Manual de Toxicología. Facultad de Química. ORIGINAL

Laboratorio de Toxicologa 2010-I
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO
FACULTAD DE QUMICA
DEPARTAMENTO DE FARMACIA
Manual de guiones experimentales para la enseanza y aprendizaje del laboratorio de Toxicologa (clave 1614)
Mara Elena Bravo Gmez Jorge Cornejo Garrido Francisco Hernndez Luis Juan Francisco Palacios Espinosa Araceli Prez Vzquez Francisco Snchez Bartez
Perla Carolina Castaeda Lpez Manuel Gutirrez Aguilar Bernardo Lucas Florentino Carlos Prez Muoz Alejandra Quijano Mateos
Facultad de Qumica, UNAM
Mxico, D.F. 2009
PROGRAMADEAPOYOAPROYECTOSPARA LAINNOVACINYMEJORAMIENTODELAENSEANZA
NDICE Pgina 3 6
PRLOGO REGLAMENTO DE HIGIENE Y SEGURIDAD PARA LOS LABORATORIOS DE LA FACULTAD DE QUMICA REGLAMENTO DE HIGIENE Y SEGURIDAD PARA LOS LABORATORIOS DEL DEPARTAMENTO DE FARMACIA REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN DE TXICOS NO VOLATILES EN UNA MUESTRA PROBLEMA CUANTIFICACIN DE CIANURO DE HIDRGENO, COMO TXICO VOLTIL, A PARTIR DE GLUCSIDOS CIANOGNICOS PRODUCCION DE METAHEMOGLOBINA POR NITRITOS Y EFECTO PROTECTOR DEL AZUL DE METILENO IN VIVO DETERMINACIN DE MALATIN RESIDUAL DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA QUERCETINA Y EL CIDO NORDIHIDROGUAYARTICO EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD GENOTXICA DE LA CICLOFOSFAMIDA UTILIZANDO LA TCNICA DE MICRONCLEOS EN MDULA SEA EFECTO TXICO DE PLOMO EN RATAS EFECTO DEL pH EN LA LIBERACIN DE PLOMO POR UTENSILIOS DE BARRO VIDRIADO DETERMINACIN DE ETANOL EN UNA MUESTRA PROBLEMA IDENTIFICACIN DE ALCALOIDES MUESTRAS PROBLEMA Y BARBITRICOS EN
9 10
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PROLOGO
En noviembre de 2004, el H. Consejo Tcnico de la Facultad aprob las modificaciones al plan de estudios de la carrera de Qumica Farmacutico Biolgica (QFB) y en junio de 2005 fue aprobado por el Consejo Acadmico de las Ciencias Biolgicas y de la Salud (CAABYS). De tal manera, que a partir del semestre 06-I se inici la implantacin gradual del mapa curricular del plan de estudios 2005. En este nuevo mapa curricular, la asignatura terico-experimental de Toxicologa, con clave 1614, qued ubicada en el 6 semestre para la carrera de QFB. El diseo del actual contenido programtico de la asignatura, consider revisar los conocimientos bsicos de toxicologa como son citotoxicidad, bioactivacin txica, estrs oxidante, mutagnesis, carcinognesis y teratognesis, para integrarlos a las etapas de estudio sobre el riesgo de exposicin, toxocintica y toxodinamia de las reacciones adversas ocasionadas por xenobioticos frmacos, metales pesados y sustancias de abuso. A travs del aprendizaje de esta asignatura, se pretende contribuir al perfil del egresado en el diseo, evaluacin y produccin de medicamentos, produccin de reactivos para diagnstico, diagnstico de laboratorio, investigacin biomdica y conservacin del medio ambiente. En consecuencia, el grupo de profesores de toxicologa, en forma colegiada, decidi realizar la actualizacin y modificacin del curso prctico, incluyendo algunos temas de inters actual en esta asignatura, y rediseando los existentes de acuerdo a la reforma a la enseanza experimental (Hernndez y Llano, 1994). Siguiendo estos criterios, se implementaron dos nuevas prcticas con el apoyo del proyecto PE202006 a travs del Programa de Apoyo a Proyectos para la Innovacin y Mejoramiento de la Enseanza (PAPIME), lo cual permiti la adquisicin de equipos, materiales y reactivos para la enseanza experimental de esta asignatura. Con base a lo anterior, los autores presentamos el Manual de guiones experimentales para la enseanza y aprendizaje del laboratorio de Toxicologa. Este manual est constituido por diez guiones experimentales que cubren las unidades temticas del curso terico (Tabla 1) y que permiten integrar, aplicar y relacionar los conocimientos tericos adquiridos en la asignatura. As mismo, los guiones propician la integracin de algunos de los conocimientos adquiridos previamente en asignaturas como Bioqumica, Farmacologa, Qumica Analtica, y Qumica Orgnica, as como su correspondiente aplicacin a la resolucin de problemas de esta rea.
Tabla 1. Relacin entre las unidades temticas del curso terico y los guiones experimentales. Curso laboratorio Guin experimental Extraccin y cuantificacin de txicos no voltiles en una muestra problema Cuantificacin de cianuro de hidrgeno, como txico voltil, a partir de glucsidos cianognicos Produccin de metahemoglobina por nitritos y efecto protector del azul de metileno in vivo Determinacin de malatin residual Determinacin de la capacidad antioxidante de la quercetina y el cido nordihidroguayartico. Cuantificacin de microncleos en eritrocitos de mdula sea como indicador de genotoxicidad Efecto txico de plomo en ratas Efecto del pH en la liberacin de plomo por utensilios de barro vidriado Determinacin de etanol en una muestra problema Identificacin de alcaloides y barbitricos en muestras biolgicas Curso terico Unidad temtica Introduccin a la Toxicologa La biotransformacin de xenobiticos y su importancia toxicolgica. La biotransformacin de xenobiticos y su importancia toxicolgica. La biotransformacin de xenobiticos y su importancia toxicolgica El estrs oxidante Mutagnesis, Carcinognesis y Teratognesis Toxicidad de metales pesados Toxicidad de metales pesados Toxicidad de sustancias de abuso Toxicidad de sustancias de abuso
Los guiones experimentales se elaboraron siguiendo los criterios establecidos por la Reforma de la Enseanza Experimental, donde la adquisicin del conocimiento se da a la luz de las evidencias observables o medibles de los fenmenos que ocurren en el laboratorio. El estudiante es enfrentado a los mismos a travs de un problema bien definido, el cual debe ser resuelto encontrando las relaciones causa-efecto de stos a travs del trabajo experimental. Cada uno de los guiones est estructurado de la siguiente manera: OBJETIVO ACADMICO. Se establece para reforzar y enriquecer los conocimientos adquiridos en las clases tericas, as como el desarrollo de habilidades para el manejo de materiales y tcnicas analticas empleadas comnmente para determinar y/o identificar la presencia de xenobiticos.
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PROBLEMA Se plantea con la intencin de enfrentar al estudiante con fenmenos relacionados con el rea que le permita adquirir los conocimientos planteados en el OBJETIVO ACADMICO a travs del trabajo experimental; encontrando las relaciones causaefecto y relacionando estos hallazgos con el riesgo de intoxicacin y/o el potencial toxicolgico. DESARROLLO EXPERIMENTAL Describe el procedimiento y tcnicas utilizadas para el desarrollo y obtencin de resultados que permitan resolver el PROBLEMA. CUESTIONARIO Se incluye con la intencin de dirigir al estudiante hacia la resolucin del PROBLEMA, resaltando los aspectos vivenciales de la experiencia en el laboratorio y, de esta forma, reforzar el proceso cognoscitivo. APNDICE I : CONOCIMIENTOS PREVIOS ste apndice contiene un listado de los conceptos indispensables para que el estudiante comprenda el guin y sea capaz de resolver el PROBLEMA planteado. APNDICE II: PREPARACIN DE REACTIVOS En este apndice se indican las cantidades necesarias para la preparacin de los reactivos a emplear en el DESARROLLO EXPERIMENTAL. APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS Considerando que en cada sesin de laboratorio se generan un nmero importante de residuos se contempl la necesidad de indicar puntualmente cada uno de ellos as como la manera en que debern ser confinados y etiquetados para su posterior tratamiento. Los autores consideramos importante tambin incluir en el presente material el Reglamento de Higiene y Seguridad de la Facultad y del Departamento de Farmacia, para concientizar a los alumnos de la relevancia y carcter obligatorio de ambos, promoviendo de esta forma el desarrollo de actitudes apropiadas para un profesionista en el rea de las ciencias biolgicas y de la salud. Finalmente, los autores agradecemos el apoyo brindado a travs del proyecto PAPIME No. PE202006 de la Direccin General de Asuntos del Personal Acadmico (DGAPA) de la UNAM.
Hernndez Luna, M. y Llano Lomas, M. Propuesta de Reforma de la Enseanza Experimental. Revista del IMIQ, Ao XXV, vol. 07, 1994, pp. 5-7.
Reglamento de Higiene y Seguridad para los Laboratorios de la Facultad de Qumica

ARTCULO 1. El presente Reglamento es aplicable en todos aquellos de la Facultad de Qumica en donde se realice trabajo experimental, sea de docencia o de investigacin. Estos sitios, para efectos del presente Reglamento, sern denominados laboratorios. Su observancia es obligatoria para el personal acadmico alumnos y trabajadores administrativos y no excluye otra reglamentacin que resulte aplicable. ARTCULO 2. Es necesario que el personal que trabaja en cada laboratorio conozca el sistema de alertamiento, las zonas de seguridad, las rutas de evacuacin, el equipo para combatir siniestros y las medidas de seguridad establecidas en cada laboratorio. ARTCULO 3. Los laboratorios debern a) Un control maestro para energa elctrica b) Un botiqun de primeros auxilios c) Extintores d) Un sistema de ventilacin adecuado e) Agua corriente f) Drenaje g) Un control maestro para suministro de gas h) Sealamientos de proteccin Civil estar acondicionados, como mnimo con lo siguiente:
ARTCULO 4. Todas las actividades que se realicen en los laboratorios debern estar supervisadas por un responsable. Los Departamentos acadmicos respectivos nombrarn a dicho responsable en sus reas correspondientes. ARTCULO 5. Al realizar actividades experimentales, nunca deber estar una persona sola en los laboratorios. El mnimo de personas deber ser, invariablemente, de 2. ARTCULO 6. Los usuarios debern abstenerse de dejar, en el lugar de trabajo, cosas de valor a la vista y cerrar las puertas de cubculos y laboratorios, as como cajones y archiveros, siempre que se ausente del laboratorio. ARTCULO 7. Para trabajar en los laboratorios es obligatorio que los estudiantes usen bata y lentes de seguridad. En el caso del personal acadmico y administrativo, el equipo de proteccin personal, lo dictaminar la Comisin Mixta de Higiene y Seguridad. Este equipo ser de uso obligatorio. El alumno que no tenga proteccin no podr permanecer en el laboratorio, siendo su responsabilidad contar con el equipo mencionado. Adems no podr trabajar ni permanecer dentro de los laboratorios, si no se encuentra su profesor o alguien responsable que los sustituya. ARTCULO 8. En los laboratorios queda prohibido: fumar, consumir alimentos o bebidas, el uso de lentes de contacto y el uso de zapatos abiertos (tipo huarache). ARTCULO 9. Para realizar trabajos con material radiactivo es obligatorio aprobar el curso de su manejo, as como la obtencin del dosmetro correspondiente. ARTCULO 10. Todas las substancias, equipos, materiales, etc., debern ser manejados con el mximo cuidado, atendiendo a las indicaciones de los manuales de uso o de los manuales de seguridad, segn el caso. ARTCULO 11. Las puertas de acceso y salidas de emergencias debern de estar siempre libres de obstculos, accesibles y en posibilidad de ser utilizadas ante cualquier eventualidad. El responsable del rea deber verificar esto, al menos una vez cada semana. ARTCULO 12. Las regaderas debern contar con el drenaje correspondiente, funcionar correctamente, estar lo ms alejadas que sea posible de instalaciones o controles elctricos y libres de todo obstculo que impida su correcto uso. El responsable del rea deber verificar esto, por lo menos una vez cada semana. ARTCULO 13. Los controles maestros de energa elctrica y suministros de gas para cada laboratorio debern estar sealados adecuadamente, de manera tal que sean identificados fcilmente. ARTCULO 14. En cada laboratorio deber existir al alcance de todas las personas que en l trabajen, un botiqun de primeros auxilios. El responsable del rea deber verificar, al menos una vez cada semana, e contenido del botiqun, para proceder a reponer los faltantes. ARTCULO 15. Los extintores de incendios debern ser de CO2, y de polvo qumico seco, segn lo determine la Subcomisin Mixta de Higiene y Seguridad y/o el Departamento de Bomberos de la Universidad; debern de recargarse cuando sea necesario, de conformidad con los resultados de la revisin o por haber sido utilizados.
ARTCULO 16. En caso de emergencias, con incendios, derrames o personas accidentadas, dirigirse a la zona de seguridad establecida y/o activar el servicio de Emergencias 55 (red digital UNAM). Al activarlo: Identifquese: Nombre y Puesto. Ubicacin: D el mayor nmero de referencias fsicas posibles y las vas de acceso. Tipo de siniestro. Nmero de lesionados. Apoyo: Especifique si requiere apoyo adicional de vigilancia. Avisar de inmediato al encargado de la Seguridad del rea y a la Coordinacin de Seguridad. ARTCULO 17. Los sistemas de extraccin de gases debern de mantenerse siempre sin obstculos que impidan que cumplan con su funcin, debern de evaluarse al menos una vez cada mes, y debern recibir el mantenimiento preventivo o correctivo que los responsables de cada rea soliciten. ARTCULO 18. Tanto los sistemas de suministro de agua corriente como de drenaje, debern de recibir el mantenimiento preventivo o correctivo que los responsables de cada rea soliciten. ARTCULO 19. Los lugares en que se almacenen reactivos, disolventes, equipos, materiales, medios de cultivo, y todo aquello relacionado o necesario para que el trabajo en los laboratorios se lleve a cabo, estarn sujetos a este Reglamento en su totalidad. ARTCULO 20. Queda prohibido desechar sustancias al drenaje o por cualquier otro medio sin autorizacin del responsable del rea correspondiente. Los manuales de prcticas correspondientes debern incluir la forma correcta de desechar los residuos. ARTCULO 21. Para transferir lquidos con pipetas, deber utilizarse la llenadora correspondiente. Queda prohibido pipetear con la boca. ARTCULO 22. Al finalizar las actividades en el laboratorio, el responsable del rea deber verificar que queden cerradas las llaves de gas, agua, vaco, tanques de gases y aire, segn sea el caso; apagadas las bombas de vaco, circuitos elctrico, luces, etc. En caso de requerir que algn equipo trabaje de manera contina, deber dejarse en el interior y en el exterior del laboratorio correspondiente, en forma claramente visible y legible, la informacin acerca del tipo de reaccin o proceso en desarrollo, las posibilidades fuentes de problema, la manera de controlar los eventuales accidentes, y la forma de localizar al responsable del equipo. ARTCULO 23. Cuando se trabaje con sustancias txicas, deber identificarse plenamente el rea correspondiente. Nunca debern tomarse frascos por la tapa o el asa lateral, siempre debern tomarse con ambas manos, una en la base y la otra en la parte media. Adems se deber trabajar en rea con sistema de extraccin y equipo de proteccin personal (segn el manual correspondiente). ARTCULO 24. En cada laboratorio de la Facultad deber existir, de manera clara, visible y legible, la informacin acerca de los telfonos de emergencia a los cuales llamar en caso de requerirlo. ARTCULO 25. Todas aquellas cuestiones que no estn especficamente sealadas en el presente Reglamento, debern ser resueltas por la Direccin de la Facultad con la opinin de la Coordinacin de Seguridad, Prevencin de Riesgos y Proteccin Civil. ARTCULO 26. Cualquier alteracin en las condiciones de seguridad o en el cumplimiento del presente reglamento, deber ser reportado al responsable correspondiente. ARTCULO 27. Las personas a quienes se sorprenda haciendo mal uso de equipos, materiales, instalaciones, etc. propias de los laboratorios, de todo aquello mencionado en el artculo 2 del presente Reglamento, o de las sealizaciones instaladas para proteccin civil, sern sancionadas conforme a la Legislacin Universitaria, segn la gravedad de la falta cometida. ARTCULO 28. En el caso de los alumnos, las sanciones aplicables sern las que decida el H. Consejo Tcnico, conforme a las disposiciones de la Legislacin Universitaria. ARTCULO 29. Tratndose de personal acadmico y administrativo, se levantarn las actas correspondientes y se dictarn las sanciones conforme a las disposiciones de la Ley Federal del Trabajo. ARTCULO 30. Cada rea acadmica deber tener un Reglamento Interno de Higiene y Seguridad y ser de observancia obligatoria, siendo este complementario al presente Reglamento, en tanto no lo contravengan. TRANSITORIO NICO. El presente reglamento entrar en vigor el da siguiente de su publicacin en la gaceta de la propia Facultad.
