2 1 TTULO Mtodo Biureto para determinao de protenas.

2 OBJETIVO Determinar quantidade de protenas de uma amostra utilizando o Mtodo Biureto.

3 RESUMO

Transferiu-se a amostra para um erlenmeyer contendo NaOH 0,5N. Aqueceu-se em banho-maria at solubilizao total das protenas. Resfriou-se, diluiu-se e retirou-se uma alquota, transferindo para um tubo de centrfuga. Adicionou-se ter etlico anidro. Deixou-se em repouso para separar as fases, retirou-se a fase aquosa inferior. Retirou-se duas alquotas e transferiu-as para tubos de ensaio. Adicionou-se gua destilada em um terceiro tubo, identificando-o como branco do reagente. Adicionou-se Reagente de Biureto em cada tubo e deixando reagir por 30 min Tamb. Utilizou-se as diluies feitas a partir da soluo de casena concentrada, identificando-as por P1, P2, P3 e P4. Utilizou-se o espectrofotmetro para fazer as leituras das solues padro.

4 INTRODUO

4.1 O mtodo de Biureto Princpio O mtodo se baseia na reao do reativo do biureto, que constitudo de uma mistura de cobre e hidrxido de sdio com um complexante que estabiliza o cobre

3 em soluo, sendo o tartarato de sdio. O cobre, em meio alcalino, reage com protenas formando um complexo quadrado planar com a ligao peptdica. O produto de reao apresenta duas bandas de absoro, uma em 270 nm e outra em 540 nm. Apesar da banda na regio de 270 nm aumentar em seis vezes a sensibilidade do mtodo do biureto14, a banda na regio de 540 nm a mais utilizada para fins analticos, porque diversas substncias, normalmente presentes na maioria dos meios analisados, absorvem na regio de 270 nm causando muita interferncia no mtodo.

Aplicaes

O mtodo de biureto tem sido aplicado para determinar concentrao de protenas totais em diversos meios, sendo eles: soro ou plasma sangneo, lquido crebro espinhal, urina, alimentos, saliva, fibrinognio e tecido animal. O mtodo de biureto tem sido, tambm, utilizado em anlise por injeo em fluxo, assim como em alguns mtodos cinticos. Apesar de ser rpido, utilizar reagentes de baixo custo e no apresentar grande variao da absortividade especfica para diferentes protenas, este mtodo no muito sensvel, como foi destacado por diversos autores, colocando-o em grande desvantagem, em relao a outras metodologias, e por isto tem sido, ao longo dos anos, substitudo por mtodos mais sensveis. Mesmo assim, o mtodo de biureto continua sendo recomendado para a determinao da concentrao de protenas totais em plasma sangneo pela Associao Americana de Anlises Clnicas e por diversos autores, bem como para a determinao de protenas totais em saliva e leite, quando comparado com outros mtodos.

5 MATERIAIS E MTODOS 5.1 Materiais Utilizados Espectrofotmetro; Cubetas e suporte;

4 Balana analtica; Banho-maria; Piceta; Erlenmeyer de 50 mL; Pipetas graduadas de 5 e 1 mL; Balo volumtrico de 50 mL; Tubos de ensaio; Funil; Centrfuga.

5.2 Reagentes Utilizados NaOH 0,5N ter Sulfrico anidro Reagente de Biureto Solues padro de casena

5.3 Esquema da aparelhagem

Figura 1 Espectrofotmetro

Figura 2 Cubetas e suporte

Figura 3 Balana analtica

Figura 4 Banho-maria

Figura 5 Pisseta

Figura 6 Erlenmeyer

Figura 7 Pipeta

Figura 8 Balo volumtrico

Figura 9 Tubos de ensaio

Figura 10 - Funil

Figura 11 Centrfuga

5.4 Procedimento Experimental

Preparao da amostra Pesou-se aproximadamente 1,0g de amostra. Transferiu-se

quantitativamente para um erlenmeyer de 50 mL contendo 20 mL de NaOH 0,5N. Dispersaram-se bem os slidos e aqueceu-se em banho-maria fervente durante 5 minutos. Resfriou-se em gua corrente e diluiu-se para 100 mL, em balo volumtrico, em seguida retirou-se uma alquota de 6 mL e transferiu-a para um tubo de centrfuga de 40 mL. Adicionou-se 6 mL de ter etlico anidro, tampou-o e agitou-o, evitando vazamentos. Deixou-o em repouso por alguns instantes.

Preparao da soluo para anlise

Retirou-se duas alquotas de 1,0 mL da amostra e transferiu-a para tubos de ensaio identificados como X1 e X2. Em um terceiro tubo colocou-se 1,0 mL de gua destilada, e identificou-o como o branco do reagente. Adicionou-se 4,0 mL do reagente de Biureto em cada tubo, misturou-se e deixou-o reagir por 30 minutos temperatura ambiente.

Preparao das solues padres

Procedeu-se conforme o item 2, utilizando as diluies feitas a partir da soluo de albumina concentrada. Identificando os tubos conforme sua concentrao.

Medida da absorbncia Mediu-se com o auxlio de um espectrofotmetro (com uma onda de comprimento de 540 nm) a taxa de absorbncia da amostra em questo.

6 RESULTADOS E DISCUSSO

6.1 Resultados Peso da amostra = 1,0032g Tabela 1 Tabela nutricional do leite me p Molico

Tabela 2 - Medida da Absorbncia. Soluo padro de albumina (mL) 0 0,5 1,0 2,0 3,0 5,0 H20 destil. (mL) 10 9,0 8,0 7,0 5,0 3,0 Concentrao da protena 0 0,1 0,2 0,3 0,5 0,7 Absorbncia (nm) 0 0,045 0,077 0,102 0,199 0,268

Absorbncia da amostra X1 e X2. X1 = 0,142 nm X2 = 0,141 nm Xmdia = 0,141 nm

10

Grfico 1 Curva padro

Clculos Para x = 0,3 0,3 mg 1 mL x 100 mL x = 30 mg de protena = 0,03 g % protena = 0,03/1,0032 . 100 % protena = 3 %

6.2 Discusso

Os resultados obtidos foram satisfatrios quando comparados ao valor terico, sendo para uma poro de 20g 9% de protena e o valor obtido experimentalmente foi de 3% para 1,0032g.

11

7 CONCLUSO Conclui-se ento que o teor de protenas do leite em p em torno de 3% para a amostra de 1,0032g.

8 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ZAIA. A.M.D. Determinao de protenas totais via espectrofometria: vantagens e desvantagens dos mtodos existentes. Disponvel em: <http://www.scielo.br/pdf/qn/v21n6/2914.pdf> Acesso 01 junho 2011.