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Manual para o uso do ProteinLynx Global Server v2.

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Fiocruz-Bahia Centro de Pesquisas Gonalo Moniz

Margareth B. C. Gallo
Salvador 2011

Manual para o processamento de dados com o PLGS, Abr/2011

ndice
1. Criando projeto de processamento no PLGS para amostras sem marcadores isotpicos/isobricos ....................................................................................................... 3 2. Criando projeto de processamento no PLGS para amostras marcadas com iTRAQ (isobaric tag for relative and absolute quantitation) ......................................................... 8 3. Criando programa de processamento (Processing Parameters) no PLGS para amostras com marcadores isotpicos/isobricos .......................................................... 26 4. Criando programa para a comparao em banco de dados (Workflow Designer) no PLGS para amostras com marcadores isotpicos/isobricos ....................................... 31 5. Criando/Adicionando modificaes fixas ou variveis ............................................ 39

6. Usando o Expression Analysis para comparar e analisar os grupos de amostras com marcadores isobricos (iTRAQ) ............................................................................ 41 7. 8. 9. Observando/interpretando os resultados da anlise de expresso ........................ 49 Organizando os bancos de dados .......................................................................... 55 Referncias ............................................................................................................ 59

Autora:

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Manual para o processamento de dados com o PLGS, Abr/2011 1.Criando projeto de processamento no PLGS para amostras sem marcadores isotpicos/isobricos
1.1.No computador de processamento de dados, clique no cone do PLGS (Protein Lynx Global Server) v. 2.4 1.2. Clique em Project Manager File new project, aparece caixa de dilogo para voc nomear o projeto, faa-o e depois clique OK. O nome do projeto aparecer preenchendo o espao em branco de projects. Na lateral direita aparece a pasta do novo projeto contendo vrias opes para criao das amostras.

1.3. Nas opes disponveis, clique esquerdo sobre microtitre plates e direito sobre new microtitre plates.

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1.4.Aparecer janela do new container. Marque microtitre plate, nomeie com o ano ms e data da anlise, format = 6 x 8 cap LC microtitre plate (este o tipo da bandeja de amostras que temos no gerenciador de amostras). Clique OK.

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1.5.Aparecer o desenho de uma placa contendo pocinhos. Esta placa ilustrativa e no tem relao com a ordem real dos vials que voc determinou na lista de amostras do UPLC, mas ter relao com o nmero de corridas que voc programou na lista de amostras do MassLynx a serem injetadas. Para isto, basta clicar sobre o primeiro pocinho, pressionar, arrastar englobando quantos pocinhos forem necessrios para o nmero de amostras que sero processadas. Os pocinhos selecionados ficam pretos.

1.6.Clique esquerdo sobre um dos pocinhos de amostra e depois clique direito em set sample. Vai aparecer a janelinha do select a sample, clique sobre default e OK. Os pocinhos se tornam cinzas e clicando sobre o novo ndulo que aparece abaixo da

microtitre plate, voc ver aparecer todas amostras numeradas adequadamente. Caso o default esteja com o instrumento errado, por exemplo Maldi em vez de QTOF, v em options preferences (clique esquerdo), aparece janela de preferences, clique instrument QTOF- MSMS apply OK. importante que o instrumento esteja determinado corretamente, pois o processamento estar baseado em parmetros especficos para cada instrumento.

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1.7.Os dados tero que ser anexados manualmente a cada pocinho (amostra). Para isto, clique esquerdo sobre da 1 amostra, clique esquerdo sobre mass spectrum

not yet obtained e depois clique direito. Aparece novas opes, clique esquerdo sobre set raw data file, v ao diretrio de Database (D:) raw selecione o arquivo da amostra. Proceda como nos passos dos captulos 3 e 4, para criar os programas de Processing Parameters e Workflow Designer. Caso voc j tenha criado os arquivos com os parmetros de processamento e do banco de dados, proceda como no tem 2.11.

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1.8. Automaticamente aps a escolha, voc j ver o nome da amostra selecionada e os arquivos de Processing e Workflow designer incorporados abaixo de cada amostra.

2.Criando projeto de processamento no PLGS para amostras marcadas com iTRAQ (isobaric tag for relative and absolute quantitation)
2.1.No computador de processamento de dados, open PLGS (Protein Lynx Global Server) v 2.4 2.2. Clique Project Manager File new project, aparece caixa de dilogo para voc nomear o projeto, faa-o e depois clique OK. Na lateral direita aparece a pasta do novo projeto contendo vrias opes para criao das amostras. 2.3. Nas opes disponveis, clique esquerdo sobre original samples e direito sobre add new sample. Responda yes pergunta add new sample to vial?. Repita esta

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operao para quantos forem os isbaros que voc est usando para marcar suas amostras (4- ou 8-plex). Observe que aparecem novos tubos para cada sample criada. 2.4. Clique sobre a sample criada. Aparece um quadro com vrios parmetros a serem preenchidos. Neste quadro clique sobre name. Embaixo do quadro aparecer um local para que voc nomeie a amostra, clique update. Automaticamente o name da amostra trocado pelo nome que voc deu a sua amostra.

2.5. Depois clique sobre Tag, embaixo do quadro aparece local para voc determinar qual o marcador. Escolha na lista conforme voc usou os reagentes iTRAQ 4-plex (114, 115, 116 ou 117) ou 8-plex (113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 ou 121). KY significa marcao isobrica nos resduos de lisina e tirosina da cadeia lateral, e Nterminal no grupo amino terminal do peptdeo. Neste campo, s necessria a escolha de uma das opes (KY ou N-term). Posteriormente, no Workflow designer, que ser necessria a escolha de todas as opes como fixed modifications.

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2.6. Se quiser verificar os dados dos reagentes isobricos, clique no cone Modifier tool, aparecer a janela com uma lista de opes, clique a desejada e veja as especificaes do mesmo, como mostra o quadro abaixo.

