TXICOS ORGNICOS FIJOS 2011

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Per, DECANA DE AMRICA)

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA

ESCUELA DE TOXICOLOGA DEPARTAMENTO ACADEMICO FARMACOLOGA BROMATOLOGA Y CURSO: TOXICOMETRA TOXICOLOGA
ALUMNOS:

Compuestos orgnicos fijos: CASTILLO GARCA, MILUSKA EFFIO COELLO, residuos 1 y 4 Evaluacin SOTOMAYOR, JOS de ROSSANA GARCA
HUAMOLLE BARRETO, AURORA RUIZ CAMACHO, JULIO

DOCENTE: Dr. LIZANO GUTIERREZ, JESUS AO: TERCERO SEMESTRE: 2011 II GRUPO: MIRCOLES DE 12:00 PM 16:00PM

LIMA, OCTUBRE DEL 2011

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INTRODUCCIN
Bajo la denominacin de Txicos Orgnicos Fijos (TOF) o no voltiles se incluye una gran variedad de sustancias orgnicas, de inters toxicolgico, que no pueden aislarse por destilacin de las matrices que los contienen, sino que debe recurrirse a la accin de disolventes orgnicos (en medio cido o alcalino) para su separacin y posterior identificacin. La mayora de estos txicos sufren profundos cambios metablicos en el organismo y, en consecuencia, pueden aparecer en los fluidos o tejidos en su forma original o como productos de biotransformacin (metabolitos), libres o conjugados con diferentes compuestos (cido glucurnico, sulfatos, aminocidos, etc.). Las propiedades fsicoqumicas del txico y sus metabolitos pueden ser muy distintas, a veces incluso entre los metabolitos de un mismo compuesto. Ello determina una excrecin caracterstica segn los casos y la conveniencia de realizar la investigacin en una u otra matriz (orina, sangre, bilis, etc.). Frecuentemente la especie que ser analizada est presente en un tejido o un fluido biolgico, unido a protenas u otros constituyentes celulares. En este caso, puede ser necesario separar el txico (el compuesto madre o sus metabolitos) del resto de los componentes de la matriz, de modo de obtenerlo en cantidad y pureza suficientes para permitir su identificacin y cuantificacin. Dentro de estos compuestos se encuentran: Benzodiacepinas, carbamacepina, fenotiazinas, butirofenonas, cannabinoles, anfetaminas, antidepresivos triciclicos, cocaina, estricnina, opiaceos, otros alcaloides y los principales metabolitos de todos ellos. Plaguicidas organofosforados, plaguicidas organoclorados y piretriodes. Cumarinas, plaguicidas carbamicos, glutetimida, hidantoinas, meprobamato, barbituricos, salicilatos y otros analgesicos antipirticos y los principales metabolitos de todos ellos.

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1.

SALICILATOS

Los salicilatos son de absorcin rpida por la va oral y logran la concentracin mxima en el plasma tras dos horas de la ingestin; se distribuyen por casi todos los tejidos del organismo; se excretan principalmente por va renal, y la excrecin depende de la dosis y del pH urinario (como salicilato libre); el pH alcalino favorece la excrecin. Los preparados ms usados son el salicilato de sodio y el cido acetil saliclico (AAS). Otros son el salsalato, la salicilamida, el diflunisal, el salicilato de metilo y el cido saliclico. El AAS es un cido dbil con un pKa 3,5 que, luego de ser absorbido es hidrolizado a cido saliclico, que en su mayor parte se encuentra en forma ionizada (99%). Los salicilatos se unen ampliamente a la albmina, atraviesan la barrera hematoenceflica, la placenta y pasan a la leche materna. En el hgado son biotransformados principalmente a cido salicilrico (conjugado con glicina), glucurnido fenlico y acil glucurnido, y se excretan de esta forma junto con un 10% como cido saliclico libre. Adems, una pequea fraccin se oxida a cido gentsico que, al conjugarse con glicina, forma cido gentisrico. Se elimina principalmente por va renal, segn la concentracin plasmtica de salicilato libre y del pH urinario, y al aumentar la dosis hasta saturar las vas de biotransformacin; la variacin del pH hacia la alcalinidad favorece la eliminacin al disminuir la reabsorcin pasiva en el tbulo distal porque aumenta la fraccin ionizada del metabolito y sta difunde menos. La vida media vara entre 2 y 40 horas conforme aumenta la dosis de salicilato ingerido hasta la sobredosis aguda. La ingestin aguda de

