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Relatrio referente aula prtica de Bioqumica I

PROTENAS: REAES DE COLORAO E PRECIPITAO

DISCENTES: Bruno Zaneli Campanari Maria Beatriz Alves Afonso Monique Aparecida DOCENTE: Denilson Albuquerque Rosa

Presidente Prudente 2012

Sumrio
1.INTRODUO...................................................................................................................3 1.1 Uma introduo as protenas.........................................................................................3 1.2 Estruturas.......................................................................................................................4 1.2.1 Estrutura primria.......................................................................................................4 1.2.2 Estrutura secundria...................................................................................................4 1.2.3 Estrutura terciria........................................................................................................5 1.2.4 Estrutura quaternria.................................................................................................... 5 1.3 Reao da Ninhidrina ..................................................................................................... 7 1.4 Reao do Biureto ........................................................................................................... 7 1.5 Precipitao de protenas com desnaturao ................................................................... 8 1.6 Precipitao por reao com os reagentes para alcalides .............................................. 8 1.7 Precipitao por reao com metais pesados .................................................................. 8 1.8 Precipitao por reao com solventes orgnicos ........................................................... 8 1 .9 Efeito da fora inica sobre a solubidade (Salting In) ................................................... 9 1.10 Reaes de precipitao sem desnaturao (Salting Out) ............................................ 9 2. OBJETIVOS.....................................................................................................................9 3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ....................................................................... 10 3.1 Reao de colorao de protenas ................................................................................. 10 3.1.1 Reao da ninhidrina .................................................................................................. 10 3.1.2 Reao do biureto ..................................................................................................... 11 3.2. Reaes de precipitao de protenas ......................................................................... 11 3.2.1 Reao de precipitao com desnaturao ................................................................ 11 3.2.2 Precipitao por ao do calor .................................................................................. 12 3.2.3 Precipitao por ao do calor ................................................................................... 12 3.2.4 Precipitao por sais de metais pesados....................................................................12 3.2.5 Precipitao por ao de solventes orgnicos...........................................................13 3.3 Reao de precipitao sem desnaturao....................................................................13 3.3.1 Solubilizao (salting- in).......................................................................................13 3.3.2 Precipitao ("salting-out")........................................................................................14 4. RESULTADOS E DISCUSSES .................................................................................. 15 5. CONCLUSES ............................................................................................................... 22

1. INTRODUO

1.1 Uma introduo s protenas As clulas, em geral, contm milhares de protenas diferentes, cada uma com uma funo ou atividade biolgica diferente. Estas funes incluem catlise enzimtica, transporte molecular, nutrio, motilidade do organismo ou celular, papis estruturais, defesa do organismo, regulao e muitas outras. As protenas consistem de cadeias polipeptdicas muito longas, tendo no mnimo 20 aminocidos unidos por ligaes peptdicas e arranjados em sequncias diferentes. Uma ligao peptdica a unio do grupo amino (-NH2) de um aminocido com o grupo carboxila (-COOH) de outro aminocido, atravs da formao de uma amida.

A palavra protena vem do grego proteios, que significa que tem prioridade. Essa palavra tem real sentido, j que elas so e fato as macromolculas mais importantes das clulas. Nos animais, as protenas correspondem a cerca de 80% do peso dos msculos desidratados, cerca de 70% da pele e 90% do sangue seco. Mesmo nos vegetais as protenas esto presentes. A importncia das protenas, entretanto, est relacionada com suas funes no organismo, e no com sua quantidade. Todas as enzimas conhecidas, por exemplo, so protenas; muitas vezes, as enzimas existem em pores muito pequenas. Mesmo assim, estas substncias catalisam todas as reaes metablicas e capacitam aos organismos a construo de outras molculas - protenas, cidos nuclicos, carboidratos e lipdios - que so necessrias para a vida.