Reglamento de Higiene y Seguridad de los Laboratorios del Departamento de Farmacia

ARTCULO 1. El presente Reglamento es complementario del Reglamento de Higiene y Seguridad, para Laboratorios de la Facultad de Qumica de la UNAM, aprobado por el H. Consejo Tcnico el 28 de abril de 1994. Su observancia es obligatoria para el personal acadmico, alumnos y trabajadores administrativos, y no excluye otra reglamentacin que resulte aplicable. ARTCULO 2. REGLAS DE SEGURIDAD 2.1 Seguir todas las indicaciones de seguridad que se sealan en cada equipo o reactivo, as como las sealadas en cada prctica. 2.2 Queda prohibido correr dentro del laboratorio. 2.3 Todas las lesiones sufridas dentro del laboratorio, no importa qu tan insignificantes sean, debern darse a conocer al coordinador del laboratorio. 2.4 Antes de desarmar o limpiar un aparato elctrico, debe asegurarse de que est desconectado de la corriente elctrica. Nunca opere un equipo que desconoce, pregunte primero al laboratorista o al profesor. 2.5 No debe usarse material de vidrio roto o despostillado. 2.6 Si en su rea o equipo se va a efectuar algn servicio de mantenimiento, asegrese de dar aviso oportuno a todos los involucrados y comunquelo a la Coordinacin de Seguridad. 2.7 El alumno que necesite salir por cualquier motivo, deber comunicarlo a los profesores. 2.8 El alumno que acta como supervisor de cada equipo de trabajo, deber verificar, al finalizar la prctica, el orden y la limpieza de cubculos y equipos. 2.9 Al finalizar cada sesin prctica, los alumnos entregarn al profesor responsable de la asignatura o al laboratorista en turno, los cubculos y equipos empleados, limpios y en buen estado; asimismo debern informar cualquier defecto o anomala detectada en los mismos. 2.10 Deber colocar sus artculos personales en el sitio que para tal efecto se asignar en cada laboratorio. ARTCULO 3. MANUFACTURA DE MEDICAMENTOS 3.1 Todo el personal involucrado en la manufactura de medicamentos, deber cubrir totalmente su cabello con una cofia limpia y en buen estado. 3.2 Deber usar guantes de cirujano y cubrebocas limpios, en buen estado, cuando el proceso lo indique (por ejemplo, surtido y pesado de materias primas, etc.). 3.3 De preferencia debe portar zapatos cerrados con suela antiderrapante. 3.4 Queda prohibido introducir alimentos, bebidas o golosinas, excepto cuando as se requiera (Biofarmacia). 3.6 Quedan prohibidas las visitas. 3.7 Las puertas de los cubculos deben permanecer cerradas. ARTCULO 4. DISPOSICIN DE RESIDUOS BIOLGICOS 4.1 En caso de romper o derramar material contaminado, se deber agregar fenol al 5% y dejar actuar el desinfectante por 10 minutos. 4.2 Queda estrictamente prohibido arrojar medio de cultivo, disolventes orgnicos o productos biolgicos, al sistema de drenaje, as como a los colectores de basura; estos residuos se debern incorporar a recipientes que se localizan en cada laboratorio, para ser dispuestos adecuadamente. 4.3 Los cultivos deben esterilizarse antes de ser desechados; si se encuentran en material desechable, ste debe depositarse en los recipientes que se localizan en cada laboratorio. Estos residuos sern reciclados. 4.4 Otros desechos orgnicos (alimentos, animales, muestras biolgicas) se depositarn en los recipientes etiquetados que para este propsito se encuentran en cada laboratorio. 4.5 El material de plstico se depositar en otro recipiente especial. 4.6 El material de vidrio se colectar aparte, en el recipiente indicado. 4.7 El papel limpio de desecho se depositar en otra caja para ser reciclado. ARTCULO TRANSITORIO NICO. El presente Reglamento entrar en vigor al da siguiente de su aprobacin por el H. Consejo Tcnico de la Facultad.
REPORTE DE SEGURIDAD GRUPO:_____________ FECHA:___________________ PRACTICA:_______________________________________________________________ INTEGRANTES:___________________________________________________________ UTILIZACIN DE REACTIVOS. REACTIVO Cantidad empleada Observaciones
VIGILANCIA DE EQUIPO
Equipo Hora de inicio Hora final Observaciones
MEDIDAS DE SEGURIDAD TRATAMIENTO DE RESIDUOS OBSERVACIONES
Firma del responsable:________________________________________
EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN DE TXICOS NO VOLTILES EN UNA MUESTRA PROBLEMA OBJETIVO ACADMICO Que el alumno emplee mtodos de extraccin cida y bsica para obtener eficientemente txicos no voltiles de naturaleza cida y bsica en una muestra problema y concluya que mtodo de extraccin es el ms eficiente. PROBLEMA Establecer las condiciones ms adecuadas para realizar una extraccin mayor o igual al 90% de los txicos no voltiles cidos y bsicos (cido acetilsaliclico [AAS] y cafena) presentes en una muestra problema. La muestra deber trabajarla en medio cido y medio bsico. REACTIVOS cido tartrico Hidrxido de sodio (NaOH) Nitrato frrico (Fe(NO3)3) cido clorhdrico (HCl) Bicarbonato de sodio (NaHCO3) EQUIPO Espectrofotmetro Rotaevaporador MATERIAL MATERIAL POR EQUIPO Gradilla 1 Piseta con agua destilada Tubos de ensayo 13 x 100 4 Matraz de bola de 50 mL Matraz aforado de 10 mL 2 Pipeta Pasteur Matraz aforado de 25 mL 2 Probeta de 25 mL Embudo de separacin de 250 mL 2 Esptula Matraz Erlenmeyer de 250 mL 1 Pipeta graduada de 10 mL Matraz Erlenmeyer de 50 mL 2 Pipeta graduada de 5 mL Anillo metlico 2 Pipeta graduada de 1 mL
Cafena Cloroformo (CHCl3) Salicilato de sodio Cloruro mercrico (HgCl2) Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)
Balanza analtica Vrtex
1 2 2 1 1 2 2 1
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MATERIAL PARA LA CURVA PATRN Gradilla 1 Matraz volumtrico de 10 mL 5 Matraz volumtrico de 25 mL 5 Tubos de ensayo 10 Vaso de precipitado de 100 mL 1 Pipeta graduada de 1 mL 1 Pipeta graduada de 10 mL 1 NOTA: El profesor proporcionar las celdas a los alumnos.
DESARROLLO EXPERIMENTAL El profesor proporcionar 30 mL de muestra problema la cual deber dividirse en dos porciones de 15 mL para realizar a una porcin la extraccin en medio cido y a la otra porcin la extraccin en medio bsico. La cuantificacin de cido acetilsaliclico (AAS) y cafena se determinar siguiendo los apndices correspondientes. A) PROCESO DE EXTRACCIN EN MEDIO CIDO PARA TXICOS NO VOLTILES 1. Agregar cido tartrico hasta un pH = 2. 2. La solucin cida se extrae con 2 porciones de 15 mL de CHCl3, separando las fases orgnicas y reunindolas en un matraz. 3. La fase acuosa se guarda, etiquetndola como fraccin A. 4. La fase orgnica se extrae con dos porciones de 10 mL de agua destilada y se renen las fases acuosas con la fraccin A. 5. Tratamiento de la fase orgnica: sta fase se trata con 5 mL de una solucin saturada de NaHCO3, se separan las fases. Etiquetar la fase acuosa como fraccin B. Tratar esta fraccin como se indica en el inciso C.
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5.1. Extraer la fase orgnica con 5 mL de NaOH 0.1 N. La fase acuosa resultante, etiquetarla como fraccin C y trabajarla como se indica en el inciso C. La fase orgnica resultante marcar como R1. 6. Tratamiento de la fraccin A. La fase acuosa obtenida del inciso 4 se alcaliniza hasta pH = 10 con NaOH 2.5 N. 6.1. Extraer con dos porciones de CHCl3 de 10 mL (2 x 10 mL CHCl3) y separar las fases. Desechar la fase acuosa resultante en el contenedor etiquetado como R2. 6.2. Concentrar la fase orgnica hasta sequedad en rotaevaporador. Etiquetar como fraccin D y tratarlo como se indica en el inciso D. El disolvente orgnico resultante que se encuentra en el matraz de condensacin debe ser desechado en el contenedor etiquetado como R1. B) PROCESO DE EXTRACCIN EN MEDIO BSICO PARA TXICOS NO VOLTILES 1. La muestra se ajusta a pH = 10 con NaOH 2.5 N. 2. Realizar la extraccin con dos porciones de CHCl3 de 15 mL, separando las fases. 3. La fase orgnica se concentra hasta sequedad y el residuo se etiqueta como fraccin E y se trata como se indica en el inciso D. 4. La fase acuosa se etiqueta como fraccin F y se trata segn el inciso C.
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C) CUANTIFICACIN DE CIDO ACETILSALICLICO Tratamiento de la muestra (Fracciones B, C y F) 1. Colocar 1 mL de las fracciones B, C y F en tubos de forma separada y adicionar a cada una 5 mL del reactivo para desarrollar color (apndice II), agite, espere 2 min. 2. Determinar la absorbancia a 540 nm. Si la lectura de absorbancia no cumple con la ley de Lambert y Beer, realice las diluciones necesarias, repita el procedimiento y vuelva a realizar la lectura. 3. Calcular la concentracin de AAS presente en su muestra, interpolando la lectura de absorbancia en la curva patrn. 4. Despus de haber realizado la lectura y una vez obtenidos los resultados, las fracciones B, C y F se renen y desechan en el contenedor etiquetado como R3. Curva patrn del AAS 1. Solucin patrn de salicilato de sodio (1000 g/mL): Pesar 25 mg de salicilato de sodio y disolverlo. Llevar hasta 25 mL con agua destilada. 2. A partir de la solucin patrn de salicilato de sodio (1000 g/mL), preparar la curva patrn como se describe a continuacin (realizar dos curvas patrn por grupo). Alicuota de la solucin patrn (mL) 0.5 1 3 5 7 Aforo con agua destilada 10 10 10 10 10 Concentracin (g/mL) 50 100 300 500 700
En un tubo de ensaye colocar 1 mL de las soluciones recin preparadas y adicionar 5 mL del reactivo para desarrollar color (apndice II), agitar la muestra en un vrtex durante 1
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min, esperar 2 min. y determinar la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm, ajustando a cero con un blanco (1 mL de agua y 5 mL del reactivo para desarrollar color). D) CUANTIFICACIN DE CAFENA Tratamiento de la muestra (Fracciones D y E) 1. Disolver por separado los residuos de las fracciones D y E en 5 mL de NaOH 0.1 N. Transferirlo a un matraz volumtrico de 25 mL y aforar con NaOH 0.1 N. 2. Determinar la absorbancia de la solucin anterior a 275 nm utilizando NaOH 0.1 N como blanco. Si la lectura de absorbancia obtenida no cumple con la ley de Lambert y Beer, realice las diluciones necesarias con NaOH 0.1N. 3. Calcular la concentracin de cafena presente en su muestra, interpolando la lectura de absorbancia en la curva patrn. 4. Despus de haber realizado la lectura y una vez obtenidos los resultados, las fracciones D y E se renen y desechan en el contenedor etiquetado como R2. Curva patrn 1. Solucin patrn de cafena (100 g/mL). Disolver 10 mg de cafena anhidra en 10 mL de NaOH 0.1 N y afore con la misma solucin a 100 mL. 2. A partir de la solucin patrn de cafena (100 g/mL) preparar la curva patrn como se describe a continuacin. Por grupo realizar dos curvas patrn. Alicuota de la solucin patrn (mL) 1 2 3 4 5 Aforo con NaOH 0.1 N 25 25 25 25 25 Concentracin (g/mL) 4 8 12 16 20