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2.7. Depois de nomear e determinar todas as amostras com seus respectivos isbaros, clique sobre uma delas, aperte ctrl e v selecionando todas as outras. Clique direito generate processed samples. Automaticamente uma nova amostra criada, a qual composta por todas as que foram selecionadas (pois na prtica elas foram misturadas, conforme protocolo do iTRAQ).

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2.8. Clique sobre a amostra criada e no quadro de edio da amostra, clique Name. Logo abaixo do quadro, nomeie a amostra com os isbaros que voc usou, por exemplo 114 e 117, clique update. Automaticamente este nome aparece na frente do novo vial abaixo de processed samples. No se preocupe em especificar o Tag nesta amostra processada, pois as amostras que a compe aparecem quando voc clica o + em contm. , e so as que notificaro ao PLGS quais os isbaros que a mistura

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2.9. NO prximo passo, selecione vial, clique direito e new vial, aparece nova caixa de dilogo. Selecione vial e nomeie a amostra. Clique ok.

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2.10. Clique sobre vial criado set sample, aparece caixa de dilogo. Selecione a amostra processada (isbaros juntos), clique ok.

Observao: Se voc est analisando vrias sub-fraes provenientes da mesma amostra marcada com iTRAQ (por exemplo, 12 ou 24 fraes provenientes de um prfracionamento de amostra complexa em SCX ou OFFGEL), voc ter que repetir o procedimento de original samples e processed samples para cada uma das fraes. Posteriormente, poder processar cada uma separadamente, e depois todas de uma s vez (ver Merge MSMS spectra).

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2.11. Para salvar as amostras criadas, clique no cone save (disquete) da barra de ferramentas. Se voc j tem os arquivos de Processing Parameters e Workflow Designer criados, clique direito sobre o vial criado set raw data file, aparece caixa de dilogo. V em Database (D:) raw selecione arquivo desejado advanced, selecione specify template para ambos e escolha os arquivos de Processing e workflow designer desejados, clique OK ou Process. Caso no tenha os arquivos necessrios, passe para as etapas dos captulos 3 e 4.

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2.12. Depois de escolhidos os arquivos de processamento, clique sobre o da amostra e voc ver os arquivos incorporados. do vial

Dados no processados Processing parameters 2.13. Se voc no tiver clicado sobre Process no passo 2.11, para processar os dados, selecione a amostra, clique direito Process (no canto direito inferior da tela , inicia-se a contagem da porcentagem que falta para o trmino do processamento).

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2.14. Aps o trmino do processamento, aparece uma figurinha de espectro abaixo do arquivo de processing parameters. Para ver os dados processados, clique sobre o nome do workflow, clique direito e view workflow results.
Dados no processados esto anexados a este ndulo Dados processados esto anexados ao ndulo do espectro de massas

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2.15. Caso no obtenha resultados satisfatrios na identificao das protenas, aparecer a seguinte mensagem:

2.16. Talvez os parmetros de processamento usados foram muito rgidos, como por exemplo, no Workflow Designer Fragment tolerance estar com o valor de 0,1 Da. Tente criar outro Workflow Designer com o valor de 0,2 e reprocessar os dados. Aps criado, clique sobre o espectro processado, clique direito, attach workflow template. Selecione o arquivo criado na nova caixa de dilogo que aparece, clique OK.

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2.17. Aps anexar o novo arquivo de workflow, clique sobre o workflow adicionado, clique direito, Start workflow aparece caixa de dilogo com nome do workflow, d OK para comear o processamento, comea ento a contagem da porcentagem que falta para o trmino do processamento.

2.18. Para ver os dados processados, clique sobre o nome do novo workflow, clique direito e view workflow results.

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O View Workflow Results mostra dados de espectro de massas provenientes de busca em banco de dados, de anlises em Automod e sequenciamento De Novo. Pode vir de pesquisa individual ou combinada resultante de vrias amostras provenientes do fracionamento de uma amostra anterior (caso de amostras marcadas com iTRAQ que foram fracionadas no offgel ou em cartuchos SCX). 2.19. Se voc quiser ver os resultados em forma de tabela, visto que os mesmos no aparecem todos de uma vez na tela, clique direito sobre a linha onde mostra a protena identificada e clique esquerdo sobre Copy table data. Abra o excel ou openoffice (no computador do processador e em alguns computadores do CPqGM, este programa funciona como excel) e cole. Repita o procedimento com cada protena desejada. Depois copie do excel para o Paint e do Paint para o Word, colando especial como figura. Voc ter a tabela em escala. Clicando em View Maximize desktop ou clicando sobre a seta do lado esquerdo da tabela, voc ter uma viso mais ampla na tela.

