Oleh : Sherliyana Novita, S. Farm., Apt.

UJI TOKSIKOLOGI

Uji Toksikologi
Produksi+Pemasaran Obat/Makanan Ketahui batas aman

Uji Toksikolo gi
Merupakan uji keamanan pra-klinis Untuk penapisan spektrum efek toksik Hewan roden dan non-roden

ASAS METODELOGI EXPERIMENTAL TOKSIKOLOGI

O Toksisitas = segala efek z.kmw yg tjd atas Jar.Hdp

= hasil rx z.kmw dg komp.sistem Bio.

O METODE deteksi & evaluasi thd sifat perub fungsi

struktur yg disebabkan o/pejanan z.kmw & signifikansi efek2 tsb atas sel-sel hdp

Lanjutan
O Asas-asas :

z.kmw hrs kontak langsung dg target sel/jar.bio u/timb.efek 2. Tdp kisaran daerah antara NOEL s/d [] yg scr sgnifikan beri efek atassgala sistem bio. 3. Sel2 bio dlm bbg macam spesies py fungsi&jalur yg serupa, pd umumnya dg cara serupa akan dipengaruhi o/z.kmw 4. Perub.kecil yg tjd pd struktur z.kmw mgkn pengaruh aksi bio yg ditimbulkan
1.

ASAS UMUM UJI TOKSIKOLOGI

O KONSEP PENELITIAN
O TAKRIF & MAKNA O SISTEM UJI TOKSIKOLOGI O PENENTU KESHAHIHAN UJI

TOX O JENIS UJI TOX O EVALUASI KEAMANAN

Konsep Penelitian
Tahapan-tahapan penelitian : Obyek Uji Subyek Uji Proses Uji Data

Hasil
Manfaat

Takrif & Makna

Takrif / definisi Uji Toksikologi : suatu tatacara untuk mendeteksi dan mengevaluasi kondisi, mekanisme, wujud, dan sifat zat kimia pada hewan uji tertentu untuk menentukan batas keamanannya.

Makna : Objek uji tox : kondisi, mekanisme, wujud, & sifat efek toksik suatu zat kimia (asas umum tox) Subjek uji tox : hewan uji Tujuan : menentukan batas aman

Sistem Uji Toksikologi

Objek Uji : asas umum tox Subyek Uji : hewan uji Proses uji data tolok ukur kuantitatif/kualitatif hasil : informasi ketoksikan bahan uji evaluasi batas keamanan Subjek uji akan dipejani dgn bahan uji ttt, melalui serangkaian proses uji, akhirnya akan diperoleh data analisis hasil manfaat

PENENTU KESHAHIHAN UJI TOX

Keshahihan berhub dgn VALIDITAS UJI, dipengaruhi oleh byk faktor : Bahan Uji spesifikasi & sifat fisika kimia
(kemurnian, kelarutan, stabilitas, kondisi bhn uji) Subjek Uji pemilihan (pilih yg fungsi fisiologis organ mirip manusia, biaya pengadaan hewan, penanganan mudah), kondisi patofisiologi hewan (sehat), jumlah hwn,keterbatasan pengguna, Teknik / Tata cara penyiapan sediaan uji (sifat fiskim jalur pemejanan); penentuan dosis (min 3 peringkat dosis : 0% - 100% toksik), jalur pemejanan, volume , frekuensi, pengambilan cuplikan hayati (jumlah, cara, teknik pengambilan) Pengamatan scr kualitatif atau kuantitatif Analisis & Evaluasi analisis yang sudah baku (Anova, uji t, dll.)

JENIS UJI TOX

UJI KETOKSIKAN TAK KHAS uji tox yang dirancang untuk mengevaluasi keseluruhan atau spektrum efek toksik suatu senyawa pada aneka ragam jenis hewan uji Uji Ketoksikan Akut Uji Ketoksikan Subkronis Uji Ketoksikan Kronis

 UJI KETOKSIKAN KHAS uji tox yg dirancang untuk mengevaluasi secara rinci efek yang khas suatu senyawa pada aneka ragam jenis hewan uji Uji Potensiasi Uji Kekarsinogenikan Uji Kemutagenikan Uji Keteratogenikan Uji Reproduksi Uji Kulit & Mata Uji Perilaku