Todas as protenas contm carbono, hidrognio, nitrognio e oxignio, e quase todas contm enxofre. Algumas protenas contm elementos adicionais, particularmente fsforo, ferro, zinco e cobre. Seu peso molecular extremamente elevado. 1.2 Estruturas As protenas podem ter 4 tipos de estrutura dependendo do tipo de aminocidos que possui, do tamanho da cadeia e da configurao espacial da cadeia polipeptdica. As estruturas so: 1.2.1 Estrutura primria dada pela seqncia de aminocidos ao longo da cadeia polipeptdica. o nvel estrutural mais simples e mais importante, pois dele deriva todo o arranjo espacial da molcula. So especficas para cada protena, sendo, geralmente, determinadas geneticamente. A estrutura primria da protena resulta em uma longa cadeia de aminocidos, com uma extremidade "amino terminal" e uma extremidade "carboxi terminal". Sua estrutura somente a seqncia dos aminocidos, sem se preocupar com a orientao espacial da molcula. Suas ligaes so ligaes peptdicas e pontes dissulfeto. representada pela sequncia de aminocidos unidos por meio das ligaes peptdicas, e ligada a carboidratos assim como outro.

1.2.2 Estrutura secundria dada pelo arranjo espacial de aminocidos prximos entre si na sequncia primria da protena. o ltimo nvel de organizao das protenas fibrosas, mais simples estruturalmente. Ocorre graas possibilidade de rotao das ligaes entre os carbonos alfa dos aminocidos e os seus grupos amina e carboxilo. O arranjo secundrio de uma cadeia polipeptdica pode ocorrer de forma regular; isso acontece quando os ngulos das ligaes entre carbonos alfa e seus ligantes so iguais e se repetem ao longo de um segmento da molcula.

So dois os tipos principais de arranjo secundrio regular: Alfa-hlice: presente na estrutura secundria dos nveis de organizao das protenas. So estruturas cilindricas estabilizadas por pontes de hidrognio entre aminocidos. As cadeias laterais dos aminocidos encontram-se viradas para fora. Existem vrias formas de como as hlice alfa podem organizar-se. Folha-beta: padro estrutural encontrado em vrias protenas, nas quais regies vizinhas da cadeia polipeptdica associam-se por meio de ligaes de hidrognio, resultando em uma estrutura achatada e rgida

1.2.3 Estrutura terciria Resulta do enrolamento da hlice ou da folha pregueada, sendo estabilizada por pontes de hidrognio e pontes dissulfeto. Esta estrutura confere a atividade biolgica s protenas. A estrutura terciria descreve o dobramento final de uma cadeia, por interaes de regies com estrutura regular ou de regies sem estrutura definida, podendo haver interaes de segmentos distantes de estrutura primria, por ligaes no covalentes. Enquanto a estrutura secundria determinada pelo relacionamento estrutural de curta distncia, a terciria caracterizada pelas interaes de longa distncia entre aminocidos, denominadas interaes hidrofbicas, pelas interaes eletrostticas, pontes de hidrogenio e de sulfeto. Todas tm seqncias de aminocidos diferentes, refletindo estruturas e funes diferentes. Efetua interaes locais entre os aminocidos que ficam prximos uns dos outros.

1.2.4 Estrutura quaternria Algumas protenas podem ter duas ou mais cadeias polipeptdicas. Essa transformao das protenas em estruturas tridimensionais a estrutura quaternria, que so guiadas e estabilizadas pelas mesmas interaes da terciria. A juno de cadeias polipeptdicas pode produzir diferentes funes para os compostos.

Um dos principais exemplos de estrutura quaternria a hemoglobina. Sua estrutura formada por quatro cadeias polipeptdicas.

Figura 1 - Estrutura da Hemoglobina

1.3 Reao da Ninhidrina: A ninhidrina (2,2-diidroxi-hidrindeno-1,3-diona) um produto qumico utilizado para a deteco de aminas primrias, particularmente de aminocidos. Quando uma soluo de ninhidrina aquecida em uma mistura com uma soluo de aminocido, peptdeo ou protena desenvolve-se uma colorao azul violcia, conhecida como prpura de Ruhemann. A reao da ninhidrina, reao que caracteriza a presena de grupos amino, de extrema importncia na nalise de protinas e aminocidos. Esta dar positivo para grupos de amino de aminocidos livres, grupos amino terminais de peptdeos e protenas e grupos amino da lisina, presentes em protenas. A reao da ninhidrina de extrema importncia na Bioqumica onde utilizada na deteco de aminocidos, que possuem a caracterstica amina primria. Por ser um agente oxidante muito poderoso, a ninhidrina reage com o aminocido da cadeia, dando origem a um composto de cor prpura.

