UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHO CENTRO DE CINCIAS EXATAS E TECNOLOGIAS DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA QUMICA DISCIPLINA: QUMICA ANALTICA III PROFa:

DJAVNIA

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

LAUANDICE S MENESES NOGUEIRA MANOEL DE JESUS DE A. LIMA MARCOS LEITE S. JUNIOR ROMES SILVA TAYANE AGUIAR FREITAS

QM06114- 46

QM09110-54 QM06111- 43 QM06102-42 QB09104-45

SO LUS MA 2010

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

LAUANDICE S MENESES NOGUEIRA MANOEL DE JESUS DE A. LIMA MARCOS LEITE S. JUNIOR ROMES SILVA TAYANE AGUIAR FREITAS

QM06114- 46 QM09110-54 QM06111- 43 QM06102-42 QB09104-45

Trabalho Curso de

Apresentada Qumica Federal

ao da do

Universidade

Maranho Para Obteno da Terceira Nota da Disciplina de Qumica Analtica III

SO LUS MA 2010

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Placa de camada fina ..................................................................... 16 Figura 2: Desenvolvimento da placa de cromatografia ............................. 17 Figura 3: Cromatografia ascendente ............................................................ 18 Figura 4: Desenvolvimento da placa ............................................................ 18 Figura 5: Cromatografia horizontal ............................................................... 21 Figura 6: Esquema de um equipamento para desenvolvimento circular .. 22 Figura 7: Esquematizao de um cromatograma obtido por CCD ............ 23

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Comparao entre (CDD) e (CCDAE) ......................................... 26

Sumrio
1.02.03.0INTRODUO ................................................................................................... 6 CCD UMA VISO GERAL.................................................................................. 6 ADSORVENTES ................................................................................................ 8

4.0- ADSORVENTES UTILIZADOS EM CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA .......... 8 4.1- SLICA (SIO2) ..................................................................................................... 8 4.2- ALUMINA (AL2O3) .............................................................................................. 9 4.3- TERRA DIATOMCEA ...................................................................................... 9 4.4- CELULOSE ...................................................................................................... 10 4.5- POLIAMIDA ..................................................................................................... 10 5.0- TCNICAS GERAIS ............................................................................................ 11 5.1- Preparao das Placas .................................................................................... 11 5.1.1- Preparao por Espalhamento .................................................................. 11 5.1.2 Placas Pr Fabricadas ............................................................................. 13 5.2 Ativao das Placas .......................................................................................... 14 5.3- Seleo da Fase Mvel .................................................................................... 14 5.4- Aplicao da Amostras nas Cromatoplacas ..................................................... 15 5.5- Desenvolvimento das placas ............................................................................ 17 5.6- Revelao dos cromatogramas ........................................................................ 22 5.7- Documentao ................................................................................................. 22 6.0- ANLISES QUANTITATIVAS .............................................................................. 23 7.0- CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DE ALTA EFICINCIA ................ 25 8.0- APLICAES DA CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA ....................... 27 9.0- CONCLUSO ...................................................................................................... 28 10- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ...................................................................... 29

1.0- INTRODUO

A qumica analtica possui diversos mtodos de anlise, dentre eles um mtodo moderno que ocupa um lugar de destaque devido a sua facilidade em efetuar separao, identificao e quantificao das espcies qumicas a cromatografia em camada delgada. A CCD um processo fsico-qumico de separao que est fundamentada na migrao diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interaes, entre duas fases imiscveis, a fase mvel e a fase estacionria. Essa tcnica teve incio como ferramenta de anlise em qumica e bioqumica com os trabalhos de Izmailov e Sharaiber, em 1938, e somente a partir da dcada de 1960 passou a ser largamente utilizada em qualquer laboratrio que envolva anlise de substncias orgnicas e organometlicas. O grande desenvolvimento dessa tcnica conseqncia natural das mltiplas vantagens que mesma oferece, como fcil compreenso e execuo, separao em breve espao de tempo. Neste trabalho estudaremos a fundo as tcnicas de uma CCD, suas aplicaes, caractersticas, seus desenvolvimentos e outros assuntos que caracterizam esta tcnica.

2.0- CCD UMA VISO GERAL

A cromatografia uma tcnica da qumica analtica utilizada para a separao de misturas e substncias. De maneira mais completa, a tcnica baseia-se no princpio da adsoro seletiva (que no deve ser confundida com absoro), um tipo de adeso. A tcnica foi descoberta em 1906 pelo botnico italiano naturalizado russo Mikahail Tswett, mas no foi largamente utilizada at os anos 30. Tswett separou pigmentos de plantas (clorofilas) adicionando um extrato de folhas verdes em ter de petrleo sobre uma coluna com carbonato de clcio em p em um tubo de vidro vertical. Enquanto a soluo percolou atravs da coluna os componentes individuais da mistura migraram para baixo em taxas diferentes de velocidades e ento a coluna apresentou-se marcada com gradientes horizontais de cores. A esse gradiente deu-se o nome de cromatograma. A cromatografia funciona graas ao fato das molculas possurem uma propriedade chamada polaridade em comum e tenderem a se atrair mutuamente. Uma molcula polar simplesmente aquela que possui uma regio rica em eltrons e uma outra regio que pobre em eltrons. Estas regies s vezes so representadas como sendo negativamente e