3. Determinar la absorbancia de la curva patrn a una longitud de 275 nm, ajustando a cero con un blanco (NaOH 0.1 N).
CUESTIONARIO 1. En el caso de emplear una muestra biolgica indique cul es el objetivo de adicionar cido tartrico adems de ajustar el pH? 2. Una vez desarrollado el guin para una eficiente extraccin de un xenobitico qu puntos del proceso y propiedades fisicoqumicas considera que son crticos? 3. Complete la siguiente tabla e indique los datos de la regresin lineal de cada curva. Tabla 1. Curva Patrn AAS [g/mL] 50 100 300 500 700 Pendiente (m) Ordenada al origen (b) Coeficiente de correlacin lineal (r) Abs* curva 1 Abs* curva 2 cafena [g/mL] 4 8 12 16 20 Pendiente (m) Ordenada al origen (b) Coeficiente de correlacin lineal (r) *Abs:Absorbancia Tabla 2. Lecturas de Muestras Absorbancia de las fracciones B C F D E Abs* curva 1 Abs* curva 2
Equipo 1 2 3
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4. Interpole los datos de absorbancia de cada una de sus fracciones y calcule la concentracin de AAS y/o cafena en su muestra indicando el procedimiento que sigui para realizarlo. 5. Es necesario considerar el factor de dilucin para calcular la concentracin inicial de los xenobiticos en su muestra? Justifique su respuesta. 6. Complete las siguientes tablas y de acuerdo a los resultados grupales concluya cual es el mejor mtodo de extraccin para los xenobiticos analizados. Tabla 3. Resultados grupales AAS cido acetilsaliclico Equipo Extraccin en medio cido Concentracin (g/mL) 1 2 3 Tabla 4. Resultados grupales cafena cafena Equipo Extraccin en medio cido Concentracin (g/mL) 1 2 3 7. En caso de no haber obtenido un rendimiento superior al 90% analice a que puede atribuirse el hecho. Rendimiento (%) Extraccin en medio bsico Concentracin (g/mL) Rendimiento (%) Rendimiento (%) Extraccin en medio bsico Concentracin (g/mL) Rendimiento (%)
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APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Efectos txicos del cido acetilsaliclico (AAS) y de la cafena. Relacin entre el pKa de una sustancia con el pH del medio en el que se encuentra disuelto. Estructura de la forma inica y no inica del AAS y de la cafena. Reaccin de hidrlisis del AAS. Valores de pKa del AAS, cido saliclico, cido tartrico, cido actico y de la cafena Solubilidad de una sustancia inica en medio acuoso y disolvente orgnico. Densidad de los disolventes a emplear. Fundamento de una extraccin mltiple y selectiva. Sustancias que pueden precipitar protenas. medio bsico especificando qu especies qumicas se encuentran en cada uno de las fases. 11. Propsito de lavar la fase orgnica con dos porciones de agua destilada en la extraccin en medio cido. 12. Propsito de juntar las facciones acuosas obtenidas de la particin con CHCl3 con la fraccin A en el proceso de extraccin en medio cido. 13. Objetivo de adicionar NaHCO3 y NaOH 0.1N en el proceso de extraccin cida. 14. Naturaleza de los compuestos obtenidos en cada una de las fracciones. 15. Dibujo de la reaccin de identificacin y cuantificacin del AAS. 16. Rango de absorbancia en el cual se cumple la ley de Lambert y Beer. 17. Razn por la cual se determinan la cafena y el AAS a diferentes longitudes de onda. 18. Forma de obtener el rendimiento de la extraccin de una sustancia. 19. El anlisis de una muestra biolgica de 20 mL para determinar la presencia de salicilatos y/o cafena arroj las siguientes lecturas de absorbancia:
10. Esquema de los procesos de separacin empleados tanto en medio cido como en
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Tabla 1. Absorbancia y volumen final de las fracciones B,C y D Absorbancia a = 540 nm fraccin B = 0.613 fraccin C = 0.456 Volumen (mL) 15 7 Absorbancia a = 275 nm fraccin D = 0.785 Volumen (mL) 6
Para la realizacin de los clculos considere el proceso de extraccin en medio cido descrito en el guin experimental y tome en cuenta las diluciones necesarias. Las lecturas de absorbancia de las curvas patrn para AAS y cafena son las que se muestran a continuacin: Tabla 2. Curva patrn AAS Concentracin [g/mL] 50 100 300 500 700 b = 5.8 x 10-3 m = 1.409 x 10-3 r= 0.999 0.060 0.133 0.421 0.713 0.970 A = 540 nm [g/mL] 4 8 12 16 18 b = 9.2 x 10-3 m = 0.0566 r =0.996 0.184 0.484 0.684 0.885 1.000 Cafena Concentracin A = 275 nm
Calcule la concentracin de AAS y Cafena en la muestra inicial.
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APNDICE II: PREPARACIN DE REACTIVOS Reactivo para desarrollar color: Pesar 4 g de HgCl2 y disolverlo en 12 mL de HCl 1N. Adicionar 4 g de Fe(NO3)3 y agitar hasta su total disolucin. Diluir con agua destilada a 100 mL (considerar cantidades adicionales para el blanco y curva patrn) Solucin de hidrxido de sodio 2.5 N Disolver 10 g de NaOH en 25 mL de agua destilada y aforar a 100 mL. Solucin de hidrxido de sodio 0.1 N Disolver 0.4 g de NaOH en 25 mL de agua destilada y aforar a 100 mL. Solucin de cido clorhdrico 1 M Colocar 83 mL de HCl concentrado en un matraz aforado y adicionar agua destilada hasta 1 L. Solucin de cido tartrico al 10% Colocar 10 g en 100 mL de agua destilada. Solucin saturada de bicarbonato de sodio. Colocar una cantidad aproximada de bicarbonato de sodio R.A., en 10 mL de agua destilada, hasta que no se pueda disolver en fro.
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APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS R1: Cloroformo (restos de acido acetilsaliclico y cafena) R2: Solucin acuosa bsica de NaOH (pH = 10), tartrato de sodio y restos de cafena ionizada, cido acetilsaliclico y cido saliclico. R3: Solucin acuosa con HgCl2 y Fe(NO3)3.
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CUANTIFICACIN DE CIANURO DE HIDRGENO, COMO TXICO VOLTIL, A PARTIR DE GLUCSIDOS CIANOGNICOS
OBJETIVO ACADMICO Que el alumno determine la cantidad de cianuro de hidrgeno liberado a partir de glucsidos cianognicos presentes en muestras que forman parte de la dieta de humanos y animales, y relacione la concentracin con su potencial toxicolgico. PROBLEMA Que el alumno cuantifique la concentracin de cianuro de hidrgeno presente en una serie de 2 muestras de semillas o plantas, y concluya cul de estas muestras presentan riesgo de toxicidad para el humano, en base a la cantidad de HCN que est presente en el consumo de 100 g de muestra. REACTIVOS Reactivo de Guignard * Cianuro de potasio * (KCN) Carbonato de sodio (Na2CO3) * VER APNDICE II EQUIPO Espectrofotmetro Estufa MATERIAL POR EQUIPO Tubos de ensaye 20 x150 con tapn de hule Cajas Petri Mortero con pistilo 3 1 1 Tijeras Pinzas Navaja (traer por equipo) 1 1 1 Termmetro cido clorhdrico * (HCl) Cloroformo (CHCl3) cido pcrico
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Tiras de papel filtro cualitativo (filtracin rpida) de 2 x 10 cm Pipeta volumtrica de 25 mL Probeta de 50 mL Vaso de precipitado de 100 mL 3 1 1 3
Matraz Erlenmeyer de 250 mL con tapn de hule Pipeta graduada de 1 mL Embudo de cola corta Hielo (proporcionado por laboratorista) 3 1 3
MATERIAL PARA LA CURVA Matraces Erlenmeyer de 250mL con tapn de hule Matraces volumtricos de 25 mL Pipeta graduada de 1 mL Tubos de ensaye 20 x 150 con tapn de hule. Papel filtro (tiras de 2 x 10 cm) NOTA: El profesor proporcionar las celdas para las lecturas MATERIAL DE ESTUDIO Traer por equipo aproximadamente 1g de una de las siguientes muestras: almendra de durazno, semillas de manzana roja, almendra de ciruela pasa, semilla de lima, almendra de capuln, almendra de cerezas. 6 6 1 6 6
DESARROLLO EXPERIMENTAL Cada equipo trabajar con 2 muestras problema de plantas o semillas segn la lista mencionada, una de las cuales ser proporcionada por el profesor.
NOTA: La solucin patrn de cianuro de potasio, el cido clorhdrico 0.5N y el agua destilada deben de estar en bao de hielo antes de realizar la parte experimental. PREPARACIN DE LA TIRA REACTIVA
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1. Cortar 2 tiras de papel filtro de 2 x 10 cm. El equipo que prepare curva patrn de HCN deber preparar 6 tiras adicionales. 2. Sumergir las tiras de papel filtro en el reactivo de Guignard y escurrirlas, colocndolas para su secado sobre una caja Petri. 3. Introducir las tiras en una estufa que se encuentre estable a una temperatura entre 5055oC, dejndolas aproximadamente 10 min cuidando que estn humedecidas. PREPARACIN DE LAS MUESTRAS NOTA: Antes de comenzar a triturar y pesar su muestra debern tener todos los reactivos necesarios dentro del matraz, as como lista la tira reactiva, tanto para su muestra como para la curva patrn. A cada una de las muestras se le realizar el siguiente procedimiento: 1. Medir 25 mL de agua destilada con pipeta volumtrica y agregarlos a un matraz Erlenmeyer de 250 mL, colocar el matraz en bao de hielo. 2. Adicionar al matraz del inciso anterior 1mL de solucin de HCl 0.5N y dos gotas de CHCl3. 3. Poner con cuidado la tira reactiva de papel en el matraz como se indica en la figura 1 4. Tapar inmediatamente cada uno de los matraces Erlenmeyer con su tapn despus de concluir este procedimiento. 5. Pesar la cantidad de cada muestra de acuerdo al siguiente cuadro y colocarla en el mortero con la ayuda de las pinzas de diseccin y navaja cortarla y macerarla lo ms rpido posible. Insertar Tabla Leticia 6. Colocar rpidamente la muestra fragmentada en el matraz Erlenmeyer de 250 mL y tapar inmediatamente. 7. Introducir simultneamente en la estufa a 40C los matraces con las muestras problema y con los correspondientes de la curva estndar de HCN durante 1 hr.
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TAPON DE HULE PAPEL FILTRO (TIRA REACTIVA)
MUESTRA
FIGURA 1. Preparacin de la muestra en el matraz y colocacin de la tira reactiva. PREPARACIN DE LA CURVA PATRN DE CIDO CIANHDRICO La curva patrn de HCN se prepara colocando en matraces volumtricos de 25 mL los volmenes de la solucin patrn de KCN indicados en la siguiente tabla y llevando al aforo con agua destilada: Tabla 2. Curva patrn de HCN Alcuota de la solucin patrn de KCN (mL) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Concentracin de HCN (g/mL) Blanco 0.4 0.8 1.2 1.6 2
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1. Colocar con cuidado la tira reactiva en el matraz como se indica en la figura 1 y agregar a cada matraz 1 mL de la solucin de HCl 0.5 N y dos gotas de CHCl3, cuidando de no mojar la tira. Tapar inmediatamente cada uno de los matraces Erlenmeyer con su tapn despus de concluir este procedimiento. 2. Una vez preparadas las soluciones de la curva patrn, pasarlas inmediatamente a matraces Erlenmeyer de 250 mL, debidamente etiquetados y colocarlos en bao de hielo. 3. Introducir simultneamente en la estufa a 40C los matraces con las muestras problema y con los correspondientes de la curva estndar de HCN durante 1 h. TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS PROBLEMA, CURVA PATRN Y BLANCO 1. Transcurrido el tiempo de incubacin, los matraces se sacan de la estufa y se dejan enfriar. Decantar el contenido del matraz y colocar el residuo lquido en un contenedor etiquetado como R1. El material vegetal se deja secar en la campana sobre papel peridico para ser desechado posteriormente. 2. Introducir en un tubo de ensaye la tira reactiva positiva (procedente de muestra problema, curva estndar blanco) adicionar al tubo 20 mL de agua destilada, tapar el tubo y agitar vigorosamente. Filtrar la solucin con papel filtro para eliminar residuos de la tira de papel. 3. Determinar la absorbancia de la muestra y de la curva patrn en el espectrofotmetro a 520 nm, utilizando como blanco el primer punto de la curva. 4. Despus de haber realizado la lectura y una vez obtenido resultados, la mezcla se coloca en un contenedor etiquetado como R2.
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CUESTIONARIO 1. Reporte en la siguiente tabla los valores de absorbancia obtenidos, e indique los valores de la regresin lineal. Tabla 1. Absorbancias de la curva patrn HCN Absorbancia [g/mL] 0.4 0.8 1.2 1.6 2 Pendiente (m) Ordenada al origen (b) Coeficiente de correlacin lineal (r) 2. Interpole sus valores de absorbancia en la curva y calcule la concentracin de HCN en mg/100g de muestra, indicando el procedimiento realizado para esta determinacin. 3. Reporte los resultados obtenidos en su grupo y llene la siguiente tabla: Material vegetal Tabla 2. Resultados grupales Concentracin de HCN mg HCN/100 g de (g/mL) muestra Riesgo de toxicidad*
Equipo 1 2 3
* alto 10 mg/100g de muestra; bajo < 10 mg/100g de muestra
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4. Indique cules muestras representan un riesgo potencial en caso de su consumo. 5. Cmo podra eliminar la presencia de glucsidos cianognicos de sus muestras? 6. Proponga un mtodo para extraer txicos voltiles a partir de una muestra.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Conn, E.E. (1969). Cyanogenic glucosides. Journal of Agricultural and Food Chemistry 17, 519526. Conn, E.E.; Cyanogenic glucosides. En: Toxicants ocurring naturally in foods. (2 ed). National Academy of Sciences, Washington, D.C., 1973, pp 290308. Eyjolfsson, R. (1970). Recent Advances in chemistry of cyanogenic glucosides. Fortschritte der Chemie Organischer Naturstoffe 28, 74108. Fabre, R. Y Truhaht, R. Tratado de toxicologa. Vol. I. Paraninfo, S.A., Madrid, 1976, pp 311332. Francisco, I.A. y Pimenta-Pinotti M.H. (2000). Cyanogenic Glycosides in Plants. Brazilian Archives of Biology and Technology 43, 487492. Harborne, J.B. Cyanogenic glucosides and their function. En: Phytochemical ecology. Academic Press, London, 1972, 104123. Linder, E. Toxicologa de los alimentos. Ed. Acribia, Zaragoza, 1978, pp 15-19. Lucas, B. Sotelo, A. (1984). A simplified test for the quantitation of cianogenic glucosides in wild and cultivated seeds. Nutrition Reports International 29, 711-719 Montgomery, R.D. Cyanogens. En: Toxic constituent of plant foodstuff, Liener, IE, (Ed.) Academic Press, New York, 1980, 143160. Speijers, G.J. y Egmoad, H.P. Natural Toxins III. Inherent Plant Toxins. En: International Food Safety Handbook: Science, International Regulation, and Control. Younes, M., Fishbein, L., Miller, S., (Eds.). Marcel Dekker, Inc, New York, 1999, pp 368380. Vetter, J. (2000). Plant cyanogenic glycosides. Toxicon 38, 1136.
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APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Estructura de un glucsido cianognico. Hidrlisis enzimtica de un glucsido cianognico. Importancia toxicolgica de los glucsidos cianognicos. Reaccin de Guignard para la deteccin de HCN. Importancia que tiene durante la prctica que la trituracin de la muestra se realice rpidamente y sea colocada en bao de hielo. Razn por la cual la tira reactiva no debe tocar la solucin en que se encuentra la muestra. Razn por la cual se da una reaccin positiva sin que la tira reactiva est en contacto con la muestra. Razn por la cual es necesario colocar las soluciones de cianuro de potasio y el HCl 0.5N empleadas en la preparacin de la curva patrn en bao de hielo. Propsito de agregar HCl y CHCl3 a la muestra y a la curva patrn. 10. Propsito de calentar la muestra a 40C en la estufa. APNDICE II: PREPARACIN DE SOLUCIONES
Reactivo de Guignard Colocar 2.5 g de cido pcrico en un matraz Erlenmeyer de 250mL y disolver con 200mL de agua destilada. Enseguida agregar 12.5 g de carbonato de sodio (Na2CO3) y agitar cuidadosamente para disolverlo. Llevar la solucin a un volumen de 500 mL con agua destilada. NOTA: Manejar con cuidado el cido pcrico, ya que esta sustancia es cancergena y se absorbe fcilmente por la piel. Solucin patrn de cianuro de potasio.(KCN) Se pesa exactamente 12.05 mg de KCN transferir la pesada cuidadosamente a un matraz aforado de 50mL, disolver y aforar con agua destilada.
NOTA: A pesar de que la concentracin utilizada de KCN en este guin es de aproximadamente 0.24 mg/mL y esta concentracin est por debajo de la DL50 en ratones, no deber descuidar las medidas de seguridad para su trabajo.
Solucin cido clorhdrico 0.5 N. (HCl) Medir 42.5 mL de HCl concentrado (densidad: 36.46g/100mL) y vaciar a un matraz volumtrico de 1000 mL que contiene aproximadamente 500mL de agua destilada, aforar enseguida con agua destilada. APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS R1: Solucin acuosa de HCl (0.5 N), KCl, KCN. R2: Solucin de cido pcrico, Na2CO3, restos de isopurpurina.