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TXICOS ORGNICOS FIJOS 2011 una dosis entre 150 y 200mg/kg, lo que implica la ingestin de 25 tabletas de 500mg para una persona de 70kg, lleva a la intoxicacin moderada. La intoxicacin severa ocurre con dosis de 300 a 500mg/kg, o sea la ingestin de 40 tabletas de 500mg para una persona que pesa 70kg. En la intoxicacin aguda, se presenta vmito pocas horas despus de la ingestin seguida de hiperpnea, tinnitus y letargia. En el examen de gases arteriales se puede observar alcalosis respiratoria y la acidosis compensatoria, lo cual depende de la dosis y del tiempo transcurrido desde la ingestin. La intoxicacin severa cursa con convulsiones, hipoglicemia, hipertermia (por incremento del metabolismo basal) y edema pulmonar. La muerte ocurre por alteracin en el sistema nervioso central o por colapso cardiovascular. Como se mencion, la fenotiazina es un ncleo heterocclico formado por tres anillos resultantes de la unin de dos anillos benznicos a travs de un puente de N y S. FENOTIAZINAS DIMETLICAS: Estas fenotiazinas, tienen dos grupos metilos en el nitrgeno terminal de la cadena lateral (R1). Poseen una accin sedativa evidente. Sus efectos tranquilizantes son intensos por lo que son utilizados comnmente en episodios esquizofrnicos agudos, excitacin manaca, delirios, agitacin ansiosa, etc. Provocan usualmente hipotensin ortosttica y extrapiramidalismo moderados. Su accin antiemtica, es tambin de moderada intensidad. El prototipo es la CPZ. La levomepromazina, se diferencia de la CPZ, en que posee un grupo CH3 adicional en el segundo carbono de la cadena lateral siendo ms sedativa, y posee adems una potente accin antilgica . La promazina, no posee el Cl en posicin 2, nica diferencia con la CPZ, siendo la intensidad de sus efectos menores que ella. FENOTIAZINAS PIPERAZNICAS: Son las fenotiazinas ms potentes. Su accin antipsictica permite su uso crnico en pacientes esquizofrnicos. Prcticamente no provocan hipotensin ortosttica, o su accin es muy pequea, en este sentido. Son marcadas sin embargo sus acciones extrapiramidales (de mayor intensidad que las dimetlicas). Son activas en dosis menores que las CPZ, y su accin es ms rpida provocando escasa accin sedativa. FENOTIAZINAS PIPERIDLICAS: Son las drogas menos potentes. La ms conocida es la tioridazina, que tiene una indicacin en casos de E.A.P:TOXICOLOGA 4

TXICOS ORGNICOS FIJOS 2011 esquizofrenia con sndromes depresivos. Tomando como base las acciones de la clorpromazina, se ha demostrado que la flufenazina, es a dosis iguales, aproximadamente 20 veces ms potente que aquella, y que la trifluoperazina y tioproperazina lo son 10 veces ms. La tioridazina, por otra parte, posee solo la mitad de la actividad farmacolgica de la clorpromazina. En general, las diferencias de accin observadas, son solo cuantitativas, y no cualitativas. Se puede afirmar que las fenotiazinas piperaznicas, son ms potentes que las dimetlicas y estas ms potentes que las piperidlicas, corriendo porotra parte la potencia de la accin antipsictica paralela a la intensidad de los efectos extrapiramidales, pudiendo esto considerarse como ndice de la accin antipsictica.

