspectos genticos Como j mencionado, FMA s completam seu ciclo de vida quando associados plantas compatveis. Esta caracterstica esperada em simbioses altamente evoludas. Provavelmente estes fungos seguem um ciclo reprodutivo assexual (Rosendahl & Taylor, 1997) formando esporos grandes, em relao a outros grupos de fungos, variando de 22 a 1050 m em dimetro (Perez & Schenck, 1990). Os esporos so multinucleados e podem apresentar centenas a milhares de ncleos. Evidncias moleculares indicam que o fungo haplide havendo controvrsias sobre o seu carter homo ou heterocaritico (Hijri & Sanders, 2004; Hijri & Sanders, 2005; Pawlowska & Taylor, 2004). Ambas situaes podem ser esperadas se o fungo seguir um ciclo parasexual de recombinao. O ciclo parasexual caracterizado pela ocorrncia de anastomose seguida de troca de ncleos entre fungos geneticamente distintos mas que apresentem compatibilidade

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vegetativa. Este processo resulta em um miclio contendo ncleos geneticamente distintos (heterocaritico). No entanto, a heterocariose uma condio instvel onde, em geral, ncleos diferentes se fundem formando um ncleo diplide o qual, para retornar condio haplide, devem sofrer perdas cromossomais (Schardl & Craven, 2003). Recentemente, evidncias da ocorrncia de recombinao parasexual em fungos do gnero Gigaspora foram encontradas (de Souza et al., 2005a). Alm disso outros estudos de recombinao j tinham sido relatadas (Pawlowska & Taylor, 2004) indicando que estes fungos apesar de se multiplicarem clonalmente, desenvolveram mecanismos de recombinao que operam durante o crescimento somtico. A elucidao destes mecanismos de fundamental importncia para que possamos compreender processos de evoluo, especiao e adaptao destes fungos. Recentemente, foi caracterizado o tamanho, a complexidade e a ploidia do genoma de trs espcies de fungos MA, Glomus intraradices, Glomus etunicatum e Scutellospora castanea (Hijri & Sanders, 2004; Hijri & Sanders, 2005). Todas as espcies estudadas apresentaram condio haplide e o tamanho aproximado do genoma foi respectivamente 17, 37, e 795 Mb. A grande diferena entre o tamanho do genoma das espcies de Glomus para a Scutellospora castanea se deve a uma grande quantidade de seqncias repetidas: 58% do genoma em contraste com 1,6% em G. intraradices. O genoma do fungo G. intraradices est sendo seqenciado, resultados preliminares indicam que o fungo apresenta aproximadamente 30% contedo GC e presena de pequenos introns entre genes (Shachar-Hill (comunicao pessoal).

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3.2 Morfotipos O miclio dos fungos micorrzicos dimrfico e no septado, ou coenoctico (Perez & Schenck, 1990). Septos quando presentes indicam que o miclio esta senescente. Apesar de cerca de 80% das plantas superiores formarem MA, as associaes se distinguem morfologicamente em apenas dois tipos: o Paris e o Arum. Estes termos advm do fato do primeiro grupo ter sido reconhecido h cerca de 100 anos, na espcie vegetal Paris quadrifolia enquanto o segundo em Arum maculatum (Dickson 2004). No tipo Arum a hifas crescem intercelularmente, de maneira linear e longitudinal ao longo do espao cortical formando estruturas finas e muito ramificadas nas clulas, os arbsculos (Figura 6). No tipo Paris, hifas mais grossas, enovelam-se intracelularmente, desenvolvendo hifas arbusculares (Figura 7). As estruturas arbusculares so similares para ambos os morfotipos enquanto que, funcionalmente, sugere-se que em hifas enoveladas tambm possam ocorrer deslocamento de fosfato ao hospedeiro. Ao que parece, estas estruturas so definidas pela planta (Gerdeman, 1965; Bedini et al., 2000; Ahulu et al., 2005; van Aarle et al., 2005) apesar de Cavagnaro et al. (2001) terem observando a mesma espcie vegetal, mas colonizada por 6 diferentes espcies de FMA, formava tanto arbsculos do tipo Arum como Paris.

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Figura 6 - Colonizao tipo Arum hifas se desenvolvem intercelularmente, de maneira linear e longitudinal ao longo do espao cortical formando estruturas finas e muito ramificadas nas clulas, os arbsculos (Fotografia gentilmente cedida por Dr. Larry R. Peterson, University of Guelph, Canada).

Figura 7 - Colonizao micorrzica tipo Paris com hifas mais grossas, enovelam-se intracelularmente (Fotografia gentilmente cedida por Dr. Larry R. Peterson, University of Guelph, Canada).

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Diversos levantamentos tm registrado que espcies anuais e a maioria das perenes apresentam morfotipo Arum, como no extenso levantamento realizado por Santos et al., (2000) com monocotiledoneas da Regio Nordeste do Brasil. Sugere-se portanto que este tipo esteja mais presente em espcies vegetais de rpido crescimento pelo fato destas plantas apresentarem taxas de crescimento, e de colonizao micorrzicas, mais altas (Brundrett and Kendrick 1990). Assim, FMA seriam capazes de acompanhar o crescimento das razes com um elevado custo energtico para estas. Plantas com taxas de crescimento menor, apresentariam a predominncia do morfotipo Paris apesar de Breuninger et al. (2000) terem encontrado em Araucria angustifolia o morfotipo Arum. Existem espcies intermedirias, que apresentam os dois tipos, conforme relatado em Anandenantera peregrina, o angico do cerrado (Gross et al., 2004). O mais provvel que ocorra um continuum nas estruturas fngicas de Arum para Paris em uma mesma planta (Dickson 2004). Como pouco se conhece dos aspectos funcionais envolvidos em ambos os tipos, sugere-se que em estudos de identificao da colonizao, tente-se, para futuras referncias, determinar o morfotipo do fungo e no apenas a presena ou ausncia da simbiose, ao longo dos estdios sucessionais do hospedeiro (Figura 8).

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8 Nmero de plantas

Tipo de crescimento Ca Pe rs du ist Pe ci en re f ne te lia

T ipo: Arum Paris Intermedirio Ausente

0 Pioneiros S ucesso inicial S ucesso tardia

A nu al

0% 20% 40% 60% 80% 100 % Proporo de espcies de plantas

Grupos de sucesso

Figura 8 Diagrama sugerindo a distribuio dos morfotipos de FMA entre tipos de espcies vegetais e sua sucesso, de acordo com Ahulu et al., 2005. 3.3 Hifas extraradiculares

O comprimento de hifas extraradiculares expresso por unidade de massa ou volume do solo ou ainda por unidade de comprimento de raiz colonizada. A extenso e impacto das FMA sobre o volume do solo varia principalmente com as caractersticas radiculares e de textura do solo sendo que razes mais finas tendem a induzir maiores comprimentos de hifa (Figura 7). Por exemplo em razes de Lolium perene (monocotiledonea com razes fibrosas e nveis elevados de colonizao micorrzica), observou-se 14 metros de hifas (m) de FMA . g solo-1 mas apenas 1 m hifas . m de raiz colonizada-1. Por outro lado, razes de Trifolium repens (leguminosa trevo, com razes bem mais grossas) induziu a produo de 3 m de hifas. g de solo-1 e 46 m hifas. m de raiz colonizada-1 (Tisdall & Oades, 1979). Normalmente, em condies de campo, observa-se

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maiores valores de hifas em solos sob pastagem bem conduzidas onde a perturbao mnima e o solo est coberto permanentemente.

Figura 9 Raiz de Trifolium repens colonizada por Gigaspora margarita. Barra 250 m. (fotografia de Souza, no publicada).

Para fungos ectomicorrzicos, devido s dificuldades em distinguir-se suas hifas das de fungos saprofticos, os resultados obtidos so incertos variando de 30-8000 m hifas . m-1 raiz ou 3 600 m. g solo-1. Finlay & Soderstrom (1989) encontraram, a partir de correlaes entre micomassa e respirao, valores de 200 m. g solo-1 sob floresta de conferas o que um valor mdio em relao aos determinados em microcosmos (Leake et al., 2001). De qualquer forma, pelas caractersticas do fungo ectomicorrzico que graas a sua exuberante micomassa desloca maiores quantidades de C da planta que FMA, os valores devem ser superiores aos encontrados para FMA.

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4. CLASSIFICAO E NOMENCLATURA A taxonomia deste grupo de fungos vem sendo alterada significativamente. Gerdemann & Trappe (1974) propuseram a primeira classificao dos fungos MA. Estes pesquisadores utilizaram parmetros morfolgicos para agrupa-los na ordem Endogonales (Zigomicota), gnero Endogone. Posteriormente, Morton & Benny (1990) utilizaram cladstica para analisar parmetros morfolgicos e formular uma nova classificao, onde os fungos MA foram reclassificados em uma nova ordem chamada Glomales, composta por duas sub ordens Glominea e Gigasporineae. Esta ordem exclua o gnero Endogone que forma ectomicorrizas. No entanto, o filo Zigomicota no refletia adequadamente a filogenia dos fungos MA. Em 1998, Cavalier-Smith criou a classe Glomeromicetos para englobar os fungos MA dentro do filo Zigomicota. Morton (1999) lanou uma hiptese na qual os fungos MA teriam uma origem polifiltica, contrariando evidncias moleculares que indicavam claramente que os fungos MA constituam um grupo monofiltico e que Acaulosporaceae era filogeneticamente prxima famlia Gigasporaceae e no a Glomeraceae (Simon et al., 1993a; Simon 1996). Morton e colaboradores, com base na anlise filogentica de seqncia de DNA da sub unidade menor do gene ribossomal (SSU rDNA), verificaram que seqncias pertencentes a espcies do gnero Sclerocystes agrupavam junto com espcies de Glomus. Estes autores reclassificaram ento todas as espcies descritas como Sclerocystes para o gnero Glomus (Morton et al., 2000). No ano seguinte, Morton & Redecker (2001) propuseram duas novas famlias (Paraglomeraceae e Archaeosporaceae, e seus respectivos gneros Paraglomus e Archeospora) com base em caracteres morfolgicos e moleculares (SSU rDNA). Estas famlias so consideradas linhagens ancestrais dos fungos MA. No

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mesmo ano, Schwarzott et al. (2001) propuseram, com base na anlise filogentica de seqncia do SSU rDNA, a polifilia do gnero Glomus, o gnero com maior nmero de espcies descritas. Estes autores agruparam as espcies do gnero Glomus em trs grupos denominados A, B e C. Espcies no grupo C foram posteriormente reclassificadas para o gnero Diversispora (Walker et al., 2004) Ainda em 2001, Schler e colaboradores (2001) propuseram, com base na anlise filogentica de seqncia SSU rDNA, a criao do filo Glomeromicota, o qual agrupa todos os fungos MA e o fungo Geosiphon pyriformis (Tabela 1). Esta anlise confirma que os fungos MA formam um grupo monofiltico e sugere que estes fungos compartilham o mesmo ancestral que os Basidiomicetos e Ascomicetos, e no com Zigomicota que forma um grupamento artificial. Recentemente, a famlia Pacisporaceae e o gnero Pacispora foram propostos (Oehl & Sieverding, 2004) com base em uma nova descrio da espcies Glomus scinthillans e da descoberta de novas espcies com caractersticas morfolgicas similares (Walker et al., 2004), com aspectos de Glomoides (vesculas e hifa de sustentao) e com caractersticas encontradas em Acaulosporaceae e Scutellospora (paredes internas flexveis e escudo de germinao ou orbe). Estas evidncias morfolgicas fortaleceram a criao da ordem Diversisporales que foi criada exclusivamente com base na anlise filogentica do SSU rDNA. Ela indica que caractersticas ligadas presena de paredes flexveis e estrutura de germinao com formao de escudo ou orbe, so homologas entre Pacispora, Acaulosporaceae (Acaulospora e Entrophospora) e Scutellospora. Buscando evidncias, de Souza e colaboradores fizeram uma avaliao filogentica do gnero Scutellospora comparando resultados da anlise filogentica baseada em seqncias do SSU rDNA com a anlise morfolgica baseada no padro de desenvolvimento ontognico de esporos. A anlise indicou que para algumas espcies o padro morfolgico no coincide com o 24

molecular, ou seja, espcies com padro de paredes similares agruparam separadamente na anlise molecular. Este resultado sugere que apesar destas caractersticas morfolgicas serem teis para diferenciar espcies os agrupamentos feitos com base nestes critrios podem no ser adequados para reconstruir a filogenia deste grupo (de Souza et al., 2005b). Por outro lado, a anlise filogentica baseada em um s gene tambm deve ser analisada com cuidado, visto que a evoluo de genes nem sempre segue o processo de especiao. No caso dos fungos MA a anlise de outros genes como beta tubulina (Corradi et al., 2004), fator de elongamento alfa 1 (Helgason et al., 2003), tem comprovado o carter monofiltico dos fungos MA, mas a posio do grupo ainda continua incerta. A anlise parcial do Fator de elongamento 1 alfa aponta os Zigomicota como grupo irm (Helgason et al., 2003). J Corradi e colaboradores verificaram que pela anlise dos genes da Beta tubulina, Glomeromicota se coloca como um grupo prximo ao Chitridiomicota, que engloba linhagens ancestrais dos fungos. Atualmente o projeto AFToL (Assembling the Fungal Tree of Life, Lutzoni et al., 2004) est sequenciando um conjunto de genes cromossomais e mitocondriais de representantes de todos os grupos de fungos conhecidos visando aprimorar a filogenia dos fungos.

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Tabela 1. Ordens, famlias e gneros pertencentes diviso Glomeromycota e distribuio de espcies por gnero. Nmero de Ordem Diversisporales Famlia Diversisporaceae Gigasporaceae Pacisporaceae Acaulosporaceae Glomerales Archaeosporales Paraglomerales Total: 4 Glomeraceae Archaeosporaceae Geosiphonaceae Paraglomeraceae 8 Gneros Diversispora Gigaspora Scutellospora Pacispora ** Acaulospora Entrophospora Glomus *** Archaeospora Geosiphon**** Paraglomus 10 espcies descritas * 3 7 32 7 33 5 104 3 1 2 197

(*) O nmero total de espcies inclui sinonmias. (**) Recentemente a famlia Pacisporaceae e o genero Pacispora foram propostos para acomodar espcies semelhantes Glomus, bem como novas espcies que partilham germinao e caractersticas internas da parede e apresentam aspectos moleculares que as vincula a espcies de Scutellospora e Acaulosporaceae (Oehl & Sieverding, 2004; Walker et al., 2004). Pacispora foi descrita na famlia Glomeraceae (Oehl & Sieverding, 2004), e reclassificado na ordem Diversisporales, com base em resultados morfolgicos, citolgicos e moleculares (Walker et al., 2004). (***) O gnero Glomus polifiltico e foi dividido em Glomus grupos A, B e C (Schwarzott et al., 2001). Glomus grupo C pertence agora ao gnero Diversispora, ordem Diversisporales.

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(****) Geosiphon no forma micorriza arbuscular. Esta espcie estabelece simbiose mutualstica com cianobactrias, sendo considerada uma possvel precursora da simbiose micorrzica. A taxonomia molecular tem sido muito til para elucidar a filogenia dos fungos MA ao nvel de sub-gnero ou nveis superiores. No entanto, pouco tem sido feito para a diferenciao de espcies. Isto se deve principalmente a dificuldades em se multiplicar o fungo em cultura pura. O sistema tradicional de vasos de cultivo no garante a ausncia de contaminantes em esporos que podem ser de outros fungos como Ascomicetos (Schler, 1999; Fonseca et al., 2001) ou mesmo outros fungos MA. Alm disso, vrias bactrias so comumente encontradas no citoplasma de fungos MA. Inclusive reconhecida uma endosimbiose entre bactrias do gnero e espcie nova Candidatus Glomeribacter gisporararum e esporos de diversas espcies da famlia Gigasporaceae (Bianciotto et al 2003). Outra caracterstica que dificulta a anlise de fungos MA ao nvel de espcies o alto grau de polimorfismo entre genes encontrados em um mesmo fungo (esporo). Recentemente esta caracterstica foi utilizada para diferenciar espcies ou at isolados do gnero Gigaspora, parece ser promissora para diferenciar espcies de outros gneros tambm (Figura 8, de Souza dados no publicados).

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Figura 10 Identificao de espcies de Gigaspora atravs da diferenciao do polimorfismo inter e intra especfico entre cpias do rDNA pela tcnica do PCRDGGE (Denaturing Gradiente Gel Electrophoresis). Dendrograma mostrando a similaridade (Jaccard - UPGMA) entre perfis de bandas de PCR-DGGE de 48 estirpes de Gigaspora e dois perfis divergentes encontrados em esporos das culturas das estirpes Gi. albida CL151 e Gi. margarita UFLA36. A escala indica a similaridade entre os perfis de bandas, e linhas tracejadas indicam separao entre os grupamentos principais, barra nos grupamentos indica faixa de erro. Nmeros indicam o fator cofentico de correlao (Modificado de Souza et al., 2004). 5. Fungos MA como determinantes da diversidade de plantas 28

Estudos conduzidos em condies controladas indicam que a resposta em crescimento da planta inoculada depende da compatibilidade gentica e funcional entre a espcie vegetal e a estirpe do fungo utilizada, bem como das condies ambientais vigentes, como tipo de solo, pH e disponibilidade de nutrientes em especial o P. Alm destas variveis, em condies naturais onde mais do que uma espcie de fungo coloniza simultaneamente razes da planta hospedeira, os benefcios da simbiose micorrzica dependero da comunidade de fungos presentes e da competio que se estabelece entre eles conforme discutido na Figura 9.

Planta A

Planta B

Fungo a

Fungo b

Figura 11 - Coexistncia hipottica entre duas espcies de plantas, uma com folhas escura (A) e a outra com folhas claras (B). O fungo a favorece o crescimento da planta A que passa a dominar a comunidade vegetal. Assim manejos que favoream a manuteno do fungo a promovero a excluso da planta B (Modificado de van der Heijden 2001).

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Um experimento clssico conduzido em microcosmos por Marcel van der Heijden e colaboradores ilustra bem os efeitos deste tipo de interao sobre o desenvolvimento de comunidades de plantas. Para conduo do experimento foram isolados quatro espcies de fungos MA e 11 espcies de plantas autctones de uma pastagem temperada em solo calcreo na Europa. A manipulao da diversidade de fungos MA resultou em profundas modificaes na diversidade da comunidade de plantas enquanto os tratamentos com maior diversidade fngica resultaram tambm em maior diversidade de plantas (van der Heijden et al., 1998a). Em sntese, fungos micorrzicos arbusculares causam impactos que vo desde suas relaes com plantas (processos de absoro de nutrientes), com comunidades vegetais (influenciando em sua diversidade e abundncia) e finalmente, com processos relacionados estabilidade de ecossistemas, ao participarem de forma ativa e significante na dinmica do C e agregao do solo, conforme ainda enfatizaremos neste captulo. Assim, percebida no apenas na perspectiva da planta, mas do solo em suas mltiplas relaes, MA so hoje reconhecidos como um componente integral e fundamental na construo e estabilidade de ecossistemas de todo o planeta (van der Heijden et al., 1998a; van der Heijden et al., 1998b; van der Heijden et al., 2003). 6. MICORRIZAS E A DINMICA DO CARBONO O ciclo do carbono orgnico do solo um componente fundamental de ecossistemas terrestres sendo um dos elementos reguladores dos fluxos de gases entre a biosfera e a atmosfera. Os principais elementos definidores da magnitude e rapidez deste ciclo so a relao entre a produtividade primria e a distribuio do carbono entre a parte area e as razes, com os processos de mineralizao e imobilizao (Brady, 1989). Um dos 30

indicadores utilizados para determinar-se a eficincia deste processo a biomassa microbiana e sua atividade. O quanto de C drenado direta ou indiretamente da atmosfera pelas funes microbianas incerto mas certamente depende de variveis como o a estrutura da cobertura vegetal, manejo, quantidade e qualidade da matria orgnica adicionada, clima e fatores edficos. No por acaso, as mesmas variveis que regulam a abundncia, riqueza e atividade de FMA (Lovelock & Ewel, 2005). Fungos micorrzicos so um importante componente do ciclo do C no solo devido a sua direta influncia sobre: (a) a produtividade primria graas ao seu impacto na absoro de nutrientes e gua por plantas; (b) a estabilidade de agregados do solo e; (c) por sua imensa biomassa e produo de Glomalinas (Zhu & Miller, 2003) protenas de alta estabilidade produzida por hifas de FMA conforme discutido no prximo item. Apesar do impacto evidente, poucos so os estudos, em especial em sistemas tropicais, sobre o papel destes organismos no ciclo do C. Fungos micorrzicos so fontes (graas a sua respirao e a de aumentos na taxa respirao da raiz colonizada) ou, bem mais provvel, dreno (devido sua imensa biomassa, produo de glomalinas e modificaes na produtividade primria) de C da atmosfera? Em qual escala e como este balano pode ser mediado pelo ambiente e manejo? Estudos diversos usando 14C tm demonstrado que fotossintetatos so deslocados da parte area s hifas poucas horas aps este elemento ter sido marcado (Bucking & ShacharHill, 2005). Estes resultados confirmam que FMA so dreno importante de C da planta podendo impor perdas de at 20% do C fixado pelo simbionte autotrfico. Como resposta da planta ao dreno imposto pelo sistema micorrzico, ocorrem aumentos significativos de sua taxa fotossinttica ocasionando aumentos no potencial da produtividade primria e dreno de C da atmosfera (Jakobsen et al., 2002). Estima-se que, globalmente, FMA possam 31

ser responsveis pelo dreno anual de 5 bilhes de toneladas de C aos solos (Bago et al., 2000). As consequncias deste fenmeno so ainda desconhecidas, seja nas propriedades do solo, seja em escala global, nas relaes referentes s mudanas globais e o papel desta simbiose no sequestro de C da atmosfera. Pode-se especular sobre a necessidade em ampliar-se as linhas de investigao das AM para alm de seus aspectos nutricionais. Fungos micorrzicos podem portanto serem considerados canais de drenagem do C da atmosfera para o solo, via planta, por terem acesso direto fontes de carbono da planta. Esta caracterstica os diferenciam de boa parte dos microorganismos saprfitas que adquirem acares (energia) a partir de fontes diversas e espacialmente limitadas. Estes organismos so energizados por uma quantidade e qualidade de fontes orgnicas praticamente ilimitadas, desde que haja plantas metabolicamente ativas sendo colonizadas. Esta vantagem competitiva lhes confere uma significativa parcela da biomassa microbiana presente no solo (Bago et al., 2000; Graham 2000). Entretanto, alguns mtodos tradicionais de quantificao da biomassa microbiana baseada na tcnica de respirao induzida pelo substrato no conseguem detectar essa imensa contribuio micorrzica por duas razes: Os mtodos discriminam contra a deteco da biomassa micelial. Isso porque a tcnica da respirao induzida (Anderson & Domsch, 1978) aplicada amostras de terra destorroadas e peneiradas. Neste processo hifas micorrzicas so fragmentadas e suas coneces s plantas, ou seja, sua nica fonte de C, destrudas. Como consequncia, a induo por adio de sacarose ao substrato indiferente ao fungo uma vez que este incapaz de mobilizar aucares que no sejam os deslocados por plantas. Desta maneira, como FMA no conseguem mobilizar fontes externas de aucares, sendo dependentes obrigatrios da planta para este fim, o mtodo subestima a contribuio fngica;

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Os mtodos de fumigao Voroney & Winter (1993), da mesma forma, apenas conseguem detectar a atividade de FMA se as anlises forem realizadas aps poucas horas da coleta. A insensibilidade destes mtodos em detectar a biomassa de hifas de FMA intactas, coloca em dvida os resultados quantitativos obtidos para biomassa microbiana (Leake et al., 2004) e os cuidados em se considerar este atributo como indicador da fertilidade biolgica do solo. Apenas hifas extraradiculares podem contribuir com at 30% da biomassa total do solo em sistemas agropastoris (Hamel et al., 1991; Miller & Kling, 2000; Olsson & Wilhelmsson, 2000). Os valores de biomassa microbiana encontrados na literatura provavelmente esto subestimados. A biomassa de fungos micorrzicos, no deve ser desconsiderada. Apesar de boa parte do C transferido ao fungo retornar atmosfera via respirao, cerca de 25% deste C pode ser acumulado apenas no miclio extraradicular o qual pode representar 90% da biomassa de hifas do FMA (Olsson et al., 1999). O miclio intraradicular por sua vez, corresponde a 3-20% do peso das razes (Smith & Read, 1997). Considerando-se a biomassa micelial, desconsiderando-se esporos, vesculas ou clulas auxiliares, podem ser encontrados valores de biomassa prximos aos do prprio sistema radicular. Extenses superiores a 70 m de hifas por grama de solo j foram registrados em solos sob pastagem. Em solos tropicais estes valores so em geral menores (30-50 m hifas g-1 solo) talvez devido maior taxa de ciclagem ou acidez (van Aarle et al., 2002; 2003). Considerando-se que mais de 50% do comprimento de hifas no solo advenham de fungos micorrzicos (Rillig et al., 2002), correspondendo a 0,03 0,5 mg g-1 em peso seco de hifas extraradiculares, conclumos que FMA representam uma grande e funcionalmente significativa parcela da biomassa microbiana, podendo, apenas as hifas extraradiculares, chegar a 1 33

tonelada ha-1, considerando-se os 20 cm iniciais do perfil. Ainda mais, se o solo no for perturbado e os agregados mantidos intactos, a meia vida de hifas, ricas em quitina, uma molcula recalcitrante e de difcil decomposio, pode chegar a 25 anos (Rillig et al., 2001). Hifas so, portanto, um importante reservatrio de C no solo, ainda no incorporados nos estudos de sua ciclagem. Outro dreno no desprezvel, so os prprios esporos. Em condies controladas, em placas de Petri contendo razes transformadas, pode-se observar mais de 40.000 esporos (ver Figura 3). Portanto, no existe constrangimento, sob o ponto de vista gentico (da planta ou do fungo), na produo de imensas quantidades de propgulos fngicos. Como de 45% a 95% do pool de C em esporos constitudo por lipdeos, pode-se concluir que estas estruturas so potencialmente um importante dreno de C garantido pelos simbiontes autotrficos em algumas situaes ainda mais significantes que o encontrado em hifas (Bago 2000).

6.1 Glomalina A contribuio das hifas extraradiculares no se limita sua biomassa ou aumentos na capacidade de plantas em mobilizar nutrientes. Estas so caractersticas clssicas e fundamentais na simbiose micorrzica. Entretanto, o miclio externo tambm responsvel pela exsudao (ou incorporao em suas paredes celulares bem como de esporos) de glicoproteinas hidrofbicas chamadas glomalinas. Estas protenas muito provavelmente so produzidas por FMA uma vez que em sua ausncia, glomalinas no so encontradas (Leake et al.,2004). Elas apresentam alta estabilidade no solo podendo permanecer 42 anos at sua mineralizao completa, perodo bem superior aos de hifas, que no ultrapassa 5-7 dias (Rillig et al., 2001; Zhu & Miller, 2003) ou razes que variam de 10 34

dias at morte da planta arbrea (Fitter & Moyersoen, 1996). Glomalinas constituem-se em um importante componente do Corg do solo podendo atingir 1.45 Mg C.ha-1 em florestas tropicais apenas nos 10 cm do perfil, se estabilizando em geral na frao argila (Lovelock et al., 2004). A funo das glomalinas incerto, entretanto provvel que elas tenham impacto sobre a construo de nichos ao promover a agregao do solo e sua estruturao com a consequente reduo dos processos erosivos. Desta forma, apesar de estudos de hifas fngicas intraradiculares absorverem maior ateno graas a sua maior facilidade e ao interesse nos mecanismos de transferncia de nutrientes, so as hifas extraradiculares que atuam diretamente sobre atributos relacionados qualidade do solo, entendida como expresso de um conjunto de processos que estimulam ganhos de produtividade sem prejuzo das funes nele realizadas, conforme diagrama da Figura 10. Isso porque, como j mencionado, estas estruturas ultrapassam em muito o espao rizosfrico, mobilizam nutrientes para bem alm da zona de depleo, produzem uma srie de compostos quelantes (uma das quais, glomalinas), clulas mortas que interagem com outros organismos criando uma hifosfera com uma bem caracterstica e particular comunidade microbiana. Bactrias especficas, no encontradas na rizosfera, interagem com glomalinas ampliando o efeito rizosfrico criando uma micorrizosfera, com propriedades prprias (Vancura et al., 1990; Bomberg et al., 2003). Se, alm destas qualidades, considerarmos a influncia de hifas extraradiculares nos processos de agregao do solo, a concluso de que FMA so um fundamental indicador de qualidade de manejo e cobertura do solo, torna-se emblemtica. Considera-se a agregao do solo como a forma em que partculas e poros se distribuem no solo. Ela influenciada pela ao da biota (em especial bactrias e fungos em geral) e atividade de cargas superficiais em um contexto de secagem e humidecimento do 35

solo (Brady, 1989). O papel dos FMA, em particular, no , via de regra, considerado ou menos ainda, dimensionado. No sabemos qual sua contribuio neste processo: secundrio ou absolutamente fundamental? Alguns estudos indicam que a importncia de FMA similar ao das razes enquanto outros apontam que hifas extraradiculares so o elemento mais importante dentre todos os que atuam neste processo com bvias implicaes na capacidade de armazenamento de gua (Thomas et al., 1993; Jastrow et al., 1998). Se assim, quais so os mecanismos que permitem ao FMA esta ao, tanto sobre a agregao quanto sobre sua estabilidade? Provavelmente so dois: um fsico, com hifas extraradiculares envolvendo e enovelando partculas minerais e orgnicas do solo e, outro, quelante, graas ao de glomalinas. Em estudos realizados em um gradiente de textura e classes de solos, comprovou-se que existe forte e positiva correlao entre estabilidade de agregados com a quantidade de glomalinas no solo (Wright & Upadhyaya, 1998). Percebeu-se tambm que estas protenas ficam estocadas dentro destes agregados, protegidos ento dos processos de mineralizao. Desta forma, glomalinas representam uma forma estvel de armazenar C no solo (Rillig 2004). Pelo exposto, clara a necessidade de criar-se condies que apontem para o aumento da produo destes metablitos. Sabe-se que o manejo (em especial a mecanizao), a diversidade da cobertura vegetal alm de variveis fsicas e qumicas do solo, controlam a produo de glomalinas. Sistemas que estimulem a produo de hifas extraradiculares devem tambm induzir a sntese destas molculas apesar de resultados iniciais serem contraditrios (Piotrovsky et al., 2004). Em solos agrcolas, a quantidade de glomalina detectada baixa em relao aos encontrados sob pastagem ou florestas. Isso porque com o revolvimento e compactao do solo, a rede micelial destroada e, com isso, a produo de glomalinas diminui drasticamente (Figura 10). 36

Figura 12 - Diagrama indicando as mltiplas funes desempenhadas pelos FMA, seja sobre funes do solo, seja sobre a comunidade de espcies vegetais (Zhu & Miller 2003).

Existe necessidade de ampliar-se os estudos em condies tropicais sobre o impacto destas glicoproteinas sobre o pool do C, agregao e estabilidade, bem como da relao glomalina FMA, ainda no definida.

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7. NUTRIO MINERAL Daremos nfase na nutrio fosfatada pelo seu maior impacto sobre plantas hospedeiras apesar de estudos com inoculao com FMA tambm ocasionarem, via de regra, aumentos tanto na taxa de crescimento como nos nveis de Cu, Mg e Zn, no por acaso, todos elementos pouco mveis no solo. Micorrzas arbusculares so reconhecidas por sua habilidade em estimular o crescimento de plantas principalmente atravs do incremento na absoro de nutrientes em geral, P em especial. Ryan e colaboradores (2003) identificaram nveis elevados de nutrientes em hifas intraradicais. Os nveis de P variaram de 60 170 mM, apesar de valores como 600 mM terem sido detectados. Estes valores correlacionaram-se fortemente com os de K, com cerca de 350 mM, e Mg, com 175 mM. Muito pouco Ca foi detectado. Os nveis de P em arbsculos ativos variou de 30 50 mM enquanto os nveis de potssio foram de 100 mM. Estes elevados valores so muito superiores aos encontrados em solos ou mesmo em tecidos vegetais, confirmando a capacidade de FMA na absoro e acumulao de elementos minerais. Fsforo um macronutriente presente no solo em baixas concentraes, normalmente em nveis inferiores a 1 M de fsforo disponvel, e pouco mvel em solos intemperizados, como so os tropicais. So nestas condies que as AM assumem um papel determinante na sobrevivncia de diversas espcies vegetais, incapazes de mobilizar este elemento. No que FMA no absorvam nitrognio por exemplo. Absorvem e em nveis superiores aos de P (Gamper et al., 2004). Entretanto, a planta no necessita do FMA para sua nutrio nitrogenada pois seu prprio sistema radicular capaz de absorve-lo, visto que apresenta grande mobilidade no solo. Alm disso, P um nutriente estrutural na constituio de cidos nucleicos, fosfolipdeos bem como de diversas enzimas (Lehninger

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et al., 1989). Est envolvido diretamente nos processos de fosforilao e portanto no metabolismo energtico, na transduo de sinais e regulao da atividade celular. Sua falta ocasiona significante declnio no contedo de ATP (-74%) e ADP (-91%) bem como dos nveis de enzimas (Duff et al., 1989). Portanto, a manuteno da homeostasis celular deste elemento central para organismos em geral e plantas tropicais desenvolvidas em solos de baixa fertilidade em particular. Como a taxa de absoro e transporte de Pi por razes maior que sua taxa de difuso no solo, uma zona de depleo formada, resultando em uma zona de esgotamento para este elemento ainda no ambiente rizosfrico. Desta forma, a planta, em sua evoluo, desenvolveu mecanismos de captura deste elemento para alm desta zona, atravs das MA (Figura 11). Os aumentos na taxa de absoro do P propiciados pelas MA podem ser atribudos a: Aumento do volume de solo explorado pelas hifas extra-radiculares do fungo arbuscular; O pequeno dimetro da hifa, o que a permite explorar espaos do volume do solo inatingveis pela raiz; Maiores taxas de influxo por unidade de superfcie; A formao de polifosfatos, molculas orgnicas sintetizadas pelo fungo AM ricas em P, as quais acarretam a diminuio da concentrao de P inorgnico no interior das hifas com o concomitante acumulo de P em condies de alta disponibilidade deste elemento, com sua remobilizao em condies de estresse permitindo, assim, um fluxo contnuo ao hospedeiro;

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Produo de enzimas como fosfatases que catalisam a liberao de P dos complexos orgnicos; permitindo sua absoro na forma inica pelas plantas nas unidades arbusculares (Marschner & Dell, 1994).

Figura 13 - Estrutura das hifas intra-radicular, arbsculos e vesculas, e extra-radicular com hifas ultrapassando a zona de depleo de Pi. Como se pode constatar (grfico) a taxa de absoro de Pi maior que a sua taxa de difuso no solo.

O aumento da nutrio de P em plantas colonizadas ocasionar ento: (a) aumentos no crescimento e atividade fotossinttica; (b) aumentos na taxa de transferncia de carboidratos para as razes e (c) aumentos no seu efluxo ao apoplasto, em direo ao dreno imposto pelo fungo micorrzico (Bucking & Shachar-Hill, 2005). Devido ao aumento da absoro de P (e em menor escala Zn), o pH da rizosfera normalmente cai na presena de FMA, o que leva a aumentos da solubilidade de P no solo (Mohammad et al., 2004).

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Como outros nutrientes, fosfato absorvido de forma seletiva contra um gradiente de potencial eletroqumico partindo de nveis no solo da ordem de micromolar, para mais de 1000 vezes estes valores no interior da clula. Este processo de absoro portanto energeticamente dependente dos transportadores de P (simporte) e da ao das H+-ATPases (Figura 12). Recentemente alguns destes transportadores foram identificados. Estudos realizados por Smith et al. (2003 e 2004), demonstram que os transportadores de fosfato envolvidos na sua absoro por razes, so distintos dos envolvidos pela absoro por razes colonizadas. Este resultado sugere h regulao gentica dos mecanismos de transporte de Pi em sistemas AM e que esta regulao controlada diretamente pelo fungo pois sabe-se que genes que codificam para estes transportadores, apenas so expressos na presena do fungo simbionte (Karandashov & Bucher, 2005).

Figura 14 Clulas arbusculares de Lunularia cruciata (L.) Lindb. com diagrama indicando a transferncia de fosfato (Pi) e estruturas de carbono atravs da interface micorrzica. Em circulos fechados H+-ATPases e transportadores secundrios j identificados. Circulos abertos indicam modelos hipotticos de transferncia de metablitos ou Pi (modificado de (Ferrol et al., 2002). Barra 10m. Fotografia Fonseca & Berbara, no publicada.

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Como no existe conexo simplstica entre os simbiontes, nutrientes e fosfato devem ser absorvidos via apoplasto (Rausch et al., 2001). provvel que ocorram transferncias passivas tanto de Pi como de carboidratos atravs da plasmalema de ambos os simbiontes, ao apoplasto matricial (que separa as membranas dos simbiontes) e, posteriormente, ativamente absorvidas graas a ao de bombas H+-ATPases. Modelos originais propunham o que seria mais plausvel: a existncia de transportadores acoplados de carboidratos fosfato (Schwab et al., 1991; Smith et al., 1994) apesar de Nehls et al. (2001), terem identificado transportadores independentes para P e carboidratos em associaes ectomicorrizicas. Estudos com plantas sob limitaes fotossintticas, mostram diminuies nos efeitos benficos do fungo arbuscular devido, provavelmente, competio por carboidratos (Son & Smith, 1988). Nesta linha, (Bucking & Shachar-Hill, 2005) um estudo com razes transformadas e em placas dividas, demonstrou que aumentos na oferta de carboidratos, em especial sacarose, estimulam o transporte de C atravs da interface micorrzica, em direo ao simbionte fngico. Neste momento, carboidratos diversos (monosacarideos, di-sacarideos ou poli-sacardeos), exudados pela raiz, seriam hidrolisadas por invertases presentes no apoplasto, em hexoses, principalmente, estruturas que podem ser absorvidas pelo FMA (Bago et al., 2000). Como a atividade da invertase pH dependente, deve-se incrementar a ao das H+-ATPases as quais, no por acaso, tem sua expresso genica ativada tanto pela infeco micorrzica como pela concentrao de sacarose (Blee & Anderson, 2002), de acordo com o modelo proposto na Figura 12. Provavelmente MA obtm todo o seu C do ambiente radicular, passivamente deslocado pelas razes em favor de um gradiente de concentrao. Nas razes, FMA polimerizam os aucares absorvidos, hexoses principalmente, em trealose e glicognio, estruturas encontrados em fungos em geral (Bago et al., 2003). fungo. Algumas destas 42

formas de lipdeos podem ento ser deslocadas das hifas intra para as extraradiculares. O transporte de C de hifas para a planta no tem sido reportada, sendo o transporte de C considerado unidirecional da planta para as hifas. Os Triacilglicerois (TAG) so outra das mais importantes formas em que carbono armazenado pelo fungo (Pfeffer et al., 2004). Entretanto nas hifas, ocorre um rpido fluxo citoplasmtico nos dois sentidos com deslocamento de recursos de regies fonte para regies dreno dentro no miclio fngico. Este fluxo tambm responsvel pela movimentao de organelas (Bago et al., 2002; Bago et al., 2003).

Figura 15 - Modelo de transporte de fosfato indicando stios de transferncia de entre solohifa. esquerda, graas atividade de ATPases, protons (H+) so bombeados, com gastos de energia (ATP), pela planta. O gradiente de concentrao de protons gerado por este mecanismo, cria um potencial eletroqumico atravs da membrana. Este gradiente facilita a movimentacao de Pi atravs de transportadores especficos (Pnt1) conforme indicado direita (modificado de Karandashov & Bucher, 2005).

provvel que a absoro de Pi pelo FMA e sua transferncia planta seja estimulada pela transferncia de carbono da planta para o fungo (Bucking, 2004). Frente 43

maior oferta de C, o fungo diminui a sntese de polifosfatases levando a aumentos nos nveis de Pi citoplasmticos bem como na sua incorporao em fosfolipdeos e Poli P (Viereck et al., 2004). Pi ativamente absorvido por hifas extra-radiculares e metabolizado em cidos nucleicos, fosfolipdeos e outras molculas fosforiladas, bem como condensadas em molculas de polifosfatos (poliP). Polifosfatos so polmeros ricos em fosfatos e presentes em diversos organismos, como bactrias, fungos, plantas e animais superiores (BjmBRASIL). Em fungos micorrzicos arbusculares, os poliP so armazenados em hifas intra e extraradiculares, bem como em esporos, e so centrais no metabolismo do fosfato. Aps absoro de Pi por hifas, poliP so sintetizados antes mesmo de serem detectados em vacolos (Viereck et al., 2004) denotando a importncia desta via metablica no armazenamento de fosfato em estruturas moleculares capazes de concentrar grandes quantidades de Pi. Pode-se especular que a rapidez e a quantidade com que poli P sintetizado e armazenado tem como objetivo manter seja o dreno de Pi do solo pelo fungo inalterado, seja a transferncia de Pi raiz. Eventualmente estas molculas so deslocadas ao espao intra-radicular, hidrolisados em Pi e, finalmente, deslocados ao apoplasto e clulas vegetais, devido ao dreno imposto pela planta (Karandashov & Bucher, 2005). A hidrlise do Poli P provavelmente ocorre nas hifas intra-radiculares e no no apoplasto ou menos ainda nas clulas vegetais uma vez que plantas no absorvem poliP, mas Pi (Ohtomo et al., 2004). Esta hidrlise intracelular induziria a incrementos no Pi do citoplasma fngico levando ao seu transporte em direo ao apoplasto interfacial. A passagem de fosfato atravs da plasmalema fngica seria portanto passiva em favor de um gradiente de concentrao. Sua passagem pela matriz micorrzica pode se dar por canais ou transportadores inicos. Finalmente, o fosfato liberado transferido s clulas corticais 44

atravs de transportadores de fosfato, conforme j discutido. Bucking (2004) sugere que as trocas de C por P estejam efetivamente acopladas conforme a Figura 10. Assim, a absoro de P pelo fungo e sua transferncia planta, estaria diretamente associada disponibilidade de C ao fungo micorrzico. Da mesma forma que para Pi, FMA absorvem e deslocam plantas significantes quantidades de Nitrognio seja na forma de amonia seja na de nitrato. As enzimas de assimilao de N esto presentes tanto em razes como em estruturas do FMA. Este elemento pode ser acumulado em fungos, o que garante gradientes de concentrao entre o espao extra e intracelular bem como entre clulas do cortex (Jolicoeur et al., 2002). Os pools gerados pelo acumulo de P na forma de PoliP / Pi e de N, na forma de distintos amino cidos, NH4+ ou NO3-, tanto em clulas corticais como em hifas, produzem gradientes que so percebidos pelos simbiontes provavelmente no espao arbuscular. Estudos realizados por Jolicoeur et al. 2002, demonstram que os nveis de Pi (e possivelmente outros nutrientes) alm de acares intracelulares regulam a orientao do fungo em produzir hifas ou cessar seu crescimento. comum observar o incremento no nmero de esporos de algumas espcies de FMA conforme avana o desenvolvimento das razes (Berbara e de Souza, observaes pessoais). Estudos de (Declerck et al., 2001) em meio de cultura utilizando razes transgnicas, confirmam que a produo de esporos segue uma fase lag, log e estacionria, obedecendo uma curva clssica sigmoide, sugerindo que este processo obedece uma dinmica similar ao do metabolismo primrio. 8. MANEJO DE FMA No contexto da nutrio mineral de plantas e otimizao das funes de ecossistemas, visando aumentos em sua estabilidade e resilincia, considera-se alguns

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atributos biolgicos como centrais: (a) quantidade e qualidade de razes (finas, terminais, no-lignificadas e metabolicamente ativas); (b) riqueza e abundncia de organismos como FMA; (c) bactrias promotoras de crescimento de plantas (incluindo bactrias fixadoras e solubilizadoras de fosfato) e; (d) minhocas (Hamel et al., 2004; Wardle et al., 2004). Aqui, considera-se estabilidade como a capacidade que um sistema apresenta para manter inalteradas suas propriedades frente a um impacto ambiental ou antrpico, enquanto que, resilincia, como a capacidade de ecossistemas em recuperar suas funes aps sofrer uma perturbao ou estresse, sendo uma funo do tempo (Lal, 1997). Ambas estas propriedades so decisivamente influenciadas pelas associaes micorrzicas. Isso porque FMA e bactrias promotoras de crescimento associadas, relacionam-se estrutura de comunidades vegetais (ver item 5). Portanto, podem ser manejados juntamente com os tratos culturais. Outros grupos funcionais, como os da meso-macrofauna, da mesma forma so importantes. Entretanto, seu manejo bem mais complexo ao no se correlacionarem to rapidamente com variaes ambientais ou antrpicas (Schloter et al., 2003). Pelos seus mltiplos impactos, j apontados neste captulo, estratgias de manejo que incrementem no apenas a diversidade de FMA, mas em especial hifas extraradiculares, devem ser buscadas mesmo porque, a maioria dos agroecossistemas apresenta condies no-timas para o funcionamento de FMA. Manejos como mecanizao excessiva com alta fertilizao do solo, aplicao de pesticidas, rotaes de cultura com plantas no hospedeiras (ex. Brassicas), poluentes diversos, inclusive orgnicos com uso excessivo de esterco por exemplo, levam diminuio da otimizao desta simbiose seja pela reduo da atividade fngica, de sua diversidade ou da produo de hifas extraradiculares. Considera-se que as chamadas modernas tcnicas de manejo do solo vm diminuindo sobremaneira no apenas a diversidade, mas a importncia de FMA nas 46

funes j discutidas neste captulo, implicando em quedas na resilincia e estabilidade de agroecossistemas (Jeffries et al., 2003). 9. CONCLUSES Os primeiros estudos sobre micorrzas realizados no Brasil por Sacco (1958, 1962), foram descritivos. Avanou-se desde ento, de maneira gradual, na formao de pesquisadores que tiveram acertadamente o interesse em estudar o impacto das MA sobre o desenvolvimento de plantas em solos tropicais. Estes trabalhos foram importantes por enfatizar seu carter fundamental na sobrevivncia de inmeras espcies vegetais, as quais, sem esta simbiose para garantir sua nutrio fosfatada, provavelmente no existiriam. Os novos desafios para a pesquisa nestes ambientes no so menos relevantes. Incorporar este componente fngico s inmeras funes realizadas pelo solo, relacionadas estabilidade e resilincia de ecossistemas imperativo (Fitter, 2005). Apesar de seus mais de 120 anos de estudos, desde as primeiras descries e hipteses formuladas sobre a funcionalidade das associaes micorrzicas (Trappe, 2005), suspeitamos que o impacto mais profundo desta simbiose ainda est por ser desvendado. O esforo pela potencializao das AM em campo, bem como pela gerao de tecnologias a elas relacionadas, demanda tcnicas de estudo que incorporem protocolos de multiplicao de FMA, seja em potes, aero ou hidroponia, ou principalmente cultivos in vitro com o uso de Ri-DNA, razes transformadas (Berbara & Fonseca, 1996) uma formidvel ferramenta ainda pouco explorada no Brasil. Implica considerar este componente em estudos de longa durao que busquem detectar no apenas seu impacto sobre o desenvolvimento de uma planta, mas sobre a magnitude de sua contribuio a eventos globais e estruturao de comunidades vegetais. Com a perspectiva aberta pelas tecnologia moleculares, temos a

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oportunidade de entender mecanismos de evoluo de espcies vegetais e da prpria simbiose. Resta aos investigadores em MA ampliarem seu leque de investigao em um esforo multidisciplinar, mesmo porque, sem esta abordagem, no compreenderemos a dimenso completa desta formidvel simbiose.

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CAPTULO 4 SOLUES NUTRITIVAS: FORMULAO E APLICAES Nilton Nlio Cometti 1, Pedro Roberto Furlani2, Hugo Alberto Ruiz3 & Elpdio Incio Fernandes Filho3
1

Escola Agrotcnica Federal de Colatina - ES, CP 256 Colatina - ES, CEP 29709-910,

www.eafcol.gov.br, 2Pesquisador Cientfico Voluntrio, Bolsista do CNPq Instituto Agronmico, CP 28, CEP 13.001.970 Campinas - SP: pfurlani@iac.gov.br , 3 Professores do Departamento de Solos da Universidade Federal de Viosa, CEP 36570-000, Viosa (MG). Emails: hruiz@ufv.br; espidio@ufv.br

SUMRIO

1. INTRODUO 2. COMPOSIO DAS SOLUES NUTRITIVAS 2.1. Composio da soluo nutritiva 2.2. Sais utilizados nas solues 2.3. Exemplo de formulao de soluo nutritiva para a cultura da alface 2.4. Concentrao da soluo nutritiva 3. MANEJO DA SOLUO 3.1. Reposio da soluo 3.2. Preparo e utilizao de solues estoque 3.3. pH da soluo nutritiva 4. ESPECIAO INICA DA SOLUO NUTRITIVA 4.1. Fora inica 4.2. pH 4.3. Quelatos 5. ESTUDOS DE CINTICA DE ABSORO DE NUTRIENTES 6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

3 3 8 9 10 12 16 16 18 21 24 25 26 28 33 40

1. INTRODUO Uma soluo nutritiva pode ser definida como um sistema homogneo onde os nutrientes necessrios planta esto dispersos, geralmente na forma inica e em propores adequadas. Alm dos nutrientes, pressupe-se que a soluo nutritiva contenha O2 e esteja na temperatura ideal para a absoro dos nutrientes. Entretanto, uma soluo nutritiva no composta inteiramente de elementos em suas formas minerais, puras e simples, onde uma simples anlise dos elementos seja suficiente para desvendar os segredos de suas frmulas mgicas. A partir do instante em que a soluo nutritiva colocada em contato com as razes, transforma-se em uma verdadeira sopa nutritiva, contendo vrios compostos orgnicos provenientes da atividade microbiana, dos exsudatos das razes e da decomposio de fragmentos de razes. Alm desses, h resduos do meio de cultivo das mudas, fragmentos do sistema hidropnico e do sistema hidrulico. Em qualquer sistema de cultivo sem solo, duas variveis so preponderantes sobre a produtividade: a ambincia, determinada pelo tipo de proteo das plantas, especialmente a cobertura com filmes plsticos transparentes e telas de sombreamento; e a soluo nutritiva, que pode estar livre ou dispersa em um substrato. Em condies normais, todos os nutrientes podem ser absorvidos da soluo nutritiva pela raiz em quantidades suficientes ao requerimento da planta. Alm dos nutrientes, O2 e gua so absorvidos diretamente da soluo, enquanto o C retirado normalmente da atmosfera. Tanto em pesquisas de nutrio mineral de plantas, quanto na produo de alimentos em sistemas hidropnicos, a soluo nutritiva tem o carter de ser o objeto e a ferramenta de trabalho e estudo.

2. COMPOSIO DAS SOLUES NUTRITIVAS A composio da soluo nutritiva tem sido estudada h muitos anos, com relatos de solues datando de 1865, como a soluo de Knopp (Resh, 2002). Entretanto, somente a partir 3

de 1933 houve preocupao com a elaborao de uma soluo contendo micronutrientes, em 1938, Hoagland & Arnon apresentaram uma soluo nutritiva completa e balanceada para tomateiro, baseada na composio de plantas cultivadas em vasos com soluo nutritiva (Hoagland & Arnon, 1950). Em 1957, essa soluo sofreu uma pequena adaptao na relao NO3-:NH4+ para o valor de 7:1, por Johnson e colaboradores, para manter o pH mais prximo de cinco. A partir da soluo de Hoagland & Arnon, muitas outras foram desenvolvidas, mas a tradicional soluo Hoagland permanece como a mais utilizada, por atender adequadamente s necessidades das culturas. Admite-se que no exista uma soluo nutritiva ideal para todas as culturas. Desta forma, a composio da soluo nutritiva varia com uma srie de fatores: a espcie de planta cultivada (a exigncia nutricional geneticamente controlada), o estdio fenolgico da planta, a poca do ano (durao do perodo de luz), fatores ambientais (temperatura, umidade e luminosidade) e a parte da planta colhida e, eventualmente, comercializada. Alm disso, aspectos intrnsecos soluo alteram sua composio, tais como pH, fora inica, temperatura e presena de molculas orgnicas, em especial os agentes quelantes. Diversas solues nutritivas tm sido propostas, havendo diferenas marcantes em relao s concentraes dos macronutrientes, enquanto que para os micronutrientes, as diferenas so bem menores (Quadro 1). comum encontrar nos artigos cientficos a soluo nutritiva modificada de Hoagland, isto , frmulas derivadas da soluo nutritiva proposta por Hoagland & Arnon. Essa soluo tem sido a mais usada na pesquisa em nutrio mineral de plantas e constitui a base para a formulao de inmeras solues nutritivas comerciais. As faixas de concentraes dos nutrientes utilizadas nas solues so muito amplas, variando em at 10 vezes, como no caso do S (Quadro 1).

Quadro 1. Faixas de concentrao encontradas nas solues nutritivas e soluo de Hoagland & Arnon (1950) modificada. Nutriente Massa atmica Faixas de concentrao 1 ----mg L-1----N-NO3N-NH4+ P K Ca Mg S 14,0 14,0 31,0 39,1 40,0 24,3 32,0 70 0 15 150 70 15 20 - 250 33 80 --------mmol L-1-----5,00 0,00 0,48 3,84 1,75 0,62 0,63 17,86 2,36 2,58 10,23 5,00 3,29 6,25 Hoagland & Arnon mg L-1 196 14 31 234 160 48 64 mmol L-1 14,00 1,00 1,00 5,98 4,00 1,98 2,00 mol L-1 0,5 0,02 1 0,5 0,01 0,05 46,30 0,31 17,92 9,11 0,10 0,76

- 400 - 200 80

- 200

------mol L-1-----B Cu F Mn Mo Zn Cl
1

10,8 63,5 55,8 54,9 95,9 65,4 35,5

0,1 0,05 0,8 0,5 0,01 0,05 1

- 0,6 - 0,3 6 2

9,26 0,79 14,34 9,11 0,52 1,53 28,17

55,56 4,72

- 107,53 36,43 1,56 7,65

- 0,15 - 0,5 - 188

- 5.295,77

Adaptado de Barry (1996) e Resh (2002).

Para formular uma soluo nutritiva, importante entender o modo e a velocidade com que os nutrientes so absorvidos pelas plantas. H vrios sistemas de monitoramento da concentrao dos ons na soluo nutritiva, incluindo aqueles totalmente automatizados, compostos de sensores (eletrodos especficos para ons) e computadores para registrar o teor do nutriente e a necessidade de reposio. Entretanto, esse monitoramento pode ser interessante, mas no fundamental para a manuteno da soluo adequada ao cultivo hidropnico.

muito comum verificar a rpida depleo de um nutriente na soluo, enquanto outros se acumulam, devido s diferentes taxas de absoro. A velocidade de absoro de N, P e K maior do que dos outros nutrientes, o que pode levar ao rpido esgotamento desses nutrientes e acmulo de outros, especialmente S e Ca (Figura 1). O mesmo pode ocorrer com micronutrientes, considerando que o Mn tem alta taxa de absoro em comparao ao B. Assim, os nutrientes podem ser separados em trs grandes grupos, considerando a velocidade de absoro (Quadro 2). O conhecimento da velocidade com que um on absorvido pode explicar porqu, na anlise de uma soluo nutritiva, um nutriente pode estar praticamente ausente, enquanto outros ainda esto em concentraes adequadas para a cultura, mesmo que as plantas tenham um crescimento exuberante. Ento, a depleo do nutriente na soluo nutritiva, ao invs de indicar sua deficincia, pode indicar que as plantas esto saudveis, e que esto absorvendo os nutrientes rapidamente. Por exemplo, se a concentrao de P for mantida constante na soluo circulante (0,5 mmol L-1), sua concentrao no tecido poder atingir a 1% da massa seca, valor trs vezes maior do que o timo para a maioria das plantas, o que pode induzir deficincias de Fe e Zn (Chaney & Coulomb, 1982). Sendo assim, ao longo do ciclo de um cultivo hidropnico sem renovao da soluo, os resultados de anlises devem apresentar concentraes estveis dos nutrientes de absoro lenta (Figura 1 e Quadro 2), enquanto para os nutrientes de absoro rpida, as concentraes normalmente so baixas, mesmo com o ajuste dirio da concentrao da soluo.

Quadro 2. Taxa de absoro aproximada dos nutrientes por plantas crescidas em soluo nutritiva (adaptado de Bugbee, 1995). Grupo 1 2 3 Taxa de absoro Absoro rpida Absoro intermediria Absoro lenta Nutriente N-NO3 N-NH4 P K Mn Mg S Fe Zn Cu Mo Ca B

100 80 60

% do Inicial (%)

40 20 0 80 60

P N

S Ca Mg K

B 40 Fe 20 0 0 20 40 60 80 100 Mn 120

Tempo (horas)
Figura 1. Variao temporal da concentrao relativa de nutrientes da soluo nutritiva em NFT (tcnica do nutriente em filme) em cultivo de alface (Adaptado de Furlani, 2003 dados no publicados).

A concentrao total dos nutrientes na soluo pode ser estimada medindo-se a condutividade eltrica (CE) da soluo. Devido taxa diferencial de absoro dos nutrientes, a CE da soluo indica, na maior parte, o Ca, Mg e S remanescentes, enquanto os micronutrientes contribuem com menos de 0,1 % da CE da soluo. No Sistema Internacional de Unidades, a CE expressa em S m-1 (siemen por metro), sendo mais comum sua utilizao na faixa de mS m-1, muito empregada comercialmente, e que equivale unidade mMho cm-1 usada no passado.

2.1. Composio da soluo nutritiva Em seu trabalho pioneiro, Hoagland & Arnon (1950) formularam uma soluo nutritiva a partir da composio elementar mdia de plantas de tomate, mas seus clculos foram baseados em plantas cultivadas em recipientes com 18 L de soluo, com troca semanal de soluo. Com o advento das novas tcnicas de cultivo hidropnico e novas formas de reposio da soluo nutritiva, surgiram algumas questes: o que ocorre quando se cultiva uma planta diferente, ou quando o volume de soluo por planta for diferente, ou quando a forma e a freqncia de reposio da soluo nutritiva forem distintas? Portanto, dois fatores devem ser considerados para a formulao de uma soluo nutritiva: a composio da soluo, determinada pela relao entre as concentraes dos nutrientes no tecido da planta cultivada; e a concentrao da soluo, determinada pela razo de transpirao para o crescimento da planta, pelo volume de soluo por planta, pelo grau de agitao da soluo e pela velocidade de reposio da soluo. A composio da soluo deve ser determinada a partir da concentrao desejada de cada nutriente dentro da planta. O ponto de partida a anlise qumica de toda a planta, j que as diferentes partes contm concentraes diferentes de nutrientes. As quantidades acumuladas de cada nutriente, e suas propores relativas, servem de referncia para a definio da concentrao relativa de cada nutriente na soluo nutritiva. Outro meio utilizar referncias bibliogrficas, com interpretao de anlise de plantas contendo as concentraes adequadas de nutrientes para o crescimento e desenvolvimento timos das plantas. Quando se procede 8

anlise das exigncias nutricionais de plantas visando ao cultivo em soluo nutritiva, deve-se enfocar as relaes existentes entre os nutrientes, pois essa uma indicao da relao de extrao do meio de crescimento. Alm das diferenas nos teores de nutrientes nas folhas em funo de sua posio, cultivares e pocas de amostragem, tambm ocorrem diferenas nas relaes entre os teores foliares de nutrientes para as diversas espcies, o que deve ser levado em considerao quando se utiliza uma nica soluo para a nutrio de diversas espcies vegetais. Quando isso ocorre para espcies que possuem relao de extrao diferente, h grande possibilidade de desequilbrio nutricional ao longo do desenvolvimento das plantas, principalmente aquelas com ciclo mais longo e quando a soluo nutritiva no renovada integralmente. Essas relaes devem ser consideradas tambm para a reposio de nutrientes durante o crescimento das plantas. Em trabalhos de pesquisa, comum a renovao total da soluo aps uma semana de cultivo em vasos, a fim de evitar desequilbrios nas relaes entre os nutrientes. 2.2. Sais utilizados nas solues Para a escolha de um sal para uma determinada soluo deve-se considerar, primeiramente, a finalidade da soluo. Em trabalhos de pesquisa, utilizam-se normalmente sais puros para anlise, a fim de evitar contaminaes com outros nutrientes que possam distorcer os resultados. Entretanto, em cultivos hidropnicos com fins comerciais, o volume de soluo utilizado geralmente grande, e neste caso o uso de sais comerciais prefervel pelo seu menor custo. Esses sais so comumente utilizados em fertirrigao devido sua alta solubilidade e ausncia de resduos que possam obstruir os emissores. Se o objeto de estudo forem os micronutrientes, os cuidados devem ser maiores, inclusive com a purificao de sais. No fornecimento de macronutrientes, prefervel utilizar sais que no contenham Na e Cl, que podem acumular-se na soluo, aumentando a salinidade e reduzindo a absoro de alguns nutrientes. O Cl pode reduzir a absoro de NO3-, e o Na pode interferir na absoro de Ca e K (Marschner, 1995). 9

2.3. Exemplo de formulao de soluo nutritiva para a cultura da alface Como exemplo de um mtodo prtico de clculo de uma soluo nutritiva, deve-se inicialmente definir a relao de concentrao entre os nutrientes para a cultura em questo (dados do Quadro 3, para a cultura da alface), para preparar a base da soluo, assumindo uma quantidade inicial de 100 g de K por m3 de soluo (Quadro 6).

Quadro 3. Relao entre nutrientes, e quantidade de nutriente para preparar a soluo bsica para a cultura da alface K Relao entre nutrientes Relao 100 Quantidade (g m-3) 1,00 100 100 N 0,62 62 62 P 0,09 9 9 Ca 0,31 31 31 Mg 0,08 8 8 S 0,03 3 3

Em seguida, definem-se os sais que sero utilizados para os macronutrientes. Geralmente utilizam-se os seguintes sais: - nitrato de clcio (Ca 19 %, N-NO3 4,5 %, N-NH4 1,0 %); - nitrato de potssio (K 36,5 %, N-NO3 13 %); - MAP purificado (N-NH4 11 %, P 26 %); deve ser utilizado quando o pH da soluo for ligeiramente neutro ou alcalino, devido presena do amnio que acidifica a soluo; - MKP (K 29 %, P 23 %); deve ser utilizado quando o pH da soluo for cido; - sulfato de magnsio (Mg 10 %, S 13%).

a)

Clculo do Ca: nitrato de clcio = 31/0,19 = 163,2 g m-3

(o valor 31 indica a quantidade de Ca do Quadro 3; o valor 0,19 indica 19 % de Ca no nitrato de clcio; iniciou-se pelo nitrato de clcio por ser a nica fonte de clcio. b) c) d) Clculo do K: nitrato de potssio = 100/0,36 = 278 g m-3 Clculo do P: de MAP = 9/0,26 = 23 g m-3 Clculo do Mg: sulfato de magnsio = 8/0,10 = 80 g m-3 10

e) 62,3 g m-3 f)

Clculo do N: N contido nos sais acima = 163,20,145 + 2780,13 + 230,11 =

Caso o N resultante da soma das quantidades dos sais no seja suficiente, pode-se

complet-lo com nitrato de clcio e nitrato de potssio. g) A composio da soluo nutritiva bsica para atender a proporo entre os

nutrientes ser (em g m-3): 163,2 g de nitrato de clcio, 278 g de nitrato de potssio, 23 g de MAP e 80 g de sulfato de magnsio; esta dever ser corrigida para a condutividade eltrica desejada, 1,5 mS cm-1, por exemplo. h) Para a estimativa da condutividade eltrica, multiplica-se a CE de uma soluo em

g L-1 (Quadro 4) pela quantidade do sal. Para a soluo nutritiva bsica, a CE estimada ser: 163,21,18 + 2781,28 + 230,95 + 800,88 = 641 S cm-1 ou 0,64 mS cm-1. i) Para se obter a CE da soluo nutritiva desejada (CE = 1,5 mS cm-1), deve-se

multiplicar os valores de concentrao de sais calculados no item g pelo fator de correo da CE (fce = 1,50 / 0,64 = 2,3), obtendo-se as concentraes finais dos sais (Quadro 4).

Quadro 4. Soluo nutritiva final para a cultura do alface, corrigida para a condutividade eltrica desejada. Sal utilizado Soluo bsica g m-3 Nitrato de clcio Nitrato de potssio MAP Sulfato de magnsio CE (mS cm-1) 163 278 23 80 0,64 Soluo desejada g m-3 375 639 53 184 1,5

Para o clculo da soluo de micronutrientes, no h necessidade de correo da CE. Podem-se utilizar as concentraes consideradas adequadas e preparar uma soluo estoque, 10 vezes mais concentrada, chamada de soluo de micronutrientes 10 (Quadro 5). Portanto, a 11

soluo nutritiva com CE de 1,50 mS cm-1 ter, em g m-3: 375 g de nitrato de clcio, 639 g de nitrato de potssio, 53 g de MAP, 184 g de sulfato de magnsio e 100 mL da soluo de micronutrientes 10.

Quadro 5. Clculo de uma soluo de micronutrientes 10 para alface Micronutriente Sal utilizado (% do micronutriente) 1 Concentrao adequada 2 mg L-1 B Cu F Mn Mo Zn
2

Quantidade do sal mg L-1 1,76 0,08 34,00 1,60 0,15 0,29

Soluo 10

g L-1 17,6 0,8 340,0 16,0 1,5 2,9

cido brico (17) Sulfato de cobre (25) Fe-EDDHA (6) Sulfato de mangans (25) Molibdato de sdio (39) Sulfato de zinco (21)

0,3 0,02 2,0 0,4 0,06 0,06

Furlani et al. (1999) 2.4. Concentrao da soluo nutritiva A definio da concentrao dos nutrientes na soluo nutritiva a ser fornecida s plantas

o segundo passo para sua formulao. A concentrao adequada, independentemente da relao entre os nutrientes, vai depender primariamente da taxa transpiratria da planta. Segundo Bugbee (1995), uma boa estimativa da gua transpirada em relao ao crescimento de plantas em hidroponia est em torno de 300 a 400 L de gua transpirada por kg de massa seca acumulada. A taxa de transpirao depende principalmente da umidade do ar, ventilao, concentrao de CO2, temperatura e luminosidade. Em condies de clima tropical, a alta transpirao contribui ainda mais para a reduo do volume e da concentrao da soluo nutritiva. A absoro dos nutrientes, por outro lado, determinada pela taxa de crescimento da planta. Por isso, muito comum encontrar um desequilbrio entre a quantidade de gua e de nutrientes que a planta 12

absorve da soluo, ocorrendo aumento da CE da soluo ao longo do dia, quando no h reposio da gua. As primeiras solues nutritivas propostas na literatura cientfica eram muito concentradas, por serem formuladas para sistemas hidropnicos estticos, geralmente em vasos com oxigenao. Com o advento dos sistemas circulantes, com constante agitao e renovao da soluo fluindo em velocidade pelas razes, foi possvel reduzir consideravelmente sua concentrao. Enquanto as primeiras solues utilizavam CE de 2,5 a 3,0 mS cm-1, atualmente comum a utilizao de CE em torno de 1,0 a 1,5 mS cm-1 (Cometti, 2003). Um exemplo consiste na determinao da concentrao de um nutriente na soluo nutritiva a partir do balano de massas. Assumindo-se a concentrao de K no tecido em torno de 40 g kg-1 de massa seca e uma transpirao de 300 L kg-1 de massa seca, deveria haver 40 g de K em 300 L de gua, ou 133 mg K L-1. Se a taxa de transpirao for maior, 400 L kg-1, a soluo deveria ser mais diluda, ou seja, 40 g por 400 L, ou 100 mg K L-1. Em uma soluo nutritiva, o principal componente do potencial da gua o osmtico, conseqncia da quantidade de sais dissolvidos na soluo. Quanto maior a quantidade de sais na soluo, tanto maior ser a restrio absoro de gua pelas razes, e, portanto, de nutrientes. Se a concentrao de sais for muito alta, os vegetais podero perder gua para o meio, ocorrendo injrias (plasmlise das clulas) que, dependendo da intensidade, podem causar morte de razes e da planta. O efeito salino de cada sal varivel, sendo geralmente utilizado o nitrato de sdio como referncia (Quadro 6). Na prtica, em solues nutritivas, a salinidade pode se tornar um problema apenas quando a circulao da soluo interrompida por longos perodos em momentos de alta transpirao, podendo ocorrer acmulo de sais na superfcie das razes.

