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Expanso do proteoma eucaritico por splicing alternativo

A coleo de componentes necessrios para a realizao dos intricados processos envolvidos na gerao e manuteno de uma vida, respirao, incrivelmente complexa. De onde todas as partes vm? As primeiras estimativas indicaram que cerca de 100.000 genes seriam necessrios para formar um mamfero, no entanto, o nmero real inferior a um quarto disso, apenas quatro vezes o nmero de genes em levedura. Agora claro que a informao 'ausente' em grande parte, fornecido por splicing alternativo, o processo pelo qual mltiplos diferentes RNAs mensageiros funcionais, e, portanto, protenas, podem ser sintetizados a partir de um nico gene.

Splicing alternativo precursor de RNA mensageiro (pre-mRNA) foi descrito pela primeira vez h quase 30 anos, quando descobriram que anticorpos ligados e secretados pela membrana so codificados pelo mesmo gene. Logo aps, mais exemplos deste fenmeno foram descritos: por exemplo, a calcitonina/calcitonina polipeptdio relacionado a genes que codificam 2 peptdeos hormonais, que so expressos em modo tecido-especficos. Em ambos estes exemplos, a incluso e excluso diferenciada de sequencias de xons atravs de splicing alternativo (e poliadenilao alternativa) responsvel por dobrar o nmero de protenas codificadas pelos genes. Apesar de uma vez ter sido considerado incomum, o nmero estimado de genes que codificam mais do que uma protena (ou isoforma de protena) como resultado de splicing alternativo de um pr-mRNA tem vindo a aumentar ao longo do tempo. Estudos recentes usando altos mtodos de sequenciamento indicam que 95-100% do pre-mRNA humano contem sequencias correspondentes a mais de xon e so processados para se obter mltiplos mRNAs. E no s a maioria dos genes que codificam pr-mRNAs QUE fazem splicing alternativo, mas tambm o nmero de isoformas de mRNA codificados por um nico gene pode variar de dois a vrios milhares. Um exemplo espetacular o gene Down syndrome cell adhesion molecule (Dscam) de Drosophila melanogaster, que pode gerar 38,016 isoformas de mRNA distintas, um nmero muito superior ao nmero total de genes (~14.500) no organismo. Se a enorme diversidade de protenas que podem ser geradas por splicing alternativo considerado em conjunto com outros processos tais como a utilizao de locais de incio de transcrio alternativos, poliadenilao alternativa e edio de RNA, bem como modificaes ps-traducionais (tais como fosforilao, ubiquitilao e SUMOilao; uma rea amplamente inexplorada), o nmero de protenas funcionalmente distintos que podem ser codificadas pelo genoma surpreendente. Embora a extenso relativa qual estes e outros mecanismos e modificaes contribuam para a diversidade de protenas aumentando no clara, o splicing alternativo uma das principais fontes de diversidade protemica em eucariotos multicelulares. Nesta reviso, discutiremos a complexidade do splicing alternativo e consideraremos os mecanismos que so conhecidos ou suspeitos, de estar envolvido na regulao da escolha do stio de splicing. Em seguida, descreveremos as questes importantes pendentes no campo e especularemos sobre as implicaes evolutivas da diversidade protemica expandida.

Diversas manifestaes de splicing alternativo Splicing alternativo envolve a utilizao diferencial de locais de splicing para criar diversidade de protenas. Quase todos os casos de splicing alternativo resultam da utilizao de um ou mais dos quatro mdulos bsicos: escolha alternativa 5 splice-site, escolha alternativa 3 splice-site, a incluso de cassete-xon ou saltar, e ntron de reteno (Fig. 1). Genes que codificam um pequeno nmero de isoformas de mRNA contm tipicamente apenas um ou dois desses mdulos. Por exemplo, dois mRNAs podem ser sintetizados a partir de um gene contendo um nico xon cassete: um mRNA que contm a sequncia exnica, e uma que no a tem. Em contraste, repertrios de mRNA tremendamente diversos podem ser gerados a partir de genes construdos com muitos mdulos. Por exemplo, o gene humano KCNMA1 (tambm conhecido como SLO) contm mdulos, incluindo numerosas alternativas 5 splice sites, alternativas 3 splice sites e os cassetes de xon, e mais de 500 isoformas de mRNA de KCNMA1 podem ser geradas (Fig. 2a).

