HIBRIDIZAO DE CIDOS NUCLICOS

Genmica II Graduao em Biotecnologia

SOUTHERN BLOTTING
O Southern blot um mtodo da biologia molecular que serve para verificar se uma determinada seqncia de DNA est ou no presente em uma amostra de DNA analisada
O mtodo foi batizado com o nome de seu inventor, o bilogo britnico Edwin Southern

SOUTHERN BLOTTING - Etapas

Extrao do DNA Digesto do DNA Preparo da Sonda Transferncia Hibridizao Deteco

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1. Extrao do DNA

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1. Extrao do DNA

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2- Digesto do DNA
EcoR I

Hind III

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2- Digesto do DNA/Eletroforese

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3- Transferncia

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Desnaturao O gel onde foi feita a eletroforese de DNA tratado com uma soluo alcalina (tipicamente contendo hidrxido de sdio) para promover a desnaturao da dupla fita do DNA, separando-a em simples fitas. A desnaturao necessria porque o DNA nas etapas seguintes ir aderir membrana e ir parear com a sonda.

Transferncia do DNA para uma membrana Uma membrana de nitrocelulose (ou, alternativamente, nylon) posta sobre o gel. Uma presso aplicada uniformemente sobre o gel (tanto usando-se suco, ou pondo-se sobre a membrana uma pilha de toalhas de papel com um peso em cima). Isso faz com que o DNA passe do gel para a membrana, onde ele se adere.

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3- Transferncia

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4- Hibridizao
Marcao da Sonda de DNA
Radioativa: 32P No radioativa: peroxidase, fosfatase alcalina

Desnaturao DNA

DNA fita simples

+ peroxidase complexada com polimero positivo

Ligao Fraca (DNA+ Peroxidase)

+ glutaraldedo

Sondas Covalentemente marcada com a enzima

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4- Hibridizao

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4- Hibridizao

GENMICA II
5- Deteco

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SOUTHERN BLOTTING - Etapas

NORTHERNNORTHERN BLOT - Etapas BLOTTING

1. Extrao do RNA 4. Gerao de uma sonda marcada
dATP dTTP dGTP dCTP pGEM-T

2. Eletroforese do RNA
5. Hibridizao

6. Visualizao

3. Transferncia para a menbrana

GENMICA II

http://www.icb.ufmg.br/big/genmed/southblot.html