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PRODUCCION DE METAHEMOGLOBINA POR NITRITOS Y EFECTO PROTECTOR DEL AZUL DE METILENO IN VIVO OBJETIVO ACADEMICO Que el alumno observe la formacin de metahemoglobina (MHb) como consecuencia de la administracin de nitrito de sodio y el efecto protector del azul de metileno. PROBLEMA Determinar cuantitativamente, en ratas tratadas con NaNO2, la reduccin en el porcentaje de MHb debida a la administracin de azul de metileno. REACTIVOS. Heparina 1000 UI o EDTA al 10% Cianuro de potasio* (KCN) Solucin salina isotnica (SSI) cido actico glacial (CH3COOH) Hidrxido de amonio (NH4OH) *Ver APNDICE II EQUIPO. Espectrofotmetros UV-Vis Centrfugas Balanza para pesar animales Solucin amortiguadora de fosfatos* Ferricianuro de potasio* (K3[Fe(CN)6]) Nuevo azul de metileno* Nitrito de sodio* (NaNO2) ter dietlico
MATERIAL. Jeringa de insulina (traer por equipo) Tubos de ensaye 13x100 Pinzas de diseccin 3 10 1 Jeringa de 3 mL (traer por equipo) Tijeras de diseccin Tabla de diseccin 3 1 1
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Caja de contencin Pipeta graduada de 5 mL Pipeta graduada de 0.1 mL
1 2 1
Rejilla Pipeta graduada de 1 mL Tubos de ensaye 16 x 150
1 1 3
ANIMALES DE EXPERIMENTACIN 3 Ratas Wistar macho de 200-250 g (por equipo). PARTE EXPERIMENTAL 1. 2. Pesar cada uno de los animales e identificarlos como I, II y III. Administrar a la rata III, por va intraperitoneal (i.p.) una dosis de 2 mg/Kg de la solucin de azul de metileno y 15 minutos despus administrar por la misma va, 50 mg/Kg de la solucin de nitrito de sodio. 3. 4. 5. 6. Administrar a la rata I por va i.p. 1 mL/Kg de SSI. Administrar a la rata II por va i.p., 50 mg/Kg de la solucin de nitrito de sodio. Dejar transcurrir 30 min despus de la administracin. Preparar 3 jeringas con 0.1mL de solucin de heparina o EDTA y 3 tubos de ensaye con 0.3 mL del mismo anticoagulante e identificarlos de acuerdo al nmero de rata correspondiente. 7. 8. Anestesiar a cada rata con ter, colocarla en la tabla de diseccin y extraer de cada una, por puncin cardiaca 1 mL de sangre. Colocar la muestra sangunea en el tubo correspondiente. QUITAR LA AGUJA DE LA JERINGA PARA EVITAR HEMOLIZAR LA MUESTRA SANGUINEA. MEZCLAR LOS TUBOS PERFECTAMENTE POR INVERSIN PARA EVITAR LA COAGULACIN DE LAS MUESTRAS. 9. Depositar las jeringas y las agujas en el contenedor para residuos peligrosos biolgicoinfecciosos (RPBI). Envolver los restos de los animales de experimentacin en una hoja de papel peridico y colocarlos en la caja de contencin para su posterior incineracin.
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10. Determinar el contenido de metahemoglobina y hemoglobina total de cada muestra como se indica a continuacin: a) Colocar 4.9 mL de solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.6 en un tubo de ensaye. b) Agregar 0.1 mL de sangre. Conservar el resto de la muestra hasta el final de la determinacin y despus desactivar con hipoclorito de sodio (NaClO). c) Mezclar y dejar reposar durante 5 minutos. d) Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos. e) Separar el sobrenadante. f) Medir la absorbancia del sobrenadante a 630 nm (lectura A1), contra un blanco de solucin amortiguadora de fosfatos. g) Pasar la solucin a un tubo limpio. h) Agregar una gota de la solucin neutralizada de KCN al sobrenadante y al blanco. i) Mezclar y dejar reposar 2 minutos. j) Determinar nuevamente la absorbancia a 630 nm (lectura A2). Recuperar la solucin en el mismo tubo. k) Agregar una gota de NH4OH concentrado al tubo del inciso i, y mezclar. l) Transferir 2 mL de la solucin del tubo del inciso k, a otro tubo y agregar 8 mL de la solucin amortiguadora y 0.1 mL de la solucin de K3[Fe(CN)6] al 20% en solucin acuosa. Desechar el sobrante de la solucin proveniente del inciso k en el contenedor etiquetado como R1. m) Preparar un blanco empleando 2 mL de agua destilada, 8 mL de solucin amortiguadora y 0.1 mL de la solucin de K3[Fe(CN)6] al 20% en solucin acuosa. n) Despus de 2 minutos agregar una gota de la solucin neutralizada de KCN a cada tubo (blanco y problema). o) Mezclar, esperar 10 minutos y determinar la absorbancia a 540 nm, contra su respectivo blanco (lectura A3). Despus de haber realizado la lectura y una vez obtenidos los clculos, desechar el contenido de la celda y el resto de la solucin del inciso n en el contenedor etiquetado como R1.
NOTA: Todo material de vidrio que estuvo en contacto con muestras sanguneas deber ser inactivado con NaClO previamente a su lavado. 11. Clculos: Hemoglobina total (Hbt) en g/100 mL = A3 x 37.4 Metahemoglobina total (MHbt) en g/100 mL = (A1 - A2) 23.4 Porcentaje de MHb en sangre total (%MHbt) = (MHbt) x 100/Hbt
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CUESTIONARIO 1. Reporte los resultados grupales en las siguientes tablas: Tabla 1. Lecturas espectrofotomtricas Equipo A1 1 2 3 Tabla 2. Determinaciones de Hb y MHb totales Azul de metileno + SSI NaNO2 NaNO2 Hbt MHbt Hbt MHbt Hbt MHbt (g/100 mL) (g/100mL) (g/100 mL) (g/100mL) (g/100 mL) (g/100mL) SSI A2 A3 A1 NaNO2 A2 A3 Azul de metileno + NaNO2 A1 A2 A3
Eq 1 2 3 Prom SD %CV
Tabla 3. Comparacin del porcentaje de MHb en los diferentes tratamientos SSI NaNO2 Azul de metileno + NaNO2 Equipo %MHbt %MHbt %MHbt 1 2 3 Prom SD %CV 2. Graficar los resultados promedio de Hbt y MHbt para cada tratamiento 3. Graficar los resultados porcentuales de MHbt para cada tratamiento 4. Qu efecto observ en el %MHbt en la rata II? A qu lo atribuye? 5. Qu efecto observ en el %MHbt en la rata III? A que lo atribuye?
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6. Observ algn cambio en la cantidad de Hbt en funcin de los xenobiticos administrados?, Por qu? 7. Por qu es necesario comparar la cantidad de MHbt en valores porcentuales? REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Dreisbach, R. H. y Robertson, W.O. Tratamiento de los envenenamientos. En: Manual de toxicologa clnica, prevencin diagnstico y tratamiento. Editorial El Manual Moderno (6 ed.), Mxico, D.F. 1988, pp 6870. Hall R., Malia, R.G. Investigation of hemolitic anaemias. Medical Laboratory Hematology. Ed. Butterworths, Gran Bretaa. 1984, pp 327333. Klassen, C.D., Watkins, J.B. Casarett & Doull, Manual de Toxicologa. Ed. McGraw-Hill Interamericana (5 ed.), Mxico. 2001, pp 394395. Stahr, H. M. Inorganic and other Analisis. Analitical Methods in toxicology. Ed. John Wiley and sons, inc., USA. 1991, pp 57.
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APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. Efectos txicos de una intoxicacin por nitritos. 2. Efectos txicos de una intoxicacin con azul de metileno. 3. Esquema que explique el efecto protector del azul de metileno en una intoxicacin por nitritos. 4. Fundamento de los mtodos analticos para determinar hemoglobina total y metahemoglobina en sangre. 5. Especies que se determinan en A1, A2 y A3. 6. Propsito de agregar la solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.6, NH4OH en el paso k de su tcnica, K3[Fe(CN)6] y KCN. APNDICE II: PREPARACIN DE SOLUCIONES a) Solucin amortiguadora de fosfatos pH = 6.6. Realizar una primera solucin amortiguadora de fosfatos, disolviendo 3.8 g de fosfato disdico anhdro (Na2PO4) y 5.44 g de fosfato monopotsico anhdro (KHPO4) en 1000 mL de agua destilada. Mezclar una parte de la solucin anterior con tres partes de agua destilada y ajustar el pH a 6.6. b) Solucin de cianuro de potasio neutralizada.(KCN) Mezclar una parte de una solucin de cianuro al 10% y otra parte de cido actico glacial al 12% (v/v).
NOTA: Tanto el cianuro de hidrgeno como los cianuros slidos o en disolucin son txicos por absorcin por la piel, ingestin e inhalacin. c) Solucin de ferricianuro de potasio al 20%. (K3[Fe(CN)6]) Preparar 10 mL de sta solucin.
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d) Solucin Salina Isotnica (SSI) Preparar 50 mL de sta solucin o comprar una presentacin comercial. e) EDTA al 10%. (Preparar slo en caso de no haber heparina, consultar con el laboratorista o el profesor) Pesar 1 g de EDTA y disolver en agua destilada, aforar a 10 mL. f) Solucin de nuevo azul de metileno en SSI (4 mg/mL) Preparar 10 mL de sta solucin, pesando 40 mg de nuevo azul de metileno y disolviendo en 10 mL de SSI. g) Solucin de nitrito de sodio (NaNO2) en SSI (100 mg/mL) Preparar 10 mL de sta solucin, pesando 1 g de NaNO2 y disolvindolos en 10 mL de solucin salina isotnica. APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS R1: Solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.6, KCN, NH4OH, K3[Fe(CN)6] y residuos de sangre.
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DETERMINACION DE MALATION RESIDUAL OBJETIVO ACADMICO Que el alumno sea capaz de extraer y cuantificar un xenobitico empleando sus propiedades cido-base y reacciones de degradacin. PROBLEMA Cuantificar malatin residual en la superficie de vegetales comestibles y reportar un porcentaje de recuperacin mayor o igual al 75% en la muestra control. Relacionar la cantidad de insecticida presente en ambas muestras con el riesgo toxicolgico de su consumo.
MATERIAL VEGETAL Traer por equipo 50 g de cscara de limn, calabaza chayote; o bien 50 g de hojas externas de col o coliflor.
MATERIAL POR EQUIPO Frasco de vidrio de boca ancha con tapa (traer por equipo) Pipeta volumtrica de 10 mL Pipeta graduada de 1 mL Pipeta graduada de 5 mL Pipeta graduada de 10 mL Embudo de filtracin rpida Probeta graduada de 50 mL 2 1 3 2 2 2 1 Probeta graduada de 25 mL Tubo de ensaye de 16 x 150 Vasos de precipitado de 100 mL Propipeta Soporte universal con anillos de fierro Embudo de separacin de 125 mL Papel filtro
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1 2 2 1 2 2
MATERIAL PARA LA CURVA Embudo de separacin de 125 mL Tubo de ensaye de 16 x 150 Embudo de filtracin rpida 3 3 3 Pipeta graduada de 5 mL Vasos de precipitado de 100 mL 1 3
REACTIVOS Sulfato de sodio* (NaSO4) Hidrxido de sodio* (NaOH) Cloruro frrico* (FeCl3) Sulfato cprico* (CuSO4) Acetona * Ver APNDICE II DESARROLLO EXPERIMENTAL 1. Colocar 25 g del material de estudio (nicamente la cscara o superficie del vegetal) en un frasco de vidrio de boca ancha y aadir 30 mL de CCl4, tapar y agitar vigorosamente durante 5 minutos. 2. 3. Filtrar y recolectar cuando menos 20 mL. (Medir el volumen exacto con una probeta). Desechar el material vegetal tratado con CCl4 colocndolo sobre un papel peridico, identificar como R1 y colocar en la campana. Al finalizar la sesin los responsables de seguridad e higiene debern colocar R1 en una bolsa de plstico y cerrarla. 4. Preparar un tubo problema con 10 mL del extracto filtrado midiendo con pipeta volumtrica. Adicionar a cada tubo 0.2 mL de solucin de CS2 al 0.5% y 5 mL de etanol. Pasar esta mezcla a un embudo de separacin y agitar suavemente. 5. Adicionar 15 mL de solucin cida de Na2SO4 al 9% y agitar cuidadosamente el embudo por 1 minuto. Malatin al 50% Fenoftalena* Etanol (EtOH) Tetracloruro de carbono (CCl4) Disulfuro de carbono (CS2)
40
6.
Colectar la fase orgnica en un vaso de precipitado y filtrarla transfirindola nuevamente al embudo de separacin enjuagado previamente con acetona. Etiquetar la fase acuosa como R2.
7.
Aadir 5 mL de etanol, agitar y aadir 0.2 mL de NaOH 6N. Agitar nuevamente por 5 minutos, dejar reposar durante 1 minuto y adicionar 15 mL de solucin de Na2SO4 al 9%. Mezclar, separar las fases, recolectar la fase acuosa y desechar la fase orgnica etiquetndola etiquetar como R3.
8.
Aadir 5 mL de CCl4 a la fase acuosa y una gota de indicador fenoftalena al 1%. Neutralizar gota a gota con HCl 6N con agitacin continua hasta la desaparicin del color azul violeta.
9.
Aadir 0.2 mL de solucin de FeCl3, agitar y desechar la fase orgnica en el recipiente etiquetado como R3.
10. Aadir a la fase acuosa 5 mL de CCl4 y 0.3 mL de solucin de CuSO4 al 3.5% y agitar. Colectar la fase orgnica y desechar la fase acuosa etiquetndola como R4. 11. Leer la fase orgnica en el espectrofotmetro a 416 nm, ajustando previamente a 100% de transmitancia con CCl4. 12. Una vez que se obtengan los resultados finales desechar la fase orgnica etiquetndola como R5. PROCEDIMIENTO PARA LA CURVA PATRN Preparar la curva patrn de la siguiente forma: Tabla 1. Procedimiento para la curva patrn de malatin Tubo 1 2 3 Reactivos 1 mL de solucin patrn de malatin + 4 mL de etanol 2.5 mL de solucin patrn de malatin + 2.5 mL de etanol 5.0 mL de solucin patrn de malatin Concentracin 8 g/mL 20 g/mL 40 g/mL
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Colocar el contenido de cada tubo en un embudo de separacin. Adicionar 10 mL de CCl4 y 0.2 mL de solucin de CS2 al 0.5%. Agitar suavemente y continuar el procedimiento como en la muestra a partir del inciso 5.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Adrien. A. Selective Toxicity: the physicochemical basis of therapy. Ed. Chapman and Hall (6a ed.), London, 1979, pp 455463. CremLyn, C. Pesticides and mode of action, John Wiley & Sons, New York, 1978. Katzung. B. Farmacologa Bsica y Clnica. Ed. El Manual Moderno (7 ed.), Mxico. 1999, pp 119121. Klassen, C. D., Watkins, J.B. Casarette & Doull, Manual de Toxicologa. Ed. McGraw-Hill Interamericana, Mxico, 2001, pp 615618, 624-634, 937. Morifusa. E. Organophosphorus pesticides: Organic and Biological Chemistry. CRC Press, Cleveland, 1979, pp 6277, 103, 196199. Negherban, O.W. Handbook of toxicology: Insecticides. W. B. Saunders Comp., E.U.A., 1959, pp 451464. Norris, M.V., Voil, W.A., Averall, P.R. (1954). Colorimetric estimation of malation residues. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2, pp 570. Robertson, W.O., Dreishbad, R.H. Manual de Toxicologa Clnica. Prevencin, Diagnstico y Tratamiento. El Manual Moderno (6 ed.), Mxico, 1987, pp 95104. White-Stevens, R. Pesticides in the Enviroment Part I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, 1971.