Da mesma forma, os potenciais 38,016 isoformas de mRNA Dscam so sintetizadas a partir de um gene contendo 95 xons cassetes, as quais so unidas a partir do pr-mRNA de uma forma mutuamente exclusiva (isto , cada isoforma de mRNA contm sequncia correspondente a um nico xon cassete) (Fig. 2b). Uma manifestao ainda mais elaborada de splicing alternativo exemplificada pelo gene modificador de D. melanogaster de mdg4 (mod (mdg4)), que codifica 28 mRNAs. Estes so gerados por trans-splicing de sequncia correspondente a um grupo de xons comuns, presente em um pr-mRNA, para sequenciar o que corresponde a um conjunto de 28 xons variveis, presentes em prmRNAs separados (Fig. 2c). No se sabe se eventos semelhantes ao trans-splicing ocorrem em outros eucariotos multicelulares.

Mecanismos de splicing alternativo No claro o quanto de splicing alternativo 'constitutivo' (isto , a extenso em que mltiplas isoformas so produzidas nas mesmas propores em todos ou na maioria dos tipos de clulas). Isto ocorre porque os casos mais extensivamente estudados de splicing alternativo so eventos de splicing alternativo regulados. Regulao neste contexto, significa que os padres de splicing distintos so observados em diferentes ambientes celulares. Tal regulao pode ser especfica do tecido (por exemplo, uma sequncia correspondente a um xon particular seja includa no msculo, mas no no crebro) ou ditada por pistas de desenvolvimento ou de diferenciao especfica. Alm disso, alguns padres de splicing alternativo tm sido mostrados para ser modulado em resposta a estmulos externos, tais como a despolarizao de neurnios ou ativao de cascatas de transduo de sinal. Os mecanismos bioqumicos que controlam o sitio de splice, e portanto, splicing alternativo, so complexos e em grande parte, continuam a ser mal compreendidos. evidente que no pode haver fatores especficos e distintos dedicados a cada um dos mais de 100.000 decises de splicing alternativo que ocorrem nas clulas humanas; genomas diversos no valor de protenas reguladoras seria necessrio se fosse esse o caso. Portanto, espera-se que apenas um pequeno nmero de fatores sejam especificamente dedicados a um ou alguns poucos eventos de splicing alternativo, tais como os fatores que determinam a determinao do sexo em cascata em D. melanogaster. Assim, no surpreendente que um pequeno nmero de protenas foi repetidamente considerado responsvel (pelo menos em parte) pela regulao de um grande nmero de eventos de splicing alternativo (Tabela 1). Na verdade, poucos RNA tecido-especficos - protenas de ligao de foram identificados. Em vez disso, reguladores mais conhecidos de splicing alternativo, tais como protenas de SR e ribonucleoprotenas nucleares heterogneos (hnRNPs), so expressos ubiquamente, embora sua abundncia relativa possa variar em diferentes tecidos. Excees notveis so NOVA, nPTB (tambm conhecido como PTBP2), fox1 e FOX2 (tambm conhecido como A2BP1 e A2BP2), ESRP1 e ESRP2 (ref. 24), e nSR100 (tambm conhecido como SRRM4), a codificao de genes que so expressos de um modo tecido-especfico. Como pode este punhado de reguladores de splicing ser responsvel por controlar o grande nmero de eventos de splicing alternativo que ocorrem? Os reguladores de splicing mais estudados at agora so os membros da famlia SR-protena e hnRNP. SR protenas (assim chamada porque contm domnios compostos de repeties extensas de serina e arginina) so protenas de ligao ao RNA que so geralmente consideradas para ativar splicing pela ligao s sequncias correspondentes a xons e componentes de recrutamento da maquinaria de splicing do ncleo (o spliceossomo). Em contraste, hnRNPs, que so tambm protenas de ligao ao RNA, so geralmente consideradas para reprimir splicing por ligao a sequncias correspondentes