13

Quadro 6. Solubilidade de alguns sais utilizados em hidroponia (adaptado de Boodley, 1996 e Resh, 2002). Sal Solubilidade gua fria (0,5 oC) g L-1 cido brico Cloreto de potssio Fosfato diamnio Fosfato monoamnio Nitrato de amnio Nitrato de clcio Nitrato de potssio Nitrato de sdio Sulfato de amnio Sulfato de clcio Sulfato de magnsio 2 Sulfato de mangans Sulfato de potssio
1 2

ndice salino 1

gua quente (100 oC) g L-1 389 561 1063 1730 8711 6598 2471 116 34 30 105 53 74 100

19,5 277 426 224 1183 1212 134

704 Insolvel 700 516 67

1033

69 8

906 696 239

46

ndice de salinidade relativo ao nitrato de sdio = 100. Temperatura em gua fria = 20 oC e gua quente = 40 oC. O potencial osmtico (o) pode ser calculado pela equao de Vant Hoff, que relaciona

o potencial osmtico concentrao de soluto na soluo:


o = - nsRT V

em que o o potencial osmtico em pascals, V o volume do solvente em litros, ns o nmero de mols de soluto, R a constante dos gases (0,00832 MPa K-1 mol-1 a 273 oK), e T a temperatura em
o

K. Medies diretas, entretanto, tm mostrado que esta relao aproximadamente correta para

14

solues diludas que no se dissociam. Para eletrlitos que se dissociam em soluo, no entanto, h um grande desvio do valor terico. Assim, a presso osmtica de uma soluo molar de NaCl aproximadamente 4,32 MPa, em vez do valor terico de 2,27 MPa. Assumindo-se que haja a completa dissociao do NaCl, o potencial osmtico seria 4,54 MPa, e a discrepncia pode ser atribuda, principalmente, s foras de Van der Waals operando entre os ons. Em solues nutritivas, que trabalham na faixa milimolar, o efeito da concentrao sobre a fora inica menor, permitindo uma aproximao maior entre os valores calculado e real do potencial osmtico. Um potencial osmtico entre -0,05 e -0,1 MPa tem sido considerado adequado para o cultivo hidropnico. Considerando-se uma soluo nutritiva que contenha uma concentrao de ons totais em torno de 20 mmol L-1 e temperatura de 27 oC, o potencial osmtico seria: o = - 0,02 * 0,00832 * 300 = 0,0499 MPa 1

Devido dificuldade de medio direta da presso osmtica da soluo e de seu clculo, pois seria necessrio conhecer a concentrao de cada on, pode-se utilizar a medida de CE, que apresenta uma boa correlao com a quantidade total de slidos solveis da soluo ou com a sua fora inica estimada (Figura 2). H uma relao significativa entre a CE e a concentrao total de ons da soluo, que pode ser determinada pelas seguintes equaes: CE (mS cm-1) = [total de ons (mmol L-1)] 0,0698; ou total de ons (mmol L-1) = [CE (mS cm-1)] 14,33; ou total de ons (mg L-1) = [CE (mS cm-1)] 655 Estas equaes permitem que se utilize apenas a molaridade total da soluo, sem que sejam necessrias as concentraes individuais dos nutrientes na soluo. A relao entre CE e a concentrao de ons deve ser determinada para cada sal em soluo, visto que h grande variao entre a CE de cada espcie inica (Quadro 4). Quando se utilizam estas relaes para estimar a concentrao total dos ons a partir da CE, deve-se considerar que seu valor pode ser diferente para cada soluo nutritiva, dependendo da relao entre os nutrientes. Finalmente, a 15

soma das CE estimadas de cada sal dissolvido pode ser utilizada como a CE estimada da soluo nutritiva, com uma boa aproximao do valor medido por meio de condutivmetro. A CE da soluo tambm varia com sua temperatura. A cada cinco graus de aumento de temperatura, h um aumento da CE em torno de 11,0 %. Sendo assim, uma soluo com CE de 1 mS cm-1 a 25 oC dever apresentar, aproximadamente, uma CE de 1,11 mS cm-1 a 30 oC.

2,5

2,0

Fora Inica Concentrao de ons

CE = FI*0,0853 2 r = 0,99

CE (mS cm-1)

1,5

1,0

CE = [Total de ons] * 0,0698 2 r = 0,99

0,5

0,0 0 5 10 15 20
-1

25

Concentrao Total de ons e Fora Inica (mmol L )


Figura 2. Relao entre condutividade eltrica (CE) da soluo nutritiva e a concentrao total
de ons e fora inica (FI) estimada; fora inica simulada com o programa GEOCHEM 3.0 (Parker et al., 1995). Fonte: Cometti (2003).

3. MANEJO DA SOLUO

3.1. Reposio da soluo


Durante o crescimento das plantas em soluo nutritiva, h absoro de gua e nutrientes em propores diferentes, com diferentes quantidades acumuladas no tecido vegetal. Os nutrientes, por sua vez, so absorvidos da soluo nutritiva com velocidade diferenciada (Figura 1). Assim, o manejo da soluo nutritiva deve contemplar essas diferenas a fim de se alcanar o 16

fim do ciclo de cultivo com o menor desbalanceamento inico possvel, constituindo um desafio a adequada reposio dos nutrientes e da gua. Dentre os mtodos disponveis de reposio da soluo nutritiva, podem-se listar: a) Renovao de toda a soluo: em vasos, comum a troca de toda a soluo ao final de uma semana de cultivo, utilizando-se 2 a 3 L de soluo para plantas como soja, arroz, e feijo. Para determinar o momento da troca da soluo, Ruiz (1977) props utilizar o K como nutriente indicador. Em cultivos comerciais, o volume total de soluo costuma ser grande, tornando alto o custo com desperdcio de soluo, alm de riscos de contaminao do meio ambiente. b) Reposio da soluo absorvida: esse mtodo utiliza a soluo bsica para repor a gua absorvida por transpirao. Em condies de baixa umidade relativa do ar, alta velocidade do vento e alta temperatura, h uma perda de gua por transpirao desproporcionalmente maior do que a absoro de nutrientes, provocando a concentrao da soluo nutritiva remanescente. Caso seja feita a reposio da soluo na mesma concentrao inicial, haver um aumento da concentrao de sais na soluo, aumentando consideravelmente sua CE. A forma de solucionar o problema monitorar a CE da soluo e adicionar gua pura para reduzi-la, quando necessrio, ou efetuar a reposio com uma soluo mais diluda do que a original. c) Reposio de nutrientes e gua separadamente com anlise qumica da soluo. Depois de efetuada a anlise qumica da soluo nutritiva, pode-se adicionar gua para atingir o nvel inicial e adicionar os nutrientes por meio de solues-estoque concentradas de cada sal. O custo de monitoramento da soluo por esse mtodo pode ser impeditivo, alm de demandar um certo tempo para a anlise e de no traduzir exatamente a necessidade de reposio dos ons, Apesar do ajuste da concentrao dos nutrientes, a soluo tem restries para uso indefinido, pois h exsudao de cidos orgnicos, descamao e quebra de razes liberando fragmentos, crescimento de algas, bactrias e fungos, e contaminao por microrganismos patognicos, resduos de substratos, poeira e metais pesados contaminantes . Todos esses elementos exigiriam um tratamento de alto custo da soluo para que esta pudesse ser reutilizada com segurana. A 17

vida til de uma soluo com acompanhamento semanal por anlise qumica pode chegar a trs meses, segundo Resh (2002). d) Reposio de gua e nutrientes separadamente, com uso de sensores de concentrao dos ons. Alm do custo elevado dos eletrodos especficos para os ons, sua vida til reduzida e necessitam de calibraes freqentes. A esse mtodo, aplicam-se as consideraes anteriores sobre a vida til da soluo. e) Reposio de gua e nutrientes separadamente, por meio do monitoramento da CE da soluo. Este o mtodo mais utilizado atualmente na hidroponia comercial, alm de aplicar-se s pesquisas em nutrio de plantas, pois de baixo custo e permite um acompanhamento da concentrao total de sais da soluo. A reposio de gua pode ser efetuada instantaneamente por meio de vlvula de nvel com bia ou diariamente, de forma manual. A medida da CE permite monitorar a absoro de nutrientes pois, apesar de no fornecer a concentrao de cada on, a CE d uma idia da concentrao total dos ons em soluo (Figura 2). A reposio dos ons feita com solues-estoque concentradas, repondo-se apenas um volume de soluoestoque suficiente para elevar a CE para o valor inicial. O descarte da soluo nutritiva efetuado apenas ao final de um ciclo de cultivo, reduzindo bastante os custos com nutrientes e anlises qumicas da soluo. A vida til da soluo, em condies de cultivo hidropnico de hortalias folhosas, no Brasil, tem sido em torno de trinta dias em sistemas NFT, ou tcnica do filme nutriente, onde a soluo nutritiva conduzida por toda a parte inferior do tanque inclinado onde as plantas so crescidas.

3.2. Preparo e utilizao de solues estoque


Para facilitar o manejo da reposio de nutrientes, conveniente preparar soluesestoque concentradas, contendo todos os nutrientes na mesma proporo da soluo nutritiva. Para determinar a concentrao mxima da soluo estoque, necessrio utilizar a solubilidade dos sais como o limite (Quadro 6). Alm disso, pode haver incompatibilidade entre sais que no permita que os mesmos sejam colocados na mesma soluo concentrada, destacando-se a 18

incompatibilidade entre nitrato de clcio e os sais contendo P e S por formarem precipitados de baixa solubilidade (Quadro 7). Portanto, preparam-se duas solues, intituladas A e B, onde o nitrato de clcio colocado em apenas uma delas. Considerando que o nitrato de potssio tenha compatibilidade com todos os outros sais, e que seja utilizado em maior quantidade, pode ser dividido entre as solues A e B, e servir como determinante para a concentrao final das solues.

19

Quadro 7. Compatibilidade entre diferentes fertilizantes (C compatvel; I incompatvel; R


compatibilidade reduzida). C C C C C C C R R C R C I C C C C I R R R I I C I C C C C C C C C C C C C C C C C C I R R R C C C C C C C C C C C C C C C C C I R R R I I C C C I C C C C C C C I C C C C C C I C C C C C C C C C C C C C I C C C Uria Nitrato de amnio

Sulfato de amnio

Nitrato de clcio

Nitrato de potssio

Cloreto de potssio

Sulfato de potssio

Fosfato diamnio (DAP)

Fosfato monoamnio (MAP)

Sulfato de magnsio

cido fosfrico

cido sulfrico

cido ntrico

Sulfato de ferro, zinco, cobre e mangans

Quelato de ferro, zinco, cobre e mangans

Utilizando como exemplo de clculo a soluo formulada para a cultura do alface, considerando que o nitrato de potssio possui solubilidade de 134 g L-1 (Quadro 6), sero necessrios 4,77 L para solubilizar os 639 g para a soluo nutritiva (Quadro 8); este valor pode ser arredondado para 5 L. Assim, o nitrato de potssio ser utilizado como base para as solues estoque por ser o sal com maior quantidade de gua necessria para solubilizao. Como ser utilizado nitrato de potssio em ambas as solues A e B, pode-se ento dobrar as quantidades dos outros sais e recalcular as quantidades para preparar 10 L de cada soluo estoque.

20

Quadro 8. Volume mnimo necessrio para solubilizar os sais da soluo nutritiva para a cultura
do alface

Sal

Solubilidade
g L-1

Soluo desejada
g m-3 375 639 53 184

Volume mnimo
L 0,14 4,77 0,24 0,26

Nitrato de clcio Nitrato de potssio MAP Sulfato de magnsio

1212 134 224 700

3.3. pH da soluo nutritiva


Altas concentraes de H+ na soluo nutritiva podem desestabilizar as membranas celulares, provocando perda de ons e morte das clulas da raiz. As plantas podem suportar perfeitamente pH entre 4,5 e 7,5 sem grandes efeitos fisiolgicos. Entretanto, efeitos indiretos, tais como a reduo na disponibilidade de nutrientes, podem comprometer seriamente o crescimento das plantas, pois as mudanas de pH podem favorecer a formao de espcies inicas que no so prontamente transportadas para o interior das clulas, comprometendo a absoro do nutriente. Alm disso, dependendo do pH da soluo, h formao de complexos insolveis. Em pH acima de 6,5 h reduo na disponibilidade de Mn, Cu, Zn, B, P e, especialmente, Fe, enquanto h uma pequena reduo na disponibilidade de P, K, Ca e Mg em pH abaixo de 5,0. Portanto, em uma cultura hidropnica recomendado um pH entre 5,5 e 5,8, condio que permite a mxima disponibilidade dos nutrientes em geral (Bugbee, 1995). Em soluo nutritiva, Inoue et al. (2000) observaram reduo no crescimento da parte area e do sistema radicular de alface quando o pH foi reduzido abaixo de 4,2. As variaes de pH que ocorrem na soluo nutritiva so reflexos da absoro diferenciada de ctions e nions. Por exemplo, quando o N suprido na forma ntrica, a absoro de nions maior que ctions, ocorrendo elevao do pH. A absoro de um mol de NO3- feita 21

em cotransporte com dois mols de H+, enquanto na absoro de um mol de NH4+ pode ocorrer o bombeamento de um mol de H+ para o exterior da clula. Assim, enquanto a absoro de NO3aumenta o pH, a absoro de NH4+ o reduz. Em plantas supridas com NH4+ e NO3-, o pH da soluo pode voltar a subir assim que o NH4+ tenha sido absorvido e que a absoro de NO3torne-se maior do que a de NH4+ (Figura 3). Devido ao abaixamento do pH com a absoro do NH4+, recomenda-se o suprimento apenas parcial do N na forma amoniacal, tornando a soluo mais tamponada. Em geral, o poder de tamponamento das solues nutritivas utilizadas em hidroponia muito pequeno. A utilizao de gua deionizada, muito comum em pesquisa, reduz ainda mais o poder de tamponamento da soluo. Apesar do poder do fosfato (H2PO4- HPO42-) de tamponar a soluo, sua concentrao necessria para estabilizar o pH em uma soluo nutritiva o tornaria txico para as plantas. Alm disso, a rpida absoro do P retira toda sua capacidade de tamponamento, que se encontra a partir de 5,5, e alcana o mximo no pH 7,2. Portanto, mais conveniente manter a soluo nutritiva equilibrada em ctions e nions para atender a demanda da planta, do que tentar manter o pH numa faixa estreita de valores por meio do uso de cidos (sulfrico, fosfrico, ntrico ou clordico) e bases (hidrxido de sdio, potssio ou amnio) fortes para reduzir ou elevar o pH do meio de crescimento, respectivamente.

22

200 150

N-NO3-

Nutrientes na Soluo Nutritiva (mg L )

-1

100 50 0 25 20 15 10 5 0 6 5 4 3
17 24 31 38 45

N-NH4+

pH

Dias Aps a Semeadura


Figura 3. Variao de NO3-, NH4+ e pH da soluo nutritiva em cultivo hidropnico (NFT) de
alface. A soluo foi renovada totalmente a cada sete dias (linhas verticais pontilhadas) e ajustada diariamente pela condutividade eltrica e pH com soluo de hidrxido de sdio (Furlani, 1998). A utilizao de doses pequenas e contnuas de N-NH4+ de uma soluo de sulfato de amnio pode manter o pH em 5,5 ( 0,5) durante todo o ciclo da cultura, sem que haja necessidade de lanar mo de cidos fortes para baixar o pH da soluo e sem comprometimento da produtividade da cultura (Martins et al., 2002). Entretanto, esses estudos tm sido realizados em sistemas automatizados, onde o computador interpreta o pH e libera uma soluo contendo amnio atravs do controle por uma vlvula solenide. Em experimentos conduzidos em vasos com soluo nutritiva, possvel manter o pH estvel utilizando-se uma concentrao de 1 mmol

23

L-1 de MES (cido 2 (N-morfolino) ethanosulfnico) sem qualquer prejuzo para as plantas (Bugbee & Salisbury, 1985).

4. ESPECIAO INICA DA SOLUO NUTRITIVA


A especiao inica para compreender as respostas das plantas presena de certos ons nas solues, principalmente em cultivos hidropnicos, tem sido crescente, e cada vez mais til. Apenas a concentrao total de um elemento tal como se obtm a partir de anlises laboratoriais, ou aquela que se acredita ter sido adicionada, no corresponde, muitas vezes, aos efeitos observados no aumento ou na reduo do crescimento vegetal. Da mesma forma, os efeitos txicos de metais pesados tm se mostrado mais coerentemente correlacionados com a atividade de espcies inicas do que com a concentrao total do elemento. Na especiao de solues contendo Al, Sr, Fe, Ca, P e outros elementos, observa-se o forte efeito do pH na formao de vrios complexos e precipitados, acarretando sua baixa disponibilidade para a planta mesmo sob altas concentraes, e assim pouco ou nenhum efeito pode ser observado em resposta ao aumento de sua concentrao na soluo nutritiva. Segundo Bernhard et al. (1986), espcie qumica refere-se a uma forma molecular (configurao) de tomos de um elemento ou aglomerado de tomos de diferentes elementos. O termo especiao qumica, por sua vez, tem sido utilizado para descrever a anlise das espcies predominantes numa amostra, a abundncia dessas espcies ou distribuio numrica, a reatividade de dadas espcies e a transformao de uma espcie em outra. Como as formas do metal complexado so de difcil ou impossvel determinao por mtodos de anlises laboratoriais, o uso de expresses termodinmicas em modelos computacionais mostra-se uma alternativa mais vivel, simples e segura para a obteno desse conhecimento. Programas de computador tais como REDEQL, GEOCHEM-PC, MINTEQ, CHEAQS e outros, podem indicar as espcies qumicas em uma soluo nutritiva a partir das concentraes analticas conhecidas

24

dos elementos adicionados, apontando os pares inicos, complexos e formas livres dos ons (Parker et al., 1995). Na especiao inica de uma soluo nutritiva, trs variveis determinam a disponibilidade de um dado on: a fora inica da soluo, que atua sobre a atividade inica individual; o pH, que propicia a presena das vrias espcies inicas; e a presena de agentes quelantes, que promovem o seqestro de alguns ons em maior ou menor escala.

4.1. Fora inica


Geralmente, quando a fora inica aumenta, ons de cargas opostas interagem de tal forma que sua atividade inica diminui, e ento, o nmero de ons ativos diminui. Pesquisadores na rea de solos, aparentemente, foram os primeiros a desenvolver o conceito de que as respostas das plantas se correlacionam melhor com a atividade do que com a concentrao analtica de ons inorgnicos (Adams, 1971). O Quadro 9 mostra que a atividade inica mais prxima da concentrao analtica tanto quanto mais diluda for a soluo. Em solos, essa situao agravada devido s mudanas observadas nas reaes de troca inica. Em estudos com soluo nutritiva, entretanto, no faz diferena em se utilizar atividade ou concentrao inica, pois a maioria das solues nutritivas utilizadas possui fora inica na faixa de 5 a 20 mmol L-1, onde as comparaes podem ser realizadas razoavelmente utilizando-se tanto atividade quanto concentrao inica. Cuidado adicional deve ser tomado quando se trabalha com o on Al3+, que tem a atividade fortemente reduzida pelo aumento da fora inica da soluo.

25

Quadro 9. Efeito da fora inica nos coeficientes de atividades individuais on ri x 10-8 1


1

Fora inica (mmol L-1)


5 10 50 100

coeficiente de atividade de ons univalentes 2 K+, OH-, Cl-, NO3Na+, HCO3-, H2PO4H+ 3 4 9 0,964 0,964 0,967 0,925 0,927 0,933 0,899 0,901 0,914 0,805 0,815 0,860 0,755 0,770 0,830

coeficiente de atividade de ons bivalentes SO42-, HPO42Ca2+, Fe2+ Mg2+ 4 6 8 0,867 0,870 0,872 0,740 0,749 0,755 0,660 0,675 0,690 0,445 0,485 0,520 0,335 0,405 0,450

coeficiente de atividade de ons trivalentes PO43Al3+, Fe3+


1 2

4 9

0,725 0,738

0,505 0,540

0,395 0,445

0,160 0,245

0,095 0,180

ri = raio da atmosfera inica.


Coeficiente de atividade: razo entre a atividade e a concentrao analtica do on.

4.2. pH
Alguns trabalhos mostram que a absoro por plantas, de nions que exibem um comportamento de cido ou base fraca, depende do pH e do seu efeito na especiao. Para alguns nions, o efeito pode ser observado como um aumento do cotransporte do nion com prtons (Marschner, 1995). O potencial transmembrana negativo nas clulas torna o processo de entrada na clula de qualquer nion um transporte ativo, onde qualquer reduo da carga aninica reduz o potencial da barreira energtica de entrada do on na clula. Alguns exemplos incluem a maior absoro de H2PO4- em relao ao HPO42- (Hendrix, 1967) e maior absoro de H3BO30 do que B(OH)4- (Oertli & Grgurevic, 1975). Outro exemplo o aumento da toxidez de N amoniacal s razes de algodo com o aumento do pH (Bennett & Adams, 1970). A maioria das solues 26

nutritivas so pouco tamponadas, e o pH varia bastante, no se mantendo dentro de uma faixa ideal. Diferentemente do solo, a faixa de pH ideal deve situar-se entre 5,0 e 6,0, pois valores de pH diferentes destes ocasionam alterao nas formas livres e complexadas dos nutrientes. Com relao aos macronutrientes, apenas as formas disponveis de Ca e de P so negativamente afetadas por aumentos no pH da soluo nutritiva. A partir do pH 6,0 ocorre reduo na disponibilidade de Ca2+ e HPO4- Furlani et al. (1999). Em pesquisas com Al e metais pesados, importante observar o efeito do pH na disponibilidade do metal livre, pois o Al e o Sr tm sua disponibilidade reduzida em pH mais elevado ou formam precipitados. importante observar que o efeito do pH varivel com a fora inica da soluo, bem como a concentrao dos elementos. A simulao de uma soluo de Hoagland com 40 mol de cloreto de alumnio mostra que a concentrao preponderante sobre a disponibilidade e a formao de precipitados de Al (Figura4). Assim, o Al em soluo nutritiva s ocasiona restries ao crescimento vegetal quando em solues altamente diludas ou em altas concentraes de Al (Pintro et al., 1999).

27

100 80 Composto formado pelo metal (%) 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0

100% da Soluo de Hoagland Fora Inica Al - EDTA

10 8 6 Fora Inica (mmol.L-1)


28

4 2 0 25 % da Soluo de Hoagland Al-OH - slido Al3+ - livre


10 8 6 4 2 0

3,8

4,0

4,2 pH

4,4

4,6

Figura 4. Efeito da concentrao da soluo nutritiva de Hoagland na disponibilidade de Al


(adio de 40 mol L-1 de AlCl3) e na formao de quelato de EDTA e hidrxido precipitado em funo do pH; simulao com o programa GEOCHEM-PC (Parker et al., 1995).

4.3. Quelatos
A presena de agentes quelantes tambm determinante no resultado da especiao inica da soluo. Um bom exemplo disso o Fe, normalmente quelatado nas formas de FeDTPA (dietileno triamino penta acetato de ferro), FeEDTA (etileno diamino tetra acetato de ferro), FeEDDHA (etileno diamino di-orto hidroxi fenil acetato de ferro) e FeEDDHMA (etileno diamino di-orto hidroxi para metil fenil acetato de ferro).

Para o Fe (Figura 7) e demais ctions micronutrientes (Quadro 10), as alteraes nas formas livres e complexadas so dependentes do pH e do quelato de Fe utilizado. Considerando a faixa normal de pH das solues nutritivas (5,5 a 6,5), o quelato FeEDDHA mais estvel que o FeDTPA e este mais estvel que o FeEDTA. Aumentos eventuais de pH na soluo podem comprometer a disponibilidade de Fe, acarretando sua deficincia. Desta maneira, comum ocorrer carncia de Fe em pH acima de 7, quando se utiliza o EDTA como quelante.

Composto de Ferro Formado (%)

100 80 60 40 20 0 4,5 5,0 5,5 6,0 pH 6,5 7,0 7,5 8,0 Fe-EDTA Fe-EDDHA Fe-DTPA Fe-OH (com EDTA) Fe-OH (com EDDHA) Fe-OH (com DTPA)

Figura 5. Formao de compostos de ferro em funo do quelato de ferro usado e do pH da


soluo nutritiva simulado com o programa GEOCHEM-PC (Parker et al., 1995). A adio de quelatos de Fe soluo tambm leva quelao de Cu, Zn e Mn. O quelato entra em soluo dissociando-se conforme sua constante de estabilidade, liberando o agente quelante que poder se ligar aos outros ons. A adio do quelato FeEDDHA como fonte de Fe (2,5 mg L-1) soluo nutritiva (Quadro 10) promover, em parte, a quelao apenas do Cu, enquanto outros agentes quelantes como o DTPA e EDTA tambm formam complexos com Zn e Mn. No caso do Zn, tanto o DTPA quanto o EDTA possuem capacidade semelhante e crescente de quelao a partir do pH 5,5. No caso do Mn, o EDTA tem capacidade de quelao superior ao DTPA, porm com importncia significativa apenas em pH superior a 7,0. Essas relaes na 29

soluo se refletem na absoro dos micronutrientes pelas plantas. Os dados da Quadro 15 indicam que as formas livres de Mn e de Zn so determinantes na absoro pelas plantas. No caso de plantas de alface, as concentraes de Mn e de Zn so maiores em plantas crescidas com soluo nutritiva contendo FeEDDHA do quem em plantas crescidas em soluo nutritiva contendo FeEDTA. Na primeira soluo, as quantidades de Mn e de Zn livres ocorrem em maiores propores do que em soluo com EDTA (Quadro 10). Em crisntemo (Quadro 11), o EDDHA e o DTPA proporcionam semelhantes concentraes livres de Mn, porm a concentrao de Zn maior na soluo com EDDHA (Quadro 10), refletindo em maior acmulo de Zn nas folhas (Quadro 11). Esses experimentos validam as simulaes das especiaes inicas realizadas com programas computacionais.

30

Quadro 10. Formao de compostos de Cu, Mn e Zn em funo do quelato de Fe e do pH da


soluo nutritiva.

Quelatos

Formas
4,5 5,0

pH da soluo nutritiva
5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0

Composto formado (%) FeEDTA


Cu2+ Mn2+ Zn2+ Cu EDTA Mn EDTA Zn EDTA 6,3 92,7 83,1 92,8 0,0 6,2 0,7 92,5 54,5 99,2 0,2 38,1 0,1 91,3 13,1 99,9 1,5 84,9 0,0 82,1 1,8 100,0 11,4 97,9 0,0 67,0 0,6 100,0 27,2 99,2 0,0 18,5 0,1 100,0 79,7 99,9 0,0 4,3 0,0 100,0 92,6 100,0 0,0 3,4 0,0 100,0 96,1 100,0

FeEDDHA

Cu2+ Mn2+ Zn2+ Zn OH Cu EDDHA Mn EDDHA Zn EDDHA

28,1 92,6 88,6 0,0 67,7 0,1 0,0

22,1 92,6 88,1 0,1 74,4 0,1 0,0

13,5 92,6 86,6 0,4 84,0 0,1 0,0

6,5 92,6 82,9 1,1 91,3 0,1 0,0

6,6 92,0 81,2 3,4 88,8 0,0 0,0

1,4 91,4 77,8 10,4 95,9 0,1 0,0

0,1 89,8 63,8 27,3 98,3 1,1 0,1

0,0 75,1 37,9 53,6 98,8 13,6 0,8

FeDTPA

Cu2+ Mn2+ Zn2+ Cu DTPA Mn DTPA Zn DTPA

2,9 92,7 79,5 96,7 0,0 10,4

0,6 92,7 62,0 99,3 0,0 29,6

0,1 92,6 33,9 99,9 0,1 60,9

0,0 92,0 11,1 100,0 0,8 86,6

0,0 89,9 5,7 100,0 2,3 93,0

0,0 68,3 0,5 100,0 25,3 99,4

0,0 9,1 0,0 100,0 90,0 100,0

0,0 0,4 0,0 100,0 99,5 100,0

31

Em uma hidroponia comercial, observou-se em certa ocasio que a adio acidental de grande quantidade de sulfato de zinco. Apenas a no adio do sal de Zn com a adio de maior quantidade de Fe-EDTA foi suficiente para recuperar as plantas com sintomas de toxidez de Zn. Quando foi utilizado Fe-EDDHA, qualquer excesso de Zn causava sintomas caractersticos de reduo abrupta no crescimento radicular, com grave deficincia de Fe. A partir do uso de FeEDTA, esses sintomas desapareceram, mesmo quando a anlise da soluo nutritiva mostrava uma concentrao de Zn potencialmente fitotxica. Tanto o tipo de quelato de Fe utilizado, quanto as concentraes de P e S (que formam complexos com Zn) podem explicar porqu podese encontrar altas concentraes de Zn na soluo nutritiva, acima de 0,5 mg L-1 (10 vezes acima do recomendado na soluo de Hoagland), sem que haja sintomas visuais de toxidez de Zn. Muito h que ser pesquisado para uma perfeita compreenso dessas relaes.

Quadro 11. Teores de Mn e Zn em folhas de alface e de crisntemo cultivadas em soluo


nutritiva com diferentes quelatos de ferro.

Quelato de Ferro

Teor de Mn
mg kg-1

Teor de Zn

Folhas de alface 1 FeEDDHA FeEDTA 125,2 a 80,9 b 69,0 a 38,4 b

Folhas de crisntemo 2 FeEDDHA FeDTPA


(1)

219,6 a 230,6 a
(2)

104,6 a 45,8 b

Furlani (dados no publicados);

De Kreij & Paternotte (1999). Para cada espcie

vegetal, mdias seguidas por letras iguais em cada coluna no diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5%.

32

5. CINTICA DE ABSORO DE NUTRIENTES


As solues nutritivas tm larga aplicao em estudos de cintica de absoro de nutrientes em plantas. A absoro de ons presentes em solues de concentraes relativamente baixas, pelos vegetais, segue, geralmente, a cintica de Michaelis-Menten (Epstein, 1975), cujo modelo matemtico representado pela equao:

I=

Vmax C Km + C

(1)

em que I o influxo ou velocidade de absoro do on (mol g-1 h-1) numa soluo de concentrao C (mol L-1). As constantes Vmax (mol g-1 h-1) e Km (mol L-1) representam a velocidade mxima de absoro e a concentrao em que a velocidade de absoro corresponde metade da Vmax, respectivamente. Para facilitar o clculo das constantes foram propostas diversas transformaes, que permitem obter formas lineares da equao de Michaelis-Menten. Assim, Lineweaver & Burk (1934) relacionaram os valores inversos de I e C por meio da equao:

1 Km 1 1 = + I Vmax C Vmax
e Hofstee (1952) estimou I em relao a I/C:

(2)

I = K m

I + Vmax C

(3)

Uma representao no-linear foi proposta por Claassen & Barber (1974). Eles caracterizaram a absoro pela velocidade de diminuio da quantidade, Q (mol), do nutriente na soluo. Esse valor depende da concentrao, C (mol L-1), e do volume da soluo, v (L), no tempo t (h):

Qt = Ct vt

(4)

A representao grfica de Q, em relao ao tempo t, denota a diminuio da quantidade do on em soluo com o tempo, em conseqncia da absoro pela planta. O influxo, em 33

qualquer ponto da curva, ser o valor correspondente a dQ/dt dividido pela massa radicular. Pode-se tambm usar o comprimento ou a superfcie das razes. Claassen & Barber (1974) ajustaram Q vs t a uma srie de funes cbicas ou parablicas e estimaram as constantes de Michaelis-Menten. Essas constantes podem, tambm, ser determinadas graficamente. Neste caso, a declividade da poro de maior comprimento dentro da curva, aproximadamente linear, permitir o clculo de Vmax e a tangente, na parte mais curva da representao, com valor equivalente metade da declividade anteriormente determinada, indicar o Km. Para minimizar as imprecises devidas a uma estimativa exclusivamente grfica, Ruiz (1985) props uma aproximao matemtica para o clculo das constantes Vmax e Km. Os dados que sero utilizados para exemplificar o mtodo resultaram de um ensaio de absoro de fsforo, conduzido em cmara de crescimento, usando soja como planta-teste. Nesse ensaio usou-se uma concentrao inicial de fsforo igual a 32,29 mol L-1, estimando-se a absoro do nutriente pela diminuio da atividade de
32

P na soluo, amostrada a cada meia hora. Essa atividade foi

corrigida para o tempo de contagem, devido meia vida, relativamente curta, do 32P. O volume de soluo para cada tempo, vt, foi calculado levando em conta o volume inicial, vi (0,801 L), o volume aps 24 horas, vf (0,410 L), o volume amostrado, va (0,026 L) e uma taxa de transpirao uniforme, uma vez que a iluminao e a temperatura foram mantidas no mesmo nvel por 24 horas. O valor do va resulta de uma amostragem inicial (tempo zero) de 0,002 L, acrescido de amostragens de 0,001 L cada meia hora, at totalizar 12 horas de ensaio. Assim, va foi estimado a cada meia hora, no intervalo de 0 a 12 horas, usando a equao:

v vf va v t = v i 0,002 i + 0,002 t 24
A concentrao para cada tempo, Ct, foi calculada pela equao:

(5)

a v C t = C0 t t a 0 v0

(6)

34

em que a a atividade do 32P corrigida, v o volume estimado (equao 5) e os subndices 0 e t os tempos zero e t, respectivamente. Com os valores de vt e Ct calculou-se a quantidade do nutriente em soluo por meio da equao 4. No Quadro 12 apresentam-se os dados de uma repetio desse ensaio, que foram utilizados para exemplificar o clculo das constantes de Michaelis-Menten. A seqncia do ajuste grfico e matemtico foi a seguinte: a) Os valores de Q = f(t) foram representados graficamente (Figura 8); b) Na regio inicial da curva, onde so observadas as maiores declividades, escolheu-se, em seqncia ininterrupta, os pontos que melhor se ajustaram a uma reta (intervalo de 1 a 3,5 horas, no exemplo), determinando-se uma equao de regresso linear:

Q = a1 + b1t
em que a1 e b1 so os valores da intercepo e da declividade, respectivamente; c) Calculou-se Vmax pela equao:

(7)

b Vmax = 1 M
em que M a massa da matria seca das razes (0,9348 g, no exemplo);

(8)

35

Quadro 12. Tempo de exausto, atividade de

32

P, volume e concentrao da soluo e

quantidade de fsforo absorvida por plantas de soja em ensaio para determinar as constantes de Michaelis-Menten (Fonte: Ruiz, 1985)

Tempo
h 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5

Atividade
cpm 4.998,8 4.452,6 3.490,5 3.128,8 2.447,4 1.747,9 1.526,6 870,6 462,2 346,2 162,5 127,2 106,8 83,4 81,0 74,1 56,8 69,5

Volume
L 0,7990 0,7904 0,7818 0,7732 0,7646 0,7560 0,7474 0,7388 0,7302 0,7216 0,7130 0,7044 0,6958 0,6872 0,6786 0,6700 0,6614 0,6528

Concentrao mol L-1


32,29 28,45 22,06 19,56 15,13 10,68 9,22 5,20 2,73 2,02 0,94 0,72 0,60 0,46 0,44 0,40 0,30 0,37

Quantidade mol
25,80 22,49 17,25 15,12 11,57 8,08 6,89 3,84 1,99 1,46 0,67 0,51 0,42 0,32 0,30 0,27 0,20 0,24

36

Figura 6. Diminuio da quantidade de fsforo (Q) com o tempo de exausto (t) e equaes de
regresso usadas para o clculo das constantes de Michaelis-Menten.

d)

Na regio curva da parte inferior do grfico (intervalo 3,5 a 6,5 horas, no exemplo),

determinou-se a equao de regresso com melhor ajuste aos pontos experimentais, que exigisse somente 1 grau de liberdade para o modelo. Para os dados analisados, a melhor aproximao correspondeu a uma equao exponencial:

Q = a 2t b2

(9)

em que a2 e b2 so o coeficiente e o expoente, respectivamente. O critrio de menor soma do quadrado dos desvios (Nelson & Anderson, 1977) foi usado para escolher os pontos da reta e da curva. Considerando que a exausto um fenmeno contnuo usou-se, como critrio, a coincidncia do ltimo ponto da reta com o primeiro ponto da curva;

37

e) Km foi calculada por uma relao semelhante equao 4:

Km =

Qm vm

(10)

em que Qm a quantidade de ons para a qual a velocidade de absoro equivale metade da Vmax e vm o volume de soluo correspondente. Qm o ponto da curva da regio inferior do grfico em que sua tangente iguala-se metade da declividade da reta usada no clculo de Vmax. Matematicamente:

1 d (a1 + b1t ) = d a 2 t b 2 2 dt dt

(11) (12)

1 b1 = a 2 b 2 t m (b 2 1) 2
em que tm o tempo em que Q iguala-se a Qm. Reordenando:
1 (b 2 1)

b1 tm = 2a b 2 2

(13)

Calculando tm estimou-se vm, Qm e Km pelas equaes 5, 9 e 10, respectivamente. Os valores numricos obtidos com os dados apresentados no Quadro 16 foram os seguintes: Equao da reta: Equao da curva: Q Q Vmax tm vm Qm Km = = = = = = = 22,70 5,4417 t 592,85 t -4,0791 5,821 mol g-1 h-1 3,81 h 0,733 L 2,531 mol 3,453 mol L-1 R2 = 0,987*** R2 = 0,980***

O mtodo grfico-matemtico envolve um volume aprecivel de clculos matemticos para alocao dos pontos experimentais, o que o torna um processo demorado. Para superar essa 38

dificuldade Ruiz & Fernandes Filho (1992) desenvolveram o programa CINTICA, inicialmente em DOS, que executa de forma rpida e confivel os clculos necessrios. Uma nova verso desse programa, em ambiente Windows foi desenvolvido por esses autores, e pode ser obtido a partir do link ftp://ftp.solos.ufv.br/cinetica . interessante observar, que embora esse mtodo tenha sido desenvolvido para sistemas estticos (vasos), Cometti (2003) empregou com sucesso o programa CINTICA a sistemas de hidroponia NFT, para estudar a cintica de absoro de NH4+ e NO3- por alface.

39

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43

CAPTULO 5
ABSORO DE NUTRIENTES Manlio S. Fernandes1 e Sonia R. Souza2
1 2

Departamento de Solos, UFRRJ

Departamento de Qumica, UFRRJ

SUMRIO

1 2 3 4 5 6 7 8

TRANSPORTE ATRAVS DA PAREDE CELULAR E DA MEMBRANA PLASMTICA. 2 MEMBRANA PLASMTICA E A ABSORO ONS. ........................................................ 13 ENERGTICA DO PROCESSO DE ABSORO ................................................................. 21 CONTROLE DE pH NAS CLULAS ...................................................................................... 36 CINTICA DE ABSORO DE IONS ................................................................................... 39 INTERAES INICAS.......................................................................................................... 44 TRANSLOCAO DE NUTRIENTES ................................................................................... 46 REFERENCIAS......................................................................................................................... 50

TRANSPORTE ATRAVS DA PAREDE CELULAR E DA MEMBRANA PLASMTICA. As clulas vegetais so separadas do meio externo por membranas. Genericamente falando,

as membranas permitiram o desenvolvimento da vida, pois criaram compartimentos separando o ambiente externo do ambiente interno, ao mesmo tempo em que possibilitam trocas entre estes ambientes. As membranas permitem assim que as clulas possam ter composio diferente daquela do meio que as circundam, ao mesmo tempo em que podem retirar do meio o material de que necessitam para o seu metabolismo e sua organizao estrutural. As clulas vegetais tm uma parede celular externa, rgida, composta na sua maior parte de material inerte, e que mantm a sua forma mesmo aps a morte da clula. Internamente, existe uma membrana, composta principalmente de material lipoprotico, e conhecida como plasmalema ou membrana plasmtica (Figura 1). Como pode ser visto na figura 1 a membrana plasmtica um delgado filme de fosfolipdios e protenas, pressionado contra a parede celular. Na verdade, pode-se dizer que a parede celular "contm" a membrana plasmtica e o citoplasma. Isto porque, o interior da clula um meio hipertnico em relao soluo do solo. Deste modo, a clula vegetal se em contacto livre com a soluo do solo tenderia a expandir explosivamente. Neste sentido, a clula vegetal contida pela parede rija que a circunda. A parede celular formada principalmente por uma rede de microfibrilas de celulose interligadas por feixes de glicanas (Figura 2). Este conjunto est embebido em uma matriz de hemicelulose e substncias pcticas. A celulose que forma as microfibrilas da parede celular um polissacardio, que ocorre em longos polmeros de unidades de D-glicose, que esto unidas por ligaes 1-4, este arranjo espacial confere celulose a conformao de longas fibras paralelas de 100 a 200 de largura. A unidade estrutural de repetio da celulose a celobiose formada pela unio de duas molculas de glicose. A cadeia glicana da celulose pode ter de 200 a mais de 25.000 resduos de glicoses. As molculas longas e rgidas da celulose combinam-se em orientao paralela, para formar as microfibrilas. Cada microfibrila pode ter aproximadamente 35 cadeias de celulose (Raven et al., 2001). Em fungos, as microfibrilas da parede celular podem ser formadas principalmente por quitina (polmeros de N-acetilglicosaminas). O dimetro das microfibrilas est entre 5 e 10 nm. A parede celular tem aproximadamente 100 nm de espessura, podendo conter de 5 a 10 camadas de microfibrilas (Figuras 1 e 2).

Clula A

Clula B

Figura 1. Clula vegetal destacando a parede celular e membrana plasmtica. Deslocamento de ons pelos macro e microporos, e atravs dos transportadores da membrana at o citossol.

Figura 2. Estrutura dos blocos de construo das substncias pcticas (cido -Dpoligalacturnico) depositadas nas microfibrilas de celulose da parede celular.

A hemicelulose um heteropolissacardeo composto de hexoses (glicose) pentoses (arabinose, xilose) e cidos urnicos (cido glicurnico). Na hemicelulose de gramneas a cadeia principal composta de xilanas ( 1-4-glicose-glicose) e a cadeia lateral de cido metil-glucurnico, enquanto as leguminosas apresentam xilanas no ramificadas. As substncias pcticas podem ser denominadas de homopolissacardeos, quando formadas por cido 1,4 D galacturnico, ou heteropolissacardeos, quando em sua constituio pode haver cido galacturnico, D-galactose, L-arabinose e L-ramnose. As substncias pcticas so

5 particularmente importantes para a nutrio mineral das plantas. Elas so formadas por polmeros do cido 1,4 D-galacturnico, geralmente esterificado com grupos metila. Estas substncias tm peso molecular variando entre 25.000 a 360.000. Os feixes de microfibrilas com seus depsitos de poligalacturatos esto representados na figura 2. Nessa mesma figura podem ser observados os resduos de cargas negativas sobre as microfibrilas. Na tabela 1, est a composio da parede celular de alguns tecidos vegetais:

Tabela 1. Composio da parede celular de alguns tecidos vegetais. Composio da parede celular (% de massa seca) Tecido Vegetal Milho (coleptilo) Trigo (folhas) Aveia (caule) Celulose 35 30 26 Hemicelulose 30 11 40 Pectatos 13 22 20 Protenas 13 Lipdios 21 1

As protenas na parede celular podem ser estruturais (como a extensina) ou enzimticas (oxidases, fosfatases, ATPases, estearases e outras). Essas protenas podem ser excretadas para o meio externo. Em geral essas protenas so consideradas "incrustaes" na matriz da parede celular. Protenas estruturais como a extensina so ricas em prolina e hidroxiprolina. Considera-se que a maior flexibilidade dos caules das plantas aquticas deve-se principalmente a converso de prolina em hidroxiprolina nos ambientes aquticos, devido a menor presso de oxignio. Esta organizao da parede celular permite a formao no seu interior de microporos e macroporos. Estes poros tm em torno de 3 a 5 nm de dimetro, e em torno de 100 a 200 nm de comprimento (Figura 2) Diversas substncias que esto incrustadas ou apenas sobrepostas s microfibrilas de celulose tm grande importncia para a nutrio das plantas. Protenas, particularmente as que tm atividade enzimtica podem estar depositadas sobre a superfcie dessas microfibrilas. Tambm podem ocorrer deposies de acares e de lipdeos. Entretanto, so as deposies de cidos poligalacturnicos e seus steres (as substncias pcticas), que afetam intensamente a circulao de ons dentro e atravs da parede celular (Figura 2). As pectinas podem dar origem a pectatos como os de clcio, que afetam grandemente a rigidez das membranas. As microfibrilas de celulose, nas plantas superiores, no formam uma parede contnua, mas so constitudas de cadeias de polisacardeos de tamanho varivel, que se fixam atravs de ligaes

6 no-covalentes com a matriz que as envolve, e pela coeso desenvolvida pelas foras fsicas resultantes de seu enovelamento. Por sua natureza, as microfibrilas de celulose no tm praticamente qualquer expansibilidade, e por essa razo, os movimentos de expanso celular ocorrem atravs do rompimento das ligaes no-covalentes entre as microfibrilas e a matriz. Nessa situao, as microfibrilas e matriz podem deslizar umas sobre as outras, permitindo assim que a clula se expanda cedendo s presses de turgor. Embora ainda no se conheam em todos os detalhes do exato mecanismo atravs do qual as paredes celulares expandem, permitindo o crescimento celular, certo que este fenmeno envolve a acidificao do espao livre, e portando a ao das bombas inicas de extruso de H+. A acidificao do espao livre ativa a ao de um grupo de enzimas que atua neste processo; as expansinas. Aparentemente, a ao das expansinas se d atravs do rompimento das ligaes nocovalentes que ligam as microfibrilas de celulose matriz de hemicelulose e pectinas. Ou seja, as expansinas rompem as pontes de hidrognio que unem os feixes de microfilbrilas. Este rompimento de ligaes no-covalentes permite ento o deslizamento dos feixes de microfibrilas. Diversas outras enzimas so tambm ativadas quando da acidificao do espao livre. Entre elas destacamos as endoglicanases que cortam as glicanas da matriz em segmentos menores, o que contribui para diminuir a resistncia da parede celular. Dentro da parede celular temos os micro e macroporos formados pela organizao das microfibrilas de celulose, hemicelulose e lignina, com incrustaes, depsitos de cidos orgnicos, protenas estruturais e outros compostos que ajudam a formar a estrutura da parede celular (Figuras 1 e 2). Estes macro e microporos conectam-se com os espaos intercelulares e formam um continuum. A este conjunto formado pelos espaos intercelulares e poros da parede celular chamamos de espao livre. Na verdade, este espao est dividido em dois: um espao em que gua e ons circulam livremente, e um outro, em que ons de um sinal circulam livremente, enquanto que ons de outro sinal tm a sua circulao restrita. Assim por exemplo, Cl- e SO4= poderiam circular livremente neste espao, enquanto que K+ tem a sua circulao limitada. Isto d origem ao conceito de " espao livre aparente ". A figura 1 mostra o conjunto formado pelo espao intercelular e poros na parede celular, formando o o espao livre aparente. Na figura 1, o espao intercelular e o poro com gua (H2O)

7 formam o espao livre de gua. gua e solutos podem circular no espao livre (com restries devido carga). Solutos podem entrar e sair dos poros, dependendo dos gradientes de concentrao, e pode ocorrer troca com o meio externo (soluo do solo). No apenas ons podem circular no espao livre, mas tambm molculas como acares, aminocidos e outras. Consideramos estar na endoderme o limite interno do espao livre porque nem a gua nem os solutos podem atravessar os seus espaos intercelulares, uma vez que, eles esto cimentados com suberina que recobre as clulas e as une como o cimento une uma parede de tijolos, embora essa limitao no seja absoluta, principalmente nas reas de crescimento da raiz. ons e gua podem circular dentro da parede celular, atravs de seu sistema de poros, mas no conseguem atravessar a membrana interna (plasmalema), que com a sua natureza lipo-protica, impermevel a ons e gua. Assim podemos estabelecer os limites do espao livre das razes como sendo o espao entre a epiderme, a endoderme e a plasmalema das clulas do crtex radicular (Ver captulo 2, neste volume). Qualquer espcie inica, o K+ por exemplo, pode difundir livremente da soluo do solo para o interior das razes, circulando pelo espao livre, seja no espao intercelular ou nos poros dentro da parede celular. Veja o exemplo do macroporo na clula B da figura 1. A maior ou menor circulao desse on no espao livre vai depender da concentrao relativa do on nos diversos compartimentos (macro e microporos-espao intercelular) e da eventual interferncia de foras de adsoro. Eventualmente o on pode ser perdido para o espao externo. Por esta razo no se pode considerar que os ons que circulam no espao livre radicular tenham sido realmente absorvidos. Embora eles estejam dentro da raiz, podem ser facilmente perdidos para o meio externo por simples difuso. S so considerados realmente absorvidos os ons que atravessam a membrana plasmtica e passam para o espao interno da clula. A passagem de um on do espao externo (espao livre) para o espao interno da clula s ocorre atravs de stios especficos na superfcie da plasmalema. Se um on no encontra o seu stio especfico de absoro, pode circular por macro e microporos, voltar para o espao intercelular, ou sair do espao livre. Uma vez que tenha atravessado a plasmalema, entretanto no pode mais voltar livremente ao espao externo. Foi absorvido! (Figura 1). O continuum formado pelo conjunto dos espaos intercelulares e poros da parede celular que resulta numa via de deslocamento de ons tambm chamado de apoplasma, e essa via de deslocamento a via apoplstica (Figura 3).

8 A absoro de um on (passagem para o interior da clula) pode ocorrer em uma das clulas da endoderme atravs de sua superfcie exposta (no revestida de material suberificado). Neste caso, o on atravessa uma nica clula, e chega ao parnquima vascular. A absoro pode tambm ocorrer em uma das clulas corticais, ou numa clula da epiderme. Nestes dois ltimos casos o on absorvido tem que ser deslocado, de uma clula a outra at chegar finalmente ao parnquima vascular. O caminho a ser percorrido, de clula a clula, tornado possvel graas a uma intensa rede de comunicao clula a clula, os plasmodesmas (Figura 3 e captulo 2). O plasmodesma um prolongamento do material celular que passa atravs de poros na parede celular. formado por um desmotbulo, e tem uma espcie de revestimento citoplasmtico. O desmotbulo o prolongamento do retculo endoplasmtico de duas clulas adjacentes. A maior parte do transporte clula a clula, entretanto, pode ser feito atravs do revestimento citoplasmtico. Os plasmodesmas ocorrem em uma densidade que pode ir de 0,1 a 10,0 por m2 (cerca de 20.000 por cada parede tangencial, ou 5 X 108 /cm2) (Ver captulo 2 neste volume). Estes canais ligam as clulas desde a epiderme at a endoderme formando um continuum. A este conjunto chamamos de simplasma. Os ons que se deslocam de clula a clula atravs do simplasma esto seguindo a via simplstica (Figura 3). Seguir a via simplstica uma maneira de contornar as limitaes e/ou restries ao deslocamento que os ons enfrentam, nos diversos compartimentos do espao livre aparente. Algumas espcies inicas, de absoro muito rpida so quase que totalmente absorvidas nas clulas epidrmicas ou nas primeiras camadas de clulas corticais, o que significa que praticamente s alcanam a rea vascular das plantas por deslocamento atravs do simplasma. O on fosfato (H2PO4-) uma dessas espcies. Outros ons como o K+ deslocam-se facilmente por via apoplstica. Na figura 3 esse movimento do on H2PO4- pode ser visto desde a clula epidrmica (1 esquerda) at as clulas do parnquima vascular.

Figura 3. Deslocamento de ons, desde a soluo externa at o xilema; por via apoplstica (K+), ou simplstica (H2PO4-).

O deslocamento por via simplsmica resulta em um significativo aumento das possibilidades de partio ao longo da via de transporte. No caso do fsforo, quando ocorre deficincia desse nutriente h uma partio desequilibrada de matria seca entre raiz e parte area. Como o on fosfato tem que percorrer a longa via simplsmica, sob deficincia, a demanda metablica ao longo da via de transporte retira o fsforo da rota de deslocamento e o incorpora ao metabolismo das clulas da raiz. Disso resulta o fato de que sob deficincia de P, as razes crescem proporcionalmente mais do que a parte area (Tabela 2).

10 Tabela 2 Massa seca das Folhas e das razes de plantas de hortel aos 64 dias aps o transplantio (DAT) em cultivo hidropnico com diferentes doses de N e P (Souza et al., no prelo) Tratamento T1 T2 T3 T4 Teor (mg/L) N-NO3 120 60 120 60
-

-------Massa Seca (g/5 plantas) ------Razes 30,5 b 29,5 b 37,7 a 37,8 a Folhas 122,9 a 81,2 b 73,8 c 65,8 d

P 16 16 4 4

Letras minsculas iguais na mesma coluna no diferem significativamente (Fisher LSD 5%).

O espao livre aparente subdividido em dois: o espao livre de gua, e espao livre de Donnan. O espao livre de gua aquele em que gua e solutos circulam livremente, enquanto que o espao livre de Donnan, aquele onde existem limitaes para circulao de ions. Para entender a origem e extenso deste espao (de Donnan), voltamos a nossa discusso a respeito da deposio de cidos galacturnicos sobre a superfcie das microfibrilas de celulose. Pela figura 2 vemos que os cidos galacturnicos so cidos orgnicos de cadeia longa. O pK dos grupos carboxlicos desses cidos est em torno de 3,5. Isto significa, que nas condies normais de equilbrio entre a soluo do solo e o apoplasto, estes cidos estaro dissociados (o pH da soluo do solo, em solos normais est entre 5,0 e 7,0 ). Quando o espao intercelular e os macro e microporos das clulas entram em contacto com a soluo do solo, ocorre um arraste e eventual substituio dos prtons do cido. Pode ento ocorrer uma troca de ctions (H+ por K+ por exemplo), com os resduos de carga negativa formando uma superfcie de carga negativa fixa. Essas cargas fixas formam uma superfcie de troca de ctions. Esta superfcie, capaz de trocar ctions a origem da capacidade de troca de ctions das razes, ou CTCR (Figura 4). Nos microporos, se estas cargas estiverem muito prximas, e sua densidade for grande, forma-se uma barreira para a livre difuso dos ons. Os ons Cl- , NO3- e H2PO4- por exemplo teriam grande reduo de sua velocidade de difuso sob essas condies. Por outro lado, os ctions seriam atrados por essas superfcies carregadas. A intensidade dessa atrao depende da densidade das cargas eltricas fixas, e da valncia do on. Assim por exemplo, em uma superfcie de pequena densidade de carga um on monovalente como o K+ seria atrado com muito maior facilidade do que um on trivalente como o Al+++ (Figura 4A e 4B). Por outro lado em uma superfcie de alta densidade de carga, ctions de maior valncia como o Ca++, seriam atrados com maior intensidade, e teriam maior atividade do que os ons monovalentes (Figura 4D). Deste modo, teremos como uma

11 regra geral: poros com baixa densidade de carga atraem preferencialmente ons monovalentes, em detrimento dos ons di e trivalentes, enquanto que, poros com alta densidade de carga atraem preferencialmente ons di e trivalentes, em detrimento dos ons monovalentes (Figura 4). ons trivalentes como o Al+++, tm uma interao to grande com superfcies de alta densidade de cargas, que praticamente entram em colapso sobre essas superfcies, formando ligaes quase covalentes (Figura 4C). Neste caso, dificilmente so substitudos nas superfcies de troca e reduzem a CTCR da planta (ver captulo 15 neste volume). Em geral, as monocotiledneas tm uma menor densidade de carga do que as eudicotiledneas. Plantas como o milho, arroz e brachiaria, tm uma densidade de carga (expressa em CTCR) em torno de 10 a 20 meq/100 g de razes secas, enquanto que soja e feijo tm suas CTCR em torno de 40 a 80 meq/100 g de razes secas. Esta variao da CTCR nos permite fazer algumas consideraes sobre a capacidade de diferentes plantas de extrair nutrientes do solo. Embora a CTCR seja um dentre os inmeros fatores que afetam o processo de aquisio de nutrientes pelas plantas, se colocarmos sob as mesmas condies ambientais duas razes com diferentes CTCR e do mesmo tamanho, podemos esperar que as plantas de menor CTCR sejam mais eficientes na absoro de K+, enquanto que as plantas de maior CTCR absorvero Ca++ e Mg++ mais eficientemente, se todos os outros fatores forem mantidos constantes. Glass et al. (1992) observaram que a absoro de ctions monovalentes (K+ e Na+) diminui, e a absoro de ctions divalentes (Ca++ e Mg++) aumenta, medida que a CTCR das plantas aumenta. Este fenmeno importante no desenvolvimento de espcies de plantas calccolas ou calcfugas.

12

Figura 4. Superfcies de cargas nos macro e microporos da parede celular

13

MEMBRANA PLASMTICA E A ABSORO ONS. A membrana celular (plasmalema ou membrana plasmtica) formada por uma dupla camada

de fosfolipdios e incrustada de protenas apresenta o seu interior hidrofbico, portanto impermevel gua e a espcies inicas (Figura 5).

Figura 5. Diagrama representativo de um segmento de membrana biolgica: dupla camada de fosfolipdios e protenas.

A absoro de ons atravs das membranas ocorre necessariamente atravs de stios especficos, de origem protica (protenas integrais da membrana), que permitem a passagem dos ons do meio externo para o interior das clulas. Essas protenas integrais de membrana formam os trs sistemas que atuam no transporte de ons: as bombas inicas, os transportadores de ons e os canais inicos (Figura 6).

14 As bombas inicas atuam no transporte unidirecional de ons (uniporte), e esto acoplados a sistemas geradores de energia (ex. H+-ATPases). A velocidade de transporte das bombas inicas de 100 ons/segundo. Os transportadores de ons (carreadores) podem ser unidirecionais (uniporte); podem atuar na troca de uma espcie inica por outra (antiporte), ou no transporte simultneo de ons (simporte). Sofrem mudanas conformacionais durante o transporte. A velocidade de transporte variar de 300 a 1000 ons/segundo. Os canais inicos so de alta velocidade. Transportam apenas a favor de gradientes de potencial eletroqumico. A velocidade de transporte dos canais inicos pode variar de 106 a 108 ons/segundo.

Figura 6. Sistemas de transporte atravs da membrana plasmtica.

15 A seguir feita uma descrio detalhada dos sistemas de transporte. a) Bombas inicas As bombas inicas atuam no transporte ativo de ons, com o uso direto de energia metablica. Geralmente so sistemas que incluem ATPases ou Pirofosfatases. Estes transportadores usam a energia gerada pela hidrlise de ligaes de alta energia (ATP ou PPi), sofrem mudanas conformacionais, e voltam ao estado inicial aps transportar o on. Entre as bombas inicas, sem dvida a mais estudada a bomba inica de extruso de prtons. A extruso de prtons, conhecida como "transporte ativo primrio" um mecanismo gerador de eletrogenicidade, e portando atua sobre as diferenas de potencial que compem, junto com as atividades da espcie inica, o potencial eletroqumico que determina as caractersticas do transporte ativo ou passivo. Foram identificadas bombas de prtons que atuam tanto na membrana plasmtica como na membrana do vacolo (tonoplasto). Na plasmalema, a bomba de extruso de prtons atua, tornando o interior da clula mais negativo e criando um gradiente de prtons entre o exterior e o interior da clula (gradiente protoninico). No tonoplasto, foram identificadas bombas de prtons que atuam no sentido citoplasma vacolo, que so as H+-ATPases e as H+-PPases. No caso de transporte atravs do tonoplasto, um gradiente protoninico criado de dentro para fora (vacolo citoplasma) (figura 7).

Figura 7. Sistemas de transporte de ons na clula: (1) P-H+-ATPase; (2) Transportador de nitrato (simporte com 2H+); (3) Canal inico; (4) V-H+-ATPase; (5) P-H+-PPase; (6) Transportador de nitrato (simporte com 1H+)

16 A P-H+-ATPase uma glicoproteina de aproximadamente 100 kDa com 10 hlices transmembrana (Figura 8), que hidrolisa ATP para gerar um movimento vetorial de H+ em direo ao apoplasto, criando gradientes de pH e potencial eltrico na membrana, o que viabiliza o transporte de ons e molculas para dentro ou fora da clula atravs de sistemas de transporte ativo secundrio.

H+ H+ H+ H+

H+

Apoplasto

Citosol
H+

H+3N

H+

H+

ATP FC Ao da FC ADP + Pi
14-3-3

COO

Figura 8. Forma estendida da P-H+-ATPase destacando as 10 hlices transmembrana, domnio de hidrlise do ATP e ao da fusicocina (FC) na extremidade auto-inibitria C-terminal, ativando irreversivelmente a enzima (Adaptado de Azevedo, L., tese de mestrado, UFRRJ, 2006). As P-H+-ATPase so fortemente inibidas por ortovanadato (HVO42-), um on anlogo ao fosfato (HPO42-) que compete com o fosfato do ATP pelo stio de fosforilao de um resduo de aspartato na enzima. Isso ocorre porque o ortovanadato muito parecido com a estrutura do fosfato no momento da hidrlise. Estas protenas so reguladas pela concentrao de substrato, temperatura, pH, e ons entre outros, e podem ser reversivelmente ativadas ou desativadas por diversos sinais exgenos como hormnios, luz, ataque de pragas e/ou patgenos, dentre outras. A regulao das P-H+-ATPase mediada por um domnio auto-inibitrio localizado na extremidade C-terminal da cadeia

17 polipeptdica (face citosslica), que atua na regulao da atividade hidroltica desta protena. Esta regulao pode tambm ser resultado da ao de quinases ou fosfatases que podem adicionar ou remover grupos fosfato nos resduos de serina ou treonina presente no domnio auto-inibitrio da enzima (Figura 8). A fosforilao destes resduos e a ligao da protena regulatria 14-3-3, resulta na ativao da enzima. Este complexo H+-P-ATPase-14-3-3 pode ser observado em plantas tratadas com fusicosina, uma toxina produzida pelo fungo Fusicoccum amygdali. A fusicosina liga-se ao complexo H+-P-ATPase-14-3-3 e o estabiliza, ativando dessa forma irreversivelmente a enzima. (Figuras 8 e 9).

A
0.8

B
K+ H+

C
300

CONTROLE
0.6
-1

FUSICOCCINA
250 200

meq K L

0.4

150 100

0.2 50 0.0 0

10 12 14 16 18 20 22 24 0

10 12 14 16 18 20 22 24 0

10 12 14 16 18 20 22 24

TEMPO (HORAS)

Figura 9. Efeito do vanadato (inibidor) e da fusicocina (estimulante) na atividade das H+ATPase nas razes de arroz. (A) Controle, (B) Com vanadato h uma completa inibio da extruso de H+ e consequentemente no h queda na concentrao externa de K+ (influxo de K+); (C) Ao contrrio, a fusicocina aumenta a extruso de H+ e a absoro de K+ (Bucher et al., no prelo).

A H+-ATPase vacuolar ou V-H+-ATPase uma enzima que acidifica compartimentos intracelulares e est localizada no apenas no tonoplasto, mas tambm no retculo endoplasmtico (RE), provacolos, membrana plasmtica, e outras membranas da via secretria. Essas enzimas diferem tanto estrutural quanto funcionalmente das P-H+-ATPases de plasmalema (Figuras 8 e 10). A V-ATPase estruturalmente mais relacionada as F-ATPases (ou F1Fo ATP-sintase) que normalmente funciona na sntese de ATP em mitocndrias, cloroplastos e bactrias. A V-ATPase usa a energia liberada durante a hidrlise do ATP para bombear prtons para o interior do lmem vacuolar, portanto criando um gradiente de potencial eletroqumico, e a fora

eq H L

VANADATO

-1

18 prton motriz para uma variedade de eventos de transporte de ons e metablitos. Dessa forma, a H+-V-ATPase gera um gradiente de pH atravs do tonoplasto explicando o fato do pH vacuolar ser tipicamente de 3 a 6 enquanto o pH do citosol se encontra por volta de 7,5. A V-ATPase composta de dois domnios estruturais. O domnio perifrico (V1) um complexo de 640 kDa responsvel pela hidrlise de ATP e contm oito diferentes subunidades (AH) de massa molecular entre 13 e 70 kDa com a estequiometria A3B3CDEFG2H1-2. O domnio integral (Vo) um complexo de 260 kDa responsvel pela translocao de prtons e composto de cinco subunidades (a, b, c, c, c) com massa molecular entre 17 e 100 kDa na estequiometria abccc4 (Kawasaki-Nishi, et al., 2003). A subunidade a forma dois hemi-canais em comunicao com os lados citoplasmticos e o lmem vacuolar e provavelmente o local por onde os prtons passam.

A B G

ADP+Pi
B A

H+
E C H a

ATP

D F d

c c c

Figura 10: Modelo rotacional de funcionamento das V-H+-ATPase. (Azevedo, L., tese de mestrado, UFRRJ, 2006, adaptado de Kawasaki-Nishi, et al., 2003).

Muitos estudos sobre a funo fisiolgica dessas protenas tem sido possveis graas existncia de inibidores especficos das V-ATPAses como a bafilomicina A1. Este antibitico inibe a atividade da V-ATPases de diferentes organismos em concentraes na faixa do nanomolar. A ao da bafilomicina A1 se d pela ligao desse inibidor ao setor Vo impedindo o fluxo de prtons atravs do canal de prtons da enzima. As V-H+-ATPase so tambm inibidas pela presena de NO3- no citossol. Esta caracterstica importante no metabolismo de N nas plantas.

19 Outro tipo de bomba de prtons, a H+-PPase trabalha paralelamente s V-ATPases para gerar um gradiente de prtons atravs do tonoplasto. A H+-PPase composta de um nico polipeptdio com massa molecular em torno de 80 kDa com tamanho aparente em gel de poliacrilamida de 67 a 73 kDa. A H+-PPase a nica bomba de prtons que utiliza um substrato de baixo custo energtico, o pirofosfato (PPi), sendo este, produto gerado por vrios processos biosintticos de macromolculas, como protena, DNA, RNA, celulose entre outras. comumente aceito que o requerimento diferenciado de energia entre as V- H+-ATPases e as H+-PPases pode prover uma plasticidade energtica necessria para manuteno da homeostase celular numa ampla faixa de condies metablicas. Por exemplo, tem sido argumentado que H+PPase a bomba predominante em tecidos jovens que contm um elevado contedo de pirofosfato oriundo das altas atividades biossintticas desses tecidos. Alm disso, a atividade das V-PPase nas clulas em crescimento ajuda a conservar o ATP, que moeda corrente de energia na clula. A sntese de H+-PPase vacuolar em determinadas plantas pode ser induzida por carncia de Pi, anoxia ou frio. Portanto, prope-se que esta enzima deva funcionar como um sistema para garantir a manuteno das funes essenciais da clula sob condies em que a produo de energia metablica (ATP) reduzida pela inibio do processo respiratrio. A gerao de um gradiente protoninico, no caso da plasmalema, fundamental para o transporte simultneo (simporte) de um on e de um prton como no caso do transporte de nitrato (NO3-/ 2H+) ou para o transporte de nitrato do vacolo para citoplasma (NO3-/ H+) (Figura 7). Gradientes protoninicos so tambm essenciais para o transporte (simporte) de acares e de aminocidos em plantas. Os transportadores de ons (carreadores) podem transportar ons atravs da plasmalema a favor de um gradiente de potencial eletroqumico (transporte passivo) sem troca por outra espcie inica de mesma carga (uniporte) ou permitir a troca de uma espcie inica de um sinal, por outra de mesmo sinal (antiporte). O transporte de Na+ para fora da clula atravs da plasmalema em troca de um H+, um exemplo de transporte do tipo antiporte. O transporte de K+ (de fora para dentro) um exemplo de transporte unidirecional (uniporte) (Figura 11). Os transportadores podem tambm fazer o transporte ativo de ons (contra um gradiente de potencial eletroqumico) em sistemas de cotransporte (simporte) em que o on, a ser transportado (ction ou anion) entra na clula contra o seu gradiente de potencial eletroqumico. A energia para esse processo obtida com a entrada simultnea de outro on, este sim, entrando a favor do seu gradiente de potencial eletroqumico.

20 A atividade das H+-P-ATPases gera um gradiente de prtons H+ entre o exterior e o p

interior da clula. Este acmulo de H+ no exterior da clula cria um potencial, com tendncia dos H+ a voltar ao interior eletronegativo da clula. Isso gera na verdade, uma fora prton motriz (Figura 11). A fora prton-motriz est relacionada ao potencial da membrana e a diferena de pH ( pH) entre os meios interno (citosol) e externo (espao livre):

p = - 2,303 RT/F. pH (R= constante dos gases; T=Temperatura absoluta; F= Constante de Faraday) A 25C, teremos: p= - 59 pH Por exemplo: com o potencial de membrana em -110mV e a diferena entre o pH externo e o pH interno ( pH) de 2,0; teremos: p=-228mV esta fora prton-motriz ( p) que energiza o transporte de outros ons, que por seu gradiente de potencial eletroqumico tem que ser absorvidos ativamente, nas que no dispem de um sistema ativo primrio (tipo bomba inica) para transporte.

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Figura 11. Gerao de gradiente de prtons (

+ H )

atravs da plasmalema.

ENERGTICA DO PROCESSO DE ABSORO Os nutrientes esto em concentraes muito pequenas no solo e para que esses nutrientes

possam ser retirados deste ambiente rarefeito, a estratgia desenvolvida pelas plantas foi a de criar uma grande superfcie radicular, para permitir contacto com o maior volume possvel da soluo do solo. Por outro lado, as plantas tambm desenvolveram uma grande superfcie foliar na parte area para permitir a captao mais eficiente da energia solar, que chega a superfcie das folhas em pequena densidade sob a forma de quanta de luz. A imagem usada fica assim justificada; uma grande superfcie de captao de nutrientes em contacto com o solo, e uma grande superfcie de captao de energia, aberta para o cu. Entre as duas, um eficiente sistema de transporte (Figura 12).