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CUESTIONARIO 1. Reporte sus resultados en la siguiente tabla: Tabla 1. Resultados Malatin (g/mL) %Transmitancia Absorbancia 8 20 40 Muestra 1 Muestra 2 Pendiente (m) Ordenada al origen (b) Coeficiente de correlacin lineal (r) 2. Explique por qu se determinan las lecturas en transmitancia. 3. Indique el procedimiento que sigui para realizar los clculos de concentracin de malatin en sus muestras. 4. Reporte los resultados grupales en la siguiente tabla: Tabla 2. Resultados grupales Malatin Rendimiento Malatin en la (g/mL) muestra (ppm)
---
Equipo 1 2
Material vegetal
Riesgo txico*
---
3
---
* Alto 8 ppm; bajo < 8 ppm 5. De acuerdo a los resultados obtenidos concluya si existe un riesgo toxicolgico por el consumo del material vegetal analizado. 6. En caso de encontrar una baja concentracin en alguna de las muestras. Comente como influira cada uno de estos factores en el resultado del anlisis: A) estabilidad del
compuesto, B) el desarrollo experimental realizado, C) cumplimiento de las normas de aplicacin del pesticida en cuestin. APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. Usos y propiedades biolgicas del malatin. 2. Ventajas que organoclorados. 3. Mecanismo de toxicidad del malatin en el insecto. 4. Mecanismo de potenciacin del efecto txico del malatin en insectos. 5. Enzimas involucradas en la destoxificacin del malatin en insectos y en mamferos. 6. Comparacin de los valores de DL50 para mamferos y para insectos. 7. Propsito de adicionar los siguientes reactivos: CCl4, CS2, EtOH, solucin cida Na2SO4 al 9% , NaOH, solucin Na2SO4 9%, fenoftalena, HCl, FeCl3 y CuSO4. 8. Dibuje la reaccin que se lleva a cabo con el malatin en medio bsico y presencia de etanol . 9. Estructura del compuesto de coordinacin que se forma durante la prctica con los productos de la reaccin anterior y el catin Cu2+, Relacin matemtica entre absorbancia y transmitancia. 10. Lmites permitidos de acuerdo a la NOM vigente para el malatin. APNDICE II: PREPARACIN DE REACTIVOS Solucin patrn de malatin 40 g/mL Medir 0.1 mL de malatin al 50% y aforar con etanol a 100 mL. De esta solucin medir 8 mL y aforar a 100 mL con etanol. presentan los pesticidas organofosforados con relacin a los
Nota: El malatin es inhibidor de la colinesterasa y se absorbe fcilmente por piel y vias respiratorias, se debe extremar cuidado con su contacto directo. Sus efectos agudos incluyen convulsiones, coma y fallo respiratorio.
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Disulfuro de carbono al 0.5% (CS2) Para preparar 100 mL, medir 0.5 mL de CS2 y aforar a 100 mL con CCl4. Nota: El CS2 es altamente txico, se absorbe por piel y vas respiratorias. Sus efectos txicos incluyen irritacin de membranas, nausea, vmito, prdida de conocimiento y convulsiones. Sulfato de sodio al 9% (Na2SO4) Para preparar 100 mL, pesar 9 g de Na2SO4 y aforar a 100 mL con agua destilada.
Solucin cida de sulfato de sodio A 100 mL de solucin de Na2SO4 al 9% adicionar 3 mL de HCl concentrado.
Hidrxido de sodio 6N (NaOH) Para preparar 100 mL, pesar 24 g de NaOH y aforar a 100 mL con agua destilada.
cido clorhdrico 6N (HCl) Para preparar 100 mL, medir 48.5 mL de HCl concentrado y aforar a 100 mL con agua destilada.
Cloruro frrico al 5% (FeCl3) Para preparar 100 mL, pesar 5 g de FeCl3 y disolver en 1 mL de HCl 6N, aforar a 100 mL con agua destilada.
Sulfato cprico al 3.5% (CuSO4) Para preparar 100 mL, pesar 3.5 g de CuSO4 y aforar a 100 mL con agua destilada.
Fenolftalena al 1% Para preparar 100 mL, pesar 1 g y aforar a 100 mL con EtOH.
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APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS R1: Material vegetal con CCl4 R2: Solucin cida de Na2SO4 al 9% y EtOH R3: CCl4 y subproductos orgnicos de hidrlisis cida R4: CuSO4, FeCl3, Na2SO4, fenoftalena, H2O R5: CCl4 y compuesto de coordinacin de cobre
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DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA QUERCETINA Y EL CIDO NORDIHIDROGUAYARTICO
OBJETIVO ACADMICO Que el alumno sea capaz de determinar la capacidad antioxidante de sustancias qumicas. PROBLEMA Determinar la capacidad antioxidante de la quercetina y el cido nordihidroguayartico mediante la reduccin en la produccin de anin superxido utilizando el sistema xantinaxantina oxidasa-nitroazul de tetrazolio. REACTIVOS Xantina (Xan) Xantina oxidasa (XO) Nitroazul de tetrazolio (NAT) Quercetina cido nordihidroguayartico (ANDG) EQUIPO Balanza analtica Espectrofotmetro MATERIAL POR EQUIPO 4 Tubos Eppendorf 1.5 mL 1 micropipeta de 100-1000 l 1 micropipeta de 10-100 l 1 celda 1 gradilla 1 esptula de cromo nquel 1 nave de pesado 2 matraces de 250 mL Potencimetro Carbonato de sodio (Na2CO3) Bicarbonato de sodio (NaHCO3) EDTA Nitrato de cobre (Cu(NO3)2)
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DESARROLLO EXPERIMENTAL 1. Todo el material de vidrio deber ser enjuagado previamente con EDTA. 2. Marcar 4 tubos Eppendorf como control positivo (C+), control negativo (C-), quercetina y ANDG. 3. Preparar los tubos de acuerdo a la siguiente tabla, siguiendo el orden de adicin indicado en la columna reactivo. Tabla 1. Preparacin de los tubos problema y control Tubo Reactivo a. Xantina b. EDTA c. Solucin amortiguadora d. NBT e. Antioxidante f. XO* g. Agitar e Incubar ** h. Cu(NO3)2 Control positivo (L) 100 100 300 300 300 1h 200 Control negativo (L) 100 100 600 300 1h 200 Antioxidante 0.25 M quercetina (L) 100 100 200 300 100 300 1h 200 ANDG (L) 100 100 200 300 100 300 1h 200
* Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo.** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversin e incubar a 24-30C
4. Transcurrido el tiempo de incubacin leer las diferentes muestras a 560 nm empleando como blanco una solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2. 5. Interpretar los resultados obtenidos considerando que el control positivo representa el 100% de formazn en el sistema Xan-XO-NAT de acuerdo a la siguiente frmula. % atrapamiento= 100 - [(AM) x100/A C+] En donde: AM= absorbancia de la quercetina y/o ANDG A C+= absorbancia del control positivo 6. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como R1. 7. Depositar las puntas y los tubos Eppendorf en un contenedor proporcionado por el profesor.
CUESTIONARIO 1. Reporte sus resultados en la siguiente tabla: Tabla 1. Resultados por equipo Control positivo (C+) Absorbancia % Atrapamiento
2.
quercetina
ANDG
0%
Cul de los dos antioxidantes muestra una mayor capacidad atrapadora del radical O2estrs oxidante?. Justifique su respuesta.
3. Considera que el consumo habitual de estos antioxidantes contribuira a disminuir el 4. Reporte los resultados grupales en la siguiente tabla: Tabla 2. Resultados grupales Equipo 1 2 3 4 promedio desviacin estndar % de Atrapamiento quercetina ANDG
4. En caso de que los resultados grupales muestren una elevada variabilidad discutan a que factores se podra atribuir ese comportamiento.
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BIBLIOGRAFA Cadenas, E. Packer L. Handbook of Antioxidants. Marcel Dekker, Inc., New York, 2002. Klaassen, C.D., Watkins, J.B. Manual de Toxicologa de Casarett & Doull: la ciencia bsica de los txicos. (5 ed.) McGraw-Hill, Mxico, 2001. Klassen, C.D. Casarett and Doulls Toxicologia. La ciencia de los venenos. (6a ed.). Ed. Mc Graw Hill, Interamericana 2001. Martnez-Flrez, S., Gonzlez-Gallego, J., Culebras, J. M., y Tun, M. J. (2002). Los flavonoides: propiedades y acciones antioxidantes. Nutricin Hospitalaria. XVII, 271278. Owena, P.L., Johns, T. (1999). Xanthine oxidase inhibitory activity of northeastern north American plant remedies used for gout. Journal of Ethnopharmacology 64, 149160. Tsutomu, K., Susumu, T., Hidetaka, N., et al. (2003). A novel and potent biological antioxidant, kinobeon A, from cell culture off sunflower. Life Sciences 74, 8797. Wardman, P., (2007). Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosactive species in cells and tissues: Progress, pitfalls, and prospects. Free Radical Biology & Medicine 43, 9951022. World Health Organization monographs on selected medicinal plants. Volume 1. 1999, Geneva. Pp 16-32.
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APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. Definicin del proceso de estrs oxidante. 2. Reaccin catalizada por la XO. 3. Concepto de radical libre y especies reactivas. 4. Concepto de antioxidante. 5. Reaccin de Fenton. 6. Propsito de la adicin secuencial de: xantina, EDTA, solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2, nitroazul de tetrazolio, XO y Cu(NO3)2. 7. Completar los productos en el siguiente diagrama.
8. Especie qumica que absorbe a 560 nm. APNDICE II: PREPARACIN DE REACTIVOS
1. Xantina 1.5 mM Pesar 22.7 mg de xantina, agregar Na2CO3 0.4 M hasta solubilizar y aforar a 50 mL con solucin amortiguadora de carbonatos.
2. Solucin amortiguadora de bicarbonato de sodio-carbonato de sodio 84 mM, pH 10.2 Pesar 970 mg de NaHCO3 y 1.01 g de Na2CO3, disolverlos con agua destilada. Ajustar pH a 10.2 y aforar a 250 mL.
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3. Nitroazul de tetrazolio 0.1 M Pesar 41 mg de nitroazul de tetrazolio y aforar a 50 mL con agua destilada. Guardar la solucin en un frasco mbar en el refrigerador.
4. EDTA 0.1 mM Pesar 33.6 mg de EDTA, disolver con agua destilada, aforar a 1L.
5. Xantina oxidasa La enzima se preparar durante la sesin de laboratorio de acuerdo a la indicacin de los profesores.
6. Nitrato de cobre 0.2 mM (Cu(NO3)2) Pesar 4 mg de Cu(NO3)2 y aforar a 100 mL con agua destilada. 7. Quercetina 0.25 M Pesar 1.4 mg de quercetina y aforar a 250 mL con solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2 (solucin stock). 8. ANDG 0.25 M Pesar 1.3 mg de ANDG y aforar a 250 mL con solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2 (solucin stock) APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS R1: xantina, xantina oxidasa, EDTA, solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2, nitroazul de tetrazolio, quercetina, cido nordihidroguayartico, Cu(NO3)2, formazn, cido rico, H2O2.
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EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD GENOTXICA DE LA CICLOFOSFAMIDA UTILIZANDO LA TCNICA DE MICRONCLEOS EN MDULA SEA
OBJETIVO ACADMICO Que el alumno sea capaz de determinar la actividad genotxica de un xenobitico empleando la tcnica de cuantificacin de microncleos en mdula sea de ratn. PROBLEMA Identificar la presencia de microncleos, inducidos por ciclofosfamida, en eritrocitos policromticos de mdula sea murina. ANIMALES DE EXPERIMENTACIN 1 ratn ICR por equipo administrado 24 horas antes con ciclofosfamida con una dosis de 40 mg/Kg i.p. o un ratn ICR control negativo no tratado.
MATERIAL POR EQUIPO Tijeras de diseccin Pinzas de diseccin Bulbo para Pipeta Pasteur Microscopio de Contraste 2 2 4 2 Portaobjetos Pipeta Pasteur 6 4
Contador de clulas 1
REACTIVOS Solucin salina isotnica (SSI) Aceite de inmersin. Solucin amortiguadora de fosfatos pH=6.8 Colorante de giemsa 2 % Etanol (EtOH)
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DESARROLLO EXPERIMENTAL NOTA: El siguiente protocolo requiere que no pasen ms de 30 minutos entre los pasos 1 y 9. 1. Sacrificar al ratn por dislocacin cervical.
2. Una vez muerto el animal de experimentacin fijarlo a la mesa de trabajo. 3. Dislocar la articulacin del fmur con la cadera, estirando las patas traseras del animal.
4. Diseccionar y extraer el fmur cortando por arriba de la cresta iliaca (en la cadera) y por debajo de la rodilla.
5. Limpiar cuidadosamente cada fmur con papel hasta eliminar totalmente todo el tejido muscular. Para facilitar la eliminacin del tejido muscular, tomar la parte que queda debajo de la rodilla y rotarla al lado contrario del movimiento natural de la articulacin de la rodilla y el femur.
6. Una vez limpio, cortar cuidadosamente ambas epfisis y lavar el interior del fmur con 3 mL de SSI empleando una jeringa de 3 mL con aguja del nmero 21. Recolectar y reunir en un mismo tubo de 13 x 100, la mdula de cada fmur.
7. Envolver los restos del animal de experimentacin en una hoja de papel peridico, colocarlos en la caja de contencin para su posterior incineracin. 8. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 min el tubo que contiene la mdula (tubo del inciso 6), extraer el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta Pasteur y resuspender el botn en una gota de SSI. Depositar el sobrenadante en una solucin de hipoclorito de sodio.
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9. Realizar 4 extendidos de la siguiente manera: colocar en la orilla de un portaobjetos una gota de la suspensin de mdula sea y un segundo portaobjetos justo atrs de la gota en ngulo de 45. Dejar que la muestra se distribuya por capilaridad y deslizar suavemente para formar una delgada capa de clulas.
10. Secar completamente los extendidos al aire. 11. Adicionar por goteo EtOH a las laminillas hasta cubrir la superficie y secar al aire. Repetir esta operacin durante 5 minutos.
12. A cada laminilla adicionar dos o tres gotas de colorante giemsa 2% y cubrir con un cubreobjetos, dejar reposar durante 10 minutos.
13. Retirar cuidadosamente el cubreobjetos, y enjuagar la laminilla con agua destilada.
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14. Cubrir la laminilla con solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.8 durante 5 minutos. 15. Enjuagar la laminilla una vez ms con agua destilada y secar al aire. 16. Observar al microscopio con aceite de inmersin, y registrar los siguientes datos: El nmero de eritrocitos policromticos por cada 200 eritrocitos totales. El nmero de eritrocitos policromticos micronucleados por cada 1000 eritrocitos policromticos.
Eritrocito Policromtico Micronucleado Eritrocito Normocromtico Eritrocito Policromtico Eritrocito Normocromtico Micronucleado
NOTA: Debido a que el conteo de los microncleos se debe realizar al ciego, el alumno no sabr hasta el final de la prctica si el animal de experimentacin proporcionado ha sido tratado o no con ciclofosfamida.