a xons e introns ou interferir com a capacidade da principal mquina de splicing para envolver stios de splice; Contudo, os mecanismos pelos quais hnRNPs regulam negativamente o splicing esto longe de serem compreendidos. A existncia de classes opostas de fatores reguladores de splicing, e as provas abundantes de que esses fatores esto envolvidos em um grande nmero de decises de splicing, levou elaborao de um modelo simples 'yin-yang' de splicing alternativo. Neste modelo, a utilizao de stios de splicing determinada pelo nmero de stios que atuam positivamente (potenciadores de splicing que esto ligados por protenas SR) e negativamente (silenciadores de splicing ligados por hnRNPs). Quando os sites positivos superam os stios negativos, o splicing ocorre; quando os sitios negativos predominam, o

splicing inibido. Embora este modelo seja reconfortante em sua simplicidade e tenha algum valor preditivo, subestima muito a complexidade bioqumica de regulao de splicing. O nmero de mecanismos que so conhecidos por estarem envolvido na regulao de splicing aproxima-se do nmero de decises de splicing especficos que foram analisados em qualquer detalhe. Estes mecanismos vo desde os simples, como o bloqueio estereoquimico de stio de splicing ou recrutamento positivo da maquinaria de splicing, at outras mais complicadas, tais como formao de complexos "beco sem sada, bloqueio de comunicao splice-site ou facilitao de comunicao de stio de splice. Mesmo esses mecanismos so mal compreendidos em um nvel bioqumico detalhado (por exemplo, o que distingue um complexo de beco sem sada de complexos produtivos ainda no est claro). O quadro fica ainda turvo quando o splicing (e splicing alternativo) visto no como um processo esttico, mas como um processo altamente dinmico que abrange um nmero (ainda a ser definido) grande de passos cinticos. agora claro que muitos fatores podem ter efeitos marcantes sobre os padres de splicing, que incluem taxa de transcrio, nveis de maquinaria principal de splicing, tamanho do intron e a concorrncia entre stios de splicing. Em termos de competio, foi recentemente mostrado que os efeitos de alguns elementos de controle fortes de splicing (silenciadores de splicing fortes) so aparentes apenas quando um stio de competio de splicing est presente a montante do local afetado (Fig. 3a). Estes estudos mostraram tambm que um silenciador 'clssico' (ao qual se liga um hnRNP) no tem funo por ocluso, ou de outra forma de inativao do local afetado, mas sim, ao alterar um passo no limitante da velocidade na reao de splicing em geral. importante ressaltar que, quando ambos os sitios concorrentes foram "silenciados", o padro original de splicing foi restaurado, sem reduo no grau de splicing (Fig. 3, canto inferior direito). Estes resultados indicam que os parmetros cinticos tem papel determinante na escolha do sitio de splice. Quando visto a partir desta perspectiva cintica, os efeitos da taxa de transcrio de splicing alternativo tornam-se simples de racionalizar. O dobramento do transcrito nascente, e, portanto, a acessibilidade dos locais de ligao aos spliceosomo e reguladores de splicing, poderia ser determinada pela taxa em que o transcrito nascente est exposto. Desta forma, 'pequenas' mudanas podem tornar certos locais de splicing em uma vantagem ou desvantagem competitiva em relao a outros locais de splicing. Estudos recentes tambm indicam que xons no transcrito nascente tornam-se presos ao alongamento do complexo de transcrio medida que emergem a partir de RNA polimerase. Embora parea plausvel que este "amarramento" seja necessrio para a sequncia exnica serem includas no mRNA - ou ento se perder no ambiente nuclear - os mecanismos envolvidos no amarramento do RNA exnico so