Macam-Macam Uji Toksikologi

Uji Toksisitas Khusus/Kha s

Reproduksi, Potensiasi, Karsinogenik, Mutagenik

Macam Uji Toksisitas

Dosis Tunggal

Uji toks.Akut

Uji Toksisitas Umum/Tak Khas

Dosis Berulang Uji toks.Subkronis, Kronis

Perbedaan : Sifat pemberian Lama pemberian / pemejanan Sasaran uji Luaran uji

1. Uji Ketoksikan Akut

Dirancang

utk menentukan efek toksik suatu senyawa (ex : zat tambahan makanan) yang akan terjadi dalam waktu singkat setelah pemejanan/pemberiannya dengan takaran ttt. Tujuan : - Mempelajari potensi ketoksikan - Mempelajari gejala klinik/toksik yg timbul - Mempelajari mekanisme kematian subyek uji Sasaran : - wujud efek toksik - potensi ketoksikan akut - mekanisme kematian hewan uji - angka kematian LD50

Pemilihan Hewan Uji

Tata Cara Pelaksaan

min 2 jenis hewan (roden:tikus, mencit, kelinci; &nirroden:anjing, kera), baik jantan atau betina Satu galur, dewasa, sehat, berat seragam (variasi yg dipbolehkn 10%)

Pengelompokan Hewan uji

dibagi menjadi beberapa kelompok sesuai peringkat dosis yg digunakan (biasanya 4 klmpok) + 1 kontrol negatif. Satu kelompok terdiri 4-5 ekor

Pemejanan Dosis sediaan uji

Dosis yg diberikan min 4 peringkat dosis, berkisar dosis tertinggi yg mnyebabkan 0% kematian; sampai dengan dosis terendah yang yang mematikan seluruh/hampir seluruh hewan uji.

Pengamatan
Lama pengamatan 24 jam, kecuali pada kasus ttt (tidak ada kematian) dpt dilanjutkan sampai 7-14 hari. Pengamatan meliputi gejala klinis yang timbul, perubahan BB, jumlah hewan yang mati tiap kelomp, data histopatologi beberapa organ penting

Analisis & Evaluasi Hasil

Ada 3 metode utk analisis perhitungan LD50 : # Metode Grafik Lithfield # Metode kertas grafik probit logaritma Miller&Tainter # Metode rata-rata bergerak Thomson Weill Didasarkan pada kekerabatan peringkat dosis dan % hewan yang menunjukkan respon Evaluasi Hasil : - Data gejala klinis (kualitatif) evaluasi penyebab kematian - Data pemeriksaan histopat spektrum efek toksik - Data jml hewan yg mati (kuantitatif) mhitung LD50 menetukan potensi ketoksikan akut senyawa uji

Manfaat Uji Ketoksikan Akut

Harga LD50 dpt digunakan utk menentukan peringkat/kategori potensi ketoksikan akut suatu senyawa sgt toksik bila dosis kecil sj bisa menimbulkan kematian. (LD50 bukan ukuran batas aman!!) Potensi ketoksikan (LD50) bersama potensi keefektifan (ED50) evaluasi batas aman suatu senyawa/indeks terapi = LD50/ED50 batas keamanan uji tox : KETT (kadar efek toksik terkecil) atau NOEL (No Observe Adverse Effect Level) Pengetahuan ttg potensi ketoksikan dimanfaatkan utk merancang uji ketoksikan subkronis/kronis atau dosis awal/dosis terapi penelitian yg lain (5-10% LD50)

*
* Uji ketoksikan suatu senyawa yg diberikan dg dosis berulang pada hewan
uji ttt, selama < 3bln

* Tujuan :
- Mengetahui spektrum efek toksik suatu senyawa uji - Mengetahui apakah spektrum efek suatu senyw berhub dg takaran/dosis - Mengetahui harga NOEL (dosis tertinggi yg tdk menimbulkan efek toksik) - Mengetahui reversibilitas spektrum efek toksik yg terjadi

* Sasaran :
- hispatologi organ (organ yg terkena efek toksik) - gejala-gejala toksik - wujud efek toksik (kekacauan biokimia, fungsinal, struktural) - sifat efek toksik - Batas keamanan toksikologi terutama KETT

* Pemilihan Hewan Uji

dpt digunakan roden (tikus) dan nirroden (anjing) pilih hewan yg pola metabolisme mirip manusia, dewasa, sehat, jantan atau betina. Jumlah min 10 ekor utk masing-masing jenis kelamin dlm setiap kelompok takaran dosis. min 4 kelompok (3 kelompok dosis & 1 kontrol negatif) regresi min 3 data (analisis hub dosis-efek )

* Pengelompokan Hewan uji

* Pemejanan Dosis sediaan uji

* Pengamatan

Dari dosis yg sm skali tdk menimbulkan efek dosis yg betul2 menimbulkan efek toksik nyata. Min 3 peringkat dosis, syarat : dosis tertinggi sebisa mungkin tdk mematikan hwn tapi mberi efek toksik yg jelas; dosis terendah setingkat dg ED50.
# Wujud efek toksik/spektrumnya, semua jenis perubahan diamati : - Perub Fungsional : pengamatan hematology (Leukosit, Eritro, Hb, dll) - Perub Biokimia : pengamatan kimia darah & urin - Perub struktural : pemeriksaan hispatologi seluruh organ # Kondisi hewan uji (max 3 bln) jml makanan&minuman, perubahan BB