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Tabela em escala, copiada do Paint:
OK 2 2 2 2 2 OK 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Accession Entry Description W (Da) pI (pH) PLGS ScoreProbability (%) m Peptides Coverage (%) Error MS Error Modified (%) Mean R Missed Cleavages (%) P00924 ENO1_YEAST Enolase 1 EC 446642 2 phosphoglycerate dehydr 2 1 11 6.1527 11.5553 100 10 28.6697 10.4776 11.5341 10 P30575 ENO1_CANAL Enolase 1 EC 447202 2 phosphoglycerate dehydr 0 2 1 11 5.4181 -0.1737 2 3.6364 13.5668 15.2821 P00925 ENO2_YEAST Enolase 2 EC 446754 2 phosphoglycerate dehydr 0 2 1 11 5.5865 -0.1778 6 16.9725 11.1044 12.6769 16.6667 P38516 RL4_THEMA0S ribosomal 26614 L4 5 protein 10.3649 -0.1778 0 1 4.2553 22.8743 22.8743 100 Q56148 CPT_STRVL Chloramphenicol 3 O phosphotransferase EC 2 7 10 18804 4.4484 -8.5398 1 12.9213 78.3477 78.3477 m/z Charge 708.8687 928.9723 643.8652 789.919 706.9222 404.2187 580.3132 878.4877 644.8633 378.7483 Peak mW Peptide mW Delta (Da) Delta (ppm) Ladder Score Likelihood Log Start 1415.722 1415.715 0.007324 5.173514 73.3333 227.5177 1855.929 1855.91 0.019043 10.26072 53.3333 65.8694 1285.715 1285.703 0.011841 9.209609 71.0145 152.1774 1577.822 1577.794 0.028687 18.18142 41.3793 30.4969 1411.829 1411.815 0.01416 10.02976 65.5172 121.4396 806.4218 806.4286 -0.00684 -8.47681 64.1026 87.828 1158.611 1158.603 0.007568 6.532314 80.7018 198.743 1754.96 1754.941 0.018311 10.43371 53.5354 131.7135 1287.711 1287.703 0.007568 5.877409 53.6232 91.8804 755.481 755.4654 0.015564 20.60182 57.5758 68.3536 End 15 32 67 88 105 178 185 312 346 409 Sequence Modifications Retention Query Tool Time (min) 27 (R)GNPTVEVELTTEK(G) 11.54 PLGS Databank Search 49 (R)SIVPSGASTGVHEALEMR(D) PLGS Databank Search Oxidation M (17) 11.99 78 (K)NVNDVIAPAFVK(A) 16.02 PLGS Databank Search 102 (K)AVDDFLISLDGTANK(S) 20.73 PLGS Databank Search 119 (K)LGANAILGVSLAASR(A) 18.73 PLGS Databank Search 184 (K)TFAEALR(I) 9.75 PLGS Databank Search 194 (R)IGSEVYHNLK(S) 7.62 PLGS Databank Search 328 (K)TAGIQIVADDLTVTNPK(R) PLGS Databank Search 17.92 357 (K)VNQIGTLSESIK(A) 12.47 PLGS Databank Search 414 (K)LNQLLR(I) 9.27 PLGS Databank Search

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Significado dos subttulos da tabela acima: O ladder score est baseado no nmero de ons b e y do peptdeo. Quanto mais ions consecutivos b e y, maior o score. ons y tambm contribuem para um maior score (acima de 66%) do que os ons b. Delta (DA) a diferena entre a massa terica de um fragmento e a massa observada. Tambm pode ser dada em ppm. PLGS Score = uma medida calculada pelo Protein Lynx Global Server (PLGS 2.2.5) software usando o algortmo de Monte Carlo para analisar todos os dados dos espectros de massas. uma medida estatstica de acurcia da identificao. Quanto maior o score maior ser a confidncia da identidade protica. Alguns autores s levam em considerao identificaes com PLGS score 9 (Zanini et al., 2008; Xu et al, 2008). Probability = indica, em porcentagem, qual a chance da identificao da protena ser verdade. Coverage = mostra a porcentagem correspondente do peptdeo (s) identificado (s) em relao sequncia total de peptdeos da protena.

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RMS = root mean square, uma medida usada para indicar as diferenas entre os valores previstos por um modelo e os valores observados. uma boa medida de preciso. Peptide = nmero de peptdeos identificados na sequncia da protena. Mean error: mdia do erro Significado das cores nos espectros de MS e MS/MS: Color Red Blue Green Meaning y-series ion b-series ion All other ion types

Color Gray Blue Red Green Yellow

Meaning The peak is not matched to a peptide from the current protein or EST. A standard peptide (that is, with no modifications or missed cleavage sites). A peptide that contains one or more missed cleavage sites. A modified peptide, neutral loss (a or z ion), or immonium ion. A peptide that contains post-translational modifications and missed cleavage sites.

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2.20. Na mesma janela do tem 2.19, se voc seleciona a protena de interesse e clica sobre Protein workpad, aparece um quadro contendo a sequncia de aminocidos da protena e os peptdeos identificados marcados com cores diferentes conforme a massa com a qual foram detectados pelo espectrmetro:

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2.21. Se voc quer dar um zoom em alguma rea do espectro, clique com o direito duas vezes sobre o pico. Aparece um quadradinho vermelho sobre o pico selecionado e uma janela extra com o espectro. Para acertar/mudar a posio desejada, s clicar direito e arrastar o quadradinho vermelho e a janela do espectro se atualiza automaticamente.

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2.22. Se voc quiser ver os espectros sem processamento raw", clique sobre o espectro desejado , clique direito View spectrum, aparece janela ao lado contendo

todos os espectros obtidos para os respectivos precursores, clique sobre um deles para visualizar qual o seu tempo de reteno no espectro geral (parte de cima, marcado com tringulo vermelho). Se o precursor tiver gerado fragmentos, o espectro contendo os fragmentos aparece automaticamente abaixo. Para observar uma determinada rea, clique direito e arraste. Para retornar o espectro original, clique 2 vezes com o boto esquerdo do mouse.

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Manual para o processamento de dados com o PLGS, Abr/2011 3.Criando programa de processamento (Processing Parameters) no PLGS para amostras com marcadores isotpicos/isobricos
Para se adquirir MS/MS de compostos desconhecidos, o Micromass Q-Tof micro tem um poderoso software de sistema de controle capaz de permitir o instrumento de realizar Data Depedent Analysis (DDA), trocando-se do modo MS para o modo MS/MS e retornando ao modo MS usando-se critrios dependentes dos dados. A vantagem deste mtodo que ele remove a necessidade de se analisar a amostra primeiramente no modo MS, o qual identifica os ons precursores alvos, para depois correr a amostra novamente no modo MS/MS, o qual realiza a fragmentao dos precursores escolhidos. Os dados de MS e MS/MS so adquiridos subsequentemente na mesma anlise, podendo-se escolher vrios canais para se realizar a fragmentao de mltiplos precursores. Esta ferramenta particularmente importante na anlise de amostras desconhecidas usando-se cromatografia on-line, onde os ons precursores alvos e seus respectivos tempos de reteno podem ser ligeiramente diferentes para cada corrida da respectiva amostra. O programa de processamento ProteinLynx Global Server engloba dois projetos para se analisar os dados: Processing Parameters e Workflow Designer. O Processing Parameters determina como os dados provenientes tanto dos espectros de MS quanto dos espectros de MS/MS no tratados sero processados. Os atributos que devem ser considerados determinam a acurcia da massa, reduo de rudo e deisotoping/centroid dos dados. O Workflow Designer possibilita a determinao de parmetros para se realizar uma busca automatizada no banco de dados de amostras. A busca (fragment ion search) realizada comparando-se os fragmentos inicos obtidos da amostra com aqueles listados no banco de dados, identificando-se os peptdeos baseando-se no padro de fragmentao e, subsequentemente, as protenas.