desconhecidos. Propomos que, quando a RNA polimerase rapidamente percorre os xons no gene, os xons transcritos evitam ser capturados e so ignorados, no entanto, quando eles so transcritos lentamente, eles so eficientemente amarrados e a sequncia correspondente est includa no mRNA (Fig. 3b). agora bem estabelecido que a estrutura da cromatina altamente dinmico e pode afetar a taxa de transcrio, que por sua vez pode influenciar o padro de splicing alternativo. Na verdade, num estudo em que um RNA interferncia curto foi utilizado para induzir a formao de heterocromatina, esta alterao na estrutura da cromatina correlacionada com uma reduzida capacidade de alongamento do complexo transcrio para avanar ao longo do DNA e com modificaes correspondentes nos padres de splicing alternativo. Alm disso, foi recentemente demonstrado que os xons esto especificamente marcados por histonas H3 trimetilada no resduo 36 da lisina (H3K36me3) de uma maneira transcrio-dependente. Esta modificao da histona foi encontrada com maior frequencia em histonas que so empacotadas com exons constitutivos (isto , aqueles que so constitutivamente presente em mRNA) em vez de exons alternativos (aqueles que no esto sempre presentes no mRNA). Por conseguinte, especula-se que uma grande proporo de eventos de splicing alternativo regulamentados pode ser determinada no pelo splicing tecido-especficos ou de fase de desenvolvimento-especfica, mas sim por diferenas de tecidos especficos ou fase especfica nas taxas de transcrio, que podem ser ditadas por modificaes locais de cromatina (Fig. 3b). Ser interessante explorar se as taxas de transcrio diferem acentuadamente entre o crebro e os msculos, que tm nveis particularmente altos de splicing alternativo, e tecidos onde o splicing alternativo menos prevalente.

Os efeitos sobre o splicing alternativo do esgotamento de protenas no spliceossomo nuclear tambm se tornou interpretvel, quando escolha do stio de splice vista em termos de competio cintica. Se a mquina de splicing est presente a uma concentrao saturante, o seu recrutamento no seria um passo limitante da velocidade, de modo que os outros parmetros determinam os padres de splicing. Mas, se a concentrao dos componentes da maquinaria de splicing ncleo se torna limitante, parece certo que especficos pares de stios de splice seriam mais eficazes no recrutamento de constituintes do spliceossomo, resultando em padres alterados de splicing. Como o caso para a transcrio, ser interessante descobrir as concentraes relativas dos componentes spliceossomo em diferentes tipos celulares e em diferentes fases de desenvolvimento organismo. Um exemplo final da importncia da cintica em splicing alternativo vem de estudos do gene Dscam de D. melanogaster (Fig. 3c), que (como indicado anteriormente) codifica mais de 38.000 isoformas de mRNA. Esta diversidade notvel principalmente gerada por splicing mutuamente exclusivo de pr-mRNA correspondente seqncia de quatro clusters grandes, controlados independentemente de xons alternativos. o splicing mutuamente exclusivo de um desses aglomerados de sequncia exnicas, que corresponde ao exon 6, mediada por estruturas secundrias concorrentes de RNA que se formam entre um local de encaixe nico e uma das sequncias seletoras localizada a montante de cada uma das 48 sequncias alternativas exnicas (Fig. . 