*
*Data BB, asupan makanan&minuman, gejala2 klinis
evaluasi status kesehatan & perkembangan patologi hewan uji akibat pemberian sediaan uji *Hematologi darah&urin evaluasi perubahan fungsional sistem organ *Manfaat : menentukan NOEL menggambarkan batas keamanan secara sub kronis

 Serupa dg uji ketoksikan sub kronis. Perbedaan : lamanya pemberian / pemejanan takaran dosis senyawa uji. Pengamatan selama masa hidup hewan uji pilih hewan yg masa hidupnya pendek Manfaat : mengevaluasi kemungkinan potensi terjadinya tumor/kanker pd hewan uji dilanjutkan ke uji karsinogeni

 Tujuan lain : menutupi kelemahan akut/subkronis : Krn kronik, py nilai prediktif >>> representatif.u/ tegaskan NOEL/dptkan ADI Krn : - z.kmw mgkn hsilkn respon toksik yg bbda bila diberi bulang2 dlm wktu pnjng, - Slm proses menua, faktor2 spt perub kepekaan jar, kapabilitas metabolik+ fisiologis,peny spontan,akan pengaruhi drjt dan sifat respon toksik - Bbrp peny ptg (jantung, ginjal )

UJI POTENSIASI
Tujuan : Utk meneliti kemungkinan terjadinya peningkatan efek toksik suatu senyawa dg hadirnya senyawa yang lain, dimana terdapat kemungkinan akan menaikkan ketoksikan salah satu senyw. Sasaran : Menentukan potensi ketoksikan akut (LD50) gabungan senyawa.

ANALISIS & EVALUASI HASIL

Diperoleh data potensi ketoksikan akut masing2 senyawa dan gabungan senyawa LD50 senyawa gabungan dibandingkan dg LD50 senyw tunggal bila LD50 kombinasi << drpd senyw tunggal berarti terjadi potensiasi (peningkatan potensi ketoksikan) Ex : LD50 senyw A = 500 mg LD50 senyw A+B = 200 mg

TATA CARA PELAKSANAAN Pemilihan Hewan Uji

~ Uji Ketoksikan Akut

Pengelompokan Hewan uji

~ Uji ketoksikan akut. Bedanya : pengelompokan lebih dari 1 senyawa masing2 senyawa diuji sendiri2 dlu, baru diuji gabungan kedua senyawa

Pemejanan Dosis sediaan uji

~ Uji Ketoksikan Akut

Pengamatan
~ Uji Ketoksikan Akut

MANFAAT PENELITIAN Utk evaluasi senywa kombinasi byk obat di pasaran yg terdiri > 1 macam senyawa; resep dokter biasanya obat kombinasi perlu evaluasi apakah tdpt kemungkinan peningkatan efek toksik suatu senywa akibat senyw lain Bila terjadi potensiasi senyawa tsb jgn digunakan

Uji Keteratogenikan
Tujuan : Untuk mengetahui kemungkinan munculnya cacat bawaan pada janin yang dikandung oleh induk yang sedang bunting akibat pemberian suatu senyawa tertentu Sasaran : Wujud efek toksik yang berupa : -Cacat makroskopis, misalnya munculnya sumbing, cacat celah langit, kelengkapan tangan dan kaki -Cacat mikroskopis -Cacat rangka/skeletal/tulang

Tata Cara Pelaksanaan

Hewan uji berupa roden/nirroden. Ciri hewan uji yang bisa dipergunakan : Hewan betina yang mempunyai daur etrus teratur. Kenapa? Hewan yang anaknya banyak, Kenapa? Harus yang masih perawan, Kenapa?

Pengelompokan
Minimal 3 kelompok (3 peringkat dosis) dan 1 kontrol negatif. Kenapa 3 kelompok? Karena nanti akan dianalisis hubungan dosis respon dengan regresi, jadi perlu min 3 titik untuk bisa membuat persamaan garisnya

Perlakuan
Senyawa uji diberikan pada masa organogenesis, karena pada saat itu organ2 janin sedang berkembang, jadi kalau ada cacat mudah sekali terlihat. Masa pengawinan hewan terutama roden yaitu pada sore hari (antara jam5-6) karena pada saat itu hewan dalam masa His (mudah terangsang)

Penetapan Masa Bunting

Dengan cara melihat adanya sperma pada vagina hewan betina, yaitu dengan apus vagina. Proses penglihatan hal tersebut di atas harus cepat, jangan terlalu lama dari masa kawin (paling lambat keesokan paginya) karena jika terlalu lambat, sperma terlanjur hilang.