positivamente carregadas, respectivamente. Molculas polares so unidas por foras de atrao entre cargas opostas de molculas diferentes. Molculas de gua tm regies ricas em eltrons nos tomos de oxignio e regies pobres em eltrons nos tomos de hidrognio. Assim, as molculas de gua so polares e por conseguinte organizam-se de maneira que a regio de carga positiva de uma molcula atrada pela regio de carga negativa de outra. Estas interaes provem uma explicao para o elevado ponto de ebulio da gua. A gua (H20) uma molcula muito mais simples que o etanol (H2C-H2COH), mas tem um ponto de ebulio muito mais alto - etanol = 46C; gua =100C, 1atm.

3.0- ADSORVENTES

O mercado dispe de uma grande variedade de adsorventes para fins cromatogrficos, os quais podem ser adquiridos para a confeco de placas no prprio laboratrio ou como placas pr-fabricadas, nas quais esses adsorventes so espalhados em camadas de diferentes espessuras. Alguns dos principais fornecedores desses produtos so: Merck, Macherey-Nagel, entre outros. Entre os adsorventes mais utilizados em CCD esto a slica, a alumina, a celulosa.

4.0-

ADSORVENTES UTILIZADOS EM CROMATOGRAFIA EM

CAMADA DELGADA
4.1- SLICA (SIO2)

silcio amorfo, altamente poroso, seguramente um dos adsorventes mais utilizados em cromatografia por adsoro. Apresenta carter fracamente cido, que pode ser aumentado pela presena de impurezas cidas, podendo ocorrer como conseqncia, fenmenos de

quimiossoro de bases ou reaes cido-catalisadas das amostras.Existem vrios tipos de slicas disponveis no comrcio, de acordo com certas caractersticas adicionais de cada produto. Em geral, a slica empregada na separao de compostos lipoflicos como aldedos, cetonas, fenis, cidos graxos, aminocidos, alcalides, terpenides e esterides, usando mecanismo de adsoro. Entretanto, quando for propositalmente desativada com vapor de gua, retm gua suficiente para que as separaes ocorram por mecanismo semelhante cromatografia em papel.

Na preparao de placas, misturam-se cerca de 30g de slica com 60-70 ml de gua destilada. Essa quantidade de suspenso suficiente para preparar cinco placas de 20 por 20cm, com uma espessura da camada ao redor de 0,3mm.

4.2- ALUMINA (AL2O3)

A alumina depois da slica o adsorvente mais utilizado. Tem caractersticas alcalinas, embora possa tambm ser preparada para apresentar caracterstica neutra ou cida. Deve-se sempre considerar a possibilidade de a alumina catalisar diversas reaes orgnicas, como as condensaes de compostos carbonlicos . A alumina geralmente empregada na separao de compostos lipoflicos e, pelo fato de poder ser preparada com caractersticas cida, neutra ou alcalina, bastante til na separao de substncias que apresentem variaes dessas caractersticas alcalides, . Ela separa e bem

hidrocarbonetos lipossolveis.

policclicos,

aminas

vitaminas

Para preparar cinco placas de 20 por 20cm e espessura de 0,3mm, recomenda-se a utilizao de uma suspenso de 30g de alumina em 40ml de gua destilada. 4.3- TERRA DIATOMCEA

um adsorvente neutro amplamente empregado como suportes nas separaes por partio. Quando comparada com a slica e alumina, menos adsorvente e com menor poder de resoluo. Algumas vezes adicionada slica para diminuir seu poder adsorvente. Pode ser encontrada

comercialmente com seu aglutinante. Na preparao de placas, utilizam-se as mesmas propores citadas para a slica, ou seja, uma parte de adsorvente para duas partes de gua destilada.

10

4.4- CELULOSE

Tem sido empregado como suporte da fase estacionria lquida em cromatografia por partio ou troca inica. Assim, tem-se a celulose impregnada com polietilenoimina (PEI-celulose),empregada na separao de nucleotdeos e nucleosdeos;a carboximetil-celulose (CM-celulose)para

separao de protenas; a dietilaminoetil-celulose (DEAE-celulose) e uma mistura de celulose alcalina,trietanolamina e epicloridrina (ECTEOLA-celulose), para separao de protenas e cidos nuclicos. A celulose microcristalina pode ser empregada em todos os tipos de separaes realizveis por cromatografia em papel, uma vez que exerce as mesmas funes, com a vantagem de fornecer manchas mais compactas, devido uniformidade das partculas.Tambm por isso de desenvolvimento mais rpido, e o limite de detectabilidade do mtodo mais baixo.As diferentes celuloses tm sido empregadas na separao de cidos carboxlicos, aminocidos,

carboidratos,ctions inorgnicos e fosfatos, entre outros. Para preparao de cinco placas de 20 por 20cm,misturam-se 25g de celulose a 90ml de gua destilada, levando-se ao agitador por dois minutos antes de colocar na placa de vidro.