3c) no mRNA. Mas no compreendido como a seqncia seletora escolhida para ser a que vai interagir com o stio de ancoragem. Neste caso, cada aspecto do processo a partir da fora do seletor para o stio de ancoragem de cada par de sequncia para a taxa de transcrio atravs do agrupamento de xon 6 e da distncia de cada sequncia de seletor e o stio de ancoragem susceptvel de ter um papel. Para complicar ainda mais, o HRP36 hnRNP (tambm conhecido como HRB87F) reprime ativamente todas as 48 seqncias exnicas (Fig. 3c) e a depleo desta protena resulta na incluso de mltiplas seqncias exnicas. Inesperadamente, no entanto, quando uma protena SR foi empobrecida junto com HRP36, o splicing correto foi encontrado para ser restaurado. Estes resultados no s mostram que as protenas SR e hnRNPs tm papel de equilibrio, mas tambm indicam que as seqncias exnicas que no foram selecionadas no esto 'adormecidas'. A explicao mais simples para esses achados que a sequncia exnica selecionada tem uma vantagem competitiva sobre as sequncias exnica no selecionadas tal que o splicing para as seqncias exnica que flanqueiam o cluster passa mais rpido do que a juno de seqncias exnica dentro do cluster. Parece provvel que muitos, se no todos, os casos de splicing mutuamente exclusivo so determinados por tais parmetros cinticos, embora os detalhes, sem dvida, so diferentes. Por ltimo, antes de deixar os aspectos mecnicos de splicing alternativo, deve notar-se que temos subestimado a complexidade dos mecanismos envolvidos. Quase todos os ativadores' de splicing podem, em alguns casos, ter a funo de repressores, e quase todos os repressores' tm sido mostrados que funcionam como ativadores. Exemplos particularmente notveis so o U1 small nuclear RNP (U1 snRNP) e NOVA. U1 snRNP parte da mquina de splicing do ncleo e essencial para o reconhecimento do stio 5 splice. No entanto, em certos contextos, U1 snRNP um componente necessrio para potentes silenciadores de splicing. NOVA, um fator de splicing neurnio-especfica, funciona como um regulador positivo quando posicionado a montante dos stios de splice, mas um regulador negativo quando posicionado a jusante de locais de splicing afetados. As generalidades desse direcionamento e os detalhados mecanismos bioqumicos subjacentes s funes opostas de ambos U1 snRNP e NOVA (bem como muitos outros reguladores splicing) continuam a ser elucidados. Mas claro que afeta o funcionamento contexto, e isto proporciona uma camada de complexidade ao campo j complexo de regulao do splicing alternativo.

Bioinformtica e splicing alternativo Uma das ferramentas mais teis para o estudo de splicing alternativo durante a ltima dcada tem sido a bioinformtica. Abordagens computacionais tornaram cada vez mais poderoso e sofisticado com cada genoma que foi completamente seqenciado e com cada avano nas tecnologias utilizadas para a anlise genmica. O objetivo final da utilizao de bioinformtica no campo splicing para poder identificar quais exons de um genoma so splicing alternativo do pr-mRNAs, para prever com preciso o padro espacial e temporal em que os exons so regulados, e para prever fatores de splicing que

esto envolvidos na regulao dos exons. Estes objetivos ainda precisam ser alcanados, mas tem havido progressos considerveis nestas reas, particularmente nos ltimos cinco anos. Um dos mtodos mais potentes na caixa de ferramentas de bioinformtica a genmica comparativa, que usa o grau de similaridade entre dois ou mais genomas para inferir informaes funcionais sobre regies de interesse. Por exemplo, esta abordagem revelou que exons alternativos so tipicamente mais conservados entre as espcies do que so os exons constitutivos, presumivelmente por causa do contedo de informao necessria para facilitar a regulao. Esta observao, por sua vez, tem sido usada para prever se um determinado exon mais provvel de ser constitutivo ou alternativo e para identificar exons alternativos anteriormente no reconhecidos. Genmica comparativa tambm tem sido utilizada para caracterizar potenciadores ou silenciadores de splicing atravs da identificao de sequncias que so enriquecidas ou empobrecido em exons ou introns e atravs