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TXICOS ORGNICOS FIJOS 2011 3. BENZODIAZEPINAS

Las benzodiacepinas potencian la accin inhibitoria del neurotransmisor cido gaba amino butrico (GABA), favoreciendo el ingreso de iones de cloro a la clula, lo cual genera hiperpolarizacin celular y disminuye la excitabilidad neuronal. En general el nivel de toxicidad para las benzodiacepinas es muy alto. Los efectos de la sobredosis por va oral son leves o moderados. Se han descrito ingestiones de diazepam de 1520 veces la dosis teraputica sin presentarse deterioro importante de la conciencia; sin embargo, la administracin intravenosa rpida, aun en dosis teraputicas, puede inducir paro respiratorio, posiblemente debido en parte al vehculo de la ampolla (propilenglicol). La coingestin de benzodiacepinas con otras sustancias sedantes, hipnticas, etanol o antipsicticos, potencializa el efecto depresor sobre la respiracin y la conciencia. Los sntomas de depresin del sistema nervioso central (SNC) suelen iniciarse rpidamente por va venosa, o a los 30120 minutos por va oral, dependiendo del compuesto. Los sntomas ms comunes son sedacin, ataxia, somnolencia, disartria, nistagmus y pupilas miticas o intermedias. Puede haber adems hiporreflexia, hipotermia e hipotensin con taquicardia compensatoria. La nusea y el vmito son ms comunes en los nios. La aparicin de coma debe hacer sospechar la coingestin de otros depresores. Ocasionalmente pueden observarse algunos efectos paradjicos como agresin, excitacin, psicosis o deterioro neurolgico importante, siendo ancianos y nios ms susceptibles a este tipo de manifestaciones. La inmovilidad prolongada por inconciencia puede generar rabdomilisis o escaras. Muy ocasionalmente el compromiso respiratorio desencadena hipoxia y acidemia secundaria.

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OBJETIVOS Identificar y diferenciar a los compuestos orgnicos fijos mediante reacciones especficas Determinar la presencia de salicilatos y fenotiazidicos en una muestra. PARTE EXPERIMENTAL
MATERIALES Y EQUIPOS

Reactivo de trinder Reactivo F.P.N. Cloruro frrico cido perclrico

cido ntrico Sulfamato de amonio Etilendiamina

PROCEDIMIENTO A. Residuo 1- Anlisis de salicilatos:

1.

Determinacin:

La determinacin de los salicilatos, en este caso del cido saliclico (ASA), se hace generalmente con cloruro frrico (FeCl3). Cabe resaltar que en el organismo, el ASA sufre una biotransformacin condicionada por el medio bsico proporcionado por el intestino delgado, que es el lugar de absorcin, por lo general, de los salicilatos.

OH O H3C O

OH OH O

OH-

+
cido saliclico

H3C OH

ASA

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Al agregar el reactivo FeCl3, se obtiene un complejo coloreado de salicilato frrico, este complejo de color azul puede ser usado para cuantificacin espectrofotomtrica de ASA a una longitud de onda de 530nm.
O HO OH O
3+

OH

3 cido saliclico

FeCl 3

OH

Fe O
-

OH

El mtodo operativo consiste en agregar 1mL de orina en un tubo de ensayo y calentar ligeramente, tras ello se agrega gotas de FeCl3 5%. Se observa un precipitado color azul que desaparece por el agregado de gotas de HCl concentrado (debido a que el complejo retorna a su estado original de cido saliclico y el Fe+3 gana nuevamente aniones cloruro). 2. Cuantificacin: Para la cuantificacin, P. Trinder decidi hacer una modificacin al mtodo de determinacin cualitativa con FeCl3. Como estamos hablando de una evaluacin toxicolgica en muestras biolgicas, se requiere eliminar impurezas presentes en las mismas, en este caso nos referimos a las protenas, es por ello que aparte de agregar sales de fierro al procedimiento tambin le agreg HgCl y HCl, que en su conjunto efectan la precipitacin de las protenas. El reactivo de Trinder en general est conformado por 40g de HgCl, 120mL de HCl 1N y 40g de Fe(NO3)3 agregando agua csp 1L. El mecanismo de reaccin es el mismo para el expresado en la determinacin con Fe; el metabolito formado para la cuantificacin es el complejo coloreado de salicilato frrico, en este caso cuantificable a 540nm. La tcnica operatoria consiste en colocar en un tubo de ensayo limpio 1mL de sangre (suero) u orina ms 5mL del reactivo de Trinder, E.A.P:TOXICOLOGA 8

TXICOS ORGNICOS FIJOS 2011 finalmente este producto se debe de agitar bien y leer en un espectrofotmetro a 540nm.