4.5- POLIAMIDA

A utilizao de poliamidas vem crescendo nos ltimos anos. A poliamida pode ser de dois tipos, de acordo com sua preparao. A poliamida 11 preparada a partir do cido poliaminoundecanico (nylon 11), enquanto a poliamida 6 vem da aminopolicaprolactama ( perlon ).em geral, as separaes dos solutos ocorrem atravs da competio, pela formao de ligaes de hidrognio, com adsorvente e fase mvel.Tem sido empregada, com maior freqncia, na separao de fenis e cidos carboxlicos. Sua maior utilizao comprometida pela dificuldade de separao das cromatoplacas no laboratrio no laboratrio, em funo de sua baixa aderncia ao vidro.

11

Para a preparao das placas, recomenda-se fazer a suspenso de 15g de p em 60ml de metanol, previamente purificado.Essas quantidades so suficientes para cinco placas de 20 por 20c e 0,3mm de espessura.

5.0- TCNICAS GERAIS

5.1- Preparao das Placas 5.1.1- Preparao por Espalhamento

Existem diversas formas de se separar uma placa cromatogrfica, quer manualmente quer com emprego de espalhadores. Independentemente do mtodo escolhido, a preparao sempre se inicia com a limpeza da placa de vidro, procurando-se eliminar toda a gordura de sua superfcie. Para tanto, recomenda-se que a placa seja lavada com detergente, soluo sulfocromica e gua corrente, evitando-se ao final enxaguar com solvente orgnico que possam dificultar a aderncia do adsorvente, e, finalmente, secando-se em estufa. O tamanho da placa de vidro deve ser observado, pois os espalhadores em geral so construdos com vistas utilizao de placas com 20 cm de comprimento e largura varivel. Quando a preparao for manual, esse cuidado pode ser ignorado. Quando no se dispe de um aplicador, existem outras formas bastante simples de preparar uma placa. Uma delas consiste em preparar a suspenso do adsorvente no solvente adequado e, mantendo-se a placa de vidro na posio horizontal, transferir a suspenso para superfcie da placa, espalhando-a com de maneira uniforme com o auxilio de um basto de vidro e fazendo-a oscilar, para facilitar a uniformizao da camada. Repousa-se a placa em uma superfcie plana horizontal e deixa-se secar ao ar. A dificuldade encontrada nesse processo a obteno de superfcies uniformes. Outro processo bastante simples, mais indicado para placas de pequenas dimenses, consiste na imerso da placa em uma pequena suspenso de adsorvente, mantido em um frasco de boca larga. Nesses casos, a suspenso

12

feita em um solvente orgnico voltil, como o clorofrmio, na proporo de 40 g de adsorvente para 100 ml de solvente. Tomam-se duas placas com as faces justapostas, mergulhando-as na suspenso, segurando-as com uma pina e, a seguir, retirando-as lentamente. As placas so separadas, o solvente evaporado, e a camada de adsorvente exposta ao vapor dgua. Nesse processo obtem-se superfcies bem mais delgadas e uniformes, o que permite a utilizao de menores quantidades de amostras e o desenvolvimento mais rpido dos cromatogramas. Placas assim preparadas tem seu uso restrito a escala analtica. Uma vez aplicada camada do adsorvente sobre a placa de vidro, ela seca ao ar livre. Quando sua superfcie torna-se opaca, isso significa que ela est seca e, conseqentemente, o adsorvente encontra-se fixado ao vidro. O tempo necessrio para isso varivel. A titulo de exemplo, as placas de PEI celulose necessitam de 12 horas para secar, antes de ficarem prontas para uso, enquanto as de poliamida ficam prontas em 30 min. Quando se pretende preparar placas bem uniformes e com espessuras definidas, para uso analtico ou preparativo, faz-se necessria a utilizao de espalhadores. Eles so encontrados no mercado em tipos e marcas diferentes, sendo os mais comuns fundamentalmente em manter as placas fixas em um suporte e, sobre elas, fazer deslizar um recipiente contendo a suspenso, atravs a suspenso do adsorvente. Enquanto o recipiente desliza, deixando escoar a suspenso, atravs de uma fenda regulvel existente ao longo de sua base. A abertura da fenda varia segundo a origem do equipamento; entretanto, em geral, esto dentro dos limites de 0 a 2,0 mm. Existem ainda espalhadores que mantm o recipiente com adsorvente fixo e, sob ele, fazem deslizar as placas fixadas em um suporte mvel. Esses modelos so de uso menos freqente. possvel que as laminas de vidro no tenham a mesma espessura, o que provoca oscilao durante o deslizamento do recipiente, ao passar de uma placa para outra. Para evitar esse tipo de problema, alguns modelos de espalhadores permitem o nivelamento das placas, atravs de guias laterais que

13

comprime-nas contra um fundi provido de espuma de nilon, o que permite colocar todas as faces superiores das placas no mesmo nvel. Alm dos espalhadores existentes no mercado, mencionada na literatura a existncia de diversos espalhadores adaptados ou construdos pelos pesquisadores em seus laboratrios.