de uma identificao de sequncias codificantes dentro de exons (aqueles traduzida em protena as ESTs) que so mais altamente conservadas do que o esperado, dada a flexibilidade do cdigo gentica. Do mesmo modo, a genmica comparativa facilitou a identificao de sequncias que participam na formao das estruturas de RNA envolvidas no controle de splicing alternativo. No entanto, as abordagens genmicas comparativas tm limitaes. Embora a conservao evolutiva fornea fortes evidncias para o significado funcional de um padro de splicing particular, o inverso nem sempre verdade. Um exemplo particularmente notvel a cascata de splicing alternativo que controla a determinao do sexo em D. melanogaster. Embora esta elegante via seja crucial para a sobrevivncia das espcies, ela mostra o rpido fluxo evolutivo. Mesmo entre as espcies estreitamente relacionadas de Drosophila, existem diferenas sutis, mas importantes na organizao e expresso dos genes que esto envolvidos nesta cascata. Alm disso, os insetos ligeiramente mais distantemente relacionados, tais como a mosca domstica (Musca domestica) e a mosca da fruta Mediterrnea (Ceratitis capitata), no se une o pr-mRNA correspondente ao primeiro gene na via de determinao do sexo (sexo letal) de uma forma especfica a cada sexo. Ainda mais surpreendentemente, quase todos os componentes da cascata de determinao do sexo de D. melanogaster e da abelha, Apis mellifera, so diferentes, apesar de o processo baseiar-se em splicing alternativo em ambas as espcies. Estes exemplos mostram o elevado nvel de plasticidade evolutiva que o splicing alternativo proporciona. Como as alteraes pequenas (isto , mutaes pontuais) em ambos os exons ou introns podem criar ou destruir os elementos de controle splicing, fcil de prever que os padres de splicing esto em constante evoluo: mutaes vantajosas teriam que ser rapidamente selecionadas, e mutaes deletrios seriam selecionadas contra. Na verdade, especula-se que alteraes nos padres de splicing 'no-conservados podem estar por trs das variaes fenotpicas observadas entre espcies e entre indivduos dentro das espcies. Estudos recentes tm fornecido percepo da maneira em que exons humanos tm evoludo e a extenso das diferenas de splicing alternativo entre os seres humanos e chimpanzs. Estudos adicionais ao longo destas linhas so susceptveis de melhorar a compreenso de como splicing alternativo contribui para a especiao e diversidade fenotpica.

Questes pendentes Em adio s amplas perguntas que temos descritas, numerosas questes permanecem sem soluo. A primeira delas se o grau de splicing alternativo pode explicar a complexidade dos organismos. Vale ressaltar que Caenorhabditis elegans, D. melanogaster e os mamferos tm cerca de 20.000, 14.000 e 20.000 genes, respectivamente, mas os mamferos so claramente muito mais complexos do que nematides ou moscas. No sistema nervoso sozinho, nematides tm apenas algumas centenas de neurnios, enquanto os mamferos tm vrios bilhes. Na verdade, atualmente, a quantidade absoluta de splicing alternativo que ocorre em mamferos parece ser muito mais elevada do que em nematides ou moscas. Estas medidas, no entanto, so baseadas em muito menos dados em nemtodos e moscas do que em seres humanos. Assim, a realizao do projeto organismo modelo Encyclopedia of DNA Elements (modENCODE), que procura identificar todas as sequncias baseadas em elementos funcionais em C. elegans e D. melanogaster, deve ajudar a descobrir a verdadeira extenso do splicing alternativo nestes organismos. No entanto, o tecido neuronal de mamfero enriquecido para os produtos splicing alternativo em comparao com outros tecidos de mamferos e, pelo menos, neste caso, a extenso de splicing alternativo correlaciona-se com uma maior complexidade.