22

Figura 12. As plantas superiores apresentam duas grandes superfcies que so como uma imagem especular uma da outra, e ligadas por um sistema de vasos condutores (xilema e floema) para comunicao entre elas.

Na tabela 1 do captulo 1, neste volume, esto as concentraes dos nutrientes nas plantas. Em condies normais, as concentraes de nutrientes nas plantas podem exceder em muito as concentraes no solo. Experincias feitas com cenoura, por exemplo, mostram que os tecidos podem acumular K+ em concentraes 10.000 vezes maiores do que a concentrao na soluo em que esto imersas. Mesmo que as concentraes normais nos tecidos vegetais no sejam assim to elevadas, o fato que as plantas, e em particular as razes das plantas tm em geral uma concentrao de nutrientes muito maior do que a soluo do solo. A despeito desta grande diferena de concentrao, as plantas retiram do solo os nutrientes de que necessitam. Se os ons encontrados entre a soluo do solo e o interior das razes fossem distribudos naturalmente, de acordo com os princpios da fisico-qumica, deveria haver um deslocamento dos ons do local de maior concentrao para o de menor concentrao. No caso, como a concentrao de ons na planta (razes) maior do que na soluo do solo, deveria haver uma perda de ons pela raiz e um conseqente enriquecimento da soluo do solo em nutrientes. Entretanto, o que a experincia nos mostra que ocorre exatamente o contrrio: mesmo que a concentrao de ons em uma soluo externa seja 1000 vezes menor do que o das razes, ainda assim as plantas retiram este nutriente deste meio rarefeito e aumentam a concentrao do on em seus tecidos. Em outras

23 palavras, os ons podem se deslocar de um ambiente para outro (do solo para as razes) contra gradientes de concentrao. Agora vamos nos deter um pouco na questo; que foras seriam capazes de vencer a barreira formada pelos gradientes de concentrao durante o processo de absoro de nutrientes pelas plantas? Inicialmente vamos considerar que a entrada de nutrientes na clula pode ser passiva. Por passivo queremos dizer: energia metablica no est sendo usada diretamente no transportador, o que no significa como j vimos que este transporte esteja sendo feito sem gasto de energia. Todo e qualquer processo metablico usa energia. A questo onde e quando! No caso do transporte passivo, a energia metablica (no caso, energia obtida atravs da hidrlise de ATP) est sendo usada em outro processo, que usa essa energia para gerar gradientes de potencial atravs das membranas. So ento esses gradientes as foras que ajudam transportar os ons de fora para dentro das clulas. Em outras palavras, no transporte passivo ocorre um uso indireto da energia metablica, tornada disponvel pela hidrlise do ATP. No caso do transporte ativo, que feito contra um gradiente de potencial eletroqumico, energia pode ser usada diretamente pelo transportador, como o caso das bombas inicas, ou indiretamente, atravs da gerao de gradientes de prtons. O gradiente de prtons permite um cotransporte em que o H+ transportado a favor de seu gradiente (passivamente), enquanto que o elemento co-transportado (anions, acares, aminocidos) o contra seu gradiente (ativamente). Este tipo de deslocamento de solutos, de um local em que esto em menor concentrao, para outro em que esto em maior concentrao, em desacordo aparente com as leis da fsica, conhecido como "deslocamento contra um gradiente de concentrao". Vejamos, na tabela 3, o deslocamento de um soluto de um compartimento cuja concentrao 0,01 mM, para outros compartimentos de maior concentrao, e a energia necessria para este trabalho. Tabela 3. Deslocamento de um glicose de um compartimento cuja concentrao 0,01 mM, para outros compartimentos de maior concentrao, e a energia necessria para o processo (Adaptado Nelson e Cox, 2004) Concentrao de Glicose (mM) externa interna 0,01 0,1 0,01 1,0 0,01 10,0 Razo de concentrao 1:10 1:100 1:1000 Variao de Energia Livre (G) (Kcal / mol) 1,34 2,68 4,02

24 Como pode ser observado na tabela 3, temos um soluto (glicose), sendo transportado de um compartimento em que a concentrao de 0,01 mM para outros compartimentos em que as concentraes so 10, 100 ou 1000 vezes maiores. Para que isso ocorra, necessrio que alguma fora atue empurrando o soluto contra um gradiente de concentrao. Para um soluto neutro, como a glicose, por exemplo, possvel calcular qual a fora necessria para este trabalho, atravs da equao de Nernst: G = RT ln Ci Ce

(1)

Onde: Ci = concentrao interna e Ce= concentrao externa. No nosso exemplo : G = RT ln 0,1 0,01 Nesta equao, G a variao da energia livre no sistema (formado pelos dois compartimentos), R a constante dos gases, e T a temperatura absoluta. ln o logaritmo natural, no caso, da razo entre as concentraes interna e externa do on. Pelo que podemos ver na ltima coluna da tabela 2, a energia necessria para "empurrar" um mol de glicose contra um gradiente de concentrao duplica medida que a concentrao interna aumenta de 10 para 100 e de 100 para 1000 vezes. Estes dados indicam que tambm a absoro de ons pelas plantas a partir de baixas concentraes como as que ocorrem na soluo do solo, exigem energia, sendo feita contra um gradiente de concentrao. necessrio observar, entretanto, que no exemplo acima se trata de uma molcula neutra (glicose). Os nutrientes, entretanto, existem nas solues externas s razes como espcies inicas, tm carga. Neste caso, a equao tem que ser modificada para incluir a carga. A equao de Nernst pode ento ser modificada: G = RT ln C2 + ZF C1 (2)

Onde: Z a carga do on, F a constante de Faraday (96,493 Coulomb/Eqg) e a diferena de potencial eltrico atravs da membrana por onde o transporte est sendo mediado. Para que possamos entender melhor as aplicaes deste conceito preciso antes examinar o conceito de "potencial atravs da membrana", sua origem e suas funes.

25 Quando uma clula vegetal em equilbrio com a soluo externa examinada com um microeletrodo (do tipo Ling- Gerard ), observa-se que entre o interior da clula e a soluo externa, geralmente existe uma diferena de potencial em torno de - 100mV (interior negativo). Estes microeletrodos tm em geral pontas de 10 de dimetro quando so usados em algas gigantes, e de 1 de dimetro para clulas animais e vegetais. Os microeletrodos so feitos de vidro, e tm alta impedncia. Internamente o eletrodo imerso no citoplasma ou no vacolo e externamente na soluo que banha a clula. Os trabalhos clssicos nesta rea foram feitos com algas unicelulares (algas gigante) (figura 12).

Figura 12. Correntes eltricas podem ser formadas entre o interior da clula e o meio externo

A existncia deste potencial, em condies de equilbrio de fluxos, indica que as plantas tendem a manter um excesso de carga negativa no seu interior (em relao soluo externa). Estas cargas tm origem nos resduos de carga negativa resultantes da dissociao de cidos orgnicos, com posterior extruso dos prtons. Estes cidos podem ser de grande peso molecular ou no, o que pode lhes dar caractersticas de superfcies de cargas fixas. O pH citoplasmtico est em torno da neutralidade, os cido orgnicos tem um pK em torno de 3,5, assim sob condies normais de metabolismo estes cidos esto dissociados. Para que ocorra

26 um desequilbrio em favor das cargas negativas, necessrio que as plantas eliminem o excesso de H+, ficando na clula os resduos negativos (Figura 11). As plantas desenvolveram um eficiente sistema de eliminao de prtons, atravs das bombas inicas de extruso de prtons. A bomba inica de extruso de prtons o mecanismo central no processo de nutrio mineral das plantas. Este mecanismo gera direta ou indiretamente a energia que permite a entrada de espcies inicas nas clulas, mesmo contra um gradiente de concentrao (ou como veremos adiante, contra um gradiente de potencial eletroqumico). A bomba de prtons na verdade um transportador de ons, especfico para prtons que funciona usando energia metablica (ATP). O transportador, estimulado pela presena de H+ no meio interno, usa a energia gerada pela hidrlise do ATP para mudar de estado energtico, liga-se ao H+, e o bombeia para o meio externo, independentemente de troca por outro cation (do meio externo). , portanto, um sistema de transporte unidirecional chamado uniporte. (Figura 6) Uma transferncia unidirecional de cargas positivas gera eletronegatividade (pois no ocorre transporte simultneo de outro ction de fora para dentro, de modo a que a diferena de carga positiva pudesse ser compensada) (interior negativo). Deste modo quando um microeletrodo for inserido na clula, surge uma corrente. Este potencial que gerado entre o interior e o exterior da clula, atravs da plasmalema, denominado potencial de membrana ( ). Origem dos potenciais de membrana (desenvolvimento de cargas negativas no interior das clulas): O potencial qumico de um on J : -j = *j + RT Ln aj + VjP + zj FE O termo VjP indica o efeito da presso no potencial qumico. Nas razes, este termo negligvel.(considerando-se -j) R = constante dos gases T = temperatura absoluta aj = atividade qumica do on j z = valncia do on F = Constante de Faraday E = potencial eltrico em volts

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Consideremos as atividades do on j dentro e fora da clula:

- jo = *jo + RT Ln ajo + zj FEo

- j i = *ji + RT Ln aji + zj FEi

Exterior

Interior da clula

em condies de equilbrio : - j o = -ji Ei - Eo = RT ln ajo zj F aji

logo :

Por essa equao, verificamos que, em condies de equilbrio, o potencial gerado atravs da membrana depende da atividade qumica do on nos dois compartimentos. A bomba de prtons desloca este equilbrio em favor do compatimento externo, gerando eletronegatividade, e criando um gradiente protoninico. Potencial atravs da membrana. A difuso de um on (C+) com um coeficiente de permeabilidade diferente do co-ion gera um potencial (potencial de difuso). Quando existe um on fixo (por exemplo, os cidos orgnicos no citoplasma, ou as protenas estruturais) a direo do potencial dada pela carga do on fixo.

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A-o C+

A-i C+ C+X-

Exterior

Interior da clula

Onde: X-, o on fixo. Quando um on difunde livremente (e passivamente), sem ser afetado por outros ions ou por interaes com a membrana: Ej = Em Onde, Ej o potencial do on (potencial de Nernst) e o segundo termo, Em, o potencial da membrana. Quando Ej difere de Em, isso significa que foras outras que no a difuso esto agindo sobre os ons. Podemos agora voltar equao de Nernst, adequada para a incluso da carga dos solutos: G = RT ln Ce + ZF Ci Ce= concentrao externa de ons. Ci= concentrao interna de ons. A partir desta equao podemos calcular qual o potencial de membrana a partir do qual uma espcie inica pode ser transportada para o interior da clula, a favor do gradiente de potencial eletroqumico. Vejamos o potencial de membrana para a absoro de K. Em primeiro lugar, necessrio conhecer as concentraes externa e interna da espcie inica. No caso, teremos uma concentrao

29 externa (na soluo) de 1 mM. A concentrao interna (na clula) de 89mM (Lttge e Higinbothan, 1979) Arranjando a equao teremos: Ek+ = RT ln [K]e ZF [K] i Onde : (ZC+ =+1); (RT =25,3) ZF

Ek+ = 25,3 ln 1 89 Ek+ = -114 mV No exemplo citado (Lttge & Higinbotham, 1979), o potencial da membrana medido com eletrodo foi de -109 mV. A pergunta ento : dadas s concentraes de K+ (Ke/Ki), e o potencial de membrana (), a tendncia do on K ser de entrar ou de sair da clula? A fora potencial para entrada (ou sada) de um on ser: EDK= Em - Ek ou seja: EDK= (-109) - (-114) = 5 mV (D=drive) Com este resultado (+5) no haver tendncia de deslocamento de K+ para o interior da clula. Neste caso, o gradiente de potencial eletroqumico desfavorvel ao transporte (passivo) de K+. Para que o on possa ser transportado ser necessrio usar energia adicional, capaz de realizar o trabalho de transporte do on. A partir deste exemplo de Lttge & Higinbotham (1979), fizemos uma modificao nesse sistema de modo a permitir que se desenvolva um gradiente de potencial eletroqumico favorvel absoro passiva de K+. Um parmetro que pode ser modificado facilmente a concentrao externa de K (na prtica agronmica isso feito via aplicao de fertilizantes). Neste caso, por exemplo, vamos duplicar a concentrao externa de K. Teremos:

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[K]e = 2mM EK+ = 25,3 ln 2 89 EK+ = - 96 mV logo, EKD = -109 (-96) = - 14 mV (Em) (EK)

[K]i = 89 mM

Com este resultado negativo, o on K+, nessa nova situao, ser absorvido passivamente. Uma outra possibilidade seria estimular a atividade da bomba inica de extruso de H+, por exemplo, com a aplicao de Fusicocina, como pode ser visto na figura 9. Neste caso, e todos os outros fatores sendo mantidos constantes, o potencial da membrana () torna-se ainda mais negativo. Vamos supor, por exemplo, que como resultado do estmulo atividade das H+-ATPases, devido aplicao da Fusicocina, o potencial da membrana caia para 150 mV. Neste caso, e mantendo-se as mesmas concentraes iniciais interna (89 mM) e externa (1 mM), teremos o seguinte resultado: EDK+= -150 (-114) = -36 mV Tambm neste caso, o K+ pode ser absorvido, passivamente, graas ao gradiente de potencial eletroqumico favorvel, criado pela ao eletrognica da bomba inica de extruso de H+. Resumindo teremos: Transporte ativo: feito contra um gradiente de potencial eletroqumico Transporte passivo: feito a favor de um gradiente de potencial eletroqumico Quando transportadores do tipo simporte, aceitam o on a ser transportado ativamente em um stio, e o H+ em outro stio, a fora prton-motriz ( p) arrasta as duas espcies inicas para o interior da clula. Como pode ser visto na figura 7, o NO3- por exemplo, praticamente nunca teria condies de entrar passivamente em uma clula da raiz. Seu transporte teria que ser ativo. Neste

31 caso, a energia para o transporte contra um gradiente de potencial eletroqumico, fornecida pela fora prton motriz ( p). Em qualquer dessas formas de transporte, o transportador sofre mudanas de conformao. A velocidade de transporte desse sistema est em torno de 103 ons por segundo. Os canais inicos, formados por protenas, com uma frao apolar embebida no interior da plasmalema, e com o lmen formado com stios eletricamente carregados so mecanismos de transporte de grande velocidade (106 a 108 molculas por segundo), reduzindo a energia necessria para o transporte atravs da membrana. Os canais inicos atuam sempre a favor do gradiente de potencial eletroqumico, e pela sua velocidade so retificadores de corrente. Quando abertos, os canais inicos formam poros seletivos que transportam ons sem que ocorram mudanas de conformao na protena (Zimmermann & Sentenac, 1999). Canais inicos ajudam a controlar o potencial das membranas, e participam da transduo de informaes em plantas. Alguns canais inicos so de maior seletividade, enquanto que outros podem transportar diversas espcies inicas, como por exemplo os canais no seletivos de ctions. Certos canais inicos s so ativados a partir de um dado potencial de membrana, ou seja tm um controle ou (portal) umbral a partir do qual esto abertos. Abaixo deste potencial de membrana o canal inico estar fechado. Por exemplo, o canal inico pode abrir a potenciais de membrana mais negativo que 200mV, e fechar com potenciais mais positivos que -100mV. Os canais inicos mais estudados so os de K. Canais transportadores de K existem em plantas e em animais, e podem ser de diversos tipos. Os mais conhecidos so os da famlia shaker. So formados por uma cadeia polipeptdica com 6 segmentos que atravessam a membrana (S1 a S6), estando as extremidade N-terminal e C-terminal, ambas no interior da clula (Figura 13). O domnio P localizado entre os segmentos S5 e S6 forma o poro aquoso, quando quatro cadeias polipeptdicas se arranjam espacialmente na membrana, formando a estrutura tetramrica do canal. O segmento S4 o elemento sensor do potencial eltrico, ele caracterizado pela presena de aminocidos com carga positiva. O arranjo espacial de quatro cadeias polipeptdicas (estrutura tetramrica) com seus respectivos seguimentos que atravessam a membrana (S1 a S6) formam o poro do canal de K+, por onde esse on atravessa a membrana (Figuras 13 e 14). Em canais de K do tipo KAT1, aminocidos com carga positiva foram identificados como parte do sistema de sensores de voltagem (Zimmermann e Sentenac, 1999).

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Figura 13. Representao esquemtica dos domnios transmembrana dos canais de K+.(Adaptado de Zimmermann e Sentenac, 1999).

Figura 14. Arranjo espacial em estrutura tetramrica dos domnios transmenbrana dos canais de potssio (vista superior) (Modificado a partir de Zimmermann e Sentenac, 1999)

33 Alguns canais inicos esto localizados prioritariamente em rgos especficos da planta. Canais codificados pelos genes AKT1 so expressos preferencialmente em clulas da epiderme e crtex da raiz ( possvel que este canal tambm participe do transporte de alta afinidade de K). (Figura 3). H tambm os canais que aceleram a sada de ons, da clula. No caso do K por exemplo, o gene skor (Stellar K+ outward-rectifying channel) codifica para um canal inico (SKOR) que acelera a sada de K da clula. Estes canais esto situados preferencialmente nas clulas do periciclo e do parnquima vascular. So eles os responsveis pela liberao no espao livre estelar, do K+ que vai ser deslocado para o xilema (Figura 3). Os canais inicos so extremamente importantes no controle de Ca++ no citoplasma, e no transporte de NO3- para o vacolo. No caso do nitrato, o rpido transporte para fora do citoplasma explica as quedas de atividade das enzimas de reduo (NR) quando o suprimento externo de nitrato reduzido, mesmo quando o teor total de nitrato na planta ainda elevado. Canais para transporte de anions tambm foram localizados na raiz, e so importantes para o efluxo de nutrientes para o apoplasto, na rea do parnquima estelar (Roberts, 2006). Tambm de grande significao para a nutrio de plantas so os canais inicos para efluxo de cidos orgnicos. Na plasmalema das clulas da raiz, existem canais deste tipo, que so ativados pela presena no meio externo de ons potencialmente txicos como o Al+++(Ver Cap. 15 neste Volume). Existem outros canais especializados na exsudao de cidos orgnicos que so ativados quando h deficincia de Fsforo (P) no meio externo. Este tipo de canal aninico particularmente ativo nas razes proteides de algumas espcies vegetais. A importncia dos transportadores de ons para as plantas pode ser avaliada pelo fato de que um grande nmero de genes ou de famlias de genes codifica para a sntese das protenas envolvidas. No primeiro organismo cujo patrimnio gentico foi completamente decodificado (Haemophilus influenzae), de um total de 1743 genes, nada menos que 12,2 % codificam para os transportadores ou para as protenas que formam o complexo transportador. Ao que tudo indica esta percentagem deve ser regra geral para todos os organismos. Em H+ATPases vacuolares foi observado que existem famlias multignicas codificando para as subunidades das H+-ATPases, que funcionariam em complemento aos genes bsicos que codificam para o transportador e que mantm o sistema em funcionamento. Isto significa que podem surgir genes codificando para sistemas transportadores em resposta a estmulos ambientais, o que extremamente interessante do ponto de vista da nutrio mineral de plantas.

34 Como j mencionamos, interessante observar a existncia de bombas inicas como a de Ca++ (de dentro para fora atravs da plasmalema) e do antiporte Ca++/ H+ no tonoplasto atuando como um eficiente sistema para a homeostase do Ca++ nas clulas. Por outro lado a existncia de bombas inicas de protons tanto para fora atravs da plasmalema como para o vacolo atravs do tonoplasto (inclusive com as PPiases) permite um eficiente controle do pH citoplasmtico. Os sistema de bombas que usam energia das PPiases tambm so importantes nas situaes de estresse por baixa presso de oxignio. Tambm j foi confirmada a existncia no tonoplasto de um antiporte Na+/ H+. Este transportador seria de grande importncia no desenvolvimento da tolerncia ao estresse salino. A hidrlise de ATP aumenta, em plantas halfitas, com o tratamento (aplicao) de sal. Isto pode indicar o aparecimento de novas subunidades (polipeptdeos) dos transportadores. Na figura 15, temos os principais sistemas de transporte conhecidos, tanto atravs da membrana plasmtica como do tonoplasto.

Figura 15. Sistemas de transporte localizados na membrana plasmtica e tonoplasto.

35 A figura 15 mostra que o K+ e o Ca++ podem ser deslocados para o interior das clulas, atravs da plasmalema, via canais inicos. O K+ tambm pode ser transportado ativamente via simporte (H+/K+). NH4+ e H+ so transportados via uniporte por transportadores de ons na plasmalema. Ainda na plasmalema foi observado um antiporte, com a troca de Na+ por H+. Na plasmalema ocorre o cotransporte de Cl-/ 2H+; de 2H+/ NO3-, H+(2-4)/H2PO-4 e 3H+/SO-4. Acares e aminocidos tambm so transportados via simporte (cotransporte) com um prton. Duas bombas inicas de grande importncia para o metabolismo celular operam na plasmalema: a bomba de prtons (transporte ativo primrio), e a bomba de Ca++. No tonoplasto, trs canais inicos operam no tranporte de K+, Ca++, e NO3-. Este ltimo, provavelmente tambm capaz de transportar Cl- e malato. Um mecanismo antiporte H+/Na+ funciona no tonoplasto, transportando H+ para fora do vacolo, e Na++ do citosol para o vacolo. Tambm ocorre no tonoplasto um antiporte Ca++/ 2H+ transportando Ca++do citoplasma para o vacolo. Nitrato sai do vacolo via simporte (NO3-/ H+) enquanto que o sistema de cotransporte para o malato exige dois prtons (malato-/ 2H+). A formao de um gradiente protoninco no vacolo, em relao ao citosol, garantido por duas bombas inicas: uma H+-ATPase, e uma H+-PPase. Este esquema via bombas inicas, uniportes, simportes e antiportes, mostra algumas caractersticas importantes dos sistemas de transporte, e de sua influncia no metabolismo celular. Em primeiro lugar, h que ressaltar a eficiente bomba inica de extruso de prtons (5 a 20 pmoles/cm2/seg) de carter eletrognico, e que funciona como sistema primrio de transporte, permitindo a criao de potenciais que possam ser favorveis ao transporte unidirecional (uniporte) de ctions. Este mesmo mecanismo acaba por gerar grandientes de prtons (de fora para dentro) que permitiro o cotransporte de anions. Inversamente, no tonoplasto, as duas bombas de protons retiram H+ do citosol, acumulando-o do vacolo. Isso permite o controle do pH citoplasmtico e tambm a gerao de um gradiente prton-inico de dentro para fora, em relao ao vacolo. Este ltimo gradiente, permitir a sada de NO3- e de malato do vacolo (Figura 15). Este esquema de transportes mostra ainda claramente os mecanismos de excluso de Ca++ e de Na+ do citoplasma. No caso do Ca++, ele tanto pode ser eliminado da clula via bomba inica, quando transportado rapidamente para o vacolo via canal inico. No caso do Na+, o on pode ser trocado por um proton de fora da clula, via plasmalema, ou trocado por um proton do vacolo, via tonoplasto. De qualquer maneira estes mecanismos evitam o acmulo de Ca++ no citoplasma, mantendo sua atividade citoplasmtica em torno de 10-6 M. Tambm evitam o acmulo de Na+,que poderia perturbar o funcionamento de sistemas enzimticos em que K+ tem um papel essencial.

36 interessante observar que o gradiente prton-inico vacolo/citoplasma garantido por duas bombas inicas (uma das quais H+-PPiase), e ocorre mesmo sob condies de stress de oxignio (baixas presses de O2). Com isto, a planta tem o potencial de retirar NO3- do vacolo, e us-lo no metabolismo de N, o que viabiliza o vacolo como compartimento de reserva de N nas plantas.

CONTROLE DE PH NAS CLULAS Para que as atividades enzimticas ocorram a um nvel timo para o metabolismo, o pH

citoplasmtico deve ser mantido um pouco acima da neutralidade (7,3). Como se pode antever do estudo dos mecanismos de absoro de nutrientes, este pH timo pode facilmente ser mudado. Extruso de H+, entrada de H+ nas clulas, ou bombeamento de H+ para o interior do vacolo podem afetar o pH celular. Alm desses mecanismos, a constante produo de cidos orgnicos tambm contribui para essas mudanas no pH celular. Pequenas variaes de pH (entre 0.2 e 0.3 unidades de pH) podem ser controladas pela capacidade tampo do citoplasma. Esta capacidade gira em torno de 20 mmol de H+ por litro por unidade de pH. A eficincia deste mecanismo tambm de curta durao (6 a 8 minutos). Quando as variaes do pH citoplasmtico vo alm desta capacidade de tamponamento natural da clula, um segundo mecanismo de controle acionado. Neste caso, o metabolismo celular cria ou destri cidos orgnicos para controlar as variaes do pH celular. Em casos de aumentos de pH, cidos orgnicos so gerados, a partir de precursores neutros, com o consumo de CO2 e OH-. Nos casos de queda de pH, cidos orgnicos so descarboxilados, com a liberao de CO2 e OH-. O cido orgnico formado o malato, e sua descarboxilao d origem ao piruvato. Esquematicamente, este mecanismo pode ser assim descrito:

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Este mecanismo chamado de "sintonia fina". Quando as variaes de pH celular so superiores a capacidade de controle deste mecanismo bioqumico de sintonia fina, entram em ao os sistemas fisico-qumico de controle, fazendo a extruso de prtons atravs da plasmalema, ou bombeando prtons para o vacolo atravs do tonoplasto. A extruso de prtons, alm dos importantes efeitos que tem sobre o metabolismo celular, afeta o espao livre (macro e micro poros e o espao intercelular) aumentando a extensibilidade plstica da parede celular por ativao de enzimas hidrolticas de polissacardeos, o que permite o deslizamento das microfibrilas e a expanso celular. Os efeitos da extruso de prtons podem tambm se extender alm deste espao livre celular, afetando o pH do rizocilindro e mesmo da rizosfera como um todo. Na figura 16, temos um exemplo de como a absoro de K+, via canal inico ou via simporte afeta o pH da soluo externa. A figura 16 mostra a variao de pH observado no meio de cultivo (K2SO4 + CaSO4), em funo da absoro de K+ por plantas de arroz. A rpida queda do contedo de K+ (Figura 16 A e B) corresponde faixa de absoro via canal inico. A contrapartida a extruso de H+, com queda de pH. Na extremidade oposta (Figura 16 A e C), quando a percentagem de K+ se aproxima de zero, afeta o simporte H+/K+, com predomnio dessa fase o pH sobe.

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Figura 16. A absoro de K+ estimula a extruso de H+ e resulta em queda do pH da soluo externa (A e B). Em concentrao muito baixa de K+, um sistema de co-transporte (simporte) elva o pH da soluo externa (A e C).

Sob condies normais de metabolismo, a absoro de ctions e de nions resulta em influxo lquido de um excesso de carga negativa. Experincias feitas com 62 espcies, mostraram que a soma de K+, Na++, Mg++, e Ca++ na parte area dessas plantas produz um total de 2,5 meq/g de carga. A absoro de NO3-, SO4-- , H2PO4- e Cl- por outro lado, produz um total de 3,6 meq/g de carga. Nestas condies, h um desequilbrio em favor de cargas negativas, o que pode resultar, em mdio prazo, na necessidade de que a planta faa a extruso de cargas negativas (ou absoro de H+).

39 preciso observar, entretanto, que o NO3- responsvel por cerca de 50% do total de anions absorvidos pelas plantas. Assim, se o suprimento de N s plantas for feito via fixao de N2, ou atravs de N-NH4+, esta equao (balano entre ctions e anions) alterada, e a planta passa a absorver um excesso de carga positiva. Neste caso, mantendo-se esta tendncia por perodos longos de tempo, deve ocorrer uma extruso ativa de prtons, para reequilibrar as cargas no interior do citoplasma, e controlar o pH celular.

CINTICA DE ABSORO DE IONS O grupo que estudava nutrio de plantas em Davis (Rains e Epstein, 1967; Rains, 1976), fez

um experimento que consistiu em colocar razes, envoltas em gaze, em bechers contendo solues de K+, de concentrao crescente. Por exemplo, concentraes de K+ de 0,002 mM a 0,2 mM, a intervalos constantes. As razes ficaram em contato com a soluo por um certo perodo de tempo (20 minutos a 1 hora). Ao fim deste perodo um grama de razes foi pesado e o seu contedo em K+ determinado (na esses autores usaram Rb+, que tem um istopo de vida mais longa para substituir o K, e mediram a radiao emitida pelas razes). Os trabalhos iniciais de Epstein e seu grupo em Davis mostraram que a absoro de K mostrava cintica de saturao (figura 17).

Figura 17. Grfico da velocidade de absoro (V em moles/g/h) em funo da concentrao do on (M)

40 Relacionando-se o desaparecimento do K+ sua absoro pelas razes das plantas, e conhecendo-se o peso das razes, teremos ento a absoro de certa quantidade de ons, por unidade de peso de razes, por tempo. Por exemplo, teremos 10 umoles de K sendo absorvidos por grama de razes por hora. Ou seja, umoles K/ g/ hora = velocidade de absoro. Logicamente, quando a concentrao mnima (prxima de zero) a velocidade de absoro do ion muito baixa, quase zero. medida que aumenta a concentrao do on na soluo aumenta a velocidade de absoro. Entretanto, este fenmeno no linear na faixa de concentrao que estamos considerando. Ou seja, vamos chegar a certa concentrao do on na soluo a partir da qual os aumentos na velocidade de absoro sero negligveis, mesmo que a concentrao do on continue a crescer. O resultado desta experincia pode ser colocado em um grfico, em que no eixo dos X teremos as concentraes de K (mM), e no eixo dos Y as velocidades de absoro (mol./g/hr) (Figuras 17 e 18). Imagine-se agora uma roleta de estdio de futebol, com pessoas chegando para entrar antes do jogo. Quando apenas uma pessoa est do lado de fora, a velocidade de entrada das pessoas mnima. medida que aumenta o nmero de pessoas a velocidade de entrada tambm aumenta, at que uma velocidade mxima alcanada. A partir desse ponto, mesmo que aumente o nmero de pessoas do lado de fora, a velocidade no aumenta mais. Seria correto dizer que a partir desse ponto os aumentos de velocidade de entrada so negligveis. Os limites de velocidade de entrada das pessoas no estdio so fixadas pelo tempo necessrio para que a roleta gire permitindo a passagem de uma pessoa do lado de fora para o lado de dentro, ficando livre para que a prxima pessoa seja transportada. Em linguagem de cintica de absoro, dizemos que h uma limitao de velocidade, neste caso devido razo de turnover. O influxo de pessoas no estdio vai depender no apenas da velocidade de entrada de cada roleta, mas tambm do nmero total de roletas que esto sendo efetivamente usadas em dado momento (Vmx). Ou, em linguagem de cintica de absoro, a velocidade de absoro de ons em um dado momento ser: v= Vmx x em que (fator intensidade) a frao do total de stios de transporte sendo efetivamente utilizados em um dado momento (N de roletas disponveis).

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Figura 18. Diferentes isotermas so formadas (so mostradas aqui apenas como I e II), medida que a concentrao K+ aumenta na soluo externa.

Quando verificamos a curva resultante do grfico da velocidade versus concentrao temos uma hiprbole quadrada (Figuras 17 e 18). Pode-se observar nesta curva, que inicialmente, quando a concentrao aumenta, a velocidade de absoro aumenta quase linearmente. A seguir, a inclinao da curva comea a diminuir, e deixa de existir proporcionalidade entre os aumentos de concentrao e velocidade de absoro. A partir de concentraes maiores, a curva comea a se aproximar assintoticamente de um ponto a que chamaremos velocidade mxima (mx). Vmx. linguagem emprestada da cintica enzimtica, em Nutrio de Plantas, podemos usar Influxo mximo, Imx. Fica claro por este grfico, que de nada adianta aumentar as concentraes de K+ alm de 0,2mM. Diz-se que, neste ponto, houve saturao. Ou seja, a absoro de K+ mostra cintica de saturao. Neste grfico, chamamos de Vmx, mxima velocidade que o sistema atinge, a uma dada concentrao. Agora podemos a partir do eixo dos Y (da velocidade) em direo curva, determinar a concentrao do nutriente (K) na qual, a absoro atinge a metade da velocidade mxima. Este ponto o Km aparente. Por Km aparente, entendemos a concentrao do substrato na qual o processo de absoro atinge a metade da sua velocidade mxima (Vmx/2).

42 Vmx o mximo de transporte possvel, quanto todos os stios dos transportadores esto carregados o fator capacidade. Chamaremos de teta () frao do transportador que est sendo efetivamente utilizado a uma determinada concentrao do substrato. tambm chamado de fator intensidade.

v= Vmx. [M] = _____ Km + [M] e assim teremos a: [M] = concentrao do ion a ser absorvido.

Vmx [M] v = __________ Km + [M] Esta ltima equao descreve a hiprbole obtida na figura 18. Em nutrio de plantas, o Km aparente uma medida da afinidade do sistema transportador (na raiz) pelo on a ser transportado. Neste caso, quanto menor o Km, maior a afinidade do sistema pelo on. Inversamente, quanto maior o Km, menor a afinidade do sistema pelo on a ser transportado. Outros modelos de representao grfica deste sistema podem ser usados. Aqui usaremos apenas uma outra possibilidade; o modelo Lineweaver-Burk. Este modelo usa um grfico duplo invertido, assim, no eixo das ordenadas (Y) teremos 1/V e no eixo X teremos 1/[M]. O resultado que a hiprbole do caso anterior transformada em uma reta. Este tipo de grfico tem uma grande vantagem sobre o anterior, a Vmx obtida com exatido, isto porque a intercesso da reta com o eixo Y 1/Vmx. (Figura 19)

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Figura 19. Grfico duplo invertido de Lineweaver-Burk, indicando os inversos de velocidade x concentrao, o que transforma a hiprbole quadrada em reta

A faixa de concentrao que estamos usando neste caso (0 a 0,2 mM) est dentro dos limites do mecanismo de alta afinidade para absoro de K, mecanismo I (Epstein & Bloom, 2005). Quando as concentraes externas de K vo muito alm desse limite, surge uma segunda isoterma, que foi chamada por Epstein de mecanismo II. Na verdade, esta segunda isoterma uma soma de vrias isotermas que surgem nas faixas de alta concentrao de K (Figura 18). Em uma primeira aproximao, podemos considerar que no caso do K, a primeira isoterma corresponde faixa do transporte ativo do on (K+/H+) (Mecanismo I), enquanto que as isotermas das faixas de maior concentrao refletem a absoro via canais inicos (uniporte) (Mecanismo II). A figura 16, baseada em trabalho de V. Pimentel (resultados no publicados) exemplifica esses casos. A faixa do mecanismo I, da figura 18, tambm denominada de Sistema de transporte de alta afinidade (HATS em lngua inglesa). A faixa do mecanismo II representa o Sistema de transporte de baixa afinidade (LATS em lngua inglesa). Para o NO3-, o NH4+ e o K+, a grosso modo, as concentraes de 1mM do on em soluo externa pode ser usada como limite entre os dois mecanismos.

44 6 INTERAES INICAS Embora o transporte de ons seja especfico isto ; cada espcie inica transportada atravs de um stio particular, seja ele um tipo qualquer de transportador (ATP-ase especfica, canal inico, ou um sistema acoplado de transporte, cotransporte), existem situaes em que dois ou mais ons por sua semelhana em termos de raio inico e carga podem ser transportados pelo mesmo sistema. O caso mais bvio, pelo seu largo uso em pesquisa cientfica, o dos ons K+ e Rb+. Os sistemas transportadores de K+ no conseguem distinguir entre o on K+ e o on Rb+ . Como no existem istopos estveis de K+, o fato do transportador de K+ tambm transportar Rb+, permite o uso de um istopo de Rb+ como traador para K+. Outros casos existem em que este tipo de interao evidente. O on SeO4= e o on SO4= so outros exemplos de interao deste tipo. Interaes deste tipo so chamadas de interaes competitivas. Nas interaes competitivas o on competidor compete de modo reversvel com o on nativo (no caso acima, Rb+ o on competidor, e K+ o on nativo) pelo mesmo lugar no transportador. Neste caso, no ocorrem mudanas no total de stios disponveis, mas sim na frao do total de stios que ficam disponveis para o on nativo. Como o total de stios transportadores no muda, se representarmos graficamente este processo de interao, usando o grfico de Lineweaver-Burk, teremos ento a figura 21.

Figura 21. Efeito de um on competidor (linhas pontilhadas) sobre a absoro do on nativo

45 A intensidade deste tipo de competio depende: a) da concentrao do on nativo b) da concentrao do on competidor c) das afinidades relativas dos ons nativos e competidor em relao ao sistema transportador. Um outro parmetro foi introduzido no estudo da cintica de absoro, o Cmin. Que representa a concentrao do on na soluo externa a partir da qual no se observa mais influxo lquido desse on. Todos estes parmetros (Vmx, Km, e Cmin) so geneticamente determinados e refletem as presses relativas a que as planta foi submetida ao longo do processo de evoluo. Na Tabela 4, temos a variao dos parmetros cinticos na absoro de NH4+ para duas variedades de arroz: uma variedade tradicional (Bico Ganga) e uma variedade melhorada (Agulha). Observa-se que com o aumento das concentraes de N-NH4+ na soluo nutritiva a Vmx para a variedade Agulha aumenta, enquanto que para a variedade Bico Ganga diminui. Os valores de Cmin para a variedade Bico Ganga so menores do que para a Agulha, indicando que ainda h influxo de NH4+ na variedade tradicional mesmo em menores concentraes externas. Os maiores valores de Vmx associados aos valores baixos de Cmin, apresentado pela variedade Bico Ganga tanto aos 25 quanto aos 50 dias, quando cultivadas com 20 mg de N-NH4+ .L-1 sugerem maior capacidade de absoro de N em condies de menor disponibilidade desse nutriente, sendo um indicativo de adaptabilidade ambientes com baixa fertilidade natural. Os mtodos de estudo da cintica de absoro foram modificados por Claassen e Barber (1974). Ao invs de vrios recipientes com concentraes diferentes do nutriente, um s vaso usado, e a depleo de nutriente medida a intervalos regulares de tempo. A curva de depleo ento usada para determinar os parmetros cinticos. Baseado neste conceito, um mtodo grficomatemtico foi desenvolvido por Ruiz (1985), e um software usado para estimativas das constantes Vmx e Km (Ruiz e Fernandes Filho, 1992). Um CD com uma verso deste software desenvolvido para ambiente Windows, e as instrues sobre como us-lo, esto no anexo I deste volume.

46 Tabela 4. Parmetros Vmx, Km e Cmin em plantas de arroz (variedades Agulha e Bico Ganga) aos 25 e 50 dias, submetidas a quatro nveis de N-NH4+ em soluo nutritiva (Baptista, Fernandes e Souza, 2001) Vmx (mol L-1.h-1) Agulha 16,27b 28,50ns 34,20a 54,60a 20,31b 32,40b 100,60a 134,81a Bico Ganga 22,10a 29,50ns 32,90ab 44,29b 41,70a 35,50a 52,20b 11,60b Km (mmol L-1) Agulha 0,513b 1,061a 2,796ns 3,514b 0,836a 2,044a 3,450a 3,517ns Bico Ganga 0,577a 0,867b 2,691ns 4,510a 0,518b 1,645b 2,938b 3,582ns Cmin (mmol L-1) Agulha 0,252a 0,868a 1,377b 2,049b 0,389a 1,606a 1,208b 1,873b Bico Ganga 0,222b 0,828b 1,537a 2,134a 0,119b 0,708b 1,374a 2,880a

N-NH4+ (mgL-1) 20 40 60 80 20 40 60 80

________________________________25 dias______________________________

________________________________50 dias______________________________

Mdias seguidas de letras iguais na mesma linha, para cada parmetro no diferem significativamente pelo teste de Tukey 5%

TRANSLOCAO DE NUTRIENTES Os nutrientes, aps deslocamento por via simplstica ou apoplstica alcanam as clulas do

parnquima vascular, e um processo inverso tem lugar, com o efluxo dos nutrientes para o espao livre da rea estelar. Esses nutrientes e a gua seguem ento via xilema para a parte area das plantas onde so novamente depositados no espao livre das clulas. Para participar do metabolismo celular, esses nutrientes precisam atravessar novamente a barreira da plasmalema (Figura 23) A sada de ctions e nions das clulas do parnquima estelar para o apoplasma e consequentemente o xilema requer o funcionamento de canais inicos tanto para ctions como j foi mostrado para K+, como para nions. Canais de efluxo de anions podem ser ativados por hiperpolarizao das plasmalema. possvel, entretanto, que canais para ctions e anions atuem simultaneamente (Roberts, 2006). Temos agora uma viso de conjunto do sistema de aquisio de nutrientes pelas plantas via sistema radicular: os nutrientes so absorvidos via plasmalema das clulas da epiderme, crtex ou plos radiculares, que do ponto de vista do conjunto (trans-root) podem ser classificadas como

47 clulas perifricas (Roberts, 2006), internamente, esto as clulas estelares que atuam na liberao dos nutrientes para o apoplasma estelar e vasos do xilema (Roberts, 2006). Como pode ser visto no esquema da figura 22, nutrientes como o H2PO4- e K+ so absorvidos por clulas da epiderme e crtex, respectivamente, via canais inicos e transportadores. Circulando via plasmodesmas esses ons ultrapassam a barreira da endoderme e alcanam as clulas do parnquima estelar. Nas clulas do parnquima estelar esses nutrientes so passveis de efluxo, e podem deslocar-se para o apoplasma, seguindo para o xilema acompanhando o fluxo de gua. Via xilema os nutrientes alcanam a parte area das plantas, ou outras partes (incluindo razes em crescimento) que podem funcionar como drenos (Fernandes e Souza, 2004). Na parte area, os nutrientes encontram-se num espao que seria o equivalente ao espao livre das razes. Novamente precisam deslocar-se atravs de macro e micro poros, vencer as barreiras dos espaos de Donnan, e alcanar a plasmalema das clulas, onde podem ser transportados para o citossol. Os nutrientes assim absorvidos podem entrar no metabolismo celular, ou ser deslocados por via simplstica em direo aos vasos condutores. Em alguns casos, conexes podem ser estabelecidas com as clulas companheiras, mas o mais provvel, que esses nutrientes, juntamente com produtos do metabolismo celular sofram efluxo para o apoplasma, e depois voltem a ser absorvidos, via transportadores, atravs da plasmalema das clulas companheiras. A partir da, alguns nutrientes podem se deslocar diretamente via floema na direo dos drenos. Outros nutrientes, entretanto, apenas aps sofrerem transformaes (assimilao) so deslocados no floema (Figura 22). O deslocamento de ons pode ser feito como pares inicos. Por exemplo, o NO3- e o K+ deslocam-se juntos no xilema. No sentido inverso, nutrientes podem tambm ser translocados via floema (Fernandes e Souza, 2004). Entretanto, nem todos os nutrientes conseguem se deslocar no floema em forma inica. O NO3- por exemplo, no se desloca no floema. O N geralmente movimentado no floema como aminocidos ou amidas. O K+ por outro lado, desloca-se no floema, e como acontece no transporte no xilema, e geralmente o faz em companhia de um anion, neste caso de cidos orgnicos (R-COO-). O resultado dessa mobilidade o fenmeno da recirculao do K+ entre raiz-parte area-raz. O clcio, o enxofre e o ferro que tambm so transportados para a parte area, via xilema, ao contrario do K+, no circulam no floema. O clcio e o ferro so particularmente pouco mveis na planta. Uma vez localizados em um tecido vegetal, no so mais remobilizados para outra parte da planta. conhecido um tipo de clorose chamada clorose de topo caracterstica de deficincia de ferro. Isto ocorre porque o ferro no se desloca das folhas mais velhas para as mais novas. Como

48 resultado, so as folhas mais novas que apresentam clorose. No caso de elementos de grande mobilidade como o nitrognio, sua deficincia gera clorose das folhas mais velhas, que perdem o nutriente em uma relao fonte-dreno (Fernandes e Souza, 2004). Em todo esse processo ao longo da via de absoro, translocao e efluxo h uma demanda de energia, principalmente via ativao das ATPases, para a absoro de nutrientes, seja nas clulas da epiderme, do crtex da raiz, ou nas clulas de folhas, bainhas e caule. O processo como um todo resulta, portanto em um custo energtico, principalmente para a gerao de gradiente de potencial entre compartimentos da clula, e o apoplasma. Aps o deslocamento no floema, sempre no sentido fonte dreno, os nutrientes podem seguir por via simplstica, para as clulas dos frutos ou sementes, ou para clulas em crescimento nas razes. Como pode ser visto na figura 22, ocorre ento uma ltima etapa de efluxo (para o apoplasma) e nova absoro, desta vez para as clulas do destino final.

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Figura 22. Esquema da circulao dos nutrientes desde sua absoro por clulas epidrmicas ou corticais; circulao no xilema e no floema, e redistribuio entre clulas da parte area e da raiz (Modificado a partir de Sondergaard et al., 2004).

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REFERENCIAS

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CAPTULO 6 FIXAO BIOLGICA DE NITROGNIO SIMBITICA E ASSOCIATIVA Veronica Massena Reis1,3, Andr Luiz de Martinez de Oliveira1, Vera Lucia Divan Baldani1, Fbio Lopes Olivares2 & Jos Ivo Baldani1. Embrapa Agrobiologia, Rodovia 465, km 7, CP 74505, CEP 23851-970, Seropdica, Rio de Janeiro, Brasil. 2Centro de Biocincias e Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense, Campo dos Goytacazes, RJ, Brazil. Autor para correspondncia: veronica@cnpab.embrapa.br SUMRIO 1 2 3 4 4.1 4.2 4.3 4.4 5 6 7 7.1 Introduo.......................................................................................................... 2 Mecanismos de fixao biolgica de nitrognio ............................................... 5 Quem so os organismos responsveis por esta fixao biolgica de Onde ocorre o processo de fixao biolgica de nitrognio.............................. 9 Formao do ndulo .......................................................................................... 9 Interaes associativas..................................................................................... 11 Associaes com bactrias diazotrficas endofticas ...................................... 12 Vida livre ......................................................................................................... 14 Fixao Biolgica de Nitrognio e o ambiente ............................................... 15 Absoro de nitrognio fixado pelas plantas................................................... 17 Quantificao da FBN ..................................................................................... 22 Mtodos para estimar a contribuio da FBN ................................................. 24 Reduo de acetileno ...................................................................... 24 Balano de N .................................................................................. 25 Tcnicas isotpicas 15N ............................................................... 26 7.1.1 7.1.2 7.1.3 8 9 10
1

nitrognio? ........................................................................................................................ 7

Potencial de uso agrcola e otimizao da FBN .............................................. 28 Perspectivas Futuras ........................................................................................ 29 Referencias bibliogrfica................................................................................. 32

INTRODUO

Um dos mais importantes processos conhecido na natureza e realizado apenas por microrganismos procariotos o da fixao biolgica de nitrognio (FBN). A primeira publicao sobre a capacidade das bactrias fixarem nitrognio atmosfrico e este ser absorvido pelas plantas foi descrita em 1888. A incorporao de nitrognio via FBN aos diferentes ecossistemas de nosso planeta bastante elevada, representando uma economia substancial de energia fssil, normalmente empregada na produo de fertilizantes nitrogenados necessrios para atender a demanda da agricultura mundial. Para se ter uma idia, a contribuio da fixao biolgica de nitrognio para o total de N introduzido em sistemas agrcolas no mundo, estimada em 65 %. A disponibilidade de nitrognio para os vegetais em sistemas naturais ocorre principalmente pela mineralizao da matria orgnica do solo (ciclagem de nutrientes), haja vista o pequeno contedo deste nutriente nos minerais do solo. Apesar disto, a grande maioria do nitrognio do solo est presente em fraes cuja mineralizao bastante lenta (hmus e argilosilicatos), sendo mineralizado (disponibilizado para absoro pelas razes) apenas 2 % a 3 % do N total presente no solo a cada ano. Esta frao mineralizvel est ainda sujeita perdas por lixiviao, volatilizao e desnitrificao, alm da imobilizao e adsoro pelas partculas do solo. A primeira bactria fixadora de nitrognio atmosfrico, tambm conhecida como diazotrfica, foi descrita em 1893. Desde o comeo, esta descoberta gerou um grande impacto e vasta literatura no tema, sendo at hoje os rizbios as mais estudadas. Atualmente o uso de tcnicas moleculares tem possibilitado a reclassificao e o conhecimento da grande diversidade existente neste grupo de bactrias. Estes so reconhecidos pela capacidade de formar ndulos, principalmente na famlia das

leguminosas. Hoje se sabe que estes ndulos podem ser formados por outros gneros, tais como Herbaspirillum, Ralstonia, Orthrobactum, etc., deixando de ser exclusividade de um pequeno grupo de microrganismos. Os ndulos no so exclusividade das razes, mas tambm podem ocorrer nos caules de plantas que sofrem perodos de alagamento. Ainda que as maiores contribuies da fixao biolgica de nitrognio tenham sido detectadas em oceanos e plantas leguminosas, algumas plantas da famlia Poacea (antiga famlia Gramineae) tm mostrado um potencial bastante significativo de fixao biolgica de nitrognio. No caso especfico da cultura de cana-de-acar cultivada no Brasil, esses ganhos so bastante expressivos, podendo gerar uma economia potencial de cerca de 200 milhes de reais por ano se considerarmos que o processo de fixao biolgica de nitrognio contribui com cerca de 65 % do N acumulado pela cultura. Ainda que possamos considerar esses ganhos apenas razoveis quando comparados ao das leguminosas, a fixao biolgica de nitrognio tem um papel fundamental a exercer tambm no ambiente, principalmente pela reduo dos nveis de nitrato acumulado nos lagos e rios, devido lixiviao do nitrognio aplicado na forma de fertilizantes. A seguir, apresentamos a tabela contendo os gneros de microrganismos fixadores de nitrognio conhecidos atualmente. Esta tabela tem como base a atual classificao dos microrganismos baseada na evoluo e foi proposta e aceita a partir dos anos 70. A molcula usada para diferenciar os grupos, a subunidade 16 S (S de Svedberg unidade de sedimentao de molculas) do cido ribonuclico ribossomal (ARN). Como esta molcula possui em torno de 1500 pares de bases e seu arranjo espacial permite a sua diviso em regies chamadas de hipervariveis e sua variao na composio dos pares de bases usada na formao dos trs super-reinos: Archae (archae = antigo bactrias ancestrais), Eubactria (Eubactria bactria verdadeira) e Eucaria (organismos que possuem membrana nuclear) (maiores detalhes Sapp, 2005)

Tabela 1: Grupo e gnero de microrganismos fixadores de nitrognio conhecidos atualmente. Esta classificao est baseada na organizao dos grupos de microrganismos levando em considerao a evoluo destes usando a variabilidade gentica presente na composio de pares de bases da subunidade 16 S do cido ribonuclico (ARN) ribossomal (16 S rRNA). Gnero Grupo Gnero Azospirillum Gamma cont. Scytonema Gluconacetobacter Symploca Mesorhizobium Synechococcus (Cyanothece) Rhodobacter Synechocystis (marine) Rhodospirillum Tolypothrix Rhizobium Trichodesmium Sinorhizobium Xenococcus Beijerinckia Delta Desulfobacter Methylocella Desulfomicrobium Methylosinus Desulfovibrio Methylocystis Desulfotomaculum Bradyrhizobium Desulfonema Methylocystis Firmicutes Frankia Xanthobacter Paenibacillus Methanosarcina Clostridium Beta Alcaligenes Acetobacterium Burkholderia Desulfosporosinus Herbaspirillum Spirochaetes Spirochaeta Azoarcus Treponema Thiobacillus Spirochaeta Epsilon Arcobacter Treponema Gamma Anabaena Spirochaeta Azotobacter Spirochaeta Chlorogloeopsis Treponema Calothrix Archae Methanobrevibacter Cyanothece Methanococcus Dermacarpa Methanothermobacter Fischerella Methanosarcina Gloeothece Methanothermobacter Lyngbya Methanopyrus Myxosarcina Methanococcus Nostoc Methanocaldococcus Oscillatoria Heliobacteria Heliobacterium Phormidium Cyanobacteria Grupo das Cyanothece Plectonema Grupo das Gloeocapsa Pseudanabaena Gloeothece Adaptado de Zehr,J.P.; Jenkins,B.D.; Short,S.M.; Steward,G.F (2003). Grupo Alfa

MECANISMOS DE FIXAO BIOLGICA DE NITROGNIO

Todos os microrganismos fixadores de nitrognio so procariotos e esta habilidade est distribuda entre os super-reinos Archaea e Eubacteria. Todos eles possuem o complexo nitrogenase, que hidrolisa 16 adenosinas tri-fosfato (ATP) e 8 eltrons por molcula de nitrognio fixado, sendo um dos processos metablicos mais caros para a clula. Estudos tm mostrado que a quantidade de N fixado no planeta gira em torno de 2 x 1013 g por ano. A nitrogenase, um complexo enzimtico redox-ativo que hidrolisa ATPs para efetuar a reduo do N molecular (N2). formado por duas subunidades, um heterotetrmero, a dinitrogenase 22, e um homodmero, a dinitrogenase redutase 2. A subunidade contem um stio ativo para a reduo do nitrognio, composto de molibdnio, ferro e enxofre MoFe7S9 chamado de FeMocofator. Alguns microrganismos contm nitrogenases ditas alternativas, onde o Mo trocado pelo Vandio (V) ou Ferro (Fe) e os genes que codificam estas nitrogenases so denominados de Vnf e Anf respectivamente, no lugar do Nif. At o momento, poucas bactrias diazotrficas descritos possuem estas nitrogenases alternativas, mas todas possuem a nitrogenase de Molibdnio. As alternativas s so expressas na falta de Mo, sendo que a de vandio expressa preferencialmente de ferro. Nesta mesma ordem est a eficincia de reduo do nitrognio (Loveless, T.M., Saah, J.R., & Bishop, P.E. 1999;. Miller & Eady, 1988). A estequiometria da reao de reduo do N2 at NH3 apresentada na equao 1.

Equao 1 N2 + 8 H+ + 8e- + 16 ATP = 2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi

Por ser uma enzima redutora, o oxignio reprime a expresso da nitrogenase ou inativa quando j sintetizada e em funcionamento. No caso dos microrganismos diazotrficos aerbicos, que precisam de oxignio para crescer, alguns mecanismos de proteo podem atuar quando o processo de fixao biolgica de nitrognio est ativo. Alm disso, por ser um processo fisiolgico que requer uma grande quantidade de energia, a sua regulao controlada em diversos momentos, atravs da ao modular de genes reguladores. A disponibilidade energtica da clula, idade fisiolgica, concentrao de oxignio, presena de alguns aminocidos essenciais, disponibilidade de oxignio e nitrognio em excesso (principalmente o amnio) so alguns dos fatores que inibem a atividade da nitrogenase. A tabela 2 apresenta alguns mecanismos de proteo contra concentraes elevadas de oxignio (O2) presentes em microrganismos diazotrficos. Geralmente a fixao biolgica de nitrognio ativa em baixas presses de O2 (<0.1 % v/v). Tabela 2. Mecanismos de proteo contra o oxignio Mecanismo Aerotaxia Proteo Forma de ao Busca por baixas presses de oxignio Respirao Hemoglobina que combina eficientemente com O2 Organismo Azospirillum Azotobacter, Derxia ndulos de rizbio, casuarina-Frankia Simbiose Azotobacter Cianobacteria Frankia Scenedesmium microrganismo marinho Cianobacteria Klebsiellaspp., Clostridium spp. Ndulos Derxia, Beijerinckia Azotobacter

Algumas protenas protegem exposio ao O2 proteo conformacional Separao Heterocistos - no fazem fotossntese e no espacial envolve O2 Vesculas na simbiose de Frankia Colnia, diferencia em filamentos fotossintticos e filamentos fixadores de nitrognio Separao no Fotossntese durante o dia e FBN noite. tempo Mudana de Facultativos s fixam em anaerobiose metabolismo Fsica Barreira de clulas contra o O2 Produo de polissacardeos extracelulares Relao superfcie/volume celular

QUEM SO OS ORGANISMOS RESPONSVEIS POR ESTA FIXAO BIOLGICA DE NITROGNIO?

Sabe-se hoje que muitos gneros e espcies capazes de realizar a FBN esto distribudos no ambiente e associados s plantas. Estas associaes podem variar em especificidade, estrutura, localizao, e microrganismo responsvel. Temos as bactrias denominadas simbiticas que so capazes de formar ndulos, e pertencem principalmente ao grupo do rizbio e do gnero Frankia. Temos tambm bactrias que colonizam os tecidos internos das plantas e so denominadas de bactrias diazotrficas endofticas. Um terceiro grupo forma associaes superficiais aos tecidos radiculares, sobrevivem bem no solo e no so caracterizadas como espcie-especficas, sendo denominadas de associativas. O que todos estes organismos tem em comum a presena da nitrogenase. Alm deste grupo de bactrias heterotrficas, temos as cianobactrias de vida livre, cianobactrias simbiticas, bactrias que vivem no trato digestivo de animais, lquens e bactrias minerotrficas do grupo Archae. A maioria das bactrias diazotrficas est posicionada na subdiviso alfa de Proteobacteria, sendo este o subgrupo mais estudado. Dentro deste grupo esto tambm posicionados as bactrias simbiticas do gnero Azorhizobium, Bradyrhizobium, Rhizobium e Sinorhizobium, alm de organismos fototrficos e metanotrficos, tornando esta subdiviso bastante varivel. J a subdiviso Beta e Gamma de Proteobacteria possuem uma minoria das bactrias diazotrficas descritas. A subdiviso Delta de Proteobacteria possui, em sua maioria, bactrias anaerbicas obrigatrias redutoras de enxofre, incluindo espcies de Desulfovibrio e Desulfobacter. A descoberta de organismos fixadores de N2 em Archaebacteria foi uma surpresa, o que trouxe luz a hiptese mais plausvel de ter havido um ancestral diazotrfico comum a todos os microrganismos atuais, do que ter ocorrido uma

transferncia lateral dos genes estruturais da enzima nitrogenase, ou uma evoluo independente, e que a separao entre eucariotos e procariotos ocorreu posteriormente a diferenciao de Archaebacteria e Bacteria. Neste grupo, esto inseridas bactrias halfitas, termfitas dependentes de enxofre (como doador ou receptor de eltrons), entre outras, mas nenhum gnero foi descrito com associado a plantas. Existe ainda a simbiose das cianobactrias com diatomceas, fungos e bactrias. Na simbiose entre Azolla e Anabaena/Nostoc o simbionte est localizado na cavidade foliar de vegetal e a troca de N2 fixado por fotoassimilados realizada atravs de plos de transferncia. Esta simbiose tem importncia agrcola principalmente na cultura do arroz inundado. No caso das cianobactrias, ocorre a especializao de um rgo onde ocorre a FBN, o heterocisto. Estas simbioses ocorrem em sistemas aquticos marinhos ou de gua doce, e desempenham um papel fundamental no ciclo de nitrognio. A simbiose de fungos e cianobactrias formam os liquens que so os pioneiros na pedognese e na colonizao de ambientes inspitos. Actinomicetos do gnero Frankia formam ndulos radiculares em oito famlias de plantas pertencentes a sete ordens. Estimativas de FBN em espcies destes gneros se situam entre 40 a 300 kg de N ha-1 ano-1 (Arora, A.& Singh,P.K., 2003). Na Tabela 3 so apresentados alguns tipos de relaes simbiticas entre bactrias diazotrficas e organismos vegetais.

Tabela 3: Lista de microrganismos fixadores de nitrognio atmosfrico Microrganismo Grupo Gnero Planta Hospedeira Grupo de Plantas Leguminosas e Parasponia Tecido Ndulos (induzidos) Localizao Dentro ou fora da clula vegetal Dentro Dentro Fora Fora Fora Dentro Isolado ??? Sim Sim Sim No Sim Sim

Bacteria Rhizobium (alfaBradyrhizobium Proteobacteria) Azorhizobium Actinomicetos Frankia Cianobacteria Nostoc Nostoc (Anabaena?) Nostoc

Nostoc

Betulaceae e 8 Ndulos familias de rvores (induzidos) Bryophytes Cavidade da (Antheros etc.) folha Pteridophyte Cavidade da (Azolla) folha Cycadophyta Raiz coralide (Cycas, Macrozamia etc.) Angiosperm Tecido da (Gunnera) glande

ONDE OCORRE O PROCESSO DE FIXAO BIOLGICA DE NITROGNIO

4.1

Formao do ndulo

Vrios genes especficos controlam os diferentes aspectos do processo de nodulao. Uma estirpe de Rhizobium pode infectar somente algumas espcies de legumes, o que chamamos de especificidade hospedeira. Por exemplo: Rhizobium leguminosarum biovar viciae, nodula ervilha e R. leguminosarum biovar trifolii. nodula trevo. Existem casos em que a estirpe nodula a planta, mas se no for o seu hospedeiro correto ela no fixa o nitrognio, sendo chamado de ndulo inefetivo. A efetividade do processo de nodulao governada por diferentes genes. Os genes nod agem diretamente nos vrios estgios de nodulao. No estgio inicial ocorre a liberao de uma variedade de compostos qumicos das clulas radiculares para o solo, influenciando a multiplicao da bactria no seu estgio de vida livre. Estes compostos so

responsveis pelo reconhecimento do hospedeiro pela bactria, permitindo a adeso superfcie dos plos radiculares. Estas substncias qumicas so chamadas de flavonides e isoflavonides e induzem a formao do ndulo. Na etapa seguinte, a bactria secreta os fatores nod que estimulam a curvatura dos pelos radiculares e a invaso da raiz, que inclui a formao de um cordo de infeco. Este cordo formado pelas clulas das razes em resposta a infeco. A bactria continua a se multiplicar e a secretar fatores nod, que estimulam a diviso das clulas radiculares. Aps uma semana, o pequeno ndulo visvel e cada ndulo representa um pacote de milhes de clulas vivas de Rhizobium, que nesta fase so denominados de bacterides. Estes bacterides so envolvidos por membrana de origem vegetal conhecidas como membrana peribacteroidal. Existem outras maneiras de formao do ndulo, onde o rizbio invade a planta por feridas e no h a formao do cordo de infeco. Este o caso da nodulao de Parasponia (Famlia Ulmaceae; ordem Urticales). o nico gnero de plantas no leguminosas que possui ndulos do simbionte Bradyrhizobium/Rhizobium. No caso do amendoim e do Estilosantes, o stio de infeco a regio de emergncia da raiz lateral. Tambm no corre a formao do cordo de infeco.

Ndulos de crescimento determinado em Dalbergia nigra. Foto: Sergio Miana de Faria (Embrapa Agrobiologia)

Quanto ao tipo de ndulos, podemos ter o clssico ndulo formado na soja, feijo, etc chamado de ndulo de crescimento determinado (circulares). Neste caso, uma

vez formado ele fixa enquanto a simbiose estiver ativa, facilmente notada pela colorao avermelhada da atividade da leghemoglobina. Uma vez que a simbiose for interrompida, por vrios motivos, este ndulo senesce e se despende da planta hospedeira. O outro tipo de formao de ndulos chamado de indeterminado. Neste caso o ndulo no para de crescer, isto , o centro responsvel pela FBN muda conforme um novo tecido organizado para este fim formado. So comumente encontrados em espcies arbreas como os ndulos de Leucena.

Ndulos de crescimento indeterminado em simbiose com Accia podalfriaefolia. . Foto: Dr. Sergio Miana de Faria Embrapa Agrobiologia).

4.2

Interaes associativas

Entre as bactrias que fixam nitrognio e no formam ndulos, as mais estudadas so as do gnero Azospirillum, principalmente A. brasilense e A. lipoferum. Este gnero est dividido hoje em sete espcies, sendo que estas duas espcies so mais freqentemente encontradas colonizando a maioria das plantas de regies tropicais e temperadas, chegando a ser isoladas de gramneas crescidas em locais gelados como o

rtico. As espcies citadas acima e A. amazonense tem sido encontradas em associao com plantas monocotiledneas incluindo milho, arroz, cana-de-acar, sorgo e gramneas forrageiras como Digitaria, Brachiaria alm de plantas eudicotiledneas como palmeiras e fruteiras. Apesar da sua ampla ocorrncia, o isolamento da espcie A. amazonense tem se restringido a plantas crescidas em algumas regies do Brasil, exceto por sua deteco em amostras de plantas de cana-de-acar cultivadas no Hava e Tailndia. As outras quatro espcies possuem poucos relatos de sua presena, sendo que A. halopraeferens foi isolado de uma espcie de grama (Leptochloa fusca L.) crescida em solos salinos no Paquisto, A. doebereinerae (espcie cujo nome homenageia a cientista Johanna Dbereiner) foi isolada de plantas de outra espcie de gramnea forrageira do gnero Miscanthus plantada na Alemanha, e A. irakense foi descrito utilizando amostras do solo da rizosfera e de razes de plantas de arroz cultivadas no Iraque. J a espcie A. largimobile uma reclassificao de Conglomeromonas largomobilis, mas no foi evidenciada a capacidade de fixar nitrognio. Da mesma forma, outros gneros e espcies so descritos em associao com diversas plantas e em diversos ecossistemas, mostrando a grande diversidade de organismos diazotrficos no planeta.

4.3

Associaes com bactrias diazotrficas endofticas

Algumas bactrias so capazes de colonizar os tecidos internos das plantas e se perpetuarem nestes tecidos sem causar nenhum sintoma de patogenicidade, promovendo o crescimento da planta hospedeira. Estas associaes internas so denominadas de endofticas. Algumas espcies de bactrias diazotrficas foram caracterizadas como

endfitas tais como Gluconacetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum seropedicae, Herbaspiririllum rubrisubalbicans, Azoarcus spp., entre outras.

Independente das controvrsias, existe um consenso razovel quanto a definio prtica do termo endfito. De acordo com Kloepper et al. (1997), bactrias endofticas so aquelas que podem ser isoladas de tecidos vegetais superficialmente desinfestados ou extradas de dentro da planta, e que no causam danos visveis ou induzem sintomas na planta. Fica claro portanto, que bactrias com capacidade para estabelecer-se endofiticamente em tecidos vegetais, devem ser enquadradas em algumas regras: A bactria deve ser capaz de invadir e proliferar nos tecidos da planta hospedeira, desenvolvendo mecanismos para ultrapassar as barreiras fsicas e qumicas desenvolvidas pela planta (mecanismos constitutivos e induzveis), estabelecendo vias de infeco e colonizao, bem como os stios de estabelecimento; A bactria no deve induzir uma resposta drstica da planta infeco (resposta hipersensvel), caracterizada pela morte rpida e necrose das clulas ao redor do ponto de infeco, impedindo a colonizao dos tecidos (H. seropedicae causa HR em sorgo) A bactria deve possuir um padro de colonizao modelado pela planta hospedeira, uma vez que a multiplicao massiva e/ou hiperativao de genes de virulncia, pode colapsar os tecidos, induzindo sintomas na planta e consequentemente estabelecendo uma interao patognica; No caso de interaes mais evoludas, a bactria deve seguir o ciclo de vida da planta hospedeira, desenvolvendo mecanismos para colonizar sementes ou estruturas de propagao vegetativa.

Vamos dar como exemplo a descrio do endfito mais conhecido atualmente e que recentemente foi reclassificado como Gluconacetobacter diazotrophicus (antiga Acetobacter diazotrophicus) (Yamada et al., 1997, 1998). Esta espcie foi isolada inicialmente de razes, colmos e folhas de cana-de-acar por Cavalcante & Dbereiner, (1989), e posteriormente outros relatos mostraram a sua existncia em canaviais plantados na Argentina, no Uruguai, no Mxico, Cuba, Estados Unidos, ndia, Canad e Austrlia. Esta bactria tambm est associada a outras plantas tais como a batata-doce, e capim elefante (Pennisetum purpureum), caf, abacaxi, entre outras. Por no possuir a enzima nitrato redutase, a atividade do complexo nitrogenase no ser inibida pela presena de nitrato no meio externo clula da bactria. considerada uma bactria endoftica pois possui baixa sobrevivncia no solo. A via principal de transmisso o tolete de cana-de-acar, muito embora o palhio da prpria cultura no deva ser descartado como uma fonte alternativa de inculo quando incorporado ao solo, esporos de fungos micorrzicos arbusculares ou atravs da contaminao ocorrida no momento da suco da seiva do floema por cochonilhas que vivem dentro da bainha foliar da plantas de cana-de-acar e que possuem esta bactria dentro da linfa. Devido a estas caractersticas fisiolgicas e a importncia da cana-de-acar na economia brasileira, o seu genoma est sendo seqenciado alm dos estudos relacionados a caracterizao de protenas presentes nos diversos estgios de seu metabolismo (Baldani, J.I.; Reis, V.M.; Baldani,V.L.D.; Dobereiner, J.; 2002).