B. Residuo 4Anlisis benzodiacepinas:

de

alcaloides,

fenotiazinas

1. Identificacin fenotiazinas:

La identificacin de fenotiazinas ha sido un tpico de amplia investigacin sobretodo aplicado al mbito clnico. Forrest F.M y Forrest F.L, en 1960, propusieron un mtodo de determinacin cualitativa basado en el uso de FeCl3, HClO3 y HNO3 (el reactivo FPN, de fierro, perclrico y ntrico), el cual produce un radical libre con coloracin variable (azul, azul violceo).

La composicin del reactivo FPN consiste en 5 partes de 5% de FeCl3, 50 partes de 50% de cido ntrico y 45 partes de 20% de cido perclrico. Este ltimo funciona como un estabilizador del radical, al E.A.P:TOXICOLOGA 9

TXICOS ORGNICOS FIJOS 2011 cual le da una vida de 3 horas, mientras que el cido ntrico ayuda a intensificar el color.

El mtodo operatorio para una muestra lquida, por ejemplo orina (es ms fcil detectarla ah) consiste en agregar la muestra a un tubo de ensayo y agregar gotas de reactivo FPN, se mostrar finalmente la reaccin con un color azul o azul violceo, al agregar cido clorhdrico se mantiene la coloracin.

Como en la mayora de anlisis toxicolgicos nos encontramos con muestras muy diluidas, es casi nula la presencia del analito en ellas. Ha habido estudios en donde se evala la produccin de falsos negativos sin explicacin alguna para dicho problema (K.N, Campbell, 1960); sin embargo, Forrest y col. en 1966 determinaron que la aparicin de dichos falsos positivos dependa de cuan concentrada estaba la muestra, por ello propusieron que tales deban ser concentradas con calor. El mtodo operatorio para esta variante consiste en colocar gotas de la muestra en una cpsula de porcelana y calentar por unos segundos hasta que el lquido se evapore, de esta manera se agrega gotas de FPN a la zona en donde se coloc la muestra y se observa la coloracin.

2. Identificacin benzodiacepinas: Por lo general, las benzodiacepinas son identificadas por el reactivo de Dragendorff (Tetraiodobismutato de potasio), formndose un precipitado de color naranja, el cual da para los compuestos alcaloideos. Se propuso el uso del reactivo de Bratton- Marshall para la determinacin de benzodiacepinas por diazotizacin (este reactivo fue propuesto originalmente por sus creadores para la determinacin de sulfonamidas en orina). La composicin del reactivo de BrattonMarshall es la siguiente: Nitrito de sodio, sulfamato de amonio y N- (1Naftil) etilendiamina. Previamente, la orina ha de ser sometida a una hidrlisis cida con HCl para la produccin de una benzofenona:

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N
1

NH2

HCl

Con el medio cido proporcionado previamente, el nitrito de sodio se convierte a cido nitroso: NaNO2 + HCl NaCl HNO2 +

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TXICOS ORGNICOS FIJOS 2011 Ahora, se lleva a cabo la reaccin de diazotizacin:

+ N- (1- naftil) etilendiamina

N R NH2 R
1 1

N O

NH NH CH3

HNO2
NH N N NH CH3

Benzofenona
R
1

Compuesto coloreado

El mtodo operatorio consiste en agregar en un tubo, gotas de la muestra, 5mL de HCl 6N y someter la mezcla a un bao de glicerina a 124C por 30 (hidrlisis cida). Se enfra y se agrega 0,5mL de NaNO2 0,1%, se deja en reposo por 3 y se agrega 0,5mL de sulfamato de amonio 0,5%, nuevamente se reposa la mezcla por 3 y finalmente agregamos N- (1- naftil) etilendiamino clorhidrato 0,1%. La reaccin se notar por una coloracin azul o azul violcea.