5.1.2 Placas Pr Fabricadas

Placas cromatogrficas, pr-fabricadas, dos adsorventes mais utilizados esto disponveis no mercado h algum tempo. Apesar de terem custo bem mais elevado, dispensam a fase de preparao e so bem mais uniformes e homogneos os que, sem duvida, melhora a separao e torna os valores mais reprodutveis. A camada de adsorvente est depositada sobre uma lamina de material plstico, de alumnio ou de vidro. So pr-cortadas geralmente nos tamanhos 5 x 20 cm e 20 x 20 cm, e com a espessura da camada de adsorvente variando entre 0,1 a 2,0 mm. Tambm podem ser encontradas placas de 20 x 40 cm, com 2,0 mm de espessura, para fins preparativos. Um dos cuidados a serem observados na realizao de um experimento de cromatografia a colocao das amostras exatamente na mesma linha de partida, para no ocorrem variaes nos valores. Isso pode ser contornado com o uso de cromatoplacas com zona de concentrao. So preparadas com dois componentes diferentes em camadas adjacentes que apresentam uma bem definida linha divisria, que no oferece resistncia ao fluxo da fase mvel. A zona de concentrao ocupa toda a extremidade inferior da placa, at uma altura de 2,5 cm no sentido do desenvolvimento do cromatograma, tem um comportamento inativo e apresenta boa velocidade de fluxo. O restante da placa constitudo do adsorvente propriamente dito. Em produtos disponveis comercialmente, essa zona de concentrao pode ser de dixido de silcio (SiO2) ou terra diatomcea.

14

5.2 Ativao das Placas

Para muitas separaes, as placas preparadas ou pr-fabricadas, secas ao ar livre, so usadas diretamente, enquanto outras separaes exigem sua ativao. O tempo e a temperatura utilizados para a ativao esto na dependncia do adsorvente utilizado e da atividade desejada. Temperatura mais elevadas, por tempos prolongados, tornam a maioria dos adsorventes mais ativos. Slica, alumnio e terra diatomcea so ativados a 105 110 C por 30 a 60 min. A celulose no deve ser aquecida por mais de 10 min. a 105C. As placas podem ser conservadas, prontas para uso, em ambientes secos como dissecadores ou caixas semelhantes a estantes fechadas.

5.3- Seleo da Fase Mvel

O solvente ou mistura de solvente a serem utilizados como fase mvel deve ser escolhida cuidadosamente, pois tero papel fundamental na separao da mistura. Entende-se que existe uma competio entre as molculas da fase mvel e da amostra, pela superfcie do adsorvente. Portanto, na escolha da fase mvel, devem-se considerar a natureza qumica das substancias a serem separadas e a polaridade da fase mvel. Nessa seleo, toma-se como base a serie cluotropica dos solventes, na qual eles so ordenados segundo suas polaridades, as quais esto diretamente relacionadas com o poder de eluio. Essa serie auxilia muito, porem deve-se ter em mente que no raro encontrarem-se nela alteraes, em funo do tipo de adsorvente ou da natureza das sustncias. Quando uma fase mvel pura no separa bem os componentes de uma amostra, pode-se utilizar uma mistura. Existem diferentes misturas que promovem igual separao das amostras/ em geral, observa-se que pequenas

15

variaes na composio da fase mvel levam a grandes alteraes no deslocamento das manchas. Uma maneira bastante pratica de se ter uma idia do poder eluente da fase mvel consiste em colocar manchas da amostra sobre uma cromatoplaca e gotejar sobre cada uma delas, com auxilio de uma micropipeta, diferentes solvente. Sero observados deslocamentos concntricos das substancias, o que permite que, em poucos minutos, se tenha informao a respeito da capacidade de deslocamento de diferentes solventes.