4.4

Vida livre

As bactrias capazes de sobreviver no solo, e que tambm colonizam as plantas desde que o ambiente esteja proprcio para a sua multiplicao celular so chamadas de

bactrias de vida livre. Este grupo representado por bactrias aerbicas, anaerbicas e facultativas. Esses organismos podem viver harmoniosamente em associao com as plantas, utilizando para sua nutrio os exudatos das razes das plantas. Mas como fazem para manter a sua populao? Por serem quimiorganotrficas, utilizam compostos orgnicos como principal fonte de carbono e energia. Este grupo representado pela maioria das bactrias fixadoras como Azospirillum, Beijerinkia, Derxia, Azotobacter entre outras. Outros, denominados de fotoautotrficas, utilizam a luz como fonte de energia e CO2 como fonte de carbono. Neste grupo est a espcie Rodospirillum rubrum, as cianobactrias como Nostoc, entre outras. Tambm temos os fotoheterotrficos, que utilizam compostos orgnicos como a principal fonte de carbono e a luz como fonte de energia. Neste grupo esto as bactrias verdes sulfurosas Chlorobium. As quimiolitotrficas utilizam compostos inorgnicos reduzidos como fonte de energia e CO2 como fonte de carbono e tem como principal representante Thiobacillus ferroxidans.

FIXAO BIOLGICA DE NITROGNIO E O AMBIENTE

Independente do tipo de associao entre a planta e a bactria, o gentipo da planta exerce grande influncia. Na simbiose, a especificidade hospedeira um exemplo deste controle entre os componentes da interao. No caso das associativas, endofticas e de vida livre, esta associao menos exigente. Vrios estudos tm mostrado que a eficincia da inoculao depende do gentipo da planta. Outros fatores biolgicos, qumicos e fsicos podem interferir na fixao biolgica de nitrognio. As plantas diferem entre si quanto a quantidade do N fixado, e uma mesma espcie vegetal se diferencia quanto ao gentipo e idade. Dependendo da promiscuidade do hospedeiro e

da eficincia do simbionte, teremos taxas variveis de FBN. A seguir apresentamos os fatores que interferem no N fixado e a recomendao para solucionar o problema.

Tabela 4: Fatores que afetam a fixao biolgica de nitrognio Recomendao Introduzir o inoculante nas camadas mais profundas evitando a dessecao Usar cobertura morta Salinidade Reduo massa seca de parte area, Uso de estirpes tolerantes nodulao e atividade da nitrogenase e/ou adaptadas regio Uso de Inibio da nodulao e da fixao Utilizao de pequenas fertilizantes biolgica de nitrognio. quantidades no solo, ou nitrogenados foliar em plantas que no fixam todo o N necessrio A compatibilidade do rizbio com Pesticidas, Antes do uso do produto pesticidas pouco conhecida. fungicidas e fazer teste de sensibilidade inseticidas Os fungicidas interferem na Se possvel aplicar longe da sobrevivncia semente Os inseticidas no tm efeito desde que no sejam aplicados nas sementes. Se conhece o efeito de herbicidas de Poucos herbicidas Cultivo Aumentam as oportunidades do uso Rotao de culturas intercalado do N complementar. Reduzir a necessidade de fertilizantes nitrogenados, alm de aumentar a disponibilidade de N ou de sua transferncia. Solos cidos Limitam a produtividade e a FBN. Usar cultivares adaptados bem como de estirpes. Acidez e toxidade de alumnio Fazer a calagem Preparo do solo Com o uso do plantio direto, ocorre Estimular a FBN menor mineralizao e nitrificao acoplada a maior imobilizao e a maior denitrificao, o que limita a disponibilidade de N. Deficincia Fsforo principalmente em solos Uso de fertilizantes nutricional tropicais Elementos Metais pesados Uso de estirpes tolerantes txicos Fatores Temperatura e umidade Efeito Na sobrevivncia do rizbio e na habilidade de nodular e fixar N2 Occore inibio da FBN

ABSORO DE NITROGNIO FIXADO PELAS PLANTAS

Em sistemas agrcolas tropicais, a simbiose mutualstica entre rizbios e leguminosas apresenta-se como uma das principais tecnologias para reduzir a carncia, e/ou aumentar a disponibilidade de nitrognio assimilvel. Entretanto, as associaes no mutualsticas, envolvendo gramneas e bactrias diazotrficas endofticas, vem sendo cada vez mais amparadas por resultados experimentais, e tornando-se uma realidade para culturas importantes, como o arroz, o milho e a cana-de-acar, apesar de ser um sistema quantitativamente inferior ao observado para leguminosas. Para que as plantas consigam aproveitar os benefcios da FBN, necessrio que o N fixado pelos organismos diazotrficos seja liberado em uma forma assimilvel. Em sistemas onde ocorre a contribuio destes microrganismos em vida livre, bem como em alguns sistemas associativos, a disponibilizao do nitrognio biologicamente fixado ocorre aps a morte das clulas bacterianas e a lise de constituintes orgnicos celulares, que so diretamente absorvidos pelas razes vegetais atravs de transportadores especficos. Em sistemas simbiticos, ocorre a transferncia direta de molculas contendo o N fixado para dentro de vias metablicas vegetais de assimilao de N (Kennedy, I. R., Choudhury, A. T. M. A., Kecskes, M. L.; 2004). Nas simbioses mutualsticas entre leguminosas e rizbios, todo o processo de interao entre os organismos envolvidos bastante estudado, apesar de estar longe de ser esgotado. Nestes casos, aps as etapas de sinalizao e reconhecimento de molculas de origem bacteriana e vegetal, ocorre a penetrao das razes pelos microrganismos simbiontes atravs do cordo de infeco. O carter especfico no dilogo molecular entre a planta hospedeira e a bactria diazotrfica caracteriza-se pelo fato de que determinada espcie de rizbio apresenta um nmero limitado de espcies vegetais com as quais interage. O cordo de infeco um canal formado por um processo de

endocitose dos plos radiculares, e direciona as clulas bacterianas para o crtex radicular onde elas diferenciam-se em bacterides e induzem a formao dos ndulos, verdadeiras fbricas de produo de compostos aminados. A forma bacteride dos rizbios caracterizada pela perda da parede celular bacteriana e o conseqente aumento do volume celular, alm da represso da atividade da enzima glutamato sintase (GOGAT) que impede a assimilao do N fixado pelos bacterides. Os bacterides no possuem contato direto com o citoplasma celular, sendo envolvidos por uma membrana de origem vegetal denominada membrana peribacteride, extremamente importante para a formao de ndulos eficientes. A estrutura formada pela membrana peribacteride e os bacterides assemelha-se uma organela, e denomina-se simbiossoma, a unidade bsica de fixao de nitrognio no ndulo. Um ndulo maduro ativo apresenta muitos milhares de simbiossomas dentro das clulas diferenciadas. A Figura 1 apresenta um esquema simplificado do funcionamento de simbiossomas em ndulos de soja.

citoplasma de clula infectada do ndulo (-) assimilao ADP + Pi A ATP H+ H+ malatoB malatoNH3 + H+ D NH4+ H+

N2 + nitrogenase C bacteride (-)

(+) membrana peribacteride

Figura 1 Representao grfica de um simbiossoma de ndulo de soja (Glycine max). A, ATPase da membrana peribacterioidal; B, carreador de composto dicarboxilado da membrana peribacterioidal; C, carreador de composto dicarboxilado do bacteride; D, transportador de amnio. Simplificado de Udvardi & Day, (1997).

A membrana peribacteride envolve de um a muitos bacterides (dependendo da espcie vegetal e idade dos ndulos), permitindo um controle da planta sobre a colonizao bacteriana em seus tecidos. Sua funo regular o trnsito de nutrientes entre os bacterides e a planta hospedeira, onde a planta fornece compostos reduzidos de carbono para o funcionamento constante da nitrogenase no bacteride, e este fornece compostos nitrogenados reduzidos para a planta, que so assimilados no citoplasma vegetal. Alm disso, a membrana peribacteride apresenta outros transportadores e canais, que so responsveis pelo suprimento de compostos necessrios para o

funcionamento eficiente da simbiose. A degradao desta membrana leva senescncia da simbiose, e sua no formao leva a ndulos ineficientes (Udvardi & Day, 1997). A sacarose formada atravs da fotossntese a principal fonte de energia para o ndulo, metabolizada enzimaticamente no citoplasma vegetal a dicarboxilados que iro suprir a demanda energtica dos bacterides ativos no processo de fixao biolgica de nitrognio. Outros compostos reduzidos de carbono so presentes em abundncia nos ndulos, e provvel que ocorra a utilizao de mais de um composto, bem como variaes qualitativas no fornecimento de compostos energticos de acordo com o desenvolvimento do ndulo e a espcie vegetal. A energia dos compostos dicarboxilados utilizada na forma de poder redutor e ATP para catalizar a reduo de Nitrognio molecular amnia pela enzima nitrogenase, segundo a Equao 1, anteriormente citada. A amnia produzida liberada pelo bacteride por difuso simples, e assimilada no citoplasma da clula infectada pela enzima glutamina sintase (GS), convertendo a amnia at glutamina. Em seguida ocorre a ao da GOGAT, que converte a glutamina at glutamato. A enzima GOGAT apresenta uma atividade bastante elevada nos ndulos, promovendo um nvel muito baixo de amnia no citoplasma da clula infectada e o consequente efluxo da amnia presente nos bacterides. O glutamato contendo o N derivado da FBN utilizado na sntese de compostos aminados que sero utilizados para suprir outros tecidos da planta. A molcula utilizada para o transporte deste nitrognio apresenta variao entre diferentes espcies de leguminosas. Em geral, leguminosas de clima temperado exportam amidas, enquando leguminosas de clima tropical exportam uredos (Udvardi M. K., Ou Yang L-J, Young S, Day D. A., 1990). A forma de assimilao do N biologicamente fixado nas relaes associativas com bactrias diazotrficas, envolvendo principalmente gramneas, ainda no

conhecida. Apesar dos estudos baseados no balano de N utilizando o istopo

15

comprovarem a contribuio de diferentes espcies de bactrias diazotrficas (destacando-se Azospirillum spp., Herbaspirillum spp. e Gluconacetobacter

diazotrophicus) em culturas como arroz, milho, sorgo, trigo e cana-de-acar, entre outras, a forma como ocorre a transferncia do N fixado no foi determinada (vide tpicos anteriores). Alm disso, a maioria destes organismos apresenta outras formas de promoo do crescimento vegetal, como a produo de fitormnios, resistncia a estresses, produo de siderforos e antibiose, entre outras (Gray & Smith, 2005). Soma-se a isso a inexistncia de uma estrutura especializada semelhante aos ndulos, dificultando o estudo destas associaes, e a determinao da real contribuio de cada mecanismo na melhoria da nutrio das plantas inoculadas. Estas associaes apresentam uma eficincia muito menor que a observada nas simbioses entre rizbios e leguminosas, e uma baixa reproducibilidade dos resultados experimentais. Entretanto, resultados experimentais de co-cultivo sugerem a capacidade de excreo de amnia por G. diazotrophicus, bem como a ausncia da enzima nitrato redutase e uma baixa represso do mecanismo de fixao de N por quantidades relativamente elevadas de amnia, como observado em bacterides. Estudos recentes baseados na anlise da expresso gnica comparativa de variedades de cana-de-acar contrastantes quanto capacidade de associao com bactrias diazotrficas, sugerem que a enzima glutamina sintetase (GS) citosslica do vegetal pode estar envolvida na assimilao do N biologicamente fixado. Espera-se que a continuidade de estudos fundamentados em ferramentas de biologia molecular possa fornecer em breve um modelo da associao entre gramneas e bactrias fixadoras de Nitrognio.

QUANTIFICAO DA FBN

A presena de bactrias capazes de fixar nitrognio em plantas que no formam ndulos no significa que estas plantas estejam recebendo contribuies significativas deste processo. Os primeiros trabalhos utilizavam clculos sobre o balano de nitrognio onde todas as entradas e sadas do sistema eram medidas. Resultados positivos destes estudos, aplicados em plantas crescidas em potes, sugeriram uma quantidade significativa de entradas via FBN. Estes trabalhos, embora limitados a condies experimentais e pouco convincentes, foram suficientes para estimular os estudos sobre contribuies agronmicas em plantas que no formavam ndulos como a maioria dos cereais e forrageiras. Mas quais so as necessidades de nitrognio de culturas onde no h a formao dos ndulos? Por exemplo, o arroz remove cerca de 16-17 kg N por tonelada produzida de gros secos (Sahrawat, 2000), o trigo requer cerca de 26-28 kg de N para produzir 1 tonelada de gros secos (Angus, 2001). O milho requer de 9-11 kg de N para produzir 1 tonelada de biomassa (Anuar, Shamsuddin & Yaacob, 1995) e a cana-de-acar utiliza 1,45 kg de N para produzir 1 tonelada de biomassa fresca ou 7 kg N para 1 ton massa seca por hectare, o que seria igual a 116274 kg N/ha (Bhuiyan, 1995). Mas este nitrognio pode ser adquirido apenas via o processo biolgico? Infelizmente, os estudos tm mostrado que no melhor dos casos para plantas como o arroz e a trigo, menos de 20 % do N advm do processo biolgico (Tabela 5).

Tabela 5: Estimativa de contribuio de FBN por diversas espcies de bactrias diazotrficas inoculadas em cereais e gramneas forrageiras. Gnero Azotobacter Azospirillum Quantidade de N Planta Arroz 20% aumento gro Arroz 20% a 58% dependendo da variedade/casa de vegetao Arroz 58,9 % Ndfa Referncia Yanni & El-Fattah, 1999 Mirza et al., 2000

Burkholderia Herbaspirillu m

Rhizobium

Mirza, Rasul, Mehnaz, Ladha, So, Ali & Malik, 2000 Trigo 30% aumento gro/ 50Okon & Labandera60 kg N/ha Gonzalez,1994 Trigo 7-12% - 15N Malik, Mirza, Hassan, Mehnaz, Rasul, Haurat, Bally & Normand, 2002 Trigo 14 37 %; Balano de Didonet, A. D., Rodrigues, O. N & Kenner, M. H. 1996 10 a 79 %; Balano de Boddey, R. M., Oliveira, O. C. N de, Urquiaga, S., Reis, V. M., Olivares, F. L., Baldani, V. L. D. & Dobereiner, J. 1986 Cana 9 t/ha cana-planta e 5 Muthukumarasamy, Revathi & t/ha em cana soca Lakshminarasimhan, 1999 Milho 50-95% dependendo Dobbelaere, Vanderleyden & solo com aplicao 18Okon, 2001 46 kgN/ha Riggs, Chelius, Iniguez, 13 a 25% aumento gros Kaeppler &Triplett, 2001 dependendo do gentipo Arroz 0,8 t/ha Trn Van, Berge, K, Balandreau & Heulin., 2000 Arroz 19-58% casa de Mirza, Rasul, Mehnaz, Ladha, vegetao So, Ali & Malik, 2000 Arroz 58,2 % Ndfa Mirza, Rasul, Mehnaz, Ladha, So, Ali & Malik, 2000 Milho 11% campo Gutirrez-Zamora & MartinezRomero, 2001

Para as leguminosas, a expectativa de contribuio da FBN varivel. O que determina esta amplitude a variedade, o local de plantio, o mtodo utilizado para medir a contribuio, a estirpe utilizada entre outros fatores biticos e abiticos.

Tabela 6: Quantificao de contribuio da FBN em leguminosas Espcies Alfalfa (Medicago sativa L.) Amendoim (Arachis hupogaea) Caupi (Vigna unguiculata L.) Ervilha (Pisum sativum) Ervilhaca peluda (Vicia villosa Roth) Trevo (Trifolium pratense L.) Estilosantes (Stylosanthes sp.) Lupine (Lupinus spp. L.) Feijo (Phaseolus vulgaris L.) Guandu (Cajanus cajan) Lentilha (Lens culinaris) Mucuna preta (Stizolobium aterrimun) Feijo mungo (Vigna radiate) Soja (Glycina max) Sesbania rostrata Sesbania sesban Trevo branco (Trifolium repens) Adaptado de Freire, (1992) e Moreira & Siqueira (2002) (kg N/ha/por ano) 80-250 33-297 73-240 7-244 110-184 22-150 110-184 50-100 30-50 7-235 35-192 157 55 17-450 324 7-18 128-291

7.1

Mtodos para estimar a contribuio da FBN

7.1.1

Reduo de acetileno Os primeiros esforos em medir a contribuio da FBN utilizaram um inibidor

competitivo da enzima nitrogenase, que uma vez presente na atmosfera era reduzido preferencialmente: o acetileno. Neste mtodo substitui-se parte da atmosfera por acetileno, que reduzido a etileno e medido em um cromatgrafo a gs. A principal crtica deste mtodo era o tempo de pr-incubao de 6 a 12 horas, e durante este perodo ocorria uma diferena alta entre o incio e o fim do perodo de anlise, sendo

este atribudo multiplicao de clulas estimulada pela liberao de carbono advindo da lise celular das razes aps a extrao (Van Berkum & Bohlool, 1980). Vrias modificaes foram feitas no mtodo para minimizar crticas como estas e outras advindas da dificuldade de difuso de gases em sistemas inundados, dificuldade de medir a contribuio de bactrias diazotrficas e no de algas fotossintticas e tambm fixadoras, etc. O principal problema advindo deste mtodo era a modificao da pO2, visto que sistemas nodulantes apresentam queda imediata da atividade da nitrogenase aps distrbios fsicos aplicados ao sistema radicular, mesmo sabendo-se que barreiras fsicas protegem os ndulos do efeito inibidor do oxignio (Witty & Minchin, 1988).

7.1.2

Balano de N O princpio muito simples: estimar o N total no solo, semente, e outros

insumos como adubos desde o incio do crescimento at a colheita e novamente ao final quantificar o N total na planta e no solo. Diminuindo o teor inicial do final tem-se o balano de N. Se o N total na cultura e no solo for significativamente maior que o inicial, assume-se que houve incremento de N ao sistema advindo da FBN. Devemos ter em mente que perdas naturais de nitrognio normalmente ocorrem no solo tais como lixiviao, denitrificao e volatilizao e estas perdas normalmente no so quantificveis, o que leva a uma superestimativa da contribuio de FBN. Como a massa de solo necessria para crescer uma planta sadia pode ser maior que 100 vezes a massa da planta, o N total do solo muito maior que o acumulado na planta, mesmo em solos deficientes. Desta forma, as perdas advindas dos trs processos descritos acima devem ser quantificadas e portanto esta tcnica deve ser aplicada em experimentos de vasos ou similares, capazes de serem quantificados e mesmo assim deve-se utilizar as mesmas condies para sucessivos plantios, para obter um ganho de

N significativamente superior aos erros de amostragem e das anlises. A principal vantagem desta tcnica a sua simplicidade e baixo custo e permitem explorar sistemas onde no se tenha nenhum dado da contribuio de FBN por grupos de pesquisa iniciantes.

7.1.3

Tcnicas isotpicas 15N

6.1.3.1. Incorporao de 15N2 gs Com a utilizao do istopo mais pesado do nitrognio, o 15N, possvel marcar compostos ou mesmo utilizar 15N2 para quantificar a contribuio da FBN. No caso do gs marcado necessrio o controle da atmosfera de CO2 e O2 pela clausura das plantas, alm de mant-las em um sistema de luz controlada, temperatura e transpirao, necessitando de um sistema sofisticado de controle ambiental (Eskew, Eaglesham & App, 1981). Devido a problemas como perdas de gases e perodos curtos de incubao em atmosfera controlada inibem a quantificao da FBN de uma maneira global que incluem dados de todo o ciclo da cultura, principalmente tratando-se de um processo que varia com as condies ambientais e perodo de crescimento. Se a contribuio for muito pequena no perodo de incubao, erros advindos de variaes na aplicao da tcnica podem ocasionar valores de acmulo de (Morris, Zuberer & Weaver, 1985).
15

N2 menores que a planta controle

6.1.3.2. Diluio de 15N Podemos utilizar compostos nitrogenados onde parte do teor de N est na forma de 15N e adicionar este adubo ao solo para ser absorvido pelas plantas. Uma vez que a planta absorve esta istopo mais pesado juntamente com o
14

N, podemos discriminar

esta absoro utilizando um espectrmetro de massa, com sensibilidade suficiente para quantificar o
15

N presente nas amostras de tecidos vegetais e subtrair da abundancia

natural (McAuliffe, Chamblee, Uribe Arango & Woodhouse, 1958). Este clculo da contribuio de FBN na planta depende da comparao com uma planta controle que devemos escolher. Esta planta primeiramente no fixa nitrognio e portanto todo o nitrognio absorvido vir do contedo de N disponvel no solo. Outras caractersticas tambm devem ser levadas em conta para a escolha da planta controle: possuir taxa de crescimento semelhante a planta teste, ter um sistema radicular que explore as mesma camadas de solo. Os principais problemas advm do fato que ao se adicionar adubo marcado com
15

N, o N disponvel marcado (essencialmente NH4+ e NO3-) geralmente

varia de acordo com a profundidade e com o tempo. Plantas com absoro diferencial ao longo do tempo e espao explorado pelas razes tero uma marcao diferente, introduzindo um erro na estimativa na contribuio da FBN (Witty, 1983). A soluo para este tipo de problema utilizar vasos ou tanques de concreto e incorporar o material marcado com
15

N em diferentes profundidades alguns meses antes do plantio,

permitindo a estabilizao do N disponvel no solo (Kohl & Shearer, 1981).

6.1.3. 3. Abundncia natural de 15N O que se entende pela tcnica de abundncia natural do 15N refere-se a marcao natural deste istopo no solo. Plantas que recebem contribuies significativas da FBN acumularo teores deste elemento de duas fontes: solo e ar, diluindo esta marcao natural. Com o advento de espectrmetros de massa mais sensveis, possvel diferenciar a absoro entre plantas. O uso desta tcnica para estimar a contribuio da FBN em plantas noduladas e plantas capazes de se associar com actinorrizas, foi feito primeiramente por Shearer & Kohl (1986). Para aplicar a tcnica de abundncia natural

de 15N na quantificao de FBN para gramneas ou cereais faz-se necessrio utilizar um grande nmero de plantas vizinhas, ou mesmo invasoras dos campos de produo que se deseja avaliar. Somente quando esta diferena de marcao natural entre sua planta de interesse e suas plantas controle for significativa pode-se realmente estimar a contribuio da FBN ao sistema. Tabela 7: Comparao entre os mtodos de se estimar a contribuio da fixao biolgica de nitrognio Mtodos 1. Balano de N total 2. Incorporao de N2 3. Reduo de acetileno 4. Diluio de
15 15

Vantagem Simples Mais direto Simples e sensvel Mede todo o

Desvantagem Baixa sensibilidade e no inclui todos os itens de ganhos e perdas Caro e apenas por perodos curtos Indireto e semi-quantitativo Somente para FBN em planta e do solo

Sensibilidade Baixa Alta a moderada Alta Alta-baixa

perodo de cultivo problemas de marcao estvel Simple e no pertuba o sistema Diferena no contedo de 15N grande Somente baixa diferena no contedo de 15N Mudana do 15N em tempo e no solo Moderado Baixa

4a. Abundncia natural 4b. Adio de substrato

POTENCIAL DE USO AGRCOLA E OTIMIZAO DA FBN

Em sistemas agrcolas, a possibilidade de utilizao de fertilizantes nitrogenados para suprir a demanda de cultivos comerciais com nitrognio pode ocorrer tanto pela transferncia de N de uma rea para outra, atravs do uso da biomassa vegetal ou de estercos animais, como pela utilizao de tecnologias baseadas na utilizao de sistemas capazes de fixar biologicamente o nitrognio atmosfrico. Esta ltima alternativa, onde

se inclui a utilizao de adubao verde, apresenta-se como a nica capaz de aumentar naturalmente a quantidade de N assimilvel in situ. Quando se fala de FBN lembramos de plantas da famlia das leguminosas, principalmente da soja. Realmente o maior sucesso da tecnologia de uso de bactrias fixadoras de nitrognio como inoculante a cultura da soja onde no se recomenda a adubao nitrogenada em todo o territrio brasileiro. Hoje 95 % ou mais da industria de inoculantes instaladas no Brasil produzem somente insumos para a soja. Outras culturas de importncia nacional como o feijo Phaseolus vulgaris, regional Caupi (Vigna unguiculata), ou mesmo para cereais como milho, arroz e plantas de importncia industrial como a cana-de-acar, so passveis de aplicao de inoculantes comerciais. O que falta a iniciativa privada mudar a linha de produo para atender a demanda crescente por produtos biolgicos, no trangnicos, e que podem contribuir para reduzir os custos e o impacto ecolgico da produo.

PERSPECTIVAS FUTURAS

Alguns pontos importantes devem ser alvo das pesquisas nesta rea visando um maior aproveitamento da FBN em gramneas. Primeiro refere-se a seleo de gentipos, pois existe um grande nmero de evidncias sobre diferenas entre cultivares. Segundo, qual a bactria ou grupo destas deve ser a melhor combinao com o gentipo mais promissor. Terceiro, refere-se aos fatores ambientais biticos e abiticos relativos a eficincia do processo tais como temperatura, gua, luminosidade, nitrognio, associao com outros organismos tais como micorrizas, interao com a microflora nativa, etc. Quarto ponto seria referente a modificaes tanto na planta como na bactria visando o aperfeioamento desta associao.

Algumas perguntas continuam sem resposta: Existe suficiente fonte de carbono para suportar uma populao elevada de bactrias ou estas podem ser um dreno para as plantas? A Nitrogenase expressa (genes nif) mas est realmente ativa? Os produtos da fixao so diretamente transferidos para a planta ou somente aps a morte e mineralizao das clulas? Os nmeros encontrados em plantas no leguminosas ficam entre 10.00.000 clulas por grama de massa fresca sendo que no caso do rizbio estes nmeros chegam a 100.000.000.000 bacterides por grama de massa fresca. Estes nmeros seriam suficientes? Como poderemos aument-lo sem causar uma resposta de defesa da planta? Muitos aspectos ainda precisam ser estudados visando tornar esta associao mais eficiente. Acima de tudo, o que a pesquisa busca atualmente fazer uso destas associaes benficas para substituir fontes no renovveis de energia, como o caso do processo de obteno de nitrognio fertilizante, que usa energia fssil. A busca por sustentabilidade e produtividade tem que levar em considerao o custo / benefcio da tecnologia, facilidade de implantao, disponibilidade de obteno do inoculante ou muda inoculada, entre outros fatores scio-econmicos e mesmo ambientais. Acima de tudo o manejo sustentvel visualizado na figura 1, engloba todas as possveis utilizaes da FBN para a agricultura.

Associativas Vida livre

Endfitos Ndulos

Fixao Biolgica de Nitrognio

Quais os possveis hospedeiros que podem se beneficiar dos ganhos da FBN, mantendo a produtividade agrcola?

Manejo Sustentvel dos Agroecossistemas Figura 1: Maneiras de utilizar os ganhos advindos da fixao biolgica de nitrognio para a reduo do uso de fertilizantes nitrogenados na agricultura.

Agradecimentos Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico-CNPq pela bolsa de recm-doutor do segundo autor, as bolsas de produtividade em pesquisa dos outros autores, Fundao de Amparo Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ) pelas bolsas Cientista do Nosso Estado do primeiro e ltimo autor. Este trabalho foi parcialmente financiado pela Embrapa, pelo CNPq (PRONEX II),

10 REFERENCIAS BIBLIOGRFICA

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CAPTULO 7 EFEITOS FISIOLGICOS DE SUBSTNCIAS HMICAS UMA REVISO SOBRE O ESTMULO NAS H+-ATPASES Luciano Pasqualoto Canellas(1), Daniel Baslio Zandonadi(1), Fbio Lopes Olivares(2) & Arnoldo Rocha Faanha(2)

(1) Laboratrio de Solos, Centro de Cincias e Tecnologias Agropecurias, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), Av. Alberto Lamego 2000, 28013-602 Campos dos Goytacazes RJ.bolsista do CNPq: canellas@uenf.br; daniel@uenf.br (1)Laboratrio de Biologia Celular e Tecidual Centro de Biocincias e Biotecnologias, UENF. bolsista do CNPq: fabioliv@uenf.br; arnoldo@uenf.br

SUMRIO

1 2

INTRODUO........................................................................................................ 2 CARACTERSTICAS QUMICAS E ESTRUTURAIS DAS SUBSTNCIAS 2.1 2.2 2.3 plantas 2.4 plantas 2.5 2.6 Bioatividade de Substncias hmicas................................................. 11 perspectiva histrica ........................................................................... 11 Efeitos indiretos das substncias hmicas sobre o crescimento das ............................................................................................................ 13 Efeitos diretos das substncias hmicas sobre o metabolismo das ............................................................................................................ 14 O papel da H+-ATPases na nutrio e crescimento celular ................ 15 Mecanismos de ativao da H+-ATPase de membrana plasmtica pelas

HMICAS........................................................................................................................ 3

substncias hmicas.................................................................................................... 26 3 REFERENCIA BIBLIOGRFICA........................................................................ 36

INTRODUO

As substncias hmicas so o principal componente da matria orgnica dos solos, das guas e dos sedimentos. Alm de influenciar as propriedades qumicas, fsicas e biolgicas determinando a produo biolgica dos ecossistemas, elas exercem um efeito direto sobre o crescimento e metabolismo das plantas, especialmente sobre o desenvolvimento radicular (Nardi et al., 2002). No recente a concepo de que as substncias hmicas podem regular o crescimento das plantas, porm os mecanismos celulares atravs dos quais tal efeito se manifesta ainda no so bem claros. Parte do atraso na evoluo deste tema decorre de uma concepo reducionista que, freqentemente, pe em questo se os cidos hmicos, sendo macromolculas de alto peso molecular, poderiam de fato serem reconhecidas por receptores de membrana na superfcie/apoplasto, ou mesmo acessar o interior da clula e regular o metabolismo das plantas. Entretanto, evidncias experimentais recentes tm lanado luz sobre o problema ao verificar que as substncias hmicas, e entre elas especificamente os cidos hmicos, podem regular a atividade das bombas de H+ induzindo a sntese de H+-ATPase de membrana plasmtica e vacuolar. Existe uma srie de trabalhos que compilam o efeito fisiolgico de substncias hmicas (Vaughan & Malcolm, 1985; Chen & Aviad, 1990; Nardi et al., 2002). Esta reviso centrada nos efeitos fisiolgicos de cidos hmicos sobre a atividade de enzimas transmembranares responsveis pela gerao do gradiente eletroqumico que energiza os canais e transportadores de ons e molculas, utilizados na absoro de nutrientes pelas clulas, e ainda, pela acidificao do apoplasto, condio necessria para a expanso celular. Antes, porm, realizada uma breve discusso sobre aspectos estruturais das substncias hmicas

CARACTERSTICAS QUMICAS E ESTRUTURAIS DAS SUBSTNCIAS HMICAS

Tradicionalmente, os cidos hmicos (AHs) tm sido definidos como substncias de colorao escura compostas por macromolculas de massa molecular relativamente elevada formada atravs de reaes de sntese secundria a partir de resduos orgnicos de plantas, animais e microrganismos (Stevenson, 1994). Entretanto, alguns estudos tm sugerido uma nova concepo para a estrutura destas complexas substncias hmicas (Orlov et al., 1975; Piccolo, 2002). Piccolo et al. (1996a; 1996b) observaram que AHs submetidos cromatografia de excluso por tamanho molecular apresentaram alteraes reversveis no perfil de distribuio da massa molecular, ou seja, diminuio do tamanho dos Ahs, com a acidificao da soluo de AHs pela adio de cidos orgnicos (na faixa de pH 9,2 2,0). A partir destes dados, Piccolo postulou que, em vez de consistir num polmero estvel em pH neutro ou alcalino, os AHs se comportam como uma associao supramolecular de molculas relativamente pequenas e heterogneas que se mantm unidas pela ao de foras fracas dispersivas, tais como foras de van der Waals e interaes - , CH- em valores de pH na neutralidade ou atravs de pontes de H+ em valores mais baixos de pH. Segundo a concepo mais antiga de Orlov et al. (1975), esse menor agregado corresponderia clula estrutural mnima das substncias hmicas sobre a qual vai se desenvolvendo paulatinamente a macroestrutura atravs da adio de camadas sobre esta clula bsica, num arranjamento semelhante ao supraestrutural. A adio de cidos orgnicos altera a estabilidade dessa conformao atravs do rompimento de interaes hidrofbicas fracas. A subseqente eluio na cromatografia por excluso de tamanho resulta em subunidades menores, que so protegidas da

reassociao das unidades estruturais, que pode ocorrer em condies estticas. Piccolo e colaboradores consideraram os resultados desse experimento como a expresso da natureza associativa de pequenas molculas hmicas, que se auto-organizam num material de tamanho molecular aparentemente elevado. Essas fraes de menor massa molecular so um produto do rearranjamento conformacional e composio qumica diferente das substncias hmicas. A associao supramolecular em soluo formada, ento, por meio da interao de domnios hidrofbicos de compostos anfipticos (um composto anfiptico ou anfiflico aquele que apresenta uma parte polar e outra apolar na mesma molcula). A tendncia termodinmica natural desses compostos de formar agregados espontaneamente. Essas associaes so isoladas progressivamente da rede de estrutura da gua (Wershaw, 1986). Tal separao resulta no acrscimo da entropia do sistema e na energia livre de estabilizao das diferentes unidades moleculares hmicas para formar a superestrutura. Na associao hmica supramolecular, as foras intermoleculares determinam a conformao estrutural das substncias hmicas, e a complexidade de mltiplas interaes no covalentes controlam e regulam a sua reatividade no ambiente. Considerando a nova concepo (associao supramolecular ou unidade estrutural mnima) para o comportamento estrutural das substncias hmicas, a definio clssica de cidos flvicos e hmicos precisa, necessariamente, ser revista. Piccolo (2002) redefine, ento, cidos flvicos como a associao de pequenas molculas hidroflicas com uma quantidade de grupamentos funcionais cidos suficientemente grandes para manter os agrupamentos de cidos flvicos dispersos em qualquer valor de pH. Os cidos hmicos, por sua vez, so compostos por associaes de material humificado onde predominam compostos hidrofbicos (cadeias

polimetilnicas, cidos graxos, esterides), que so estabilizados em pH neutro por

foras hidroflicas dispersivas. De acordo com o modelo de Piccolo, a conformao dos cidos hmicos cresce progressivamente de tamanho quando as foras oriundas das ligaes hidrognio so progressivamente aumentadas at um valor baixo de pH onde os cidos hmicos floculam. Essa concepo foi duramente criticada por Swift (1999), que considerou as modificaes provenientes do cromatograma de excluso por tamanho das substncias hmicas com variao do pH de eluio como uma conseqncia de artefatos produzidos pela interao polmero gel da cromatografia. No entanto, o modelo supraestrutural se mostrou consistente ao serem reproduzidos qualitativamente os experimentos de Piccolo por Faanha et al. (2002). Alm disso, uma srie de outras evidncias de um arranjamento supra-estrutural para substncias hmicas foram obtidas a partir de diferentes mtodos espectroscpicos. Atravs de uma extensiva reviso de literatura sobre o uso da pirlise na anlise de estrutura de substncias hmicas, SaizJimenez (1996) concluiu que os principais produtos da pirlise encontrados nos fragmentos da frao hmica tambm foram observados em ligninas e polissacardeos, no havendo evidncias de uma condensao aparente entre lignina e polissacardeos. O mesmo autor argumenta que, tendo em conta os produtos da pirlise, no se pode, necessariamente, assumir que as substncias hmicas sejam geradas por reaes de condensao de lipdeos, carboidratos, amino-cidos, etc. Teoricamente, misturas de compostos mais ou menos biodegradveis, de macromolculas e de outras molculas com baixo peso molecular podem explicar mais adequadamente os dados de pirlise (Saiz-Jimenez & Leew, 1986). A associao supramolecular de substncias hmicas foi encontrada por Haider et al. (2000) e Ricca et al. (2000) e por meio da ruptura at pequenos componentes pela preparao de derivados hmicos atravs de reaes silanizao ou metilao de

funes oxigenadas cidas. Com essa simples produo de derivados (que no quebra ligaes ter e steres), desagregado o frgil aglomerado de estruturas hmicas num plano supramolecular at chegar a pequenas entidades que so prontamente dissolvidas em solventes orgnicos e, assim, eludos em faixas de massa molecular pequenas por cromatografia por excluso de tamanho a alta presso. Os espectros de ressonncia magntica nuclear (RMN) e de infravermelho (IV) gerados dessa forma so muito melhor resolvidos. Estudos com espectroscopia RMN tm demonstrado que, como sugere Piccolo et al. (2003), as substncias hmicas resultam da agregao de vrias classes de compostos orgnicos, tais como acares, aminocidos, steres e teres alifticos e aromticos. Numerosos estudos mostram que h uma correlao direta entre o peso molecular e os coeficientes de difuso para uma variedade de espcies orgnicas e estas correlaes so descritas por equaes empricas. Baseado nestas observaes foi desenvolvido um experimento bidimensional chamado DOSY (do ingls Diffusion Ordered

SpectroscopY), em que observam-se deslocamentos qumicos em um eixo e no outro eixo encontram-se os respectivos coeficientes de difuso. Comparando-se os deslocamentos qumicos e os coeficientes de difuso com os de diferentes padres, possvel identificar vrias classes de compostos no agregado. Usando a tcnica de DOSY 1H RMN, Simpson (2002) foi capaz de demonstrar que as substncias hmicas so, na realidade, associaes ou agregados de molculas de menores pesos moleculares que podem ser rompidos pela adio de cido. A Figura 1 mostra os espectros de DOSY, em duas concentraes diferentes, de AHs isolados de turfa.

Figura 1. Espectros de DOSY de cido hmico isolado de turfa em concentrao de 5mg mL-1 (A) e 133 mg mL-1 (B) e aps adio de 5l de cido actico (C e D). Adaptado de Simpson 2002. Em ambas as concentraes de AHs, os componentes da mistura exibem coeficientes de difuso semelhantes, indicando que existem associaes entre os vrios componentes. Entretanto, a adio de cido actico, que promove a desagregao de materiais hmicos (Piccolo 2002), resulta na formao de bandas discretas de difuso que esto correlacionadas com deslocamentos qumicos consistentes com as espcies mais abundantes nestas misturas, ou seja, lignina, polissacardeos e peptdeos (ver tambm Piccolo et. al. 2003). Aps a desagregao com cido actico, os coeficientes de difuso mdios para cada uma das espcies podem ser calculados (Figura 1D).

Finalmente, os tamanhos moleculares podem ser extrapolados a partir da comparao destes coeficientes com padres e os resultados estimam pesos moleculares na regio de 200-600, ~1000 e 2000-2500 Da, respectivamente. Este resultado muito significante, pois valida a concepo do arranjamento supraestrutural de pequenas associaes de molculas orgnicas com grandes implicaes para o efeito fisiolgico de substncias hmicas como se ver mais adiante. Wang and Xing (2004), usando a tcnica de correlao de tempos para RMN de 1H, obtiveram uma srie de informaes novas sobre a mobilidade das substncias hmicas em soluo. Eles concluram que os fragmentos estruturais tpicos de carboidratos so maiores e apresentam baixa mobilidade em soluo, enquanto que grupamentos alqulicos e aromticos so relativamente menores e mais mveis. Esta mobilidade diferencial das unidades constitutivas dos cidos hmicos pode estar diretamente relacionada com a capacidade de interao das substncias hmicas com as clulas vegetais. O estudo da ao direta das substncias hmicas sobre o metabolismo e o crescimento das plantas tem sido centrado, principalmente, sobre os cidos flvicos, ou seja, a frao humificada considerada de menor massa molecular (Vaughan & Malcolm, 1985). Isto ocorreu por uma simples questo: no era possvel conceber que uma substncia de massa dois ou trs milhes de vezes maiores como os cidos hmicos (na ordem de micrmetros) (Cameron et al., 1972a; Cameron et al., 1972b) pudessem passar por poros ou espaos aparentes no apoplasto (na ordem de nanmetros). No entanto, baseando-se na concepo emergente do arranjamento macro-estrutural de substncias hmicas, compostos de reconhecida capacidade de regulao e estimulao do crescimento vegetal tais como os hormnios vegetais podem estar fracamente unidos supra-estrutura das substncias hmicas e serem liberados para a soluo do solo e para a absoro das plantas por uma simples variao de pH na interface das razes

decorrente, por exemplo, da exsudao de cidos orgnicos como experimentado por Faanha et al. (2002). Dessa forma, os cidos hmicos e seus domnios hidrofbicos predominantes podem ser considerados como um armrio de compostos qumicos que pode ser aberto ou fechado para liberao de determinados componentes de acordo com uma conversa entre a planta e seu ambiente de crescimento. O stio inicial de interface ativa entre os AH e as razes de plantas a regio que compreende a rizosfera e o rizoplano, onde partculas supra-estruturais de cidos hmicos aplicados a planta ou que naturalmente so formadas no solo, entram em contato com uma diversidade de secrees e exsudatos radiculares das plantas (Figura 2A). O produto desta interao causa alteraes fsico-qumicas no ambiente radicular externo, que, por conseguinte promovem alteraes estruturais nas partculas supra-estruturais de AH. Tais alteraes, podem supostamente gerar sub-unidades/fragmentos de baixo peso molecular (como demonstrado por estudos de pirlise, excluso molecular e alterao de perfil cromatogrfico), potencialmente capazes de induzirem alteraes no metabolismo celular de plantas. Embora os detalhes moleculares que respondem pelas alteraes fisiolgicas na planta sejam pouco explorados, presumivelmente tais sub-produtos de baixo peso molecular podem ser reconhecidos por receptores presentes na plasmalema ou mesmo de modo no conhecido serem internalizados (via apoplasto/simplasto) (Figura 2B e 2C) e elicitarem respostas em nvel celular, eventos de transcrio e transduo especficos, resultando em alteraes estruturais e fisiolgicas na planta. Neste sentido, a localizao desse armrio est na rizosfera/ rizoplano das razes. Os quais parecem guardar a chave desse armrio, e que, promovem, de forma no elucidada, a entrada de substncias hmicas para o interior da clula (Figura 2B e 2C, D, E). A linguagem dessa conversao permanece ainda como um mistrio desafiador.

A A

Figura 2. A: Fotomicrografia de imunomarcao fluorescente de partculas de cidos hmicos (AHs) dispersas no rizoplano de razes de milho (estrela). Aumento de 620X. B: Fotomicrografia de imunomarcao fluorescente de seo transversal de razes de milho, com imagem de sinal amplificado, evidenciando agregados de partculas de AHs no lmem de vasos do protoxilema. Aumento de 750X. C/D: Imagens de correspondncia, respectivamente por microscopia tica de contraste diferencial e interferncial (DIC) e de fluorescncia de seo transversal de razes de milho evidenciando agregado de AHs presente nos espaos intercelulares de clulas do parnquima cortical de milho (quadrado). Aumentos de 500X. E: Fotomicrografia de imunomarcao fluorescente de razes de milho evidenciando agregados de AHs (seta) em clulas de parnquima prximas ao aernquima formado pelas condies de cultivo hidropnico no ensaio em questo. Aumento de 250X. A Deteco de AHs na planta foi feita por imunoflorescncia, combinando anticorpos secundrios de cabra, IgG anti-coelho, marcados com isotiocianato de fluorescena (FitC) e anticorpos primrios policlonais no purificado anti-AHs isolado de vermicomposto.

2.1 2.2

Bioatividade de Substncias hmicas Perspectiva histrica Vaughan e Malcoln fizeram, em 1985, uma reviso brilhante sobre a cronologia

do estudo do efeito das substncias hmicas sobre a fisiologia das plantas. Aqui feito um breve resumo desse artigo. Por mais de 8000 anos, o homem tem considerado que as terras de colorao escura so normalmente mais produtivas e que a colorao e a produtividade esto associadas presena de matria orgnica proveniente da decomposio dos resduos de plantas ou animais. Conta uma famosa lenda que o rei Augeas de Elis possua um curral com 3 mil cabeas de gado. Por trinta anos, o curral nunca fora limpo. O legendrio Hrcules se disps a limpar o curral numa nica noite. O rei Augeas, considerando impossvel tal proeza, concordou em pagar o equivalente a 10% de seu rebanho pela tarefa. Hrcules desviou o rio Alpheus para dentro do curral dispersando todo o esterco. Ento, o rei usou a perda do precioso material como uma das razes para no pagar a dvida. Homero, na Odissia, escrita provavelmente entre 800 e 900 antes de Cristo, menciona a fertilizao das vinhas com esterco. Teofrasto (372-287 A.C.) recomendava o uso abundante de esterco nos solos enfraquecidos. Alm desses, h uma srie de outros relatos do uso da matria orgnica desde a Antigidade, seja em fatos histricos ou em contos mitolgicos (Tisdale & Nelson, 1966). Aristteles sempre mencionado como o primeiro a sugerir que as plantas deveriam absorver seus alimentos na mesma forma que os animais. No sculo XVII, muitos estudiosos consideravam que as plantas poderiam absorver seus nutrientes orgnicos diretamente do solo. A utilizao direta do hmus pelas plantas (A teoria do hmus) foi enunciada originalmente por Thaer, que, no incio do sculo XIX, indicou que o hmus compreende uma poro mais ou menos considervel do solo e a

fertilidade do solo depende dele; alm da gua, o hmus o nico material capaz de fornecer nutrientes para as plantas. Apesar da Teoria do Hmus de Thaer ter sido amplamente disseminada, foi na mesma poca que tambm surgiu a maior crtica sobre o papel do hmus na fertilidade do solo. De Saussure foi o responsvel pela descoberta de que as plantas podem sintetizar substncias orgnicas a partir de CO2 atmosfrico e gua. Tambm o papel dos elementos inorgnicos na nutrio das plantas foi descrito por Liebig, que formulou, em contraposio Teoria do Hmus, a Teoria da Nutrio Mineral de Plantas: a produo das culturas no campo aumenta ou diminue na exata proporo em que aumentam ou diminuem a quantidade de substncias minerais que podem ser liberadas do esterco. Embora a controvrsia entre as duas teorias ainda tenha perdurado, ao longo dos anos, a teoria da nutrio mineral de plantas mostrou-se inequcova e tem sido a mais defendida na literatura especializada. Numa srie de 15 artigos para a Academia Real Inglesa, publicados entre 1912 e 1921, Bottomley chegou concluso de que as substncias hmicas aumentavam o crescimento de Lema major, Salvinia natans e Limobium stoloniferum em soluo de cultivo. Ele cunhou a denominao de auximnios para a frao bioativa da matria humificada. Bottomley (1917) considerou que os auximnios poderiam regular o crescimento das plantas. Foram publicados, nessa mesma poca, os primeiros relatos sobre os hormnios vegetais. Idias muito semelhantes s de Bottomley foram defendidas por Hillitzer, Chaminade e Boucher. Seguindo uma outra linha de pensamento, Olsen pregava que as substncias hmicas promoviam o crescimento das plantas por tornarem os micronutrientes mais solveis e mais disponveis para a absoro celular. O caso clssico estudado por Olsen em 1930 foi o aumento da absoro de ferro pelas plantas, que inspirou, mais tarde, os trabalhos de Pinton et al. (1997; 1999b), Mohamed et al. (1998), Cesco et al. (2000), Agnolon et al. (2002),

Nikolic et al. (2003) e Chen et al. (2004). A forma absorvida pelas plantas FeII e Olsen demonstrou que as substncias hmicas tm poder redutor suficiente para transformar FeIII em FeII. Alm disso, Lieske (1931) sugeriu que as substncias hmicas tambm poderiam alterar a permeabilidade das membranas das plantas atravs de sua ao surfactante aumentando a capacidade de absoro de nutrientes. A ao detergente das substncias hmicas e o conseqente aumento da fluidez das membranas ainda advogada at hoje como um dos principais efeitos das substncias hmicas no metabolismo celular (Visser, 1985; Visser, 1987a e 1987b; Samson & Visser, 1989; Varanini et al., 1993). Na seqncia, desenvolveremos uma discusso crtica dos resultados e interpretaes dos trabalhos mencionados acima, os quais tm constitudo a base do conhecimento geralmente aceito e descrito na literatura cientfica que versa sobre a influencia das substncias hmicas no metabolismo e crescimento das plantas.

2.3

Efeitos indiretos das substncias hmicas sobre o crescimento das plantas

O condicionamento das propriedades do solo pela matria orgnica, via de regra, proporciona melhores condies de cultivo. Esta influncia global das substncias hmicas sobre a macro e a microestrutura dos solos, a qual proporciona benefcios para a atividade biolgica, conhecida como o efeito indireto da matria orgnica humificada sobre o crescimento vegetal. Existe uma srie muito grande de evidncias experimentais que asseguram que as substncias hmicas (SH) participam de reaes importantes que ocorrem na interface soluo parte slida do solo, influenciando a fertilidade atravs da liberao de nutrientes, da detoxificao de elementos qumicos, na formao de estrutura, ou seja, da melhoria das condies qumicas, fsicas e

biolgicas do solo (Canellas et al., 1999). O Quadro 1 resume alguns dos principais efeitos da matria orgnica humificada sobre as propriedades do solo.

2.4

Efeitos diretos das substncias hmicas sobre o metabolismo das plantas

As substncias hmicas podem afetar diretamente o metabolismo das plantas atravs de mecanismos ainda no muito claros. O efeito das substncias hmicas sobre o metabolismo das plantas foi resumido por Nannipieri et al. (1993) como resultado (i) da influncia positiva sobre o transporte de ons, facilitando a absoro; (ii) do aumento da respirao e da velocidade das reaes enzimticas do ciclo de Krebs, resultando em maior produo de energia metablica sob a forma de ATP; (iii) do aumento no contedo de clorofila; (iv) do aumento da sntese de cidos nuclicos; (v) do efeito seletivo sobre a sntese protica e (vi) do aumento ou inibio da atividade de diversas enzimas. Todavia, as molculas hmicas dotadas de bioatividade e seus alvos celulares bem como as vias sinalizadoras primariamente envolvidas nessas respostas no foram ainda elucidadas.

Quadro 1. Propriedades gerais das substncias hmicas e efeitos causados no solo Propriedade Cor Reteno de gua Unio de partculas slidas Substncias hmicas Apresentam colorao variando de amarelo at escuro Podem reter gua at 20 vezes a sua massa Cimentam partculas do solo formando agregados Efeitos no solo Interferem no matiz e no croma do solo; reteno de calor Proteo contra eroso; armazenamento de gua no solo Formao de estrutura no solo; porosidade do solo; densidade do solo Detoxificao de ons txicos (Al+++), aumentam mobilidade de ons

Formam complexos especficos (Cu++, Mn++, Complexao Zn++, Al+++) e no especficos (Ca++, Cd++) Devido sua associao Pouca matria orgnica Insolubilidade em gua com argilas e sais de perdida com a gua de ctions di e tri valentes percolao Tm funo tamponante ajudam a manter o Efeito tampo em amplos intervalos de equilbrio da soluo do pH solo Responsveis pela A acidez total das fraes capacidade de troca de Troca de ons isoladas do hmus varia de 300 a 1400 cmolesc kg-1 ctions e de nions no solo A decomposio da Fornecimento de nutrientes matria orgnica libera para o crescimento das Mineralizao ons e molculas (CO2, plantas + -3 -2 NH4 , NO3 , PO4 e SO4 ) Adaptado de Rocha & Rosa (2003) 2.5 O papel da H+-ATPases na nutrio e crescimento celular

Em funo de seu papel central no processo de nutrio e proteo celular e por ser a barreira que comunica o citoplasma com a rizosfera, evidente que a membrana plasmtica deveria ser um dos alvos primrios da ao das substncias hmicas. Neste contexto, evidncias experimentais crescentes tm sugerido que o monitoramento da atividade das bombas de prtons nesta membrana poderia ser utilizada para avaliar a bioatividade das substncias hmicas.

A H+-ATPase de membrana plasmtica exerce um papel central no crescimento das clulas vegetais e em sua nutrio mineral. Essa enzima funciona como uma bomba de H+ acionada pela hidrlise de ATP, sendo responsvel pelo transporte primrio de prtons (H+) do interior da clula para o apoplasto e, conseqentemente, pela formao do gradiente de H+ gerado atravs da membrana plasmtica. Este gradiente de H+ energiza o transporte secundrio de ons e outros metablitos contra um gradiente de concentrao. Vrios ons dos principais micro e macro-nutrientes vegetais se encontram em concentraes nano ou micromolares nos solos e precisam ser transportados para o interior celular, onde esto centenas de vezes mais concentrados. Para isto, existem na membrana plasmtica vrias protenas transportadoras especficas capazes de acoplar a dissipao do(s) componente(s) eltrico e/ou qumico do gradiente de H+ gerado pelas bombas ao co-transporte dos H+ com estes ons. De fato, o principal papel imputado H+-ATPase de membrana plasmtica na fisiologia das plantas sempre foi o de ativar o transporte secundrio de ons (Sondergdard et al., 2004). A absoro de ons da soluo do solo pode acontecer contra ou a favor de um gradiente de concentrao e, em qualquer dos casos, o gradiente de H+ pode exercer forte influncia, quer seja energizando o transporte ativo atravs de transportadores tipo simporte, uniporte ou antiporte, quer seja regulando a abertura e o fechamento de alguns canais responsveis pelo transporte passivo de ons (Figura. 3). Alm dos ons, o gradiente eletroqumico de H+ tambm fornece a energia necessria para o transporte de alguns compostos orgnicos (Maathuis et al., 2003). Um exemplo j bem caracterizado o do transportador de sacarose envolvido no transporte de acar do apoplasto para os vasos do floema (Morsomme & Boutry, 2000)

Teoria do Crescimento cido

H+
AH / AUXINA

CELULOSE

+ + ++ - - - -

EXPANSINA HEMICELLULOSE

H2O
nions
ATP ADP + Pi

ctions

uniport

simport

antiport

Figura 3. Representao esquemtica da H+-ATPase de membrana plasmtica. A atividade de hidrlise de ATP gera de 3 a 5 moles de H+ que, transportados em outro domnio da mesma enzima, gera gradiente de prtons necessrio para i) energizar o transporte de ons e ii) diminuir o pH do apoplasto (condio para ao das expansinas e conseqente afrouxamento da parede celular).

Tambm existem vrias evidncias que indicam que as respostas das plantas a diversos estresses ambientais, tais como o a tolerncia salinidade e ao estresse hdrico, esto relacionadas com a ativao dos sistemas de transporte primrios e secundrios. Para prevenir a acumulao excessiva de sais no citoplasma, as plantas desenvolveram os mais variados tipos de mecanismos, parte destes envolvendo a expresso diferencial de transportadores especficos. Uma resposta imediata ao acmulo de um sal ou de outro agente potencialmente citotxico na clula consiste, basicamente, na excluso deste do citoplasma por meio de sua compartimentalizao no vacolo ou sua extruso

para o exterior celular. No caso especfico do estresse salino, a super- expresso do antiporte Na+/H+ tanto na membrana plasmtica quanto na vacuolar (tonoplasto) parece ser fundamental para o desenvolvimento da tolerncia. Adicionalmente, tem se evidenciado que o processo tambm envolve a ativao dos transportadores primrios de H+ presentes nestas membranas. A abertura e o fechamento dos estmatos tambm energizado pelas H+-ATPases das membranas plasmticas e dos vacolos das clulas guardas que mantm e regulam um fluxo massivo, bidirecional de ons e de gua atravs de transportadores e de canais especficos que controlam a presso de turgor destas clulas e, conseqentemente, a funo estomtica. As H+-ATPases tambm exercem um papel central na regulao do pH celular, o qual, na maioria das espcies, permanece constante dentro de uma estreita faixa de pH (7,0 a 7,5), independente do estdio fisiolgico da clula vegetal ou do estresse a que est submetida. Apesar de saber-se relativamente pouco sobre o mecanismo de ao das H+-ATPases nesta regulao, vrios experimentos tm demonstrado que o pH citoplasmtico varia de acordo com o estado de ativao das H+-ATPase e com a modulao da expresso dos genes que as codificam. Enquanto o pH celular mantido acima de 7,0, o pH timo para a atividade da H+-ATPase de membrana plasmtica fica entre 6,0 e 6,5. Assim, qualquer acidificao do citoplasma pode ativar esta enzima, aumentando a extruso de H+ e contribuindo para a alcalinizao do citoplasma. Entretanto, tambm foi observado em plos radiculares de alfafa que mudanas pontuais da atividade da H+-ATPase no provocaram mudanas no pH do citoplasma. Obviamente, existem outros controles na regulao do pH celular e muitos caminhos metablicos e de transporte que envolvem H+, tornando difcil uma idia clara de como essa regulao feita.

No obstante, um dos fenmenos que tm sido mais relacionado com a bioatividade das substncias hmicas corresponde acidificao da parede celular causada pela ativao da H+-ATPase de membrana plasmtica. Esse evento tido como o evento inicial da expanso celular. Esse mecanismo conhecido como teoria do crescimento cido (Rayle & Cleland, 1992) e est associado com a ao da auxina, um hormnio vegetal que ativa a H+-ATPse por diversos mecanismos, entre eles a induo da sntese de H+-ATPse modulada por genes Mha1 e Mha2 (Frias et al., 1996). A acidificao do apoplasto seguida da elogamento celular tambm ativada pela fusiccocina (uma toxina fngica) que, reconhecidamente, estimula a H+-ATPase. De acordo com a teoria do crescimento cido, a acidificao do apoplasto leva ao rompimento de ligaes da parede celular promovendo sua elasticidade, enquanto a hiperpolarizao da membrana plasmtica aumenta a absoro de K+ (por meio da energizao de transportadores). Essa absoro provoca mudanas no potencial osmtico da clula, permitindo influxo de gua atravs das membranas mediado pelas aquaporinas, favorecendo, assim, o crescimento celular (Morssome e Boutry, 2000). Esse breve resumo do trabalho de Morssome e Boutry (2000) deixa claro o papel central dessa enzima na adaptao da planta ao ambiente. As primeiras evidncias de que as bombas de prtons membranares estariam envolvidas no aumento da absoro de nutrientes na presena de substncias hmicas foi obtida por Varanini et al. (1993) que obtiveram uma evidncia direta da interao entre substncias hmicas de baixo peso molecular e H+-ATPase de membrana plasmtica. Nesse estudo foi usado um surfactante (brij58) e postulado que o aumento da permeabilidade da membrana poderia ser responsvel pela maior capacidade de absoro de nutrientes proporcionada pela presena de substncias hmicas em soluo tem sido justificada por um hipottico aumento da permeabilidade da membrana

plasmtica por meio da ao surfactante das substncias hmicas e a ativao da H+ATPase de membrana plasmtica (Varannni et al., 1993). Nessa linha de argumentao, h vrios estudos que sugerem uma analogia entre a ao fisiolgica das substncias hmicas e a ao dos surfactantes. Os dois grupos de substncias exercem algum efeito sobre o crescimento das plantas. Visser (1985) sugeriu que o resultado da atividade de superfcie das substncias hmicas teria como alvo principal s membranas celulares, uma vez que os surfactantes aumentam a fluidez da membrana, diminuindo a coeso entre os componentes da membrana. Esse fenmeno resulta num aumento da permeabilidade da membrana plasmtica e na diminuio da temperatura na qual ocorre a transio da matriz lipdica entre as fases lquida e slida. O mesmo autor, utilizando clulas de batata, estudou a ao de dipalmitoil fosfatidicolina (DPPC) e de cidos hmicos. A concentrao de 40 mg AH L-1 de soluo foi suficiente para aumentar o efluxo de K+ da clula. A explicao para o fenmeno dada por Visser (1987a) inclui o aumento da permeabilidade da membrana celular. Reconhecidamente, os agentes surfactantes, que apresentam superfcie ativas, aumentam a permeabilidade de membranas biolgicas (Visser, 1985; 1987b; Samson & Visser, 1989). Entretanto, seria improvvel que o aumento da permeabilidade da membrana plasmtica e a dissipao do potencial transmembranar possam induzir qualquer efeito benfico sobre as plantas. O controle da permeabilidade celular est intimamente relacionado manuteno da seletividade da membrana plasmtica, fator fundamental para a manuteno da homeostase celular. Em outras palavras, com a perda da seletividade, o aumento do fluxo de ons atravs da membrana leva, invariavelmente, perda do equilbrio qumico da clula e de sua funcionalidade. A Figura 4 mostra claramente a ao de cidos hmicos adicionados ao meio de reao contendo vesculas enriquecidas de membrana plasmtica e ATP como substrato

para reao de hidrlise e gerao de H+ + Pi + ADP. observada uma forte ao depletora na atividade da enzima in vitro com o aumento da concentrao de cidos hmicos na soluo de reao, provavelmente pela ao surfactante mencionada acima.

Caf

Milho

100 100 90 80 70 A.E. (%) 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 20 40 50 100 A.E. (%) 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 20 40 50 100 90 80 70

CIDOS HMICOS (mg/ L)

CIDOS HMICOS (mg/ L)

Figura 4. Ensaio in vitro da ao dos AH sobre a atividade especfica (A.E.) sensvel


vanadato (expressa em porcentagem) da H+ ATPase de membrana plasmtica isolada de razes de caf e milho controle (i.e. crescidas sem cidos hmicos). O meio de reao consistiu de 50 mM Mops-tris pH 6,5, 100 mM KCl, 3 mM MgSO4, 1 mM ATP, 0,05 mg.mL-1 de protena e concentraes crescentes dos cidos hmicos extrados de vermicomposto (o) e de lodo da estao de tratamento de esgoto ().

A ativao das bombas de H+ pelas substncias hmicas isoladas de vermicomposto foi observada por Nardi et al. (1991), que verificaram aumento na hidrlise de ATP pela H+-ATPase da frao microssomal obtida de razes de milho. Ensaios in vivo, com plntulas de milho tratadas com substncias hmicas solveis em gua isoladas de turfas, tambm mostraram a estimulao da atividade da H+-ATPase associada a um aumento na absoro de NO3- (Pinton et al., 1999). Por outro lado, Nardi

et al. (2000) encontraram forte inibio da H+-ATPase tambm obtida de microssomos de razes de milho, porm tratado com substncias hmicas de baixo peso molecular extradas do horizonte superficial de um solo de regio de clima temperado.Tal discrepncia foi relacionada s diferenas encontradas nas concentraes e na natureza qumica das substncias hmicas testadas. A maioria dos trabalhos sobre bioatividade de substncias hmicas tem se concentrado nas fraes solveis em gua e/ou de baixo peso molecular porque essas substncias poderiam acessar mais facilmente possveis receptores na superfcie da membrana plasmtica ou no interior da clula (Vaughan & Malcolm, 1985). Canellas e Faanha (2004) observaram um forte estmulo no transporte de prtons atravs de vesculas enriquecidas de membrana plasmtica isoladas de razes de milho por substncias hmicas isoladas das camadas superficiais de um Argissolo Amarelo em avanado estdio de intemperismo em comparao com as substncias hmicas isoladas das camadas mais profundas. Alm disso, foi observado que o estmulo no transporte de H+ e no crescimento de razes de plntulas de milho foi maior para cidos hmicos do que para os cidos flvicos (Quadro 2). Foi encontrada uma correlao matemtica significativa entre o estmulo no transporte de H+ e a relao E4/E6 determinada pela razo entre a absorbncia em 465 nm e 665 nm (Figura 5). Esse ndice est diretamente relacionado com a agregao das substncias hmicas (Kononova, 1982). Quanto menor a relao, maior a hidrofibicidade da substncia hmica e o grau de agregao das unidades no arranjamento supra-estrutural. A mesma relao foi encontrada quando comparado o efeito da bioatividade de cidos hmicos isolados de solos com estdios diferentes de intemperismo. cidos hmicos com valores de E4/E6 mais elevados foram isolados de solos mais intemperizados e apresentaram maior acidez total e carboxlica (Latossolo

Amarelo > Luvissolo Crmico> Argissolo Vermelho Amarelo). cidos hmicos isolados dos Chernossolos e do Neossolo Litlico apresentaram valores menores de E4/E6 e de acidez total e carboxlica.

Quadro 2. Efeito de cidos flvicos e hmicos isolados de diferentes profundidades


de um Argissolo Amarelo sobre a rea e o transporte de H+ em vesculas isoladas da preparao microssomal de razes de plntulas de milho.

Amostra

Profundidade
(m)

rea superficial radicular


(mm2)

Velocidade inicial do transporte de H+


% min

cidos Hmicos
Controle AH-1 AH-2 AH-3 AH-4 0,00-0,05 0,05-0,10 0,10-0,20 0,20-0,40 28,81 C* 36,44 BC 58,76 A 38,22 BC 46,49 AB 3,8 14,0 16,0 11,0 8,0

cidos Flvicos
AF-1 AF-2 AF-3 AF-4 F CV 0,00-0,05 0,05-0,10 0,10-0,20 0,20-0,40 47,06 AB 37,29 BC 34,92 BC 32,04 C 4,87** 25,6 8,0 5,2 11,5 0,0 -

mdias seguidas de letras iguais no diferem estatisticamente pelo teste de Tukey P <

0,05.(**) significativo a P < 0.01.

O efeito de uma soluo de 20 mg C de cidos hmicos L-1 sobre o crescimento radicular de plntulas de milho apresentado no Quadro 3. Os diferentes cidos hmicos promoveram estmulos na massa seca, rea superficial e no nmero de stios de mitose e de razes laterais emergidas em comparao com o tratamento controle

(soluo de CaCl2 2 mmol L-1 sem os cidos hmicos). Aps o perodo do ensaio (sete dias de exposio das plntulas) foi possvel observar incrementos entre 237% e 395% para massa radicular, de 89% a 378% para rea superficial, de 35% a 162% para o nmero de stios de mitose e entre 14% e 108% para o nmero de razes emergidas. O aumento do desenvolvimento radicular promovido pelos cidos hmicos est dentro de uma faixa j observada por Vaughan & Malcolm (1985) e por Chen & Aviad (1990). Foi possvel estabelecer uma relao inversa e significativa entre a razo E4/E6 dos cidos hmicos e os incrementos de massa seca (r2= 0,70 p<5%) e de rea radicular (r2=0,74 p<5%) (Figura 5). A correlao entre a E4/E6 e a soma do nmero de stios de mitose mais o de razes laterais j emergidas foi, tambm, inversa e significativa (y= 0,0195 x + 12,516; r2= 0,82 p<1%).

10 9 8

AF4 AF2 AF1 AH4 AF3 AH3 R2 = 0,92** AH1

E4/E6 7
6 5 4 3 2 0 100

AH2

R2 = 0,99** 200 300


+

400

estmulo no transporte de H

(%)

Figura 5. Relao entre o estmulo no bombeamento de H+ em vesculas da


preprarao microssomal isoladas de plntulas de milho tratadas com cidos hmicos (AH) e flvicos (AF) isolados em diferentes profundidades de um Argissolo Amarelo (0,00-0,05; 0,005-0,10; 0,10-0,20; 0,20-0,40 m).

Provas adicionais da ao de substncias hmicas sobre a H+-ATPase de membrana plasmtica e a absoro de nutrientes foram obtidas atravs do estudo do efeito de substncias hmicas sobre a absoro de nitrato. A principal via para o transporte desse nutriente um processo ativo que envolve o co-transporte com ons H+. Sabe-se, tambm, que altas taxas de absoro de nitrato freqentemente ocorrem paralelamente elevao dos nveis de expresso da H+-ATPase na membrana plasmtica e de sua atividade. Este o caso descrito para a ao de substncias hmicas de baixo peso molecular sobre razes de milho, onde se demonstrou que ocorre um aumento na capacidade de absoro de nitrato associada a um aumento na expresso da H+-ATPase de membrana plasmtica (Quaggiotti et al., 2004).

Quadro 3. Bioatividade dos cidos hmicos isolados de uma seqncia tpica de solos
do Rio de Janeiro avaliada atravs da promoo do crescimento radicular e sobre a atividade de hidrlise do ATP da frao microssomal de plntulas de milho crescidas em meio mnimo de CaCl2 2 mmol L-1 (controle) e 20 mg C de AH L-1.