1.4 Reao do Biureto O reagente de biureto um reagente analtico feito de hidrxido de potssio (KOH) e sulfato de cobre (II) (CuSO4), junto com tartarato de sdio e potssio (KNaC4H4O64H2O). Este reagente de colorao azul torna-se violeta na presena de protenas, e muda para rosa quando combinado com polipeptdeos de cadeia curta. O responsvel por essa colorao um complexo, como o representado abaixo:

Figura 2 - Estrutura do complexo

1.5 Precipitao de protenas com desnaturao A solubilidade de uma protena muito varivel e depende da distribuio e da proporo dos grupos polares (hidroflicos) e apolares (hidrofbicos), na molcula. Muitas protenas so solveis em gua ou solues salinas. Desde que uma protena possui muitos grupos carregados positiva e negativamente provenientes das cadeias laterais dos aminocidos, as molculas iro interagir umas com as outras, com pequenos ons de cargas opostas e com a gua. Assim, ocorrem interaes protena - protena, protena-gua e protena-pequenos ons. Se a interao protena-protena grande e a interao protena-gua pequena, a protena tender a ser insolvel. Por outro lado, se a interao protena-gua alta, a protena tender a ser solvel. Qualquer condio que aumente a interao protena protena ou decresa a interao protena - gua, decrescer a solubilidade e vice- versa. A temperatura um fator importante na solubilizao das protenas. Em geral, entre O e 40C o aumento da temperatura favorece a solubilidade. Isto decorre do fato do

calor provocar um aumento da energia cintica das molculas de protena, facilitando a interao destas com o solvente. Entretanto, acima de 40C, as protenas comeam a precipitar: os movimentos moleculares se tornam to intensos que os grupamentos qumicos se afastam alm da distncia permitida para se reassociarem, aproximando-se de outros com os quais se associam. Assim, ocorre o rompimento das estruturas secundria, terciria e quaternria e a protena adquire outra conformao, uma conformao inativa (desnaturada).

1.6 Precipitao por reao com os reagentes para alcalides Os nions de alcalides (TCA) so capazes de se combinar com protenas que possuam resduos de aminocidos na forma de ctions, formando complexos insolveis que se precipitam e caracterizam a desnaturao. 1.7 Precipitao por reao com metais pesados Os ctions de metais pesados como Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe2+, Cd2+ e Zn2+ formam precipitados insolveis de protenas, denominados de acordo com o elemento formador (exemplo: proteinato de mercrio, proteinato de chumbo, etc.). Essa precipitao mais intensa quando o pH est acima do ponto isoeltrico (pI). Isso porque, acima do pI, a carga lquida sobre a protena negativa, favorecendo a interao com os ctions provenientes do sal.

1.8 Precipitao por reao com solventes orgnicos A solubilidade das protenas em solventes orgnicos menor do que em gua. Isso acontece porque a capacidade de interao com as partculas de soluto diferente para cada solvente. A grandeza que mede a capacidade de interao do solvente com o soluto denominada constante dieltrica. A gua apresenta constante dieltrica bastante elevada A precipitao por solventes orgnicos depende muito da temperatura. Os solventes orgnicos, quando utilizados a temperaturas baixas, so bastante teis na separao de misturas de protenas. A temperaturas mais elevadas esses solventes podem levar

desnaturao por rompimento das pontes de hidrognio e estabelecimento de interaes apolares, importantes na manuteno da conformao proteica.

1.9 Efeito da fora inica sobre a solubidade (Salting In) Em baixas concentraes de sais (baixa fora inica), a solubilidade em geral aumenta, pois os ons salinos tendem a se associar s protenas contribuindo para uma hidratao e/ou repulso entre as molculas, aumentando a solubilidade salting in.