5.4- Aplicao da Amostras nas Cromatoplacas

As amostras so aplicadas nas cromatoplacas na foram de solues, em solventes bastante volteis, que possa,, ser facilmente eliminados aps a aplicao. Em geral so empregados solues de 0,1% a 1,0%, devendo-se sempre ter em mente o limite de detectabilidade do revelador, pois, se ele no detectar a amostra, deve ser aumentar sua concentrao na placa. Solues muito diludas podem exigir a aplicao de um volume grande de amostra e, conseqentemente, aumentar muito o dimetro da mancha. Para a aplicao da amostra, podem-se utilizar micropipetas ou

microsseringas, que permitem determinar a quantidade de substancia colocada na placa. Quando no exigida a preciso na quantidade de amostra, podem ser utilizados tubos capilares de vidro. A aplicao da amostra tambm pode ser feita empregando-se aplicadores automticos. Esses aplicadores so sistemas que, movimentando o embolo de uma seringa, permitem tomar um volume apropriado de amostra do recipiente que a contem e dispensar esse volume na placa de maneira muito precisa e exata. As gotas/manchas devem ser aplicadas 1,5 a 2,0 cm acima da borda inferior, evitando-se que fiquem mergulhadas na fase mvel quando a placa for colocada na cuba. A distancia entre cada gota/mancha de aproximadamente 1,0 cm, evitando-se sempre que haja contato entre as gotas/manchas adjacentes.

16

Em placas preparativas, uma soluo concentrada da amostra aplicada na forma de faixa ou linha horizontal, cerca de 2 cm acima da borda inferior da placa. A aplicao pode ser feita mo, com auxilio de pipetas ou utilizando-se aplicadores automticos de amostras, porem sempre de maneira rpida e bem uniforme. Se a amostra no estiver aplicada como uma faixa horizontal uniforme, as bandas das substancias tambm no sero horizontais e o trabalho estar perdido por m separao. Nas placas preparativas, aps o desenvolvimento e revelao do

cromatograma, a faixa correspondente a substancia desejada retirada da placa, com o auxilio de uma esptula ou aspirador apropriado, e a substancia extrada do adsorvente com um solvente adequado.

Figura 1: placa de camada fina

17

5.5- Desenvolvimento das placas

Uma cromatografia busca o melhor desenvolvimento possvel para obter a separao dos componentes na amostra. Dentre diferentes formas podemos destacar o desenvolvimento ascendente, o desenvolvimento horizontal e o desenvolvimento circular, todos sero descritos ainda neste item. Na cromatografia ascendente o solvente colocado no fundo da tinta de cromatografia e tem um movimento ascendente atravs do papel

cromatogrfico durante o desenvolvimento do cromatograma. representada na figura (1.0) abaixo:

Essa tcnica

18

FIGURA 3 Este o mtodo mais utilizado e que pode ser como considerado a tcnica bsica. O desenvolvimento pode ser unidimensional ascendente, bidimensional ou ascendente unidimensional com mltiplo desenvolvimento. Geralmente se inicia em trabalho com o movimento unidimensional ascendente, com fase mvel e absorvente puro. Neste mtodo, a fase mvel (ou solvente) deve cobrir todo o fundo da cuba, at uma altura que seja inferior uma altura quela das manchas das placas (em geral 0,5-1,0 cm). Logo aps este procedimento, coloca-se a placa na cuba cromatogrfica qual a posio deve ser quase vertical, ou seja, apoiada no fundo da cuba e inclinada em direo s paredes laterais. Colocam-se fitas de papel de filtro nas paredes da cuba, mergulhadas no solvente (fase mvel), para garantir que a cuba fique saturada com vapor de solvente (ilustrado na figura 2.0). Atravs de foras capilares o solvente move-se para cima at a distncia desejada (usualmente 10 a 15 cm), onde ento a corrida interrompida. Remove-se a placa e marca-se a posio da frente de solvente com um objeto pontudo. Seca-se a placa em capela ou em uma estufa. Na secagem, deve-se levar em considerao a sensibilidade da amostra ao calor e a luz.

FIGURA 4
Desenvolvimento da placa

19

Pode-se colocar mais de uma placa em uma cuba; entretanto, deve-se ter cuidado para que exista um espaamento no muito estreito entre elas, na qual a fase mvel no suba por capilaridade entre elas. Algumas cubas retangulares possuem nas paredes laterais menores, sulcos de encaixe das placas, o que permite vrios desenvolvimentos ao mesmo tempo. Durante o processo de desenvolvimento existem algumas consideraes que devem ser feitas, pois assim que a cuba fechada iniciam-se os seguintes processos: i) O equilbrio entre os componentes do solvente de desenvolvimento e sua fase de vapor; dependendo da presso de vapor dos componentes individuais a composio da fase gasosa pode ser significativamente diferente da composio do solvente de desenvolvimento. ii) Enquanto a fase estacionria (placa) estiver seca adsorver molculas da fase gasosa. Este processo tambm um equilbrio, chamado saturao. Particularmente os componentes polares sero removidos da fase gasosa e carregados para a superfcie da fase estacionria. iii) Simultaneamente, a parte da placa que ainda est mida com a fase mvel interage com a fase gasosa. Assim, especialmente o componente menos polar do lquido liberado para a fase gasosa. iv) Durante a migrao, os componentes da fase mvel podem ser separados pela fase estacionria sob certas condies, causando a formao de fronts secundrios. Em muitos casos, mesmo usando diversas etapas de separao com solventes diferentes, a separao de misturas por TCL com o desenvolvimento em uma s direo no permite uma boa resoluo dos componentes. Este problema pode ser superado com o uso da cromatografia em camada fina em duas dimenses ou cromatografia bidimensional. A tcnica pode ser aplicada at mesmo para compostos estruturalmente muito relacionado. Neste