C. Screening en CCF: El screening en cromatografa en capa fina (CCF) sirve para hacer una determinacin en serie de los metabolitos que queremos evaluar, aunque tienen la ventaja de ser rpidos y de rutina, puede que en algunos casos no sean tan especficos como los mtodos anteriormente descritos. El mtodo operatorio consisti en la preparacin de 3 placas cromatogrficas con slicagel G para cada compuesto respectivamente (salicilatos, benzodiacepinas y fenotiazinas), el sistema de solventes para el salicilato es MeOH: acetona en proporcin 5:5, para las benzodiacepinas y fenotiazinas es MeOH: acetona: trietanolamina en proporcin 5:5:0,03. La siembra de la muestra se debe hacer con un capilar pequeo y para evitar problemas con muestras con escaza concentracin del analito, se presiona con el capilar en el punto de simbra hasta 15 veces. Hay que tener cuidado que se desmorone la fase slida, el punto de siembra debe estar por encima del nivel de la E.A.P:TOXICOLOGA 12

TXICOS ORGNICOS FIJOS 2011 fase mvil, para evitar perdida de muestra en el mismo. Una vez realizada la corrida, se procede a secar con cuidado las placas y se revela. Para los salicilatos se usa revelador trinder, para las fenotiazinas el FPN y para las benzodiacepinas, reactivo de Dragendorff. Todos los reveladores tienen que colocarse en distintos roceadores para evitar mezclas.

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TXICOS ORGNICOS FIJOS 2011 RESULTADOS Residuo 1: Evaluacin de salicilatos Determinacin: Positivo (color violeta oscuro) Cuantificacin: LecturaMP= 1,394, LecturaST= 2.308 Se hizo una dilucin de la muestra de 0,3mL en 5,3mL.

Pero como se hizo una dilucin:

Residuo 4: Evaluacin fenotiazinas y benzodiacepinas. Screening en CCF.

de Determinacin: Negativo Benzodiazepinas: Positivo Salicilatos: Positivo. Fenotiazinas: Negativo. Benzodiazepinas: Positivo (en general para alcaloides).

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TXICOS ORGNICOS FIJOS 2011 DISCUSION Para la identificacin de cada una de las fracciones aisladas de txicos orgnicos fijos se recurri a mtodos qumicos de reaccin colorimtrica y cromatografa. Se utilizo reacciones de generales y particulares de identificacin y para el screening de salicilatos se cuantifico con el reactivo de Trinder por espectrofotometra. Para detectar fenotiazinas se utilizo el reactivo fierro perclrico ntrico mientras que para benzodiacepinas se someti a la reaccin de Dragendorf que solo tiene valor cuando es negativo pues da positivo para cualquier compuesto aminado. En el caso de cromatografa en placa frente al estndar se tuvo los siguientes inconvenientes: el tiempo de vida del estndar estuvo excedido, la siembra de muestra fue insuficiente. Por ello, se visualizo las marcas de los compuestos con poca definicin y claridad. CONCLUSIONES o Mediante reacciones qumicas de identificacin se detecto la presencia de salicilatos y fenotiazinas en la muestra problema. o Se confirmo la presencia de salicilatos y compuestos fenotiazidicos por cromatografa en placa frente a un estndar.

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TXICOS ORGNICOS FIJOS 2011 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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de Toxicologa del Cuerpo Mdico Forense- Poder Judicial de Mendoza. Mendoza, Argentina- 2007.
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Iron (III) and Hexacyanoferrate (III) as Reagents for the Spectrophometric Determination of Promazine and perazine. Acta poloniae pharmaceutica- Drug Research Vol. 58 No 6.
Forrest and Forrest. Urine Color Test for the Detection of

Phenothiazine Compounds. Clinical Chemistry.

K.N,

Campbell. Phenothiazine Derivatives in Urine: False Negative Results with the Forrest Color Test (FPN), and a Method for Their Elimination. Vol 11, No 10- 1965. with the FPN Forrest Test for Phenothiazine Derivatives in Urine. Clinical Chemistry.

Forrest, Forrest, Kanter. Elimination of False Negative Results

P. Trinder. Rapid Determination of Salicylate in Biological Fluids.

Act. Biochimica. UK- 1953. http://es.scribd.com/doc/16275753/toxicologia-forense

Dra. Leda Giannuzzi. Toxicologa Analtica. Manual de Tcnicas

Analticas en el Laboratorio de Toxicologa. http://www.adnsalta.com.ar/Capitulo-3.pdf

Disponible

en

http://www.biol.unlp.edu.ar/toxicologia/guiastp/guia_tp2/toxicologia_ur gencia.html

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