1.10 Reaes de precipitao sem desnaturao (Salting Out) A capacidade dos sais neutros de influenciar a solubilidade das protenas uma funo de sua fora inica, que tanto depende de sua concentrao como da valncia de ctions e nions que formam o sal. Em altas foras inicas, conseguidas pela adio de grandes quantidades de um sal muito solvel (por exemplo, o sulfato de amnio) a uma soluo de protena, pode ocorrer remoo de molculas de gua de hidratao das protenas, o que leva predominncia das interaes protena-protena, resultando em precipitao, fenmeno conhecido como salting-out.

2. OBJETIVOS
Os objetivos desta aula prtica so caracterizar a presena de protenas em material biolgico, verificar experimentalmente a precipitao de protenas com e sem desnaturao e relacionar as observaes prticas com a teoria de propriedades gerais, estrutura e isolamento de protenas.

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3. PROCEDIMENTOS

3.1. REAO DE COLORAO DE PROTENAS

3.1.1 Reao da ninhidrina Equipamentos e vidrarias: 02 tubos de ensaio Bico de Bunsen 01 pipeta graduada de 2 mL 01 pera

Reagentes: Soluo de ninhidrina a 0,1% em tampo fosfato pH 7,0 (10mM) Soluo de protenas: clara de ovo a 10% v/v em soluo salina 0,9% Soluo de glicina 0,1%

Tcnica utilizada: Numeramos 2 tubos de ensaio. No primeiro tubo colocamos 2 mL da soluo de ninhidrina a 0,1%, mais 5 gotas de protenas, fervemos em chama direta durante 2 minutos. Logo em seguida, no segundo tubo, colocamos 2 mL da soluo de ninhidrina a 0,1%, adicionamos 5 gotas de glicina e fervemos em chama direta durante 2 minutos.

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3.1.2 Reao do biureto Equipamentos e vidrarias: 03 tubos de ensaio 03 pipetas graduadas de 2 mL 02 peras

Reagentes: Soluo de hidrxido de sdio 2,5 M Soluo de sulfato de cobre 1% Soluo de protena: clara de ovo a 10% v/v em soluo salina 0,9% Soluo de glicina 0,1%

Tcnica utilizada: Numeramos 3 tubos de ensaio. No primeiro colocamos 1 mL da soluo de protenas, adicionamos 5 gotas de NaOH 2,5 M e 3 gotas de sulfato de cobre 1%. No segundo tubo colocamos 1 mL de soluo de glicina, adicionamos 5 gotas de NaOH 2,5M e 3 gotas de sulfato de cobre 1% Aps, no terceiro tubo, colocamos 1 mL de gua destilada, adicionamos 5 gotas de NaOH 2,5 M e 3 gotas de sulfato de cobre 1%. Comparamos com o tubo 2.

3.2 REAES DE PRECIPITAES DE PROTENAS


3.2.1 Reao de precipitao com desnaturao Equipamentos e vidrarias: 04 tubos de ensaio 01 bico de Bunsen 03 pipetas graduada de 2 mL

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01 pipeta graduada de 5 mL

Reagentes: Soluo de protenas preparada pela diluio da clara de ovo a 10% (v/v) com salina [NaCl 0,9g % (p/v)] cido tricloroactico (TCA) a 10% (p/v) Acetato de Chumbo a 5% (p/v) lcool etlico absoluto

3.2.2 Precipitao por ao de calor Tcnica utilizada: No tubo de ensaio 01 colocamos 2 mL da soluo de protenas e aquecemos diretamente na chama.

3.2.3 Precipitao por reao com os reagentes para alcaloides Tcnica utilizada: No tubo de ensaio 02 colocamos 1 mL da soluo de protenas e 1 mL de cido tricloroactico a 10% (TCA).

3.2.4 Precipitao por reao com sais de metais pesados Tcnica utilizada: No tubo de ensaio 03 colocamos 1 mL da soluo de protenas e 1 mL de acetato de chumbo a 5%.

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3.2.5 Precipitao por ao de solventes orgnicos Tcnica utilizada: No tubo de ensaio 04 colocamos 1 mL da soluo de protenas e 3 mL de lcool etlico, at a formao de precipitado de protenas.