Tratamentos

massa seca
g

rea superficial
m
2

Hidrlise de ATP mol de Pi mg Protena-1


min-1

Controle AH-1 AH-2 AH-3 AH-4 AH-5 AH-6

0,019

0,009

0,86 + 0,014 (100%) 2,46 + 0,037 (286%) 1,40 + 0,049 (163%) 4,40 + 0,076 (511%) 3,67 + 0,037 (427%) 2,69 + 0,042 (312%) 5,24 + 0,113 (609%)

0,064 c 0,079 abc 0,090 ab 0,087 ab 0,071 bc 0,094 a

0,019 cd 0,024 bc 0,043 a 0,032 ab 0,017 cd 0,041 a

Mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si (teste de Duncan a 5%). Luvissolo Crmico Plico abrptico (AH-1), Argissolo Vermelho Amarelo Distrfico (AH-2), Chernossolo Argilvico rtico vrtico (AH-3), Chernossolo Rndzico

Saproltico tpico (AH-4), Latossolo Amarelo Coeso tpico (AH-5) e Neossolo Litlico Eutrfico tpico (AH-6)

2.6

Mecanismos de ativao da H+-ATPase de membrana plasmtica pelas substncias hmicas

Os trabalhos acima mencionados explicitam a notria estimulao que as substncias hmicas, especialmente cidos hmicos e flvicos, exercem sobre o desenvolvimento de razes de plntulas e sua possvel associao com a induo da expresso da enzima que representa o sistema primrio de transporte de H+ da membrana plasmtica e, conseqentemente, da hidrlise de ATP e do transporte de H+, estudados, principalmente, em vesculas microssomais. O aumento na atividade das bomba de H+ parece favorecer a induo da emisso de plos radiculares, de razes laterais finas, o que resultaria, principalmente, no aumento na rea superficial do sistema radicular (Figura 6). A teoria baseia-se num processo onde grupamentos com atividade auxnica, presentes na composio estrutural dos substncias hmicas, sensibilizariam receptores especficos na membrana plasmtica, desencadeando cascatas de sinalizao que culminariam com a ativao da transcrio dos genes que codificam para isoformas especficas da H+-ATPase de membrana plasmtica, as quais seriam superexpressas na superfcie das clulas radiculares (Canellas et al., 2002). Essa hiptese foi confirmada no trabalho de Quaggiotti et al. (2004). Isto promove o aumento do gradiente eletroqumico de H+ atravs da membrana, ativando os sistemas secundrios de transporte de ons (estimulao da nutrio) e a acidificao e conseqente aumento de plasticidade da parede celular (teoria do crescimento cido), condies estas que dariam suporte profuso dos plos radiculares e induo de razes laterais (Figura 6).

Figura 6. Efeito do tratamento de razes de plntulas de cana-de-acar (A), milho (B) e


tomate (C) com 20 mg C de AH isolado de vermicomposto. O tratamento com cidos hmicos induz a formao de stios de mitose nas razes e, posteriormente, o nmero de razes laterais emergidas.

Todavia, permanecem ainda pendentes vrias questes que envolvem o mecanismo de ativao das bombas de H+ pelos cidos hmicos. E uma das principais questes diz respeito dificuldade de identificao das molculas bioativas responsveis pela sensibilizao dos receptores. Atravs da cromatografia de excluso por tamanho em gel de sephadex, foi observado uma mudana drstica no perfil de distribuio das faixas de tamanho dos agregados hmicos aps o contato da soluo de cidos hmicos com o sistema radicular tanto de plntulas de milho como de caf (Figura 7)

A
0.5 0.45 0.5 0.45

A
depois

Ab 0.4 sor v 0.35 nci a 0.3 em 25 0.25 0 nm 0.2


0.15 0.1 0.05 0 0 10 20

depois

0.4 Ab sor v nci a em 25 0 nm 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15

antes

antes
0.1 0.05 0 30 40 50 60 0 20 40 60

Volume de eluio (mL)

Volume de eluio (mL)

Figura 7. Cromatografia de excluso por tamanho da soluo de cidos hmicos a pH


5,5. AHVantes: cidos hmicos isolados de vermicomposto antes do crescimento das plntulas de milho; AHV depois: cidos hmicos isolados do vermicomposto depois do crescimento de plntulas de milho. AHLantes: cidos hmicos isolados de lodo da estao de tratamento de esgoto antes do crescimento das plntulas de milho; AHL depois: cidos hmicos isolados de lodo da estao de tratamento de esgoto depois do crescimento de plntulas de milho. (Adaptado de Faanha et al., 2002).

As substncias exsudadas pelas razes de milho parecem modificar a distribuio e/ou conformao dos componentes de ambos os cidos hmicos testados neste ensaio. Foi postulado por Piccolo et al. (1999) que os cidos hmicos so formados por uma mistura heterognea de pequenas molculas reunidas num arranjo supramolecular estabilizado por foras relativamente fracas (ligaes do tipo van de Waals, -, CH-). Essas ligaes podem ser quebradas reversivelmente na presena de baixas concentraes de cidos orgnicos (Nardi et al., 2000; Cozzolino et al., 2001). Vrios cidos orgnicos so exsudados pelas razes de vrias plantas que podem mobilizar subunidades estruturais das SH, resultando na alterao observada do perfil

cromatogrfico de excluso das amostras (Piccolo, 2002). possvel que pelo menos algumas dessas subunidades possuam atividade hormonal tais como os grupamentos auxnicos detectados nos derivados metilados de cidos hmicos (Muscolo et al., 1998; Canellas et al., 2002). Um esquema representativo ilustrando essa hiptese mostrado na Figura 8.

Figura 8. Esquema representativo da ruptura do arranjamento supra-estrutural dos


cidos hmicos em decorrncia da ao de cidos orgnicos. Pequenas subunidades estruturais podem ser portadoras de atividade qumica especfica para estimular o metabolismo de plantas como, por exemplo, grupamentos similares auxina detectados atravs da cromatografia gasosa espectrometria de massas. A e B cromatograma e espectro de massas de 1,3 cido indol actico respectivamente, C e D correspondem ao cromatograma e espectro de massa do pico assinalado pela seta obtido de cido hmico isolado do vermicomposto.

Essas subunidades funcionais, uma vez dissociadas da molcula base dos cidos hmicos, poderiam acessar receptores na superfcie ou no interior das clulas das razes desencadeando processos que culminariam com o estmulo do desenvolvimento radicular das plntulas. Ou seja, parece existir um dialogo envolvendo a troca bidirecional de substncias interativas, onde exsudatos radiculares interagem com a matria orgnica do solo liberando molculas bioativas, as quais, por sua vez, interagem com as clulas radiculares promovendo alteraes fisiolgicas complexas. Evidncias experimentais tm sugerido que pelo menos uma dentre estas molculas liberadas das substncias hmicas apresenta similaridades estruturais a/ou funcionais com fitohormnios como a auxina. Tal descoberta est de acordo com os vrios relatos na literatura sobre a atividade hormonal semelhante auxina exibida por vrias substncias hmicas, incluindo cidos hmicos (Bottomley, 1917; Hillitzer, 1932; Chaminade & Boucher, 1940; Paszewski et al., 1957; ODobmel 1973; Cacco & DellAgnola, 1984; DellAgnola & Nardi, 1987; Nardi et al., 1988; Piccolo et al., 1992; Muscolo et al., 1993; Muscolo et al., 1998; Canellas et al., 2002; Quaggiotti et al., 2004). O efeito do crescimento de razes na presena de cidos hmicos e de inibidores de transporte (TIBA) e de receptores (PCIB) de auxinas mostrado na Figura 9.

Figura 9. Crescimento radicular de plntulas de milho controle (A), na presena de 20


mg C cidos hmicos L-1 (B) e de cidos hmicos com inibidores de auxinas; C: inibidor de transporte (TIBA), D: inibidor no especfico de receptores (PCIB).

A interao dos cidos hmicos deve ocorrer via receptores especficos e no diretamente com a H+-ATPase, pois devido a evidncias experimentais, os cidos hmicos no parecem responder pela ativao dessa enzima porque in vitro, a adio de ambos AH ao meio de reao promoveu a inibio da atividade ATPsica (Figura 6). As atividades da H+-ATPase exibidas no Quadro 3 e 4 foram obtidas de vesculas de membrana plasmtica que se formaram durante o fracionamento celular com a face citoplasmtica exposta ao meio (inside-out vesicles). Logo, parece que a hiptese mais plausvel que molculas de AH ou suas subunidades interajam com receptores na superfcie celular, que, por sua vez, transmitiriam um sinal para dentro da clula, desencadeando a ativao da H+-ATPase.

Esses resultados so o alicerce da hiptese onde a H+-ATPase de membrana plasmtica figura como um dos principais alvos moleculares envolvidos na ao dos cidos hmicos sobre o crescimento das plantas. Essa enzima o principal sistema de transporte ativo de H+ da membrana plasmtica, exercendo forte efeito sobre a regulao do pH do apoplasto (Morsomme & Boutry, 2000). A acidificao do apoplasto uma pr-condio para o aumento da plasticidade da parede celular e a conseqente elogamento da clula vegetal. Esse fenmeno tem sido associado ao do fitormnio auxina, promovendo ativao da H+-ATPase atravs de mecanismos que ainda no foram completamente elucidados (Rayle & Cleland, 1992). Portanto, o aumento do desenvolvimento radicular em resposta ao tratamento com AHL e AHV pode estar relacionado estimulao da atividade da H+-ATPase de membrana plasmtica observada nas preparaes de vesculas extradas de plntulas tratadas com cidos hmicos Esse estmulo parece resultar de uma superexpresso da enzima na membrana plasmtica evidenciada pela maior quantidade de H+-ATPase detectada imunologicamente nas vesculas isoladas (Figura 10).

Figura 10. Diferena no contedo de H+-ATPase de membrana plasmtica em


preparaes de razes tratadas (+) ou no (-) com 20 mg C de cidos hmicos isolados de vermicomposto separadas em gel de SDS-PAGE a 7,5%. O

Western blot foi realizado utilizando-se anticorpos contra H+-ATPase de


membrana plasmtica de Nicotiniana plumbaginifolia para identificar esta enzima nas prepraraes de vesculas de membrana plasmtica de razes de milho. (Adaptado de Canellas et al., 2002).

Esse dado refora a idia de um envolvimento direto dos grupamentos auxnicos dos AH (Figura 8) na ativao da H+-ATPase, uma vez que j foi demonstrado que a incubao de tecidos de milho com auxina induz um aumento do nmero de H+ATPases expressas na membrana plasmtica (Frias et al., 1996). Comparativamente, foram observadas diferenas significativas entre os AH no estmulo da atividade hidroltica da H+-ATPase de membrana plasmtica. Tanto nos experimentos com caf como com plntulas de milho, os AH isolados de lodo de esgoto (AHL) estimularam mais a atividade da H+-ATPase de membrana plasmtica do que os isolados do vermicomposto (AHV) (Figura 11). O gradiente de H+ gerado pela ATPase

nas vesculas isoladas de razes de milho tratadas com AHL foi maior do que o das tratadas com AHV, consistente com o efeito fisiolgico observado no crescimento radicular (Figura 9). Outra possibilidade seria um acoplamento entre o estmulo da atividade da H+-ATPase e o aumento do transporte de nutrientes que, por sua vez, resultaria em estmulo do crescimento da planta (Pinton et al., 1999).

Figura 11. Transporte de H+ atravs de vesculas enriquecidas com membrana


plasmtica isolada de razes de milho tratadas com cidos hmicos (a e b) e controle (linha tracejada). O aumento no transporte de H+ corresponde ao decrscimo na intensidade de fluorescncia da sonda ACMA. A seta aponta adio do protonforo (FCCP) permeabilizando as membranas para H+ dissipar o gradiente eletroqumico.

Foi postulado previamente que cidos flvicos poderiam dissipar o potencial eltrico da membrana plasmtica e que tambm promoveriam aumento gradual na

permeabilidade da mesma a nutrientes. Contrrio a essa hiptese, apesar de ambos os efeitos promoverem de fato aumento da atividade ATPsica in vitro, seria improvvel que os mesmos possam proporcionar qualquer efeito benfico sobre a clula vegetal intacta, uma vez que o potencial eltrico e a permeabilidade seletiva das membranas so caractersticas indispensveis para a homeostase, a sinalizao e a integridade celular. A ao das substncias hmicas sobre as bombas de H+ membranares representa um efeito geral sobre o metabolismo energtico celular e aponta para uma ao sinalizadora mltipla dos cidos hmicos envolvendo vrios processos metablicos. A matria orgnica humificada, alm de condicionar todas as propriedades do solo, contribui diretamente para a adaptao das plantas ao meio de cultivo.

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq (471910/2003-1), FAPERJ (E26/170.526/2004) e International Foudation of Science (IFS grants # c3391-1; C/3483-1) pelo apoio financeiro.

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CAPTULO 8 ORIGEM DO XIDO NTRICO EM PLANTAS E SEU PAPEL COMO SINALIZADOR DE ESTRESSES

Jose R Magalhaes1, Luzia V Modolo2, Sonia R de Souza3, Luciano freschi4, Marcel G C Frana5, Filomena LIM Silva1
1

Embrapa Gado de Leite - 36038-330 Juiz de Fora MG; 2Plant Biology Division, Samuel

Roberts Noble Foundation, 2510 Sam Noble Parkway, Ardmore, OK 73401, USA; 3Dep. Qumica-Bioqumica-UFRRJ, BR465 km7, 23890-000 Seropdica RJ; 4Dep. Botnica, IB, USP, 05508-900 So Paulo SP; 5Dep. Botnica, ICB, UFMG, Av. Antnio Carlos, 31270901 Belo Horizonte MG

SUMRIO

1. Introduo........................................................................................................................... 3 2. Qumica e Bioqumica do xido Ntrico............................................................................ 5 3. Produo de xido Ntrico em Algas, Fungos e Bactrias ................................................ 6 4. Produo de xido Ntrico via Nitrato Redutase em Plantas............................................. 8 5. Estimativa da Capacidade da Nitrato Redutase para a Formao de xido Ntrico ........ 10 6. Papel do Oxido Ntrico no Desenvolvimento Vegetal e Estresse Ambiental................... 11 7. Novas fronteiras da Nitrato Redutase e a produo de xido Ntrico em Plantas........... 15 8. Consideraes finais ......................................................................................................... 19 9. Referncias ....................................................................................................................... 21

Resumo

O xido Ntrico (NO) um radical livre gasoso altamente reativo com outros tomos ou molculas que contm eltrons no emparelhados. Em animal, o NO sintetizado pela enzima NO sintase (NOS). No entanto, vrios estudos indicam que clulas vegetais possuem outras vias de produo de NO alem daquela mediada pela NOS, destacando-se a reduo enzimtica de nitrito (NO2-). Os primeiros estudos com mutante duplo de Arabidopsis thaliana nia1 nia2 defectivo para nitrato redutase (NR), indicaram a produo de NO atravs da atividade desta enzima. A NR teria um papel chave como fonte de NO2- para as atividades produtoras de NO. A origem do NO2- depende da atividade NR a partir da reduo de NO3-, e a produo de NO derivada de NO2- dependente de uma atividade redutora mitocondrial. Em todos os sistemas vegetais estudados por Planchet et al. (2005), a emisso de NO foi exclusivamente devido reduo do NO2- a NO. A concentrao do NO2- o fator limitante e o transporte mitocondrial de eltrons seria a principal fonte de energia para a reduo do NO2- a NO. Este captulo focaliza os conhecimentos atuais dos mecanismos para a produo de NO em plantas, em resposta a condies de estresse.

1. INTRODUO O NO um radical livre gasoso que reage rapidamente com outros tomos ou molculas que contm eltrons desemparelhados, tendo uma meia vida de menos de 10 segundos na presena de oxignio (Lancaster Jr., 1992; MeBmer et al., 1994). O NO produzido como um poluente do ar pela atividade industrial, tendo um papel chave na qumica dos gases atmosfricos. A oxidao do NO por radicais de perxido de hidrognio (H2O2) levam formao do radical hidroxila (OH), dixido de nitrognio (NO2) e produo fotoqumica de O3 na troposfera. Assim, o NO importante para o equilbrio de radicais na atmosfera e para a gerao de foto-oxidantes (Wildt et al., 1997). O NO tambm produzido por vrios componentes da biosfera, incluindo bactrias, fungos, plantas e animais. Devido ao crescente interesse do papel do NO na fisiologia humana, este radical livre tem despertado grande ateno como composto sinalizador no desenvolvimento das plantas e nas interaes planta-patgeno. Por se tratar de uma molcula pequena e com caracterstica lipoflica, o NO facilmente se difunde atravs de membranas biolgicas sem precisar de um transportador (Leshem, 1996). Uma das suas principais funes na clula a ativao da enzima guanilato ciclase que converte guanosina trifostato (GTP) gerando um segundo mensageiro a guanosina-3',5'-monofosfato cclica (cGMP) (Moncada, 1998). Comparado grande quantidade de referncias para o NO em clulas animais e humanas, os estudos da sua produo e funo em plantas so ainda escassos (Delledonne et al. 1998; Durner et al. 1998; Kim et al. 1998; Magalhaes et al. 1999; 2000; 2005). O primeiro relato da produo de NO em plantas aconteceu h mais de 30 anos (Klepper, 1975). Entretanto, foi somente a partir de 1998 que o papel deste radical livre como sinalizador no desenvolvimento de planta e em interaes planta3

patgeno foi evidenciado, causando grande impulso nas pesquisas com NO em plantas. Um conhecimento detalhado dos processos que esto potencialmente envolvidos na sntese de NO e sua regulao de fundamental importncia para a elucidao do papel deste radical de nitrognio em plantas sob condies de estresse. Em animais, o NO sintetizado a partir da L-arginina atravs de uma oxidao complexa catalisada pela NOS (EC 1.14.13.39) (Ignarro, 1996). A enzima NOS catalisa a oxidao da L-arginina a L-citrullina com formacao de NO, num processo dependente de oxignio e NADPH. Esta reao requer no mnimo outros cinco cofatores, incluindo flavina adenina dinucleotideo (FAD), flavina mononucleotideo (FMN), tetrahidrobiopterina (H4B), heme, clcio e calmodulina. Em clulas de mamfero, vrias isoenzimas da NOS foram isoladas, purificadas, clonadas, e seqenciadas (Tzeng e Billar, 1996). De maneira geral, tais isoenzimas so formadas por protenas altamente conservadas (Stuehr, 1997; Lin et al., 1996; Marletta, 1999;). Vale destacar que existem diferentes reaes possveis para produo de NO in vivo independente da NOS. Estas reaes incluem: a reduo do NO2- a NO sob condies cidas; oxidao da arginina por H2O2; a reduo do NO2- catalisada pela xantina oxidase (XO) em condies de anoxia (Zhang et al., 1998). A Reducao de NO2-, catalisada por nitrito redutase microbiana seria uma outra fonte de NO sendo que em vegetais a produo deste radical livre tambm pode ocorrer por vias independentes de ao enzimtica. NO pode ser produzido em cloroplastos atravs da converso fotoqumica de dixido de nitrognio (NO2), mediada por carotenides (Cooney et al., 1994). Ainda, a produo de NO a partir de NO2- foi observada em camadas de aleurona de cevada devido s condies de acidez do espao apoplstico (Bethke et al., 2004). Em plantas, foram descritas atividades do tipo NOS (Delledonne et al., 1998; Durner et al., 1998; Ribeiro et al., 1999; Modolo et al., 2002). Alem da atividade do tipo 4

NOS, largamente conhecido que plantas adubadas com NO3- podem gerar NO atravs da ao da enzima nitrato redutase [NAD(P)H-NR] como um subproduto da assimilao de nitrognio. Inicialmente este mecanismo parecia ser restrito a NR constitutiva (Dean e Harper, 1988; Klepper, 1990). Porm, evidncias que a NR induzida tambm pode produzir NO so descritas (Yamasaki et al., 1999; Magalhaes et al., 2000). Este captulo focaliza o conhecimento da NR concernente produo de NO em plantas sob condies de estresse.

2. QUMICA E BIOQUMICA DO XIDO NTRICO

A qumica do NO envolve a disposio de formas redox inter-relacionadas: ctions de nitrosnium (NO+), oxido ntrico (NO), e nion nitrosil (NO-). fundamental para o conhecimento da bioqumica do NO, compreender as propriedades e reatividades qumicas de NO+, NO, e NO-. Sem dvida os compostos nitrosos e nitrosil so amplamente estudados. Dentre estes compostos destaca-se S-nitrosoglutationa, um nitrosotiol produzido como forma de armazenamento de NO. Alem disso, a reao entre o grupamento sulfidrila (-SH) da glutationa com NO parece ser um recurso utilizado pela clula para aumentar a eficincia de transporte deste radical livre ao seu stio de ao (Gaston, 1999). Snitrosoglutationa comercial amplamente utilizada como uma molcula doadora de NO para o estudo do papel deste radical de nitrognio em plantas. Um exemplo de composto nitrosil tambm amplamente utilizado como doador de NO em modelo de planta o nitroprussiato de sdio (SNP). Ao contrrio da S-nitrosoglutationa, o SNP um composto inorgnico que apresenta um tomo de ferro ligado a cinco grupos CN- e um grupo NO. Apesar disso, sabe-se que o NO pode interconverter nas diferentes formas redox, j citadas e que apresentam caractersticas qumicas distintas. 5

A forma neutra NO tem um nico eltron em seu orbital 2P- . A neutralidade de carga do NO facilita sua livre difuso em meio aquoso e atravs da membrana celular. A reao do NO com O2 em fase gasosa ou soluo aquosa um processo complexo que acontece na seguinte ordem [NO] [K (NO)2(O2)]. Assume-se que a meia-vida biolgica do NO, esteja na ordem de grandeza de segundos, dependendo criticamente da sua concentrao inicial (Stanler a al., 1992).

3. PRODUO DE XIDO NTRICO EM ALGAS, FUNGOS E BACTRIAS O NO formado via nitrato redutase (NR), no somente em plantas superiores (Magalhaes et al., 2000), mas tambm em algas (Mallick et al., 1999; Sakihama et al., 2002), em fungos (Takaya, 2002) e em bactrias, (Baumgrtner et al., 1991; Zhang et al., 1998). A produo do NO foi observada em algas como Chlamydomonas reinhardtii (Sakihama et al. 2002), Scenedesmu, Anabaena doliolum, e Synechoccocus (Mallick et al., 1999). Experimentos com inibidores de fotossntese (DCMU), de sntese de ATP (2,4DNP) e o arsenato, revelaram que a inibio da assimilao do NO2- no plastdio est conectada com a emisso de NO. Desta forma destaca-se a uma relao linear entre concentrao de NO2- no meio de cultura e a produo de NO. Ausncia de crescimento de Scenedesmus, quando se substitui no meio de crescimento o metal molibdnio (Mo) por tungstnio (W), com conseqente reduo na sntese de NO/NO2- em picos de luz ou no escuro indicam que a NR funcional (que contem um centro metlico de Mo) necessria para a produo de NO2- e NO num meio de crescimento suplementado com NO3- como fonte de nitrognio. Alm disso, o

papel da NR na emisso de NO destaca-se pelo aparecimento de pico de NO imediatamente aps a suplementao de NO2- no escuro em meios de culturas no qual utiliza-se W (Mallick et al. 1999). A produo de NO foi tambm estudada em algas verdes unicelulares Chlamydomonas reinhardtii utilizando tcnicas amperomtricas e um eletrodo especfico para NO. A L-arginine, o substrato para NOS sintase, no induziu a produo de NO, e o inibidor de NOS N-nitro-L-arginina no teve efeito na produo de NO dependente de NO2. Uma Chlamydomonas mutante deficiente de atividade da NR no mostrou quaisquer das respostas observadas nas clulas selvagens. Estes resultados obtidos in vivo diretamente confirmam as evidncias que a NR est envolvida na produo de NO a partir de NO2- em algas verdes (Sakihama et al., 2002). No fungo Fusarium oxysporum a via de desnitrificao do NO3- catalisada pelas reaes seqenciais da NR e da nitrito redutase (NiR). Essas enzimas esto acopladas com a gerao de ATP pela cadeia respiratria e produo de NO. A xido ntrico redutase do fungo utiliza NADH como doador direto de eltron em contraste aos sistemas bacterianos, e assim pode funcionar na regenerao de NAD+ e detoxificao do radical txico, NO. Outras vias podem reduzir NO3- a amnio (NH4+), acoplando reaes acetognicas com fosforilao em nvel de substrato. Este mecanismo tambm caracterstico de uma variedade de fungos e a via metablica chamada de fermentao de amnia (Takaya, 2002). Em bactrias, durante a oxidao de NH4+ a NO3-, quantidades significativas de NO so produzidas e o NO2- acumulado. Por outro lado, a nitrificaro e a liberao de NO so detectadas somente em pH neutro. A aplicao de nitrapirina inibe tanto a oxidao de NH4+ como a produo de NO. A produo de NO pode tambm ser detectada em amostras 7

de rochas que contm Nitrosomonas ou Nitrosovibrio, mas no em amostras contendo somente a Nitrobacter. A maior parte da produo de NO pela corroso das rochas atribuda bactria nitrificadora que oxida amnia (Baumgrtner et al., 1991). Sob condies de hipoxia o NO pode tambm ser formado por outros mecanismos independentes de NOS e NR. A reduo do NO2- a NO pela xantina oxidase (XO) foi estudada sob hipoxia, uma vez que nitrato/nitrito reductases bacteriana tem semelhana estrutural a XO. A xantina oxidase presente no tecido catalisa a reduo do NO2- a NO. Esta reao redox tambm requer NADH como doador de eltron, e independente de oxignio (Zhang et al., 1998).

4. PRODUO DE XIDO NTRICO VIA NITRATO REDUTASE EM PLANTAS A produo de NO pelas clulas vegetais tem sido estudada basicamente com os mesmos mtodos utilizados na pesquisa animal, descritos por Kojima et al. (1998). Recentemente mostramos que a produo de NO em clulas vegetais pode ser visualizada usando uma sonda especfica, diaminofluoresceina diacetato (DAF-2DA), e que o NO induz apoptose em plantas (Magalhaes et al., 1999; 2000; 2005). A produo de NO in vitro por solues enzimticas foi quantificada utilizando mtodos amperomtricos (Yamasaki, 2000) e a emisso de NO na atmosfera a partir de plantas ou rgos vegetais, foi medida pela deteco de quimioluminescncia (Rockel et al., 2002). A emisso de NO em vrias espcies vegetais foi observada em tanque-reator, e a ligao entre a emisso de NO e absoro de CO2 (3x10-6 mol de NO emitido por mol de CO2 absorvido) permitiram

estimar o potencial das plantas para evoluo de NO em uma escala global de 0.23 Tg ano1 de N (Wildt et al., 1997). Estudos anteriores indicam que as clulas vegetais possuem uma via de produo de NO dependente de NO2-, distinta das reaes mediada pela NOS. A nitrato redutase (NR, EC 1.6.6.1-3), uma enzima bifuncional, pode reduzir NO3- a NO2- [NO3- + NAD(P)H + H+ NO2- + NAD(P)+ + H2O] ou NO2- a NO [2 NO2- + NAD(P)H + H+ + 2 NO + NAD(P)+ 2 OH-], porem este ltimo processo em uma menor taxa de converso. A produo de NO pelas plantas foi inicialmente observada por Klepper (1975) em soja tratada com herbicidas inibidores de fotossnteses e outros compostos qumicos, como tambm sob condies anaerbias no escuro (Klepper, 1990). Em seguida, a produo de NOx pelas plantas foi confirmada e a nitrato redutase constitutiva dependente de NAD(P)H era responsvel pela evoluo de NOx (Dean e Harper, 1988; Klepper 1990). Mais recentemente, medies eletroqumica, fluoromtrica e quimioluminescncia in vitro mostraram que o NO pode tambm ser produzido por NR purificada de milho ou por NR na presena de NO3- ou NO2- e NADH em pH 7 a partir de extratos brutos foliares dessalinizados (Yamasaki, 2000; Yamasaki e Sakihama, 2000; Rockel et al., 2002). A produo de NO pode ser inibida por azida sdica, um conhecido inibidor de NR (Yamasaki, 2000). Alm disso, uma NR ligada membrana plasmtica acoplada a NO2-: NO redutase em vesculas de membrana de razes de tabaco tambm mostraram produo de NO (Sthr et al., 2001). A utilizao de inibidores da NOS no contribuiu para a reduo da emisso de NO em folhas de Arabidopsis (Magalhaes et al., 2000; Rockel et al., 2002). Novas evidncias para a produo de NO dependente da NR foram obtidas atravs do uso de mutantes duplos nia (Tabaco ou Arabidopsis), que no possuem atividade NR. Essas plantas no produziram 9

NO, tanto por medies por cromatografia gasosa (49457 e 00000 nL.gfw-1.h-1 em planta selvagem e mutante nia1/nia2 respectivamente) (Magalhaes et al., 2005), quanto por quimioluminescncia (Rockel et al., 2002). Experimentos utilizando NO3- marcado com
15

N mostraram a produo de 15NOx evidenciando, de maneira inequvoca, que os xidos de

nitrognio foram formados a partir de NO3- (Dean e Harper, 1988).

5. ESTIMATIVA DA CAPACIDADE DA NITRATO REDUTASE PARA A FORMAO DE XIDO NTRICO Extratos de folhas contendo NR ou NR purificada, na presena de NAD(P)H, produziram NO a partir de NO3-. Substituindo-se o NO3- por NO2-, a produo de NO iniciou-se imediatamente (Yamasaki 2000; Rockel et al., 2002), indicando que o NO2- o real substrato, e que a produo de NO partir do NO3- requerer a formao e acmulo de NO2-. A produo de NO no foi observada na ausncia de NAD(P)H ou de NR, e foi completamente inibida por azida sdica que interrompe o fluxo de eltron para a atividade da NR (Yamasaki, 2000). O valor de KM da NR (purificada a partir de folha de milho) para o NO2- foi relativamente alto (100 M) para a formao de NO quando comparado concentrao de NO2- em folhas sob condies de luz (10 M). NO3- foi um inibidor competitivo (Ki=50 M) neste processo. A capacidade mxima, in vitro, da NR para formao de NO a partir do NO2- e NAD(P)H de aproximadamente 1% da capacidade de reduo do NO3- (at 0.2 mol g-1 pf-1 h-1 com NR de espinafre) e foi detectada por quimioluminescncia (Rockel et al., 2002). Taxas similares in vitro foram obtidas utilizando deteco amperomtrica (Yamasaki, 2000). 10

As taxas de emisso de NO por girassol (Helianthus annuus L.) ou por folhas de espinafre, medidas por quimioluminescncia, foram freqentemente muito baixas (Rockel et al., 2002). Em girassol, os valores observados foram de 0,05 mol g-1.pf-1.h-1 no escuro at 0,5 mol g-1.pf-1.h-1 na presena de luz As mais altas taxas de emisso de NO foram obtidas no escuro sob anoxia, 200 mol g-1pf-1h-1 (Rockel et al. 2002). Plantas de Arabidopsis intactas produziram at 20 mol de NO g-1 pf-1 h-1 na luz (Tabela 1). Avaliando o conjunto dessas medidas a taxa mxima de emisso de NO pela NR in vitro ou por plantas ou folhas representa apenas uma pequena percentagem da capacidade da NR. Essas baixas taxas contrastam nitidamente com resultados anteriores de Klepper (1990), que encontrou taxas de NO 100 vezes maior quase to alta quanto a taxa de produo, quase to alto quanto a taxa de reduo de NO3- (at 15 moles NO g-1pf-1h-1 sob condies anaerbicas no escuro). A razo para esta grande discrepncia no clara, mas nas medidas efetuadas por Klepper (1990) as taxas muito altas podem estar baseadas em uma insuficiente remoo de outros compostos gasosos emitidos pelas folhas os quais podem tambm dar um sinal quimioluminescente.

6. PAPEL DO OXIDO NTRICO NO DESENVOLVIMENTO VEGETAL E ESTRESSE AMBIENTAL Os fatores que induzem estresse, tais como ataque de patgenos, ferimentos, perturbaes mecnicas, anaerobiose, seca, alagamento, esfriamento, congelamento, estresse salino, metais pesados, oznio, correntes eltricas, certos herbicidas, levam ao estabelecimento do chamado estresse de etileno (Kacperska, 1997). O estresse de etileno est relacionado ao NO como molcula sinalizadora em plantas (Magalhaes et al., 2000). 11

Como anteriormente observado, a emisso de NO por plantas altamente varivel. Um exame mais detalhado mostra que emisso de NO varia grandemente com o estdio de desenvolvimento da planta, intensidade luminosa e diferente tipo de estresse. Uma tendncia inversa para NO e emisso de etileno foi observada na fase da florao at o inicio da senescncia (Magalhaes et al., 2000). Quando as plantas entram em senescncia, a emisso de NO diminui. A relao inversa entre a emisso de etileno e NO sugere a interao das duas vias de sntese, embora o mutante duplo nia1, nia2 defectivo para NR, que no emite NO, produza etileno de modo similar planta selvagem (Magalhaes et al., 2000). A seca e o alagamento reduzem drasticamente a emisso de NO (Magalhaes et al., 2000). No entanto, anoxia em curto prazo ativa NR, leva ao acumulo de NO2- e altas taxas de emisso NO pelas folhas e razes (Rockel et al., 2002). Assim, tanto em curto quanto em longo prazo a hipoxia e a anoxia podem ter diferentes efeitos na produo de NO pelas razes. Uma queda da atividade da NR tambm foi observada em condies de estresse provocado pela seca (Garg et al., 1998). A emisso de NO em funo da intensidade luminosa um processo complexo. A emisso cai a valores prximos de zero nas primeiras duas horas de exposio luz e ento aumenta drasticamente com o tempo e com aumento da intensidade luminosa, embora tenha sido observada emisso de NO no escuro (Tabela 1). Nas primeiras duas horas do dia, a intensidade luminosa na casa de vegetao baixa (115 ol.m-2.s-1 em mdia). Isto explica a queda at zero da emisso de NO e consistente com experimentos em uma cmara de crescimento com intensidade luminosa de 105 ol.m-2.s-1, onde NO no foi produzido.

12

Diversos experimentos mostraram significativa variao diurna na emisso de NO. Por esta razo, as medies de NO mais precisas quando feitas pelo menos h trs horas aps as plantas serem expostas a luz (Tabela 1). Isto produz resultados consistentes e comparveis. A Tabela 1 mostra que plantas transferidas do escuro para baixa luminosidade (105 mol.m-2.s-1) no emitem NO durante 12 horas. Quando transferidas de 555 para 105 mol.m-2.s-1, uma diminuio gradual foi observada nas primeiras 4 horas e ento diminuiu para prximo de zero por 12 horas. Quando as plantas foram transferidas de 555 mol.m2 -1

.s para o escuro, a emisso de NO diminuiu gradualmente, mas uma considervel emisso

de NO foi observada ao fim de 12 horas. Aps a transferncia da luz para o escuro, Salalkar et al. (1999) observaram que a atividade da NR nas folhas persistiu por algum tempo durante a fase de escuro e ento declinou gradualmente. Aps a re-exposio luz a atividade da NR aumentou rapidamente de uma maneira bastante similar emisso NO em nossos estudos, respaldando a observao do paralelismo entre as taxas de NO, atividade da NR e eventual concentrao de NO2-. tambm razovel atribuir a diminuio da emisso de NO ao declnio da atividade da NR com a idade da planta (Anburaj e Francis, 1996; Lee et al., 1998; Yu et al., 1998). A NR em alface mostrou pico de atividade 20 dias aps o plantio (Lee et al., 1998) em uma maneira similar emisso de NO observada por Magalhaes et al. (2000). A nitrato redutase uma enzima altamente regulada (Magalhaes et al., 2005). Tem uma meia vida curta de algumas horas e sua induo requer NO3- e luz (fotossntese). A atividade da enzima pode ser diminuda em minutos por fosforilao de um resduo de serina conservado na regio 1, e subseqente ligao de uma protena 14-3-3, o que inativa a enzima. A fosforilao um processo reversvel e depende da presena de ctions bivalentes. Uma vez desfosforilada, a enzima volta a sua atividade normal. A degradao 13

proteoltica da NR acelerada quando a enzima est ligada a protena 14-3-3 (Magalhaes et al., 2005). In vitro, a NR inativada por incubao com magnsio (Mg) e ATP, eventualmente na presena de inibidores da fosfatase PP2A, que impedem a desfosforilao. A pr-incubao com ATP tambm diminui a produo de NO dependente de NO2-enquanto que a reativao da NR por desfosforilao aumenta a produo de NO (Rockel et al., 2002). Como mencionado anteriormente, a luz e altos nveis de CO2 ativam a NR, o que tambm leva a altas taxas de emisso de NO. Isto tambm sugere que a modulao da NR in vivo acompanhada pela produo NO. Os tratamentos artificiais com conhecidos ativadores da NR no escuro (quando a enzima est freqentemente inativa) levam a alta emisso de NO (que tambm freqentemente baixa no escuro). Ao lado da anoxia, essas condies podem produzir desacopladores de anlogos de 5'-AMP (5-aminoimidazol-4carboxiamida-1--ribofuranosill 5'-monofosfato) entre outros. Quando a ativao da NR impedida pelo cido okadaico, um inibidor das fosfatases, a emisso de NO bloqueada (Rockel et al., 2002). Estes resultados indicam, que a modulao da NR in vivo tambm modula a emisso de NO. Em interaes planta-patgeno, uma das primeiras respostas aps inoculao do hospedeiro a formao de espcies reativas de oxignio (ROS). O nion superxido (O2-) pode reagir rapidamente com NO levando formao de peroxinitrito (ONOO-) que altamente txico, desencadeando prontamente a nitrao de aminocidos aromticos como a tirosina presente em muitas protenas. De forma interessante, a NR tambm capaz de catalisar em baixas taxas a reduo de oxignio molecular a superxido (Yamasaki, 2000). A produo simultnea de superxido e NO leva quase inevitavelmente formao de peroxonitrito. Mutantes de tabaco defectivas para nitrito redutase (NiR), mas com NR 14

normal acumulam NO2-, emitem altas quantidades de NO e tm um alto grau de nitrao da tirosina (Morot-Gaudry-Talarmain et al., 2002). Enquanto as consideraes anteriores esto focalizadas na formao de NO dependente de NR, no deve ser negligenciada a atuao da NOS como uma fonte de NO em plantas, H indicaes para a presena em plantas de uma atividade enzimtica suposta NOS (Delledonne et al., 1998; Durner et al., 1998; Ribeiro et al., 1999; Modolo et al., 2002). Embora, nem o gene e nem uma protena homloga NOS de mamferos foram isolados em plantas, recentemente, Guo et al. (2003) identificaram um gene de A. thaliana (AtNOS1) que codifica uma protena com atividade conversora de L-arginina em Lcitrulina com liberao de NO. AtNOS1 uma protena homloga quela responsvel pela sntese de NO em Helix pomatia (Huang et al., 1997).

7. NOVAS FRONTEIRAS DA NITRATO REDUTASE E A PRODUO DE XIDO NTRICO EM PLANTAS A enzima nitrato redutase (NR; Ec: 1.6.6.1) a mais estudada entres as possveis fontes de NO em planta (Magalhaes et al., 2005). A converso de NO2- a NO poderia ser atribuda atividade da NR, como tem sido sugerido na literatura (Yamasaki e Sakihama, 2000; Rockel et al., 2002; Vanin et al., 2004). A produo de NO partir da atividade da NR ocorre em tecidos onde a concentrao de NO2- alta (Morot-Gaudry-Talarmain et al., 2002; Rockel et al., 2002) e, em plantas transgnicas expressando a enzima NR permanentemente ativada apresentam uma emisso de NO consideravelmente aumentada (Lea et al., 2004).

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Evidncias espectroscpicas fornecem um estado intermedirio em que o nitrosil-Fe (II) siroheme formado durante o ciclo cataltico da enzima nitrito redutase (NiR), purificada a partir de cloroplastos de espinafre (Kuznetsova et al., 2004). Contudo, plantas de tabaco contendo uma seqncia anti-senso para NiR (Morot-Gaudry-Talarmain et al., 2004), bem como alga verde Chlorella sorokiniana (Tischner et al., 2004) acumulam NO2e, emitem uma quantidade elevada de NO. Em adio a NiR como uma possvel fonte de NO, uma enzima ligada membrana plasmtica tambm proposta com atividade conversora de NO2- (Sthr et al., 2001). Em todos os sistemas vegetais estudados por Planchet et al. (2005), a emisso de NO foi exclusivamente devido reduo do NO2- a NO. A concentrao do NO2- foi um fator limitante e o transporte mitocondrial de eltron foi identificado como a fonte principal para a reduo do NO2- a NO. O NO est envolvido no controle de vrios aspectos de resistncia da planta ao patgeno, crescimento, e desenvolvimento (Delledonne et al., 1998, Garcya-Mata e Lamattina, 2003). Uma enzima tipo NOS parece contribuir para a produo de NO durante a interao planta-patgeno, convertendo L-arginina em L-citrulina (Delledonne et al., 1998; Modolo et al., 2002; Zeidler et al., 2004). A produo de NO via atividade da enzima tipo NOS foi relacionada com a sinalizao de movimento de estmatos (Garcia-Mata e Lamattina, 2003). No entanto, a NR tem sido considerada tambm como a fonte do NO, em ambos sistemas, na relao planta-patgeno (Yamamoto et al., 2003) e no controle dos estmatos (Desikan et al., 2004). Planchet et al. (2005) mostraram que as plantas ou suspenses de clulas sem NR supridas com NO3- por curtos perodos de tempo nunca emitiam NO. Entretanto, quando supridas com NO2-, as suspenses de clulas sem NR crescidas com amnio virtualmente 16

emitiam NO sob condies de anoxia quase nas mesmas taxas que as clulas com NR. Assim, a NR imprescindvel para produo de NO, porque a fonte do NO2-. Como a alta produo de NO foi encontrada em folhas de mutante deficiente em nitrito redutase (NiR), parece muito improvvel que a prpria NiR seja uma enzima fonte para a produo de NO. Estudos baseados em inibidores e suspenso de clulas mostram que a mitocndria contribui para produo do NO a partir do NO2-, pelo menos nos casos onde a enzima NR estava ausente. Confirmando isto, foi demonstrado que a mitocndria das plantas, assim como a de algas, reduzem o NO2- a NO sob anoxia (Planchet et al., 2005). A ao combinada dos inibidores mixotiazol e cido salicilhidroxmico (SHAM, inibidor da oxidase alternativa) no causou inibio completa da produo de NO. Contudo, produo de NO foi bloqueada na presena de KCN (inibidor da NR e outras enzimas heme). Assim, quando no h nenhuma dvida que todo o NO foi produzido enzimaticamente, algumas reaes sensveis a cianeto ainda indefinidas parecem contribuir de certa forma para formao de NO (Planchet et al., 2005). A oxidorreductase de NO2-, detectada por Sthr et al. (2001), pode ser uma candidata possvel. Em quase todos os sistemas estudados pelo grupo de Werner M. Kaiser, a produo de NO foi fortemente inibida pelo oxignio do ar. Assumiu-se originalmente que o NADH do citosol poderia se tornar um fator limitante na presena do ar, pelo menos sob condies em que o NO2- era elevado (em suspenses de clulas supridas com NO2-). Embora, as determinaes de piruvato/lactato sugerirem apenas um ligeiro aumento de NADH/NAD+ na luz em comparao com escuro. Alm disso, mitocndrias purificadas a partir de suspenses de clulas no apresentaram quase nenhuma emisso de NO na presena de ar, mesmo quando NO2- e NADH foram adicionados ao meio. A baixa produo aerbica de 17

NO no poderia ser rastreada pela limitao substrato, e presentemente no temos nenhuma explicao satisfatria para essa observao. Encontrou-se que 0.05% oxignio era o suficiente para uma inibio de 50% da emisso de NO das mitocndrias purificadas de razes. Em contraste mitocndria, a emisso de NO a partir da atividade da NR purificada foi bastante insensvel ao ar (Planchet et al., 2005). Hemoglobina pode catalisar a oxidao de NO, dependente de NADH, de volta a nitrito e nitrato (Igamberdiev e Hill, 2004). Tal reao conduziria a uma produo de NO subestimada na presena do ar, mas no em presena de nitrognio. A que extenso esta reao contribui no sentido de retirar NO do meio ainda desconhecido. Considerando a hiptese da produo mitocondrial de NO em clulas supridas com NO2-, estudos com os inibidores SHAM e mixotiazol causaram inibio quase completa da emisso de NO de clulas sem NR, sob anoxia, uma inibio de 57% em clulas crescidas com NO3- e baixa emisso de NO em mitocndria purificada. Quando o NO2- foi suprido no escuro sob o anoxia, a folha do mutante nia deficiente para NR emitiu muito pouco NO (abaixo de 0.3 mol g-1 FW h-1), embora em folhas do material selvagem com NR houve emisso de NO 100 vezes maior (50 mol g-1 FW h-1) (Planchet et al., 2005). Sob condies de anoxia, o NO2- acumulado em todos os tecidos (ou liberado ao meio) que contem NR e NO3-. Este acmulo de NO2- sob anoxia tem duas razes: uma a bem conhecida ativao da NR, provocada provavelmente pela acidificao celular; a segunda a queda na taxa de reduo do NO2- do plastdio (Planchet et al. 2005). Com a utilizao de suspenso de clulas NR-deficientes nia supridas com NO2-, observou-se que a reduo deste anion sob anoxia foi aproximadamente 25% daquela na presena do ar. Os plastdios no-verdes ou cloroplastos no escuro produzem NAD(P)H atravs do ciclo da

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pentose fosfato oxidativa (OPP). Sob o anoxia, os nveis de ATP e do acar fosfatado so muito baixos, eventualmente insuficientes para abastecer o ciclo da OPP. Vale especular se a reduo do NO2- a NO sob anoxia, onde se acumula NO2-, pode representar uma respirao do nitrito. Entretanto, as taxas medidas da produo de NO em condies de anoxia so muito baixas, demasiadamente distantes para serem consideradas relevantes para a produo de energia (Planchet et al. 2005). 8. CONSIDERAES FINAIS No passado, o grande foco dado aos estudos da nitrato redutase se dava ao papel desta enzima no metabolismo de nitrognio, enquanto que sua habilidade para produzir NO no era considerada. Embora o NO tenha se mostrado um importante mediador em vrios processos fisiolgicos ou relacionados com estresse, pouco se conhece a respeito de sua origem nestes sistemas. Compreender a relevncia da contribuio de todas as possveis fontes de NO em plantas, bem com a localizao subcelular de sua produo, torna-se essencial para um melhor entendimento de quais enzimas estariam relacionadas a um processo fisiolgico e/ou de estresse. Como o NO pode ser originado a partir de diferentes vias, cada uma delas poderia ser regulada independentemente bem como interaes entre elas poderiam ocorrer. Um exemplo dessa interao seria a produo de NO a partir de NO2- com relevante contribuio de ambas, NR e mitocndria conforme discutido neste capitulo. Alem disso, vale ressaltar que o NO formado via atividade NR poderia refletir na sinalizao em resposta a nutrio, intensidade luminosa e fotossnteses. Os efeitos fisiolgicos do NO sugerem um potencial papel-chave para este radical livre como uma molcula sinalizadora

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em situaes adaptativas e a emisso de NO tambm pode ser utilizada como indicador para fatores que provocam estresse em plantas.

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Legendas Table 1. Emisso de NO em Arabidopsis, em funo da intensidade e tempo da exposio de luz. Plantas de quatro semanas de idade foram submetidas aos diferentes regimes de luz, transferindo as plantas de 555 para 105 moles.m-2.s-1; de 555 moles.m2 -1

.s para escuro; do escuro para 105 moles.m-2.s-1 (em cmara do crescimento) e a

transferncia do escuro para casa de vegetao 555 moles.m-2.s-1 ou completa luz do sol 1500 moles.m-2.s-1. NO foi medido no tempo zero, 2; 4; 6; 8 e 12 h com quatro repeties. Os resultados so apresentados nL.gfw-1. h-1 erro padro da media.

Tabela 1 Regime de Luz 555 para 105 mol.m-2.s-1 555 mol.m-2.s-1 - Escuro Escuro - 105 mol.m-2.s-1 Escuro - 555 mol.m-2.s-1 0h 50362 50362 26424 26424 2h 18724 49247 0000 0000 4h 17223 47742 0000 27827 8h 8912 42541 0000 66757 12 h 1.790.20 23224 0000 54362

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NITROGNIO
Sonia R. Souza1 e Manlio S. Fernandes2 1 Departamento de Qumica, UFRRJ 2 Departamento de Solos, UFRRJ

SUMRIO 1 2 O NITROGNIO NA NATUREZA............................................................................................2 ABSORO DE NITROGNIO PELAS PLANTAS................................................................3 2.1 2.1.1 2.2 2.2.1 2.3 3 3.1 3.2 4 5 A absoro de Amnio (NH4+) ............................................................................................6 Transportadores de Amnio.........................................................................................8 Absoro de Nitrato (NO3-)................................................................................................10 Transportadores de Nitrato.........................................................................................13 Absoro de nitrognio orgnico por plantas ....................................................................14 Nitrato Redutase (NR) .......................................................................................................16 Nitrito Redutase (NiR) .......................................................................................................18

REDUO DO NITRATO .......................................................................................................15

ACMULO E REMOBILIZAO DO NITRATO.................................................................18 ASSIMILAO DO AMNIO ................................................................................................22 5.1 5.2 5.3 Glutamina Sintetase (GS)...................................................................................................24 Glutamato Sintase (GOGAT).............................................................................................25 Glutamato Desidrogenase (GDH)......................................................................................26

6 7 8

VISO GERAL DO METABOLISMO DE NITROGNIO ....................................................29 TOXIDEZ DE NH4+ EM PLANTAS ........................................................................................30 REMOBILIZAO DE NITROGNIO...................................................................................34 8.1 8.2 Senescncia ........................................................................................................................34 Enchimento dos Gros .......................................................................................................37

Referncias.................................................................................................................................39

O NITROGNIO NA NATUREZA

O nitrognio (N) um dos elementos minerais requeridos em maiores quantidades pelas plantas e o que mais limita o crescimento. Ele faz parte de protenas, cidos nuclicos e muitos outros importantes constituintes celulares, incluindo membranas e diversos hormnios vegetais. Sua deficincia resulta em clorose gradual das folhas mais velhas e reduo do crescimento da planta, sendo que inicialmente, em detrimento das reservas da parte area a planta promove um alongamento do sistema radicular, como uma tentativa de buscar o nutriente (Figura 1).

Figura 1. Folhas e razes de plantas de arroz cultivadas em soluo nutritiva com 0,1 e 0,5 mM de N-NO3- ou sem nitrognio.

O nitrognio molecular (N2) representa 78% dos gases de nossa atmosfera, entretanto, a despeito dessa abundncia h uma escassez desse nutriente em formas disponveis para as plantas, o que pode ser explicada pela extraordinria estabilidade do N2 que, ao contrrio de outras molculas 2

diatmicas, como O2, NO ou CO, praticamente no passvel de reaes qumicas em condies naturais. A ligao dos tomos da molcula de N2 curta (1,098), o potencial de ionizao de 15,6 eV, e a energia de dissociao de 224,5 kcal. Os eltrons do nitrognio molecular esto em orbitais de baixa energia, e o mais elevado orbital molecular efetivamente preenchido um orbital , no centro da molcula. Nestas condies, a reatividade qumica da molcula extremamente baixa. Chatt e Leigh (1968) observaram: No existe nenhum agente oxidante que seja suficientemente forte para oxidar nitrognio em condies ambientais, nem mesmo fluoreto. Nenhum agente redutor que seja suficientemente forte para reduzir o nitrognio molecular pode existir em meio aquoso, porque a gua seria preferencialmente reduzida, produzindo hidrognio. Existe um aporte de nitrognio aos solos atravs do arraste, pela chuva, dos xidos de nitrognio produzidos na atmosfera por descargas eltricas. Entretanto, a maior parte do nitrognio disponvel nos solos para a nutrio de plantas obtida atravs de fixao biolgica, um processo complexo que envolve a enzima nitrogenase presente em bactrias. A decomposio dessas plantas fixadoras contribui para a disponibilidade de nitrognio mineral para as outras culturas. Embora a simbiose bactria-leguminosa seja o principal sistema responsvel pela fixao de N2, observou-se que a fixao biolgica de nitrognio tambm pode ocorrer na rizosfera de gramneas. A fixao de N2, tanto simbitica quanto associativa abordada no captulo 6 neste volume. Os estudos do nitrognio em plantas indicam uma tendncia para o mximo de economia, atravs de complexo sistema de absoro, assimilao e remobilizao desse nutriente nos tecidos vegetais, de modo a evitar desperdcios. O desenvolvimento desses mecanismos, atravs de processos de seleo, indica uma progressiva adaptao das plantas a condies ambientais caracteristicamente deficientes em nitrognio.

ABSORO DE NITROGNIO PELAS PLANTAS O nitrognio est disponvel no solo em diversas formas, incluindo amnio, nitrato,

aminocidos, peptdeos e formas complexas insolveis. As espcies vegetais diferem na sua preferncia por fontes de N, mas o absorvem principalmente sob formas inorgnicas como nitrato (NO3-) ou amnio (NH4+) (Williams & Miller, 2001). O nitrato absorvido pode ser reduzido a amnio, atravs da ao seqencial das enzimas Nitrato redutase e Nitrito redutase. O NO3- tambm pode ser acumulado no vacolo ou exportado para outras partes da planta. O transporte para as folhas ocorre via xilema, embora a redistribuio a partir das folhas para outros rgos ocorra predominantemente na forma de aminocidos, via 3

floema. Essa redistribuio essencial para suprir os tecidos que no participam na assimilao de N. O amnio absorvido ou o proveniente da reduo do nitrato imediatamente incorporado em esqueletos de carbono preferencialmente atravs das enzimas da via Glutamina sintetaseGlutamato sintase (GS-GOGAT). Tanto a reduo do NO3- quanto a assimilao do NH4+ requerem energia na forma de ATP e poder redutor como o NADH, o NADPH e a Ferredoxina reduzida, bem como esqueletos de carbono derivados do ciclo de Krebs, como o -cetoglutarato. Esses processos drenam tanto esqueletos de carbono quanto energia e doadores de eltrons, competindo com o metabolismo do carbono. Quando ocorre a assimilao do N nas razes, aminocidos so transportados para as folhas via fluxo transpiratrio, pelo xilema (Marschner et al., 1995). O N tambm pode ser transportado atravs da membrana plasmtica de certas clulas, em outras formas tais como peptdeos menores e as bases purinas e pirimidinas e seus derivados (Gillissen et al., 2000). Na natureza, as concentraes de amnio e de nitrato podem variar grandemente em funo de inmeros fatores inerentes a caractersticas fsicas, qumicas e biolgicas do solo. As plantas desenvolveram ao longo de sua histria evolutiva, em suas membranas celulares protenas transportadoras que permitem a aquisio desses nutrientes a partir de concentraes bastante variveis. As plantas absorvem o NO3- e o NH4+ em processos dependentes de energia. H uma bomba de prtons na plasmalema, P-H+ATPase, que hidrolisa ATP, bombeando H+ para fora da clula, o que cria um gradiente de potencial eletroqumico, que composto do potencial eltrico atravs da membrana () e da diferena de potencial qumico para o ion NH4+ ou NO3- (NH4+ ou NO3-) entre o interior e o exterior da clula (ver captulo 5 neste volume). O gradiente de prtons gera uma fora prton motriz, direcionando os H+ do exterior da clula para o citossol. O gradiente de potencial eletroqumico contribui favoravelmente para a entrada de ctions na clula, enquanto que os nions so absorvidos acompanhando o fluxo de prtons. Deste modo, a absoro do NH4+ passiva, e acontece atravs de um transportador do tipo uniporte, enquanto a absoro do NO3- um processo ativo secundrio, em simporte com 2 H+ (Figura 2).

Figura 2. Absoro de nitrato (NO3-) e amnio (NH4+) atravs da membrana plasmtica. (1) Bomba de prtons (P-H+ATPase); (2) Transportador de NO3- (simporte) =; (3) Transportador de NH4+ (uniporte). (potencial eltrico atravs da membrana); NH4+ ou NO3(respectivamente, diferena de potencial qumico para o ion NH4+ ou NO3-, entre o interior e o exterior da clula)

As protenas transportadoras de NO3- ou NH4+ podem ter maior ou menor afinidade pelo on transportado, deste modo, eles formam nas plantas os sistemas de absoro que so denominados de: sistema de transporte de alta afinidade (HATS High affinity transport system) ou sistema de transporte de baixa afinidade (LATS Low affinity transport system). A concentrao de 1mM de NH4+ ou NO3- pode, de modo geral, ser tomado como um limite de concentrao abaixo do qual opera o sistema de alta afinidade (HATS), e acima do qual opera o sistema de baixa afinidade (LATS):

Os transportadores de NO3- do sistema de alta afinidade so passveis de induo (iHATS), embora exista tambm um sistema de alta afinidade constitutivo (cHATS). Os sistemas de transporte de NO3- de baixa afinidade (LATS) so todos constitutivos. Os sistemas de transporte de NH4+ tambm so de alta afinidade (passveis de induo) e de baixa afinidade (constitutivos). A induo dos genes que codificam para as protenas transportadoras de NO3- do sistema iHATS, estimulada pela presena de NO3- no meio, enquanto que os sistemas transportadores de NH4+ so induzidos pela ausncia de NH4+ no meio externo. As protenas transportadoras de NH4+ so codificadas por uma famlia multignica, e apresentam ampla variao de padres de cintica de absoro, este fato demonstra a plasticidade das plantas, para a aquisio de formas reduzidas de N, que devem ter sido abundantes durante certo perodo na evoluo das plantas superiores. Por outro lado, a existncia de transportadores constitutivos na faixa do LATS e passveis de induo na faixa do HATS, pode sugerir uma gradual, porm contnua, adaptao a condies ambientais caracterizadas pela passagem da predominncia de formas reduzidas para formas oxidadas de N e uma progressiva reduo na disponibilidade de N mineral em ambientes de terra firme. Dentro dessa linha de raciocnio, de se esperar que plantas adaptadas a ambientes de baixa disponibilidade natural de nutrientes, especialmente N, acionem com maior facilidade sistemas de transporte de alta afinidade.

2.1

A absoro de Amnio (NH4+) Evidncias indicam que o on amnio (NH4+) a forma absorvida pelas plantas e no o gs

amnia (Ludewig , 2002). A amnia (NH3) uma base fraca (pK = 9,25), deste modo, como o citossol tem em mdia pH 7,2, aproximadamente todo o N-amoniacal neste compartimento est na forma protonada de NH4+ . A absoro de NH4+ feita por um sistema bifsico. Quando os nveis de NH4+ no meio externo (soluo nutritiva ou soluo do solo) so baixos opera um sistema de absoro de alta afinidade (HATS), mediado por uma protena transportadora do tipo uniporte e que mostra cintica de saturao. Enquanto que, em nveis elevados de NH4+ no meio externo entra em funcionamento 6

o sistema de baixa afinidade (LATS), sendo a concentrao de 1mM de NH4+ o limite abaixo do qual opera o sistema de alta afinidade (HATS), e acima do qual opera o sistema de baixa afinidade (LATS). HATS e LATS so protenas integrais da membrana, com 12 hlices que atravessam a membrana, separadas por uma regio hidroflica em dois domnios de seis hlices. Na faixa de absoro do sistema de alta afinidade (HATS) os valores da velocidade mxima (Vmx) diminuem, enquanto que os valores da constante de Michaelis-Menten (KM) aumentam, acompanhando o aumento dos teores de N-NH4+ na soluo externa, o que levou Wang et al. (1993) a concluir que estes parmetros cinticos resultam da combinao dos dois mecanismos de absoro (sistema de alta afinidade + baixa afinidade). Em milho, milheto e cevada o sistema de alta afinidade mostrou cintica de saturao em plantas que foram cultivadas sob concentraes externas de NH4+ entre 0,1 a 1,0 mM. Em arroz, foram observadas velocidade de absoro de NH4+ (Vmx) em torno de 5,2 e 5,4 moles/g. peso fresco/hora (Kronzucker, 1998). Baptista et al. (2000) observaram em duas variedades de arroz valores de Km de 0.51 e 0.58 mM, quando se utilizou 20 mg N-NH4+ /L na soluo nutritiva. Quando as plantas foram submetidas 80 mg N-NH4+/L, o Km aumentou para 3.5 e 4.5 mM respectivamente. Wang et al. (1993) estimaram o influxo lquido de NH4+ em arroz (influxo - efluxo) em 1,32; 6,08 e 10,16 moles/g. peso fresco/hora, quando sob concentraes externas de NH4+ de 2, 100 e 1000 M respectivamente. Em tomate, Ludewig (2002) observou que o Km do transportador HATS para amnio variou em funo do potencial de membrana, sendo muito menor -140 mV do que a -40 mV (4 vezes). semelhana do que ocorre com a absoro de outros ctions como o K+, vrios fatores afetam a absoro de NH4+. Teremos ento um sistema de transporte que positivamente influenciado pela ao da luz (ocorre uma duplicao no total absorvido, em relao a plantas no escuro), e negativamente influenciado por inibidores metablicos e hipoxia. Alm disso, preciso levar em considerao que a absoro de NH4+ passvel de inibio por feedback. Com o aumento dos teores de NH4+ na soluo externa (0,002 a 1mM) aumenta o efluxo de NH4+ das razes de modo que o influxo lquido pode cair de 89% para as plantas sob 0,002 mM NH4+, para 80% em plantas sob 1mM NH4+. Um processo de efluxo contnuo de NH4+ sugerido como uma caracterstica do processo de absoro de N-NH4+ por plantas. O NH4+ absorvido por razes de arroz pode tambm ser compartimentalizado, acumulando no vacolo. Wang et al. (1993) observaram que em 30 minutos, cerca de 20% do NH4+ absorvido 7

acumulou no vacolo, enquanto que 41% do total permaneceram no citoplasma, 19% foi assimilado, e 20% saram das razes para o meio externo por efluxo.

2.1.1

Transportadores de Amnio Estudos moleculares identificaram uma famlia de genes que codificam para os

transportadores de amnio (AMT, ammonium transporter), e que operam na membrana plasmtica das plantas (Figura 3). Este grande nmero de transportadores de uma mesma famlia permite ao organismo adequar-se s mltiplas condies de concentrao de NH4+ no meio externo, e aumenta a eficincia da planta como um todo. O sistema AMT de transporte de NH4+ em plantas especfico. Por exemplo, os ons K+, Rb+ e Cs+ no interferem com a absoro do NH4+. O sistema AMT do tipo uniporte, e o transporte de NH4+ passivo (a favor do gradiente de potencial eletroqumico gerado pelas P-H+ATPases da membrana) (Figura 2). Os membros da famlia de transportadores AMT1 so responsveis pelo transporte de alta afinidade em plantas (HATS) e os AMT2 pelo transporte de baixa afinidade (Figura 3).

Figura 3. Famlias de tranportadores de NH4+ (AMT, ammonium transporter), de alta (AMT1) e baixa afinidade (AMT1)

Em Arabidopsis, um dos transportadores codificados por essa famlia de multigenes, o AtAMT1;1 parece ser responsvel pela absoro de NH4+ quando o N est em baixas concentraes no meio externo. Foi observado em Arabidopsis que a deficincia de NH4+ no meio, resulta em rpido incremento da transcrio do gene AtAMT1. Essa transcrio diminui rapidamente com o aumento de NH4+ no meio. A queda nos nveis do RNA mensageiro do gene que codifica para o transportador AtAMT1 parece ser causada principalmente pelo acmulo de glutamina nos tecidos. O nmero de transportadores da famlia AMT em arroz muito maior do que em Arabidopsis e em tomate, o que indica que cada planta forma o seu sistema de transporte de acordo com as presses seletivas a que foi submetida (Loqu e von Wrem, 2004). O sistema de transporte de NH4+ de alta afinidade (HATS) mostra cintica de saturao, com KM tipicamente abaixo de 100M. Como mencionado anteriormente a atividade desses transportadores depende do gradiente de potencial eletroqumico gerado atravs da membrana plasmtica. Quando plantas so submetidas deficincia de NH4+, o AtAMT1;1 o transportador que mais aumenta de atividade, enquanto que AtAMT1;2 e AtAMT1;3 mantm-se constantes, o que mostra que sob deficincia, o transportador de maior afinidade que transcrito. O sistema de transporte de baixa afinidade (LATS) aparentemente no saturvel, e no indica ser passvel de regulao por produtos do metabolismo de N. O gene do primeiro transportador de NH4+ a ser isolado foi o AtAMT1;1, em Arabidopsis thaliana. Depois foram isolados em Arabidopsis os genes de outros membros da famlia AMT1: o AtAMT1;2, AtAMT1;3, AtAMT1;4 e AtAMT1;5. Um outro gene, o AtAMT2;1 tambm j foi identificado. Genes homlogos ao AMT foram localizados em arroz: OsAMT1;1 e em tomate LeAMT1;1/ LeAMT1;2/ e LeAMT1;3. Ludewig (2002) demonstrou que o gene LeAMT1;1 de tomate codifica para uma protena transportadora do tipo uniporte (AMT1;1). A existncia desses diversos sistemas de transporte de NH4+, controlados por vrios genes so uma indicao da importncia na nutrio amoniacal para as plantas. Embora os genes AMT1 sejam normalmente expressos nas razes das plantas, os genes que codificam para os transportadores AMT1;1 e AMT1;2 tambm so expressos na parte area, o que mostra a importncia desses transportadores no processo de reassimilao do NH4+ produzido na parte area das plantas, principalmente como conseqncia da fotorespirao. O influxo de NH4+ em plantas mostra uma variao circadiana. O mximo de absoro ocorre ao fim do perodo luminoso, e uma queda acentuada no ritmo de absoro ocorre aps o incio do perodo escuro (von Wirn et al., 2000). 9

2.2

Absoro de Nitrato (NO3-) A absoro de NO3- ativa ou seja, contra um gradiente de potencial eletroqumico, e uma

ampla variao de Km aparente foi observada para espcies vegetais distintas, indicando diferenas de presso seletiva nos diversos ambientes em que essas espcies vivem. Epstein (1972) cita a alga marinha Skeletonemas notatum, cujo Km aparente para NO3- de 0,4M, enquanto que em arroz (O. sativa), uma planta de terra firme, o Km aparente de 0,6mM. Experincias feitas com diferentes concentraes externas de NO3- demonstraram que a absoro de NO3- mediada por dois sistemas de transporte atravs da membrana plasmtica, ambos co-transportadores (Glass et al., 1992; Siddiqi et al.,1990). Ou seja a absoro de NO3- bifsica. O primeiro seria um sistema de transporte de NO3- de baixa afinidade (LATS), que se torna funcional sob condies de elevadas concentraes externas de NO3- (> 1mM). O outro um sistema de absoro de alta afinidade (HATS), que funcional em concentraes menores que 1 mM. Esses sistemas so aditivos. O sistema de baixa afinidade (que opera a elevadas concentraes de NO3-), constitutivo (cLATS), enquanto que o sistema de alta afinidade (que opera a baixas concentraes de NO3-) passvel de induo pelo substrato NO3- (iHATS). Em baixas concentraes externas o sistema de absoro de alta afinidade saturvel. Em cevada, este sistema de alta afinidade mostra Km aparente na faixa de 10 a 100 M. Em milho, foi observado um Km aparente de 50 M para o sistema de alta afinidade. Estudos feitos em cevada por Siddiqi et al. (1990), mostraram que na faixa de concentrao externa que vai de 5M a 0,5 mM o transporte de NO3- obedece cintica de Michaelis-Menten, mostrando saturao com o aumento na concentrao externa de NO3-. No sistema de baixa afinidade ([NO3-] >1mM) a velocidade de absoro de NO3- aumenta linearmente com o aumento da concentrao externa. A soma dos dois sistemas mostra claramente a existncia de um sistema bifsico para a absoro de NO3-. Embora o sistema LATS no mostre cintica de saturao, muito pouco provvel que se trate de um sistema passivo de transporte. Clculos feitos por Crawford (1995) mostram que, com um potencial de membrana de 110 mV, e com uma concentrao externa de 2mM, para que houvesse transporte passivo de NO3- a concentrao citosslica desse on deveria estar em torno de 28 M. Na prtica, as concentraes citosslicas obtidas experimentalmente so milhares de vezes maiores.