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3.1.Clique sobre o cone Data Preparation para escolher como os espectros foram adquiridos no espectrmetro. A princpio nada aparece na tela ao lado. Clique sobre o cone para criar novos projetos na barra de ferramentas e aparecero vrias para

opes. No nosso caso vamos selecionar Electrospray DDA. Clique em confirmar.

3.2. Aparece ento a janela do Processing parameters, a qual j vem com um ttulo automtico. Voc pode mud-lo digitando no espao selecionado.

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3.3.Na pasta de Mass Accuracy, clique sobre Electrospray Survey para ativar a janela dos seus parmetros. Clique sobre Perform LockSpray Calibration, aparecer um quadradinho pra confirmar a seleo na parte debaixo do quadro dos parmetros. Depois, clique sobre LockSpray lock mass, digite no espao abaixo o valor de m/z terico do padro usado, no nosso caso o GFP (Glu-fibrinopeptide), que 785,8426. O valor de Lockspray scans pode variar de 5 a 10 (o mais usado 10; o nmero consecutivo de espectros do lockspray que sero somados para se determinar a correo de massa para cada precursor). O valor de Lockmass tolerance vai depender da carga do on do padro. No nosso caso, o GFP tem carga +2. Logo, a diferena entre os isotoplogos 0.5; se fixamos uma tolerncia de 0.3, descartamos a possibilidade de deteco dos isotoplogos, assim como eliminamos a chance de ocorrncia de mltiplas identificaes, por isto no necessrio validar manualmente as sequncias identificadas. No mude nada em MSMS.

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3.4. Na pasta de Noise Reduction, clique sobre Electrospray Survey, selecione background subtract type adaptative. Mantenha os outros parmetros como especificados no quadro abaixo. Ao clicar sobre MSMS, no background subtract type digite none, isto porque a relao rudo/sinal j muito pequena neste tipo de espectro, e se pedirmos para diminuir, podemos perder sinal de amostra. Mantenha o restante dos parmetros como est.

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3.5.Na pasta de Deisotoping and Centroiding, para ambos experimentos selecione Perform deisotoping yes e mantenha os outros valores que aparecem conforme quadro abaixo. Clique no cone save da barra de ferramentas, visto que no passo 3.2 voc j nomeou o programa. Caso voc queira criar um novo programa a partir de um existente, v em File open file, escolha um dos arquivos, mude conforme desejado, inclusive o nome inicial e depois save. Os arquivos so salvos em (System (C:) PLGS 2.4 doc Processing parameters na extenso *.xml. Caso queira reduzir o nmero de ons relatados ou melhorar sensibilidade, em vez de colocar yes para automatic thresholds, tente modificar os parmetros abaixo relatados (ver p. 8-6 a 8-14 manual PLGS para entender o que cada parmetro significa).

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Manual para o processamento de dados com o PLGS, Abr/2011 4.Criando programa para a comparao em banco de dados (Workflow Designer) no PLGS para amostras com marcadores isotpicos/isobricos
4.1.Clique sobre o cone Workflow Designer File New, aparecem opes para voc selecionar que anlise voc quer realizar. Clique sobre Fragment ion search, confirme .

4.2. Aps confirmado, aparece caixa de dilogo do Fragment ion search, nomeie o arquivo (title) do seu workflow, clique direito sobre workflow add databank search.

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4.3. Aparece janela do Databank search query contendo os atributos que voc dever usar na sua anlise. Search engine type sempre PLGS; clique sobre Databanks no quadro que aparece esquerda e selecione, na lista que aparece abaixo do quadro, o banco de dados com o qual voc quer trabalhar. Clique sobre cada atributo e mude conforme o seu experimento.

Fragment tolerance: a diferena mxima permitida entre a massa do fragmento observada e a massa do fragmento terico ao qual a primeira ser comparada. Quanto menor este valor, mais acurada ser a identificao. Geralmente o valor varia de 0,1 a 0,3. Para uma mistura de protenas padro usamos 0,1 e para amostras desconhecidas, usamos 0,2 se no quisermos restringir muito as identificaes.