3.3 Reaes de precipitao sem desnaturao Equipamentos e vidrarias: 01 bquer de 50 mL 01 basto de vidro 02 pipetas graduadas de 2 mL 01 pipeta graduada de 10 mL 01 pipeta graduada de 5 mL 01 tubo de ensaio

Reagentes: Clara de ovo in natura Cloreto de sdio 1 M Soluo saturada de sulfato de amnio 76,6 g% (p/v)

3.3.1 Solubilizao (salting- in) Tcnica utilizada: Colocamos 3 mL de clara de ovo em um bquer pequeno. Dilumos com um pequeno volume de gua destilada, agitando suavemente com um basto de vidro, at

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notarmos um aparecimento de precipitado (globulinas). Em seguida, adicionamos soluo de cloreto de sdio, gota a gota, at a redissoluo do precipitado.

3.3.2 Precipitao (salting- out) Tcnica utilizada: Pipetamos 2 mL da soluo obtida na experincia anterior (salting-in) em um tubo de ensaio. Em seguida, adicionamos 2 mL de soluo saturada de sulfato de amnio e observamos a formao de precipitado de protenas (globulinas), que corresponde ao fenmeno salting-out. Aps, adicionamos 6 mL de gua destilada a fim de recompor a fora inica anterior e como consequncia, redissolver o precipitado.

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4. RESULTADOS E DISCUSSES

4.1 Reaes de colorao de protenas

4.1.2 Reao com ninhidrina

Tabela 01 Dados experimentais reao com ninhidrina. Tubos 1 Observou-se logo no inicio do aquecimento a mudana da colorao da soluo de incolor para prpura menos intenso. 2 Observou-se a mudana da colorao da soluo de incolor para prpura mais intenso.

Imagem 01-Reao com a ninhidrina

Discusses: A clara do ovo composta por protenas como a albumina e por outras substncias que dificultam a reao com a ninhidrina, por isso no incio no foi observada a formao do

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composto corado. Entretanto, logo aps o aquecimento a uma temperatura elevada, a ninhidrina reagiu com os aminocidos da clara do ovo, apresentando uma colorao prpura menos intensa. Isto aconteceu porque, sendo a clara de ovo uma protena, os aminocidos que a constituem esto ligados por ligaes peptdicas e no no estado livre, por esse motivo a reao com a ninhidrina no aconteceu, pois esta detecta apenas aminocidos livres. No entanto aps o aquecimento, esta reagiu com a ninhidrina, uma vez que as ligaes peptdicas foram quebradas, pois houve o aumento da vibrao das partculas (consequncia do aquecimento), alterando a conformao desta protena e expondo os aminocidos livres a ninhidrina, da a observao da colorao prpura. A glicina um dos aminocidos codificados pelo cdigo gentico, portanto era de se esperar que essa reagisse com a ninhidrina. Entretanto inicialmente no se observou claramente a reao deste aminocido com a ninhidrina, mas assim que o tubo de ensaio foi aquecido reao foi instantnea, podendo-se comprovar que a ninhidrina estava na presena de um aminocido. O aquecimento, assim como no caso da clara de ovo, provocou o aumento da vibrao das partculas, o que ajudou a ninhidrina a reagir com a glicina, e formar o composto de colorao prpura intenso. A cor do composto formado pela clara de ovo foi menos intensa que a formada pela glicina, pois sendo a clara de ovo um material biolgico esta possui mais material em sua composio para alm das protenas. Assim a quebra dessas ligaes peptdicas dificultada pela presena dessas outras substncias, o que contribui tambm para um menor nmero de aminocidos livres a reagir com a ninhidrina, resultando num inferior nmero de compostos corados, da a cor menos intensa da clara de ovo comparada com a da glicina.

4.1.3 Reao do biureto

Tabela 02 Dados experimentais reao com biureto Tubos 1 2 3 - branco Houve a mudana de colorao de incolor para violeta. Houve a mudana de colorao de incolor pra azul claro. Houve a mudana da colorao de incolor para azul claro.

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Imagem 02- Reao com biureto (tubo 1)

Imagem 03- reao com biureto (tubos 2 e 3)

Discusses: O tubo 3 foi utilizado como branco, este continha apenas gua destilada, pois sabido que a gua destilada no contem protenas, assim a reao neste tubo no ocorre e este pode ser usado como referncia para os restantes. Assim os tubos cujos comportamentos foram semelhantes ao do biureto com a gua, colorao azul claro, pode-se dizer que tem resultado final negativo, no ocorre reao. Por outro lado, os tubos cujos comportamentos se mostraram diferentes ao tubo com gua destilada com biureto, pode-se dizer que tem um resultado positivo para presena de protenas.