CUESTIONARIO 1. Con base a la experiencia adquirida, indique dos caractersticas que le permitan identificar un microncleo y diferenciarlo de un artefacto producto de la tincin. 2. Reporte sus resultados en la siguiente tabla: Tabla 1. Resultados por equipo EPCa/ ETb EPCMNc/ EPC Laminilla 1 Laminilla 2 Laminilla 3 Laminilla 4 Sumatoria /200 ET /1000 EPC a) EPC: Eritrocitos policromticos, b) ET: Eritrocitos totales, c) EPCMN: Eritrocitos policromticos micronucleados 3. Reporte los resultados grupales en la siguiente tabla: Tabla 2. Resultados grupales Ciclofosfamida EPCa/ ETb EPCMNc/ EPC
Promedio
/200 ET
/1000 EPC
Datos tericos de los individuos control Control (-) n=3 Promedio 116/200 ET 5/1000 EPC cociente 0.58 0.005 SD 0.0006 0.0006 a) EPC: Eritrocitos policromticos, b) ET: Eritrocitos totales, c) EPCMN: Eritrocitos policromticos micronucleados 4. Realice una comparacin estadstica mediante (t-student) entre los dos grupos y concluya si existen diferencias significativas como para considerar un dao genotxico.
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5. Con el protocolo empleado y los resultados obtenidos Podra establecer si el dao genotxico ocasionado por la ciclofosfamida fue clastognico o aneuploidgeno?. Explique su respuesta. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Andreoli, C., Gigante, D., Nunziata A. (2003). A review of in vitro methods to assess the biological activity of tobacco smoke with the aim of reducing the toxicity of smoke. Toxicology in Vitro 17, 587594. EPA (US Environmental Protection Agency), Health Effects Test Guidelines OPPTS 870.5395, Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test, Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances (7101) EPA 712-C-98-226, August 1998. (Ver: www.epa.gov/opptsfrs/publications/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test _Guidelines/Series/870-5395.pdf.) Hessel, H., Radon K., Pethran A., Maisch, Bettina., Grbmair, S., Sautter, I., Fruhmann, G. (2001). The genotoxic risk of hospital, pharmacy and medical personnel occupationally exposed to cytostatic drugs evaluation by the micronucleus assay. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 497, 101109. Kirsch-Voldersa M., Elhajoujia A., Cundaria E., Hummelenb P.V. (1997). The in vitro micronucleos test: a multi-endpoint assay to detect simultaneously mitotic delay, apoptosis, chromosome breakage, chromosome loss and non-disjunction. Mutation Research 392, 19-30. Konopacka, M. (1994). Evaluation of frequency of micronuclei in exfoliated cells from bladder of mice treated with benzo(a)pyrene, 2-acetylaminofluorene and cyclophosphamide. Cell Biology International 18, 669672. Krishna, G., Hayashi, M. (2000). In vivo Rodent Micronucleus Assay: Protocol, Conduct And Data Interpretation. Mutation Research 455, 155166. Pastor, S., Gutirrez S., Creus, A., Cebulska-Wasilewska A., Marcos R. (2001). Micronuclei in peripheral blood lymphocytes and buccal epithelial cells of Polish farmers exposed to pesticides. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 495,147156. Proudlock, R.J., Statham J., Howard W. (1997). Evaluation of the rat bone marrow and peripheral blood micronucleus test using monocrotaline. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 392, 243249.
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APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. Definicin de Eritropoyesis. 2. Concepto de microncleo y proceso de formacin. 3. Diferencia entre dao clastognico y aneuploidgeno y como se pueden diferenciar con la tcnica de microncleos. 4. Fundamento de la tincin de giemsa. 5. Coloracin que adquieren los eritrocitos maduros, inmaduros y micronucleados con el colorante giemsa. 6. Mecanismo de accin genotxico de la ciclofosfamida. 7. Usos clnicos de la ciclofosfamida. 8. Propsito de adicionar: EtOH y solucin amortiguadora de fosfatos pH=6.8. 9. Se determin la actividad genotxica de la daunorrubicina y la apigenina en sangre perifrica de ratn, administrando grupos de 15 animales para cada tratamiento. Los xenobiticos en estudio se administraron a 2.5 mg/kg, mientras que el grupo control fue administrado con SSI, obteniendo los siguientes resultados: Tabla 1. Promedio de nmero de microncleos por cada tratamiento Grupo SSI daunorrubicina apigenina Microncleos/1000 clulas 0.5 0.33 18.6 0.62 1.6 0.80
Realice una comparacin estadstica (t-student) de los grupos tratados respecto al control y concluya si existen diferencias significativas que sean indicativas de dao genotxico.
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Tabla 2. t-student
Grados de libertad 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 40 60 120 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.025 0.01 0.005
1.000 0.816 0.765 0.741 0.727 0.718 0.711 0.706 0.703 0.700 0.697 0.695 0.694 0.692 0.691 0.690 0.689 0.688 0.688 0.687 0.686 0.686 0.685 0.685 0.684 0.684 0.684 0.683 0.683 0.683 0.681 0.679 0.677 0.674
1.376 1.061 0.978 0.941 0.920 0.906 0.896 0.889 0.883 0.879 0.876 0.873 0.870 0.868 0.866 0.865 0.863 0.862 0.861 0.860 0.859 0.858 0.858 0.857 0.856 0.856 0.855 0.855 0.854 0.854 0.851 0.848 0.845 0.842
1.963 1.386 1.250 1.190 1.156 1.134 1.119 1.108 1.100 1.093 1.088 1.083 1.079 1.076 1.074 1.071 1.069 1.067 1.066 1.064 1.063 1.061 1.060 1.059 1.058 1.058 1.057 1.056 1.055 1.055 1.050 1.046 1.041 1.036
3.078 1.886 1.638 1.533 1.476 1.440 1.415 1.397 1.383 1.372 1.363 1.356 1.350 1.345 1.341 1.337 1.333 1.330 1.328 1.325 1.323 1.321 1.319 1.318 1.316 1.315 1.314 1.313 1.311 1.310 1.303 1.296 1.289 1.282
6.314 2.920 2.353 2.132 2.015 1.943 1.895 1.860 1.833 1.812 1.796 1.782 1.771 1.761 1.753 1.746 1.740 1.734 1.729 1.725 1.721 1.717 1.714 1.711 1.708 1.706 1.703 1.701 1.699 1.697 1.684 1.671 1.658 1.645
12.706 4.303 3.182 2.776 2.571 2.447 2.365 2.306 2.262 2.228 2.201 2.179 2.160 2.145 2.131 2.120 2.110 2.101 2.093 2.086 2.080 2.074 2.069 2.064 2.060 2.056 2.052 2.048 2.045 2.042 2.021 2.000 1.980 1.960
31.821 6.965 4.541 3.747 3.365 3.143 2.998 2.896 2.821 2.764 2.718 2.681 2.650 2.624 2.602 2.583 2.567 2.552 2.539 2.528 2.518 2.508 2.500 2.492 2.485 2.479 2.473 2.467 2.462 2.457 2.423 2.390 2.358 2.326
63.657 9.925 5.841 4.604 4.032 3.707 3.499 3.355 3.250 3.169 3.106 3.055 3.012 2.977 2.947 2.921 2.898 2.878 2.861 2.845 2.831 2.819 2.807 2.797 2.787 2.779 2.771 2.763 2.756 2.750 2.704 2.660 2.617 2.576
61
APNDICE II: PREPARACIN DE REACTIVOS
Solucin salina isotnica (SSI) Para preparar 100 mL, se pesan 0.9 g de NaCl y se disuelven en 100 mL de agua destilada; o bien, puede utilizarse la solucin comercial.
Solucin amortiguadora de fosfatos Na2 HPO4 .....................2.56 g KH2 PO4........................6.63 g Agua destilada (cuanto baste para un litro)
Giemsa al 2% Tomar 2 mL de giemsa comercial y diluir en 100 mL de agua destilada.
62
EFECTOS TXICOS DE LA ADMINISTRACIN DE PLOMO EN RATAS
OBJETIVO ACADMICO Que el alumno visualice el dao macroscpico ocasionado en hgado y bazo de ratas administradas de forma sub-aguda con diferentes dosis de acetato de plomo por va i.p. Relacionar dicho dao con las alteraciones que se presentan en la morfologa de los eritrocitos y en los valores del hematocrito (Hto), hemoglobina total (Hbt) y hemoglobina libre (Hbl). PROBLEMA Identificar cul de las dos soluciones de acetato de plomo causa mayor dao en las ratas, al relacionar los resultados encontrados macroscpicamente en el hgado y bazo, con los encontrados microscpicamente en los eritrocitos y en la cuantificacin del Hto, Hbt, y Hbl DESARROLLO EXPERIMENTAL El trabajo experimental se desarrollar por equipos en 4 sesiones de laboratorio.
ANIMALES DE EXPERIMENTACIN (POR EQUIPO PARA LAS CUATRO SESIONES) 3 ratas del mismo sexo y peso entre 180 y 300 g.
MATERIAL POR EQUIPO Balanza para animales Caja de contencin Algodn 3 jeringas para INSULINA (traer por cada sesin) Traer marcadores de tinta permanente color rojo, negro y azul Perforador (primera sesin)
63
REACTIVOS Acetato de plomo (Pb(CH3COO)2) Solucin salina isotnica (SSI) Hipoclorito de sodio al 6% (NaClO) PROCEDIMIENTO SESION I (PRIMERA ADMINISTRACIN) 1. 2. Cada equipo contar con 3 ratas. Pesar e identificar mediante tincin en la cola y perforaciones en la oreja, previa anestesia con ter, a cada una de las ratas. Nota: El profesor indicar el color con el que se deber marcar las colas de las ratas en cada equipo y que numeracin se asignar a cada una de las ratas, de acuerdo con el siguiente cdigo. ter etlico Etanol (EtOH)
8
Unidades = Oreja derecha Decenas = Oreja izquierda
10
3. A cada equipo se le proporcionar 3 soluciones etiquetadas como solucin A, B, y SSI. 4. A cada rata se la administrar por va intraperitoneal, un volumen de 0.5 mL de la solucin que le corresponda. PROCEDIMIENTO PARA LA SESION II Y III (SEGUNDA Y TERCERA ADMINISTRACIN) 1. Pesar a cada una de las ratas. 2. A cada rata se la administrar un volumen de 0.5 mL de la solucin que le corresponda por va intraperitoneal.
PROCEDIMIENTO PARA LA SESION IV MATERIAL POR EQUIPO Navaja para bistur con porta bistur 1 Gradilla Tijeras de diseccin Caja de contencin Jeringas de 5 mL Tubos capilares Portaobjetos Pipetas volumtricas de 5 mL Vaso de precipitados de 250 mL Micropipeta REACTIVOS Nuevo azul de metileno Solucin de heparina 1000 UI o EDTA al 10 % Colorante de Wrigth Solucin patrn de cianometahemoglobina (CNMHb) Perxido de hidrgeno al 1% (H2O2) EQUIPO Centrfuga para microhematocrito Microscopio de inmersin DESARROLLO EXPERIMENTAL 1. 2. Preparar 3 jeringas con 0.1 mL de solucin de heparina o EDTA al 10%. Marcar 3 tubos de ensayo de 13 x 100 con el nmero de la rata que corresponda y agregar 0.1 mL de heparina 0.5 mL de EDTA al 10 % como anticoagulante.
Pinza de diseccin Tubos de ensayo de 13 x 100 Tabla de diseccin Pipetas graduadas de 10 mL Tubos de ensayo de 16 x 150 Vasos de precipitados de 100 mL Algodn Celdas de vidrio Cajas de Petri Pipeta graduada de 1 mL
1 15 1 2 5 2 2 4 1
1 1 1 5 8 16 2 1 1
Reactivo de Drabkin ter etlico Etanol (EtOH) Bencidina al 1% Solucin salina isotnica (SSI)
Espectrofotmetro Centrfuga
3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Anestesiar las ratas con ter etlico y mediante puncin cardiaca obtener un volumen de 3 mL de sangre de cada una de las ratas. Quitar la aguja de la jeringa y transferir la sangre inmediatamente al tubo de 13 x 100 correspondiente. Mezclar perfectamente con el anticoagulante por inversin del tubo. Sacrificar la rata por dislocacin cervical. Llenar dos capilares con la sangre obtenida en el inciso 4 para calcular el hematocrito de acuerdo a lo indicado en la seccin de tcnicas experimentales. Realizar dos frotis de cada una de las muestras sanguneas con colorante de Wright de acuerdo a la seccin de tcnicas experimentales. Realizar dos frotis de cada una de las muestras sanguneas con colorante nuevo azul de metileno (NAM) de acuerdo a la seccin de tcnicas experimentales. Realizar la cuantificacin de hemoglobina total de acuerdo a la seccin de tcnicas experimentales: Una vez realizadas las determinaciones anteriores, centrifugar cada uno de los tubos con la sangre restante a 2500 rpm x 5 min y separar el plasma del paquete celular. Determinar hemoglobina libre en plasma segn la seccin de tcnicas experimentales. Colocar el tubo con el paquete celular residual en un contenedor con hipoclorito de sodio.
10. Hacer una incisin en la parte media del abdomen y extraer el bazo y el hgado de cada rata. Colocar los rganos en cajas de Petri con SSI, para evitar su deshidratacin. Observar y comparar los rganos con respecto a la rata control. 11. Envolver los restos de los animales de experimentacin en una hoja de papel peridico y colocarlos en la caja de contencin para su posterior incineracin. TCNICAS EXPERIMENTALES TCNICA DE MICROHEMATOCRITO 1. 2. Llenar con sangre las 2/3 partes de un tubo capilar para cada muestra. Realizar esta operacin por duplicado. El extremo vaco se cierra con calor.
66
3. 4.
Colocar los capilares con el extremo cerrado hacia fuera en los surcos radiales de la centrfuga para microhematocrito y centrifugar a 11000 rpm x 10 min. Calcular el hematocrito midiendo la altura del paquete globular (M2) en relacin con la altura total de la muestra (M1) y expresarla en %.
M1 _________ 100 % M2_________ X% M1 M2
5.
Una vez obtenido los resultados depositar los capilares en el contenedor para residuos peligrosos biolgico-infecciosos (RPBI).
TINCIN DE WRIGHT 1. Hacer un frotis de cada muestra, de la siguiente forma:
Muestra de sangre
2
A. Poner una pequea gota de sangre sobre el portaobjetos 1 y colocar el portaobjetos 2 en
B. Mediante un movimiento uniforme deslizar el portaobjetos 2 sobre el 1
C. Para formar una monocapa uniforme de clulas
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2. 3. 4.
Dejar que los extendidos sequen al aire. Adicionar por goteo EtOH a las laminillas hasta cubrir la superficie y secar al aire. Repetir esta operacin durante 5 minutos. Cubrir el portaobjetos por completo con el colorante de Wright. Transcurridos 5 minutos, enjuagar con agua destilada y dejar secar. Depositar los residuos de la tincin en un frasco etiquetado como R1.
5.
Observar los frotis al microscopio con el objetivo 100x, usando aceite de inmersin.
TINCIN CON NUEVO AZUL DE METILENO 1. 2. 3. 4. Agregar con una pipeta Pasteur 3 gotas de sangre y 3 de colorante a un tubo de 13 x 100 y mezclar. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 5 min. Colocar una gota de la mezcla anterior en un portaobjetos y hacer un frotis siguiendo la tcnica descrita la metodologa de la tincin de Wright. Dejar secar al aire. Observar los frotis al microscopio con el objetivo 100x, usando aceite de inmersin. Colocar los tubos en el contenedor con hipoclorito de sodio y lavar.