20

procedimento, a separao feita usando-se uma placa de TLC quadrada. A aplicao da amostra feita perto de um dos vrtices da placa e um primeiro desenvolvimento feito usando um sistema de solventes. Quando o desenvolvimento se completa, a placa retirada da cuba e seca. Gira-se a placa de modo a fazer com que a coluna de manchas separadas passe a ser a linha de partida. O cromatograma desenvolvido novamente usando-se um segundo sistema de solventes. O resultado uma separao efetiva que cobre uma boa rea da placa de TLC. Uma das grandes vantagens da cromatografia em camada fina em duas dimenses o que possvel se obter separaes semelhantes com placas quadradas de apenas 10 cm X 10 cm. (VOGEL) Pode-se utilizar ainda a cromatografia ascendente unidimensional com mltiplo desenvolvimento. Uma vez desenvolvido o cromatograma, a placa retirada da cuba e seca, retornando para novo desenvolvimento. Utiliza-se em geral a mesma fase mvel; uma placa pode sofrer sucessivos desenvolvimentos, at que se consiga uma boa separao. Este procedimento pode ser encarado como um aumento da camada de adsorvente, no sentido de desenvolvimento do cromatograma. (COLINS) Como mencionado no incio deste item, o desenvolvimento horizontal e vertical tambm podem ser utilizados na TLC. Essas tcnicas tambm produzem um bom resultado, porm so menos utilizadas. Nessas duas tcnicas as placas ficam apoiadas na posio horizontal, ilustrado na figura abaixo:

FIGURA 5 Para o desenvolvimento horizontal, as amostras destacam-se em linha reta em placa retangular e a fase mvel colocada em uma das extremidades. Para o desenvolvimento circular, a amostra fica em um circulo ao redor do centro e, neste, aplica-se a fase mvel. As manchas aparecem em crculos concntricos.

21

O desenvolvimento de um equipamento relativamente simples, porm muito eficiente, o chromatotron, que uma cromatografia em camada delgada preparativa e acelerada centrifugamente. Foi desenvolvida pelos autores do Compendium of Organic Synthetic Methods. Trata-se de uma CCD

desenvolvimento circular, em um disco de 24 cm de dimetro, com uma camada de adsorvente de espessura varivel entre 1 e 4 mm. O processo cromatogrfico desenvolve-se do centro para as bordas, estando o disco na cmara cromatogrfica submetido a um movimento circular de velocidade controlada. Possui uma grande vantagem, pois h a possibilidade de rpidas separaes preparativas com quantidades variveis de amostra, que varia de 0,1 a 1,0 g. Alm disso, o sistema permite que a separao se processe at que as manchas separadas atinjam as bordas da placa e possam ser coletadas, juntamente com a fase mvel, em frascos coletores (representado na figura 4,0). (COLINS)

FIGURA 6
Esquema de um equipamento para desenvolvimento circular

Outro equipamento que ser feito o desenvolvimento horizontal so nas cmaras de desenvolvimento especiais, onde so utilizadas poucas

quantidades de fase mvel.

22

5.6- Revelao dos cromatogramas

Os diversos solutos separados no desenvolvimento podem ser detectados por diferentes mtodos. Substncias coloridas podem ser vistas diretamente sobre a fase estacionaria e substancias incolores podem torna-se visveis por meio de mtodos fsicos ou qumicos. Se tratar de utilizao de reaes enzimticas ou bactericidas, o processo poder ser biolgico. Substancias incolores podem ser detectadas borrifando-se

(uniformemente) a placa com um reagente apropriado que colore as regies ocupadas pelas manchas. Os reagentes de revelao devem ser manipulados em capela. Este o mtodo qumico. O mtodo fsico consiste na deteco de alguns compostos pela luz ultravioleta, sem a necessidade de revelao, se esses compostos forem fluorescentes. Quando as substncias no so fluorescentes, podem-se utilizar adsorventes impregnados com reagentes fluorescentes; nesse caso, observam-se manchas escuras contra um fundo claro. As manchas que foram deter minadas podem ser marcadas com uma agulha.Os olhos devem ser protegidos com culos especiais quando este mtodo for utilizado.