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Fixed modifications: neste parmetro devem estar contidas as modificaes qumicas s quais o peptdeo pode ser submetido em decorrncia das reaes ocorridas durante o preparo da amostra (leia no prximo pargrafo). Para inserir mais de uma modificao, mantenha a tecla CTRL pressionada enquanto seleciona as modificaes desejadas. Para apagar, s clicar em cima de outra modificao. Variable modifications: Neste parmetro voc deve incluir reaes provveis de ocorrer que no esto ligadas ao processamento. Por exemplo, vrios aminocidos podem sofrer oxidao nas suas cadeias laterais, porm aqueles que contm enxofre so os mais susceptveis a esta modificao. A oxidao de resduos de metionina (M) nas cadeias laterais um processo fisiolgico relevante e pode constituir um mecanismo de regulao protica. Tem sido sugerido que a extenso da oxidao de metionina celular tem sido subestimada, visto que a maior parte das anlises de peptdeos no esto habilitadas para a deteco do sulfxido de metionina (Hoshi e Heinemann, 2001). Por este motivo, importante adicionar oxidation M como variable modifications (ver Esquema 4). Validate results: o software valida o resultado de busca identificando 3 ou mais fragmentos inicos da mesma srie peptdica. Entre as etapas realizadas para se preparar a amostra protica, a primeira delas consiste em desnaturar a protena, que significa desorganizar os arranjos espaciais das estruturas secundrias e tercirias para aumentar a solubilidade. Este fenmeno pode ocorrer atravs do rompimento, por exemplo, de interaes no covalentes fracas como as ligaes de hidrognio, Van-der-Waals e dipolo-dipolo entre os aminocidos das cadeias laterais. As conformaes do tipo alfa-hlice e beta-plissada so perdidas nesta etapa e a protena passar a adotar uma conformao em espiral aleatria. Vrios agentes so usados com este propsito como, por exemplo, detergentes como o SDS (sdio dodecil sulfato), o aumento de temperatura, a variao de pH, uria/tiouria ou desidratantes como a acetonitrila (ver Esquema 2; Friedli, 1996). A uria, quando em soluo, se encontra em equilbrio com o cianato de amnia. O aquecimento prolongado a temperaturas acima de 37C acelera a proporo de
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cianato, que pode ser hidrolizado originando o cido isocinico. Este reage com grupos nucleoflicos, como o grupo amino terminal das protenas, bloqueando-se assim o sequenciamento N-terminal da protena (ver Esquema 1). Este cido tambm ataca as cadeias laterais de lisina (K) e arginina (R), formando compostos imprprios digesto enzimtica e reao de marcao com isbaros. Mesmo que a carbamilao no impea a digesto, os peptdeos modificados apresentaro tempos de reteno e massas diferentes dos originais, podendo causar erros de identificao se a modificao no estiver prevista na programao (McCarthy et al. 2003; ver reao no Esquema 4). Sendo assim, a carbamilao uma reao secundria que pode ocorrer devido ao aquecimento da soluo contendo protenas juntamente com uria, formando um carbamyl N-term, que deve ser adicionado como fixed modifications.

Esquema 1. Degradao da uria. A) degradao causada por aquecimento prolongado a


temperaturas acima de 37oC; B) ataque do cido isocinico aos grupos reativos das protenas (McCarthy et al., 2003).

Em seguida, realiza-se o rompimento de interaes covalentes, como por exemplo, as ligaes dissulfeto existentes entre os resduos de cistena presentes nas cadeias laterais dos peptdeos. Essas ligaes so responsveis por estabilizar a protena mantendo-a enrolada e hidrofbica. A destruio destas ligaes torna a
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protena mais solvel e susceptvel ao ataque da enzima digestiva. Reagentes redutores como o DTT (ditiotreitol) e TCEP (tris(2-carboxietil)fosfina) so os mais utilizados. Para se evitar que as ligaes dissulfeto se formem novamente, necessrio que se bloquei o grupo sulfeto com um agente alquilante, como o MMTS (metanometiltiossulfonato) ou a IAA (iodoacetamida). Desta forma, a protena estar apta a sofrer quebra enzimtica, resultando pedaos menores, os peptdeos (Friedli, 1996; ver Esquema 2). Assim, a alquilao da cistena tambm pode gerar peptdeos modificados dependendo do reagente alquilante. Sabe-se que o MMTS produz menos reaes secundrias do que a IAA, visto que sua especififcidade maior. No entanto, o MMTS tende a ser menos eficiente do que a IAA, resultando um nmero maior de cistenas no modificadas e, por isto, mais susceptveis formao de ligaes dissulfeto (Stanley, 2011). Os produtos secundrios mais comuns resultantes da reao com MMTS, IAA e cido iodoactico se encontram demonstrados no Esquema 4. Aps a digesto, os peptdeos resultantes de cada amostra podem ser marcados atravs de uma reao do tipo substituio nucleoflica entre a poro carbonila do grupo peptdico reativo do reagente isobrico iTRAQ e um grupo amino primrio do peptdeo a ser marcado, podendo ser o grupo N-terminal do peptdeo e/ou o grupo -amino da lisina (K) ou N-term tirosina (Y) que se encontram na cadeia lateral do peptdeo. As amostras so ento reunidas e a mistura submetida anlise de LCMS/MS. Logo, a marcao isobrica produz peptdeos modificados (ver Esquema 3).

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Esquema 2. Reaes a que so submetidas as protenas de uma amostra at a marcao


isobrica.

A formao dos produtos secundrios deve ser informada na programao do PLGS como fixed modifications, pois o software calcula a adio da massa correspondente a cada modificao e subtrai a mesma para se identificar o peptdeo em questo em comparao com o banco de dados. Numa anlise, por exemplo, cuja a amostra protica entrou em contato com uria, reagente iTRAQ e MMTS so

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adicionados como fixed modifications o carbamyl N-term, isobaric 8-plex (massa do fragmento)N-term, isobaric 8-plex (massa do fragmento)KY e methylthio C.
O HO NH2 N (CH2)4 NH2
+

O O N O N O reagente iTRAQ N N O O NH Lys

O N O

-amino group Lys (K) da cadeia lateral de um peptdeo N O N O O NH2 N O O N O N N OH N-terminus Tyr (Y) da cadeia lateral de um peptdeo HO O NH O N O NH NH2 OH OH

OH

Esquema 3. Reaes que podem ocorrer durante a marcao isobrica usando-se reagentes
iTRAQ.