Outra questo crucial como muitas isoformas de mRNA so funcionalmente relevantes? A teleologia sugere que, se uma isoforma existe, importante (de forma semelhante maneira pela qual DNA 'lixo' agora considerado como tesouro). Mas essa ideia difcil de provar e difcil para alguns aceitar. Infelizmente, a funo de isoformas de mRNA alternativos foi analisada com cuidado em apenas uma pequena proporo de genes. Tais estudos tm, no entanto, fornecido numerosos exemplos em que o splicing alternativo claramente d origem a isoforma funcionalmente distintas (Tabela 2). Mas, assim como mudanas visveis no fentipo no so freqentes, mesmo quando os genes inteiros so excludos, tambm h muitos casos em que as distines funcionais entre isoformas de mRNA no tenham sido observadas. Um exemplo disto o gene Cadherin-N de D. melanogaster (CadN), que contm duas verses mutuamente exclusivos de exon 18 (exon 18A e exon 18B). Estes exons so dinamicamente regulados ao longo do desenvolvimento, expressos em vrios tecidos e altamente conservados ao longo da evoluo. No entanto, embora mutaes no exon 18A impeam o desenvolvimento do fotorreceptor R7, sugerindo que o splicing alternativo de CadN pr-mRNA funcionalmente relevantes, este fentipo pode ser resgatado pela expresso uma isoforma de mRNA que contm sequncia correspondente ao outro exon, exon 18B. Portanto, possvel que oficialmente splicing alternativo de CadN pr-mRNA no gere isoformas funcionalmente distintos, mas garante que uma isoforma expressa no momento e local corretos. No entanto, tambm possvel que existam distines funcionais entre as isoformas que no podem ser detectadas nos ensaios utilizados. Assim, a questo de como muitos eventos de splicing alternativo so funcionalmente relevantes est destinado a permanecer sem resposta durante algum tempo. Outra questo pendente saber se existe um "Cdigo de splicing" decifrvel. Ser um computador capaz de prever fidedignamente os padres de splicing em uma clula ou organismo? Apesar das inmeras variveis (conhecidas e desconhecidas) envolvidos no escolha do splicing, um rpido progresso tem sido feito nesta rea. Mas no est claro quando ou se a pedra de Rosetta de splicing surgir. Tambm no est claro ao que os profundos elementos de extenso dentro de sequncias correspondentes a introns (e os fatores que se ligam a eles) influenciam as decises de splicing alternativo. A maioria das investigaes concentraram-se em elementos prximos aos locais de juno, mas regies intrnicas que esto distantes dos locais de splicing prprios poderiam certamente afetar o splicing alternativo. Ainda h muito a ser aprendido sobre os mecanismos de splicing alternativo e as redes reguladoras dele. evidente que pesquisadores esto apenas comeando a compreender a diversidade e os detalhes dos mecanismos que so usados para regular o splicing alternativo, bem como os fatores envolvidos. Os avanos tecnolgicos recentes, particularmente na anlise genmica, sugerem que os prximos anos provavelmente sero preenchidos com muitas descobertas interessantes e inesperadas que poderiam rapidamente revelar os mistrios do campo.