CUANTIFICACIN DE HEMOGLOBINA TOTAL 1. Preparar 5 tubos de acuerdo a la siguiente tabla, agitando cuidadosamente despus de la adicin de cada reactivo y dejar reposar 10 min. Tabla 1. Cuantificacin de Hbt Tubo REACTIVO (mL) SOLUCIN DE REFERENCIA MUESTRA DRABKIN 2. 3. -------5 0.02 ---5 ---5 ---5 ---5 0.02 0.02 0.02 Blanco Referencia* A B SSI
*Consultar la concentracin de la solucin de referencia en la etiqueta del frasco Ajustar la absorbancia a cero con el blanco y leer a 540 nm. Calcular la concentracin de Hbt en g/dL empleando la siguiente frmula: Hbt = Aprob*(Cref./Aref.)
Donde: Cref. = concentracin de la solucin de referencia (g/dL) Aprob = absorbancia del problema Aref. = absorbancia de la solucin de referencia 4. Una vez ledos colocar el contenido de los tubos en un contenedor etiquetado como R2.
CUANTIFICACIN DE HEMOGLOBINA LIBRE EN PLASMA 1. Marcar 6 tubos de 16 x 150 y trabajar segn la siguiente tabla: Tabla 2. Cuantificacin de Hbl A Bencidina 1% Plasma Estndar Agua destilada H2O2 1% cido 10% *Preparar una solucin estndar de hemoglobina con una concentracin de 150 mg/L a partir de la solucin estndar de hemoglobina total. 2. Mezclar y dejar reposar 10 min a temperatura ambiente, leer a 515 nm. Abs. del problema mg de Hbl = ----------------------------Abs. del estndar 1.0 mL 0.02 mL ----------1.0 mL actico 10.0 mL B 1.0 mL 0.02 mL ----------1.0 mL 10.0 mL C 1.0 mL 0.02 mL ----------1.0 mL 10.0 mL SSI 1.0 mL 0.02 mL ----------1.0 mL 10.0 mL Solucin Estndar* 1.0 mL -----0.02 mL -----1.0 mL 10.0 mL 1.0 mL ----------0.02 mL 1.0 mL 10.0 mL Blanco
Mantener los tubos a temperatura ambiente durante 20 minutos
Clculos:
* concentracin del estndar (mg/L)
3.
Una vez ledos colocar el contenido de los tubos en un contenedor etiquetado como R3.
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CUESTIONARIO 1. Reporte sus resultados en la siguiente tabla: Hematocrito* (cm) Rata Absorbancia Hbt Absorbancia Hbl M1 M2 M1 M2 SSI A B *M1 = altura total de la muestras, M2 = altura del paquete globular 2. Con los datos de la tabla anterior, calcule segn la seccin de tcnicas experimentales: Hto, Hbt, Hbl y reporte sus resultados en la siguiente tabla: Rata A B SSI *En los espacios para hgado, bazo, frotis Wrigth, NAM y efecto txico, calificar con cruces el efecto txico, siendo (++) para el de mayor efecto, (+) para el menor y (-) para la ausencia de efecto. 3. 4. 5. 6. Cules fueron las diferencias en las alteraciones morfolgicas en hgado y bazo para cada tratamiento? Cules fueron las diferencias observadas en las clulas sanguneas con respecto al control utilizando las tinciones de Wright y NAM? Qu relacin observ entre las alteraciones morfolgicas de las clulas sanguneas y la proporcin de reticulocitos? Qu relacin observ entre las alteraciones morfolgicas de las clulas sanguneas y los valores de hematocrito encontrados en cada una de las ratas?, Qu relacin observ entre la proporcin de reticulocitos, los valores de Hbl y Hbt? 7. Qu relacin observ entre la proporcin de reticulocitos con los valores obtenidos de Hto?Cmo afect la dosis de la solucin A y B al valor de Hbl y Hbt con respecto al control?
rganos* Hgado Bazo
Frotis* Wrigth NAM
Hto %
Hbt g/dL
Hbl mg/L
Efecto* Txico
8. 9.
Qu relacin observ entre los valores de Hbt y Hbl con el Hto en cada una de las ratas? Concluya qu solucin provoc mayor efecto txico.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Blanke R.V., Decker W.J. Analysis of toxic substances. Textbook of clinical chemistry. Ed. Saunders. Philadelphia. 1986, pp 16701744. Clark E.E. Isolation and Identification of Drugs. Vol. I y II. Ed. Pharmaceutical Press, London. 1972 Klaassen, C.D. Casarett y Doulls Toxicology. The Basic Science of Poisons. (6a ed.). McGraw Hill, New York. 2001, pp 827834. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM- 009- SSA1- 1993. Public information office and Bureau of consumer health. Los peligros del plomo www.kdhe.state.ks.us Torres-Snchez, L., Lpez-Carrillo, L., Ros, C. (1999). Eliminacin del plomo por curado casero. Salud Pblica, Mxico 41, 51065108.
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APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Fundamento de la determinacin de hemoglobina total, por el mtodo de la cianometahemoglobina y el de la hemoglobina libre, por el mtodo de la bencidina. Fundamento de la determinacin del hematocrito, por la tcnica del microhematocrito. Fundamento de la tincin de Wrigth y del Nuevo Azul de Metileno. Influencia de la edad del individuo en la absorcin gastrointestinal del plomo. Tejidos principales de distribucin y depsito del plomo en el organismo. Efectos que ocurren en los eritrocitos cuando la concentracin de plomo rebasa el valor de 80g/dL y que es lo que provoca esta manifestacin. Manifestacin principal en una intoxicacin por plomo en el sistema nervioso central. Sntomas principales de intoxicacin por plomo en el tracto gastrointestinal. Influencia de la edad y el sexo en los niveles de plomo en sangre en los seres humanos.
10. Efectos que producen la anemia que se manifiesta por la intoxicacin por plomo. 11. Vida media del plomo en sangre y huesos. Papel que juegan los eritrocitos en la relacin de concentracin plasma/orina en la eliminacin del mismo. 12. Caractersticas en una intoxicacin crnica (30-50 g/dL) por plomo en los nios. 13. Papel que juega la sal Na2CaEDTA, en dosis de 40 mg/Kg en el diagnstico por intoxicacin por plomo. 14. Medidas teraputicas que se toman en una intoxicacin por plomo y que concentracin plasmtica del mismo debe de estar presente para que se aplique a los nios. APNDICE II: PREPARACIN DE REACTIVOS Solucin salina isotnica (SSI) Puede utilizarse la solucin comercial o preparar una solucin de cloruro de sodio al 0.9 %. Para preparar 100 mL, se pesan 0.9 g de cloruro de sodio y se disuelven en 100 mL de agua destilada.
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Reactivo de Drabkin. (preguntar al profesor si ya est preparado) Bicarbonato de sodio (NaHCO3) Ferricianuro de potasio (K3[Fe(CN)6]) Cianuro de potasio (KCN) Saponina Agua destilada c.b.p. 1.0 g 0.20 g 0.05 g 0.1 g 1000 mL
Nota: El reactivo de Drabkin y la solucin estndar de CNMHb. Contienen derivados de CIANURO, los cuales son txicos, sin embargo las concentraciones de stos estn por debajo de la dosis letal referida a un litro de solucin. Nuevo azul de metileno: (preguntar al profesor si ya est preparado) Nuevo azul de metileno Oxalato de potasio Cloruro de sodio Agua destilada c.b.p. Filtrar antes de usar. 0.5 g 1.40 g 0.80 g 100 mL
Solucin de bencidina al 1% Solubilizar 1 g de bencidina en 100 mL de cido actico al 10%.
Nota: La bencidina es un reactivo considerado como carcinognico por lo que se deben extremar precauciones en su manejo.
Perxido de hidrgeno al 1% cido actico al 10%
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Colorante de Wright (preguntar al profesor si ya est preparado) Utilizar colorante de Wright comercial. Agregar alcohol poco a poco, unos cuantos mililitros cada vez, y mezclar bien con la ayuda de 10 a 20 esferillas de vidrio. Conservar bien tapado para evitar la evaporacin, guardar en un sitio oscuro durante dos o tres semanas, mezclar con frecuencia. Filtrar antes de usarlo. APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS R1: Colorante de Wright, sangre de rata, EtOH. R2: Sangre de rata, NaHCO3, K4[Fe(CN)6], KCN, saponina. R3: Plasma de rata, bencidina, H2O2, cido actico.
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EFECTO DEL pH EN LA LIBERACIN DE METALES PESADOS POR UTENSILIOS DE BARRO VIDRIADO OBJETIVO ACADMICO Que el alumno determine cualitativamente la presencia de plomo en recipientes de cermica a diferentes valores de pH. PROBLEMA Realizar un anlisis cualitativo comparativo de varios tratamientos de curado para vasijas de barro vidriado y sugerir cul de ellos presenta mejores resultados para reducir el contenido de plomo en estos recipientes. Discutir el riesgo de exposicin al plomo liberado por recipientes de barro vidriado en los seres humanos. MATERIALES Vasija de barro vidriado * Tubos de ensayo 13x100 Anillo metlico Papel pH Probeta de 100 mL 6 10 3 3 1 Mechero Rejilla de asbestos Gradilla Pipetas de 1 mL Pinza para tubos 3 3 1 3 1
*Este material debe ser nuevo y del mismo lote, se requiere la cantidad de 6 por cada dos equipos con una capacidad mxima aproximada de 250 mL. REACTIVOS Agua destilada Hidrxido de sodio 1 N (NaOH) Yoduro de potasio (KI) cido clorhdrico (HCl) cido ntrico (HNO3)
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DESARROLLO EXPERIMENTAL 1. Previo a la sesin el profesor indicar a los alumnos los tratamientos de curado a realizar a 3 de las 6 vasijas: Vasija 1 - Ajo: Untar ajo suficiente para cubrir la superficie del interior de la vasija de barro y dejar reposar por un da antes de lavarla con jabn eliminando cualquier residuo que se haya formado, secar. Vasija 2 - Vinagre: Llenar partes de la vasija con vinagre blanco y hervir durante 1 hora, reponiendo el volumen perdido durante esta operacin. Lavar y secar. Vasija 3 - Cal: Agregar una cucharada sopera de CaCO3 comercial por cada 100 mL de agua y hervir durante 1 hora, reponiendo el volumen perdido durante esta operacin. Lavar y secar. 2. Marcar las vasijas no curadas como A, B y C. y reunirlas con las vasijas curadas 1,2 y 3 3. Colocar el volumen necesario en cada una segn el diseo de la siguiente tabla. Tabla 1. Diseo experimental A Solucin HCL, pH 2 Solucin NaOH, pH 10 Agua destilada X X X B C 1 X 2 X 3 X
4. Calentar las vasijas a ebullicin y dejarlas hervir 30 minutos. En caso de que el contenido de agua disminuya considerablemente reponer el volumen perdido con agua. 5. Colocar por separado 0.5 mL de solucin de cada vasija en tubos de ensayos. 6. Enfriar los tubos con ayuda del agua de la llave por la parte exterior, y medir el pH. 7. Agregar a cada tubo tres gotas de HNO3 concentrado.
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8. Agregar a cada tubo, 1 mL de la solucin de yoduro de potasio procurando que la solucin caiga directamente en el contenido del tubo. Agitar por unos segundos, dejar reposar en su gradilla y observar. 9. Una solucin o precipitado amarillo indica la presencia de plomo. Emplee un control negativo con agua destilada y proceda de la misma forma como se indica en los pasos 6 y 7. 10. Una vez obtenidos los resultados vaciar el contenido de los tubos en un contenedor etiquetado como R1. 11. Reunir el contenido de las vasijas con tratamiento cido (A, 1, 2, y 3) en el contenedor etiquetado como R1. 12. Reunir el contenido de las vasijas con tratamiento neutro (C) y bsico (B) en un contenedor etiquetado como R2.
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CUESTIONARIO 1. Reporte sus resultados en la siguiente tabla, indicando la presencia de plomo con cruces: negativo (-), bajo (+), medio (++), alto (+++). Utilice el control negativo como referencia. Tabla 1. Resultados Vasija pH inicial pH final Presencia de plomo A HCl B NaOH C agua destilada 1 ajo 2 vinagre 3 cal 2. Compare los resultados obtenidos entre las vasijas A, B, y C. Concluya que mtodo de extraccin fue ms eficiente. 3. Compare los resultados obtenidos en las vasijas 1, 2 y 3 con la vasija A e indique si hay alguna diferencia. A qu la atribuye? 4. Compare los resultados obtenidos entre las vasijas 1, 2 y 3. Concluya qu mtodo de curado fue ms eficiente. 5. Considera usted que los alimentos contenidos en vasijas de barro podran ser una fuente de exposicin a plomo? 6. Considera que el proceso de curado es suficiente para evitar la exposicin a plomo? Justifique su respuesta. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Blanke R.V. Decker W.J. Analysis of toxic substances. Textbook of clinical chemistry. Philadelphia, Saunders. Pp 1670-1744. 1986. C.D. Klaassen. PhD. Casarett y Doulls. Toxicology. The basic science of poisons. 6th edition. McGraw Hill 2001. Pp 827-834. Clark E. E. Isolation and Identification of Drugs. Pharmaceutical Press, London, 1972 Vol. I y II L. Torres-Snchez, L. Lpez-Carrillo y C, Ros. Eliminacin del plomo por curado casero. Salud Pblica, Mxico. 41:5106 5108 (1999). NORMA OFICIAL MEXICANA NOM- 009- SSA1- 1993. Public information office and Bureau of consumer health. Los peligros del plomo www.kdhe.state.ks.us
APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. Proceso de vidriado de utensilios de barro. 2. Reacciones que se llevan a cabo en las vasijas de barro vidriado A y B durante el proceso de extraccin e identificacin. 3. Precauciones que se pueden aplicar en casa para reducir el riesgo de exposicin a plomo por consumo de alimentos. 4. Cinco alimentos de naturaleza cida y cinco de naturaleza alcalina. 5. Lmite mximo permitido de plomo en utensilios de barro vidriado por la NOM vigente. APNDICE II: PREPARACIN DE REACTIVOS Solucin de HCl pH 2 y solucin de NaOH pH 10 Calcular la cantidad adecuada para preparar la solucin de pH = 2 con HCl y la solucin de pH 10 con NaOH.
Solucin de yoduro de potasio 16.5% (KI) Pesar 16.5 g de KI y colocarlos en un matraz aforado de 100 mL, disolver en aproximadamente 25 mL de agua mezclar y aforar. Esta solucin es sensible a la luz. APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS R1: HCl, HNO3, PbI2, KI R2: NaOH, PbI2
NOTA: El responsable de residuos reunir el contenido de R1 y R2 al finalizar la sesin, tomando las precauciones necesarias y etiquetando el recipiente final.