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A HO O O NH2 (CH2)4 NH2 Lys (K)
+

cido isocinico HO HN C O

NH2 (CH2)4 NH C

NH2 carbamyl N-terminus (CONH = 43.00581)

B HS CH2 OH NH2 O Cys (C) MMTS


+

O MeS S Me O Cys S S Me methylthio C (side - chain) (SCH2 = 45.9877)

O C HO NH2 O Cys (C) HS CH2


+

O NH2 I iodoacetamida HO

HS CH2

NH2

NH2 O S- carbamidomethyl C (CH2CONH = 57.02146) O

D HS CH2 HO NH2 O Cys (C)


+

O OH I cido iodoactico HO

HS CH2

OH

NH2 O S -carboxymethyl C

E HO

O NH2 [O] (CH2)2 S CH3 Met (M) HO

O NH2 HO (CH2)2 O S CH3 methylsulfoxide (O = 15.99491) in presence of mild oxidants

O NH2 (CH2)2 O S O CH3 methionine sulfone in presence of strong oxidants

Esquema 4. Reaes de carbamilao (A), alquilao (B, C, D) e oxidao (E) que podem
ocorrer durante preparo da amostra protica.

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Manual para o processamento de dados com o PLGS, Abr/2011 5.Criando/Adicionando modificaes fixas ou variveis
Como vimos no captulo anterior, a incluso das modificaes qumicas muito importante para que voc no perca a identificao das protenas de sua amostra. O programa j contm uma srie de modificaes previstas, mas dependendo do seu protocolo de preparao de amostra, talvez voc precise incluir alguma nova modificao. o caso quando voc realiza reao de alquilao com MMTS e forma methylthio C. Esta modificao tem que ser includa, pois no existe na lista. 5.1.No PLGS, em Tools, clique direito no cone Modifier tool. Clique New na barra de ferramentas. A mesma ao se d quando voc quer editar uma modificao que voc criou. Para ambas as aes, so gerados um painel e uma caixa de texto, de modo que voc pode definir ou editar os valores para cada atributo. Obs: somente modificadores criados pelo usurio podem ser editados.

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5.2.Para definir cada atributo, clique direito sobre cada um e, no retngulo abaixo que se torna ativo, defina os valores. Por exemplo, quando voc alquila a cistena com MMTS, os atributos so: Name: methylthio C (o produto que se forma na reao) Modifier type: side chain (a reao ocorre nos resduos de cistena presentes na cadeia lateral do peptdeo) Delta Mass (Da): 45.9877 ( a massa adicional que incorporada ao peptdeo devido ao grupo SCH2 (ver reao do esquema 4). Para calcular a massa exata, voc pode ir no site www.sisweb.com/referenc/tools/exactmass.htm

Applies to: C (letra que simboliza o aminocido cistena) 5.3.Para salvar, clique sobre o disquete da barra de ferramentas. O novo modificador pode ser visto no final da lista de Amino acid modifier reagents em letras pretas. 5.4.Para deletar, clique sobre o modificador criado na lista file delete, ou sobre o cone delete da barra de ferramentas.

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Manual para o processamento de dados com o PLGS, Abr/2011 6.Usando o Expression Analysis para comparar e analisar os grupos de amostras com marcadores isobricos (iTRAQ)
O Expression Analysis identifica e extrai pares de massas marcadas, computa suas abundncias relativas e indica quando elas esto hipo ou superexpressas. 6.1.Abra o projeto que voc quer trabalhar. 6.2.Na janela do Project manager do seu experimento com iTRAQ, selecione Expression Analysis, clique direito e Add Expression Analysis. Aparece na janela ao lado o Expression analysis design manager, e o primeiro tem Experiment attributes. Nesta aba, nomeie o experimento e, se desejar, faa uma descrio. Clique Apply (para ver esta opo, clique direito com o mouse sobre a barra do Expression analysis design manager e arraste-a, pois a opo se encontra no canto direito da aba ou clique sobre a seta para expand-la). Aps feito isto, automaticamente o nome da amostra se torna ativo e tambm o prximo passo (a aba de cor cinza se torna rosa).

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6.3.No passo 2, Selecting Grouping Method, selecione Use isotope labeled-sample e, automaticamente, o Place sample into separate groups ativado. Esta janela tambm pode ser aberta quando se clica direito em Open Expression analysis a janela do Expression Analysis Design Manager se abre para que voc possa checar ou seguir os passos consecutivos da anlise. Para ver ou esconder cada passo, clique nas setas direita.

O Select grouping method para especificar como as amostras sero desagrupadas e comparadas umas com as outras. Se voc est usando amostras com marcadores, quando voc selecionar Use isotope-labeled sample, somente aparecero na lista as processed samples contidas no project manager. O place samples into separate groups s estar ativo se mais de uma amostra estiver contida na amostra processada selecionada. Clique Select All para incluir todas as amostras, ou pressione CTRL ou SHIFT para incluir somente as amostras que voc quer comparar. Clique Apply.
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6.4.Automaticamente o programa vai para o passo 5, Select Data, o qual mostra os dados processados associados com as amostras identificadas na sesso anterior. A primeira tabela (group) contm uma linha para cada grupo e a segunda tabela contm uma linha para cada replicata associada com a amostra selecionada. Para incluir uma determinada replicata no experimento, selecione na caixa do include (desmarque se no quiser). Pelo menos uma replicata precisa ser includa para cada grupo.

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6.5.Voc usa o Assess Data Quality (passo 6) para verificar se seus dados tm qualidade suficiente para serem usados numa quantificao. Ele contm uma linha para cada isbaro usado para marcar as amostras. Clicando sobre cada cone do Data Views, obtm-se um grfico diferente.

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6.6.Quando voc termina de preencher o Select data e clica apply, o passo 7, Quantitation Analysis, se torna ativo, onde aparecem duas tabelas. A primeira contendo os tempos de reteno (RT), chamada de EMRT Table (Exact Mass Retention Time dos peptdeos). A segunda a tabela de protenas, contendo os resultados de identificao obtidos, sobre as quais sero calculadas as quantificaes. Quando voc seleciona uma delas ou as duas, as tabelas se tornam ativas (de cinza se tornam pretas). Dependendo do seu experimento, tambm aparecer a opo para o tipo de mtodo de normalizao a ser empregado na anlise. Clique apply para que o boto PROCESS se torne ativo. Clique-o para dar incio ao processamento da anlise de quantificao.