5.7- Documentao

Terminada a migrao, os resultados sero observados utilizando diferentes mtodos de revelao, seja desenhado em placas, seja delineando a placa sobre o papel de seda transparente colocado sobre o adsorvente, ou atravs de processos mais sofisticados. O sucesso da cromatografia em camada delgada depende dos solventes de desenvolvimento e das afinidades diferentes do soluto pelo adsorvente da placa. A ordem de separao das substancias depende das combinaes de solventes usadas. Sob condies de constante temperatura, sistema de solventes e adsorvente, qualquer soluto (uma droga, um corante, um esteride, etc.) move-se com uma razo constante em relao frente de solvente. Esta razo conhecida como valor Rf (frente relativa ou fator de retardamento), onde

23

Rf =

O clculo produz resultados que so nmeros decimais menores que um. Por isso, costuma-se usar hRf, um numero inteiro obtido multiplicando-se Rf por 100. (VOGEL)

FIGURA 7
Esquematizao de um cromatograma obtido por CCD

Este considerado o parmetro mais importante da cromatografia em camada delgada. Os valores ideais para Rf esto entre 0,4 e 0,6.

6.0- ANLISES QUANTITATIVAS

A cromatografia em camada delgada pode ser utilizada como mtodos quantitativos de analises de solutos que pode ser dividido em duas categorias. Nos mtodos in situ, mais geralmente usados, a quantificao baseada na medida direta da densidade ptica das manchas na placa, de preferncia com o auxlio de um densitmetro. O densitmetro varre as manchas uma por uma, medindo a reflexo ou a absoro de um feixe de luz. Usualmente, fez-se a varredura ao longo da linha de desenvolvimento da placa. A diferena de intensidade do feixe de luz refletindo (ou transmitido) entre o adsorvente e as

24

manchas de soluto vista como uma srie de picos em um registrador. As reas dos picos correspondem s quantidades das substncias existentes nas varias manchas. Este tipo de procedimento requer a comparao das manchas da amostra com manchas obtidas com quantidades conhecidas de padres cromatografados na mesma placa. Desenhos melhores de densitmetros fizeram com que aumentasse a confiana nas determinaes quantitativas de CCD. Um dos procedimentos mais barato remover os componentes separados por raspagem da poro relevante do adsorvente aps a visualizao com uma tcnica no destrutiva. O componente ento convenientemente extrado o adsorvente em um tubo de centrifuga e adicionando um

colocando-se

solvente adequado para dissolver o soluto. O tubo ento centrifugado e o lquido supernadante removido e analisado por uma tcnica quantitativa adequada, como a espectrometria no ultravioleta ou no visvel, ou a espectrometria de fluorescncia ou, ainda, a cromatografia com fase gasosa. Um outro procedimento extrair o soluto por transferncia do adsorvente para uma coluna curta de slica gel colocada sobre um filtro sintetizado e eluio com o solvente utilizado no desenvolvimento. Logo depois, o extrato analisado por uma tcnica quantitativa conveniente. Em cada caso necessrio obter uma curva de calibrao usando quantidades conhecidas do soluto no solvente usado no desenvolvimento do cromatograma. Para que os resultados obtidos por estes mtodos quantitativos de CCD sejam de melhor qualidade, as manchas devem ter Rf = 0,3-0,7. Manchas com Rf < 0,3 tendem a estar mito concentradas e manchas com Rf > 0,7 so muito difusas.(VOGEL) Outros mtodos de emprego direto so a medida de fluorescncia e de radioatividade, para substncias apresentarem essas caractersticas. As dosagens so feitas atravs de comparao com padres.

25

7.0- CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DE ALTA EFICINCIA

A CCD, tradicionalmente, uma tcnica simples, rpida e econmica de analise qualitativa, entretanto, nos ltimos anos, vem adquirindo aplicaes mais definidas em anlise quantitativa, em razo dos desenvolvimentos na qualidade e tipos dos adsorventes, na forma de aplicao de amostra e no uso de densitmetros que permitem a anlise quantitativa in situ. O uso de adsorventes com partculas menores que as convencionais (5 m)

possibilita a obteno de separaes mais eficientes (manchas mais compactas) e, conseqentemente, com maior resoluo, tomando a tcnica bem mais atrativa. Esse aumento na eficincia, em relao a CCD usual levou ao aparecimento da cromatografia em camada delgada de alta eficincia (CCDAE), denominao emanada da similaridade com a cromatografia liquida de alta eficincia (CLAE), em razo de as duas tcnicas serem muito semelhantes quanto ao fenmeno fsico que as reage, diferindo fundamentalmente no aspecto pratico. Na tabela (n tabela) apresentada uma comparao entre CCD e CCDAE. A anlise dessa tabela permite verificar que comparativamente, a C CDAE uma tcnica mais rpida, eficiente, e resulta em menores limites de deteco que a CCD convencional; pode-se dizer se trata de um seu aperfeioamento, com aplicaes indicada quando se pretende efetuar a anlise quantitativa.