Dosis / Takaran
Minimal 3 peringkat dosis + 1 kelompok kontrol negatif Yaitu tidak menimbulkan efek teratogenik sampai dosis yang menimbulkan efek teratogen 100% Dosis tertinggi yang dipergunakan tidak boleh menimbulkan pengaruh negatif pada induknya, misal sedasi atau perubahan kelakuan Dosis yang dapat menimbulkan teratogen bisa diperkirakan dari harga LD50 induk, yaitu sekitar - 1/3 LD50 induk

Pengamatan
Dimulai dari berakhirnya masa bunting hewan uji yaitu 12 24 jam sebelum kelahiran normal Kenapa harus dilakukan bedah cesar? Karena biasanya hewan akan memakan anaknya yang lahir cacat

Yang diamati adalah : Biometrika janin, meliputi resorpsi awal, resorpsi akhir, angka cacat, BB janin, dan panjang janin Cacat makroskopis, yaitu pengamatan terhadap adanya cacat badan Cacat mikroskopis, pengamatan histopatologi jaringan untuk melihat adanya cacat seluler Untuk mengamati adanya cacat rangka/skelet, yaitu dengan pewarnaan alizarin. Biasanya janin direndam dulu

Rangkaian keseluruhan Uji

Timbulkan kebuntingan Tegaskan kebuntingan & beri zat kimia Tent.efek teratogenik

Analisis & Evaluasi

Manfaat

Dari data makroskopis dan mikroskopis dapat disimpulkan adanya cacat badaniyah, aborsi, cacat seluler, hingga kelainan rangka pada janin
Adalah untuk memberi label produk obat yang beredar di pasaran bahwa obat tersebut boleh/tidak dikonsumsi oleh wanita hamil

Uji Kemutagenikan

Mutagen adalah zat atau senyawa yang dapat meningkatkan laju perubahan didalam gen(DNA). Mutasi(perubahan) dapat mempengaruhi reproduksi sel, bahkan kadang kala menyebabkan kerusakan sel atau pertumbuhan sel yang tidak terkendali. Beberapa contoh mutagen, antara lain senyawa kimia mustard, etilmetilsulfonat, sinar uv, radiasi sinar x, dll. Mutagenesis adalah proses pembentukan mutasi

Tujuan
Untuk melihat pengaruh suatu senyawa tertentu terhadap kode genetik, sehingga bila berpengaruh akan menimbulkan mutasi yang sifatnya menurun

Sasaran
Ada 2 jenis mutasi dan merupakan sasaran dari uji kemutagenikan, yaitu : Mutasi tempat, berkaitan dengan perubahan susunan basa, asam amino, atau terjadi dalam pasangan nukleotida tunggal dalam molekul DNA (biokimia) Mutasi struktur, berkaitan dengan perubahan dalam sistem kromosom (pecahnya kromosom/penyusunan ulang kromosom, berubah secara kualitas dan juga kuantitas)

Secara in vitro : bakteri (sel tunggal identifikasi komponen genetiknya mudah) Jumlah : 5 x 10 bakteri Cara : bakteri diletakkan dlm cawan petri pejani dg senyw uji periksa perubahan genetiknya

Tata Cara Pelaksanaan in vivo ada 3 metode : Secara

Metode Penetapan Letal Dominan(the dominant lethal assay) Utk mengetahui adanya mutasi kromosom Subyek uji : hewan jantan Subyek dipejani senyw uji (dosis subtoksik) kawinkan dg betina perawan hari ke 14 dicesar periksa & hitung korpus luteum, resorpsi awal&akhir, jmlh tempat implantasi hitung indeks mutasi Indeks mutasi = resorpsi awal/implantasi total x 100 u/bhn farmasetis, BTP,pestisida, sari polutan udar+air

Metode Penetapan Inang Penengah

Perlu bakteri sbg indikator kerusakan/perubahan genetik pd mamamlia Subyek dipejani i.p dg bakteri (Salmonella) ambil cuplikan hayati dr rongga perut ukur frekuensi munculnya mutasi bakteri Utk evaluasi mutasi kromosom, struktural, mutasi tempat yg praktis

Uji Sitogenetika
Senyawa uji dipejankan pd organ ttt hewan uji periksa jaringan/ sel daro organ tsb Sumsum tulang, limfosit, fibroblas, gametosit Utk melihat mutasi struktural/kromosom Cara :diberi scr akut+subakut dg bbrp peringkat dosisi dikorbankan periksa sel2 sumsum tulang pada tahap metafase

Manfaat
Utk mengevaluasi apakah senyawa yg dipakai oleh manuasia berefek menurun pd keturunannya atau tidak

MATUR NUWUN MATUR

NUWUN