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6.7.Dependendo dos dados selecionados, esta anlise pode levar um tempo considervel. At que o processamento seja completado, algumas opes no se encontraro disponveis. Voc pode monitorar o progresso do processamento na parte inferior da janela, canto direito do navegador do ProteinLynx (onde inicialmente est escrito no jobs). Quando o processamento terminar, aparecer automaticamente um quadro contendo os resultados da quantificao relativa.

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6.8.Se por acaso voc fechar a janela anterior e depois quiser observar os resultados novamente, em Project manager clique 2X sobre a Expression Analysis desejada (ou clique direito e escolha Expand all) e aparecer as anlises que foram executadas e esto disponveis. Clique sobre EMRT cluster data ou protein table, e ento clique direito view expression table. A tabela dos resultados aparecer.

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Manual para o processamento de dados com o PLGS, Abr/2011 7.Observando/interpretando expresso


No quadro onde aparece o resultado (passo 5.7), voc pode mudar as colunas de lugar, s clicar sobre uma delas e arrastar para o local desejado. Tambm pode mudar a ordem das informaes nas linhas dentro da coluna, clicando sobre o ttulo da mesma. O resultado apresentado do seguinte modo (ltima coluna): Ex. 2.94 (1.08 +- 0.33) [1.00] probabilidade de upregulation

os

resultados

da

anlise

de

desvio padro Razo entre as amostras O texto fica verde se a probabilidade de upregulation 0.95 (1 significa upregulated). O texto fica vermelho se a probabilidade de downregulation 0.05 (0 significa downregulated). Se um cluster (protena) apareceu apenas numa das amostras (grupo), mas em todas as injees daquele grupo, o nome da amostra demonstrado na coluna UNIQUE.

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7.1.Somente quando ocorre identificao possvel acessar o cone que organiza os dados (curate data), e permite mostrar todos os clusters, ou s aqueles marcados com OK ou unsure. Para isto, clique sobre o cluster marque aquele que voc deseja demonstrar (include) e depois clique curate data (cone na parte inferior do quadro de resultados), aparecer a janela com os dados somente daquele cluster. Para controlar quais clusters sero demonstrados, clique no boto (barra de ferramentas

inferior direita) para selecionar se quer mostrar todas as protenas ou s as yes ou maybe protenas.

Curate data

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7.2.Se voc fez anlise usando mais de um workflow designer, pode selecionar qual resultado quer ver clicando sobre (import workflow), aparecer uma janela para

voc escolher e depois clique OK. Automaticamente aparecer o novo resultado.

Se voc quiser exportar os resultados para uma tabela, visto que a janela do programa no permite copiar toda a imagem com os resultados de uma s vez, clique no cone Export data , abre-se uma caixa de dilogo onde voc seleciona as

informaes que voc quer exportar, d OK. Aparece caixa para voc escolher destino do arquivo. Escolha system (C:) openoffice.org 3.2 (ou excel) nomeie arquivo (*.txt). Se voc acha que seus resultados esto extensos demais e necessitam alguns filtros, clique em filter data , v no manual do ProteinLynx e verifique p. 10-

12 a 10-14). Para saber detalhes de outros cones, v no mesmo manual captulo 10. Para replicatas de iTRAQ (10-19).

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Observao: MS/MS scoring (fragment ion searches) The scoring scheme implemented for MS/MS searches addresses the question: What is the probability that a protein is in the mixture of proteins that constitutes the sample? For this reason more than one hit can be reported as having maximum (or near maximum) probability of being correct. The data consists of a set of (mass, intensity) pairs (and their associated uncertainties) representing the monoisotopic mass and intensity of every peak in the processed data.

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For each precursor ion, a set of peptide sequences is constructed by synthetic

digestion of the protein sequences in the database, which match within the user-defined peptide tolerance of the precursor mass.
For each peptide sequence, the probability of fragment spectrum GIVEN

peptide sequence is calculated. The natural log of this is the peptide score. From these probabilities a list is compiled of the most likely combinations of proteins that could have given rise to the data. For example, if we have three proteins, there are eight possible combinations. The probability of the whole data set is then calculated given each of these combinations and the probability for a particular protein is accumulated whenever it appears in a combination. We assume that the prior probability of each combination is related to the number of proteins in it and use Bayes theorem to calculate the probability of protein present in mixture GIVEN data set. The results are normalized to reflect the number of protein sequences considered in the search. Therefore: Probability of A in mixture given dataset = (sum over probabilities of combinations containing A) / (sum over probabilities of all combinations) Only the highest scoring peptide match is reported for each submitted precursor ion and its associated fragmentation data. Where more than one peptide matches the data equally well (for example, if two peptide matches differ only by one or more isobaric residues), all are reported. To determine whether a hit is real, always look to the top-scoring protein. Look at the spread of scores: if the scores are grouped together, they have the same share of the available probability. In practice, given the variable quality of data, the difference between the top score and the next highest score is usually a good indicator of the correctness of the highest-scoring protein. A difference of five (factor of ~ 150) is normally sufficient to indicate that the top-scoring protein is correct. Alternatively, a proportion of the available probability can be assumed to be significant, for example, 95%.

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For a database with 100,000 entries, the maximum score would be 11.51 and the corresponding 95% significance threshold would be 11.46 [ln(100,000) + ln(0.95)]. A difficulty can arise with the above criteria when a collection of largely homologous proteins get the top scores. The available probability is then shared among them. For example, if the database of 100,000 entries contained two identical sequences that matched the data more closely than any other candidate sequences, the highest scores would approach 10.81 [that is, ln(100,000) + ln(0.5)]. In this case, the ProteinLynx browser would present the proteins as a collapsed hit, but in other cases it might not be so easy to judge the effective equivalence of the top-scoring matches.