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DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE ETANOL EN UNA MUESTRA PROBLEMA OBJETIVO ACADMICO Que el alumno realice la determinacin presuntiva y cuantitativa de etanol en muestras problemas mediante un mtodo indirecto. PROBLEMA Cuantificar al menos el 80% de la concentracin de etanol en mg/dL en dos muestras problema y mediante los resultados obtenidos indicar el grado de intoxicacin de los sujetos de los cuales provienen las muestras analizadas. REACTIVOS Dicromato de potasio* (K2Cr2O7) cido sulfrico (H2SO4) * Ver APNDICE II EQUIPO Espectrofotmetro Estufa Balanza analtica MATERIAL Caja de Petri con centro de vidrio Pipeta volumtrica de 2 mL Pipeta volumtrica de 1 mL Tubo de ensayo 16 x 150 Celda de vidrio para espectrofotmetro Pipeta volumtrica de 5 mL 2 3 4 6 2 5 Matraz volumtrico de 10 mL Pinzas para tubo de ensayo Papel filtro ( 2 x 5 cm) Pipeta graduada de 5 mL Pipeta graduada de 1 mL Pipeta Pasteur con globo 3 3 1 3 3 4
Carbonato de potasio* (K2CO3) Etanol (EtOH)
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DESARROLLO EXPERIMENTAL A cada alumno se le proporcionarn 2 muestras problema a las cuales se les realizar la determinacin presuntiva y cuantitativa de etanol. I. Determinacin presuntiva de etanol
1. Rotular 4 tubos como control positivo, control negativo, muestra 1 y muestra 2. 2. Al tubo control positivo agregarle 5 gotas de etanol. 3. Al tubo control negativo agregarle 5 gotas de agua destilada. 4. A los tubos muestra 1 y 2 agregarles 1 mL de cada una de las muestras problema respectivamente. 5. A cada uno de los tubos, adicionarles 0.5 mL de solucin de K2Cr2O7 (Solucin A). 6. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente y observar la coloracin de los tubos. 7. Reunir el contenido de los 4 tubos y confinarlos en un recipiente etiquetado como R1. II. Determinacin cuantitativa de etanol
Centro de vidrio
Esquema 1. Cmara de Conway Cada una de las muestras se tratar de acuerdo al siguiente procedimiento: 1. 2. Colocar 2 mL de la solucin B de K2Cr2O7 en el recipiente B. Adicionar 1 mL de solucin saturada de K2CO3 en el recipiente B, agitando suavemente.
3. 4. 5.
Colocar 1 mL de la muestra problema en el recipiente A y tapar inmediatamente con el recipiente C, como se muestra en el esquema 1. Colocar la cmara de Conway en una estufa a 40 C, durante 45 minutos. Una vez transcurrido el tiempo indicado, transferir el contenido del recipiente B a un matraz volumtrico de 10 mL, lavando perfectamente dicho recipiente y la parte externa del recipiente A con un volumen mximo de 5 mL para ambos recipientes Finalmente aforar a 10 mL con agua destilada (en ocasiones puede aparecer un precipitado que desaparece al aforar con agua destilada).
6. 7.
Determinar la absorbancia a 450 nm, utilizando como blanco agua destilada. Determinar la absorbancia de la solucin B de dicromato de potasio diluida 1 a 10, a 450 nm, utilizando como blanco agua destilada. Esta solucin se utilizar como referencia para realizar los clculos pertinentes.
8.
Confinar el contenido del recipiente B y la solucin de referencia en el frasco etiquetado como R1.
82
CUESTIONARIO 1. Reporte en la siguiente tabla sus resultados de la prueba presuntiva para cada muestra. Tabla 1. Resultados presuntivos Muestra 1 2 Control negativo Control positivo 2. Considera que la intensidad de color en la prueba presuntiva es un indicador de la concentracin de EtOH en sus muestras? 3. Proponga una modificacin a la tcnica presuntiva que le permita emplearla como prueba cuantitativa. 4. Indique las lecturas de absorbancia obtenidas para cada muestra. Calcular la concentracin de etanol en la muestra en mg/dL, desglosando los clculos realizados para cada una de las muestras tomando en cuenta la lectura de absorbancia de la solucin de referencia. Considere todas las diluciones realizadas tanto de su muestra biolgica como de la solucin de referencia. Tabla 2. Resultados de la prueba cuantitativa Muestra 1 2 Solucin de referencia *En caso de haberse realizado. Absorbancia Dilucin* Concentracin (mg/dL) Coloracin Resultado (+/-)
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5. Con los valores obtenidos en sus muestras relacione la sintomatologa en la siguiente tabla y concluya si los valores se encuentran por encima del lmite legal establecido. Tabla 3. Observaciones clnicas segn el grado de intoxicacin Concentracin (mg/dL) 50 a 150 150 a 300 300 a 500 500 Falta de coordinacin, tiempo de reaccin lento, y visin borrosa. Deterioro visual, tambaleo y lenguaje cercenado, hipoglucemia intensa, sobre todo en nios. Falta notoria de coordinacin, estupor, hipoglucemia y convulsiones. Coma y muerte, excepto en individuos tolerantes. Observaciones clnicas
6. Cul es la concentracin mxima de EtOH que se puede determinar con este protocolo? 7. Qu resultados esperara si la concentracin de EtOH en la muestra es mayor a la concentracin mxima que puede determinar el protocolo? REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Fister, H.J. Ethyl alcohol. Manual of standardized procedures for spectrophotometric chemistry. E-10a.1-E-10b.3 (1950) U.S.A. Standard scientific supply corporation. U.S.A. Hobbs, W.H., Rall, T.W., Verdoorn. T.A. Hipnticos y sedantes: etanol. En: Goodman & Gilman. Las bases farmacolgcas de la teraputica. 1 9a ed. Ed. McGraw-Hill Interamericana, Mxico D.F., 1996, pp 411419. Klassen, C.D. Watkins, J.B. Efectos de los solventes y vapores en Toxicologa Clnica. En: Casarett & Doull, Manual de Toxicologia, la ciencia bsica de los txicos. (5 ed.) McGraw-Hill Interamericana, Mxico D.F. 2001, pp 739744, 934935. Pesce, A.J., y Kaplan, L.A. Alcohol por T. J. Schroeder. Methods in clinical chemistry. The C.V. Mosby Company. U.S.A., 1987, pp 324329. Sunshine, I. Ethanol. Methodology for Analitical Toxicology. CRC Press, Inc., 1978, pp 145-154.
84
APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. Balanceo de la siguiente ecuacin: CH3OH + K2Cr2O7 Cr3+ + R-COO -
2. Color de las soluciones que contienen cromo (VI) y cromo (III). 3. Especificidad de la prueba, tipo de sustancias que pueden dar un resultado falso positivo. 4. Longitud mxima de absorcin del K2Cr2O7 en el visible. 5. Fundamento de la prueba presuntiva. 6. Fundamento de la prueba cuantitativa. 7. Propsito de adicionar solucin saturada de K2CO3 e incubar. 8. Lmite mximo de EtOH en sangre legalmente establecido para conductores. 9. Calcular la concentracin de etanol en sangre de la siguiente muestra problema: Solucin de referencia: 2 mL de una solucin 0.01 M de dicromato de potasio se diluyeron a 10 mL, de esta solucin se tomaron 5 mL y se diluyeron a 10 mL. La lectura de absorbancia para la ltima solucin, a 450 nm, fue de 0.205. Muestra: 2 mL de la solucin 0.01 M de dicromato de potasio se colocaron en la celdilla B y se hicieron reaccionar con 1 mL de muestra problema (celdilla A). Al trmino de 45 minutos de calentamiento, el contenido de la celdilla B se diluy a 10 mL y se ley a 450 nm, dando una absorbancia de 0.23. Respuesta: 60.72 mg de etanol/100 mL de sangre.
APNDICE II: PREPARACIN DE SOLUCIONES
Solucin A: Solucin de dicromato de potasio (K2Cr2O7) Pesar 2.5 g de K2Cr2O7 y solubilizarlo en 20 mL de H2SO4 al 50 %, aforar a 100 mL con H2SO4 al 50 %.
85
Solucin B: Solucin de dicromato de potasio (K2Cr2O7) Disolver 0.5 g de K2Cr2O7 en 25 mL de agua destilada y agregar cuidadosamente 40 mL de H2SO4 concentrado, dejar enfriar y diluir con agua destilada a 100 mL.
NOTA: El contacto con altas concentraciones de dicromato de potasio puede resultar en ulceracin de manos, destruccin de membranas mucosas y perforacin del tabique nasal. Solucin saturada de carbonato de potasio (K2CO3) Con agitacin, agregar la cantidad necesaria de K2CO3 en el volumen de agua destilada a preparar hasta su saturacin (se observa que ya no se disuelve). Posteriormente filtrar. PM del etanol : 46 g/mol PM del K2Cr2O7: 294.7 g/mol Densidad del etanol: 0.7893 a 20 C APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS R1: EtOH, K2Cr2O7, H2SO4, CH3COOH, Cr(SO4)3, K2SO4, K2CO3
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IDENTIFICACIN DE ALCALOIDES Y BARBITURICOS EN MUESTRAS PROBLEMA OBJETIVOS ACADMICO Con base en los conocimientos adquiridos en los guiones anteriores, que el alumno proponga un proceso de extraccin e identificacin para alcaloides y barbitricos. PROBLEMA Aislar e identificar escopolamina y/o cido barbitrico de una muestra problema. REACTIVOS Hidrxido de amonio (NH4OH) Metanol (MeOH) cido actico glacial Carbonato de bismuto (Bi2(CO3)3) Acetato de cobalto tetrahidratado cido barbitrico EQUIPO Rotaevaporador Lmpara de luz ultravioleta MATERIAL Embudo de separacin de 250 mL Embudo de cola corta Matraz Erlenmeyer de 125 mL Matraz de bola de 50 mL Vaso de precipitado de 250 mL 2 Agitador de vidrio 2 Probeta de 10 mL 3 Pipeta graduada de 10 mL 2 Anillo metlico 3 Tubos de ensayo 1 1 2 1 4
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Cromatofolios de aluminio Yoduro se sodio (NaI) Acetato de etilo Isopropilamina Escopolamina
Bomba de aspersin
Vaso de precipitados de 100 mL Pipeta Pasteur Tubo capilar DESARROLLO EXPERIMENTAL
4 Anillos de corcho 3 Anillos de corcho 2
2 2
1. El profesor proporcionar una muestra que contiene escopolamina y/o cido barbitrico. El alumno desarrollar el procedimiento que proponga para aislar la forma no ionizada de los compuestos antes mencionados. 2. Una vez obtenida la forma no ionizada de las sustancias, evaporar a sequedad en un rotaevaporador. Dejar enfriar y reconstituir cada uno de los residuos con 0.5 mL (3 o 4 gotas) de metanol. Etiquetar cada uno de ellos con el nombre de la sustancia que espera que contenga. 3. Para el proceso de identificacin, solicitar a los profesores dos placas para cromatografa en placa fina. En una de ellas (placa 1) del lado izquierdo tendr aplicada previamente la referencia de escopolamina y en la otra (placa 2) la de cido barbitrico. Una muestra del residuo reconstituido previamente ser aplicada del lado derecho de cada una de las placas de acuerdo al siguiente esquema.
Esquema 1. Placa cromatogrfica

4. Para la identificacin de la escopolamina emplear como sistema de elucin una mezcla CHCl3/MeOH (9:1) + 3 gotas de NH4OH. 5. Para la identificacin del cido barbitrico emplear como sistema de elucin una CHCl3/Acetona (9:1) + 3 gotas de cido actico. 6. Saturar las cmaras durante 10 minutos antes de eluir las muestras en las placas cromatogrficas. 7. Eluir hasta la lnea limite de elucin indicada en el esquema 1. 8. Visualizar la presencia de escopolamina y/o cido barbitrico con una lmpara de luz U.V. y posteriormente, revelar las cromatoplacas utilizando la solucin etiquetada como solucin reveladora de reactivo de Dragendorff para el caso del alcaloide, y con yodo para el otro compuesto. Calcular el Rf para cada sustancia de acuerdo al esquema 1 y comparar el valor obtenido con el de la referencia proporcionada. 9. Con el residuo reconstituido excedente realizar el siguiente procedimiento de identificacin.
Alcaloides a) Colocar 2 gotas del residuo reconstituido correspondiente, y agregar 2 gotas de HCl 1N ms 2 gotas de solucin stock del reactivo de Dragendorff. b) Realizar un control positivo con las muestras de referencia y un control negativo (con agua) para esta reaccin. Barbitricos a) Colocar tres gotas del residuo reconstituido correspondiente y agregar tres gotas del reactivo A y tres gotas del reactivo B (Dille-Koppanyi). b) Realizar un control positivo con las muestras de referencia y un control negativo (con agua) para esta reaccin.
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CUESTIONARIO 1. Reporte el diagrama de separacin que utiliz para esta prctica y justifique los cambios, si los hubo, con relacin al diagrama diseado en los conocimientos previos. 2. Reporte en la siguiente tabla los resultados que obtuvo en las pruebas de identificacin. Marque con una cruz si la reaccin fue positiva. Tabla 1. Resultados de las pruebas de identificacin Referencia escopolamina Dille-Koppanyi Dragendorff Rf 3. Indique si su muestra contena cido barbitrico. Explique su respuesta. 4. Indique si su muestra contena escopolamina. Explique su respuesta. 5. Cules son los puntos que considera crticos para la adecuada separacin e identificacin de la muestra? REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Benko A. (1985). Toxicological Analysis of Amobarbital and Glutethimide from Bone Tissue. Journal of Forensic Sciences 30, 708714, Blanke R.V. Decker W.J. Analysis of Toxic substances. Textbook of clinical chemistry. Saunders, Philadelphia, 1986, pp 16701744. Bowman y Rand. Farmacologa. Bases Bioqumicas y Patolgicas. (2 ed). Editorial Interamericana, Mxico, 1984. 42.2542.32. Bruneton J. Alcaloides, Generalidades. En: Farmacognosia. Fitoquimica. Plantas Medicinales. Ed. Acribia, Zaragoza, Espaa, 2001, pp 775792. Clark E.E. Isolation and Identification of Drugs. Vol. I y II. Pharmaceutical Press, London, 1972. Residuo reconstituido de escopolamina Referencia de cido barbitrico Residuo reconstituido de cido barbitrico
90
Cochin, J., Daly, J.W. (1963). The Use of Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Drugs. Isolation and Identification of Barbiturates and Nonbarbiturates Hypnotics from Urine, Blood and Tissues. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 139, 154159. APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. Propiedades acido-base (pKa) de la escopolamina y el cido barbitrico. 2. Forma ionizada y no ionizada de cada uno de ellos. 3. Diagrama de separacin para aislar escopolamina y cido barbitrico presentes en una muestra problema, justificando en cada etapa el uso de los reactivos sugeridos. 4. Indicar en el diagrama anterior la recoleccin y almacenamiento de los desechos generados. 5. Fundamento de la reaccin de Dragendorff. 6. Fundamento de la reaccin de Dille-Koppanyi. 7. Fundamento de la cromatografa en capa fina como herramienta de identificacin de sustancias qumicas utilizando luz UV, Yodo y reactivo de Dragendorff como reveladores. APNDICE II: PREPARACION DE REACTIVOS Reactivo de Dragendorff (Solucin patrn) Solubilizar 2.6 g de Bi2(CO3)3 y 7.0 g de NaI en 25 mL de cido actico glacial, calentar por 10 minutos a 40oC para solubilizar el reactivo. Dejar reposar por 12 horas y posteriormente filtrar la solucin. Mezclar 20 mL del filtrado (solucin rojo-caf) con 8 mL de acetato de etilo, la solucin anterior se guarda en un frasco mbar (la cual es estable por 6 meses). Reactivo de Dragendorff (Solucin reveladora) Mezclar 10 mL de la solucin patrn con 25 mL de cido actico glacial y 60 mL de acetato de etilo.
Reactivo A (Dille-Koppanyi) Solubilizar 0.1 g de acetato de cobalto tetrahidratado en 100 mL de MeOH absoluto y agregar 0.2 mL de cido actico glacial. Reactivo B (Dille-Koppanyi) Mezclar 5.0 mL de isopropilamina con 25 mL de MeOH absoluto. NOTA: El reactivo A y el reactivo B son estables por 2 das.
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