10

Em Arabidobsis, LATS transporta NO3- a velocidades que variam de 4 a 700 Moles/g/hr (peso fresco de razes). O sistema LATS foi caracterizado como constitutivo e insensvel a inibidores metablicos. A absoro de NO3- controlada por feedback. Nveis elevados de NO2-, NH4+ e aminocidos livres no citossol inibem a absoro de NO3-. Em citros, a absoro de NO3- foi fortemente afetada pelo pH do meio externo. Aumentos do pH externo de 4,0 para 7,0 reduziram drasticamente a absoro de NO3-. Por outro lado, quando as razes de citros foram submetidas a inibidores de P-H+-ATPases (DCCD ou DES), tambm observou-se redues significativas na absoro de nitrato (Cerezo et al., 2000). Fried et al. (1965), usando ambos NH4+ e NO3- marcados (15N), observaram que o arroz absorve NH4+ mais rapidamente medida que o pH da soluo nutritiva aumenta, situando-se o pH timo em torno de 8,5. Para NO3-, entretanto, foi observada uma absoro mais rpida medida que o pH diminua, situando-se o pH timo em torno de 4,0. Para qualquer dos nveis intermedirios entre estes dois valores, entretanto, a absoro de NH4+ pelas plantas era sempre maior que a de nitrato. Por exemplo, a um pH de 5,5, as razes de arroz absorvem 300g de N por g de peso seco, quando NH4+ foi usado, enquanto que, quando NO3- foi usado, as razes absorveram apenas 68g de N por g de peso seco. O pH da soluo externa (de 4,5 a 9,0) teve pouco efeito sobre a absoro de NH4+ via sistema de alta afinidade (0,1 mM NH4+), mas teve um efeito acentuado sobre a absoro de NH4+ pelo sistema de baixa afinidade (pH acima de 6,0). Por outro lado, a reduo do pH para 3,0 resultou numa reduo drstica da absoro de NH4+ tanto pelo sistema de alta como de baixa afinidade. Nielsen e Schoerring (1998) observaram que no espao livre aparente da parte area de colza ocorria uma queda de 30% nos teores de NH4+ com a variao de cada unidade de pH entre 5,0 e 8,0. Mesmo em pH 4, quando a absoro de NO3- atinge o seu mximo, se NH4+ e NO3estiverem em concentraes equimolares, as plantas ainda absorvem de 5 a 10 vezes mais N como NH4+ do que como NO3-. A absoro mais rpida de N-NH4+ do que de N-NO3- foi observada tambm por Eira (1977) em Digitaria decumbens. Syrett (1956) observou que clulas de Clorela, quando expostas a altos nveis de N, tanto na forma de NH4+ ou na de NO3-, absorveram 4 a 5 vezes mais N no primeiro caso. A absoro de NH4+ por plantas , portanto, mais rpida do que a absoro de NO3- sob amplas condies de variao ambiental. Em cevada, foi observada a absoro de NO3- em nveis de 1,8 a 2,1 moles/g.peso fresco/hora sob condies normais de nutrio. Entretanto, plantas submetidas previamente 11

deficincia de N, mostraram velocidades de absoro de NO3- (Vmx) de 9,6 a 10,1 moles/g. peso fresco/hora (Sidiqqi et al., 1990). Em algodo, Aslam et al. (1997) observaram que medida que a concentrao de NO3- na soluo externa era aumentada de 0,05 at 1,00 mM, as velocidades de absoro de NO3- variavam desde 2,0 at 7,0 moles/g.peso fresco/hora, Em trigo foram observadas velocidades de absoro de 2,0 a 2,6 moles/g.peso fresco/hora dependo de haver ou no pr-induo do sistema de transporte pela presena de NO3- no meio. A velocidade de absoro de NO3- varia no apenas com a espcie estudada, mas tambm depende da concentrao externa de NO3-, da pr-incubao (com NO3-) dos sistemas transportadores, e de controles (inibio) por feedback exercido no apenas pela concentrao interna de NO3-, mas tambm por substncias resultantes do metabolismo de N-NO3- nas plantas. A absoro de nitrato causa inicialmente uma despolarizao no potencial da membrana (). Esta despolarizao inicial seguida de repolarizao, e em alguns casos at de uma hiperpolarizao. Este ltimo efeito deve-se ao estmulo que a despolarizao inicial causa sobre os mecanismos de extruso de prtons atravs das P-H+-ATPases. A despolarizao inicial deve-se ao fato de que a absoro de NO3- um processo termodinamicamente ativo. um simporte, com uma relao 2H+/ NO3- (Figura 2). Em algumas plantas esta despolarizao inicial pode ser pequena (da ordem de 10 mV ou menos), mas em cevada foram observadas despolarizaes da ordem de 40 mV, poucos minutos aps a exposio das plantas ao NO3- externo, e antes que se observe o estmulo atividade das H+ATPAses e conseqente extruso de H+. Os efeitos de NO3- sobre o potencial da membrana () podem ser observados na faixa de pH que vai de 4,4 a 7,0. Em pH = 8,0 as plantas no mais responderam presena de NO3- no meio externo. Quando, entretanto o pH da soluo foi reajustado para 6,0 a atividade eltrica das membranas reapareceu aps 30 minutos (McClure et al., 1990). Estes pesquisadores mostraram que, o transporte de NO3- em razes de milho foi sendo inibido medida que o pH da soluo externa aumentava de 4,4 at 8,0. Acima de pH = 8,0 o transporte de NO3- cessou completamente. Alm disso, a pH = 8,0 as razes no apresentaram variao no potencial da membrana em resposta concentrao externa de NO3-. Estes resultados contribuem para demonstrar que a fora prton-motriz (p) realmente responsvel pelo transporte de NO3- atravs das membranas. Isto explica em parte porque a velocidade de absoro de NO3- aumenta medida que o pH da soluo externa diminui. preciso considerar que do ponto de vista energtico, o primeiro passo para a absoro de NO3 ser a extruso ativa de H+ pelas bombas de prtons da membrana plasmtica (P-H+12
-

ATPases), de modo a que seja criado um gradiente de H+ (H+) entre o apoplasto e o interior da clula. Considerando como vlida a relao 1 H+: 1 ATP, sero necessrios 2 moles de ATP para cada mol de NO3- absorvido (Figura 2). preciso levar em conta, entretanto, que nestes clculos de custos energticos de absoro de nions, a concentrao relativa dos nions dentro e fora da clula tem um papel fundamental (ver captulo 5 neste volume). Mudanas no pH do meio, devidas absoro de ons por razes de cevada, foram observadas por Hoagland e Broyer (1940). As observaes de vrios pesquisadores indicam que a absoro diferencial de nions ou ctions resulta em aumento ou reduo do pH do meio, respectivamente (Moore, 1974). Na absoro de um excesso de nions (NO3- no caso), o sistema de cotransporte 2H+/NO3- resulta no aumento do pH da soluo externa. No caso especfico do nitrognio, variaes drsticas no pH foram observadas, quando arroz foi cultivado em soluo nutritiva em que N estava presente em forma amoniacal (Karim & Vlamis, 1962); estes autores s conseguiram obter crescimento das plantas quando um excesso de carbonato de clcio foi includo na soluo nutritiva. A mesma tcnica foi usada por Fernandes (1974) usando nveis elevados de N-NH4+ (150 ppm) em soluo nutritiva. Variaes de pH de 6,1 para 4,3 foram observadas em nossos laboratrios (resultados no publicados), quando arroz (4 plantas por 2 litros de soluo nutritiva) foi mantido por 90 horas em uma soluo nutritiva com 5 ppm de N-NH4+. As variaes de pH (aumento) obtidas quando amnio foi substitudo por nitrato, no foram to elevadas.

2.2.1

Transportadores de Nitrato

A absoro de NO3- feita atravs de sistemas de absoro de alta (HATS) e baixa afinidade (LATS). Os transportadores do tipo LATS so constitutivos, enquanto o sistema de absoro de NO3- de alta afinidade (HATS) tem um componente constitutivo (cHATS) e um outro passvel de induo (iHATS). Cada um dos trs sistemas propostos para a absoro de nitrato (cHATS, iHATS, LATS) pode consistir ou no, de diversos transportadores, geneticamente diferentes. Transportadores do tipo cHATS e iHATS, podem ser expressos simultaneamente e responder ao aumento das concentraes externas de NO3- com um aumento de atividade (upregulation). A induo do sistema iHATS pode ser feita tanto por NO2- como por NO3-. Foi observado em cevada que o sistema iHATS pode aumentar sua atividade em at 30 vezes em relao ao cHATS, como resposta ao aumento da concentrao externa de nitratos.

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Estudos moleculares em Arabidopsis, localizaram uma famlia de transportadores de NO3codificada pelos genes NRT (Nitrate transporter). Nessa famlia, os genes NRT1 codificam para os transportadores do sistema de baixa afinidade e os genes NRT2 para os sistemas de alta afinidade. Em Arabidopsis, dois membros da famlia NRT2, AtNRT2.1 e AtNRT2.2 corresponderiam ao sistema iHATS, enquanto que AtNRT2.3, AtNRT2.4, AtNRT2.5 AtNRT2.6 e AtNRT2.7 corresponderiam ao sistema cHATS (Figura 4). A expresso do genes para NRT2 estimulada pela presena externa de NO3- e reprimida pela presena interna de glutamina. Entretanto h um gene, AtNRT2;5 que ao contrrio dos outros, inibido pela adio de nitrato (Okamoto e Okada, 2004).

Figura 4. Sistemas de absoro de NO3- (NRT: Nitrate transporter) de alta (NRT2) e baixa afinidade (NRT1). cHATS (constitutivos); iHATS (induzveis)

2.3

Absoro de nitrognio orgnico por plantas

Em plantas superiores a capacidade de absorver formas orgnicas de nitrognio foi estudada por Virtanen e Linkola (1946). Entretanto, estes estudos foram limitados a certos grupos de plantas, leguminosas entre elas. Foi observado que alguns aminocidos, quando usados como nica fonte externa de nitrognio, causavam crescimento anormal em plantas.

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Em geral, o nitrognio em forma orgnica no considerado como fonte direta importante de N para as plantas, em condies normais de solo. A absoro de aminocidos feita via simporte, com prton e depende, portanto, da formao de gradientes de H+, e gerao de fora prtonmotriz, pelas P-H+-ATPases. Tambm existe a sugesto de que plantas como o arroz possam absorver diretamente protenas (Yamagata e Ae, 1999). Nsholm et al. (1998) observaram a absoro de N-orgnico por rvores e arbustos de florestas boreais. Este mecanismo seria importante nessas regies onde a baixa temperatura impede a mineralizao do N-orgnico. Glicinas marcadas no carbono e no nitrognio foram absorvidas pelas plantas, e usadas como fonte de N para o crescimento. Aparentemente este processo mediado pela micorrizao. Okamoto e Okada (2004) observaram o efeito positivo de fontes de N-orgnico (farelo e palha de arroz) no crescimento de sorgo e arroz, enquanto que milho e milheto so menos afetados e respondem melhor ao N-mineral. Estes autores sugerem que as necessidades de N do sorgo podem ser supridas com a absoro de protena da soluo do solo, e que o arroz tambm poderia recorrer a essa fonte complementar, quando h deficincia de N-mineral no solo.

REDUO DO NITRATO

O nitrato a principal fonte de nitrognio para a maioria das plantas, especialmente para os cereais e culturas granferas. As plantas no assimilam nitrognio em alto estado de oxidao, deste modo, quando nitrato absorvido, ele s ser assimilado se for primeiro reduzido a amnio. A converso de nitrato a amnio ocorre em duas etapas, atravs de uma reduo que requer oito eltrons. O nitrognio passa do estado de oxidao (+5) para (-3). Inicialmente ocorre no citossol a reduo do NO3- a nitrito (NO2-) com o uso de dois eltrons, transferidos das coenzimas NADH ou NADPH e catalisada pela enzima nitrato redutase (NR). Em seguida, o nitrito transportado para os cloroplastos nos tecidos fotossintetizantes ou para os plastdios nas razes, sendo ento reduzido a amnio, atravs da enzima nitrito redutase, com transferncia de seis eltrons doados pela Ferredoxina reduzida (Figura 5).

15

Figura 5. Reduo do nitrato (NO3-) a nitrito (NO2-) no citossol pela enzima Nitrato Redutase e do NO2- a amnio (NH4+) atravs da Nitrito Redutase no cloroplasto (plastidio).

3.1

Nitrato Redutase (NR) A Nitrato redutase (EC. 1.6.6.1) a primeira enzima na via de reduo de nitrato pelas

plantas, e representa, a etapa limitante e reguladora deste processo (Beevers e Hageman, 1969; Campbell, 1988; Campbell, 1999). Nas plantas superiores, algas e fungos as NR so consideradas enzimas solveis localizadas no citoplasma (Hageman e Bellow, 1990; Kleinhofs e Warner, 1990), embora tenha sido identificada em razes de milho e cevada uma forma de NR ligada membrana plasmtica. Essa isoforma da Nitrato Redutase ancorada na face externa da membrana plasmtica referida como um possvel sensor para o NO3- (Forde e Clarkson, 1999). A NR encontrada em muitas plantas e rgos principalmente quando nitrato a fonte de nitrognio. A atividade da NR pode ocorrer no citoplasma tanto de razes como de folhas (Hageman e Bellow, 1990), sendo que, normalmente, a atividade da enzima nitrato redutase alta nas folhas. No entanto, segundo Campbell (1999), algumas plantas tm pouca ou nenhuma atividade da NR nas folhas, havendo maior atividade nas razes. A NR pode tambm ser encontrada em um tipo de 16

clula particular, como ocorre em folhas de plantas C4, onde a enzima est localizada somente nas clulas da bainha vascular. A NR um homotetrmero formado por dois dmeros simtricos. Cada tetrmero ativo, em baixas concentraes da enzima, dissocia-se em dmeros ativos, sem que ocorra perda significativa de atividade, sugerindo que a associao/dissociao no exerce papel na regulao da atividade da enzima. Dois eltrons so necessrios para a reduo do nitrato a nitrito pela NR, esses eltrons podem ser fornecidos pelo NADH ou NADPH. Sendo que o NADH o principal doador de eltrons para a NR na maior parte das plantas superiores e algas eucariticas, enquanto que somente os fungos utilizam NADPH. Entretanto, algumas plantas superiores (arroz, milho, cevada, soja) e algumas espcies de algas podem utilizar tanto o NADH quanto o NADPH como doador de eltrons para a NR sendo chamadas de plantas NAD(P)H-NRs bi-especficas (Kleinhofs e Warner, 1990). Todas as NRs eucariticas contm trs grupos prostticos na proporo estequiomtrica de 1:1:1, por subunidade: Flavina Adenina Dinucleotideo (FAD), Citocromo b557 e Cofator Molibdnio (molibdnio associado com a pterina, formando complexo molibdopterina). Segundo Kleinhofs e Warner (1990) o fluxo de eltrons na NR ocorre da coenzima NAD(P)H atravs do FAD, Citocromo b557 e Cofator Molibdnio, e finalmente chegando ao NO3- que reduzido a NO2(Figura 6).

Figura 6. Esquema da transferncia de eltrons na enzima Nitrato Redutase. Os eltrons doados pelo NAD(P)H so transferidos pelo FAD, citocromo b557 e cofator molibdnio-pterina at chegarem ao NO3- que ento reduzido a NO2-. Como a NR est localizada no citoplasma, a fonte primria de poder redutor para a formao de NADH (forma reduzida) seria proveniente da degradao de acares (Beevers e Hageman, 1969), provavelmente atravs da via Glicoltica durante a oxidao do gliceraldeido 3-fosfato a 1,3 bisfosfoglicerato que catalisada pela enzima da Gliceraldeido 3-fosfato desidrogenase citosslica (Klepper et al., 1971). Em tecidos fotossintetizantes o poder redutor requerido para a atividade da 17

NR parece ser derivado do NADPH produzido nos cloroplastos pela etapa luminosa da fotossntese. Atravs de sistemas especiais de transporte de eltrons entre o cloroplasto e o citossol, os eltrons do NADPH reduzem o NAD+ citoplasmtico a NADH, que desta maneira poder ser usado pela NR e outras reaes de reduo do citossol (Hageman e Bellow, 1990, Oaks e Yamaya, 1990).

3.2

Nitrito Redutase (NiR)

O nitrito (NO2-) produzido pela reao da nitrato redutase, txico, devendo, portanto, ser prontamente metabolizado. A reduo do NO2- a amnio ocorre pela ao da enzima Nitrito redutase (NiR), que transfere seis eltrons de seis molculas de Ferredoxina reduzida (Fd red) para o nitrito produzindo amnio (Figura 5). A NiR est localizada nos cloroplastos da parte area ou nos plastdios das clulas radiculares. Nos cloroplastos (presena de luz) a Ferredoxina reduzida produzida atravs da cadeia de transporte de eltrons da fotossntese, enquanto nas clulas radiculares NO2- reduzido a amnio pela NiR localizada nos plastdeos, de maneira anloga a que acontece no tecido foliar. Entretanto, como no pode ser produzida diretamente, atravs da fotossntese, a Ferredoxina que ser utilizada pela NiR presente nas razes (ou na parte area no escuro) reduzida pelos eltrons doados pelos NADPH, gerados atravs da Via das Pentoses-fosfato. Sthr et al. (2001) descreveram a atividade cataltica de uma enzima ancorada na membrana plasmtica, que reduz NO2- a xido ntrico (NO) nas razes de fumo. Esses estudos sugerem que a enzima nitrito:NO redutase deve atuar concomitantemente com a NR da plasmalema, para converter NO3- externo em NO, o NO por sua vez, atravessa a membrana plasmtica e atua como intermedirio na sinalizao por NO3-. Em mamferos, o papel do xido ntrico est estabelecido como uma molcula sinalizadora importante (ver captulo 8 neste volume). Na verdade, o NO, por si s, capaz de induzir genes que respondem a NO3-.

ACMULO E REMOBILIZAO DO NITRATO De maneira geral o nitrato absorvido pela clula pode ser: Reduzido e assimilado no local de absoro Acumulado no Vacolo da clula que o absorveu, atravessando o tonoplasto por um canal de nitrato Absorvido nas razes e enviado para a parte area, onde pode ser reduzido e 18

assimilado, ou acumulado no vacolo celular. Quando o nitrato absorvido no citossol ele induz a atividade da enzima NR. Deste modo, o nitrato pode ser reduzido a nitrito pela NR, e a seguir o nitrito reduzido pela NiR a amnio, que precisa ento ser assimilado em molculas orgnicas atravs das enzimas Glutamina Sintetase (GS) e Glutamato Sintase (GOGAT). Todo esse processo de reduo e assimilao, necessita de energia, poder redutor e esqueletos de carbono, que em algumas situaes esto em nveis limitantes na clula (escuro, senescncia, baixa taxa fotossinttica, estresse etc). Nestas condies o nitrato absorvido pode ser enviado para outras clulas ou acumulado no vacolo, passando pelo tonoplasto atravs de um canal de NO3- (Figura 7).

Figura 7. Viso geral da absoro de nitrato e amnio; reduo, exportao e acmulo de nitrato; assimilao de amnio. T (tonoplasto; MP (membrana plasmtica) (1) P-H+-ATPase; (2) Transportador de NO3- (simporte); (3) Transportador de NH4+ (uniporte); (4) Canal de NO3-.

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A remobilizao do nitrato acumulado no vacolo, com seu retorno ao citossol, envolve a participao de um transportador de nitrato, do tipo simporte, com um prton e depende de um gradiente eletroqumico que gerado pelas bombas de prtons presentes no tonoplasto: a VH+ATPase e a Pirofosfatase (H+PPase). No citossol o nitrato atua como um desacoplador das unidades Vo e V1 das V-H+ATPase (ver captulo 5 neste volume), deste modo esta enzima s atua bombeando prtons para o interior do vacolo, na ausncia de nitrato no citossol, quando ento, a sua atividade permite a sada do nitrato que esteja acumulado no vacolo (Figura 8).

Figura 8. Viso geral da remobilizao de nitrato do vacolo. (5) V-H+-ATPase; (6) H+-PPase; (7) Transportador de NO3- (simporte: H+/NO3-).

Na clula pode se considerar que h dois reservatrios ("pools") de nitrato separados espacialmente: o "Reservatrio metablico ou pool indutor" (de curta durao - ligado regulao do nvel da NR) e o "Reservatrio de reserva ou pool substrato" (de existncia mais longa - ligado ao suprimento de substrato) (Heimer e Filner, 1971; Ferrari et al.,1973) 20

O pool indutor se refere ao NO3- presente no citossol, enquanto o pool substrato o NO3acumulado nos vacolos. Ferrari et al. (1973) verificaram em clulas de tabaco que o NO3- acumulado no "pool substrato" podia ser utilizado pela planta, no entanto era incapaz de substituir o NO3- do "pool indutor" em sua capacidade de induzir sntese "de novo" de NR, ou aumentar a atividade da NR j existente. O excesso de nitrato no citossol (pool indutor) passa rapidamente para o vacolo (pool de reserva), atravs de um canal inico no tonoplasto (Satter e Moran, 1988; Hedrich e Schroeder, 1989). Segundo Siddiqi et al. (1989), o fornecimento de nitrognio exgeno, pode restaurar o fluxo de nitrato no citoplasma e assim aumentar a atividade da NR. A Nitrato redutase uma enzima passvel de induo pelo substrato (NO3-). Numerosos estudos comprovaram aumento da atividade dessa enzima aps nitrato ser fornecido s plantas. O nitrato tanto induz os genes para a Nitrato Redutase (NIA) como os genes para a Nitrito Redutase (NII). Sommers et al. (1983) utilizando imunoeletroforese com anticorpos especficos para NR, encontraram aumento da atividade da NR em plantas induzidas por nitrato, que corresponde a um aumento da protena-NR. Estes resultados indicam que o nitrato induz a expresso gnica que culmina com a sntese de novo da protena NR. Posteriormente, quando o nitrato foi removido das plantas, a atividade da NR e a protena-NR diminuram, demonstrando que a NR no permanece quando o sinal-nitrato para a induo removido. Evidncias indicam que a luz no tem papel direto na atividade da NR (Campbell, 1999). A influncia da luz poderia ser devido a um efeito geral na sntese de protena e no diretamente na NR. Segundo Campbell (1988), a luz no influencia a expresso gnica para a NR, uma vez que o RNA mensageiro (RNAm) para a NR no est presente em altos nveis em plantas crescidas na luz, a menos que nitrato seja fornecido. Deste modo, a luz no capaz de exercer influncia nos nveis de RNAm para a NR a menos que o nitrato j tenha ativado o gene que codifica a NR. H evidncias de que o nitrato desencadeia a expresso gnica para a NR (e provavelmente para genes relacionados, como o da nitrito redutase), enquanto que a luz influencia o nvel de expresso desses genes, alm de fornecer energia para a reao. Em milho foi verificado que a induo da protenaNR inativa ocorreu em resposta luz, na presena de baixos nveis de nitrato, no entanto, a expresso total da atividade enzimtica requereu altos nveis de nitrato (Oaks et al., 1982). Quando plantas de milho induzidas por nitrato foram transferidas da luz para o escuro, a atividade da NR atingiu nveis baixos, em um perodo de 12 horas. No escuro o nitrato direcionado para o pool de reserva, nos vacolos, devido deficincia de poder redutor produzido 21

na fotossntese. Em um curto perodo aps a transferncia das plantas da luz para o escuro, a protena-NR no diminuiu, embora a atividade da NR tenha diminudo em 30%. A atividade da NR foi restabelecida com o retorno das plantas a luz. Estes resultados indicam a existncia de um mecanismo de inativao reversvel para a regulao da NR. Em condies de baixa energia a NR ativa pode ser fosforilada e ligada a uma protena regulatria denominada 14-3-3, formando um complexo inativo que pode ser direcionado destruio da NR. Entretanto, se for restabelecido o nvel energtico, a protena 14-3-3 se desligaria da NR e a enzima posteriormente defosforilada, voltaria sua atividade normal. A NR fosforilada tambm ativa.

ASSIMILAO DO AMNIO

Embora o nitrato e o amnio possam ser absorvidos pelas plantas, a assimilao do nitrognio somente ocorre sob a forma reduzida (amnio). Esse amnio pode ser diretamente absorvido pela clula atravs de um transportador do tipo uniporte presente na membrana plasmtica ou ser formado pelas reaes do metabolismo como a fotorespirao e a reduo do nitrato (Figura 7) At os anos 1970 acreditava-se que em plantas o amnio era incorporado em molculas orgnicas, atravs da enzima glutamato desidrogenase (GDH-EC.1.4.1.3), via aminao redutiva direta do -cetoglutarato. Embora a glutamina sintetase (GS-EC.6.3.1.2) fosse conhecida, ela no era considerada importante, porque o nitrognio era assimilado na posio amida formando glutamina. Entretanto, em 1971, Tempest et al. (1971), detectaram uma nova enzima em bactria, que catalisava a transferncia redutiva do grupo amida da glutamina para o -cetoglutarato, resultando na produo de duas molculas de glutamato. Esta enzima foi denominada glutamato sintase (GOGAT), (NADH-GOGAT-EC.1.4.1.13). Finalmente Lea e Miflin (1974), demonstraram em cloroplastos a existncia de uma GOGAT diferente da encontrada em bactria, que era dependente de Ferredoxina reduzida, que foi denominada Fd-GOGAT e que catalisava reao similar da NADH-GOGAT bacteriana. O significado da descoberta da GOGAT que, em cooperao com a GS, ela fornece uma rota alternativa para a sntese de glutamato a partir de amnio e -cetoglutarato. Este sistema foi chamado via GS-GOGAT (Miflin e Lea, 1977). Amnio inicialmente incorporado em glutamato, atravs da GS, formando glutamina (O N incorporado est na posio amida da glutamina) e ento

22

transferido, pela ao da GOGAT, para o carbono-alfa do -cetoglutarato, formando duas molculas de glutamato. Uma caracterstica tpica da via GS-GOGAT de assimilao de amnio sua natureza cclica, onde o glutamato ao mesmo tempo substrato e produto da assimilao (Figura 9).

Figura 9. Esquema representativo da Via Glutamina Sintetase-Glutamato sintase (GS-GOGAT) para a assimilao de amnio. (Fd ox = ferredoxina oxidada e Fd red = Ferredoxina reduzida) Aps a descoberta da via GS-GOGAT, verificou-se que a enzima GDH no tinha o papel principal na assimilao de amnio em plantas superiores (Miflin e Lea, 1977; Kumar e Abrol, 1990; Lancien et al.. 2000). Diversas evidncias apontam para a Glutamina Sintetase como a principal enzima na assimilao de amnio pelas plantas: A Glutamina Sintetase tem menor KM para o NH4+ (KM de 50 M) do que a GDH (KM de 5 a 70 mM), portanto, mesmo em baixas concentraes de NH4+ a GS ativa (Lea e Miflin, 1977); 23

A glutamina o primeiro produto formado quando se usa nitrognio marcado (NH4+ ou NO3-) (Magalhes et al., 1990); Inibidores de GS bloqueiam a assimilao de NH4+.

5.1

Glutamina Sintetase (GS) A enzima glutamina sintetase (GS) incorpora NH4+ formando glutamina, atravs da ligao

do NH4+ ao grupo carboxlico do glutamato, usando energia fornecida pelo ATP: NH4+ + L-glutamato + ATP L-glutamina + ADP +Pi A glutamina sintetase de plantas superiores se apresenta como uma protena octomrica (constituda de 8 subunidades) (Stewart et al., 1980) ou tetramrica (4 subunidades) (Mack, 1998) ativa. H duas isoformas de GS: a isoforma GS1 localizada no citossol e a GS2 localizada nos cloroplastos e outros plastdeos. Estudos moleculares indicam que a GS1 codificada por uma pequena famlia formada por dois a cinco genes, enquanto h um nico gene que codifica a GS2 (Ireland e Lea, 1999). Hirel e Gadal (1980) demonstraram a existncia de trs isoformas de GS em arroz: duas isoformas foram identificadas nas folhas: GS1 citosslica e GS2 cloroplstica; e nas razes foi encontrada uma isoforma citosslica denominada GSr. As enzimas GS1 e GSr so codificadas por dois genes GS1: OsGS1 e OsGSr. Entretanto, aps o sequenciamento do genoma do arroz um terceiro gene para GS1 foi descoberto (OsGS1;3), o que levou a substituio da nomenclatura OsGS1, OsGSr para respectivamente OsGS1;1, OsGS1;2 (Ishiyama et al., 2004). A proporo relativa das isoformas cloroplsticas e citosslicas influenciada por vrios fatores, inclusive o estgio de desenvolvimento e condies ambientais, tais como luz. Hirel et al. (1982), observaram atividade da GS2 baixa ou ausente em folhas estioladas. Entretanto, quando o tecido foi se tornando verde, a GS2 aumentou rapidamente, via sntese "de novo", enquanto a GS1 diminuiu. Estes resultados sugerem que a GS2 estaria restrita aos tecidos verdes e que a GS1 estaria presente de forma mais generalizada, em folhas, razes e sementes. Foi demonstrado que o amnio produzido durante a fotorespirao reassimilado nos cloroplastos pela GS2. Wallsgrove et al. (1979) isolaram mutantes de cevada deficientes em GS2 cloroplstica e observaram que esses mutantes acumularam concentraes txicas de amnio devido fotorespirao, o que enfatiza o papel da GS2 na assimilao do amnio liberado na 24

fotorrespirao. Entretanto, algumas plantas, como o espinafre e o fumo, no contm a GS citosslica (GS1) (McNally et al., 1983), o que sugere que toda o amnio produzido na clula vegetal possa ser assimilado pela GS2.

5.2

Glutamato Sintase (GOGAT)

Em plantas existem enzimas glutamato sintase (GOGAT) que podem utilizar NADH (NADH-GOGAT) ou ferredoxina (Fd-GOGAT) como doadores de eltrons. Ambas as isoformas promovem a transferncia redutiva do grupo amida da glutamina para o alfa-cetoglutarato, formando duas molculas de glutamato: L-glutamina + -cetoglutarato + NADH ou Fdred 2 L-glutamato + NAD+ ou Fdoxid Uma das duas molculas de glutamato formado pode retornar via GS-GOGAT, enquanto a outra molcula de glutamato pode ser usada nas reaes biossintticas (Miflin e Lea, 1976) (Figura 9). Os anticorpos contra NADH-GOGAT no reconhecem Fd-GOGAT e vice-versa indicando que as duas GOGAT so protenas imunologicamente distintas (Suzuki et al., 1982). A glutamato sintase (GOGAT) foi detectada em plastdios tanto em razes como em folhas (Suzuki et al., 1982; Wallsgrove et al., 1979). Nas folhas, Fd-GOGAT a forma predominante da enzima, encontrada no estroma dos cloroplastos. Ela especfica para ferredoxina reduzida, e inativa com NADH como doador de eltrons (Lea e Miflin, 1974; Suzuki e Gadal, 1982). A Fd-GOGAT presente em razes similar, mas no idntica foliar. A isoforma NADH-GOGAT est localizada principalmente em tecidos no verdes tais como razes, ndulos e cotildones em desenvolvimento (Chen et al 1990). Em tecidos verdes NADHGOGAT muito menos ativa que a Fd-GOGAT (Matoh et al., 1980). A Fd-GOGAT foi a principal forma de glutamato sintase encontrada nas folhas verdes de arroz (Suzuki e Godal, 1982; Yamaya et al., 1992), enquanto que, alta atividade de NADH-GOGAT foi detectada em folhas que ainda no tinham emergido e, portanto, no estavam verdes e expandidas (Yamaya et al., 1992). Entretanto, parece que uma vez atingida a expanso total da folha, a atividade e o contedo de protena NADH-GOGAT diminuem, sugerindo que a expresso 25

do gene para NADH-GOGAT em folhas de arroz reduzida com a idade da folha e que ocorre degradao da protena NADH-GOGAT (Yamaya et al., 1992). Nos cloroplastos a ferredoxina utilizada pela Fd-GOGAT produzida atravs da fotossntese. Na raiz a ferredoxina no pode ser reduzida pelas reaes luminosas da fotossntese, mas sim, por NADH ou NADPH proveniente da oxidao de acares, que por sua vez a mesma fonte de poder redutor para o NADH-GOGAT (Hageman e Bellow, 1990).

5.3

Glutamato Desidrogenase (GDH)

A enzima Glutamato desidrogenase (GDH) promove a aminao redutiva reversvel do cetoglutarato formando glutamato. Foram detectadas duas isoenzimas da GDH, uma localizada na mitocndria e dependente de NADH (E.C.1.4.1.2 - NADH-GDH) como doador de eletrons e outra presente nos cloroplastos que utiliza a coenzima NADPH (E.C.1.4.1.4 - NADPH-GDH). A enzima mitocondrial est associada membrana da mitocndria. A GDH est presente tanto nas razes quanto nas folhas, utilizando como doador de eltrons: NADH ou NADPH. NH4+ + -cetoglutarato + NAD(P)H + H+ L-Glutamato + H2O + NAD(P) + A afinidade da GDH pelo NH4+ baixa, com Km variando de 5-70 mM, de acordo com a localizao da enzima no tecido vegetal (Miflin e Lea, 1977). O Km pelo -cetoglutarato de 3,3 mM e pelo glutamato de 7,3 mM, na rota de desaminao. O maior Km apresentado pela GDH para o amnio em relao a GS (Km = 50 M), demonstra que a GDH no estaria atuando no sentido da aminao, pois a GS seria a enzima mais apropriada, devido a sua maior afinidade pelo amnio (menor Km). Lewis et al. (1983) verificaram que nas razes de cevada os ons NH4+ absorvidos do solo eram assimilados, exclusivamente, atravs da via GS/GOGAT e que a GDH teria somente um papel limitado neste processo. Esses reultado indicam que a GDH das plantas superiores seria importante na reao de desanimao oxidativa do glutamato e no na aminao do -cetoglutarato a glutamato. Foi observada maior atividade da GS nas regies de crescimento radicular, enquanto que, a atividade da GDH foi consideravelmente maior nas partes mais velhas da raz (Luxov,1988) Simpson e Dalling (1981), observaram que durante o perodo de enchimento dos gros, a atividade da GS e da GOGAT na folha bandeira de arroz diminui. A atividade da GDH permaneceu

26

constante durante o mesmo perodo. No entanto a enzima atingiu um pico de atividade aos 25 dias aps a antese. Esse pico coincidiu com o perodo do rpido declnio na atividade da GS. Boggio et al. (2000) observaram em tomate que GS estava presente quase que exclusivamente nos frutos verdes, enquanto que GDH se encontrava apenas nos frutos mais maduros, sugerindo um modelo recproco de atividade entre GS e GDH durante o amadurecimento e senescncia do fruto de tomate. Aumentos na GDH, no perodo tardio da senescncia foram observados em ptalas de tulipa senescentes e em folhas destacadas e senescentes de Lolium (Thomas, 1978). Tem sido observado que GDH a enzima do metabolismo de N que freqentemente atinge mais alta atividade durante a senescncia (Frith et al., 1978; Ragster e Chrispeels, 1981; Laurire e Daussand, 1983) De acordo com Robinson et al. (1992) as mudanas na atividade da GDH, observadas em folhas senescentes, poderiam estar relacionadas com a diminuio da fotossntese destes tecidos, e, portanto, ligada disponibilidade de carbono. Deste modo, como pode ser visto na figura 10, a enzima Glutamato desidrogenase pode atuar no sentido de: a) Desaminao: catalisando a oxidao do glutamato a -cetoglutarato e fornecendo assim, esqueleto de carbono para o ciclo de Krebs; b) Aminao: incorporando amnio e formando glutamato.

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Figura 10. Atividade da enzima Glutamato desidrogenase (GDH). Aminao: incorporando amnio e formando glutamato; Desaminao: catalisando a oxidao do glutamato a -cetoglutarato liberando amnio. Em cultura de clulas de cenoura, foi observado que a GDH era ativa na oxidao do glutamato, mas no na aminao redutiva do -cetoglutarato, que ocorreria somente via GS/GOGAT (Robinson et al.,1990). Em outro experimento os mesmos autores observaram relao inversa entre atividade da GDH e o suprimento de carboidrato (sacarose) ao meio de cultura. Sahulka e Lis (1980) tambm observaram aumento da atividade da GDH em resposta limitao de sacarose em razes de ervilha. Estes resultados evidenciam o papel primrio da GDH na desaminao do glutamato. Fornecendo assim, esqueletos de carbono para que o ciclo de Krebs funcione, sob condies de limitao de carbono (Srivastava e Singh, 1987; Yamaya e Oaks, 1987; Oaks e Yamaya, 1990; Robinson et al., 1990; 1992).

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Sob este ponto de vista, poderia se supor que a chamada "induo da atividade da GDH" por amnio, observada por diversos autores (Kar e Feierabend, 1984; Jain e Shargool, 1987 Shargool e Jain, 1987; Srivastava e Singh, 1987), estaria na verdade acontecendo devido diminuio de esqueletos de carbono e no pelo aumento de amnio no tecido da planta. A GDH est, portanto, envolvida em uma importante funo anaplertica, unindo o metabolismo do carbono e do nitrognio nas plantas superiores.

VISO GERAL DO METABOLISMO DE NITROGNIO

O fornecimento de energia ou poder redutor para o funcionamento das enzimas do metabolismo de nitrognio acopla o metabolismo de N ao de carbono (C) em trs vias (Tabela 1): Utilizao de esqueletos de carbono: como a GDH ou GOGAT. Utilizao de doadores de eltrons: como para a NR, NiR, GOGAT e GDH. Utilizao direta de energia: como a GS.

Tabela 1. Principais enzimas do metabolismo do nitrognio e seus doadores de eltrons ou energia. Enzima Nitrato redutase (NR) Nitrito redutase (NiR) Glutamina sintetase (GS) Glutamato sintase (GOGAT) Glutamato desidrogenase (GDH) Reao NO3- NO2NO2- NH4+ Glutamato + NH4+ Glutamina -cetoglutarato + Glutamina 2 Glutamato -cetoglutarato + NH4+ Glutamato Doador de eltrons ou energia NADH NAD(P)H Ferredoxina ATP Ferredoxina NADH NADH NAD(P)H

Nas folhas essas interaes ocorrem s expensas dos produtos primrios da fotossntese [ATP, NAD(P)H, Ferredoxina] e competem com a reduo de carbono. Por outro lado, nas razes, os carboidratos armazenados ou translocados servem como substrato para a produo de energia e fonte de carbono para a assimilao de N.

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TOXIDEZ DE NH4+ EM PLANTAS

Vrios estudos demonstram que o NH4+ pode ser txico para as plantas. Algumas plantas so muito sensveis toxidez por NH4+, mesmo em pequenas concentraes (2 mM). A toxidez de NH4+ afeta tanto a fisiologia como a morfologia das plantas. Embora as plantas s vezes consigam metabolizar as grandes quantidades do NH4+, liberadas pela fotorespirao, sem mostrar sinais da toxidez, a nutrio de plantas com N- NH4+ atravs do sistema radicular pode afetar negativamente o metabolismo vegetal, quando comparada s plantas sob nutrio ntrica ou sob uma combinao de NH4+ e NO3-. A absoro de excesso de NH4+ interfere com o balano de gua nas plantas, reduzindo o fluxo de gua das razes para a parte area de modo que plantas no tolerantes acabam murchando. Alguns sintomas de toxidez de NH4+ como folhas secas enroladas podem ser reflexo do aumento da resistncia ao movimento radial da gua em plantas sob nutrio amoniacal. Os nveis de exudao em plantas de tomate tratadas com NH4+ sofrem rapidamente uma reduo de at 60% quando comparadas com plantas sob nutrio ntrica. Alguns dos efeitos da toxidez por NH4+ podem ser revertidas por NO3-. Sintomas de deficincia de K foram observados em plantas sob nutrio amoniacal, mas a concluso foi de que este efeito foi devido a reduo na exudao e no por perda de K nas razes. Potssio tem uma ao importante na ativao das enzimas de assimilao de N quando o NH4+ est em nveis txicos nos tecidos das plantas. Plantas de tomate que tinham apresentado leses devido a absoro de excesso de NH4+ tiveram essas leses inibidas pelo K. A produtividade de milho sob nutrio amoniacal aumentou com a aplicao de nveis crescentes de K. Outros sintomas de toxidez de NH4+ podem incluir a clorose, a necrose e at a morte das plantas. O aparecimento desses sintomas depende da concentrao de NH4+ nos tecidos, da relao NH4+/ NO3- e da concentrao de outros nutrientes. Em experimento com mistura de NH4+: NO3- o feijo foi a planta mais severamente afetada pelo aumento da concentrao de NH4+ em relao ao NO3-. Enquanto que, repolho, melo e milho tiveram o peso seco das folhas reduzido pelo NH4+. Todas essas plantas apresentam uma reduo no teor de Ca com o aumento nos teores de NH4+. Para o seu funcionamento as enzimas de assimilao de NH4+ requerem energia, doadores de eltrons e esqueleto de carbono, para a incorporao do on. Quando se adicionou -cetoglutarato a plantas de tomates cultivadas sob nutrio amoniacal foi observado aumento no crescimento e nos teores de aminocidos livres, e reduo nos sintomas de toxidez. A assimilao de NH4+ formando glutamina pela ao da GS (relao C/N 5:2) ou glutamato pela ao da GDH (relao C/N 5:1) representa um dreno de esqueletos de carbono. 30

Britto et al. (2001) trabalhando com uma planta mais tolerante ao NH4+ (arroz) e outra mais sensvel (cevada), identificou na cevada um mecanismo de exudao ativa de NH4+, como uma das causas provveis da toxidez de N- NH4+. De acordo com esses autores, a cevada, ao contrrio do arroz, no mostra alta capacidade de regulao do potencial da membrana ( ) com a absoro de NH4+ (principalmente atravs de mecanismo de alta afinidade (HATS)). Como resultado, cevada acumula nveis excepcionalmente elevados de N- NH4+ no citossol. Parte deste NH4+ sofreria ento efluxo, contra a tendncia termodinmica dominante, que seria de fora para dentro. O resultado desse processo seria um gasto excessivo de energia (aumento de 41% nas taxas de respirao) com efeitos negativos sobre o metabolismo das plantas, e conseqente reduo do peso. Arroz, entretanto, mostra um eficiente sistema de controle do potencial da membrana (potencial menos negativo), e conseqentemente acumula nveis menores de NH4+ no citossol (Wang et al. 1994; Britto et al. 2001), e nveis mnimos de exudao de NH4+. Este mecanismo poderia ser uma das razes da tolerncia do arroz ao NH4+. Devido ao fato da assimilao de NH4+ ocorrer basicamente nas razes, e requerer grandes quantidades de carboidratos, plantas sob nutrio amoniacal mostram uma reduo na taxa de crescimento das razes. Quando houve reduo do suprimento de N s razes de milheto crescida em soluo nutritiva por sete dias, as razes mostraram um aumento de peso 24%, enquanto que simultaneamente as folhas tiveram uma reduo no peso de 24%. Esta reduo no peso da parte area das plantas foi atribuda a um redirecionamento dos carboidratos que seriam usados na assimilao do N uma vez que so necessrio cinco equivalentes de Glicose para a fixao de oito equivalentes de N. O acmulo de N-amino e N-amida uma das caractersticas de plantas sob excesso de N amoniacal. Na presena de elevados nveis de NH4+, asparagina e glutamina podem responder por mais de 80% do total de N-amino/N-amida livre. O teor de N-amino/N-amida livre pode aumentar de 10 a 20 vezes como resposta a toxidez do NH4+. Situaes de stresses devido ao excesso de absoro de N em plantas submetidas a condies desfavorveis de crescimento como baixa luz e alta temperatura, mudam a composio de N-amino/N-amida em plantas, como pode ser observado em experimento com arroz (Tabela 2).

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TABELA 2. Efeitos de baixa luz (17,3 Klux) e alta temperatura (35C) na composio de aminocidos e razo N-amino e N-amida em plantas de arroz submetidas a dois nveis de nitrato e amnio (20 e 150mg/L) (Adaptado de Fernandes, 1974). N-NO3Aminocidos Aspartato Glutamato Asparagina Glutamina Relao N-Amino/N-amida Total de aminocidos 20 mg N/L 10,6 25,1 3,9 12,3 5,17 12,80 150 mg N/L 5,1 16,3 11,2 21,5 2,06 17,93 N-NH4+ 20 mg N/L 1,4 5,5 26,7 54,7 0,23 124,50 150 mg N/L 2,3 5,0 12,5 70,5 0,20 173,00

___________________ % do total ___________________

(moles. g-1 peso fresco)

A acumulao de NH4+ em plantas pode ocorrer tanto devido ao aumento absoluto na disponibilidade de NH4+, como devido ao aumento relativo do NH4+ como conseqncia de um dficit de esqueleto de C. Ou seja, a uma deficincia dos cetocidos para sntese de N-amino e Namida. esta sntese de N-amino/N-amina que reduz o excesso de NH4+ livre nos tecidos. Um dficit de carboidratos pode ocorrer como resultado direto da reduo da fotossntese devido a queda de radiao fotossintaticamente ativa na superfcie do dossel (como acontece em dias nublados ou devido ao auto-sombreamento em dossis formado por plantas com excesso de folhas decumbentes), ou pode ser um efeito indireto devido ao consumo excessivo de C na respirao (como por exemplo, sob condies de alta temperatura (Britto et al., 2001)). Pode ocorrer, entretanto, uma combinao negativa de vrios fatores, como nveis elevados de NH4+, reduo da radiao incidente, temperaturas elevadas (Figura 11).

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Figura 11. Relaes entre os teores de N-amino e matria seca (A); N-amnio e matria fresca (B); e N-amino e acares solveis (C) em arroz cultivado com alto nvel de N-NH4+ (150 mg/L). Adaptado de Fernandes (1990).

Em comunidades vegetais formando dossis densos, s vezes apenas a parte superior do dossel recebe a radiao incidente total e capaz de realizar o seu potencial fotossinttico. Em situaes como essas, o dossel como um todo pode apresentar nveis elevados de respirao medida que a temperatura do ar aumenta. O resultado uma situao de estresse devido a combinao de baixa fotossntese e alta respirao que resulta na queima de nveis elevados de carboidratos, na absoro de nutrientes devido a energia disponvel atravs da respirao, ao mesmo tempo em que diversas rotas do metabolismo de N so bloqueadas devido a reduo no suprimento de esqueletos de C. Isso mostra que na aplicao de fertilizantes nitrogenados devem ser levados em considerao todos os fatores que afetam a fisiologia das plantas. Sem esse tipo de considerao pode acontecer que aplicando N na agricultura em nveis que aparentemente seriam considerados 33

adequados pode-se na verdade levar rapidamente a condies de toxidez de NH4+ ou ao acmulo de excesso de NO3- nos tecidos.

8 8.1

REMOBILIZAO DE NITROGNIO Senescncia Grande parte dos nutrientes presentes nas folhas durante o seu desenvolvimento so

transferidos durante a senescncia deste tecido, para os rgos reprodutivos ou em crescimento. A senescncia culmina com a morte foliar, no entanto esse estgio s atingido aps os processos da senescncia remobilizarem os nutrientes presentes para outras partes da planta. Na fase inicial da senescncia principia a hidrlise das protenas cloroplsticas e os aminocidos liberados podem ser exportados para as regies reprodutivas, como por exemplo, os gros em desenvolvimento. Os cloroplastos so desmontados no incio da senescncia, enquanto as mitocndrias permanecem funcionais. A perda da atividade fotossinttica acontece em paralelo degradao de protenas e RNA mensageiros, enquanto N, fsforo (P) e outros nutrientes so transferidos das folhas (BuchananWollaston et al., 2003). A remobilizao de N, P, K (potssio) em folhas de Arabidopsis foi de 80% durante a senescncia (Himmelblau e Amasino, 2001). Em plantas C3 mais de 75% do nitrognio celular total est localizado nos cloroplastos foliares (Peoples e Dalling, 1988). As principais substncias cloroplsticas que contribuem para a perda total de protenas foliares durante a senescncia so a Rubisco e o Complexo coletor de luz pertencente ao fotossistema II (Matile et al., 1997). O complexo coletor de luz faz parte das membranas tilacides e formado de protenas e pigmentos, principalmente clorofilas. A degradao, nos cloroplastos, das protenas das membranas tilacides associadas s clorofilas requer o simultneo catabolismo das clorofilas. A desmontagem dos complexos pigmentos-protenas causa a liberao de clorofilas que so potencialmente perigosas, pois podem causar danos foto-oxidativos. As clorofilas devem ento ser degradadas at formas no reativas atravs de pelo menos cinco reaes enzimticas (Hstensteiner e Feller, 2002). Os produtos finais do catabolismo das clorofilas, denominados catablitos de clorofila nofluorescentes, so depositados nos vacolos, sem que ocorra a remobilizao do N presente nessas molculas (Hinder et al., 1996; Tommasini et al., 1998). Para cada molcula de clorofila quatro moles de N no so reciclados durante a senescncia.

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Portanto, o N das clorofilas no exportado das folhas senescentes, permanecendo nas clulas na forma de catablitos tetrapirrlicos lineares que so produzidos pela abertura do anel porfirnico decorrente da introduo de oxignio por uma oxigenase. Esses derivados tetrapirrlicos so ento transportados ativamente atravs de carreadores do tonoplasto e acumulam no vacolo (Tommasini et al., 1998). Deste modo, a degradao das clorofilas no tem por objetivo mobilizar nutrientes, mas sim detoxificar os compostos de clorofila altamente reativos que so liberados dos complexos protenas-pigmentos constituintes das membranas tilacides dos cloroplastos. Durante a senescncia as enzimas envolvidas na assimilao de N e C so degradadas e os aminocidos derivados de seu catabolismo so exportados via floema com ou sem modificaes. A atividade das enzimas envolvidas no metabolismo do nitrognio diminui durante a senescncia da planta. Em geral, a atividade da nitrato redutase (NR) perdida primeiro, enquanto que a glutamina sintetase (GS), a glutamato sintase (GOGAT) e a Glutamato desidrogenase (GDH) permanecem ativas por um perodo mais longo (Storey e Beevers, 1978). A degradao da Rubisco rpida e serve como fonte de N para o desenvolvimento dos gros (Mae et al., 1983; 1985; Makino et al., 1984). Em plantas C3, como o arroz, a Rubisco contribui com cerca de 50% do total de protena solvel das folhas (Feller, 1990). No processo de remobilizao de N, durante a senescncia, quando as protenas foliares so degradadas o N liberado na forma de amnio reassimilado e convertido principalmente nas amidas glutamina e asparagina, que so translocadas para os rgos em desenvolvimento (Ghosh et al., 1995; Nakasathien et al., 2000). Apesar do glutamato ser o aminocido presente em maior proporo nas folhas de arroz, durante a senescncia o teor de glutamato diminui acentuadamente e os nveis de sua amida, a glutamina, aumentam (Kamachi et al., 1991). Segundo Hayashi e Chino (1990) a glutamina contribui com 42% do total de aminocidos presente na seiva do floema de arroz, tornando-se o principal aminocido de transporte durante o desenvolvimento dos gros. A glutamina sintetase (GS) a mais provvel enzima para a formao de glutamina, nos tecidos senescentes (Miflin e Lea, 1977; Oaks e Hirel, 1985). No entanto, como acontece com a RUBISCO, a atividade da GS tambm diminui durante o perodo reprodutivo (Simpson e Dalling, 1985; Hayashi e Chino, 1990; Kamachi, et al., 1991; 1992; Souza et al., 1999). Entretanto, como a GS no tecido vegetal est presente em pelo menos duas isoformas: a GS1 localizada no citossol e a GS2 localizada no cloroplasto (Oaks e Hirel, 1985), a queda na atividade da GS observada durante a senescncia, pode ser atribuda diminuio da isoforma GS2, que como outras protenas cloroplsticas, sofre hidrlise preferencial durante este perodo. Em 35

cloroplastos isolados observou-se que a GS2 mais suscetvel hidrlise e degrada mais rapidamente de que a RUBISCO e outras enzimas de assimilao de C (Mitsuhashi e Feller, 1992; Thoenen e Feller, 1998). A GS1 citosslica, por sua vez, se mantm constante e pode at aumentar ligeiramente durante a senescncia (Makino et al., 1983; Kamachi et al., 1991; 1992). A GS1 converte glutamato em glutamina aumentando assim a eficincia de transporte de N, pois a glutamina carreia dois nitrognios por cinco carbonos. Em folhas de arroz senescente observa-se que a GS citosslica est predominantemente localizada nas bainhas vasculares (Sakurai et al., 1996) indicando seu estreito papel para a formao de compostos para o transporte de N. Yamaya et al. (2002) detectaram imunocitologicamente protena GS1 citosslica em folhas senescentes de arroz, especificamente em clulas companheiras importantes para o carregamento do floema. Estes resultados contribuem para caracterizar a importncia da GS1 para a formao de compostos de N a serem exportados das folhas senescentes. Segundo pode ser a responsvel pela converso de glutamato e NH4+ em glutamina. Portanto, a GS1 das folhas senescentes seria a enzima responsvel pela sntese de glutamina, que por sua vez seria ento Buchanan-Wollaston e Ainsworth (1997), a GS1 citosslica est envolvida na remobilizao de compostos nitrogenados, pois a expresso de genes que codificam para a GS1 aumenta durante a senescncia. Entretanto, pode haver controle ps-traducional da GS1 por fosforilao, o que protege a enzima da degradao, e tambm podem ocorrer interaes com protenas 14-3-3 que aumentam a atividade da GS1 (Finnemann e Schoerring, 2000). Enquanto a GS1 citosslica permanece ativa por mais tempo a GS2 plastidial perdida nas folhas de cereais na fase inicial da senescncia juntamente com outras protenas cloroplsticas. Desta maneira, durante o perodo reprodutivo, apesar da atividade da GS total (GS1 + GS2) diminuir, a atividade da GS1 remanescente transferida para os tecidos em crescimento. A GS1 citosslica nestas circunstncias envolvida na formao de compostos de transporte, a partir do catabolismo de protenas. Como ocorre progressiva deteriorao das funes do cloroplasto durante a senescncia e as enzimas cloroplsticas como RUBISCO, GS cloroplstica e Fd-GOGAT tambm so degradadas, parece lgico que o glutamato deixe de ser o principal aminocido de transporte e essa posio passe glutamina. A glutamina pode transportar mais N, por unidade de C do que o glutamato. Esta modificao no metabolismo benfica no perodo da senescncia, quando a taxa fotossinttica est declinando e a produo de esqueletos de carbono limitada. Isto pode acionar outras enzimas, como a glutamato desidrogenase, para que, atravs de sua funo de desaminao possa suprir, em parte, esta demanda por esqueletos de carbono (Thomas, 1978; Robinson et al., 1990, 1992).

36

Durante esses processos tem sido observado aumento da atividade da GS1 citosslica, NADH-GOGAT e GDH, o que sugere a participao dessas isoenzimas na remobilizao do nitrognio (Hirel, et al. 2001; Lea et al., 1990; Stewart et al., 1980). Alta atividade de GDH est freqentemente, presente nas razes e folhas senescentes (Srivastava e Singh, 1987; Smirnoff e Stewart, 1987).

8.2

Enchimento dos Gros Durante o enchimento dos gros, h duas fontes de N para a planta: o N absorvido do solo e

o N remobilizado dos tecidos vegetativos (Ta e Weiland, 1992). Inicialmente o N mobilizado das folhas e caules como parte do processo de envelhecimento (senescncia), mas o N disponvel no solo tambm absorvido. No entanto se esses dois processos so incapazes de sustentar a demanda de N dos gros, ento ocorre uma acelerao no processo de senescncia com aumento da remobilizao do N das folhas e em menor extenso do caule (Borrel e Hammer, 2000). Durante a fase de enchimento dos gros, os fotossntetatos produzidos so canalizados primariamente para as sementes em desenvolvimento, sendo o suprimento via razes limitado. Ta e Weiland (1992) usando 15N para medir a taxa de remobilizao de N, sob condies de campo, em milho, observaram que as folhas e caules forneceram cerca de 45% do N remobilizado durante o enchimento dos gros, enquanto as razes contriburam com cerca de 10%. Portanto, os nutrientes absorvidos atravs das razes no so suficientes para suprir as necessidades de desenvolvimento dos gros, os nutrientes so ento translocados das folhas para os rgos em desenvolvimento, ocorrendo a senescncia rpida das folhas. Desta forma, a reposio de nutrientes poderia manter a taxa de fotossntese por um tempo maior, e se refletir em aumento da produo de gros. A manuteno do metabolismo das folhas parece importante para garantir o melhor desenvolvimento dos gros. Del Molino et al. (1989) observaram em trigo, que aps a antese, os gros so o principal dreno para o N das folhas, portanto a senescncia foliar que ocorre durante o enchimento do gro, tm grande importncia para a produo de gros e contedo de protena. Yang et al. (2000) observaram que fertilizao nitrogenada pesada atrasou a senescncia em trigo e resultou em lento enchimento do gro e baixo ndice de colheita. Esse atraso na senescncia pode ser revertido se as plantas forem submetidas durante o estgio tardio de enchimento dos gros a uma retirada controlada da umidade do solo, que promove assim a remobilizao de assimilados pr-armazenados para o enchimento dos gros e aumento da produo. 37

Sob condies de estresse abitico tais como seca e deficincia de N, a remobilizao dos tecidos vegetativos torna-se particularmente importante para o crescimento dos gros (Ta e Weiland, 1992). Desde que as folhas contribuem com a maior parte dos substratos nitrogenados para o desenvolvimento dos gros, o aumento na concentrao total de aminocidos foliares, particularmente glutamato, aspartato e suas amidas glutamina e asparagina pode ser o responsvel pelo aumento no contedo de protena nos gros de dois gentipos de soja que receberam 30 mM de N (Nakasathien et al., 2000). Barneiz e Guitman (1993) tambm observaram que a biossntese de protena em gros de trigo substrato-dependente da quantidade de aminocidos presente nas folhas e que o aumento nos teores de aminocidos foliares poderia intensificar a exportao de aminocidos para os gros. Segundo Masclaux et al (2000) a taxa de senescncia e remobilizao foliar est relacionada ao status de N e relao fonte-dreno. Em trabalho com arroz, Souza et al. (1998) observaram que a taxa diria de perda de N entre a antese e a coleta final da parte area de uma variedade tradicional Piau (9,94 mg N/dia) foi cerca de duas vezes maior do que a de uma variedade melhorada IAC-47 (4,66 mg N/dia). Para a variedade Piaui o N perdido da parte area correspondeu a 75% do Nacumulado nos gros e na IAC-47 a 42%. De acordo com estes resultados a variedade tradicional Piau apresenta maior eficincia de remobilizao do N acumulado na planta o que pode indicar um processo de adaptao a condies de disponibilidade sazonal de N, como acontece nos trpicos. As plantas de ambas as variedades quando receberam N suplementar durante o enchimento dos gros tiveram uma taxa diria de perda de N da parte area menor do que o das plantas sem suplementao nitrogenada, indicando que quando h uma fonte externa de N a planta utiliza menos de suas reservas vegetativas para o desenvolvimento dos gros.

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CAPTULO 10 POTSSIO
Egon Jos Meurer Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Faculdade de Agronomia, Departamento de Solos. Av. Bento Gonalves, 7712 Agronomia - 90001-970 - Porto Alegre, RS - Brasil Caixa-Postal: 776 - E-mail: egon.meurer@ufrgs.br

SUMRIO

1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5

POTSSIO ........................................................................................................... 2 Forma e modo como o nutriente est presente na rizosfera ................................. 3 Dinmica da interface solo-planta ........................................................................ 3 Liberao do potssio no trocvel por ao das razes ....................................... 7 Disponibilidade do potssio para as plantas na interface solo-planta .................. 8 Mecanismos de absoro do potssio................................................................. 10

1.5.1 O suprimento do potssio s razes..................................................................... 10 1.5.2 O influxo do potssio.......................................................................................... 13 1.5.3 Predio da absoro de potssio por modelos mecansticos............................. 17 1.6 1.7 1.8 2 Transporte e acmulo ......................................................................................... 19 Efeitos no crescimento........................................................................................ 21 Toxidez ............................................................................................................... 23 REFERENCIA BIBLIOGRFICA.................................................................... 25

POTSSIO

O potssio o ction mais abundante no vegetal sendo absorvido em grandes quantidades pelas razes. Tem importante funo no estado energtico da planta, na translocao e armazenamento de assimilados e na manuteno da gua nos tecidos vegetais. O potssio no faz parte de nenhuma estrutura ou molculas orgnicas na planta, como o nitrognio e fsforo que so constituintes de protenas, cidos nuclicos, fosfolipdios, ATP entre outros. O on K+ encontra-se predominantemente com ction livre ou como ction adsorvido e pode facilmente ser deslocado das clulas ou dos tecidos vegetais (Lindhauer, 1985). Esta alta mobilidade nas plantas explica as principais funes e caractersticas do K+ como o principal ction que atua na neutralizao de cargas e como o mais importantes e ativo componente inorgnico osmtico (Clarkson & Hanson, 1980). A alta concentrao do potssio no citoplasma e nos cloroplastos responsvel pela manuteno do pH das clulas e tecidos entre 7 e 8. Em plantas deficientes em potssio se o pH cai abaixo de 7 muitos processos na planta podero ser paralisados. O potssio atua em muitos processos fisiolgicos no vegetal (Marschner, 1995): ativa mais do que 60 sistemas enzimticos (sinteases, oxidoredutases, deidrogenases, transferases, kinases), atua na fotossntese, favorece um alto estado de energia (necessria para a produo da ATP), mantm o turgor das clulas, regula a abertura e fechamento dos estmatos, promove a absoro de gua, regula a translocao de nutrientes na planta, favorece o transporte e armazenamento de carboidratos, incrementa a absoro do nitrognio e a sntese de protenas, participa na sntese de amido nas folhas. 2

Estas mltiplas funes do potssio nos processos metablicos resultam em vrios efeitos positivos nas plantas quando h uma adequada nutrio do potssio (Imas, 1999): incremento no crescimento das razes, aumento da resistncia s secas, s baixas temperaturas, resistncia a pragas e molstias, resistncia ao acamamento das plantas e incremento na nodulao das leguminosas. A adequada nutrio do potssio promove, tambm, qualitativamente, incremento no teor de protena, de amido nos gros e tubrculos, na colorao e aroma dos frutos, no teor de vitamina C e de slidos solveis, na reduo de desordens fisiolgicas. Possibilita, tambm, perodos maiores de armazenamento de culturas como da banana, tomate, batata, cebola, e outras (Usherwood, 1985; Koo, 1985; Mengel, 1997).

1.1

Forma e modo como o nutriente est presente na rizosfera No solo e na regio da rizosfera (volume de solo compreendido numa distncia de

0,1 a 1,5 mm da raiz, em mdia) o potssio pode ser encontrado sob diferentes formas: como on livre (K+) na soluo do solo, adsorvido como complexo de esfera-externa nos minerais da argila e na matria orgnica do solo, como complexo de esfera-interna nas entrecamadas de minerais de argila e fazendo parte da estrutura de minerais primrios fontes de potssio (Sposito, 1984; Sparks & Huang, 1985).

1.2

Dinmica da interface solo-planta

O on potssio (K+) presente na soluo do solo a forma como as plantas absorvem esse nutriente. A quantidade de K+ na soluo necessria para o crescimento dos vegetais depende da espcie e do estdio de crescimento da planta. O teor do potssio na soluo do solo pode variar desde 1 mg L-1 at 50 mg L-1, ou mais, em solos fertilizados, e depende das caractersticas qumicas e mineralgicas dos solos. O on potssio em soluo e o potssio trocvel so, inicialmente, as formas do elemento prontamente disponveis para as plantas. Solos com alto teor de K-trocvel, pelo rpido equilbrio com o K-soluo, mantm um alto gradiente de concentrao, o que favorece a difuso do K+ para junto da superfcie radicular (item 9.3). A relao entre as quantidades do potssio na forma trocvel e o potssio na soluo (K-trocvel / K-soluo) denominada de poder tampo de potssio (PTK). uma relao simplificada que possibilita uma estimativa da quantidade de K-trocvel que necessria na fase slida do solo para manter determinada concentrao de potssio na soluo. No Quadro 9.1 so mostrados os teores de K-soluo e de K-trocvel em algumas unidades de solos da regio sul do Brasil.

Quadro 9.1 Teores de potssio trocvel e de potssio na soluo em solos do Estado do Rio Grande do Sul fertilizados com potssio ( Meurer, 1991). Solos K-trocvel mmoles L-1 solo Argissolo Vermelho Distrfico arnico Latossolo Vermelho Distrfico tpico Argissolo Vermelho-Amarelo alumnico tpico Latossolo Vermelho Distrfico tpico Argissolo Vermelho Distrfico tpico Latossolo Vermelho Auminofrrico tpico Latossolo Vermelho Distrofrrico tpico Latossolo Bruno Dlumnico cmbico Planossolo Hplico Eutrfico vrtico Chernossolo Ebnico Carbontico vrtico Vertissolo Ebnico rtico chernosslico 0,77 1,43 2,08 2,53 3,36 3,01 4,23 4,49 2,68 2,67 6,16 K-soluo mmoles L-1 soluo 2,38 0,62 0,31 0,56 0,54 0,20 0,24 0,43 0,38 0,40 0,35

O potssio trocvel, forma prontamente disponvel para as plantas, o que se encontra adsorvido na forma de complexo de esfera-externa na superficie siloxana de tetraedros de silcio) dos minerais de argila, na forma de enxame de ons difusveis neutralizando somente cargas superficiais em minerais silicatados do tipo 2:1, adsorvido como complexo de superfcie de esfera-externa nos grupos funcionais aluminol e silanol da caulinita e tambm como complexo de esfera-externa na matria orgnica do solo. O potssio no trocvel est quimiossorvido na forma de complexo de esfera-interna nas entrecamadas de argilominerais do tipo 2:1, como na vermiculita, por exemplo, e o que faz parte da estrutura dos minerais primrios, como os feldspatos de potssio, micas e outros

minerais fontes de potssio em solos ( Greenland & Mott, 1978; Sposito, 1984; Sposito, 1989). O potssio no trocvel poder estar disponvel para as plantas a curto, mdio e longo prazos. Diversos trabalhos tm mostrado que em solos intemperizados, como os brasileiros, o potssio nas formas no trocveis capazes de fornecer quantidades significativas desse nutriente para as plantas (Oliveira et al., 1971; Mielniczuk & Selbach, 1978, Rosolem et al., 1988; Nachtigall & Vahl, 1991a; Nachtigall & Vahl, 1991b; Rosolem et al., 1993; Silva & et al., 1995). No Quadro 9.2 so apresentados os resultados obtidos num desses trabalhos onde se evidencia que a maior parte do potssio absorvido pela cultura do azevm foi proveniente de formas no trocveis do potssio. Quadro 9.2 Formas e quantidade de potssio absorvido por azevm perene cultivado em solos do Estdio do Rio Grande do Sul (Oliveira et al., 1971) Solos Material origem Ktotal K absorvido pelo azevm (1) do K-trocvel do K- no Total trocvel 17 399 416 45 44 313 13 122 17 400 412 427 257 426 442 445 456 740 270 548 459

Latossolo Vermelho distrofrrico tpico Latossolo Vermelho distrofrrico tpico Latossolo Bruno alumnico cmbico Neossolo Litlico Eutrfico chernosslico Neossolo Quartzarnico rtico tpico Neossolo Flvico Argissolo Vermelho distrfico latosslico (1) em sete cortes

Basalto Basalto Basalto Basalto Sedimentos Costeiros Sedimentos Aluviais Arenitoargilito

1.960 4.560 2.600 6.400 2.080 12.000 14.200

Vrios estudos foram conduzidos para quantificar a liberao de potssio das fraes granulomtricas dos solos (K-no trocvel). Em solos arenosos Sadusky et al. (1987) e Parker et al. (1989) observaram que a frao areia de solos da plancie da costa atlntica dos Estados Unidos teve importncia na liberao de potssio para as plantas, tendo o nutriente sido liberado de feldspatos contidos nestes solos. Meurer et al. (1996) relatam que 76% do teor total de potssio de um Latossolo Vermelho Distrofrrico tpico do Estado do Rio Grande do Sul estava contido na frao argila; o teor de K-no trocvel correspondeu a 12% do K-total e se encontrava na quase totalidade (84%) na frao argila desse Latossolo. 1.3 Liberao do potssio no trocvel por ao das razes As razes pela absoro de nutrientes e liberao de exsudatos criam o seu redor uma rea (rizosfera) cujas caractersticas qumicas e biolgicas so bastante distintas da massa de solo distante da raiz (fora da rizosfera). A absoro pelas razes exaure o Ksoluo (Niebes et al., 1993) e o K-trocvel rizofrico (Kuchenbuch & Jungk, 1982), porm, sem alterar o teor de potssio do solo no rizosfrico. A exausto do potssio junto a superfcie radicular origina um gradiente de concentrao que provoca a liberao de Kno trocvel (Hinsinger et al., 1992; Hinsinger et al., 1993; Hinsinger & Jaillard, 1993), podendo induzir, inclusive, a transformao de minerais aps curtos perodos de cultivo. Kuchenbuch (1985) verificou que em solo deficiente em potssio o K-no trocvel contribuiu com 85% do total absorvido por plantas de colza com sete dias de idade e que a baixa concentrao de K+ na soluo do solo provocou liberao de potssio da mica presente na rizosfera do solo. Niebes et al. (1993) constataram que aps oito dias de cultivo, ocorreu acentuada diminuio do teor de potssio em fraes granulomtricas na rizosfera 7

de plantas de Brassica napus cv Drakkar. Hissinger et al. (1993) constataram que os exsudatos dessa mesma espcie induziram transformao irreversvel da mica flogopita em vermiculita. Segundo os autores, o provvel mecanismo que induziu a transformao foi a excreo de prtons que diminuiu o pH da rizosfera causando a dissoluo do mineral. Silva et al., (1995) em dois Latossolos do Estado do Paran constataram que o potssio trocvel no foi a nica fonte do nutriente para as plantas de soja. Nos dois Latossolos identificaram minerais micceos nas fraes silte e argila e argilominerais 2:1HE na frao argila que poderiam estar associados a liberao do K-no trocvel. Melo et al. (2004) estudando a distribuio da reserva de K e Mg nas diferentes classes da frao areia de solos do Tringulo Mineiro e o potencial de liberao de formas no-trocveis e estruturais destes nutrientes para as plantas, verificaram que solos com teores totais elevados de K e Mg na frao areia, geralmente, apresentaram maior capacidade de liberao de parte desses nutrientes para a soluo do solo. A frao areia dos solos originados de arenito da Formao Uberaba e de migmatito/micaxisto do Grupo Arax apresentaram as maiores reservas e liberao de K e Mg. Kuchenbuch (1985) afirmou que a contribuio do K-no trocvel no suprimento do nutriente s razes a freqente razo das relaes pouco significativas encontradas entre os resultados das anlises convencionais de solo e o rendimento das plantas e entre estas e as adubaes potssicas.