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Manual para o processamento de dados com o PLGS, Abr/2011 8.Organizando os bancos de dados
8.1.Primeiramente, faa o download do novo banco e grave no System (C:)/database(D:)/Databanks, criando a devida pasta para o mesmo. 8.2.Clique no cone databank admin tool (na barra ferramentas lateral esquerda do PLGS). 8.3. Uma search engine (no nosso caso sempre PLGS) precisa ser especificada para que as opes se tornem ativas. 8.4. Depois, para adicionar o novo banco de dados, clique em na barra de

ferramentas, ou clique databanks clique direito new databank. O painel do editor do banco de dados aparece.

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8.5.Preencha ou troque os atributos clicando sobre cada um deles, e ento edite os valores (value). Clique sobre o Name e nomeie o banco de dados. Clique sobre Location, aparece local abaixo do quadro dos atributos para voc procurar e adicionar o diretrio no qual se localiza o banco. Depois de ajustar todos os atributos, clique save na barra de ferramentas . Aparecer uma mensagem dizendo Saved.... Clique OK.

O novo databank aparecer na rvore do navegador depois de um certo tempo. Se o arquivo grande, o processamento pode levar alguns segundos, para s depois ficar disponvel para o uso e tambm aparecer seu nome no campo do Databank admin tool. Para garantir que voc est vendo o status mais atual do banco de dados via Databank admin tool, clique na barra de ferramentas.

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Significado dos atributos: Type se refere ao tipo de banco de dados que voc vai comparar. Ex: EST, Protein. O formato FASTA consiste de uma linha de descrio que comea com o smbolo , seguido por mltiplas linhas contendo sequncia de letras referentes a aminocidos ou nucleotdeos. Dentro deste formato geral, so usados diferentes subformatos. Se o formato FASTA especificado como uma opo de banco de dado, voc deve especificar o subformato FASTA correlacionado a ele. Para ver os diferentes subformatos, v no help do PLGS, clique no boto search, digite data bank format, clique na opo FASTA flat file format. Por exemplo, o subformato do

UniprotKB/Swissprot standard_spaced. Location o diretrio onde est gravado o banco de dados. Geralmente estaro gravados no D:/databanks/ Load into memory aumenta a velocidade na qual o banco de dados consultado, porm necessrio verificar se h memria RAM suficiente. Quando o banco muito grande e no est carregado na memria, a consulta pode falhar. Species for indexing usado quando voc quer usar o banco de dados restritamente para uma ou mais espcies. Cada espcie para o qual o banco de dados foi indexado aparecer na lista de espcies do Databank search tool. Clique sobre o atributo, v na lista que aparece abaixo do quadro. Para selecionar mais de uma espcie, aperte e segure CTRL enquanto estiver clicando sobre as espcies desejadas. Management options usado (para isto, digite TRUE) quando se deseja usar downloads e updates automticos. Periodically update uma boa opo quando voc j que deixar a atualizao do banco de dados programada automaticamente, porm voc deve sempre conferir qual foi a edio do banco usada para uma determinada identificao. Caso o banco esteja sendo atualizado muitas vezes, voc pode no ter repetibilidade nas suas anlises.

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BLAST (sigla em ingls que significa: Basic Local Alignment Search Tool), um algoritmo para comparar informaes de sequncias biolgicas primrias, tais como seqncias de aminocidos de diferentes protenas ou nucleotdeos de seqncias de DNA. Uma pesquisa BLAST permite que um investigador compare uma seqncia fornecida em uma consulta com uma biblioteca ou base de dados de seqncias e identificar as bibliotecas de seqncias que se assemelham seqncia consultada e que estejam acima de um certo grau de semelhana. Os principais programas utilizados, geralmente, so os softwares desenvolvidos exclusivamente para esta funo. Eles so elaborados na plataforma Unix ou Linux, que tm uma interface menos "amigvel", ou seja, so mais difceis de serem operados em relao aos programas convencionais, mas possibilitam uma maior capacidade de interveno do pesquisador para atender a suas exigncias. dbEST (Nature Genetics 4:332-3;1993)( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/) is a division of GenBank that contains sequence data and other information on "single-pass" cDNA sequences, or "Expressed Sequence Tags", from a number of organisms. A brief account of the history of human ESTs in GenBank is available (Trends Biochem. Sci. 20:295-6;1995). Also, consult the special "Genome Directory" issue of Nature (vol. 377, issue 6547S, 28 September 1995). The mission of UniProt is to provide the scientific community with a comprehensive, high quality and freely accessible resource of protein sequence and functional information. UniProt is comprised of four components, each optimised for different uses. The UniProt Knowledgebase (UniProtKB) is the central access point for extensive curated protein information, including function, classification, and cross-reference. It consists of two sections: UniProtKB/Swiss-Prot which is manually annotated and is reviewed and UniProtKB/TrEMBL which is automatically annotated and is not reviewed. The UniProt Reference Clusters (UniRef) databases provide clustered sets of sequences from the UniProtKB and selected UniProt Archive records to obtain complete coverage of sequence space at several resolutions while hiding redundant sequences. The UniProt Archive (UniParc) is a comprehensive repository, used to keep track of sequences and their identifiers.
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Manual para o processamento de dados com o PLGS, Abr/2011 9.Referncias


Friedli G-L. (1996). http://www.friedli.com/herbs/phytochem/proteins.html#denaturation Hoshi T, Heinemann SH. 2001. Regulation of cell function by methionine oxidation and reduction. Journal of Physiology 531.1: 1-11.

McCarthy J, Hopwood F, Oxley D, Laver M, Castagna A, Righetti PG, Williams K, Herbert B. 2003. Carbamylation of Proteins in 2-D Electrophoresis Myth or Reality? Journal of Proteome Research 2: 239-242. Stanley BA. 2011. iTRAQ sample preparation protocol. http://www.hmc.psu.edu/core/proteins_massspec/massspec/iTRAQ%20Protocol.htm

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