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Uma vez que o teste com biureto apenas d positivo (apresenta cor violeta) quando existem ligaes peptdicas no meio, podamos logo deduzir que o teste daria negativo pra o tubo 2, uma vez que este continha glicina, que um aminocido. E assim se verificou ao adicionarmos o biureto glicina no houve a formao de um complexo de cor violeta. No tubo 1 observamos a mudana da colorao para violeta, j que este continha protena, que possuem ligao peptdicas.

4.2 Reaes de precipitao de protenas

4.2.1 Reaes de precipitao com desnaturao

Tabela03- Dados experimentais das reaes de precipitao com desnaturao

Reaes de precipitao Ao do calor Alcalides Metais pesados

Observaes

Formao de um precipitado gelatinoso de colorao branca Aparecimento de uma colorao branca A soluo continuou incolor, houve apenas a apario de alguns fios esbranquiados Formao de um precipitado branco leitoso

Solventes orgnicos

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Imagem 04- Reao sob ao do calor.

Imagem 05- Reaes de precipitao com reagentes alcaloides, sais de metais pesados e solventes orgnicos, respectivamente.

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Discusses: O etanol um solvente orgnico miscvel com a gua e como as protenas tambm so solveis em vrias solues aquosas, pois apresentam grupos polares hidroflicos (que tm afinidade com os grupos polares das solues), estas vo reagir com o etanol e este vir provocar a ruptura das pontes de hidrognio e das ligaes hidrofbicas das protenas, fazendo com que ocorra a sua desnaturao e com que se tornem insolveis, verificando-se ento um precipitado. Ao adicionar cido tricloroactico, um alcaloide, as protenas estas tem suas cargas modificadas e, por conseguinte seu pH. Meios mais bsicos ou mais cidos alteram o estado de ionizao das cadeias laterais dos aminocidos e ocorre o rompimento das atraes elctricas que ajudavam a manter a configurao espacial da protena (ligaes de hidrognio e ligaes inicas). Assim sendo, como o pH da protena foi alterado, assim como a sua conformao ela deixou de estar no seu estado nativo. O aumento da temperatura aumenta a velocidade da vibrao molecular o que leva a uma quebra das ligaes fracas de hidrognio, que leva tambm a uma alterao da conformao da protena e a sua desnaturao.

Reaes de precipitao sem desnaturao

Tabela 04 Dados experimentais das reaes de precipitao sem desnaturao Reaes Solubilizao (salting in) Observaes A adio da gua levou a formao de pequenos fios brancos na clara do ovo, precipitado. A adio de um volume maior de NaCl, levou a redissoluo do precitado formado anteriormente A adio de sulfato de amnio a soluo fez com que ela se Precipitao (salting out) torna-se turva, formao de um precipitado branco. A adio de gua a soluo fez com ela volta-se ao estado inicial

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Imagem 06- Solubilizao (salting-in)

Imagem 07- Precipitao (salting-out)

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5-CONCLUSO

A partir da aula prtica realizada pode-se concluir que as reaes de colorao e precipitao de protenas permitem a caracterizao destas a partir de procedimentos que so baseados em suas propriedades fsicas e qumicas, como as ligaes peptdicas, estrutura molecular e solubilidade. Pode-se observar que as reaes de colorao permitem a identificao das protenas sem alterar a sua estrutura. Enquanto que as algumas reaes de precipitao alteram a sua estrutura proteica, podendo desnatur-las ou no, como no caso da precipitao (salting-out) e da solubilizao (salting- in) que alteram as protenas sem desnatur-las.

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6-REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Livros: Lehninger, A. Lester. Fundamentos de Bioqumica. 4 ed. So Paulo: Sarvier, 2006

Sites: http://pt.wikipedia.org/wiki/Reagente_de_biureto http://pt.scribd.com/alexandra_salvado/d/56009053-Relatorio-2 http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/precipitacao_proteinas.ht m

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