1.4

Disponibilidade do potssio para as plantas na interface solo-planta No Brasil o potssio extravel (K-trocvel + K-soluo) pelas solues de Mehlich 1

(HCl 0,05 mol L-1 + H2SO4 0,0125 mol L-1) ou por acetato de amnio 1 mol L-1 tamponado a pH 7, so os ndices mais utilizados pelos laboratrios de anlises de solos para avaliar a

disponibilidade deste nutriente para as plantas. Como a dinmica de disponibilidade do potssio na rizosfera bem diferente daquela que ocorre no solo como um todo, o ndice Kextravel, isoladamente, no tem se mostrado adequado para estimar a disponibilidade deste nutriente para as plantas (Grimme & Nemeth, 1979; Ritchey, 1982). o que confirmam as pesquisas de Silva & Meurer (1988) e de Meurer & Anghinoni (1993) em solos com diferentes caractersticas mineralgicas, qumicas e fsicas, derivados de argilito, siltito, arenito, basalto e granito. Os resultados destes trabalhos mostraram que o K-trocvel somente em 59% e 52% dos casos se relacionou com o potssio absorvido por plantas de trigo e de sorgo, respectivamente (Figura 9.1). Silva & Meurer (1988) e Meurer &

Anghinoni (1993) tambm constataram que a predio da disponibilidade do potssio para as plantas pde ser significativamente melhorada pela discriminao dos solos segundo sua capacidade de troca de ctions (CTC). Este procedimento j foi adotado nas recomendaes de adubao potssica para solos do Cerrado brasileiro (Sousa & Lobato, 2002 e para solos dos Estados de Santa Catarina e Rio Grande do Sul (Sociedade, 2004). A avaliao da capacidade de suprimento das formas do potssio no trocvel para as plantas tem sido feita com a utilizao do HNO3 1mol L-1 fervente (Pratt, 1973), H2SO4 concentrado (Hunter & Pratt, 1957) e pelo tetrafenilborato de sdio (Shulte & Corey, 1965) ou por cultivos sucessivos (Oliveira et al., 1971; Crisostomo e Castro, 1970; Mielnizcuk & Selbach, 1978). Nachtigal & Vahl (1991a), em pesquisa com 44 amostras de solos da regio sul do Estado do Rio Grande do Sul, encontraram que a capacidade de suprimento de potssio dos solos, medida pela extrao do K em cultivos sucessivos, correlacionou-se significativamente com o K extravel pelo do HNO3 1mol L-1 fervente e com o K-trocvel.

POTSSIO ABSORVIDO, mmol vaso-1

5
Y = 0,27 + 0,58 Ktroc

4 3 2 1 0 0

R2 = 0,518

4
-1

POTSSIO TROCVEL, mmol L

Figura 9.1 Relao entre o potssio extrado por acetato de amnio 1 mol L-1 e o potssio absorvido por plantas de sorgo aos 18 dias de idade em onze amostras de solos do Estado do Rio Grande do Sul, derivados de argilito, siltito, arenito, basalto e granito, fertilizados com oito nveis de potssio (Meurer & Anghinoni, 1993). 1.5 1.5.1 Mecanismos de absoro do potssio O suprimento do potssio s razes As plantas absorvem o on K+ da soluo do solo e para que a absoro efetivamente ocorra necessrio que o nutriente entre em ntimo contato com a superfcie da raiz. A difuso e o fluxo de massa so os principais mecanismos de transporte O

(suprimento) do K+ da soluo do solo at a superfcie radicular (Barber, 1995).

suprimento por fluxo de massa depende da quantidade de gua transpirada pela planta e do teor do K+ na soluo do solo. A difuso, que o principal mecanismo de suprimento do potssio s razes, ocorre em resposta a um gradiente resultante das diferenas de concentrao do K+ entre a superfcie da raiz e a rizosfera. A difuso do potssio para as razes limitada rizosfera, isto , distncias muito curtas da superfcie da raiz, usualmente em torno de 1 a 4 mm. 10

Vargas et al. (1983) verificaram, em amostras de 12 unidades de solos com diferentes caractersticas qumicas, fsicas e mineralgicas, que o mecanismo de difuso supriu, na mdia, cerca de 90% da quantidade do potssio que foi absorvido por plantas de milho. Ruiz et al., (1999) e Rosolem et al. (2003) tambm constataram que a difuso foi o principal mecanismo de suprimento de potssio s razes de milheto e de plantas de arroz, respectivamente. A equao (simplificada) a seguir descreve a quantidade de nutriente que chega superfcie radicular (Corey & Schulte, 1993; Anghinoni & Meurer, 2004):

dq / dt = D 2 A f [(C1 C2) / L] onde: dq / dt D a quantidade do nutriente que chega superfcie radicular na unidade de tempo (segundo), coeficiente de difuso do nutriente na gua; para o on K o valor de D de aproximadamente 1,98 x 10-5 cm2 s-1, 2 f teor de gua volumtrica do solo fator tortuosidade; o caminho efetivo que o on deve percorrer no solo at alcanar a superfcie da raiz. Est relacionado textura: em solos muito argilosos, por exemplo, o caminho do on at a superfcie da raiz mais tortuoso. Afeta o fator L descrito abaixo. A C1 C2 L rea superficial das razes concentrao do nutriente na soluo do solo a uma distncia L da raiz, concentrao do nutriente na superfcie da raz, distncia entre C1 e C2 que pode variar de 0,4 a 4,0 mm,

11

Esta equao mostra que a quantidade do on que chega superfcie da raiz depende do coeficiente de difuso desse on no solo, da tortuosidade do caminho difusivo, do teor de gua volumtrica no solo, da rea superficial das razes e do gradiente de concentrao. O fator A, rea superficial das razes, alm de depender das caractersticas fsicas e qumicas do solo, dependente de caractersticas da prpria planta. Plantas que apresentam sistema radicular extenso, com muitas razes finas, possuem uma grande rea radicular (A) para a absoro dos nutrientes. Qualquer fator que impea o desenvolvimento das razes, como a presena de substncias txicas, como o alumnio livre na soluo do solo, deficincia de oxignio, compactao do solo, necessariamente diminuir a taxa de difuso de nutrientes at s razes (Corey & Shulte, 1993). Solos que mantm um gradiente de concentrao (C2 C1) alto podem suprir maior quantidade do nutriente por difuso. Quanto maior for a concentrao do nutriente na soluo solo e maior a capacidade da planta de absorv-lo, mantendo baixa a concentrao na superfcie da raiz, maior ser a taxa de difuso (Barber, 1995). A aplicao direta a campo da equao que descreve a quantidade de nutriente que chega superfcie radicular pode apresentar alguma dificuldade para determinao de algumas variveis da equao. Entretanto pode-se observar ou inferir o efeito de alguns atributos e propriedades dos solos que podem afetar a absoro dos nutrientes. Por

exemplo, solos argilosos possuem maior capacidade de reter a gua (fator 2) do que solos arenosos, o que favorece a difuso dos nutrientes. Solos que apresentam propriedades fsicas que no apresentem impedimentos mecnicos para o desenvolvimento do sistema radicular, aumentam o termo A, o que favorece a absoro dos elementos nutrientes das plantas.

12

1.5.2

O influxo do potssio A taxa de absoro do potssio pela planta por unidade de superfcie radicular

denominada de influxo de entrada de potssio (In). O influxo de entrada aumenta com a concentrao do K na soluo do solo at que um mximo alcanado (Barber, 1982; Barber, 1995). Na Figura 9.2 mostra-se a relao entre o influxo de entrada e a concentrao de K em soluo em plantas de sorgo aos 18 dias de idade.

-2 -1 INFLUXO DE K, umol cm raiz s x 10E-05

1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 50

I max

Imax = 1,59E-05 umol L-1 Km = 12,07 umol L-1

Km

Cmin = 1,02 umol L-1

100

150 -1

200

K SOLUO, mmoles L

Figura 9.2. Influxo de potssio por plantas de sorgo aos 18 dias de idade em funo da concentrao de potssio na soluo, descrita pela cintica de Michaelis-Menten (Meurer &Anghinoni, 1999)

Barber (1995) prefere usar o ndice Imax, ao invs de Vmax (parmetro original da cintica enzimtica), para descrever o influxo de nutrientes nas razes das plantas, onde foi acrescentado o parmetro Cmin equao de Michaelis-Menten para caracterizar a

13

concentrao do nutriente na soluo externa onde o influxo liquido torna-se zero (In = 0). Assim, o influxo liquido (In) do on descrito por (Barber, 1995):

In

Imax ( C1 Cmin ) Km ( C1 Cmin )

Onde: In I max C C min cessa Km constante de Michaelis-Menten correponde ao valor de C quando I = Imax. Km representa a afinidade (associao) do on pelos transportadores (carregadores) atravs da membrana plasmtica. Quanto menor o valor de Km, maior a afinidade do carregador pelo on. No modelo cooperativo proposto por Hodges (1973), para explicar a dinmica da absoro, o carregador de ons consiste de vrias subunidades e existe uma interao entre estas sub-unidades que responsvel pelo decrscimo da afinidade pelos ons quando a concentrao da soluo externa aumenta. O modelo tambm sugere que a variao do campo eltrico dos stios de ligao dos carregadores a responsvel pela seletividade da absoro de ons pela raz. A respirao aerbica fornece a energia necessria para a absoro dos ons pela raiz e a ATP parece ser a fonte primria de energia para a absoro. Estudos recentes no campo do transporte de solutos atravs da membrana plasmtica demonstraram a existncia de canais, como uma descoberta revolucionria nesse campo 14 fluxo de entrada do potssio valor mximo do influxo concentrao do potssio na soluo concentrao do potssio na souo abaixo da qual o fluxo

(Schauf, 1987).

Nissen (1991) sugere que o transporte dos ons seria feito por

transportadores que apresentam a capacidade de adquirirem formas variadas. Nessa estrutura, h um stio de transio que fica exposto somente na parte externa do transportador e, por conseguinte, em contato com a soluo externa. Esse sensor seria o responsvel por induzir as mudanas conformacionais da estrutura protica transportadora. Sob baixas concentraes, o transportador apresenta forma de transporte individual, de alta afinidade. Em condies de altas concentraes a estrutura transportadora adquire forma de canal, adquirindo caractersticas de alto influxo e baixa afinidade e seletividade. Os valores de Imax, Km e Cmin so determinados experimentalmente com plantas crescendo em soluo nutritiva, determinando-se a cintica de absoro pela taxa de exausto da soluo em relao a sua concentrao inicial de potssio Esses ndices caracterizam os parmetros cinticos de absoro dos nutrientes e variam acentuadamente entre espcies, e mesmo, entre gentipos da mesma espcie, e esto associados eficincia da absoro. Os programas de melhoramento devem selecionar espcies ou gentipos que apresentem valores elevados para Imax e valores baixos para Km e Cmin. Fatores inerentes prpria planta, como idade da raz, idade da planta, fatores de natureza qumica e fsica, como interaes ou antagonismo entre ons, teor de oxignio na rizosfera, temperatura, entre outros, podem afetar significativamente a absoro do potssio pelas razes das plantas. As plantas mais jovens so mais eficientes do que as mais velhas para absorver os nutrientes (Becker & Meurer, 1986). As taxas de absoro para todos os nutrientes decrescem rapidamente com a idade da planta. Assim, razes jovens numa planta mais velha no absorvem os nutrientes na mesma taxa que razes jovens numa planta jovem. A idade da raiz, ou o perodo que permanecem ativas tambm afeta o influxo dos ons. A idade da raiz aumenta com o seu crescimento, assim, nas extremidades das razes 15

que se localizam as clulas mais jovens. Diversos autores tentaram estimar a idade efetiva da raiz, isto o tempo que permanecem ativas para a absoro. Em geral os estudos realizados indicam que possivelmente a raz permanece ativa por 5 a 8 dias (Barber, 1995). Nos Quadros 9.3 e 9.4 pode ser observado como a presena de outros nutrientes na soluo, as diferenas na capacidade de absoro entre gentipos e a idade da plantas, afetam o influxo de potssio pelas plantas.

Quadro 9.3 Prametros cinticos de absoro de potssio por dois gentipos de arroz
submetidos a trs tratamentos: A) soluo nutritiva normal; B) soluo normal + 100 mg L-1 de Fe2+ e C) soluo com 100 mg L-1 de Fe2+ e baixas concentraes de Ca e Mg (Vahl et al., 1993) Gentipo Tratamento Imax
0moles min-1 m-1 de raiz

Km

Cmin

:moles L-1 de soluo


9,28 14,67 20,50 8,64 21,20 27,10 4,16 1,18 4,48 7,84 1,68 11,92 17,50 7,47

A EEA 406 B C A BR IRGA 409 B C DMS 5%

1,29 0,80 0,68 0,78 0,45 0,30 0,50

16

Quadro 9.4 Parmetros cinticos de absoro de K+, de quatro cultivares de soja


submetidos a dois nveis do nutriente na soluo de crescimento, aos 20, 40 e 60 dias aps a transferncia para a soluo de crescimento (Sacramento e Rosolem, 1998)

Nveis de K (mmol L-1) Cultivares 1,82


Vmax

0,50

1,82
Km

0,50 mol L-1

1,82
Cmin

0,50

mol g-1 h-1


20 dias IAC 17 IAC 18 FT 2 IAC 11 IAC 17 IAC 18 FT 2 IAC 11 IAC 17 IAC 18 FT 2 IAC 11 170,70 165,52 42,56 240,42 6,19 9,75 30,06 10,01 9,97 4,94 11,25 7,37 62,76 57,46 112,93 64,06 22,57 20,04 27,71 31,71 20,52 9,59 32,35 15,58 117,03 140,60 94,11 136,69 40 dias 79,26 149,97 129,70 136,33 60 dias 103,14 128,78 134,15 104,94

20,64 18,18 21,80 19,39 35,07 53,74 29,70 58,95 71,84 39,73 40,09 36,75

29,68 63,53 24,41 28,59 32,97 69,53 21,72 102,02 14,70 24,70 34,36 35,70

3,66 3,66 4,33 4,67 2,10 2,99 1,71 2,55 1,65 1,65 1,65 1,65

1.5.3

Predio da absoro de potssio por modelos mecansticos


A absoro dos nutrientes funo da demanda pela planta e da capacidade de

suprimento do solo. Diversos modelos matemticos foram desenvolvidos com o objetivo de 17

simular a interao dinmica entre estes dois processos e so baseados essencialmente nos mesmos princpios. Os modelos predizem a absoro integrando o suprimento potencial do solo por difuso e fluxo de massa com o tamanho, morfologia e taxa de crescimento do sistema radicular e com a cintica de absoro do nutriente pela raiz. Quando o modelo descreve adequadamente a absoro ele pode ser utilizado para determinar o importncia relativa de cada parmetro na absoro, o que pode proporcionar um entendimento mais fundamental da dinmica de disponibilidade dos nutrientes no solo e dos fatores que a afetam (Barber, 1995). Meurer & Anghinoni (1994) utilizaram o modelo mecanstico desenvolvido por Barber & Cushman (1981) para avaliar a disponibilidade de potssio em oito solos com diferentes caractersticas mineralgicas e difusivas e submetidos a diferentes doses de adubao potssica. O modelo estimou satisfatoriamente a absoro do potssio, nesses solos para plantas de sorgo (Figura 9.3). O modelo subestimou a absoro em situaes em que ocorreu liberao de potssio de formas no trocveis. Mas foi muito mais eficaz que na situao em que a predio da disponibilidade do potssio para as plantas foi realizada utilizando-se somente o ndice K-trocvel como apresentado na Figura 9.1. O modelo foi til para efetivao de testes de sensibilidade como parmetros de solo (concentrao inicial de K na soluo, poder tampo e coeficiente de difuso de potssio no solo), morfolgicos de raiz da planta (raio mdio das razes, meia-distncia entre elas, comprimento inicial e taxa de crescimento e taxa de absoro de gua) e de solo (Imax, Km, Cmin) podem afetar a absoro do potssio. Os resultados mostraram que entre os parmetros de solo testados os que mais afetaram a absoro do K foram o teor de gua volumtrica e o teor inicial de potssio na soluo do solo; dos parmetros morfolgicos de

18

planta o que mais afetou a absoro foi a taxa de crescimento das razes, que afeta diretamente a rea efetiva para a absoro.

ABSORO PREDITA, mmoles vaso

-1

4 Y = 0,083 + 0,874 X 2 R = 0,800 3

0 0 1 2 3 4

POTSSIO ABSORVIDO, mmol vaso-1

Figura 9.3 Relao entre o potssio absorvido por plantas de sorgo aos 18 dias de idade e a
absoro predita pelo modelo de Barber-Cushman, em oito amostras de solos do Estado do Rio Grande do Sul com diferentes caractersticas mineralgicas e difusivas (Meurer & Anghinoni, 1994).

1.6

Transporte e acmulo
O potssio um elemento muito mvel na planta; tem alta mobilidade intracelular e

nos tecidos, translocando-se dos mais velhos para os mais novos, e no transporte longa distncia via xilema e floema. O potssio participa ou ativa processos em diversos compartimentos da planta. Est presente em altas concentraes no citossol e cloroplastos (100-200 mM), neutralizando nions solveis de cidos orgnicos e inorgnicos, nions insolveis e estabilizando o pH entre 7-8 nesses compartimentos, considerado como timo

19

para muitas reaes enzimticas. Em outros compartimentos as concentraes do K+ so variveis, como nos vacolos e clulas guardas dos estomatos. A concentrao do potssio no floema tambm alta; como os solutos no floema podem ser transportados para as partes superiores e inferiores da plantas, o transporte do K+ longa distncia na planta ocorre com facilidade. Os rgos das plantas preferencialmente supridos pelo floema so as folhas novas, os tecidos meristemticos e os frutos frescos, e, que apresentam, assim, alta concentrao em potssio (Mengel & Kirkby, 1987; Marschner, 1995). Nos estgios

iniciais de crescimento das plantas os teores de potssio nas plantas so mais elevados (Quadro 9.5), decrescendo nos estdios mais avanados devido a menor atividade da raiz e ao menor nvel do elemento metabolicamente absorvido ( Fageria, 1982)

Quadro 9.5 Teores de potssio na planta de arroz durante vrios estgios de crescimento
(Fageria, 1982)

Estdio de crescimento
inicio do perfilhamento perfilhamento ativo formao do primrdio floral diferenciao da pancula elongamento da pancula (emborrachamento) enchimento do gro colheita 1,79 2,00 3,50 3,21 2,67 2,48 2,10

Teor de K % Arroz de sequeiro Arroz irrigado


2,74 2,18 2,20 1,78 1,53 1,40 2,21

As necessidade de potssio para o timo crescimento das plantas situam-se na faixa de 2-5% da massa seca das partes vegetativas da planta, frutas frescas e tubrculos. 20

Entretanto, as plantas tm a capacidade de absorver quantidades de potssio superiores s suas necessidades, o que comumente denominado de consumo de luxo de potssio. O primeiro sintoma visvel de deficincia de potssio nas plantas a clorose em manchas ou marginal, que, ento evolui para necrose, principalmente nos pices foliares, nas margens e entre nervuras. Em muitas monocotildneas, essas leses necrticas podem formar-se inicialmente nos pices foliares e margens, e, ento, estender-se em direo a base. Como o potssio pode ser remobilizado para as folhas mais jovens, os sintomas de deficincia aparecem inicialmente nas folhas mais maduras da base da planta. As folhas podem tambm, curvar-se e secar. Os caules de plantas deficientes em potssio podem ser delgados e fracos, com regies internodais anormalmente curtas (Taiz & Zeiger, 2004).

1.7

Efeitos no crescimento
O potssio elemento essencial para o crescimento, desenvolvimento e maturao

dos gros e frutos dos vegetais. Quando os solos apresentam baixos teores do nutriente as plantas respondem adubao potssica. Pesquisas realizadas em solos brasileiros no tm apresentado acentuadas respostas fertilizao com esse nutriente. Isso deve-se, provavelmente, a fatores como teores de potssio prontamente disponveis s plantas em quantidades adequadas no solo, a presena de minerais fontes de potssio, contribuio de formas no trocveis do elemento, entre outros. No Quadro 9.6 apresenta-se a resposta de plantas de soja doses crescentes de potssio em solos do Estado de So Paulo, onde podese observar que embora tenha havido resposta da cultura ao potssio, os incrementos no

21

so notveis. Resultados semelhantes so relatados em diversos trabalhos conduzidos em solos brasileiros ( Muzilli, 1982).

Quadro 9.6 Efeitos de doses crescentes de potssio na cultura da soja, em 41 ensaios


instalados em Latossolo Roxo no Estado de So Paulo, agrupados segundo o uso anterior (Miyasaka et al., 1970).

Agrupamento segundo uso da rea Doses de K2O kg ha-1


0 30 60 90 1.743 1.883 1.875 1.883

adubada
(%) ( 92) (100) ( 99) (100)

nunca adubada
(%) 1.553 1.689 1.717 1.777 (87) (95) (100) (100)

rendimento de soja kg ha-1

Em solos cultivados com arroz irrigado por alagamento no Estado do Rio Grande do Sul esta cultura apresenta alta produtividade. Entretanto, na maior parte dos experimentos realizados no se obteve resposta adubao potssica, mesmo quando as anlises dos solos indicavam baixos teores de potssio prontamente disponveis nesses solos. Pesquisas conduzidas por Castilhos &Meurer (2001), Castilhos &Meurer (2002), e por Castilhos et al., (2002), mostraram que a principal razo da ausncia de reposta adubao potssica foi a presena de minerais fontes de potssio nesses solos.

22

1.8

Toxidez
No se tem conhecimento de toxidez de potssio em plantas, apesar deste nutriente

ser absorvido por muitas espcies em quantidades superiores s necessrias (consumo de luxo). Entretanto o excesso de potssio pode interferir, positiva ou negativamente, na absoro de outros ctions pelos vegetais, considerando que a taxa de absoro de um on pode ser afetada por outro on, desde que estejam competindo diretamente pelo mesmo stio no carregador. O teor de potssio na planta aumenta a taxa de absoro de nitrato, e pode inibir as de clcio e magnsio (Marschner, 1995). Duarte & Anderson (1983) relatam que o K inibiu a atividade de bactrias anaerbias utilizadas em processos de degradao anaerbica de efluentes de esgotos. Um exemplo clssico de antagonismo entre ons o efeito depressivo do potssio sobre o magnsio. O incremento da concentrao do potssio na soluo tem um efeito depressivo na absoro do magnsio, enquanto o inverso no ocorre (Fonseca & Meurer, 1997). Na figura 9.3 observa-se que a absoro do magnsio da soluo por plantas de milho aos 18 dias de idade, foi muito baixa, mesmo quando a concentrao de potssio na soluo foi baixa. A absoro do magnsio efetivamente passou a ocorrer quando a concentrao do potssio na soluo foi igual ao Cmin para este nutriente. Observa-se, tambm na Figura 9.3, que concentraes maiores do que 30 moles L-1 de magnsio na soluo no afetaram a absoro do potssio pelas plantas de milho.

23

200 K NA SOLUO EXTERNA, mmol m-3

40 Mg NA SOLUO EXTERNA, mol m-3

160 Mg 120

32

24

80 K 40

16

0 0 50 100 150 200 250

0 300

TEMPO, minutos

Figura 9.4. Exausto de potsssio e de magnsio da soluo por plantas de milho aos 18
dias de idade (Fonseca & Meurer, 1997).

Indiretamente o potssio pode ter um efeito prejudicial sobre as plantas. Silva et al., (2001) relatam que a aplicao de potssio afetou o crescimento radicular de Capsicum

annuum, devido ao efeito salino do KCl sobre as razes. O fertilizante comercial mais
utilizado para suprir as plantas o KCl que alm do elevado teor de K (50-52% de K), contm tambm cloro (47%), que tambm nutriente das plantas (Tisdale et al., 1993). Porm, a aplicao de altas doses de KCl podem afetar o crescimento das plantas por toxicidade do cloro. O fertilizante KCl no recomendado para a cultura do tabaco, que apresenta alta suscetibilidade ao Cl- ; igualmente, deve ser evitado na fertilizao de culturas como a da batatinha, batata-doce e citrus que tambm so suscetveis ao cloro.

24

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CAPTULO 11
FSFORO Adelson Paulo Arajo(1) & Cynthia Torres de Toledo Machado(2) (1) Professor do Departamento de Solos, UFRRJ, CEP 23890-000, Seropdica, RJ. (2) Pesquisadora da Embrapa Cerrados, Caixa Postal 08223, CEP 73310-970, Planaltina, DF.

SUMRIO 1 Introduo................................................................................................................................. 2 1.1 1.2 2 Formas de fsforo no solo................................................................................................. 2 Absoro de fsforo pela membrana celular..................................................................... 3

Caracteres radiculares associados absoro de fsforo ......................................................... 7 2.1 Controle metablico da absoro de fsforo................................................................... 11

Associaes com microrganismos ......................................................................................... 14 3.1 3.2 3.3 3.4 Mudanas na rizosfera..................................................................................................... 17 Formas de fsforo na planta............................................................................................ 18 Transporte de fsforo na planta....................................................................................... 21 Interaes do fsforo com outros nutrientes ................................................................... 24 3.4.1
3.4.2

A interao entre fsforo e nitrognio ............................................................... 24 O fsforo e a fixao biolgica de N2 ................................................................ 26

3.5 4 5

A interao entre fsforo e zinco .................................................................................... 27

Efeitos do fsforo no crescimento vegetal ............................................................................. 29 REFERENCIA BIBLIOGRFICA........................................................................................ 33

INTRODUO O fsforo participa de vrios processos metablicos em plantas, como a transferncia de

energia, sntese de , fotossntese e respiraosimbitica . Entretanto, a interao do P com constituintes do solo como Al, Fe e Ca, sua ocorrncia em formas orgnicas, e suas lentas taxas de difuso na soluo do solo, tornam o P o nutriente menos prontamente disponvel na rizosfera. Mesmo quando so aplicados fertilizantes, a maior parte do P adicionado adsorvido em colides do solo e torna-se no disponvel em compostos de baixa solubilidade, sem propiciar uma contribuio imediata para a produo vegetal. Alm disto, o suprimento mundial de P para fabricao de fertilizantes origina-se de depsitos minerais, constituindo um recurso natural no renovvel, exigindo um aproveitamento consciente deste nutriente para garantir a sustentabilidade da agricultura em um futuro prximo da humanidade.

1.1

Formas de fsforo no solo O P constitui cerca de 0,12 % da crosta terrestre, sendo que as maiores reservas de P na

crosta esto em sedimentos marinhos, solos terrestres, fosfato inorgnico dissolvido no oceano e rochas com minerais como apatita (Stevenson & Cole, 1999). Apesar de existirem na natureza mais de 200 minerais de P, apenas o grupo das apatitas tem significao quantitativa. Em escala geolgica, o intemperismo liberou P das apatitas, que foi absorvido pelas plantas e reciclado, incorporado na matria orgnica dos solos e sedimentos, ou precipitado como minerais pouco solveis de Ca, Fe e Al (Stevenson & Cole, 1999). O contedo total de P nos solos est entre 0,02 e 0,5 %, mas apenas uma pequena frao est em formas disponveis para os vegetais. O P no solo pode ser dividido em quatro amplas categorias: P na forma inica e em compostos na soluo do solo, P adsorvido na superfcie dos constituintes minerais do solo, minerais cristalinos e amorfos de P, e P componente da matria orgnica (Barber, 1984). As concentraes de fosfato na soluo do solo so usualmente muito baixas, variando entre 2

0,1 e 10 M. Os valores de pK para dissociao do H3PO4 em H2PO4- e HPO4-2 so de, respectivamente, 2,1 e 7,2, ou seja, abaixo de pH 6 a maior parte do P da soluo do solo est na forma de H2PO4-, usualmente denominada de Pi. Os teores de P orgnico nos solos podem variar desde quase zero at mais de 0,2 %, e dependendo da classe de solo o P orgnico pode representar de 20 a 80 % do P total do solo (Stevenson & Cole, 1999). A liberao de P orgnico para a soluo do solo controlada pela taxa de mineralizao da matria orgnica e depende da atividade microbiana (Barber, 1984). Como a taxa de difuso de fosfato no solo muito baixa (10-12 a 10-15 m2 s-1), a rpida absoro vegetal cria uma zona de depleo de P em volta da raiz, e os ons se difundem por gradiente de potencial qumico at a superfcie radicular (Rausch & Bucher, 2002). Aps poucos dias de absoro, a concentrao de P na rizosfera pode reduzir-se de 30 a 50 %, e a zona de depleo estender-se at cerca de 2 mm da superfcie radicular (Jungk, 1987). O coeficiente de difuso do fosfato funo da umidade do solo, tornando seu movimento mais difcil em solos com baixos teores de umidade.

1.2

Absoro de fsforo pela membrana celular Com base nos teores de nutrientes usuais em plantas jovens adequadamente nutridas, a razo

entre o influxo timo de N, P e K em razes seria de 1:0,1:1; entretanto, na maior parte dos solos frteis, a razo entre os teores disponveis de N, P e K na rizosfera de 1:0,001:1, respectivamente (Gahoonia & Nielsen, 2004). Portanto, a baixa concentrao de P disponvel nos solos exige um mecanismo de absoro bastante eficiente. As plantas adquirem P contra um elevado gradiente de concentrao atravs da membrana plasmtica: as concentraes de Pi nas clulas vegetais so geralmente mais de 100 vezes superiores (da ordem de mM) s concentraes na soluo do solo (da ordem de M) (Raghothama, 2000). Isto, em conjunto com a carga negativa dentro da clula,

exige que seja gerado um forte gradiente eletroqumico para que o transporte do fosfato para dentro da clula seja possvel (Smith, 2002). A fonte de energia livre para este transporte provm da bomba de extruso de prtons atravs da plasmalema, em que ATPases efetuam o transporte de H+ para fora da clula, gerando tanto diferena de potencial eltrico (interior negativo), quanto diferena de pH (exterior cido) (Glass, 1990; Figura 1). As taxas de absoro de P so maiores entre pH 4,5 e 6,0 na soluo, onde a forma H2PO4- predominante, indicando que o P preferencialmente absorvido como H2PO4- (Sentenac & Grignon, 1985). A despolarizao da plasmalema aps a absoro de P indica que o H2PO4- deve ser absorvido atravs de um simporte com ctions, principalmente H+ (Schachtman et al., 1998).

EFLUXO Pi

AL EM

Pi

Pi

PL AS M

ATP ADP

H+

VACOLO

H CITOPLASMA Pi H ALTA AFINIDADE


+

TO NO PL AST

PPi

Pi

Pi

BAIXA AFINIDADE

Figura 1: Transporte de fosfato atravs da plasmalema e do tonoplasto. ATPases na plasmalema e no tonoplasto provem a energia para conduzir os processos de transporte de Pi. Os mecanismos de efluxo contribuem para manter a homeostase nas clulas. O transporte de Pi no tonoplasto bidirecional (adaptado de Raghothama, 2000).

Estudos de cintica demonstram que as plantas possuem tanto transportadores de baixa quanto de alta afinidade pelo fosfato: os sistemas de baixa afinidade tm Km variando entre 50 e 300 M, enquanto os sistemas de alta afinidade apresentam Km entre 2 e 10 M, mas diante das concentraes usuais de fosfato nos solos cultivados (1-10 M), os transportadores de alta afinidade que mediam a absoro de P (Vance at al., 2003). Os transportadores de fosfato de alta afinidade, cujos genes codificadores j foram identificados em plantas, so protenas com cerca de 58 kDa e 525-550 aminocidos, que contm regies hidrofbicas transversas membrana celular, constitudas de 12 domnios separados em dois grupos de 6 domnios por uma regio de alta carga hidroflica (Smith, 2002; Vance et al., 2003; Figura 2). Os genes codificadores dos transportadores de fosfato de alta afinidade so expressos preferencialmente em razes de plantas sob deficincia de P, e algumas destas indues gnicas esto diretamente envolvidas no aumento da disponibilidade de P na rizosfera e na promoo de sua absoro (Raghothama, 2000). 5

NH2 DENTRO

FORA

Figura 2: Topologia estimada de transportadores de alta afinidade de fosfato em membranas vegetais (Vance et al., 2003).

O Pi move-se do crtex ao cilindro central das razes principalmente pelo simplasto, a uma taxa aparente de 2 mm h-1, taxa que pode ser atingida apenas pela difuso, mas provvel que o fluxo transpiratrio tambm contribua com este movimento (Bieleski, 1973). Aps sua absoro no simplasma radicular, o Pi encontra cinco possveis destinos: (i) ingressa no compartimento metablico (citoplasma celular e suas organelas), onde a maior assimilao de Pi em compostos orgnicos ocorre via formao de uma ligao anidrida no ATP; (ii) uma pequena frao de Pi ingressa nas vias biossintticas de P-lipdio, DNA e RNA, tornando-se um componente estrutural da clula; (iii) uma quantidade varivel de Pi perdida pela clula via efluxo, particularmente em condies de alto suprimento de P; (iv) ocorre o influxo e armazenamento de Pi no vacolo para regular a homeostase de Pi no interior da clula; (v) o Pi transportado simplasticamente para as clulas do parnquima do xilema, e posteriormente secretado no apoplasto do xilema para o transporte a longa distncia para os tecidos da parte area (Rausch & Bucher, 2002).

CARACTERES RADICULARES ASSOCIADOS ABSORO DE FSFORO Sistemas radiculares mais extensos aumentam a rea de contato entre as razes e o solo, e

para ons pouco mveis como o fosfato, a absoro freqentemente relacionada com o comprimento radicular. As plantas cultivadas, que usualmente apresentam elevadas taxas de crescimento, requerem a contnua explorao de novos volumes de solo ainda no exauridos pela absoro radicular. A morfologia radicular apresenta grandes variaes entre espcies, e ao menos parte desta variao est sob controle gentico, apesar de existir considervel plasticidade fenotpica em muitas espcies, pois a morfologia radicular muito sensvel s propriedades qumicas e fsicas do solo (OToole & Bland, 1987). Quando alguns nutrientes limitam o crescimento vegetal, em particular o N e o P, as razes transformam-se em forte dreno de carboidratos, causando uma maior limitao ao crescimento da parte area do que da raiz, o que aumenta a razo entre a massa de raiz e de parte area. Razes de plantas de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) crescidas em um meio deficiente em P apresentaram concentraes de acares muito superiores a razes de plantas em meio com adequado suprimento de P, em virtude da maior translocao de fotoassimilados da parte area (Wanke et al., 1998). A reduo da taxa de crescimento da parte area ocorre logo aps o incio da deficincia de P, enquanto o crescimento da raiz s limitado aps um maior intervalo de tempo, e com menos intensidade (Fredeen et al., 1989). Todavia, a maior destinao de C s razes sob baixo P, tanto para produo de biomassa quanto para respirao de manuteno, pode constituir fator limitante ao crescimento vegetal como um todo (Nielsen et al., 1998). Alm disto, os custos em termos de P podem ser relativamente maiores para a produo de razes do que de folhas, pois as razes apresentam uma pequena remobilizao de P para o restante da planta durante os processos associados senescncia (Lynch & Brown, 2001). A distribuio radicular, relacionada presena de biomassa ou comprimento de razes em um gradiente do perfil do solo, indica a capacidade do sistema radicular de explorao de diferentes 7

camadas do solo. Plantas de soja (Glycine max (L.) Merr.) apresentam baixa densidade radicular, monocotiledneas anuais valores mdios, e pastagens perenes grande densidade de razes (Barber, 1984). A distribuio radicular modificada pelo estdio de crescimento: aos 47 dias da emergncia, 2/3 da rea radicular de gentipos de milho (Zea mays L.) estava concentrada na camada superficial do solo, e 3 semanas aps este valor era inferior a 50 % (Schenk & Barber, 1980), enquanto mais de 80 % da biomassa radicular de cultivares de soja estava concentrada nos 7,5 cm superficiais do solo no incio do cultivo, e nos 15 cm superficiais no restante do ciclo (Mitchell & Russell, 1971). Observa-se maior crescimento de razes nas profundidades do solo que recebem adubao fosfatada, e medida que se aprofunda a aplicao do fertilizante, ocorre aumento na biomassa de razes (Chaib et al., 1984). A arquitetura radicular relaciona-se configurao espacial do sistema radicular, ou seja, geometria de desenvolvimento dos eixos radiculares (Lynch, 1995). Modelos de simulao indicaram que a maior eficincia de explorao do solo est associada com uma arquitetura radicular do tipo espinha de peixe, onde a ramificao ocorre predominantemente no eixo principal; entretanto, esta hiptese foi confirmada em eudicotiledneas, mas no em gramneas (Fitter & Stickland, 1991). Uma estratgia adaptativa tambm observada em plantas crescidas em solos com baixo P consiste na reduo do ngulo de crescimento de razes basais, em relao ao plano horizontal, o que aumentaria a explorao de camadas superficiais do solo (Bonser et al., 1996; Figura 3).

+P
SOLO SUPERFICIAL

-P
MAIS RAZES ADVENTICIAS RAZES BASAIS MAIS SUPERFICIAIS RAZES LATERAIS MAIS DISPERSAS

SUBSOLO MAIS RAZES LATERAIS NA PIVOTANTE

PLOS MAIS LONGOS E DENSOS

Figura 3: Modificao na arquitetura radicular pela disponibilidade de P no solo: a baixa disponibilidade de P ( direita) estimula a produo de razes adventcias, diminui o ngulo de crescimento das razes basais, estimula a produo de razes laterais, e aumenta a densidade e o comprimento de plos radiculares (adaptado de Lynch & Brown, 2001).

A morfologia radicular refere-se s caractersticas de um eixo radicular individual, incluindo propriedades da epiderme e plos radiculares (Lynch, 1995). O dimetro radicular est associado ao volume de solo que pode ser explorado pelas razes atravs do investimento de uma determinada quantidade de fotoassimilados, pois razes mais finas podem explorar um maior volume de solo por unidade de massa radicular. Sob condies de baixo suprimento de P, comum observar-se uma diminuio do raio radicular, e um sistema radicular com razes finas poderia ser considerado mais eficiente para absoro de P, mas no devem ser ignorados outros atributos funcionais de razes mais grossas em determinadas condies ambientais (Eissenstat, 1992). Alm disto, o custo de manuteno de razes finas pode ser maior, pois estas razes so repostas mais freqentemente

(Gahoonia & Nielsen, 2004). Em conseqncia da aplicao de fertilizantes e da presena de P orgnico, comum a ocorrncia de variaes espaciais na concentrao de P nos solos, acarretando modificaes na morfologia radicular. Nas partes de razes de cevada (Hordeum vulgare L.) que receberam P da soluo nutritiva, ocorreu um incremento do nmero e extenso de razes laterais (Drew & Saker, 1978), e razes de feijoeiro crescidas sob baixo teor de P alocaram mais biomassa e produziram razes laterais mais finas em um determinado volume do solo enriquecido com P, quando comparadas a plantas originalmente crescidas sob alto teor de P (Snapp et al., 1995). Os plos radiculares aumentam a eficincia com que as razes exploram a rizosfera para absoro de P: em virtude de seu pequeno raio e de seu crescimento perpendicular em relao ao eixo radicular, a concentrao de P na superfcie do plo radicular decresce mais lentamente e o influxo de P mantm-se mais elevado (Barber, 1984). Sob baixo suprimento de P, ocorre um aumento no comprimento e na densidade de plos radiculares (Figura 3), que por sua vez est associado a um aumento no nmero de clulas da epiderme radicular que se diferenciam em triclobastos (Lpez-Bucio et al., 2003). Entre todas as alternativas de aumentar a superfcie radicular, as mudanas na morfologia de plos radiculares so consideradas aquelas com menor custo metablico (Gahoonia & Nielsen, 2004). O nmero, comprimento e raio dos plos radiculares podem apresentar considervel variao entre espcies e dentro de uma mesma espcie (LpezBucio et al., 2003). Algumas espcies vegetais adaptadas a habitats de fertilidade extremamente baixa podem desenvolver estruturas especializadas, as razes proteides (ou cluster roots), que so agrupamentos de razes laterais curtas que emergem do periciclo, especializadas na aquisio de P (Lpez-Bucio et al., 2003). As razes proteides apresentam vrias caractersticas distintivas das razes laterais tpicas de eudicotiledneas, como a iniciao em grupamentos no aleatrios, a produo superabundante de plos radiculares, e um crescimento determinado que cessa logo aps a emergncia (Vance et al., 2003). O elevado sincronismo do desenvolvimento das razes proteides 10

indica que sua formao um processo sob estreito controle da planta, sendo inibido sob alto suprimento de P (Vance et al., 2003).

2.1

Controle metablico da absoro de fsforo Vrios mecanismos foram desenvolvidos pelas plantas para permitir a aquisio e utilizao

de P em ambientes onde o suprimento deste nutriente limitante, mecanismos estes que podem ser agrupados em duas amplas categorias: aqueles que aumentam o contedo de nutriente absorvido do solo, e aqueles que afetam a eficincia vegetal em utilizar o nutriente absorvido para a produo de biomassa (Elliott & Luchli, 1985). Os processos que propiciam o aumento da absoro de P incluem o maior crescimento radicular associado a mudanas na arquitetura radicular, a expanso da superfcie radicular atravs da proliferao de plos radiculares e da associao com fungos micorrzicos, a maior produo e excreo de fosfatases, a exsudao de cidos orgnicos, e um estmulo expresso dos transportadores de P (Vance et al., 2003). J os processos que conservam o P absorvido envolvem a reduo na taxa de crescimento, a maior produo de biomassa por unidade de P absorvido, a remobilizao do P interno, modificaes no metabolismo de C que contornem as etapas que requerem P, e a utilizao de vias respiratrias alternativas (Vance et al., 2003). As plantas provavelmente possuem dois diferentes mecanismos sinalizadores para manter a homeostase de P, um operando a nvel celular, e outro envolvendo mltiplos rgos e provavelmente oriundo da parte area (Raghothama, 2000). A nvel celular, o movimento de Pi para dentro e fora do vacolo, e a regulao do influxo e efluxo de P, seriam os principais mecanismos para manter a homeostase (Figura 1). J a resposta ao nvel da planta inteira muito mais complexa, envolvendo o transporte de P dos tecidos velhos para os jovens, ou das razes para a parte area e retornando s razes (Raghothama, 2000). Estudos em razes subdivididas indicam que as taxas de absoro de P por razes crescidas em meio sem P respondem ao estado geral de P da planta, mais do que concentrao externa localizada de P adjacente a esta seo das razes (Smith, 2002). Isto 11

tem sido confirmado por estudos moleculares, que indicam que a regulao transcricional dos genes codificadores dos transportadores de P respondem primeiramente ao estado de P da planta inteira. Desta forma, a regulao da absoro de P em razes uma resposta sistmica mais do que uma resposta localizada (Smith, 2002). Em clulas de plantas superiores, a concentrao de Pi no citoplasma (da ordem de mM) mantida geralmente em um nvel constante sob diferentes nveis de fornecimento de P, enquanto a concentrao de Pi no vacolo modifica-se substancialmente de forma a tamponar o Pi citoplasmtico, permitindo a regulagem de etapas metablicas no citoplasma e nos cloroplastos (Rausch & Bucher, 2002). O vacolo age como um reservatrio no metablico de P: em folhas de plantas adequadamente supridas de P, cerca de 85 a 95 % do Pi est localizado nos vacolos, enquanto em condies de deficincia, muito pouco Pi est presente no vacolo (Foyer & Spencer, 1986). O transporte de Pi atravs do tonoplasto requer ATP e alcalinizao do citoplasma, e o fluxo bidirecional de Pi atravs do tonoplasto ocorre quando a concentrao de Pi alta no vacolo, no citoplasma, ou em ambos (Raghothama, 2000; Figura 1). H vrias evidncias de que muitos dos processos bioqumicos e fisiolgicos, e das mudanas morfolgicas que ocorrem em resposta deficincia de P, esto associados com alteraes da expresso gnica (Raghothama, 2000). Os transportadores de fosfato, as fosfatases, as enzimas envolvidas na sntese de cidos orgnicos, e os canais inicos que facilitam a liberao de cidos orgnicos, so exemplos de protenas codificadas por genes cuja expresso induzida pela deficincia de P (Raghothama, 2000). Alguns hormnios vegetais, como auxinas, etileno e citocininas, podem estar envolvidos na modificao da arquitetura radicular, no desenvolvimento de razes laterais, na elongamento de plos radiculares, e na formao de razes proteides, em condies de deficincia de P (Vance et al., 2003). J quando as plantas absorvem P em taxas que excedem a demanda de crescimento, alguns processos atuam para prevenir a acumulao de nveis

12

txicos de P, como a converso de Pi em compostos de reserva (como o cido ftico), a reduo da taxa de absoro de Pi da soluo do solo, ou a perda de Pi por efluxo (Schachtman et al., 1998). Apesar das recentes evidncias sobre a expresso gnica durante a deficincia de P, pouco ainda se sabe sobre os componentes do processo de sinalizao que ativaria a resposta das plantas limitao de P. Porm, em um mutante de Arabidopsis foi identificado um gene que codifica uma protena que pode estar associada ao processo de sinalizao da deficincia de P (Lpez-Bucio et al., 2003). A concentrao de P na parte area teria um papel central na regulao da taxa de absoro de P por unidade de raiz, na partio de biomassa entre raiz e parte area e na taxa de crescimento relativo da planta (Drew & Saker, 1978). Plantas crescidas sob fornecimento limitado de P, e posteriormente supridas com o nutriente, apresentam influxos de P superiores aos de plantas originalmente crescidas sob alto fornecimento de P (Jungk et al., 1990). As plantas adaptam sua cintica de absoro de P de acordo com seu estado nutricional, por meio de um aumento de Imax com a reduo do teor de P na parte area, enquanto as mudanas no Km e Cmin seriam de menor importncia (Jungk et al., 1990). Em geral, a taxa de absoro de nutrientes pelas razes diminui com a ontogenia vegetal (Gao et al., 1998). Em sistemas radiculares jovens, a taxa de absoro de nutrientes diminuiu acentuadamente com o envelhecimento das razes, mas sistemas radiculares mais velhos tiveram pequena taxa de absoro, mas com menor declnio com o tempo (Gao et al., 1998). Partes suberizadas do sistema radicular podem assumir importante papel na absoro de P, pois como a absoro de P segue a via simplstica, seria pouco afetada pela suberizao da endoderme (Barber, 1984). Os genes codificadores dos transportadores de Pi de alta afinidade esto distribudos por todo o comprimento radicular de plantas sob deficincia de P, indicando que todo o sistema radicular mantm o potencial para absoro de P (Raghothama, 2000).

13

Quando o Pi est presente em concentraes adequadas, altas taxas de efluxo de P podem compensar o influxo de P, indicando que sob adequado suprimento de P a homeostase celular controlada principalmente pelo efluxo de P (Raghothama, 2000). O efluxo de P em razes ocorreria pelo antiporte e troca inica nos stios de absoro, e pelo efluxo passivo por um gradiente de potencial eletroqumico, e pode atingir valores equivalentes a 15-20 % do influxo de P no mesmo perodo (Schjorring & Jensn, 1984). 3 ASSOCIAES COM MICRORGANISMOS Enquanto habitantes da rizosfera e do solo como um todo, os microrganismos desempenham funes primordiais no aumento da disponibilidade do P do solo para as plantas, atravs de mecanismos que afetam a estrutura, a qumica, a bioqumica e a fisiologia do ambiente radicular. Dentre essas aes dos organismos, destacam-se a extenso dos sistemas radiculares pelas associaes com os fungos micorrzicos e a solubilizao e mineralizao microbianas do P por algumas bactrias e fungos. As micorrizas so associaes ou simbioses mutualistas entre fungos e razes das plantas hospedeiras, em que os compostos de carbono produzidos pela fotossntese so utilizados pelo hospedeiro e pelo fungo, e este ltimo fornece s plantas parte dos nutrientes absorvidos do solo. Existem sete tipos distintos de associaes micorrzicas, mas as micorrizas arbusculares e as ectomicorrizas so as mais freqentes e as mais importantes (Moreira & Siqueira, 2002). As ectomicorrizas predominam em espcies arbreas das gimnospermas e angiospermas de clima temperado, sendo bastante comuns em conferas. Os fungos formadores desse tipo de micorriza so os basidiomicetos e alguns ascomicetos e ficomicetos (Harley, 1994). Nas ectomicorrizas, a colonizao das clulas corticais acontece de forma intercelular apenas, com a formao da rede de Hartig, que substitui a lamela mdia, e com a formao de um manto fngico ao redor das razes (Moreira & Siqueira, 2002).

14

A micorriza arbuscular , provavelmente, a simbiose mais comum entre plantas e microrganismos. A grande maioria das plantas terrestres so hospedeiras potenciais de fungos micorrzicos arbusculares, que constituem um grupo de fungos biotrficos obrigatrios altamente especializados, classificados como zigomicetos e pertencentes ordem Glomales. Quando colonizam as clulas das razes, muitas das espcies destes fungos formam vesculas, rgos de armazenamento que contm grande quantidade de lipdeos, e todas as espcies formam arbsculos, estruturas constitudas por formaes de hifas altamente ramificadas que promovem as trocas metablicas entre os fungos e as plantas (Bonfante-Fasolo, 1984). A simbiose micorrzica considerada no especfica, uma vez que os fungos colonizam as razes de plantas de quase todos os gneros das gimnospermas e angiospermas, alm de algumas brifitas e pteridfitas (Harley, 1994). Todavia, tanto o desenvolvimento da associao como sua fisiologia esto sobre controle gentico do hospedeiro (Smith et al., 1993), verificando-se uma certa habilidade discriminatria entre os fungos e as plantas (Paula et al., 1988). Alguns atributos das plantas, como o comprimento e massa de razes e a relao entre a massa de raiz e de parte area, tambm afetam a simbiose micorrzica (Koide et al., 1988). Fatores ambientais tambm podem influenciar a colonizao, como a disponibilidade de nutrientes, os pesticidas, a umidade do solo, o pH e a intensidade luminosa (Azcn & Ocampo, 1981). A colonizao pelos fungos micorrzicos arbusculares promove a tolerncia a estresses biticos ou abiticos, aumentando o crescimento e a produtividade das plantas. Enquanto as plantas fornecem carboidratos aos fungos, estes colonizam inter e intracelularmente as clulas corticais, de onde estendem uma rede de hifas vrios centmetros para fora da rizosfera, desta forma expandindo o volume de solo efetivamente explorado pela planta (Smith, 2002). Da os efeitos mais expressivos da simbiose quando se considera a aquisio de nutrientes em formas pouco mveis, como o P, o Zn e o nitrognio na forma amoniacal. A aquisio de P pelas associaes micorrzicas envolve o transporte do fosfato da soluo do solo atravs das membranas das hifas fngicas, o movimento do 15

fosfato das hifas para os arbsculos, a liberao de fosfato dos fungos na interface entre os arbsculos e as clulas corticais, e a absoro do fosfato pelas clulas corticais (Smith, 2002). Os vrios mecanismos propostos para explicar o aumento da absoro de P das plantas micorrizadas foram agrupados por Smith & Read (1997) da seguinte forma: As hifas dos fungos micorrzicos so capazes de absorver o P da soluo do solo e transloclo para as razes em um processo muito mais rpido que o processo de difuso deste elemento no solo, sendo capazes de transpor as zonas de depleo de P que se formam em volta das razes; (a) a produo de hifas envolve um menor consumo de carbono por unidade de comprimento ou rea de absoro, e seu menor dimetro permite que elas penetrem em poros do solo de dimetro menor que as razes, aumentando assim o volume de solo explorado; (b) as hifas so mais efetivas, em conseqncia de seu tamanho e distribuio espacial, em competir com os microrganismos de vida livre do solo pelo P recentemente mineralizado ou solubilizado; (c) a cintica de absoro de P nas hifas difere da apresentada pelas razes, com valores mais baixos de Km, possibilitando uma absoro mais efetiva de P em concentraes nas quais a aquisio pelas razes j tenha cessado; (d) razes micorrizadas podem usar fontes de P que no estejam disponveis para as demais razes. Embora a simbiose micorrzica constitua um mecanismo adaptativo que permite maximizar a aquisio de P com um consumo de energia menor que a prpria produo de razes, o custo de manuteno da simbiose micorrzica aprecivel, representando cerca de 5 a 10 % da fotossntese total em endomicorrizas (Clarkson, 1985). O benefcio obtido com a colonizao micorrzica varia com o suprimento de P: quando o P extremamente limitante, o crescimento dos simbiontes inibido; quando a disponibilidade de P baixa, ocorre o aumento do crescimento do hospedeiro; em doses maiores de P, a proliferao do fungo pode ocorrer s custas do hospedeiro (Bethlenfalvay et 16

al., 1982b). Em geral observa-se aumento na colonizao das razes quando as concentraes de P no solo e nas razes so baixas, e um efeito adverso da fertilizao fosfatada no desenvolvimento de arbsculos, vesculas, hifas externas e esporos (Sylvia & Neal, 1990). A simbiose micorrzica tambm causa estmulos fixao biolgica de N2 em leguminosas, principalmente em virtude da maior absoro de P (Barea & Azcn-Aguilar, 1983). A simbiose micorrzica apresenta interaes com o desenvolvimento ontogentico do hospedeiro, em virtude das alteraes no suprimento de fotoassimilados causadas por relaes fonte-dreno (Bethlenfalvay et al., 1982a; Arajo et al., 1996). Pela sua importncia no processo de absoro do P do solo, de se esperar que o efeito da colonizao pelos fungos micorrzicos seja mais expressivo nos estdios iniciais do crescimento das plantas, quando a demanda por P intensa. Entretanto, a infeco micorrzica tambm pode afetar a reproduo das plantas, influenciando a produo de flores, maturao de frutos e aborto de sementes (Lu & Koide, 1994). Parece haver uma relao entre o incio da fase reprodutiva de leguminosas de gro e a reduo do crescimento do endfito micorrzico, pois as micorrizas utilizaram 17 % do total de fotoassimilados de plantas de soja de 6 semanas, valor que decaiu para 8 % aps 9 semanas (Harris et al., 1985), (captulo 3 neste volume). 3.1 Mudanas na rizosfera Mudanas do pH no solo ao redor das razes esto associadas ao balano na absoro de ctions e nions, que particularmente afetado pelas fontes de N: como as plantas necessitam manter o equilbrio de cargas e o pH no interior das clulas prximo da neutralidade, quando mais ctions so absorvidos, mais H+ so liberados pelas razes e o pH decresce; similarmente, quando mais nions so absorvidos, h um aumento de OH- e o pH aumenta (Hinsinger et al., 2003). Plantas que absorvem N como NO3- tendem a aumentar o pH da rizosfera, enquanto plantas que absorvem NH4+ ou utilizam N2 simbitico reduzem este pH, acarretando diferenas de 1-2 unidades de pH

17

entre a rizosfera e o solo, que podem se estender a uma distncia entre 1 e 4 mm da superfcie radicular (Gahoonia et al., 1992). A extruso de prtons na rizosfera pode aumentar a disponibilidade de fontes pouco solveis de P do solo e a absoro de P pelas razes, mas este fenmeno pode depender do tipo de solo: em um Luvisol, onde o fosfato estava ligado principalmente a Ca, a reduo do pH da rizosfera aumentou a absoro de P, enquanto em um Oxisol, onde o P estava ligado principalmente a Al e Fe, a absoro de P foi maior nos tratamentos com fertilizao nitrogenada que promoveram aumento do pH (Gahoonia et al., 1992). A exsudao de cidos orgnicos por razes, como os cidos ctrico, oxlico e mlico, tem sido associada com a acidificao da rizosfera, e poderia beneficiar a absoro de P (Hinsinger et al., 2003). Algumas razes de plantas eudicotiledneas, e especialmente plantas no micorrizadas, so capazes de liberar grandes quantidades de cidos orgnicos na rizosfera em resposta deficincia de P (Jones, 1998). A exsudao de quelatos de clulas da epiderme radicular tambm foi proposta como uma estratgia para aumentar a absoro de P, atravs da solubilizao de fosfatos de Fe e Al (Ae & Otani, 1997). Os tecidos vegetais contm uma alta atividade de fosfatases, uma classe de enzimas com considervel heterogeneidade quanto sua funo e cintica, e que quando liberadas no meio externo podem hidrolisar P-ster para Pi, aumentando a absoro de P de formas orgnicas (Yan et al., 2001). A baixa disponibilidade de P aumenta a secreo de fosfatases cidas na rizosfera de vrias espcies vegetais, indicando ser a secreo de fosfatases determinada pelo requerimento de P da planta (Yan et al., 2001).

3.2

Formas de fsforo na planta De forma diferente do nitrato e do sulfato, o fosfato no reduzido nas plantas, sendo

utilizado apenas na sua forma completamente oxidada de ortofosfato. Aps sua absoro, o fosfato permanece como Pi, ou esterificado por meio de um grupo hidroxil em uma cadeia de C como um 18

ster simples de fosfato (como em um acar fosfato) ou preso a outro fosfato por ligaes pirofosfato de alta energia (como no ATP) (Marschner, 1995). Em pH neutro, o fosfato ocorre tanto como um nion mono quanto divalente, contribuindo com a capacidade tampo da clula (Clarkson & Hanson, 1980). Nas clulas vegetais, o P pode estar presente nos nucleotdeos constituintes do material gentico, nos fosfolipdeos presentes nas membranas celulares, nos fosfatos de adenosina como o ATP e o ADP, e em steres de carboidratos, produtos metablicos intermedirios (Figura 4). Uma razo tpica de 0,2:2:1,5:1 entre as formas orgnicas de P DNA, RNA, P-lipdio e P-ster, respectivamente, observada nas clulas vegetais (Bieleski, 1973). J em sementes, o P acumula-se preferencialmente como fosfatos de inositol, na forma de sais de cido ftico (ou fitina) (Figura 4).

19

(a)

R C O R C O

O CH2 O C H2 C O O H O PO H2 C C H2
NH2 Purinas N
7 8 5 4

CH3 CH3 N+ CH3

(b)
-O O O PO P -O O P O -O O O
5

O
6 3 1N 2

Base O
2 ligao glicosdica

N
7 8

5 4

6 3

1N 2

N Guanina

NH2

HO

(OH - Ribose) (H - desoxiribose) Pentose

R Adenina Pirimidinas NH2


5 6 4 1 3N 2 5 6

O
4 1 3N 2

O H O H3C
5 6 4 1 3N 2

Nucleosdeo Nucleotdeo monofosfato Nucleotdeo difosfato Nucleotdeo trifosfato

H O

N R Citosina

N R Uracil

N dR Timina

(c)
N O O P O O O P O O O P O H OH HC OCH2

NH2 C C CH N O C N N

(d)

HO P O

OH OH O O P O OH

O P HO O

OH

O OH P O P O OH O OH OH OH O P O OH

H OH

Figura 4: Exemplos de compostos orgnicos com P em plantas: (a) lecitina (fosfatidil colina, um fosfolipdeo); (b) nucleotdeos; (c) trifosfato de adenosina (ATP); (d) cido ftico (hexafosfato de inositol).

20

O P no DNA fortemente segregado, e de um outro lado da escala esto os grupos do ATP, com alto turn over na clula (Bieleski, 1973). Em cevada, todas as fraes de P aumentaram com o maior suprimento de P, mas em diferentes extenses (Pi > P-nuclico > P-lipdio > P-ster), revelando que todas as fraes, mas principalmente o Pi, podem ter funo de armazenamento (Chapin & Bieleski, 1982). Altos teores de P-RNA so encontrados em tecidos meristemticos, envolvidos na sntese protica, e diferenas no tamanho desta frao podem refletir a atividade meristemtica em resposta deficincia de P (Chisholm & Blair, 1988). A remobilizao do Plipdio pode ocorrer quando as reservas de P em outras fraes reduzem-se suficientemente, mas a perda de P deste compartimento mostra a quebra de membranas como a plasmalema e de organelas como as mitocndrias (Chisholm & Blair, 1988). O suprimento de P e o gentipo vegetal governam a taxa e a extenso da incorporao do Pi nas demais fraes orgnicas (Chisholm & Blair, 1988). A utilizao de P foi negativamente correlacionada com a razo entre as taxas de acumulao de Pi e de P total em milho, indicando que a utilizao de P seria limitada pela partio de P entre formas inorgnicas e orgnicas (Elliott & Luchli, 1985). A elevada correlao entre a biomassa e os contedos de P nas fraes lipdica e residual em estilosantes e trevo branco indica que o crescimento est relacionado com a incorporao do P solvel nestas fraes (Chisholm & Blair, 1988).

3.3

Transporte de fsforo na planta O Pi a principal forma de transporte de P no xilema, e o Pi que entra na raiz, aps

rapidamente incorporado em formas orgnicas, seria hidrolisado antes da transferncia de Pi para o xilema (Loughman, 1981). A exportao de P para a parte area foi mais sensvel inibio da sntese protica do que o influxo de P nas razes, indicando que as unidades reguladoras da transferncia de P para o xilema devem diferir daquelas envolvidas no transporte de fosfato atravs da plasmalema das clulas corticais (Schjorring & Jensn, 1987). Admite-se que o Pi seja a 21

principal forma de transporte de P no floema, registrando-se velocidades de transporte de 80 cm h-1 entre as lminas foliares e o floema dos pecolos (Bieleski, 1973). Entretanto, compostos orgnicos como nucleotdeos (inclusive ATP) e hexoses-fosfatos tambm so detectados no suco floemtico (Bieleski, 1973). Em um nutriente to mvel quanto o P, o padro de redistribuio parece ser determinado pelas propriedades da fonte e do dreno mais do que pelo sistema de transporte (Bieleski, 1973), e estudos com radioistopos revelam que o movimento de P determinado pelo movimento e demanda de carboidratos dentro da planta, e no pelos requerimentos de P do dreno (Marshall & Wardlaw, 1973). Aps 24 horas da absoro, 68 % do
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P do pice radicular de plntulas de trigo (Triticum

aestivum L.) havia sido translocado, assim como mais de 80 % do P das pores mdia e de formao de razes laterais (Rovira & Bowen, 1970). Plntulas de nabo (Brassica napus L.) mostraram acumulao de
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P perto do pice das razes primrias e laterais, sem correspondente

depleo do solo adjacente, indicando forte translocao de P para os meristemas radiculares (Bhat & Nye, 1974). Sob deficincia de P, ocorre uma maior proporo de P em formas orgnicas nas razes, e uma menor concentrao de P no exsudado do xilema, o que indica que o aumento da razo entre a massa de raiz e de parte area seria conseqncia de menos Pi disponvel para o transporte para a parte area (Chapin & Bieleski, 1982; Alves et al., 1998). O P aplicado por via foliar pode ser rapidamente transportado para outros tecidos vegetais de crescimento ativo: o
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P aplicado em folhas foi detectado nas razes aps 3 horas, e continuou a

mover-se para fora da folha tratada ao menos por 6 dias aps a aplicao (Thorne, 1958). A absoro de nutrientes aplicados por via foliar varia com a idade da folha e com o gentipo vegetal, mas admite-se que 50 % do P aplicado em folhas seja absorvido em torno de 5 dias aps a pulverizao (Kannan, 1990). Entretanto, o P no tem sido utilizado comumente como adubo foliar, pois nenhum composto de P pode ser aplicado foliarmente em quantidades que contribuam significativamente para os requerimentos das culturas sem causar danos s folhas. 22

A senescncia foliar, e a concomitante degradao de macromolculas, permite o reaproveitamento de nutrientes mveis como o N e o P para o crescimento vegetal posterior (Aerts, 1996). Em plantas deficientes em P, o fornecimento limitado de Pi da raiz suplementado pela mobilizao de P de folhas velhas para as folhas jovens e as razes, processo que envolve a depleo das reservas de Pi e a quebra de P orgnico de folhas velhas (Schachtman et al., 1998). A hidrlise de cidos nucleicos e de fosfolipdeos contribuiu com 40-47% e 26-38%, respectivamente, do total de P reabsorvido de folhas senescentes de espcies decduas (Aerts, 1996). Mais da metade da demanda de P de vagens e sementes de plantas de feijoeiro foi suprida pela remobilizao das folhas (Snapp & Lynch, 1996), sendo que a mxima exportao de P das folhas de arroz (Oryza sativa L.) ocorreu nos estdios de desenvolvimento dos gros, decaindo aps (Mondal & Choudhuri, 1985). Alm disto, a proporo entre a quantidade de nutrientes nos gros e a quantidade de nutrientes na biomassa superior para o P do que para os demais macronutrientes (Haag et al., 1967), indicando uma translocao preferencial de P para os gros. Este intenso processo de translocao de nutrientes dos tecidos vegetativos para os rgos reprodutivos acarreta um decrscimo no teor de nutrientes nas folhas, o que pode limitar a fotossntese do dossel em estdios posteriores de crescimento, sugerindo que o atraso na senescncia foliar poderia ser uma estratgia para aumentar a produtividade dos cultivos anuais (Grabau et al., 1986). Entretanto, prognies de soja apresentaram uma relao inversa entre produo de gros e a senescncia foliar, sugerindo que as produes mximas s podem ser obtidas em plantas cujas folhas entrem em senescncia durante o enchimento de gros (Phillips et al., 1984). A reduo dos teores de P nos gros tem sido proposta como uma alternativa para a sustentabilidade da agricultura, propiciando uma maior eficincia de uso de fertilizantes e uma menor remoo de P pelos cultivos. Alm disto, o baixo teor de P nos gros implica em um menor teor de fitina, que est associada a sintomas de deficincia nutricional em seres humanos e animais, diminuindo a disponibilidade de minerais e protenas (Feil et al., 1992). A concentrao de P nos 23

gros parece ser parcialmente conseqncia da quantidade de carboidratos no gro, que dilui uma quantidade de P controlada por fatores genticos ou ambientais (Feil et al., 1992). Por outro lado, sementes com altos teores de P originam plantas com maior crescimento da parte area, nodulao e acumulao de N, particularmente sob baixas doses de P no solo, indicando que o P da semente pode assumir papel relevante no estabelecimento vegetal e na fixao biolgica de N2 (Thomson et al., 1991; Teixeira et al., 1999). A fitina est localizada exclusivamente nos globides dentro dos corpos proticos nos vacolos das clulas das sementes, mas no em todos estes corpos proticos, resultando em diferentes contedos relativos de N e P nos gros, e abrindo perspectivas de uma seleo independente para os teores de N e P nos gros (Arajo & Teixeira, 2003).

3.4 3.4.1

Interaes do fsforo com outros nutrientes A interao entre fsforo e nitrognio

Pela importncia do P nas reaes fotossintticas e no metabolismo de carbono, processos fundamentais para a assimilao e utilizao do N, o P tem participao essencial no metabolismo do N. O N e o P interagem de forma sinrgica, em que ambos os nutrientes em nveis adequados promovem aumentos na produo vegetal maiores do que aqueles obtidos com cada nutriente isoladamente (Shuman, 1994). Aumentos no fornecimento de P a plantas de milho promoveram incrementos no contedo total de N e na eficincia de utilizao deste nutriente (Machado, 2000). So identificados pelo menos trs tipos de efeitos gerais do suprimento limitado de P na assimilao de N: a diminuio na absoro de NO3-; a diminuio na translocao do NO3absorvido para a parte area, indicada por uma acumulao de NO3- nas razes (aparentemente devido restrio do transporte do simplasma da raiz para o xilema); e a acumulao de aminocidos tanto nas folhas (mais comum) quanto nas razes, resultante ou de inibio da sntese ou da degradao de protenas (Israel & Rufty, 1988; Rufty et al., 1990, 1993; Jeschke et al., 1997). 24

A absoro de nitrato um processo ativo, requerendo energia metablica para o transporte contra um gradiente de potencial eletroqumico, necessitando, portanto de substncias redutoras e de ATP (Kleinhofs & Warner, 1990). A limitao no fornecimento de P pode resultar em menor taxa de absoro de NO3- e NH4+, sendo relatadas em milho tanto uma reduo mais acentuada na absoro de NO3- (Magalhes et al., 1995) quanto na absoro de NH4+ (Alves et al., 1998). H tambm a hiptese de que um efeito regulatrio especfico seja exercido pelo P na formao ou atividade do sistema transportador de NO3- nas membranas celulares, ou atravs de inibio por feedback pelas elevadas concentraes de NO3- e aminocidos induzidas em razes pela deficincia de P (Rufty et al., 1990, 1993). A limitao de P, ao restringir o transporte de NO3- da raiz para a parte area, pode tambm induzir a limitao da sntese de protenas na parte area, resultando em aumento da proporo de N no assimilado na parte area (Rufty et al., 1990). A omisso de P na soluo nutritiva acarretou reduo na atividade da GS/GOGAT em folhas e razes de milho apenas aps 144 h, enquanto que a reduo na atividade da nitrato redutase ocorreu aps 6 horas, indicando que o estresse de P teria um efeito indireto na assimilao do nitrognio, ao inibir a reduo do nitrato e limitar a disponibilidade de amnio para a sntese de aminocidos (Alves et al., 2000). Como a nitrato redutase induzida pelo substrato, a diminuio na absoro de N causada pela deficincia de P reduziria a atividade desta enzima, causando acmulo de NO3-, que por sua vez exerceria um efeito regulatrio promovendo mecanismos de inibio do tipo feedback negativo na absoro de N (Alves et al., 2000). Por outro lado, a deficincia de P reduziu os teores de N total nas folhas e de N total e de nitrato nos colmos e razes em hbridos de milho, sem que tenha ocorrido acmulo de NO3- na planta, indicando que o estresse de P diminuiu a absoro de N mais do que a assimilao de NO3(Alves et al., 1996).