Figura 1 | Tipos de splicing alternativo. H quatro tipos bsicos de splicing alternativo: seleo da alternativa 5 splice-site (a), seleo da alternativa 3 splice-site (b), a incluso de cassete xon ou saltando (c) e do intron de reteno (d). Os retngulos no centro representam pr-mRNA. Para cada prmRNA, as linhas pretas abrangem as regies que podem estar fora spliced, com as linhas acima correspondente ao mRNA maduro mostrada esquerda e as linhas abaixo para o mRNA do lado direito. Isto , o mRNA que sintetizada quando o xon central (ou intron em d) saltado mostrado no lado esquerdo, e que o mRNA sintetizado quando esta sequncia est includo mostrado direita. Em d, a parte rosa considerada um xon quando includo (direita) e um intron quando saltado (esquerda). Figura 2 | A gerao de repertrios diversos de mRNA. a, pre-mRNA humano KCNMA1 descrito, com xons constitutivos em azul e xons alternativos em amarelo e vermelho. Os padres de splicing possveis para cada exon so indicados acima e abaixo do pr-mRNA (linhas pretas). O pre-mRNA KCNMA1 contm mltiplos alternative 5 splice sites, alternative 3 splice sites e sequencias correspondentes a exons cassete. Juntos, estes permitem mais do que 500 isoformas de mRNA a ser sintetizado a partir de um nico pr-mRNA. b, pre-mRNA Drosophila melanogaster Dscam descrito, com xons constitutivos em azul e xons alternativos no xon 4, 6, 9 e 17 agrupamentos mostrados em

amarelo, laranja, vermelho e roxo, respectivamente. O padro de splicing para uma isoforma de mRNA mostrado como um exemplo. O gene Dscam contem 95 xons alternativos organizados em quatro grupos de xons mutuamente exclusivos (isto , s xon de cada cluster transcrito). Estes quatro grupos esto no xon 4, xon 6, xon 9 e xon 17, que contm 12, 48, 33 e 2 xons variveis, respectivamente. Em combinao com os 20 xons constitutivos do Dscam, esta estrutura permite 38,016 mRNAs a ser sintetizados a partir de um nico pr-mRNA. C, A organizao do gene mod (mdg4) de D. melanogaster descrita, com xons comuns em azuis e xons variveis em roxo. Os xons comuns e alguns dos xons variveis esto presentes em uma cadeia do DNA e so transcritos da esquerda para a direita, como mostrado, enquanto que um outro conjunto dos xons variveis est presente na cadeia oposta e transcrito a partir da direita para a esquerda, como ilustrado. O nmero exato, e as posies exatas dos incios e fins, do xon comum pr-mRNA e do xon variveis pr-mRNA so desconhecidos. Os padres de splicing possveis para cada xon no pr-mRNA correspondente so indicadas por linhas + pretas, com as possveis posies de caudas poli(A) indicadas por linhas onduladas verdes. Um total de 28 mod (ODM4) mRNA so sintetizados, e isto ocorre atravs do trans-splicingdos de xons comuns a um conjunto de xons variveis.

Figura 3 | Mecanismos de regulao de splicing alternativo. a, um efeito cintico de silenciadores de splicing no splicing alternativo. Esquerdo, quando dois competem 5 locais de splicing esto presentes em uma hipottico pr-mRNA e o silenciador apropriado est ausente (isto , o hnRNP, que silencia a transcrio pela ligao ao silenciador splicing exnico (ESS)), o U1 small nuclear RNP (U1 snRNP) se liga a ambos 5 stios splice (enquanto U2 snRNP e U2AF se ligam nico stio de splicing 3), e a proxima 5 stio de splicing preferencialmente utilizado (linha slida preta; linha tracejada preta indica splicing em distal do 5splice sites). Canto superior direito, por comparao, quando o hnRNP est presente, a taxa qual o stio de splicing 5' proximal pode ser usado diminui, a promoo de splicing para o distante 5stio de splicing. Direito Centro, em comparao com o caso do lado esquerdo, na ausncia de um 5 stio de splicing competindo a montante, a presena do hnRNP no diminui significativamente a taxa de splicing. Canto inferior direito, em comparao com o caso do lado esquerdo, quando esto presentes sequncias silenciadores perto de ambos os locais de splicing 5', o hnRNP no tem qualquer impacto detectvel sobre a proporo em que um ou outro local de juno usado. b, Inter-relao entre taxa de transcrio de alongamento, estrutura da cromatina e modificaes de histonas, e seu impacto sobre splicing alternativo. Um gene hipottico est representado; trs exons so mostrados empacotados em nucleossomos. Os exons constitutivamente transcritos (verde) so empacotados em nucleossomos que contm constitutivamente H3 histona que trimetilada (amarelo) no resduo de lisina 36 (H3K36me3). Em clulas que no incluem o exon alternativo (rosa) no mRNA, os nucleossomos empacotam DNA exnico no contm H3K36me3 (superior).