26 (N tabela) Comparao entre cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia em camada delgada de alta eficincia (CCDAE)

Parmetro
Tamanho usual da placa Volume aplicado de cada amostra Nmero de amostras por placa Dimetro da mancha Distncia de migrao do solvente Tempo de corrida Dimetro mdio da partcula de slica gel Limites de deteco por absoro de luz por fluorescncia Nmero de pratos

CCD
20 x 20 cm 1 - 5 L 7 10 3 6 mm 10 15 cm 30 200 min 20 m

CCDAE
10 x 10 cm 0,1 - 0,2 L 10 20 1 mm 3 6 cm 3 20 min 5 m

- 5 ng - 0,1ng at 600

- 0,5 ng - 0,01 ng at 5.000

s fases estacionrias usadas em CCDAE so slica e vrias fazes que foram originalmente desenvolvidas para CLAE. Essas fases consistem de slica quimicamente modificada com grupos de diferentes polaridades, resultando fases apolares (por exemplo, C18, slica quimicamente ligada a uma cadeia com 18 tomos de carbono), ou de mdia polaridade ( por exemplo, CN, slica quimicamente ligada a um gripo cianopropil) As fazes mais polares so usadas no modo faze normal com fases mveis de baixa polaridade e apresentam comportamento semelhante a slica, ou seja, maior reteno de compostos polares. No entanto, a seletividade pode ser diferente. As fases mveis constitudas de um solvente orgnico, por exemplo, metanol ou acetonitrila, e gua, adicionadas ou no de aditivos. Em tais condies, compostos apolares so mais retidos.

27

8.0- APLICAES DA CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

A CCD mais simples e mais econmica das tcnicas cromatogrficas, quando se pretende a separao rpida e a identificao visvel. Ela tem demonstrado ser de valor extraordinrio na anlise se substancias orgnicas e inorgnicas, acompanhamento de reaes em snteses e de processos de purificaes. Seria muito difcil relacionar todas as aplicaes da CCD; mais fcil seria mencionar que ela est presente em quase todos os laboratrios de qumica ou biologia, em face de fatos como existncia de diferentes fases mveis e estacionrias diferentes tcnicas de desenvolvimento e visualizao sua rpida execuo, sua repetitividade e o curto no elevado. Por ser um mtodo simples, rpido, visual e econmico, a CCD a tcnica predominantemente escolhida para o acompanhamento de reaes orgnicas, sendo tambm muito utilizada para a purificao de substncias e para a identificao de fraes coletadas em cromatografia lquida clssica. Pode ser de aplicao analtica ou preparativa, cuja escala est na dependncia da espessura da camada de adsorvente e da amostra em anlise.

28

9.0- CONCLUSO

Uma tcnica que vem tornando-se indispensvel na qumica analtica e tambm em outras reas a cromatografia em camada delgada. Este mtodo vem apresentando ao longo do tempo, uma melhoria no desempenho dos processos de extrao e aprimorando tcnicas adequadas para resolver problemas de anlise. Como mencionado neste trabalho, a cromatografia em camada delgada- CCD (ou em camada fina) consiste em um processo fsico-qumico, no qual h a separao dos componentes de uma mistura atravs da migrao diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfcie plana, existindo uma vasta e importante aplicao na qumica podendo ser em laboratrio de pesquisas ou em escala industrial. No desenvolvimento do trabalho, notaram-se diversas vantagens adquiridas ao utilizarmos este mtodo. Dentre elas podemos destacar sua fcil manipulao, acessvel financeiramente, possui tcnicas simples, alm de ser de extrema importncia para a separao rpida e analise quantitativa para pequenas quantidades de material. Contudo, ao realizarmos essa pesquisa aprofundada sobre a CCD, conclui-se que esta tcnica uma metodologia muito eficaz, desenvolvida para determinao dos componentes em uma mistura no qual produz resultados satisfatrios para essas anlises, podendo ser determinados numericamente, possuindo valores padres que podem ser consultados em bibliografias confiveis.

29

10- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Fundamentos de cromatografia/ organizadores: Carol H. Colins, Gilberto L. Braga e Pierina S. Bonato. capinas, Sp: editora da UNICAMP, 2006. PARK, Y.K; KOO, M.H.; IKEGAKI, M.; CONTADO, J.L. Comparison of the flavonoid aglycone contents of Apis mellifera propolis from various regions of Brazil. Arq. Biol. Tecnol., v.40, p.97-106, 1997. PRATT, D.E.; BIRAC, P.M. Source of antioxidant activity of soybeans and soy products. J. Food Sci., v.44, p.1720-1722, 1979. VOGEL, A.I., Qumica Analtica Quantitativa e Qualitativa, EDITORA Mestre Jou, So Paulo, 1990 e 1991; HARRIS, D.C., Anlise Qumica quantitativa, 5 edio, LTC EDITORA, RJ, 2001; BACCAN, N.,ANDRADE, J.C.,GODINHO, .O.E.S., BARONE, J. S., Qumica Analtica Quantitativa Elementar, 3 edio, EDITORA Edgard Blcher Ltda, 2001; Iler, R. K., The Chemistry of Silica, John Wiley & Sons, New York, 1979.

30