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3.4.2

O fsforo e a fixao biolgica de N2

A deficincia de P tem um impacto negativo na fixao biolgica de N2, pois tanto a reduo do N2 atmosfrico que ocorre nos bacterides, quanto a assimilao de amnia em aminocidos e uredos que ocorre na frao vegetal dos ndulos, so processos consumidores de energia, dependentes da disponibilidade de ATP (Sa & Israel, 1991). A reduo na fixao de N2 em leguminosas sob suprimento limitado de P geralmente explicada por uma diminuio no crescimento do hospedeiro, e em conseqncia na demanda pelo N fixado, no crescimento e funcionamento dos ndulos, ou no crescimento de ambos (Almeida et al., 2000). Entretanto, os mecanismos responsveis pela inibio da fixao de N2 sob limitao de P permanecem incertos (Hogh-Jensen et al., 2002): alguns estudos sugerem que a regulao ocorre no aparato fotossinttico, afetando a produo e o suprimento de carboidratos no estruturais para os ndulos, mas outros trabalhos indicam que a deficincia de P tem um efeito direto no metabolismo dos ndulos e na atividade da nitrogenase. O suprimento limitado de P pode reduzir a atividade especfica da nitrogenase e a concentrao de ATP nos ndulos (Sa & Israel, 1991), e os teores de N, de N-amino e alantona no exsudado xilemtico (Othman et al., 1991). A deficincia de P causa atrasos na formao e crescimento dos ndulos (Vadez et al., 1997; Arajo & Teixeira, 2000; Hogh-Jensen et al., 2002) e um declnio mais rpido na atividade da nitrogenase no estdio de incio de enchimento das vagens (Vadez et al., 1997). Em soja, a carga energtica e a concentrao de ATP nos bacterides no foram afetados pelo suprimento de P, mas as concentraes de ATP e de adenilato nas fraes vegetais dos ndulos foram reduzidas pela deficincia de P, o que indica que a deficincia de P prejudicou a fosforilao oxidativa na frao vegetal dos ndulos em maior extenso do que nos bacterides (Sa & Israel, 1991).

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Plantas dependentes da fixao de N2 apresentam maior requerimento de P para obteno de crescimento timo do que plantas supridas com nitrato, e os parmetros associados fixao de N2 respondem mais intensamente ao suprimento de P do que o prprio crescimento vegetal (Cassman et al., 1980; Israel, 1987). A deficincia de P em soja sob N2 simbitico afetou o equilbrio entre a biomassa de ndulo e raiz de forma mais intensa do que o equilbrio entre raiz e parte area (Cassman et al., 1980), e aumentou a proporo do P retido nos ndulos e razes (Lauer & Blevins, 1989). Os ndulos so um forte dreno de P, com grandes respostas s doses do nutriente e concentraes de P cerca de 2 vezes superiores s da parte area; mesmo diante da reduo do teor de P nos vrios tecidos vegetais sob menor suprimento de P, a concentrao de P nos ndulos pode ser pouco afetada (Pereira & Bliss, 1987; Othman et al., 1991; Hogh-Jensen et al., 2002). Dentre as estratgias de adaptao metablica dos ndulos em plantas sob deficincia de P, podem ser citadas: um aumento da proporo de P alocada nos ndulos (Lauer & Blevins, 1989), uma maior absoro de P da soluo diretamente pelos ndulos e bacterides (Al-Niemi et al., 1998), e um maior consumo de O2 por unidade de N2 reduzido, associado maior permeabilidade do ndulo (Schulze & Drevon, 2005).

3.5

A interao entre fsforo e zinco Resultados controversos tm sido publicados sobre a interao entre o P e o zinco (Zn),

mostrando que: (a) o P no exerce influncia sobre a absoro de Zn; (b) o P pode aumentar a absoro de Zn; (c) o P pode diminuir a absoro de Zn; (d) pode existir um antagonismo entre o P e o Zn, particularmente quando um dos elementos excede o nvel crtico; (e) o P pode diminuir o transporte de Zn da raiz para a parte area; (f) a adio de P em solo deficiente em Zn pode estimular o crescimento das plantas, diluindo a concentrao de Zn nos tecidos; (g) um elevado fornecimento de P pode aumentar a acumulao deste nutriente nas folhas mais velhas em

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concentraes suficientes para causar toxicidade, sedo os sintomas dessa toxicidade identificados erroneamente como deficincia de Zn (Loneragan et al., 1982; Webb & Loneragan, 1988). Na interao mais comum entre P e Zn, a adio de P diminui a concentrao de Zn na parte area. Esta interao verificada quando ambos os nutrientes se encontram em teores limitantes, e a adio de P promove crescimento suficiente para diluir a concentrao de Zn nas plantas a nveis que induzem a deficincia de Zn (Loneragan et al., 1979; Singh et al., 1988). So observadas tambm situaes em que o aumento no fornecimento de P promove diminuio das concentraes de Zn na parte area muito alm do que pode ser explicado pela diluio decorrente do crescimento, indicando que o P pode atuar de modo a reduzir tanto a absoro de Zn pelas razes como a translocao do Zn da raiz para a parte area. A adio de P poderia diminuir a absoro de Zn atravs de dois mecanismos: os ons H+ gerados pela dissoluo dos fosfatos no solo inibem a absoro de Zn, pois esta particularmente sensvel s variaes de pH da rizosfera; o P promove a adsoro de Zn aos componentes do solo, pois a adsoro de P afeta a reteno de Zn atravs da variao de pH ou da alterao nas cargas de superfcie (Loneragan & Webb, 1993). Adicionalmente, tem sido proposto que o P pode induzir imobilizao do Zn nas razes atravs da formao de fitatos de Zn, em condies de elevado suprimento de Zn (Loneragan & Webb, 1993). H tambm situaes onde o aumento no fornecimento de P em condies de baixo suprimento de Zn induz sintomas de deficincia deste micronutriente, reduzindo o crescimento das plantas sem qualquer efeito na concentrao de Zn na parte area. Nesses casos, a aplicao de Zn elimina os sintomas e restaura o desenvolvimento das plantas. Esta sndrome, atribuda a um efeito do aumento do P dentro da planta promovendo aumentos no requerimento interno de Zn, particularmente evidente em plantas crescidas em soluo nutritiva ou areia, mas sem relatos vlidos sobre sua ocorrncia em solo e, por conseguinte, sem efeitos relevantes na produo das culturas (Loneragan & Webb, 1993).

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Uma outra situao refere-se ao efeito da deficincia de Zn promovendo a toxidez de P. Sob condies de alto suprimento de P, a deficincia de Zn aumenta as concentraes de P nas folhas ou parte area de muitas espcies a nveis txicos (Loneragan & Webb, 1993). A inativao do Zn nas plantas pelo P, ou a reduo na disponibilidade fisiolgica do Zn pelo P, seria o principal mecanismo responsvel por esta sndrome. Em todos os nveis de suprimento de Zn, o aumento da dose de P reduziu a proporo de Zn solvel em razes, caules e folhas de plantas de algodo, sendo que a concentrao de Zn solvel nas folhas foi associada com os sintomas visuais de deficincia de Zn e com os teores de clorofila (Cakmak & Marschner, 1987).

EFEITOS DO FSFORO NO CRESCIMENTO VEGETAL O P est particularmente envolvido na transferncia de energia, pois o ATP necessrio para

a fotossntese, translocao e muitos outros processos metablicos de relevncia (Shuman, 1994). Em sua forma inorgnica, o fosfato (Pi) substrato ou produto final em muitas reaes enzimticas importantes, incluindo as da fotossntese e metabolismo de carboidratos, sendo essencial para a regulao das vias metablicas no citoplasma e cloroplasto, sntese de amido e sacarore, transporte de trioses-fosfato, translocao de sacarose e sntese de hexoses (Mitra et al., 1993). Em plantas sob deficincia de P, a alterao do metabolismo primrio para o metabolismo secundrio resulta freqentemente na acumulao de metablitos secundrios como flavonides e indol-alcalides (Vance et al., 2003). Os sintomas de deficincia de P no so to marcantes como para outros macronutrientes, e os efeitos mais evidentes so uma acentuada reduo no crescimento da planta como um todo. Mesmo assim, pode-se observar em plantas deficientes uma colorao verde escura nas folhas mais velhas, e em algumas espcies coloraes avermelhadas em conseqncia da acumulao de antocianina. Outros sintomas de deficincia de P so o menor perfilhamento, atraso no

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florescimento, gemas laterais dormentes, nmero reduzido de frutos e sementes, e pequena nodulao em leguminosas (Malavolta et al., 1997). O baixo suprimento de P diminui a rea foliar, em conseqncia principalmente da reduo no nmero de folhas, e, secundariamente, da limitao expanso da folha (Lynch et al., 1991; Rodrguez et al., 1998). Entretanto, de maneira geral, a deficincia de P tem pequena influncia nas taxas fotossintticas (Fredeen et al., 1989), mas alguns efeitos conflitantes do P na fotossntese podem ser observados, caso no se considerem a intensidade e a poca do estresse por deficincia de P (Rodrguez et al., 1998). Alm disto, deve-se considerar uma possvel resposta diferenciada entre plantas C3 e C4 deficincia de P. O crescimento de plantas C3 mais sensvel deficincia de P do que de plantas C4, mas as espcies C3 e C4 apresentaram a mesma eficincia fotossinttica de uso de P, e teores similares de P em folhas (Halsted & Lynch, 1996). Em soja, a deficincia de P pode afetar a fotossntese via componentes estomticos e no estomticos, pois a taxa fotossinttica pode ser limitada pelo baixo teor foliar de P, tanto em nveis normais quanto de saturao de CO2 (Fredeen et al., 1989). A reduo da fixao fotossinttica de CO2 em soja sob deficincia de P foi atribuda principalmente limitao na regenerao da ribulose-1,5-bifosfato carboxilase (Fredeen et al., 1990). As modificaes no metabolismo fotossinttico observadas sob moderada deficincia de P, como o estmulo recirculao de Pi durante o metabolismo glicoltico e do fosfoenolpiruvato, aumentaram a adaptao de plantas de feijoeiro ao baixo suprimento de P (Kondracka & Rychter, 1997). Plantas de milho, aps 3 semanas de omisso de P, tiveram marcante diminuio nos nveis de amido e protena solvel, e em menor extenso nos nveis de sacarose e glicose (Khamis et al., 1990). Plantas de milho crescidas sob baixa disponibilidade de P apresentaram severa inibio da assimilao fotossinttica do CO2 em folhas, reduo na quantidade de C na forma de amido, reduo nas atividades das enzimas ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase, piruvato ortofosfato diquinase e fosfoenolpiruvato carboxilase, essenciais no metabolismo C4 e na via redutiva das 30

pentoses fosfato, e reduo na atividade da ADPG-pirofosforilase, enzima-chave da sntese do amido (Usuda & Shimogawara, 1991a,b). J a respirao noturna de plantas de trigo no apresentou resposta ao suprimento de P (Rodrguez et al., 1998), pois as plantas dispem de alternativas metablicas da gliclise e do transporte de eltrons nas mitocndrias, que garantem a permanncia da respirao em clulas sob deficincia de P (Theodorou & Plaxton, 1993). Espcies adaptadas a solos de baixa fertilidade geralmente apresentam pequena taxa de crescimento, taxas de absoro de nutrientes moderadas, e alta concentrao de nutrientes nos tecidos, em comparao a espcies de rpido crescimento sob as mesmas condies (Chapin & Bieleski, 1982). A baixa taxa de crescimento pode auxiliar na adaptao a condies de estresse, pois um crescimento lento induz a uma menor demanda e a uma menor exausto dos recursos do ambiente; ocorreria menor incorporao de fotoassimilados e nutrientes, permitindo a formao de reservas dentro da planta; e espcies de menor taxa de crescimento podem sobreviver durante perodos em que nenhum crescimento possvel (Grime & Hunt, 1975). Entretanto, o lento crescimento no constitui necessariamente uma adaptao ao baixo suprimento de P, pois plantas anuais necessitam de um rpido crescimento para poderem competir em seus habitats naturais (Chapin et al., 1989). Uma hiptese usualmente formulada que as cultivares modernas teriam baixa eficincia nutricional, por terem sido selecionadas em condies de alta fertilidade do solo, e uma seleo indireta para alta resposta para fertilizantes pode ter ocorrido por meio da seleo para altas produes (Duncan & Baligar, 1990). A cevada cultivada foi mais responsiva ao P do que a cevada silvestre adaptada baixa disponibilidade de P (Chapin & Bieleski, 1982), e populaes de trevo branco adaptadas a condies de baixa fertilidade foram menos responsivas ao P do que populaes adaptadas elevada fertilidade (Snaydon & Bradshaw, 1962). Todavia, gentipos silvestres de feijoeiro mostraram menor tolerncia ao baixo suprimento de P no solo do que gentipos cultivados, em termos de crescimento vegetativo e produo de gros, indicando que a adaptao ao baixo P foi 31

adquirida durante a domesticao da espcie (Arajo et al., 1997; Beebe et al., 1997). Alm disto, o baixo suprimento de P reduziu a taxa de crescimento relativo mais intensamente na espcie progenitora de cevada do que em uma cultivar, indicando que o processo de seleo no reduziu o potencial de crescimento da espcie sob baixo suprimento de P (Chapin et al., 1989). Nos solos de regies tropicais, bastante intemperizados e com baixos teores de P disponvel, as grandes culturas de interesse econmico, com elevadas taxas de crescimento, normalmente necessitam de elevadas aplicaes de fertilizante fosfatado para obteno de adequadas produtividades. Em 774 ensaios de adubao em todas as regies do Brasil, as produes mdias de oito culturas sem adubao fosfatada variaram de 47 a 91 % das produes com adubao (Raij et al., 1982). Em solos com baixos teores de P disponvel, so requeridas aplicaes anuais de manuteno da ordem de 20 a 50 kg P ha-1 para a maioria das culturas (Raij et al., 1982). Entretanto, em virtude das fortes reaes de adsoro do fosfato nos colides minerais de carga varivel, a adubao fosfatada tem eficincia muito baixa nas regies tropicais, registrando-se uma recuperao pelas culturas de 5 a 20 % do P aplicado em um dado ano agrcola. Deve-se registrar que, nos atuais ritmos de explorao, as jazidas conhecidas de apatita de baixo custo de extrao para fabricao de fertilizantes fosfatados, devem esgotar-se dentro de 60 a 80 anos (Vance, 2001).

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49

CAPTULO 12
Clcio, Magnsio e Enxofre Godofredo Csar Vitti1;Eduardo Lima2;Fernanda Cicarone1 1 - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Departamento de Solos e Nutrio de Plantas. Av. Pdua Dias, 11 Agronomia- 13418900 - PIRACICABA, SP - Brasil - Caixa-Postal: 09 E-mail: gcvitti@esalq.usp.br 2 - Departamento de Solos, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, BR 465, Km 7, SEROPDICA, 23890-000, Rio de Janeiro. E-mail: edulima@ufrrj.br

Sumrio
1 CLCIO ............................................................................................................................................3 1.1 1.2 1.3 CLCIO NO SOLO .......................................................................................................................3 CLCIO NA PLANTA ....................................................................................................................5 DISTRIBUIO E FUNO ...........................................................................................................5 FONTES DE CA ................................................................................................... 9 DEFICINCIA DE CA ......................................................................................... 11 SINTOMAS DE DEFICINCIA NAS PLANTAS ........................................................ 11

1.4 1.5 1.6 2

MAGNSIO .......................................................................................................... 12 2.1 MAGNSIO NO SOLO ........................................................................................ 12 2.2 MGNA PLANTA ................................................................................................ 15 2.2.1 Distribuio e funo.................................................................................. 15 2.3 FONTES DE MG ................................................................................................ 19 2.4 DEFICINCIA DE MG ........................................................................................ 21 2.4.1 Sintomas de deficincia .............................................................................. 22

ENXOFRE............................................................................................................. 23 3.1 ENXOFRE NO SOLO .......................................................................................... 23 3.2 ENXOFRE NA PLANTA ...................................................................................... 26 3.2.1 Distribuio e funo.................................................................................. 26 3.3 FONTES DE S.................................................................................................... 35 3.4 DEFICINCIA DE S............................................................................................ 39

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................... 42

CLCIO

1.1

Clcio no Solo A participao de Ca total no solo varia de 0,1 % at mais de 25 %. Os solos

calcrios, em ambiente rido, contm os maiores nveis deste nutriente (Lopes 1998). Solos orgnicos recentemente drenados geralmente contm muito pouco Ca e apresentam valores de pH extremamente baixos (condies freqentes em solos tropicais). Os solos argilosos geralmente contm mais Ca do que os arenosos. O Ca no solo apresenta-se, principalmente, nas seguintes formas: carbonatos metamrficos ou sedimentares, os ltimos sendo em parte de origem biolgica; sulfatos; e silicatos - estando presente em teores mais altos em alguns minerais primrios como anortita, augita, epidoto e apatita e mais baixos nos secundrios. Na realidade, minerais como a dolomita, calcita, apatita e feldspatos clcicos so as maiores fontes de Ca no solo (Figura 1) (Korndrfer, 2003).
Ca, Mg Material de origem Ca, Mg Calcrios, adubos Ca, Mg Fixos Adio Intemperismo Troca Ca, Mg - Soluo do Solo Ca, Mg Trocveis -

Mineralizao Imobilizao Ca, Mg Mat.Org.do Solo Ca, Mg Planta Absoro

Lixiviao, eroso

Ca, Mg Drenagem Enxurrada

Ciclos do Clcio e do Magnsio no sistema solo-planta. Fonte: Malavolta,1976. Figura 1--

O Ca pode se encontrar nas formas trocvel e solvel, sendo a primeira em solos mais argilosos como ction dominante no complexo de troca (65 %) seguido do Mg (20%), o potssio (5 %) e o H+ (10 %) A forma solvel ocorre na soluo do solo em concentraes muito baixas, de modo particular nos solos cidos das regies tropicais. Como um ction, participante do fenmeno de troca de ctions (CTC), e retido como Ca2+ (trocvel) nas superfcies com cargas negativas das argilas e da matria orgnica do solo. O Ca o ction normalmente dominante da CTC dos solos cultivados, ocupando cerca de 30 % ou mais da CTC. Como os solos das regies tropicais possuem, geralmente, baixas concentraes de Ca e maiores de Al, poder ocorrer deficincia de Ca que limitar o crescimento das culturas mais exigentes.

1.2 1.3

Clcio na planta Distribuio e Funo O Ca absorvido pelas razes como Ca2+ podendo sua absoro ser diminuda

por altas concentraes de K+, Mg2+ e N-NH+4 no meio de cultivo. Apresenta raio inico hidratado relativamente grande (0,412 nm). Encontra-se firmemente ligado a estruturas no apoplasma, sendo parte trocvel nas paredes celulares e membrana plasmtica. Grande parte do Ca pode ser encontrada nos vacolos. Baixas concentraes so encontradas no simplasma e no floema, indicando sua baixa mobilidade na planta. Muitas das funes do Ca esto ligadas composio estrutural de macromolculas e relacionadas a sua capacidade de coordenao, o que confere ligaes intermoleculares estveis mas reversveis, principalmente nas paredes celulares e na membrana plasmtica. Na folha o Ca torna-se muito imvel e somente pode ser redistribudo em condies especiais como: a injeo de outros ctions na nervura, tratamento com cido triiodo tetractico (EDTA agente quelante), tratamento com cido triiodo benzico (regulador de crescimento), cidos mlico ou ctrico. O Ca aplicado via foliar transportado no floema preferencialmente para tecidos novos, estando o movimento atrelado atividade metablica. A maior parte do Ca no tecido vegetal est localizada nas paredes celulares (apoplasto), resultante da grande quantidade de stios de ligao para este elemento nestas clulas e ao transporte restrito do Ca no citoplasma. Na lamela mdia ligado a radicais R-COO- das pectinas em formas mais ou menos trocveis. Quando se aumenta o suprimento de Ca, ocorre, de modo geral, um aumento na produo de oxalato de Ca nos tecidos vegetais. Um aumento na concentrao de Ca++ na soluo externa (soluo do solo ou soluo nutritiva) leva a um aumento no contedo de Ca nas folhas, mas no

necessariamente em rgos como frutos e tubrculos (drenos) que so supridos predominantemente pelo floema (em funo da sua baixa mobilidade), ocasionando, por vezes mal desenvolvimento ou deformaes nestes rgos. Plantas desenvolveram mecanismos que restringem o transporte de Ca para esses drenos mantendo baixas concentraes deste nutriente nas clulas do floema ou precipitado como oxalato ao longo dos tubos crivados ou ainda no tegumento das sementes. (Fink, 1991; Mix & Marschner, 1976). As baixas concentraes de Ca livre no citossol so atribudas a uma baixa permeabilidade geral das membranas para este elemento e pela ao de transportadores de membrana que removem Ca do citossol, colocando-o no apoplasto ou acumulando-o em estocadores intracelulares como o retculo endoplasmtico, cloroplastos e vacolo.(Evans et al., 1991). O mais importante transportador de Ca na membrana plasmtica, e provavelmente tambm no retculo endoplasmtico, a bomba de Ca-ATPase, existindo tambm um antiporte (Ca2+/H+) (Jones et al., 1993; Kasai & Muto, 1990). O transporte de Ca no tonoplasto tambm atribudo a um antiporte Ca++/H+, energizado pela bomba de prtons (H+-ATPase). Em mdia, estes antiportes mantm a diferena de concentrao da ordem de 105 entre o Ca livre no vacolo e no citossol (Schumaker & Sze, 1990). Em clulas vacuoladas das folhas, uma grande proporo de Ca est localizada nos vacolos, o que contribui para o balano ction-nion (Kinzel,1989). Em espcies vegetais que preferencialmente sintetizam oxalato em resposta reduo do nitrato, a formao de cristais de oxalato de Ca nos vacolos importante para a manuteno da baixa concentrao de Ca livre no citossol. Uma extruso ativa de Ca2+ (bomba de efluxo de Ca2+) tambm existe na membrana plasmtica das clulas da raiz (Olbe & Sommarin, 1991). Desde que a

concentrao de Ca na soluo do solo apresenta-se superior a 1 mM, a bomba de efluxo de Ca2+ deve ter uma demanda considervel de energia para evitar o transporte de Ca atravs do gradiente eletroqumico. Entretanto, deve-se considerar tambm que fatores fsico-qumicos como o tamanho e a valncia do Ca podem restringir bastante a sua mobilidade ao longo do gradiente de potencial eletroqumico atravs da membrana citoplasmtica. A maior proporo do Ca na planta encontra-se em formas no solveis em gua, ao contrrio do que acontece com o K. Uma grande parte do Ca insolvel est na parede celular, na forma de pectato de Ca como o principal componente da lamela mdia. O mesmo aumenta a rigidez da parede e dificulta o aumento do tamanho da clula. Em clulas mais maduras o Ca pode estar na parede na forma de carbonato, oxalato, sulfato, fosfato, tartarato ou citrato. O Ca tambm est presente na planta na forma de sais clcicos que ocorrem mais freqentemente nos vacolos de clulas especializadas - idioblastos. Entre esses sais predomina o oxalato que se encontra em qualquer parte da planta. Outros sais de Ca encontrados (fora das paredes) so: carbonato, sulfato, fosfato, silicato, citrato, tartarato, malato e, possivelmente, complexos insolveis com cidos graxos. A insolubilidade dos compostos de Ca na planta e sua localizao na clula justificam, em parte, a falta de redistribuio em condies de deficincia o que provoca o aparecimento de sintoma de deficincia em rgos ou partes mais novas como as gemas e ponta das razes. Nas folhas o denominador comum para a falta de Ca clorose nas mais novas; tal sintoma em geral caminha das margens para o centro. O aparecimento de sintomas em frutos, como o do tomateiro e da macieira, acontece devido competio do mesmo pelo Ca contido no xilema, uma vez que transpiram mais (Minami, 1989; Trani, 1982).

Uma das funes do Ca j foi citada (componente da parede celular), mas so conhecidas outras funes desse macronutriente secundrio. Este tem importante papel na absoro inica, particularmente na correo do efeito desfavorvel da concentrao hidrogeninica excessiva, sendo essencial para que tal efeito no diminua a absoro de nutrientes que necessitam do Ca, pois indispensvel manuteno da estrutura das membranas celulares (em particular da plasmalema). A observao de que o efeito prejudicial da salinidade provocada por altas concentraes de adubos solveis pode ser diminudo aumentando-se a disponibilidade de Ca, como sulfato, no substrato; talvez tenha relao com o papel do elemento na estrutura e no funcionamento das membranas celulares que, com pouco Ca, permitem o vazamento de compostos j absorvidos; ATP-ases de membrana que participam da absoro inica so ativadas pelo Ca. Foi demonstrado tambm que a toxidez devido amnia pode ser anulada em parte pelo Ca fornecido s razes. A falta de Ca afeta particularmente os pontos de crescimento da raiz, causando o aparecimento de ncleos poliplides, clulas binucleadas, ncleos constritos, divises amitticas, o crescimento paralisado e ocorre escurecimento com posterior morte da raiz. Para a nodulao nas leguminosas h necessidade maior de Ca do que para a planta propriamente dita, pois uma vez formados os ndulos a leguminosa pode crescer com concentraes relativamente baixas desse nutriente (Embrapa, 1996; Malavolta, 1997). O Ca indispensvel para a germinao do gro de plen e para o crescimento do tubo polnico o que se deve ao fato de estar presente na sntese da parede celular ou no funcionamento da plasmalema (Malavolta, 1980). O Ca de grande importncia para o desenvolvimento do ginforo do amendoim devendo estar presente em concentrao relativamente alta no solo nas proximidades

deste rgo, motivo pelo qual, s vezes, se usam adubos clcicos em cobertura (Cmara et al., 1980). Cerca de 60 % do Ca total das folhas encontra-se nos cloroplastos: a acumulao deste nutriente nessas organelas dependente do suprimento de energia, o mesmo acontecendo no caso dos mitocndrios. So relativamente poucas as enzimas ativadas por Ca: (exemplos) Em tubrculo de batata

ATP ADP + P; ATPase (aspirase) Em cevada

amido n glicose; alfa amilase Em repolho

lecitina + H2 colina + cido fosfatdico; fosfolipase D

1.4

Fontes de Ca O Ca pode ser fornecido s plantas de vrias formas (Figura 2), que mostra a

adio e perda de Ca e Mg no sistema solo-planta.

Minerais no solo Restos Orgnicos

Adubos Minerais

Calcrios

Ca e Mg disponveis no solo

Remoo na Colheita Lavagem

Eroso
9

. Figura 2 -Processo de adio e perda de Clcio e Magnsio nos solos. Fonte: Malavolta (1976)

Em decorrncia da maior parte dos solos deficientes em Ca ser de reao cida, um bom programa de calagem pode adicionar Ca de modo eficiente ao sistema. Tanto o calcrio calctico como o dolomtico so fontes excelentes desse nutriente. O gesso tambm pode suprir Ca quando o pH do solo j est suficientemente elevado e no necessita de calagem. O superfosfato simples que contm 50 % de gesso, e tambm em menor intensidade o superfosfato triplo, podem adicionar Ca ao solo (Vitti & Luz, 2004). No Quadro 1 so mostradas algumas fontes de Ca. Quadro 1 - Fontes comuns de Clcio Fonte Calcrio calctico Calcrio dolomtico Escria bsica Gesso Margas Cal hidratada Cal virgem Fonte: Lopes (1998) Ca (%) 32 22 - 27 29 22 24 46 60 Valor neutralizante 85 a 100 90 a 108 50 a 70 Nenhum 15 a 85 120 a 135 150 a 175

Quando forem usadas fontes de Ca que no sejam os calcrios modos, deve-se se ter cuidado com a aplicao. O excesso de cal hidratada, de acordo com Lopes (1998), pode causar danos microbiota do solo. A adio de grandes quantidades de Ca e Mg em solos deficientes em K, ou a aplicao de Ca em um solo deficiente em Mg pode causar o desequilbrio nutricional e o crescimento reduzido da cultura; portanto, necessrio o fornecimento de todos os nutrientes de maneira equilibrada para diminuir as condies limitantes ao crescimento das plantas.

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O gesso, alm de ser uma excelente fonte de S e Ca para as plantas, tem demonstrado efeitos positivos em experimentos de campo quando aplicado em superfcie, favorecendo o aprofundamento das razes das plantas cultivadas em reas com subsolos cidos. Isto leva melhor absoro de gua e nutrientes das camadas mais profundas do solo (Raij, 1991). 1.5 Deficincia de Ca A disponibilidade de Ca adequada quando os solos no so cidos (pH entre 6,0 e 6,5) ou quanto a acidez corrigida pela aplicao de calcrio em doses adequadamente recomendadas. Quando o solo se torna cido em conseqncia da lixiviao ou perda de bases pela eroso, adubao, e absoro e exportao de bases pelas culturas, o crescimento e desenvolvimento das plantas freqentemente prejudicado pelas concentraes txicas de Al, Mn e Fe, alm da falta de Ca. A anlise de solo e um bom programa de calagem so as melhores prticas de manejo para prevenir esses problemas (Raij et al., 1996). 1.6 Sintomas de deficincia nas plantas O limitado crescimento do sistema radicular um sintoma comum da deficincia de Ca. Razes deficientes, geralmente, escurecem e apodrecem, como j citado. As folhas jovens e outros tecidos novos desenvolvem sintomas porque este nutriente no remobilizado dentro da planta. As deficincias de Ca nesses tecidos causam um aspecto gelatinoso nas pontas das folhas e nos pontos de crescimento. Isso deve-se ao fato da necessidade de pectato de Ca para a formao da parede celular. Em condies de deficincia mais severa os pontos de crescimento podem morrer (Lopes, 1998).

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As deficincias de Ca podem no ser muito freqentes no campo porque os efeitos secundrios de deficincia, como a acidez elevada, geralmente limitam primeiro a produo. As deficincias so mais comuns em culturas como o amendoim e as hortalias (a podrido estilar do tomateiro). Em alguns casos, como o do tomate, as folhas apresentam teores normais deste nutriente, enquanto o fruto se mostra deficiente devido pequena translocao e ao transporte unidirecional do Ca no xilema (Castellane, 1982). 2 MAGNSIO

2.1

Magnsio no solo O Mg no solo aparece na forma inica Mg2+, em soluo e como ction trocvel.

Alm disso, o Mg participa da estrutura de micas e minerais de argila do tipo 2:1, encontrados em solos menos intemperizados, nos quais possvel a persistncia desses e de outros minerais contendo esse elemento. Em condies de boa drenagem os teores trocveis de Ca predominam na soma de bases, vindo a seguir, em teores bem mais baixos, o Mg e depois o K. O Mg pode aparecer no solo como carbonatos insolveis, em solos calcrios, ou em solos que receberam calagem recente, nesses casos em partculas de granulometria grosseira que no dissolvem rapidamente. De maneira geral, o fornecimento de Mg s culturas depende da concentrao de Mg e da sua disponibilidade no solo (Figuras 1 e 2). O primeiro fator determinante da atrao entre o on e a superfcie de troca a carga do ction, o segundo o tamanho do on hidratado, os menores sendo retidos com maior energia. Conseqentemente, em solos bem drenados, a freqncia natural de ocorrncia dos ctions trocveis , em geral, segundo essa ordem, mesmo quando o solo 12

formou-se de rochas mais ricas em Mg ou K, por exemplo. Desvios dessa seqncia ocorrem em condies de m drenagem ou, em alguns casos, por liberao de Mg ou K de minerais primrios, o que mais comum em profundidade, em alguns solos (Raij, 1981). Maior liberao (lixiviao) Ca+2 > Mg+2 > K+ > Na+ Maior adsoro Tal como acontece com o K e o Ca, o Mg aparece no solo, segundo Malavolta (1981), em diferentes formas: Minerais primrios silicatos com Mg estrutural, como o caso de piroxnios, anfiblios, olivina e turmalina; muscovita e biotita tambm contm Mg; Carbonatos e sulfatos a dolomita, CaMgCO3, calcrios dolomticos e magnesianos, magnesita, MgCO3, podem ocorrer em camadas; em regies ridas e semiridas, a epsomita (sal amargo, MgSO4.7H2O) encontrado no solo; Minerais secundrios o Mg pode fazer parte de algumas argilas como a montmorilonita, a ilita e a clorita, mediante substituio do Al octadrico; a vermiculita, produto da intemperizao hidrotermal das micas, possui Mg que desloca o K, com expanso dos espaos entre camadas; Matria orgnica Mg em compostos orgnicos. Teores mais altos de Mg so, de modo geral, encontrados nos solos mais argilosos na forma de minerais ferromagnesianos facilmente intemperizveis, tais como biotita, serpentina, hornblenda e olivina. O Mg ocorre tambm em minerais secundrios que incluem clorita, vermiculita, ilita e montmorilonita. Alguns solos contm Mg como magnesita (MgCO3) ou dolomita (CaMgCO3). Em regies ridas ou semi-ridas, solos

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podem conter grandes quantidades de Mg como epsomita (MgSO4.7H2O) (Neptune, 1986). A distribuio do Mg nos solos pode ser considerada do mesmo modo que a distribuio do K e do Ca e pode ser dividida nas seguintes formas: no-trocvel ou fixa, trocvel e solvel. A frao do Mg predominante no solo a forma no trocvel, que inclui todo o Mg nos minerais primrios e a maior parte do Mg dos minerais secundrios. Acreditase, hoje, que parte desta forma pode ser mais disponvel do que se pensava. O Mg trocvel da ordem de aproximadamente 5 % do Mg total (0,04 0,34 % nos solos do Estado de So Paulo); esta frao juntamente com o Mg solvel da maior importncia no suprimento deste nutriente s plantas. Esta forma trocvel constitui de 4 a 20 % da CTC. ento consideravelmente menor do que aquela do Ca. Nos solos cidos das regies midas, o Mg2+ o terceiro ction mais abundante no complexo de troca, aps o Ca2+ e o H+ e nos solos das regies semi-ridas, vem logo depois do Ca2+, exceto nos solos alcalinos onde perde o lugar para o Na+. Nestes solos cidos das regies midas, possvel que haja competio do H+ e do Al3+ na absoro do Mg2+, enquanto que a competio do Ca2+ pode ocorrer em solos onde foi aplicada alta dose de calcrio. Assim, abaixando ou elevando o pH, a absoro do Mg2+ diminui por competio do H+, Al3+ ou Ca2+. A deficincia de Mg no solo pode surgir sob as seguintes condies: 1) Solo cido (pH < 5,4); 2) % Mg da CTC (< 6 %); 3) Alto teor em K; 4) Relao K/Mg > 4; 5) Concentrao inferior a 48 mg.dm-3 (4 mmolc.dm-3) Mg no solo.

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Os solos, como j citado, geralmente contm menos Mg do que Ca, porque o Mg no adsorvido to fortemente pelas argilas e matria orgnica e, conseqentemente, mais sujeito lixiviao. Alm disso, a maioria do material de origem contm menos Mg do que Ca. Embora a maioria dos solos contenha Mg suficiente para suportar o crescimento das plantas, podem ocorrer deficincias, mais freqentemente em solos arenosos, cidos, formados sob condies de elevado ndice pluviomtrico. As deficincias tambm podem ocorrer em solos calcrios onde a gua de irrigao contm altos nveis de bicarbonato, ou ainda em solos alcalinos (sdicos) (Lopes, 1998). A relao do Mg para o K pode ser um fator importante sob certas condies. Por exemplo, adubando-se com K pode-se diminuir a absoro de Mg por gramneas pastoreadas por gado, o que resulta em baixo teor de Mg no soro sanguneo e uma condio conhecida como tetania das gramneas. Baixas temperaturas do solo e adequada umidade, na presena de quantidades moderadas de K, resultam numa maior absoro de K, em comparao com Mg, e o aparecimento de forragem de gramnea indutora de tetania (Lopes, 1980).

2.2

Mg na Planta

2.2.1

Distribuio e funo Considera-se como formas disponveis o Mg da soluo do solo e o adsorvido ao

complexo de troca do solo. O raio inico deste elemento da ordem de 0,428 nm. O Mg2+ trocvel normalmente constitui 5-20 % do total da capacidade de troca inica; o Ca2+ representa em torno de 35-45 % e o K+ cerca de 5 %; nos terrenos cidos das regies tropicais e subtropicais, entretanto, a participao do Ca2+ e a do Mg2+ pode ser menor. Na soluo do solo a concentrao de Mg2+ da ordem de 48 a 120 mg.dm-3; em 15

nmeros aproximados pode-se dizer que a concentrao de Mg2+ em soluo o dobro daquela de K+. Pode haver perdas de Mg do solo por lixiviao da ordem de 2-30 kg.ha-1.ano-1 (Mengel Kirkby, 1978). A absoro do Mg2+ pelas plantas se faz de modo semelhante ao K. Mas para que ocorra absoro necessrio que ocorra contato do elemento com a raiz da planta, seja por interceptao radicular, por difuso ou por fluxo de massa, sendo o fluxo de massa o mecanismo responsvel pela maior proporo do contacto dos ctions bivalentes, Ca2+ e Mg2+, com a raz. A taxa de absoro de Mg pode ser muito afetada por outros ctions como K+, NH4+, Ca2+ e Mn2+ assim como H+ em condies de baixo pH (Heenan e Campbell, 1981). Deficincia de Mg induzida pela competio com outros ctions tem sido observada com frequncia. As funes do Mg nas plantas esto relacionadas, principalmente, com a sua capacidade de interagir com ligantes nucleoflicos como os grupos fosforlicos por meio de ligaes inicas, e agindo como elemento de ligao e/ou formando complexos de diferentes estabilidades. Embora muitas das ligaes envolvendo o Mg sejam principalmente inicas, algumas so covalentes, como na molcula de clorofila. Mg forma complexos ternrios com enzimas nas quais ctions de ligao so necessrios para estabelecer a geometria precisa entre a enzima e o substrato, como ocorre na RuBP carboxilase. (Pierce, 1986). Grande proporo do Mg total da planta est envolvida na regulao do pH celular e no balano ction-nion. A relao K/Mg na planta geralmente varia entre 7 e 10. Se o teor absoluto de Mg for relativamente baixo os sintomas da falta desse elemento podero aparecer quando a relao for da ordem de 15-20, quando o Mg2+ representa menos de 10 % do total das bases trocveis, as condies so favorveis ao aparecimento da deficincia

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induzida pelo excesso de K. Um excesso de Mg, por sua vez, pode causar deficincia de K ou, principalmente, de Ca. De modo geral, os teores de Mg nas partes novas das plantas so maiores que os encontrados nas mais velhas, embora o inverso possa ocorrer tambm. O Mg2+ como o Ca2+ e o K+ se move para cima na corrente transpiratoria. Ao contrrio do que se d com o Ca e de modo semelhante ao que ocorre com o K, o Mg2+ mvel no floema, ocorrendo translocao na planta (Malavolta, 1979). Dependendo do status nutricional do Mg na planta, entre 6 e 25 % do total do elemento faz parte da clorofila. Em geral, outros 5 a 10 % do Mg total nas folhas e pices est ligado a pectatos nas paredes celulares ou precipitado como sais solveis de reserva no vacolo, como por exemplo fosfatos de Mg. Os restantes 60-90 % so extraveis em gua. Em muitos casos, o crescimento afetado e aparecem sintomas visuais de deficincia de Mg quando a proporo do elemento na clorofila excede a 2025 %. A distribuio de Mg entre o citossol e os cloroplastos deve ser regulada no pool metablico. Em cloroplastos isolados, a fotossntese inibida por 5 mmol.L-1 de Mg na soluo externa. Esta inibio causada por um decrscimo no influxo de K. Esta inibio da fotossntese pode ocorrer em funo de altas concentraes de Mg no pool metablico em plantas inteiras sob estresse causado pela seca. O Mg entra na composio da fitina (sal de Ca e Mg do cido inositol fosfrico) que se acumula nas sementes. Quando estas germinam, P e Mg migram para as diversas partes da planta em via de crescimento, contribuindo para a formao de novos tecidos (Neptune, 1986). As funes do Mg no metabolismo da planta so: 1. Clorofila as clorofilas so porfirinas magnesianas e o Mg corresponde a 2,7 % do peso molecular das mesmas; representa cerca de 10 % do teor total de Mg da

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folha. Os plastdeos, entretanto, tem mais Mg alm daquele contido na clorofila: a converso de energia das principais funes dos cloroplastos e, como se ver logo mais, o Mg ativador de enzimas relacionadas ao metabolismo energtico. 2. Ativao enzimtica o Mg ativa mais enzimas do que qualquer outro elemento. Um papel principal do elemento ser cofator de quase todas as enzimas fosforilativas, formando uma ponte entre o pirofosfato do ATP ou ADP (tri e difosfato de adenosina, respectivamente) e a molcula da enzima. A transferncia de energia desses dois compostos fundamental nos processos de fotossntese, respirao (gliclise e ciclo dos cidos tricarboxlicos), reaes de sntese de compostos orgnicos (carboidratos, lipdeos, protenas), absoro inica e trabalho mecnico executado pela planta. Em algumas das reaes de transferncias de grupos fosfatados, o Mg2+ pode ser substitudo por outros ons como o Mn2+, principalmente; muitas vezes, porm, mais eficiente do que o seu substituto. A falta de Mg inibe a fixao do CO2 mesmo na presena de clorofila suficiente: o elemento exigido em reaes de fosforilao que limitam a regenerao da ribulose difosfato o acar que `aceita o CO2 fixado fotossinteticamente; alm disso, necessrio para a atividade da prpria enzima que faz isso a carboxilase da ribulose difosfato. O metabolismo do N tambm influenciado: nas plantas deficientes em Mg o teor de N-protico menor, aumentando o de N-no protico evidenciando que a falta de Mg afeta a sntese de protena. A ativao dos aminocidos, passo obrigatrio no processo, exige Mg; a transferncia dos aminocidos ativados para formar a cadeia polipeptdica ou protica tambm necessita de Mg. 3. Carregador do P encontra-se na literatura a citao que o Mg seria um elemento carregador do P, ou seja, contribuiria para a entrada de P na planta. Talvez possa ser atribudo a isso o aumento da absoro de fsforo na presena de Mg. Acredita-se, tambm, que o efeito seja devido ao papel do Mg nas reaes de

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fosforilao. Esse papel do Mg tem um possvel aspecto prtico; o de aumentar a eficincia da absoro do fsforo pelas razes. Diferente do Ca2+, o Mg2+ muito mvel no floema e translocado das folhas mais velhas para as mais novas ou para os pontos de crescimento. Em frutos e tecidos de reserva que so dependentes do floema para o suprimento mineral, encontra-se mais K e Mg do que Ca (Schimansky, 1973).

2.3

Fontes de Mg A fonte mais comum de Mg o calcrio dolomtico um material que contm

Ca e Mg e corrige a acidez do solo. Outras fontes incluem o sulfato de Mg, xido de Mg, as escrias bsicas, o sulfato K e Mg e os termofosfatos. No Brasil, so bastante comercializados os calcrios dolomticos calcinados, que apresentam 26 a 32 % de Ca e 9 a 15 % de Mg, constituindo-se em excelentes fontes desses nutrientes (Quadros 2 e 3). As formas de sulfato de Mg so mais solveis do que calcrio dolomtico e podem ser a fonte preferida de Mg em condies que requerem de resposta rpida a esse nutriente. Quadro 2. Fontes comuns de magnsio. Material Calcrio calctico Calcrio dolomtico Magnesita (xido de Mg) Sulfato de Mg heptahidratado Sulfato de potssio e magnsio Cloreto de magnsio Termofosfato Fonte: (Lopes, 1998). Mg (%) < 5,0 5,0 12,0 55 9,6 11,2 7,5 7,0

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Quadro 3. Adubos-fonte de magnsio. Adubo Cianamida, clcica Nitrato de clcio Nitroclcio Salitre do Chile Tortas oleaginosas Estercos Resduo de esgoto Farinha de ossos Fosfato natural Superfosfatos Cloreto de potssio Sulfato de potssio Kieserita Sulfato de magnsio Nitrato de magnsio Magnesita Fonte: modificado de Malavolta (1976). As perdas por lixiviao dependem da quantidade de gua que passa atravs do solo e da concentrao de Mg na soluo do solo a qual pode ser aumentada pela adio de sais solveis: a adubao com superfosfato e sais potssicos aumenta o teor de Mg na gua de percolao. O fornecimento de Mg atravs de calcrio deve ser realizado quando o solo apresentar condies de acidez; caso contrrio, quando se pretende fornec-lo somente como nutriente, prefervel utilizar sais solveis como fonte do elemento. MgO% 0,06 1,5 6-8 0,05 0,3-0,5 0,9 0,5-0,7 0,4 0,2 0,2-0,3 0,1 1-2 18 10-16 14-16 44-46

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O quadro 4 apresenta as quantidades exigidas de Ca, Mg e S por vrias culturas. Quadro 4 - Exigncias de Ca, Mg e S por vrias culturas. Total absorvido Cultura Algodo Amendoim Arroz Caf (1) Cana Eucalipto Feijo Forrageiras Gramneas Leguminosas Laranja (2) Milho Soja Tomate Trigo 1t de matria seca 1t de matria seca 18t de frutos 5 t de gros 2,5 t de gros 40 t 3 t de gros 5 13 160 19 42 15 7 3 4 9 26 25 18 9 1 2 9 13 5 27 8 Nvel de produo 500 kg de fibra 2 t de gros 3 t de gros 3 t de gros 100 t de colmos 100 m3 de madeira 1 t de gros Ca 15 10 27 63 100 140 58 Mg -----------Kg----------12 12 9 30 52 35 19 10 11 12 10 45 38 26 S

(1) Quantidades absorvidas entre 5,5 e 6,5 anos de idade para uma produo de 50 sacas beneficiadas. (2) Quantidades totais contidas em um pomar produzindo 2 caixas de 40,8 kg/p, com 210 plantas.ha-1. Fonte: Potafs, 1996. 2.4 Deficincia de Mg A necessidade de Mg para um timo crescimento das plantas situa-se na faixa de 0,15-0,30 % do peso seco da parte vegetativa da planta. De acordo com Arnold (1967), os solos com deficincia de Mg mais freqentemente situam-se em trs grandes grupos: (1) Solos com baixos teores de Mg trocvel, geralmente de textura arenosa;

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(2) Solos cidos; (3) Solos com alto teor de K trocvel. No primeiro caso, a reserva de Mg pode ser insuficiente ou pode ser exaurida por lixiviao: nos solos cidos o antagonismo por ctions em excesso (H+, Al3+, Mn2+, Fe2+) pode causar a carncia; o alto teor de K trocvel faz com que aumente a relao K+/Mg2+ na soluo do solo podendo causar sintomas de deficincia de Mg. De modo parecido com o descrito para o K, o Mg no trocvel, tanto estrutural como o fixado entre as camadas de argila, pode se tornar disponvel devido ao intemperismo (Malavolta, 1979). A deficincia de Mg pode ser induzida por excesso de K na adubao o que produziria um efeito semelhante ao alto teor desse elemento no solo aumentando a relao K/Mg. De acordo com Shone (1967), as doses muito altas de adubos potssicos quando usadas em solos pobres em Mg++ podem, alm de causar diminuio na absoro do Mg, provocar lavagem deste nutriente para camadas mais profundas do perfil, fora do alcance das razes. Em solos deficientes em K, porm, a adio desse elemento como adubo pode levar maior absoro de Mg o que acompanhado por aumento na matria seca produzida. O baixo nvel de umidade no solo pode provocar diminuio na sua absoro, pois pode ocorrer menor transporte do Mg++ para a raiz pelo processo do fluxo de massa.

2.4.1

Sintomas de deficincia Os sintomas de deficincia de Mg geralmente aparecem primeiro nas folhas mais

velhas. Isso acontece porque o Mg redistribudo na planta. A deficincia aparece como uma cor amarelada, bronzeada ou avermelhada, enquanto as nervuras das folhas

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permanecem verdes (reticulado grosso). Exemplo: as folhas de milho com faixas amarelas e com as nervuras verdes (Bll, 1993) . O desequilbrio entre o Ca e o Mg no solo pode acentuar a deficincia de Mg. Quando a relao Ca/Mg torna-se muito alta, a planta pode absorver menos Mg. Isto pode ocorrer quando se usa somente calcrio calctico por muitos anos, em solos relativamente pobres em Mg. A deficincia de Mg tambm pode ser acentuada por altas doses de K+ ou NH4+, quando o solo esta no limite de deficincia (Lopes, 1998).

ENXOFRE

3.1

Enxofre no Solo A crosta terrestre contm cerca de 0,11 % de S e a rocha matriz constitui a fonte

primria do elemento: ela fornece sulfetos metlicos os quais, em solos bem arejados, se transformam rapidamente em sulfatos. A esse S mineral junta-se o S orgnico proveniente dos restos animais e vegetais e o da matria orgnica dos solos. Outra fonte adicional de S o SO2 da atmosfera, oriundo da queima de combustveis fsseis, da madeira e de outros produtos orgnicos. O SO2 oxidado em parte a SO42- e trazido ao solo pelas chuvas em quantidades que, no Brasil, correspondem a 5-30 kg.ha-1 de S em um ano, insuficiente para atender a exigncia da maioria das culturas (Malavolta,1980). A maior parte do S do solo est na forma orgnica que, por via microbiana, convertido em produtos disponveis para a planta. No se considerando os solos semiridos onde, devido drenagem insuficiente, acumulam-se grandes quantidades de sulfatos de K, Mg e Na, a matria orgnica o principal reservatrio de S para as culturas (Freney & Swaby, 1975) .

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Nos solos bem aerados, o S mineral aparece quase exclusivamente como sulfato (SO4-2), enquanto que em condies anaerbicas os sulfetos (S2-) so a forma mais comum. Em solos inundados ocorre a reao: SO42- + 10 H+ + 8 eH2S + 4 H2O

O gs sulfidrico produzido poder reagir como o Fe originando sulfeto ferroso (com o que fica afastado o perigo de toxidez cultura por conta do sulfeto): Fe2+ + S2FeS

Os sulfatos existem no solo em soluo ou em outras formas: em combinaes pouco solveis com Fe e Al e adsorvidos. A adsoro do SO42- depende dos teores de argila, da presena de hidrxidos de ferro e de alumnio e do pH. Segundo Malavolta (1980), acredita-se que a adsoro do sulfato implique na substituio de OH dos oxihidrxidos e da argila: - X = 2(OH) + SO42- X = SO4 + 2 OH-

O aumento do pH (ou seja, adio de hidroxila OH-) deslocaria a reao para a esquerda dessorvendo o SO42-; por isso a fixao do sulfato (adsoro) maior em solos cidos, sendo diminuda pela calagem (Vitti, 1989). Ao lado dos sulfatos, podem aparecer, em pequena proporo e de forma transitria, produtos intermedirios que se formam durante as transformaes do S no solo e que, eventualmente, vo resultar em sulfato: sulfito (SO32-); tiossulfato (S2O32-); politionato (S4O62-) (Neptune et al., 1975). No se sabe muito a respeito dos compostos orgnicos de S no solo. Admite-se que o S orgnico esteja repartido do seguinte modo: 1. Aminocidos livres: pequena proporo de cistena, cistina, metionina, sulfxido de metionina, metionina sulfona, cido cisteico, cido cisteino-sulfnico, taurina;

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2. Sulfato orgnico: alta proporo como SO42- ligado a fenis, colina (base nitrogenada), carboidratos e lipdeos; 3. Derivados de quinonas e aminocidos com S: alta proporo, parte do hmus muito resistentes mineralizao por microganismos. O processo de mineralizao pode ser ilustrado tomando-se a cistena (livre ou oriunda da decomposio da matria orgnica) como exemplo:

microrganismos (Cistena) HSCH2CHNH2COOH + H2O (Piruvato) CH3COCOOH + H2S + NH3

Do mesmo modo que a mineralizao do N, a do S depende da relao C/S do substrato (no caso do N um quociente C/N = 10 a 15 acelera o processo): o sulfato se forma somente quando o teor de S da matria orgnica excede a necessidade alimentar dos microrganismos do solo. Assim, quando C/S for menor que 200 o sulfato geralmente se acumula; acima de 400 o SO4 2- adicionado e mais o existente no solo so imobilizados. Estima-se que nos solos das regies temperadas midas 1-3 % do S total seja mineralizado por ano (Malavolta, 1980). O H2S libertado na mineralizao do S sofre oxidao: 1. em condies anaerbicas bactrias autotrficas dos gneros Beggiatoa e Thiothrix que depositam S elementar; 2. em condies aerbicas bactrias do gnero Thiobacillus principalmente que produzem H2SO4 no meio, como demonstram as reaes: 2 H2S + O2 2 S + 3 O2 + H2O 2 H2O + 2 S + Energia 2H2SO4 + Energia

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De acordo com Malavolta (1980), as quantidades de S nos solos minerais vo de 0,02 0,2 %; e em solos orgnicos podem chegar a 1 %. O S orgnico nos solos brasileiros representa 60-90 % do total. O sulfato proveniente sobremaneira da intemperizao das rochas. No entanto, a industrializao acrescenta fonte adicional de sulfato: a poluio atmosfrica. A queima de combustveis fsseis libera vrias formas de S gasoso, incluindo dixido de S, que so levados para o solo pela chuva. Segundo Taiz & Zeiger (2004), quando dissolvido em gua, o dixido de S hidrolisado e transforma-se em cido sulfrico (H2SO4), um cido forte, que a principal fonte da chuva cida. As plantas podem, tambm, metabolizar o SO2, que absorvido na forma gasosa atravs dos estmatos. Entretanto, exposies prolongadas (mais de oito horas) a altas concentraes atmosfricas do SO2 (maiores do que 0,3 ppm) causam extensos danos aos tecidos, devido formao do cido sulfrico 3.2 3.2.1 Enxofre na planta Distribuio e funo A maior parte do S nas clulas de vegetais superiores deriva do sulfato (SO4 2-) absorvido via um transportador 3H+/SO4 plasmtica (ver captulo V neste volume).
2-

do tipo simporte presente na membrana

O nion divalente SO42- absorvido pelas razes em baixas quantidades e o transporte de sulfato ocorre principalmente pelo xilema (Figura 3). Em muitos aspectos, a assimilao de S semelhante ao do nitrato. Por exemplo, a reduo necessria para a incorporao de S aos aminocidos, protenas e coenzimas. Nas folhas verdes, a ferredoxina o agente redutor para o S. Entretanto, ao contrrio do N-nitrato, o sulfato

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pode ser utilizado sem o processo de reduo e incorporado a estruturas orgnicas essenciais como os sulfolipdeos nas membranas ou polissacardeos como o agar. As folhas, alm do SO42-, so capazes de absorver tambm o gs SO2 (dixido de S) existente no ar, fazendo-o, porm, de modo pouco eficiente. A utilizao direta do S elementar (molhvel) foi demonstrada ocorrer nas folhas e frutos de plantas ctricas: empregando-se o produto marcado com S 35 (radioativo), muito usado como defensivo. Verificou-se sua absoro bem como sua incorporao em protenas.

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Figura 3. O ciclo do enxofre.

Enxofre elementar Oxidao bacteriana Oxidao bacteriana Oxidao bacteriana cido sulfdrico (H2S) Sulfato SO4-2 Reduo bacteriana Mineralizao Digesto pelos animais (Degradao bacteriana) Absoro pelas Plantas (Imobilizao) Compostos orgnicos (protenas) R-SH
Fonte: Malavolta (1976). O contato sulfato-raz se faz, principalmente, por fluxo de massa. O sulfato transportado predominantemente na direo acrpeta, da base da planta para cima; a capacidade da planta para translocar o S na direo baspeta muito pequena; por isso, em casos de carncia de S os sintomas aparecem em primeiro lugar os rgos mais novos, como as folhas mais novas (Malavolta, 1980). . A primeira etapa na sntese de compostos orgnicos contendo S a reduo do sulfato ao aminocido cistena. O sulfato muito estvel e necessita ser ativado antes que alguma reao subseqente possa ocorrer. A ativao inicia com a reao entre o sulfato e o ATP, para formar 5-adenililsulfato (o qual , algumas vezes, referido como adenosina-5-fosfosulfato e abreviado como APS) e pirofosfato (PPi). O processo todo se inicia com a seguinte reao:

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SO4-2 + Mg-ATP

APS + PPi

A enzima que catalisa essa reao, a ATP sulfurilase, apresenta duas formas: a maior encontrada nos plastdeos e a menor, no citoplasma (Leustek & Cols., 2000, citados por Taiz & Zeiger, 2004). A reao de ativao energeticamente desfavorvel. Para levar essa reao adiante, os produtos APS e PPi devem ser convertidos de imediato em outros compostos. O PPi hidrolisado a fosfato inorgnico (Pi) pela pirofosfatase inorgnica, de acordo com a seguinte reao:

PPi + H2O

2 Pi

O outro produto, APS, rapidamente reduzido ou sulfatado, sendo predominante a via de reduo. A reduo do APS um processo de mltiplas etapas, que ocorre exclusivamente nos plastdeos. De incio, a enzima APS redutase, transfere dois eltrons da glutationa reduzida (GSH) para produzir sulfito (SO3 2-):

APS + 2 GSH

SO3 2- + 2 H+ + GSSG + AMP

Onde GSSG representa a glutationa oxidada. (o SH em GSH e o SS em GSSG representam as pontes S-H e S-S, respectivamente). A seguir, a sulfito redutase transfere seis eltrons da ferredoxina (Fdred) para produzir sulfeto (S-2):

SO3 2- + Fdred

S 2- + 6 Fdox

O sulfeto resultante reage com O-acetilserina (OAS) para formar cistena e acetato. A O-acetilserina, que reage com o S 2-, formada na reao catalisada pela serina acetiltransferase:

Serina + Acetil-CoA

OAS + CoA

A reao que produz cistena e acetato catalisada pela OAS tiol-liase: 29

OAS + S 2-

Cistena + Acetato

A sulfatao do APS, localizada no citosol, a via alternativa. Inicialmente, a APS quinase catalisa a reao da APS com ATP, para formar 3-fosfoadenosina-5fosfossulfato (PAPS).

APS + ATP

PAPS + ADP

As sulfotransferases, ento, podem transferir o grupo sulfato do PAPS para vrios compostos, incluindo colina, brassinosterides, flavonol, cido glico glicosdeo, glucosinolatos, peptdeos e polissacardeos (Taiz & Zeiger, 2004). A reduo do sulfato a cistena altera o nmero de oxidao do S de +6 para 4, assim necessitando da transferncia de 10 eltrons. A glutationa, a ferredoxina, o NAD(P)H ou a O- acetilserina podem atuar como doadores de eltrons em vrios passos da rota metablica (Figura 4). Na assimilao do S, as folhas so em geral mais ativas do que as razes, provavelmente devido ao fato da fotossntese disponibilizar a ferredoxina reduzida e a fotorrespirao gerar a serina, que pode estimular a produo da O-acetilserina. O S assimilado nas folhas exportado pelo floema para os locais de sntese protica (frutos e pices caulinares e radiculares), sobretudo na forma de glutationa. A glutationa tambm atua como um sinal que coordena a absoro do sulfato pelas razes e a assimilao do sulfato pela parte area. Alm disso, nas folhas, a reao muito estimulada pela luz (Frankhauser & Brunold, 1978). Esta estimulao pela luz requerida por causa da necessidade de ferredoxina como um redutor para o carregador de sulfito. Durante o desenvolvimento da folha, a evoluo da reduo do sulfato semelhante reduo do nitrato, ou seja, mxima durante o perodo de expanso foliar mas diminui drasticamente aps a maturao da folha. 30

. A absoro do SO42- aparentemente reduzida pela presena em excesso de Cl; altos nveis de selnio em alguns solos podem induzir carncia de S. A velocidade de absoro do SO42- depende do ction acompanhante, obedecendo seguinte srie crescente Ca2+, Mg2+, NH4+, K+ (Malavolta, 1979). A necessidade de S para o bom crescimento das plantas varia de 0,1 a 0,5 % do peso seco do material vegetal. As crucferas so as mais exigentes, com teores nas sementes entre 1,1 a 1,7 % de S na base de peso seco. O contedo de S nas protenas varia entre fraes proticas de clulas individuais e entre espcies de plantas. Em geral, as protenas das leguminosas contm menos S do que as protenas dos cereais, e a relao N/S gira em torno de 40/1 e 30/1 nestas espcies, respectivamente. As protenas so os compostos nos quais a maior parte do S (e do N, naturalmente) se incorpora. Quando o fornecimento de SO42- alto, a sua absoro pode ser mais rpida que sua reduo e a assimilao dos tomos de S em compostos orgnicos. O S constituinte dos aminocidos cistena e metionina (principalmente) e, portanto, das protenas que os contm (Figura 4). A tiamina, a biotina e a coenzima A (COa) so coenzimas essenciais para o metabolismo quando ligados s apoenzimas apropriadas (protenas) que as requerem para exercer sua funo de catalisadores orgnicos (enzimas). As funes que o S desempenha na planta podem ser classificadas em dois grandes grupos: estruturais e metablicas.

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SO4-2 ATP

Adenosina fosfossulfato (APS) ATP

Reduo

Fosfo adenosina fosfossulfato (PAPS)

SO3-2

Incorporao

S-2 R-serina

Biotina NH2 HS-CH2CH-COOH (cistena) Coenzima A Glutatione Cistationina

CH2-CH-COOH NH2 S S NH2 CH3-S-CH2-CH2-CH-COOH (Metionina)

NH2

CH2-CH-COOH (cistina)

Protenas

S adenosil metionina

Figura 4. Reduo, incorporao e metabolismo do enxofre na planta

Fonte: Malavolta (1979).

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3.2.1.1 Estruturais Os compostos de S desempenham papel muito importante na estrutura das protenas. Como se sabe, as protenas tem estrutura primria por meio da ligao peptdica (NH-CO) ; a estrutura secundria pode ser devida a ligaes cruzadas ou ao desdobramento causado por ligaes de dissulfeto (S-S) covalentes e as pontes de hidrognio entre duas cadeias; a estrutura terciria controlada por ligaes H no peptdicas, ligaes inicas e grupos hidrfobicos ao longo das cadeias polipeptdicas. As trs estruturas so essenciais para o funcionamento da protena. Os aminocidos contendo S fornecem as ligaes de dissulfeto (da cistena) para a ligao de duas cadeias ou para a formao de anis estveis numa mesma cadeia. Os grupos sulfdrico (SH) fornecem stios para a ligao de ctions metlicos podendo por isso afetar a estrutura secundria devido conformao da cadeia protica ao redor do metal. Os grupos SH podem ainda funcionar como locais para a formao de pontes de H e para a ligao de grupos protticos (no proticos) das enzimas. Os grupos tioeter (S-CH3) da metionina, sendo hidrfobicos podem afetar a estrutura terciria mediante interao com outros grupos hidrfobicos da cadeia. steres de SO42- com polissacardeos so componentes estruturais importantes das membranas das membranas celulares.

3.2.1.2 Metablicas As funes metablicas do S so devidas a: Aminocidos em protenas Aminocidos livres Outros compostos de S de baixo peso molecular.

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Os grupos SH nas protenas enzimticas podem ser o stio de ligao do substrato com a enzima. Muitas das enzimas do metabolismo dos carboidratos so sensveis aos reagentes que destroem os grupos SH indicando pelos menos uma ao indireta desses grupos em processos metablicos. Os compostos de S: tiamina, cido lipoico e CoA funcionam como carregadores de acila (R-CO) na oxidao de alfa cetocidos. A biotina est associada com a fixao no fotossinttica do CO2 e com reaes de descarboxilao. O S componente essencial do anel de tiazol da tiamina, uma vitamina que pode ocorrer como vitamina livre ou ligada ao pirofosfato (tiamina pirofosfato) quando atua como coenzima na descarboxilao do piruvato a acetaldedo e na oxidao de alfa-ceto cidos. A S-adenosil metionina desempenha papel essencial nas reaes de transferncia de radicais que contm um C (transmetilaes), segundo Malavolta (1979). Devido sua participao num nmero to grande de compostos e de reaes, a falta de S provoca uma srie de distrbios metablicos: 1. 2. diminuio na fotossntese e na atividade respiratria; queda na sntese de protenas com o aparecimento de altas relaes N solvel / N protico; 3. 4. reduo no teor de gorduras; acmulo de carboidratos solveis com elevao da relao C solvel / C amido; 5. diminuio na fixao livre e simbitica do N2 atmosfrico.

Finalmente, o S desempenha funes que determinam aumentos na produo e na qualidade do produto obtido. Como j mencionado, esse nutriente componente dos

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aminocidos cistina, metionina e cistena, os quais so componentes da protena, encerrando 90 % do S encontrado na planta. Alm disso, o S est ligado s vitaminas biotina e tiamina, sendo esta ltima um problema nutricional em pases que tm como base de alimentao o arroz (Vitti, 1986). O S componente do acetil CoA, composto que representa o centro nervoso no ciclo de Krebs, influenciando, portanto, todo o metabolismo de gordura e carboidratos. Participa ainda da composio de azeites de alho livres de N (bissulfeto de alila) nas plantas bulbosas (cebola, alho) e de essncia de mostarda com N (glucosdeo) nas crucferas; na ativao de enzimas proteolticas, como a ficinase (figo), bromelina (abacaxi) e papana (mamo); da composio das ferrodoxinas, complexos enzimticos envolvidos na fotossntese e na fixao do N2; e na formao de clorofila. Os grupos sulfidrilos (-SH), no tecido vegetal, parecem aumentar a tolerncia ao frio e seca. Analisando as funes do S, segundo Vitti et al. (1988), observa-se que o S est intimamente ligado ao metabolismo do N, sendo inclusive utilizada a relao N/S do vegetal para avaliar o seu estado nutricional (Vitti & Trevisan, 2000). 3.3 Fontes de S

Mais de 95 % do S encontrado no solo esto ligados matria orgnica. Outras fontes naturais incluem os dejetos animais, a gua e a atmosfera (Lopes, 1998). Os dejetos de animais contm nveis de S variando de menos de 0,02 a at cerca de 0,3 %. Obviamente, o contedo varia consideravelmente, dependendo das espcies, do mtodo de armazenagem e aplicao. O SO2 e outros gases da atmosfera, dissolvidos na gua da chuva e da neve, podem contribuir com at 22 kg de S.ha-1.ano-1, ainda mais em algumas reas industrializadas. De acordo com Lopes (1998), a gua de irrigao pode conter

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concentraes bem altas de S. Quando o teor de S-SO4 na gua de irrigao excede 5 mg.L-1, a deficincia de S pouco provvel. Mesmo assim, aplicaes de fertilizantes de arranque, contendo S, podem ser benficas por causa da mobilidade do sulfato durante chuvas intensas. A maioria das fontes de S formada por sulfatos (Quadro 5) e so moderadamente ou muito solveis em gua. As formas solveis tambm incluem bissulfetos, tiossulfatos e polissulfatos. A forma mais importante de S insolvel em gua o S elementar, que precisa ser oxidado a S- SO4 antes das plantas poderem utiliz-lo. A oxidao bacteriana do S no solo favorecida por: Temperaturas do solo mais elevadas; Teor adequado de umidade; Aerao do solo; Partculas menores.

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Quadro 5. Fontes mais comuns de S Fonte Sulfato de amnio Tiossulfato de amnio Polissulfeto de amnio Sulfato de potssio Sulfato de potssio e Mg Gesso Sulfato de Mg Superfosfato simples S elementar Sulfonitrato de amnio Torta de algodo Esterco de curral Resduo de esgoto Tancage Superfosfato triplo Superfosfato amoniacal Fosfossulfato de amnio Fonte: modificado de Malavolta (1976) e Lopes (1998) Teor de S (%) 22-24 26 40-50 15-17 22-24 12-18 12-14 10-12 > 85 15 0,3 0,5 0,1-0,5 0,9 0,3-1,0 12 15

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O quadro 6 apresenta respostas de algumas culturas aplicao de S Quadro 6. Respostas de culturas brasileiras ao S. Cultura Algodo Arroz Caf Cana Citros Colonio Colza Feijo Milho Repolho Soja Sorgo Trigo Aumento da produo (%) 37 16 41 11 18 21 51 28 21 9 24 10 26

Os sulfatos solveis em gua so imediatamente disponveis para as plantas e devem ser utilizados quando o S necessrio rapidamente. Segundo Lopes (1998), estas fontes so usadas normalmente em fertilizantes slidos, apesar de solues de sulfato de amnio tambm serem comuns. O tiossulfato de amnio (12 % N e 26 % S) um lquido claro adequado para uso em fertilizantes fluidos ou gua de irrigao. Ele deve ser colocado junto com a semente; se aplicado em faixas, estas devem estar a pelo menos 2,5 cm da semente. O polissulfeto de amnio uma fonte fluida vermelha de S, com um forte cheiro de amnia, comumente aplicado na gua de irrigao (Lopes, 1998). O S neste ltimo produto precisa ser oxidado para a forma de sulfato para se tornar disponvel s plantas. Apesar do gesso (sulfato de Ca) ser menos solvel em gua do que os outros sulfatos, ele uma fonte eficiente e barata de S. A adubao